JP2015114630A

JP2015114630A - 光学観察装置、光学観察方法、標本観察画像の画像処理プログラム

Info

Publication number: JP2015114630A
Application number: JP2013258731A
Authority: JP
Inventors: 祥子吉田; Sachiko Yoshida; 穂積　直裕; Tadahiro Hozumi; 直裕穂積; 氏家　雅彦; Masahiko Ujiie; 雅彦氏家; 洋行須山; Hiroyuki Suyama
Original assignee: Toyohashi University of Technology NUC; Pulstec Industrial Co Ltd
Current assignee: Toyohashi University of Technology NUC; Pulstec Industrial Co Ltd
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-22
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: JP6295396B2

Abstract

【課題】標本への光の入射面側から標本の観察画像を取得した場合に、その観察画像に含まれる背景光の影響を軽減して良好な観察画像を取得することのできる光学観察装置、光学観察方法、標本観察画像の画像処理プログラムを提供すること。
【解決手段】検出システム１００では、細胞組織Ｓの表面に向けて、入射角の異なる照射光により２の画像（観察画像、比較画像）を撮影し、その撮影された画像（標的光と背景光とが混在する状態）にあるものについて、未知の分離値αを入力によって定めることで、αが未知であっても１の画像に含まれる標的光と背景光とを分離できる。よって、背景光の影響を抑制し、本来の像に近似する精緻な画像でその観察結果を得ることができる。
【選択図】図６

Description

本発明は、細胞組織等の標本を観察する光学観察装置、光学観察方法、標本観察画像の画像処理プログラムに関するものである。

従来より、光学的な観察装置による生体組織標本等の観察が広く行われている。例えば、標本を数ミクロン程度の厚さに薄切し、この薄切された標本を顕微鏡で拡大した観察像を観察する技術は広く知られている。この光学顕微鏡を用いた透過観察は、機材が比較的安価で取り扱いが容易である上、歴史的にも古くから行われており、最も普及している観察方法の一つである。近年では、光学顕微鏡に取り付けられたカメラにより観察像を撮像することも主流となっている。

また、生物試料の一般的な分析方法として、蛍光観察が知られている。蛍光観察は、フルオレセインやローダミンのような低分子有機化合物の蛍光色素を利用し、染色されたタンパク質や、核酸の観察を行うことや、蛍光標識した抗体を特定のタンパク質に反応させて（蛍光免疫染色法）該タンパク質の細胞内での局在を観察することに利用される。また、ＧＦＰを始めとする蛍光タンパク質を標的タンパク質と融合させ生きた細胞内での局在や動きを観る目的で使われる。
多くの生物試料は、光を透過させるものが多いため、生物試料は、透過観察には適しているが、落射式の顕微鏡などを用いて表面観察を行うことは困難であった。そこで、近年、全反射照明蛍光観察法が提案されている。

例えば、生物試料の蛍光観察を従来の落射蛍光観察法で行うと、光軸方向全体に励起光が照射され、その中で発する蛍光が観察される。これに対して、全反射照明蛍光観察法では、その励起光を、光軸方向全体ではなく生体試料を載置するカバーガラス近傍のごく限定された領域（例えば、カバーガラス表面から１００ｎｍ程度）にのみ発生させるので（エバネッセント光、近接場光）、その限定された領域の励起光により生じる蛍光現象が観察できるものとなる。つまり、生体試料の表面（表面近傍）の観察を行うことができる。

このようなエバネッセント光を用いた顕微鏡装置（特許文献１、２参照。）は、近年盛んに開発が進められているが、一方で、かかる顕微鏡は、光ファイバーやコンピュータを駆使した大規模なものであり、高価であるため、汎用的なものとはなっていない。

更には、生体試料（細胞）から放出される生理活性物質は、細胞間の情報伝達物質として重要な役割を担っており、医学的な見地からも細胞からの放出状態を観察することに対する要求が大きい。しかしながら、かかる物質は化学物質であり、その観察に従来の蛍光染色法を適用できない。

そこで、本願発明者の一部において、生体試料から放出された化学物質の濃度分布を、組織上の位置に対応つけて観察、測定するための小型化された光学装置が提案されている（特許文献３、４）。この光学装置は、表面に酵素が担持された載置台を備えており、該載置台は励起光の導波路としても機能するようになっている。載置台に生体試料が載置されると、生体試料から放出された生理活性物質由来の蛍光物質が酵素の作用下で生成され、生成した蛍光物質が載置台面上にしみ出す励起光にて蛍光発光するので、蛍光画像にて生理活性物質の二次元分布（空間分布）を観察できる。これによって、γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を始めとする各種の生理活性物質の濃度分布測定に成功している。

特開２００２−０３１５９１号公報特開２００５−２１４７４５号公報特開２００８−１３９２８０号公報特開２０１３−４０８００号公報

しかしながら、上述したように、特許文献１および特許文献２に開示された顕微鏡の技術は、汎用的に用いることができない高額なものである。また、特許文献３および４に開示された技術は、生理活性物質の空間分布を蛍光画像にて測定できるものであるが、観察画像がぼやけたり、精細な情報が得られないことがあるといった問題点があった。

また、いわゆる反射型顕微鏡など、標本への光の照射面と標本観察面とが同じ側にある光学観察装置においては、生体試料の表面観察を行おうとしても、特許文献３および４に開示された技術が抱える問題点と同様に、観察画像にぼやけが生じたり、精細な画像が得られないといった問題が発生していた。

ここで、撮像された観察画像は、画素値の集合であるので、コンピュータに取り込むことにより、不鮮明な観察画像に対し一般的な画像処理を適用して鮮鋭化を行うこともできる。しかし、不用意に鮮鋭化処理を行うと、得られた精彩画像が真の観察像（原画像）から大きく離れた画像となりかねず、精度および信頼性の要求されるものである観察画像においては致命的な誤りとなりかねないという問題点があった。

本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、標本への光の入射面側から標本の観察画像を取得した場合に、その観察画像に含まれる背景光の影響を軽減して良好な観察画像を取得することのできる光学観察装置、光学観察方法、標本観察画像の画像処理プログラムを提供することを目的としている。

この目的を達成するために、請求項１に記載の光学観察装置は、標本の観察対象面に対し、複数の異なる入射角度で光を照射する照明手段と、前記照明手段により照明された標本の観察対象面を撮像する撮像手段と、前記撮像手段によって撮像されると共に、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを前記照明手段からの光の入射角度に対応づけて記憶する記憶手段と、前記記憶手段に記憶された撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分との混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算手段と、前記演算手段による演算により得られたデータを用いて、前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成手段とを備えたものである。

請求項２に記載の光学観察装置は、請求項１に記載の光学観察装置において、前記演算手段が行う演算は、対応づけられた光の入射角度が大きい撮像画像データを観察画像として用いるとともに、対応づけられた光の入射角度が小さい撮像画像データを比較画像として用い、前記演算手段は、前記観察画像から前記背景光成分を除去する演算を行うものである。

請求項３に記載の光学観察装置は、請求項１又は２に記載の光学観察装置において、前記演算手段による演算は、分離係数で重みづけをした比較画像と観察画像とを加減算する演算を含むものであり、前記分離係数を設定する設定手段を備えたものである。

請求項４に記載の光学観察装置は、請求項３に記載の光学観察装置において、前記設定手段により設定された分離係数を用いた前記演算手段による演算の結果として、前記標的光成分と前記背景光成分との分離がどの程度行われたかを評価する評価手段を備えたものである。

請求項５に記載の光学観察装置は、請求項４に記載の光学観察装置において、前記設定手段は前記分離係数を入力する数値入力手段を備え、前記評価手段は、前記画像形成手段により形成された画像を表示する表示手段を備えたものである。

請求項６に記載の光学観察装置は、請求項３乃至５に記載の光学観察装置において、前記設定手段は、前記観察画像上の座標（ｘ，ｙ）に対応する画素値群Ｆ_１（ｘ，ｙ）および前記比較画像上の座標（ｘ，ｙ）に対応する画素値群Ｆ_２（ｘ，ｙ）と、標的光成分の画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）および背景光成分の画素値群ｆ_２’（ｘ，ｙ）との関係が以下の数１であるとして、分離係数であるα、βのうち、少なくともαを観察画像における背景光成分の分離係数として設定し、前記画像形成手段は、前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を標的光成分ｆ_１’（ｘ，ｙ）の画素値群により形成するものである。

請求項７に記載の光学観察装置は、請求項６に記載の光学観察装置において、前記設定手段は、観察画像における背景光成分の分離係数としてαを設定すると共に、比較画像における標的光成分の分離係数としてβを設定するものであり、前記評価手段は前記数１を用いて標的光成分の画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）と背景光成分の画素値群ｆ_２’（ｘ，ｙ）を算出し、算出された画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）とｆ_２’（ｘ，ｙ）から画素値の確率密度分布であるｐ（ｙ_１ｉ）とｐ（ｙ_２ｊ）を算出し、算出された画素値の確率密度分布であるｐ（ｙ_１ｉ）とｐ（ｙ_２ｊ）から周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）を算出し、算出された周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）から以下の数２を用いてＫＬ情報量を算出するＫＬ情報量算出手段を備え、前記設定手段は、前記ＫＬ情報量算出手段によりＫＬ情報量が算出された場合は、前記ＫＬ情報量が小さくなる方向に、次の前記αまたはβの少なくとも１つを変更して設定するものである。

請求項８に記載の光学観察装置は、請求項１乃至７に記載の光学観察装置において、前記照明手段は、前記標本の観察対象面に対する入射角度が異なる光源を複数有しており、発光させる光源を変更することにより入射角度を変更するものである。

請求項９に記載の光学観察装置は、請求項１乃至８に記載の光学観察装置において、前記標本を載置する透光性の載置台を備え、前記照明手段は、前記載置台に載置された標本を、前記載置台の内部側から複数の入射角度で照明するものである。

請求項１０に記載の光学観察装置は、請求項９に記載の光学観察装置において、前記照明手段は、前記載置台の側方に設けられ、前記載置台の側面または裏面から前記標本の観察対象面へ励起光を、前記載置台の表面の内側にて全反射させるように入射させるものである。

ここで、照明手段が、載置台の表面の内側にて全反射させるように入射させるものであるとは、照明手段からの光が、載置台の表面の内側にて理論的に全反射する臨界角以上の入射角で、載置台の表面内側に達することを意味するものであり、実際に標本を載置台上に載置した場合に、照射手段からの光が載置台の表面の内側にて全反射することを意味するものではない。

請求項１１に記載の光学観察装置は、請求項１０に記載の光学観察装置において、前記載置台の表面には酵素が固定されており、前記載置台に載置させた標本の表面に存在する化学物質を酵素の作用下で反応させ、生成される前記化学物質に由来する蛍光物質を前記照明手段から入射される励起光にて発光させるものである。

請求項１２に記載の光学観察装置は、請求項１１に記載の光学観察装置において、前記酵素は、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼとコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の混合物）、乳酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素のいずれかであり、前記載置台に載置させた標本に蛍光元物質を存在させることにより、前記化学物質と蛍光元物質とを前記酵素の作用下で反応させて蛍光物質を生成させるものである。

請求項１３に記載の光学観察装置は、請求項１乃至１２に記載の光学観察装置において、前記撮像手段は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラもしくはＣＭＯＳカメラである。

請求項１４に記載の標本の光学観察方法は、標本の観察対象面に対し、複数の異なる入射角度で光を照射し、照明された標本の観察対象面を撮像して、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを前記入射角度に対応づけて記憶する撮像記憶工程と、前記撮像記憶工程にて記憶された撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分とは混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算工程と、前記演算工程にて得られたデータを用いて前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成工程とを備える。

請求項１５に記載の画像処理プログラムは、標本の観察対象面に対し複数の異なる入射角度で光を照射し、照明された標本の観察対象面を撮像して、前記入射角度に対応づけて記憶された、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを処理するプログラムであって、前記撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分とは混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算ステップと、前記演算ステップにて得られたデータを用いて前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成ステップとを備えるものである。

請求項１記載の光学観察装置によれば、照明手段により標本の観察対象面に対して複数の入射角度で光が照射され、撮像手段により標本の観察対象面の撮影がされ、記憶手段により入射角度に対応づけて観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データが記憶される。そして、演算手段は、記憶手段に記憶された撮像画像データにおいて、１の入射角度に対応づけられた観察画像と１の入射角度とは異なる入射角度に対応づけられた比較画像との間で、各々に含まれる標的光成分と背景光成分との混合割合が異なることに基づいて、観察画像と比較画像とを用いて標的光成分と背景光成分とを分離させる演算を行い、画像形成手段は、演算手段による演算により得られたデータを用いて標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する。

標本に光を照射して撮像を行う場合、標本の観察対象面（測定面）に入射した光に応じて標本から出射される光により撮像画像が形成される。ここで、例えば、標本の種類によっては標本内を光が進行するため、実際には、観察対象面（測定面）本来の原画像を形成する光（標的光成分）に、測定面以外の部位からの光（背景光成分）が重畳した光が標本から出射され、これに基づいて撮像画像が形成される。このため、撮像画像にぼやけが生じたりして良好な画像を得ることが困難となり易く、観察対象面における標本本来の画像を取得することが困難であった。

ここで、取得した撮像画像データにおいて標的光と背景興との混合割合が未知であるが、本装置では、観察対象面の撮像画像の標的光成分と背景光成分とは未知であっても、観察対象面に照射される光の入射角度を変更して異なる深度の撮像画像を複数取得し、入射角度が異なる撮像画像（観察画像と比較画像）との間で、標的光成分と背景光成分との混合割合が異なることに基づいて観察画像と比較画像とを用いることで、近似的に標的光成分と背景光成分とを分離する処理（背景光成分とみなされた画像情報の観察画像からの除去）を行うことができ、みなし標的光成分によって観察対象面の画像を表示することができる。即ち、標的光成分と背景光成分とが混在した画像情報に対して鮮鋭化を行う場合に比べて、測定面の本来の原画像との近似性が高く信頼性の高い観察結果を示すことができる上、ノイズの影響が抑制されて精緻さの向上した観察画像を提供できる。

請求項２に記載の光学観察装置によれば、照明手段からの光の入射角度が大きい方を観察画像とし、前記照明手段からの光の入射角度が小さい方を比較画像としているので、標本の観察対象面（測定面）に対する光の侵入度合いがより小さい方を観察画像にして、表面観察に適した観察装置を提供することができる。例えば、光透過性の高い生体試料において、特に、表面状態を観察したいという要求が高いが、光の試料内への侵入度合いが大きいと、正確な表面画像の取得が困難になる。本装置では、光の試料内への侵入度合いが小さい観察画像から背景光成分とみなされた成分を除去し、標的光成分とみなされた成分にて観察対象面の画像を形成することができるので、測定面の本来の原画像との近似性が高く信頼性の高い観察結果を示すことができる上、ノイズの影響が抑制されて精緻さの向上した表示画像にて、観察結果を示すことができる。

請求項３記載の光学観察装置によれば、設定手段が分離係数を設定し、演算手段が分離係数で重みづけをした比較画像と観察画像とを加減算する演算を含む演算により標的光成分と背景光成分とを分離させているので、演算の方法が簡単であり、設定手段が分離係数の設定を変更するのみで演算の結果を変更することができる。

請求項４記載の光学観察装置によれば、設定された分離係数を用いた演算により、標的光成分と背景光成分との分離がどの程度行われたかを評価することができるので、かかる評価結果を指標としてより高評価となるように分離係数を設定することができる。

請求項５記載の光学観察装置によれば、数値入力手段にて分離係数が入力されると、その入力された分離係数を用いた演算結果である観察対象面の画像を表示手段に表示することができる。即ち、分離係数が入力されるごとに、観察対象面の画像を表示させることができるので、例えば操作者が、表示された画像を視認しながら分離係数を変更する入力操作を行うことができる。言い換えれば、表示された画像を視認しながら、分離係数を変化させていき、最終的に信頼性の高い観察対象面の画像を得るようにすることができる。

請求項６記載の光学観察装置によれば、分離係数を具体的に数１における、変数α、βとし、少なくともαを設定手段により観察画像中の背景光成分の分離係数として設定しているので、簡易に分離係数を設定でき、画像形成手段により観察対象面の画像を形成することができる。

請求項７記載の光学観察装置によれば、設定手段により、観察画像における背景光成分の分離係数としてαが、比較画像における標的光成分の分離係数としてβが設定される。そして、ＫＬ情報量算出手段が、設定されたαおよびβを数１に代入して標的光成分の画素値群ｆ_１’（ｉ，ｊ）と背景光成分の画素値群ｆ_２’（ｘ，ｙ）を算出し、画素値の確率密度分布であるｐ（ｙ_１ｉ）とｐ（ｙ_２ｊ）を算出し、周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）を算出し、数２を用いてＫＬ情報量を算出する。ＫＬ情報量は値が小さいほど周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）の一致度が高いことを示しているので、設定手段は算出されたＫＬ情報量が小さくなる方向に、次のαまたはβの少なくとも１つを変更して設定する。設定手段とＫＬ情報量算出手段がこの処理を繰り返すことでＫＬ情報量は小さくなるので、ＫＬ情報量が最小値に至ったと判断されれば、これは標的光成分と背景光成分とが最も独立した状態にあること、即ち、標的光成分と背景光成分が最適に分離された状態になったと判断でき、この時点のαおよびβを分離係数とすれば、観察画像における背景光成分の分離係数として適切な値を設定することができ、精度の良い観察対象面の画像を得ることができる。

また、分離係数αおよびβをＫＬ情報量が小さくなるよう設定を繰り返すことは、演算装置による処理にて実現することができるので、αおよびβを適正値になるよう操作者が試行錯誤しながら選定する作業を不要とすることができる上、適正な観察対象面の画像（観察結果）を得るための操作者の熟練性を不要として、装置の使い勝手を向上することができる。

請求項８記載の光学観察装置によれば、標本の観察対象面に対する光の入射角度を、照明手段が発光させる光源を変更することで変化させることができるため、機械的に光の入射角度を変更する場合に比べ、早い速度で入射角度の変更を行うことができる。すなわち、本装置によれば、極めて僅かなタイムラグで観察画像と比較画像とを取得することができる。例えば、化学反応を行わせつつ標本の状態変化を観察する場合などは、試料の状態が急速に変化することがあるが、本装置によればこのような場合でも、適切な観察対象面の画像を得ることができる。

請求項９記載の光学観察装置によれば、透光性の載置台に標本を載置し、載置台の内部側から光を照射するので、標本の観察対象面を平面にして光の入射角度を一定にでき、標本に対する光の侵入度合いを一定にできるので、適切な観察対象面の画像を得ることができる。

請求項１０記載の光学観察装置によれば、照明手段が励起光を載置台の表面の内側で全反射するように入射させているので、標本表面からの侵入度の浅い観察画像を撮像することができる。よって、表示手段に表示される画像は、標本の観察対象面における極表面の蛍光像にすることができ、かかる蛍光像を良好な精度で取得することができる。また、標本の観察対象面に平行な方向に沿って励起光が伝搬される一方で、観察対象面からの蛍光は、載置台の表面の法線方向で検出することができる。即ち、試料から発生する蛍光の蛍光強度が弱くとも、励起光とは進行方向が異なるため、強度の大きな励起光に埋もれることなく、適切に蛍光を検出することができる。

請求項１１記載の光学観察装置によれば、標本中の化学物質を酵素の作用下で反応させ、生成される化学物質由来の蛍光物質を励起光にて発光させて、撮像手段により蛍光画像を撮像することができるので、標本から放出される生理活性物質等の化学物質の二次元分布を精細な画像で得ることができる。照明手段が照射する光が励起光である場合、励起光の一部は試料内部に侵入し、試料そのものが蛍光体を含むときは背景光が発生し、画像の品質が低下する。本装置では、励起光を用いた場合でも、励起光の入射角度を異ならせて撮影した２つの画像を用いて演算を行うことにより、背景光を抑制した鮮明な画像を得ることができる。

例えば、酵素反応によって蛍光物質を生成させ、励起光照射により蛍光を発生させる場合、従来の技術では背景光を抑制するためには、酵素反応開始前にキャリブレーション用の初期蛍光像を撮影し、酵素反応開始後に蛍光像を撮影して、かかる蛍光像から初期蛍光像を差し引く方法が用いられている。しかし、酵素反応開始に伴う溶液の微細な変化で励起光の屈折率が変化する可能性があり、厳密には測定開始後の蛍光像から初期蛍光像を差し引いても、両者の蛍光強度の差が、標本から放出された化学物質濃度を反映するとは言えない。さらに、初期蛍光像は組織の状態によって変化する光量であるため、化学物質刺激や電気的刺激等で変化することが予想され、これらの刺激に伴う標本からの化学物質放出量の変化を測定しようとした場合には、刺激前の初期蛍光像を用いることは適切ではない。これに対し、本装置では、酵素反応開始後において、極めて僅かなタイムラグで撮像される複数の撮影画像を用いて背景光の影響を抑制した画像を形成できる。つまり、化学物質濃度を反映する適切な観察対象面の画像を得ることができる。

請求項１２記載の光学観察装置によれば、載置台の表面に固定する酵素は、ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼとコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の混合物（ＧＡＢａｓｅ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＤＨ）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のいずれかであり、蛍光元物質を存在させることにより、細胞から放出される化学物質と蛍光元物質とをこれらの酵素の作用下で反応させて蛍光物質を生成させるので、細胞からの放出についての観察が重要な神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸、乳酸、グルタミン酸、アデノシン三リン酸を、それぞれ検出することができる。また、特異性の高い酵素反応系であるので、高感度で、かかる神経伝達物質の二次元分布を測定することができる。

請求項１３記載の光学観察装置によれば、撮像手段は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラもしくはＣＭＯＳカメラであるので、装置コストを低廉化することができる。

また、本発明は光学観察装置の発明だけでなく、請求項１４に記載されるように光学観察方法の発明としても実行し得るものである。また、請求項１５に記載されるように、複数の異なる入射角度で光を照射して標本の観察対象面の撮影を行って得られた撮像画像データを処理する画像処理プログラムの発明としても実行し得るものである。

本発明の光学観察装置の１実施形態である蛍光検出システムの概略構成を示す図である。図１の測定装置に用いられる透明基板を詳細に説明する図である。第１の実施形態で行われる画像補正の原理を説明する図である。蛍光検出システムの電気的構成を示すブロック図である。蛍光検出システムのパーソナルコンピュータにて実行される測定処理のフローチャートである。図５の測定処理において実行される画像補正処理のフローチャートである。蛍光検出システムの測定装置において実行される測定実行処理のフローチャートである。第２実施形態で行われる画像補正の原理を説明する図である。第２実施形態において実行される画像補正処理のフローチャートである。実施例において測定した蛍光強度の画像データと補正結果を示した図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照して説明する。本発明は、観察対象の標本に対し、光の照射と観察とを同じ対面側から行い、その観察結果を撮像する光学観察装置と光学観察方法であって、標本に対する光の入射角度を変えて複数の画像を撮像することで観察画像中の背景光を擬似的に特定し、かかる背景光を除去することで、観察像の原画像を再構築するものである。

本発明は、反射型（落射型）顕微鏡、全反射顕微鏡などの光学顕微鏡や、蛍光顕微鏡、マイクロスコープなどの、標本観察を行う光学観察装置に適用できる。

図１は、本発明の第１の実施形態の蛍光検出システム１００の概要を示した概観図である。本実施形態では、生体試料を標本とし、標本表面またはその近傍に生成される生理活性物質の二次元的濃度分布（空間分布）を、蛍光にて観察でき、また、蛍光強度から濃度を測定することができるようになっている。

図１(ａ)にはシステム全体の概略図を示し、図１(ｂ)には、酵素が固定された基板である透明基板１０の表面部分拡大図を示している。本実施形態の蛍光検出システム１００では、透明基板１０上に細胞組織Ｓが載置され、透明基板１０の裏面側から細胞組織表面の観察が行われる。ここで、細胞組織Ｓが生成する非蛍光性の生理活性物質を検出するために、本実施形態では、基板に固定された酵素の作用下でかかる生理活性物質を特定の蛍光元物質と反応させ、この反応過程で該蛍光元物質が蛍光物質に変換されることを利用する。つまり、非蛍光性の生理活性物質が、他の蛍光物質が発する蛍光を検出することで代用検出され、その蛍光発光の強度により、当該生理活性物質の二次元的濃度分布情報を得ることができるようになっている。

この蛍光検出システム１００は、図１に示すように、細胞組織からの生理活性物質を検出するための反応場と光学系とが備えられた測定装置１と、その測定装置１を制御するとともに生理活性物質の濃度分布を画像で表示するパーソナルコンピュータ（以下、単に「ＰＣ」と略す。）２０とを備えており、細胞組織上において生理活性物質がどのように分布しているか、即ち、ある面積を有する二次元平面での濃度分布（空間分布）がどのようになっているかを観察、測定するようになっている。測定装置１とＰＣ２０とはケーブル１９を介して相互に接続されている。

測定装置１は、測定対象の細胞組織Ｓに対し酵素反応によって蛍光を生じさせる反応場を備えており、反応によって生じる蛍光物質に励起光を照射すると共に、生じた蛍光を検出（撮像）するように構成されている。この測定装置１は、光源ユニット７、透明基板１０、集光レンズ１１、光検出器１２、ＣＣＤカメラユニット１３、基板保持部１６を備えている。

光源ユニット７は、透明基板１０の側方に配設されており、透明基板１０の端面に向けて光を照射するものである。この光源ユニット７は、非図示のハウジングを備えており、このハウジング内に光源８とＬＥＤドライバ装置９とが収納されている。

光源８は、蛍光物質を励起する光を照射するためのものであり、発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられている。本実施形態において光源８から照射される照射光（励起紫外光）は、単色光であり、バンドパスフィルタを不要としている。光源８からの励起光の波長は、蛍光物質を励起できる波長であれば特に限定されない。一般に、蛍光物質は、吸光度が高い波長であるほど、より励起状態への遷移が生じやすく、吸光極大の波長が照射された場合に励起状態への遷移が最も活発になる。

詳細は後述するが、透明基板１０の表面は酵素反応の反応場となるものであって、透明基板１０の表面には酵素が固定化されており、透明基板１０上にセットされた細胞組織Ｓから生理活性物質が放出されると、蛍光物質が生成されるようになっている。この蛍光物質を励起させる波長を有するＬＥＤが光源８に選択されている。本実施形態では、蛍光物質は、３４０ｎｍの波長に吸光極大を有する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）であるので、これらの吸光極大近傍で十分に励起が可能な励起紫外光（ＵＶ３６０ｎｍ）を出力するＬＥＤが用いられている。

尚、光源８は、生成される蛍光物質を励起する励起光を照射するものであれば特に限定されるものではなく、ＬＥＤ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプからなる群から選択されるものの一つであれば良い。また、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプを用いる場合には、測定対象とする蛍光物質に応じて適切な励起光が照射されるように適当なフィルターが用いられる。

光源８が点灯すると、光源８からの照射光が光路Ｌ１（図１（ａ）において一点鎖線の矢印Ｌ１にて示す）を進行し、透明基板１０の端面へ入射される。入射した光は、Ｌ１方向として示すように、透明基板１０の表面の平行方向に沿って、ほぼ直線状に進行する。そして、その光によって、透明基板１０上に載置された細胞組織Ｓの載置面（観察対象面）を照明する。つまり、光源８からの照射光は、少なくともその一部が、細胞組織Ｓが載置された状態で、進行方向に対して側面となる方向（透明基板１０の表面の法線方向、光路Ｌ２）へ出射する側面光となって、細胞組織Ｓの載置面（観察対象面）を照明する。

この側面光は、直接光と同じ波長の光として扱うことができ、細胞組織Ｓの観察対象面への入射角を大きくすることによって細胞組織Ｓの観察対象面のごく浅い部分のみに到達させることができる。即ち、側面光により、細胞組織Ｓ表面の極浅い部分の光学的情報を取得することができる。

本実施形態においては、光源８には、発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられており、光源ユニット７には、第１ＬＥＤ８ａと第２ＬＥＤ８ｂとの２つの光源が設けられている。第１ＬＥＤ８ａおよび第２ＬＥＤ８ｂには、同じ種類のＬＥＤが用いられている。この第１ＬＥＤ８ａと第２ＬＥＤ８ｂとは、図示を省略しているが、上下方向に可動可能に軸支されており、非図示の調整ダイヤルを操作することにより、その操作量に応じて取付角度を変更できるようになっている。これにより各ＬＥＤ８ａ，８ｂからの照射光の透明基板１０の表面（細胞組織Ｓの観察対象面）への入射角度を調整できるようになっている。

ここで、第１ＬＥＤ８ａと第２ＬＥＤ８ｂとは、異なる取付角度で設置されており、第１ＬＥＤ８ａからの照射光の細胞組織Ｓの観察対象面への入射角が、第２ＬＥＤ８ｂからの照射光の細胞組織Ｓの観察対象面への入射角よりも大きくなるように、取付角度は調整されている。つまり、第２ＬＥＤ８ｂからの照射光は、第１ＬＥＤ８ａの照射光よりも、より深く、細胞組織Ｓへ侵入する。入射角が、ある一定の角度（臨界角）以上の場合に全反射が起こるが、第１ＬＥＤ８ａからの照射光も、第２ＬＥＤ８ｂからの照射光も、原理的には透明基板１０内で全反射し得る臨界角以上となるように、両者の取付角度は調整されている。

尚、本実施形態において、入射角とは、基板面（透明基板１０）に対する法線と光の進行方向ベクトルがなす角度のこととされている。このため、この入射角が小さいほど透明基板１０の表面に対し垂直近い状態で入射していることになる。

第１ＬＥＤ８ａおよび第２ＬＥＤ８ｂは、それぞれ２の端子を備えており、一方の端子はＬＥＤドライバ回路９の出力側と電気的に接続されており、他方の端子は、接地されている。

ＬＥＤドライバ装置９は、測定装置１のＣＰＵ２（図４参照）からの制御信号に応じてＬＥＤ８ａ，８ｂを駆動させるものであって、ＬＥＤ８ａ，８ｂに所定の電圧を供給する回路である。各ＬＥＤ８ａ，８ｂのぞれぞれに対応する電源９ａ１，９ａ２と、開閉器９ｂ１，９ｂ２と、抵抗９ｃ１，９ｃ２とが各１ずつ備えられている。各電源９ａ１，９ａ２の負極側は接地されており、正極側はＬＥＤをオンとオフとに切り替える開閉器９ｂ１，９ｂ２に接続されている。開閉器９ｂ１，９ｂ２のオンにより対応するＬＥＤ８ａ，８ｂには抵抗９ｃ１，９ｃ２を介して電圧が供給され、接続されるＬＥＤ８ａ，８ｂが発光する。また、開閉器９ｂ１，９ｂ２のオフにより電圧供給が停止し、接続されるＬＥＤ８ａ，８ｂは消光する。

尚、各電源９ａ１，９ａ２の電源は可変電源となっている。可変電源は、可変抵抗器等を備えた一般的な回路で構成され、ＬＥＤ８ａ，８ｂに供給する電圧を、ＬＥＤ８ａ，８ｂから透明基板１０端面への入射光角度に応じて調整するためのものである。透明基板１０を介して細胞組織Ｓに到達するＬＥＤの光量は、入射角度に応じて異なる。本実施形態では、各ＬＥＤ８ａ，８ｂは、異なる入射角度でそれぞれ細胞組織Ｓを照明するので、入射角度が異なっても１５のカメラに達する蛍光の平均が同程度となるように、入射角度に応じて電圧可変回路で電圧を変更し、照射光強度が調整されるようになっているのである。具体的には、入射角度が小さくなるほど低い電圧が印加され、視野内の平均蛍光量が概ね一定となるように調整されている。

これにより、対になる第１画像データと第２画像データの２枚の画像は、明るさが同程度となり、好ましい。

尚、図示を省略しているが、入射角度を調整する調整ダイヤルの値は、可変電源に設けられた可変抵抗器と連動しており、この調整ダイヤルの値に基づきＬＥＤ８ａ，８ｂへの出力電圧が変更されるようになっている。よって、本実施形態では、第１ＬＥＤ８ａに相対的に高い電圧が印加され、一方、第２ＬＥＤ８ｂには相対的に低い電圧が印加される（照射光量は減少）こととなる。

本実施形態においては、開閉器９ｂ１，９ｂ２は半導体からなる無接点リレーで構成されており、ＣＰＵ２からの制御信号に応じて、オンとオフとが切り替えられるようになっている。また、一方のＬＥＤの発光中には他方のＬＥＤは発光しないように、開閉器９ｂ１がオンの場合には開閉器９ｂ２はオフとなり、開閉器９ｂ１がオンの場合には開閉器９ｂ２はオフとなるように制御信号が入力される。

かかる開閉器９ｂ１，９ｂ２には信号線が接続されており、開閉器９ｂ１，９ｂ２のオンと同期して、いずれのＬＥＤに電圧供給がされたかを示すトリガー信号が出力されるようになっている。出力されたトリガー信号は、ＣＣＤカメラユニット１３に直接入力される。

信号線とトリガー信号出力端子との間には、電気信号により開閉を切り替えるリレーが配置されている。光源点灯コマンドを受信してから、測定実行コマンドを受信するまでにタイムラグがある。この間に第１ＬＥＤ８ａおよび第２ＬＥＤ８ｂのオンに伴ってトリガー信号がＣＣＤカメラユニット１３に入力されることを回避するために、初期状態において該リレーの接点は開放されており、ＣＰＵ２からの電気信号が入力されることにより閉じ導通状態が形成される。

透明基板１０は、測定対象の組織細胞Ｓが載置される基板であって、矩形形の板状に形成されている。基板保持部１６によって保持され、ＣＣＤカメラユニット１３の上方に配置されている。透明基板１０は、透明性の基板であり、光源８からの照射光は全反射するため照射光の光導波路となっている。この透明基板１０は高屈折材料にて形成されており、石英、ガラス（重フリントガラス）、サファイアなどの結晶やＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）などのアクリル樹脂を用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、基板表面が導波路全長にわたってＬＢ膜でディップコートされたものであっても良い。尚、励起光の照射により透明基板１０が大きく発熱する場合には、透明基板１０には耐熱性の高い石英やガラスなどが用いられる。また、透明基板１０の材質としては、励起光の波長に対して吸収がないものが好ましい。本実施形態の透明基板１０には石英が用いられている。
なお、基板の材料によっては低波長の光を通さない、または選択的に通すという事態が起こる。このため、必要とする波長に応じた基板材料が適宜選択される。

この透明基板１０の表面および裏面は、高度な平滑性を備えており、例えば、その表面粗さが、入射光の波長と同程度以下となるように形成されている。上記したように、測定装置１においては、透明基板１０の端面から入射された光は、透明基板１０の表面内側で全反射して入射側とは反対側の端面から出射するように設計されている。即ち、透明基板１０は導波路として構成されている。

基板保持部１６は、透明基板１０を略水平に保持するものであり、光路方向Ｌ１に沿って所定間隔を隔てて立設された２つの支柱１６ａと、当該２つの支柱１６ａに架設された天板１６ｂとを、測定装置１の前面側と奥方側とに一対で備えている。天板１６ｂは、透明基板１０の表面に対し、その表面の端部近傍の狭い範囲に当接する幅で形成された板状部材である。透明基板１０は、一対で設けられた天板１６ｂに載置することで、対向する二辺側の端部が支持され、４本の支柱に架設された状態で保持される。

ここで、透明基板１０の表面は酵素反応の反応場となるものであって、透明基板１０の表面には、酵素が固定化されている。また、本実施形態においては、測定に際しては、透明基板１０の表面に蛍光元物質となる補酵素が供給される。

蛍光元物質とは、分析対象の生理活性物質と反応することにより、蛍光物質を生成するものを意味している。蛍光元物質とは、最終生成物が蛍光物質となればよく、必ずしも１種類の物質には限られず、２種類以上の物質の混合物を含んで構成されても良い。このとき、蛍光物質に変化するものとしては、生理活性物質であっても、蛍光元物質のいずれでもよい。すなわち、生理活性物質と蛍光元物質とが反応し、その結果として生成したもの（１つの物質、或いは２つ以上の物質でもよい）の少なくとも１つが蛍光物質として励起光により蛍光を発すればよい。

この蛍光元物質としては、補酵素を用いることができる。本実施形態では、この補酵素、即ち、蛍光元物質として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ，ＮＡＤ＋）またはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ，ＮＡＤＰ＋）が好適に用いられる。このような酵素担持基板を用いると、透明基板１０上にセットされた細胞組織Ｓから生理活性物質が放出されると、酵素が作用し、その酵素反応により共存する蛍光元物質が蛍光物質（ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ）に変化する。このため、側面光によって励起され蛍光が発生する。

本実施形態では、発生した蛍光のうち、透明基板１０の下方側（二点鎖線の矢印Ｌ３で示す方向）に向かう蛍光を検出するように測定装置１は構成されている。

尚、検出対象の生理活性物質そのものが蛍光物質である場合には、透明基板１０は酵素担持基板である必要はなく、また、酵素反応によって生成される物質が蛍光物質である場合は蛍光元物質である補酵素は不要である。

集光レンズ１１は、透明基板１０を挟んで、光源ユニット７と反対側に配設されている。光源ユニット７から透明基板１０の端面へ入射され、透明基板１０内を表面の平行方向に沿って伝搬して入射側と反対側の端面から出射した励起紫外光を集光して、光検出器１２に入力するためのレンズである。この集光レンズ１１は、可動可能に保持されており、操作者の操作によって透明基板１０の端面に対する角度を変更できるようになっている。

光検出器１２は、励起紫外光Ｌ１の光路上において、集光レンズ１１の後方に設置されている。光検出器１２は、集光レンズ１１を介して入射された入射光の強度をフォトダイオードで電気信号強度に変換して検出するものである。検出器１１での検出信号は、ＰＣ２０へ出力されるようになっており、操作者は、ＰＣ２０にて表示される検出結果に基づいて、光源８からの照射光の入射角を調整することができる。また、光源８の正常な発光を確認することができる。

ＣＣＤカメラユニット１３は、透明基板１０の下方に配設されており、細胞組織Ｓから下方へ向かって放出される蛍光を受光し、細胞組織Ｓの撮像（光学的情報の取得）を行うものである。このＣＣＤカメラユニット１３は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラとして構成されている。ここでいうピンホール機能とは０．０５〜０．５ｍｍ径の孔（光の導入孔）から光を導入し、焦点距離が２０ｍｍ以下の小型化されうるカメラ機能を意味している。このＣＣＤカメラユニット１３は、結像レンズ１４とＣＣＤ１５とを備えている。結像レンズ１４は、本体上面に設けられた光の導入孔の下方に配設され、更に結像レンズの下方にＣＣＤ１５が配設されている。細胞組織Ｓから放射された蛍光は、光の導入孔から取り込まれ、結像レンズ１４を介してＣＣＤ１５の表面に像が結ばれる。

ＣＣＤ１４は光電変換素子であり、主に、光を感知する受光部(センサ)と、光電変換された電荷を垂直転送する垂直転送部(垂直レジスタ)と、水平転送する水平転送部(水平レジスタ)とから構成される一般的なものである。取り出された電荷は出力回路で電圧に変換される。

本実施形態の測定装置１では、上記したように透明基板１０の下方に配設され、組織細胞Ｓから放出される光路Ｌ３方向の蛍光をＣＣＤカメラユニット１３にて受光する。つまり、ＣＣＤカメラユニット１３は、励起光Ｌ１の光路とは重ならない位置（励起光の光路と直交する方向）に配置されており、組織細胞Ｓから下方に放射される光路Ｌ３の蛍光を受光する。このため、透明基板１０内の光路Ｌ１を伝播する励起光とは分離して、組織細胞Ｓからの光学情報である蛍光をＣＣＤ１５に入力することができ、ダイクロイックミラー、カットフィルタ等を不要とすることができる。ＣＣＤカメラユニット１３にて取得された画像信号は、測定装置１からケーブル１９を介してＰＣ２０へと出力される。

尚、本実施形態では蛍光検出にＣＣＤカメラを用いたが、無限焦点で近接撮影可能であればこれに限られるものではなく、例えば蛍光顕微鏡もしくはピンホール機能を備えたＣＭＯＳカメラを用いることができる。また、ピンホールを備えたカメラ構造とすることにより、結像レンズの手前（光路方向手前）の対物レンズを不要とでき、その分、カメラ本体を小型化することができる。尚、装置サイズを小型化する必要がない場合には、ピンホールに代えて対物レンズを備えたカメラ構造としても良い。

ＰＣ２０は、測定装置１を制御するコンピュータであって、大容量の記憶装置であるハードディスクドライブ（ＨＤＤ）２４と、表示装置である液晶ディスプレイ（以下、単に「ＬＣＤ」と略す。）２７と、入力装置であるキーボード２８とを備えている。操作者はキーボードからコマンドを入力することで測定装置１に測定を実行させることができる。測定装置１から入力した細胞組織Ｓの画像データにより作成された画像（蛍光画像）は、ＬＣＤ２７に表示される。

また、ＰＣ２０は、測定装置１に生理活性物質の測定を実行させるのみならず、操作者のキーボード２８からのコマンド入力に基づいて、測定装置１の光検出器１２で取得した信号をＬＣＤ２７に表示させることができるようになっている。このため、操作者は、ＬＣＤ２７に表示される表示結果を見ながら測定装置１の光源８から出射された光の光路調整を行うことができる。

図２は、本実施形態の測定装置１に用いられる透明基板１０を詳細に説明する図であり、図２（ａ）は、透明基板１０の構成を模式的に示した部分断面図である。図２（ａ）においては、紙面上側が透明基板１０の表面側となるように図示されている。また、固定された酵素を楕円形状で模式的に示している。図２（ａ）に示すように、この透明基板１０の表面側、即ち細胞組織Ｓの載置面には、酵素が全体に一様に配列されており、化学的結合によって、透明基板１０表面に固定されている。

図２（ｂ）は、図２(ａ)の微小領域IIの部分拡大図であって、透明基板１０が、生理活性物質の１種であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）等のヌクレオチド関連物質を測定することを目的に構成された酵素担持基板である場合の図である。図２（ｂ）においては、紙面の左右方向が上下方向（透明基板１０の平面に直交する方向（厚み方向））となっており、酵素としては、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（以下、単に「ＧＡＰＤＨ」と称す場合がある。）が用いられている。

ＧＡＰＤＨは、図２（ｂ）に示すように透明基板１０に固定されている。検出対象の生理活性物質がＡＴＰである場合、ＡＴＰは、ＧＡＰＤＨの作用で下記反応式に示す反応によってＧＡＰリン酸化のリン酸供給源として消費される。

ＧＡＰ＋ＡＴＰ→１,３−ビスホスホグリセリン酸＋ＡＤＰ
ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ

この場合、蛍光元物質としては、ＮＡＤ（ＮＡＤ＋）とＮＡＤＰ（ＮＡＤＰ＋）とのいずれか一方を用いても良く、両者を混合して用いても良い。発生するＮＡＤＨが発する蛍光を検出することで、ＡＴＰの存在が検出されることとなる。

また、上記したＧＡＰＤＨの酵素反応は、リン酸要求性である。従って、測定時に用いられる緩衝液は、リン酸を含有しないものが用いられる。このような緩衝液としては、例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが例示される。

尚、このＧＡＰＤＨ固定化基板を用いた場合、測定対象はヌクレオチド関連化学物質となり、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドであり、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンのいずれかのリボヌクレオシド、又はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンのいずれかのデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合したものである。尚、リン酸基のないものは検出されないので、類似した構造体であるヌクレオシドの影響をうけることなく、ヌクレオチドを選択的に検出することができる。

本実施形態においては、ＡＴＰ等のヌクレオチド関連物質以外に、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸、乳酸、スクロース、グルコース、フルクトースの測定が可能である。また、ガンマアミノ酪酸を測定する場合には、酵素としてＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼとコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の混合物）を、蛍光元物質としてＮＡＤＰを用いることができる。グルタミン酸である場合には、酵素としてＧＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、蛍光元物質としてＮＡＤを用いることができる。乳酸の場合には、酵素としてＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、蛍光元物質としてＮＡＤを用いることができる。しかしながら、これらの組み合わせに限られるものではない。

また、図２（ｂ）に示すように、ＧＡＰＤＨは、その末端側においてシッフ塩基を形成してシラン化合物と結合しており、このシラン化合物を介して石英（ＳｉＯ_２）である透明基板１０表面に固定化されている。

例えば、タンパク質である酵素の末端アミノ基（Ｎ末端）を、透明基板１０に結合されたアミノシラン化合物と反応してシッフ塩基を形成し、結合を形成することができる。

シラン化合物は、いわゆるシランカップリング剤であり、脱水縮合反応によって無機化合物（石英）の表面と共有結合を形成するものである。

シッフ塩基を形成するシラン化合物としては、例えば、アミノシラン化合物が選択され、具体的には、Ｎ−２−（アミノエチル）−3−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチル-ブチリデン）プロピルアミン、Ｎ−フェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ビニルベンジル）−２−アミノエチル−３−アミノプロピルトリメトキシシランの塩酸塩、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）などが例示される。尚、本実施形態においては、３−アミノプロピルトリメトキシシランが用いられている。

図２（ｂ）には、ＧＡＰＤＨを例示したが、他の酵素においても、上記と同様の手法にて、透明基板１０の表面に固定化することができる。また、酵素は、Ｎ末端とＣ末端とを備えており、Ｎ末端固定（Ｎ＝Ｎ）およびＣ末端固定（Ｃ＝Ｎ）のいずれかの様式で固定することができる。

尚、生理活性物質は、上記したものに限られるものではなく、また、生理活性物質から蛍光物質を生成できる反応系であれば、上記酵素反応系に限定されるものでもない。また、透明基板１０の表面に固定する酵素は１種類に限定されるものではなく、複数種類であっても良い。

更には、蛍光元物質であるＮＡＤ、ＮＡＤＰをゲル化し、または透明基板１０へ固定化しても良い。これによって、透明基板１０に標本を載置するだけで測定を開始でき、更には、蛍光元物質の供給が不要であるため、基板と標本との位置関係が、基板上面に標本を載置することに限定されず、例えば、標本上面に透明基板１０を載置し標本上側表面を観察することも可能である。上記の反応系では、生理活性物質の反応モル量と蛍光物質の生成モル量とは同じであるので、ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の蛍光強度を測定すれば、生理活性物質の濃度を測定できるのである。

このように透明基板１０の表面に酵素を固定することにより、透明基板１０上に細胞組織Ｓを載置すると、透明基板１０と細胞組織Ｓとの間に、酵素が存在することとなる。そして、酵素の作用下で、細胞組織Ｓから放出された生理活性物質に基づいて蛍光物質が生成されるので、かかる蛍光物質の濃度分布がＬＣＤ２７に二次元の蛍光画像で示される。また、上記したような酵素反応を用いた場合、反応速度はｎ秒オーダーからｍ秒オーダー（１００ｍｓ以下）で迅速に反応するため、細胞組織へのダメージを抑制でき、得られる検出結果の信頼性を向上させることができる。

更に、上記した反応は常温常圧で進行する酵素反応であるため、細胞組織に対する負荷が軽微である。このため、反応場にセットされた細胞組織が直ちに生理活性を失うといったことがなく、細胞組織からの生理活性物質放出状態の経時変化を、蛍光検出によって測定することができる。

図３は、蛍光検出システム１００にて実行される画像処理の原理を説明する図であり、図３（ａ）は、透明基板１０上に細胞組織Ｓを載置した場合に観察される観察光の状態を概念的に説明する図であり、図３（ｂ）は、ＰＣ２０で実行される画像処理の概要を説明する図である。

上記したように、透明基板１０の端面から入射された光は、基板内をＬ１方向に伝搬し、透明基板１０の基板界面（表面）に到達すると、基板界面で反射する。ここで、全反射する入射角θ０で進入した光は基板界面で全反射するとともに、透明基板１０の表面側に僅かであるがしみ出す光が発生する。理想的には、かかる全反射によって生じる染み出し光により、細胞組織Ｓの表面において、極めて浅い領域のみが照明され、かかる表面層の情報を取得することが可能となる。

しかし、基板上に屈折率が大きい水分や生体組織が付着していると、図３（ａ）に実線矢印で示すように、入射光は細胞組織Ｓの内部に入射角θｘで侵入する（光路Ｌ２、側面光）。通常、細胞組織内には多くの蛍光物質が内在しているため、細胞組織内に侵入した側面光によって組織内の蛍光物質が励起され、これに由来する蛍光が発生する。

概念を簡単に説明するため、光軸（Ｌ１）方向に進行する平面波（光源８からの入射光）が透明基板１０と細胞組織Ｓとの界面（点Ｐ_０）に入射するものとする。観察者が所望する観察されるべき蛍光は透明基板１０上の酵素担持面である界面内で発生する。これを標的光とする。

一方、細胞組織Ｓ内において、蛍光物質は奥行方向の至る処に分布しており、Ｚ軸（図３（ａ）において紙面上下方向）上の各点Ｐ_ｋに入射した平面波の強度と各点Ｐ_ｋの蛍光物質分布により各点Ｐ_ｋの蛍光強度が決定される。座標点(ｘ，ｙ)における細胞組織Ｓ内の蛍光強度は、Ｚ軸上の各点からの蛍光を、減衰を考慮してＺ軸方向に積分した値となる。これは本来観測されるべきでない蛍光であり、画像上ではノイズとなる。これを背景光とする。

従って、透明基板１０の裏面側から観察される点Ｐの実際の観察画像（測定装置１による撮像画像）は、標的光によって可視化される界面の蛍光像と、背景光によって可視化される細胞組織Ｓ内部の蛍光像とが重なりあった画像Ｆ_１となる。

ここで、平面波の入射角が変わると、標的光の強度が変わる。さらに、背景光についても、入射光が蛍光物質に至る経路が変わるので、入射光の減衰量が変化する。即ち、透明基板１０の下方に設置したＣＣＤカメラユニット１３が観測する蛍光強度は、標的光と背景光の強度の和となるが、両者の比率は光の入射角度に依存する。言い換えれば、入射角が変化すると標的光と背景光の混合比が変化する。

実際には界面に入射する光束は、フーリエ光学の原理によって異なる角度で入射する平面波に分解される。平面波成分の入射角は光軸角の周辺に分布し、通常は光軸と同じ角度をもつ平面波の成分が最も大きい。この場合、各平面波成分に対する蛍光を合成して得られる光強度が観測されるが、光の入射角の変化によって標的光と背景光の混合比が変化することに変わりはない。

図３（ｂ）に示すように、例えば、光の入射角θ１およびθ２を設定し、それぞれにて観測される観察画像をＦ_１およびＦ_２とする。観察画像Ｆ_１およびＦ_２は、実際に観察して得られる画像データ（第１画像データ、第２画像データ）であり、各座標(ｘ，ｙ)の蛍光強度を示す画素値の集合Ｆ_１(ｘｉ, ｙｊ)およびＦ_２(ｘｉ, ｙｊ)で形成される。

ここで、励起光が達する範囲内で蛍光物質の分布は奥行方向(z方向)に一様であると仮定すると、酵素担持面（界面）内の蛍光物質の分布（標的光の画像）および細胞組織Ｓ内部の蛍光物質の分布（背景光の画像）は、それぞれｆ_１およびｆ_２と表わすことができる。標的光画像ｆ_１および背景光画像ｆ_２は、それぞれ、各座標の蛍光強度を示す画素値の集合ｆ_１（ｘ，ｙ）およびｆ_２（ｘ，ｙ）で形成することができる。

蛍光物質の分布と画像強度の関係は、式（３）にて表すことができる。
ａ１１，ａ１２，ａ２１，ａ２２は定数である。即ち、標的光画像ｆ_１と背景光画像ｆ_２は、それぞれ未知であるが、観察画像Ｆ_１は、ある割合ａ１１の標的光画像ｆ_１と、ある割合ａ１２の背景光画像ｆ_２とが合算されたものであり、同様に観察画像Ｆ_２は、ある割合ａ２１の標的光ｆ_１画像と、ある割合ａ２２の背景光画像ｆ_２とが合算されたものとすることができる。これを簡略化した行列を用いて、Ｆ＝Ａ・ｆと表現すると、行列Ａの逆行列Ａ^−１を求めてＦに乗じることにより、酵素担持面内と細胞組織Ｓ内部の蛍光強度を分離することが可能となる。つまり、この割合ａ１１，ａ１２を求めることができれば、目的の標的光画像ｆ_１は、取得した観察画像Ｆ_１から導出できることとなる。

実用上は標的光の絶対値ではなくコントラストが得られればよいので、行列Ａ^−１は、以下の数４のように書き変えてもよい。
これにより、上記の数１の行列式が導かれる。すなわち、光軸の角度を変化させることにより標的光と背景光の混合比率を変化させた２枚の画像Ｆ_１およびＦ_２を取得すれば、αとβを適当に選択することにより、標的光画像ｆ_１と背景光画像ｆ_２の情報を分離することが可能となる。

尚、本実施形態では、画素値は正負の値をとれるように構成される。仮にデータ取り込みが符号なし１バイト整数でも、一旦浮動小数点数に変換してしまえば、画素値が最大値（２５５）を超えても問題なく処理することができる。実際には、αとβは負の値となり、状況によっては復元された画像が「ネガ」表示になることがあるが、実用上は標的光の絶対値ではなくコントラストが得られればよいので、形成された画像が「ネガ」表示であっても反転されてみれば正しい「ポジ」画像表示となる。

ここで、背景光の影響が小さくなるほど（背景光の画像情報が除去されるほど）得られる画像は鮮鋭化される。従って、取得した観察画像Ｆ_１，Ｆ_２を元に、αとβとを任意の値に設定して標的光画像ｆ_１、背景光画像ｆ_２を擬似的に形成させ、その表示結果を確認しながら、手動操作によりαとβとを選択、調整すれば、現実の細胞組織Ｓ表面の蛍光像に近似する標的光画像ｆ_１’と背景光画像ｆ_２’とを導き出すことができる。尚、本実施形態では、目的の観察対象面は細胞組織Ｓ表面であるので、βは任意の値（デフォルト値）とし、αのみを選択、調整し、標的光画像ｆ_１’を形成するように構成されている。

図４は、蛍光検出システム１００の電気的構成を示すブロック図である。蛍光検出システム１００は、測定装置１とＰＣ２０とを備え、両者はケーブル１９によって相互に接続されている。

測定装置１は、上記したように、細胞組織Ｓから放出された生理活性物質を検出するための装置であり、演算装置であるＣＰＵ２と、そのＣＰＵ２により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリであるＲＯＭ３と、各種のデータ等を一時的に記憶するためのメモリであるＲＡＭ４と、入出力ポート６と、光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１７とを備えている。図７に示すフローチャートのプログラムは、制御プログラムの一部としてＲＯＭ３に記憶されている。

ＣＰＵ２、ＲＯＭ３、ＲＡＭ４は、バスライン５を介して互いに接続されており、バスライン５は、また、入出力ポート６にも接続されている。この入出力ポート６は光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１８とにそれぞれ接続されている。

ＣＰＵ２は、ＰＣ２０から送信されたコマンドを解読し、コマンドに応じて測定装置１の各部を制御する。ＰＣ２０から送信されたコマンドが、光源点灯コマンドである場合には、ＣＰＵ２は光源ユニット７のＬＥＤドライバ装置９に制御信号を出力して、光源８を点灯させる。測定開始に際しては、ＰＣ２０から、測定実行を指示する測定実行コマンドと、測定条件（測定時間、タイムラプス、撮影フレーム数等）とが送信される。この測定実行コマンドを受信すると、ＣＰＵ２は、設定された撮影フレーム数と測定時間とに基づいて撮像画像のサンプリングタイムを設定する。

ここで、サンプリングタイムは撮像画像を取得(撮影)する間隔であるが、本実施形態では、標的の撮像画像を得るために入射角度の異なる複数の（２つの）画像の撮影を要する。かかる２つの撮像画像は対であり、極力同じタイミングで撮像されることが望ましい。このため、本実施形態においてサンプリングタイムは、対で撮影される２の画像を１回のサンプリングとしてカウントする態様で、サンプリングタイムが設定される。このため、サンプリングタイムに従って画像取得を図ると共に、１のサンプリングタイムの間に、一方の画像を撮像してから直ちに他方の画像の撮影ができるように、開閉器９ｂ１のオンおよびオフ、開閉器９ｂ２のオンおよびオフを指示する制御信号を生成し、測定時間中、継続して、所定のタイミングで、ＬＥＤドライバ装置９へ出力する。

更に、ＣＰＵ２は、開閉器オンオフの制御信号の入力を契機とし、ＣＣＤカメラユニット１３での撮像のトリガーとなるトリガー信号の出力を、ＬＥＤドライバ装置９に開始させる。また、撮像開始と共に、内蔵されるタイマ回路にて測定時間の計測を行い、測定時間終了時に画像信号の取得を停止させる電気信号をＬＥＤドライバ装置９へ出力する。

ＣＣＤカメラユニット１３は、ＣＣＤ１５とＡ／Ｄコンバータ１６とを備え、細胞組織Ｓの蛍光画像の撮像を行うものであって、制御部１４によってその動作が制御される。ＣＣＤ１５にて取得された各画素の信号（撮像信号）は、それぞれアンプにて増幅された後、電圧値に変換され、更にＡ／Ｄコンバータ１６によってデジタルデータに変換される。ＣＣＤ１５の全画素の一群の画素データにて、１フレームの画像データが構成される。制御部１４は、ＬＥＤドライバ装置９からのトリガー信号の受信を契機として撮像を実行し、得られた画像データは、トリガー信号が示す入射角に対応つけて撮像メモリ１７ｂに記憶され蓄積される。撮像メモリ１７ｂに記憶された画像データは、測定終了を示す信号を受信することによりインターフェース１８を介してＰＣ２０へ出力される。

尚、本実施形態では、ＣＣＤカメラユニット１３は、光の強度（輝度）を検出するものであり、画素値はモノクロデータとなっている。尚、ＰＣ２０の処理によって輝度値から模擬的にカラー画像データ（ＲＧＢデータ）を形成することが可能となっている。

ＰＣ２０は、上記したように、測定装置１での各処理を制御するものであり、演算装置であるＣＰＵ２１と、ＲＯＭ２２と、ＲＡＭ２３と、ハードディスクドライブ（以下「ＨＤＤ」と称す）２４と、入出力ポート２６と、表示装置であるＬＣＤ２７と、入力装置であるキーボード２８と、インターフェース２９とを備えている。

ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２、ＲＡＭ２３、ＨＤＤ２４は、バスライン２５を介して互いに接続されており、バスライン２５は、また、入出力ポート２６にも接続されている。この入出力ポート２６は、ＬＣＤ２７と、キーボード２８と、インターフェース２９とにそれぞれ接続されている。

ＣＰＵ２１は演算装置であり、ＲＯＭ２２やＨＤＤ２４に記憶されるプログラムを実行するものである。

ＲＯＭ２２は、ＣＰＵ２１により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリである。

ＲＡＭ２３は、各種のデータ等を一時的に記憶するための書換可能なメモリであり、ＣＰＵ２１が各種プログラムを実行する際、変数などを一時記憶するワークエリアや、後述するＨＤＤ２４の測定装置制御プログラムに記憶される制御プログラムの実行時にその制御プログラムが一時的にロードされるロードエリアを有している。また、ＲＡＭ２３は、設定値メモリ２３ａと、変数メモリ２３ｂと、第１画像メモリ２３ｃと、第２画像メモリ２３ｄと、補正画像メモリ２３ｅとを備えている。

設定値メモリ２３ａは、測定条件を記憶するためのメモリである。蛍光検出システム１００は、操作者の入力に基づいて測定装置１に実行させる測定条件を任意に設定することができるようになっている。操作者によって入力される測定条件は、測定時間、タイムラプス、撮影フレーム数、アンプゲインである。後述する測定処理にて操作者から測定条件が入力されると、入力された項目の値がこの設定値メモリ２３ａに書き込まれ、先に記憶される値が更新される。ＣＰＵ２１は後述する測定処理が実行される際に、この設定値メモリ２３ａを参照し、記憶されている測定条件にて測定装置１に測定の実行を指示する。

変数メモリ２３ｂは、後述する画像補正処理（Ｓ１１）において用いられる変数α、βを記憶するメモリである。αは、操作者の入力操作によって設定される値であり、キーボード２８から数値入力される値である。尚、本実施形態では、αの入力は、キーボード２８にて行うものとしたが、αの値の入力は、これに限られるものではなく、例えば、ＬＣＤ２７にボリュームを表示し、かかるボリュームをマウスやジョイスティック等で操作することで連続的にαの値を変更できるように構成しても良い。本実施形態においては、βは、ＨＤＤ２４の初期値メモリ２４ｂに記憶されているデフォルト値であり、画像補正処理が実行される際に、この変数メモリ２３ｂにＨＤＤ２４から読みだされて書込まれる。

以下、実施形態が２つあるため、第１実施形態および第２実施形態として説明を行う。第１実施形態では、αの値が入力されると、変数メモリ２３ｂにそのαが記憶され、先の値が更新される。そして、この変数メモリ２３ｂに記憶されるα、βが用いられて、画像データが算出され、画像が形成されてＬＣＤ２７に表示される。

第１画像メモリ２３ｃおよび第２画像メモリ２３ｄは、撮像された画像（観察画像）の内、鮮鋭化を行う（標的光を分離する処理を行う対象の）１フレームの画像データを記憶するためのメモリであり、第１画像メモリ２３ｃは、第１ＬＥＤ８ａからの入射光で照射された際に撮像された画像の画像データを記憶するものであり、第２画像メモリ２３ｄは、第２ＬＥＤ８ｂからの入射光で照射された際に撮像された画像の画像データを記憶するものである。

補正画像メモリ２３ｅは、第１画像メモリ２３ｃに記憶された観察画像の画像データから標的光の画像として作成された（背景光を差分した）画像データを記憶するメモリである。ＣＰＵ２１は、画像補正処理（Ｓ１１）において、新たに補正画像メモリ２３ｅに画像データが書き込まれると、その画像データをＬＣＤ２７に出力して表示する。

ＨＤＤ２４は、書換可能な大容量のメモリであり、電源断後も記憶されるデータを保持する不揮発性のメモリである。このＨＤＤ２４には、図示しないオペレーティングシステムの他、測定装置１に画像撮影を実行させ取得した画像の処理を実行するための測定制御プログラム２４ａと、初期値メモリ２４ｂ、原画像メモリ２４ｃ、処理画像メモリ２４ｄとを備えている。図５〜図６のフローチャートに示すプログラムは測定制御プログラム２４ａの一部として、ＨＤＤ２４内に記憶されている。ＨＤＤ２４に記憶される各種のプログラムは、必要に応じてＲＡＭ２３にロードされ、ＣＰＵ２１により実行される。

初期値メモリ２４ｂは、測定装置１に生理活性物質の測定を実行させる際の測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、アンプゲイン）や、その他必要な値をデフォルトで記憶するメモリである。ＰＣ２０にて測定処理が開始されると、この初期値メモリ２４ｂに記憶される測定条件が設定値メモリ２３ａに書き込まれて記憶される。従って、操作者にて任意の測定条件が入力されなかった場合には、初期値メモリ２４ｂにデフォルトで記憶されている測定条件に従って、測定装置１で測定が実行されることとなる。また、操作者によって測定条件が入力されると、入力された項目については、その入力された値に基づいて測定が実行されることとなる。

原画像メモリ２４ｃは、測定装置１から送信される画像データを記憶するためのメモリである。ＰＣ２０から測定装置１に対し測定実行コマンドが送信された後、測定が終了すると測定装置１から画像データが送信される。この画像データを受信すると、受信された画像データは、ＲＡＭ２３のバッファに一時的に格納された後、この原画像メモリ２４ｃに、撮影されたフレーム順に書き込まれる。受信した画像データは、各座標における画素値（輝度）で構成される一群の情報であるので、１フレームごとに、座標（ｘ，ｙ）と共に記憶される。また、測定装置１からは、各画像データについて、１フレームの画像データ毎に、入射角の情報が付加された状態で送信される。原画像メモリ２４ｃには、この入射角の情報、即ち、第１ＬＥＤ８ａによる照明によって撮像された第１画像データか、第２ＬＥＤ８ｂによる照明によって撮像された第２画像データかを示す情報が、各画像データに付加された状態で記憶される。

次に、図５〜図７のフローチャートを参照して、上記のように構成された蛍光検出システム１００で実行される処理について説明する。図５は、ＰＣ２０で実行される測定処理を示したフローチャートである。測定処理は、操作者の入力操作に基づいて、測定装置１に細胞組織Ｓにおける生理活性物質の濃度分布測定を実行させる処理である。この測定処理は、操作者が所定の入力操作により、ＰＣ２０に測定の実行を要求することで開始される。

図５に示すように、この測定処理では、まず、光源点灯コマンドを測定装置１に送信する（Ｓ１）。これにより、測定装置１においては、光源８が点灯し、照射光（励起紫外光）が透明基板１０の端面へ入射される。光源８が正常に動作しているかは、光検出器１２によって検出することができ、その信号を測定装置１から受信することでＣＰＵ２１は、光源８の安定な出力を確認することができる。

次に、初期値メモリ２４ｂの値（デフォルトで記憶されている測定条件）を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ２）、操作者から入力に基づいて処理を実行するための各種コマンドが表示されたメイン画面をＬＣＤ２７に表示する（Ｓ３）。続いて、メイン画面に表示されたコマンドが所定の入力操作によって入力されると、ＰＣ２０は、入力されたコマンドに従って処理を実行する。このため、コマンドが操作者によって入力されたかを確認し（Ｓ４）、コマンド入力がなければ（Ｓ４：Ｎｏ）、コマンドの入力を待機する。一方、コマンドが入力されれば（Ｓ４：Ｙｅｓ）、入力されたコマンドは何かを確認し（Ｓ５）、入力されたコマンドが終了コマンドであれば（Ｓ５：終了コマンド）、測定の終了要求であるので、光源８を消灯する光源消灯コマンドの測定装置１への送信と、ＰＣ２０での処理を終了するべく、ＲＡＭクリアやデータ保存、出力画面の消去などを行う終了処理を実行して（Ｓ６）、測定処理を終了する。

また、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが測定実行コマンドであれば（Ｓ５：測定実行コマンド）、測定の実行要求であるので、測定実行コマンドと設定値メモリ２３ａに記憶される測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、アンプゲイン）とを測定装置１に出力する（Ｓ７）。これにより、測定装置１では、設定された測定時間、ＣＣＤカメラユニット１３において撮像信号の取り込みが実行される。

一連の測定の終了後は、撮像された画像データが測定装置１からＰＣ２０へと送信される。従って、ＰＣ２０においては、測定装置１から画像データを受信したかを確認し（Ｓ８）、未受信であれば（Ｓ８：Ｎｏ）、受信を待機し、受信した場合には（Ｓ８：Ｙｅｓ）、受信した画像データをＲＡＭ２３のワークエリアに設けられたバッファに一旦格納した後、原画像メモリ２４ｃに記憶する（Ｓ９）。ここで、受信した画像データには、第1ＬＥＤ８ａの照明に対応する第1画像データであるか、第２ＬＥＤ８bの照明に対応する第２画像データであるかを示す情報が付加されているので、かかる情報と共に各画像データは原画像メモリ２４ｃに記憶される。その後、必要な各処理を実行し（Ｓ１５）、その処理をＳ４に移行する。この場合の各処理（Ｓ１５）においては、例えば、画像データの格納が終了したことを示す情報をＬＣＤ２７に出力すること等が実行される。

更に、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが画像処理実行コマンドであれば（Ｓ５：画像処理実行コマンド）、原画像メモリ２４ｃに記憶される画像データについての画像処理の要求であるので、初期値メモリ２４ｂに記憶されるβの値を変数メモリ２３ｂにデフォルト値として書込み（Ｓ１０）、その後の処理を行うために、非図示のステップにて画像データの補正を実行するための入力画面を表示して画面表示を更新した後、画像補正処理を実行する（Ｓ１１）。画像補正処理（Ｓ１１）の終了後は、各処理（Ｓ１５）を経て、Ｓ４の処理に移行する。

更に、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが条件設定コマンドであれば（Ｓ５：条件設定コマンド）、操作者からの測定条件の変更要求であるので、測定条件の入力画面を表示する（Ｓ１２）。この入力画面においては、操作者によるキーボードからの入力に基づいて、任意の測定条件を入力できる入力欄が設けられると共に、操作者が測定条件の入力完了を示すコマンドを入力できるように構成されている。ＣＰＵ２１は、この入力画面において測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されたかを監視し（Ｓ１３）、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていなければ（Ｓ１３：Ｎｏ）、その入力を待機し、一方、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていれば（Ｓ１３：Ｙｅｓ）、入力欄に入力された測定条件を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ１４）、先に記憶される対応する値を更新する。そして、各処理を実行した後（Ｓ１５）、その処理をＳ４の処理に移行する。

Ｓ１４の処理の後に実行される各処理（Ｓ１５）においては、ＬＣＤ２７の表示画面をメイン画面に切り替える処理を実行される。また、例えば、入力欄に入力された値が測定装置１にて実行できる範囲を超えていた場合には、エラーメッセージを表示するといった処理が実行される。

加えて、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが終了コマンド、測定実行コマンド、画像処理実行コマンド、条件設定コマンド以外のその他のコマンドであれば（Ｓ５：その他）、入力されたコマンドに応じた処理を各処理（Ｓ１５）において実行し、その処理をＳ４の処理に移行する。尚、その他のコマンドとしては、測定装置１のキャリブレーションを実行するコマンドなどである。キャリブレーションが要求された場合には、ＣＰＵ２１は光検出器１２の検出信号を測定装置１に要求し、受信した検出信号をＬＣＤ２７に表示する。これにより、操作者は光源８の状態を確認でき、ＬＣＤ２７に表示される検出データを視認しつつ、光源８（ＬＥＤ８ａ，８ｂ）の入射角調整などを実行できる。

図６は、図５の測定処理の中で実行される画像補正処理（Ｓ１１）のフローチャートである。この画像補正処理（Ｓ１１）では、まず、ＨＤＤ２４の原画像メモリ２４ｃに記憶される画像データのうち入力画面から指定された画像データに対し、サムネイル画像を生成しＬＣＤ２７に所定の書式で表示する（Ｓ２１）。原画像メモリ２４ｃには、１の測定毎に画像データが記憶されており、ここでの画像データの指定は、1回の測定にて取得された一群の画像データが指定される。また、正規の画像データは膨大な情報量を有するため、一群の画像データに含まれる各画像データ（1フレームの画像データ）は、それぞれサムネイル画像に変換されてＬＣＤ２７に表示される。また、本実施形態では、ＬＣＤ２７に表示されるサムネイル画像は、第1画像データのサムネイル画像とする。

そして、表示されたサムネイル画像の選択または終了コマンドの入力を監視し（Ｓ２２，Ｓ３３）、画像の選択がなされた場合には（Ｓ２２：Ｙｅｓ）、選択されたサムネイル画像に対応する第１および第２画像データを原画像メモリ２４ｃから読みだして、第１画像データを第１画像メモリ２３ｃに書き込み、第２画像データを第２画像メモリ２３ｄに書込む（Ｓ２３）。続いて、第１画像メモリ２３ｃ、第２画像メモリ２３ｄに記憶される第１画像データおよび第２画像データをＬＣＤ２７に出力して、表示画面を更新する。

第１実施形態の画像補正処理（Ｓ１１）では、標的光の画像を形成するために必要な値であるα（未知の値）を、操作者による入力によって設定する。このため、画面上にはαの入力要求が表示され、その入力をＣＰＵ２１によって監視する（Ｓ２５）。そして、操作者による所定の入力操作によってαの値が入力された場合には（Ｓ２５：Ｙｅｓ）、変数メモリ２３ｂに入力されたαを記憶する（Ｓ２６）。

この後、第１画像メモリ２３ｃに記憶される第１画像データ（Ｆ_１）および第２画像メモリに記憶される第２画像データ（Ｆ_２）と、変数メモリ２３ｂに記憶されるα,βとに基づき、数１式に従って表示画像ｆ_１’，ｆ_２’を作成してＬＣＤ２７に出力する（Ｓ２７）。

これによって、第１画像データ（Ｆ_１）から背景光がある程度除去された画像（ｆ_１’）と、第２画像データ（Ｆ_２）から標的光がある程度除去された画像（ｆ_２’）がＬＣＤ２７に表示される。このため、操作者は、表示画像を視認して補正結果を確認することができる。そして、確定コマンドが入力されたかを確認する（Ｓ２８）。確定コマンドは操作者の入力操作に基づいて入力されるコマンドであり、表示された画像データを確定するコマンドである。即ち、Ｓ２８の確定コマンドの入力は、Ｓ２７の処理で形成された画像が、観察対象面の真の像の近似画像に至ったとして補正の完了を操作者が判断したタイミングである。故に、この確定コマンドが入力されていれば（Ｓ２８：Ｙｅｓ）、原画像メモリ２４ｃに記憶されるＳ２１の処理で指定された画像データについて、変数メモリ２３ｂに記憶されるαを用い、全フレームの画像データに対して、夫々ｆ_１’を算出する（Ｓ２９）。これにより、１回の測定で取得された一群の画像について、全フレームの画像データの補正が行われ、表示処理（Ｓ３０）により、補正後の画像データをＬＣＤ２７に表示する処理を実行する。具体的には、補正後の画像によって各フレームのサムネイル画像が作成されて表示画面が更新される。尚、表示されるサムネイル画像は、インデックスとして表示されるものであり、任意のサムネイル画像が指定されると、対応する元画像（縮小元の正規の画像）が表示される。

表示処理（Ｓ３０）による画像データの表示後は、再処理コマンドおよび終了コマンドの入力が受付可能となっており、ＣＰＵ２１にて再処理コマンドおよび終了コマンドの入力が監視される（Ｓ３１，Ｓ３２）。そして再処理コマンドの入力がなく（Ｓ３１：Ｎｏ）、終了コマンドが入力された場合には（Ｓ３２：Ｙｅｓ）、この画像補正処理（Ｓ１１）を終了する。一方、Ｓ３１の処理において確認した結果、再処理コマンドの入力であれば（Ｓ３１：Ｙｅｓ）、その処理をＳ２２の処理に移行し、新たな画像の指定を待機する。再処理コマンドおよび終了コマンドのいずれの入力もなければ（Ｓ３１：Ｎｏ、Ｓ３２：Ｎｏ）、再処理コマンドおよび終了コマンドのいずれかのコマンド入力を待機する。

また、Ｓ２２の処理で確認した結果、画像の選択がなく（Ｓ２２：Ｎｏ）、終了コマンドの入力もなければ（Ｓ３３：Ｎｏ）、Ｓ２２の処理に移行して画像の選択を待機し、終了コマンドの入力が確認されれば（Ｓ３３：Ｙｅｓ）、この画像補正処理（Ｓ１１）を終了する。

更に、Ｓ２５の処理において確認した結果、αの入力がなければ（Ｓ２５：Ｎｏ）、終了コマンドが入力されたかを確認し（Ｓ３４）、終了コマンドが入力された場合には（Ｓ３４：Ｙｅｓ）、この画像補正処理（Ｓ１１）を終了する。また、終了コマンドが入力されていなければ（Ｓ３４：Ｎｏ）、αが入力済みであるかを確認し（Ｓ３５）、αが入力済みであれば（Ｓ３５：Ｙｅｓ）、その処理をＳ２８に移行する。また、αが入力済みでなければ（Ｓ３５：Ｎｏ）、αは値がないため、エラーとなることを回避すべく、その処理をＳ２５の処理に移行してαの入力を待機する。

尚、必要な画像は、観察対象面（細胞組織Ｓの表面）の画像であるので、本実施形態では、βをデフォルト値とし、観察対象面の標的光の画像ｆ_１’（観察面の真の画像の近似画像）のみを算出するものとした。これに代えて、βの値も入力によって任意に設定できるものとし、背景光のｆ_２’画像（背景光の真の画像）を得るものとしてもよい。
上記第１の実施形態においては、αの値を入力して形成される画像がＬＣＤ２７に出力されるが、この出力画像ｆ_１’は、背景光の影響が小さくなるほど（背景光の画像情報が除去されるほど）得られる画像は鮮鋭化される。つまり、本実施形態では、この出力される画像ｆ_１’そのものが分離がどの程度行われたかを評価する評価手法であり、画像ｆ_１’をＬＣＤ２７に出力するＳ２７の処理が請求項記載の評価手段に該当する。

図７は、測定装置１で実行される測定実行処理のフローチャートである。測定実行処理は、測定装置１に測定を実行させる、即ち、組織細胞Ｓの表面に存在する生理活性物質の二次元濃度分布を蛍光画像で撮影するための処理である。この測定実行処理は、ＰＣ２０からの測定実行コマンドを受信したことを契機として開始される。尚、この測定実行処理に先立って、ＰＣ２０から測定装置１には、光源点灯コマンドが送信されており、既に光源８は点灯している。

この測定実行処理では、まず、測定実行コマンドと共に受信した測定条件をＲＡＭ４に書き込み（Ｓ４１）、次いで、ＲＡＭ４に記憶される測定条件（測定時間と撮影フレーム数）とからサンプリングタイム（撮影間隔）を算出する（Ｓ４２）。そして、ＣＰＵ２に内蔵されるタイマ（図示せず）による計時を開始する（Ｓ４３）。続いて、制御信号出力処理を実行する（Ｓ４４）。

制御信号出力処理（Ｓ４４）では、測定の開始に伴い、開閉器９ｂ１，９ｂ２のオンオフを行うための制御信号と、開閉器９ｂ１，９ｂ２のオンに対応してトリガー信号をＣＣＤカメラユニット１３に入力するための電気信号を生成し、ＬＥＤドライバ装置９に出力するための処理である。

具体的には、まず、第１ＬＥＤ８ａに対応する開閉器９ｂ１とトリガー信号出力端子との接点を接続する電気信号と、開閉器９ｂ１をオンする制御信号と、開閉器９ｂ２をオフする制御信号とをＬＥＤドライバ装置９に出力する。これにより、開閉器９ｂ１に繋がる信号線とトリガー信号出力端子との接点がオン、開閉器９ｂ１がオン、開閉器９ｂ２がオフされる（第１画像データ撮像状態）。そして、所定の撮像時間経過後、直ちに開閉器９ｂ１をオフする制御信号と、開閉器９ｂ２をオンする制御信号と、第２ＬＥＤ８ｂに対応する開閉器９ｂ２とトリガー信号出力端子との接点を接続する電気信号とを、ＬＥＤドライバ装置９に出力する（第２画像データ撮像状態）。これにより、開閉器９ｂ１がオフ、開閉器９ｂ２がオンされる。開閉器９ｂ１に繋がる信号線とトリガー信号出力端子との接点は継続してオンのままであるが、開閉器９ｂ１がオフとなるため（回路が開放され）、対応するトリガー信号は発生しない（ＣＣＤカメラユニット１３に入力されない）。一方で、第２ＬＥＤ８ｂに対応する開閉器９ｂ２とトリガー信号出力端子との接点が接続されるので、その対応するトリガー信号がＣＣＤカメラユニット１３に出力される。

続いて、再度、所定の撮影時間経過後、開閉器９ｂ２がオフされる。これにより、入射角を変更した１回の撮影が完了し、一対の第１画像データと第２画像データが取得される。

続いて、Ｓ４３の処理によって計時が開始されたタイマの示す値が、予め規定されているタイムアウト時間（測定時間）を超えたかを確認し、タイムアウト時間以内であれば、サンプリングタイムの到来を契機として、同様の開閉器９ｂ１，９ｂ２のオンオフ動作を行わせる制御信号の出力を行う。そして、タイムアウト時間が到来すると、開閉器９ｂ１，９ｂ２を共にオフする信号（即ち、画像信号の取得を停止させる電気信号、測定終了を示す信号）をＬＥＤドライバ装置９に出力してから制御信号出力処理（Ｓ４４）を終了する。

そして、ＣＣＤカメラユニット１３に記憶される一群の画像データを、ＰＣ２０へと送信する（Ｓ４５）。続いて、トリガー信号出力端子と開閉器９ｂ１，９ｂ２との間を断する電気信号をＬＥＤドライバ装置９に出力して（Ｓ４６）、その接続を開放し、この測定実行処理を終了する。

このように、本実施形態の検出システム１００では、標本である細胞組織Ｓの表面において存在する生理活性物質を蛍光発光によって検出し蛍光画像を取得すると共に、その取得した蛍光画像について、標的光と背景光とを分離する処理を行うことにより、目的の蛍光像（真の蛍光像）により近似する蛍光画像を取得することができる。即ち、従来の観察画像では、観察対象の組織内部に存在する蛍光体からの蛍光が、観測画像に重畳されたものとなっているので、本来観測されるべき像が暈けたように見えていた。この暈けは光学的な暈けではないので、収差補正等の光学的手法で補正することはできない。更には、汎用的な画像処理は、取得された画像に対してフィルター処理を行うものであり、画像内の対象画素と周辺画素との関係で鮮鋭化が行われるので、背景光の影響が含まれたままで画像処理を行われるため、真の画像に向かう補正がなされているか信頼性に乏しかった。しかし、本実施形態の検出システム１００では、背景光を分離する処理を行うことで画像の鮮鋭化を行うものであるため、得られた画像の信頼性を向上させることができる。また、画像補正処理（Ｓ１１）では、操作者が表示される画像処理結果を視認しながら、背景光と標的光の分離に必要なαの設定と調整を行うという手法であるので、αが未知の値であっても、確実に処理を実行することができるのである。

次に、図８及び図９を参照して、本発明の第２実施形態について説明する。第１実施形態の検出システム１００は、観察画像における標的光と背景光との割合（未知の値）を、操作者の入力操作によって入力された値αで設定し、当該αの値と、１つの観察画像に対応する第１画像データ、第２画像データに基づいて画像生成を行い、生成された画像から、αの妥当性を操作者が判断するように構成されている。これに代えて、第２実施形態においては、αの妥当性を判断する判断手段を備えており、その判断結果に基づいて、標的光の画像が形成されるように構成されている。尚、上記した第１の実施形態と同じ部分については同じ符号を伏して、その説明を省略する。

図８は、第２実施形態の蛍光検出システム１００にて実行される画像処理の原理を説明する図である。図３にて述べたように、蛍光物質の分布と画像強度の関係は、上述の式（３）にて表すことができ、即ち、標的光画像ｆ_１と背景光画像ｆ_２は混合比は未知であるが、観察画像Ｆ_１は、ある割合ａ１１の標的光画像ｆ_１と、ある割合ａ１２の背景光画像ｆ_２とが合算されたものであり、同様に観察画像Ｆ_２は、ある割合ａ２１の標的光ｆ_１画像と、ある割合ａ２２の背景光画像ｆ_２とが合算されたものとすることができる。

観察画像Ｆ_１と観察画像Ｆ_２との２枚の画像において、混合比がわかっていれば、その逆行列をかけると元の画像が得られる。混合比が同じであれば、逆行列が存在しないので、画像は復元できない。通常混合比はわからないので、分離された画像の独立性を基準に分離が正しく行われたかどうかを判断する。分離された標的光の画像と、背景光の画像とが互いに及ぼし合う影響が強い場合には、独立性は低下する。つまり、分離が不十分と判断できる。即ち、標的光の画像の独立性が高ければ、背景光の影響が小さく、真の蛍光画像により近似していることを示す。

ここで、独立成分分析の理論によると、ｎ個の信号源が発する信号強度の確率分布が互いに独立であり、その分布が正規分布に従っていない場合は、観測信号は元の信号に分離できる。なお分布が正規分布に従う場合は、主成分分析を用いることもできる。以下の数５に示す確率変数が、それぞれ独立である場合、以下の数６のようになる。
ただし、ｐ（ｙ１，ｙ２・・・ｙｎ）は、それぞれの確率変数がｙ１，ｙ２・・・ｙｎとなる確率を示す同時確率であり、ｐ（ｙｎ）は、ｎ番目の確率変数がｙｎとなる確率を示す周辺確率である。

独立性の指標となるような評価関数の一例として、次式で定義されるＫｕｌｌｂａｃｋ−Ｌｅｉｂｌｅｒ情報量（以下、「ＫＬ情報量」と称す。）が用いられる。全ての確率変数について独立が成立するとき、ゼロとなるＫＬ情報量を以下の数７に示す。

ただし、ｙはｎ個の確率変数からなるベクトルｙ＝（ｙ１，ｙ２・・・ｙｎ）である。

本実施形態の場合、分離された画像は２枚ある（ｎ＝２）。また、観察画像Ｆ_１（第１画像データ）と観察画像Ｆ_２（第２画像データ）がそれぞれ座標（ｘ，ｙ）に対応する各画素値で構成されていることから、確率変数となる輝度（画素値）を、離散化してｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ、確率密度分布ｐ（ｙ_１ｉ），ｐ（ｙ_２ｊ）とすれば、以下の数８によりＫＬ情報量が求められる。そして、求められたＫＬ情報量を評価関数とし、同時分布密度関数を周辺分布密度関数に近づけるように（即ち、ＫＬ情報量を最小化するように）前記α、βを求めてゆけばよい。，

すなわち数８に従い、ＫＬ情報量を逐次計算しながらその値が最も小さくなるように、α、βを導出すれば良いこととなる。これにより、分離された信号（標的光の画像情報と背景光の画像情報）の独立性が最も大きくなるように、α、βが調整されることとなる。

本第２実施形態では、最小値の判定は、α、βの微小変動に対し、ＫＬ情報量の変化が予め決められた値より小さくなることを以て最小値が得られたと判断する。これは最急下降法のアルゴリズムの一部である。尚、最小値の判定は、算出されたα、βを基に逐次ＫＬ情報量を算出し、比較することでＫＬ情報量を最小化するα、βを求めるように構成しても良い。

更には、上述した第１の実施形態と組み合わせ、表示画像を操作者が視認しつつ手動でα，βを調整する際に、ＫＬ情報量を表示することで、そのＫＬ情報量を参照しながら、操作者がα，βを調整できるようにしても良い。

第２の実施形態の検出システム１００では、第１の実施形態と同様にＰＣ２０にて測定処理が実行される。ここで、第２の実施形態では、初期値メモリ２４ｂには、αおよびβの値が予め記憶されており、測定処理のＳ１１の処理において、初期値メモリ２４ｂに記憶されるαおよびβの値が変数メモリ２３ｂに書込まれる。そして、この測定処理において、第１の実施形態では画像補正処理（Ｓ１２）が行われたが、これに代えて、第２の実施形態では、初期値メモリ２４ｂに記憶されるβの値を変数メモリ２３ｂにデフォルトとして書込む画像補正処理（Ｓ１２０）が実行される。

図９は、第２の実施形態の検出システム１００に備えられるＰＣ２０での画像補正処理（Ｓ１２０）を示したフローチャートである。この画像補正処理（Ｓ１２０）では、第１の実施形態の画像補正処理（Ｓ１２）と同様にＳ２１〜Ｓ２６の処理を実行した後、ＬＣＤ２７に表示された標的光画像ｆ_１’、背景光画像ｆ_２’の画素値（輝度）についての対応する確立密度分布（ｐ（ｙ_１ｉ），ｐ（ｙ_２ｊ），ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ））を求め、数６に従ってＫＬ情報量を算出する（Ｓ１２１）。

次いで、Ｓ１２１の処理で算出されたＫＬ情報量が最小値であるかを判断するとともに、ＫＬ情報量の最小値を導出するＫＬ情報量最小化処理を実行する（Ｓ１２２）。そして、α、βの少なくとも一方について変更が必要であるかを確認する。ＫＬ情報量最小化処理（Ｓ１２２）にてＫＬ情報量の最小値が導出されていればα、βのいずれも変更不要であるので（Ｓ１２２：Ｎｏ）、変数メモリ２３ｂに記憶されるαを用いて標的光の画像を形成して表示する処理（Ｓ２９，Ｓ３０）を第１の実施形態同様に実行する（Ｓ２９，Ｓ３０）。尚、第２の実施形態では、ＣＰＵ２１の演算処理によってα，βが最適化されるため再処理は不要となり、第１の実施形態に備えられた再処理コマンドの入力を待機するＳ３１の処理は不要となる。よって、終了コマンドの入力をＣＰＵ２１は監視し、終了コマンドが入力されると（Ｓ３２：Ｙｅｓ）、この画像補正処理Ｓ１２０を終了する。また、Ｓ３２の処理で確認した結果、終了コマンドの入力がされていなければ（Ｓ３２：Ｎｏ）、その入力が確認されるまで、Ｓ３０の表示処理において表示された画面表示を継続する。

また、Ｓ１２３の処理で確認した結果、ＫＬ情報量の最小値が導出されていなければ、α、βの少なくとも一方について変更が必要である（Ｓ１２３：Ｙｅｓ）。このため、α，βの値を変更する、α，β変更処理を実行し（Ｓ１２４）、変更後のα，βに基づき、再度ＫＬ情報量を導出するために、その処理をＳ２６の処理に移行する。尚、算出されたＫＬ情報量が、最小値にいたったか否かは、予め定めた判定方法に従って判断される。尚、初回の算出の場合は、ＫＬ情報量の変化が存在しないので、Ｓ１２３の処理において、必ず、「Ｙｅｓ」と判断される。本実施形態において最小値の判定は、α、βの微小変動に対し、ＫＬ情報量の変化が予め決められた値より小さくなることを以て最小値が得られたと判断する。これは最急下降法のアルゴリズムの一部である。尚、最小値の判定は、最急加工法に限られるものではなく、例えば、算出されたＫＬ情報量がその時点までの最小値より小さければ、その値を新しい最小値とし、対応するα、βと共に記憶するという処理を所定回数繰り返すことで実行しても良い。

上記各実施形態において測定される細胞組織Ｓは、生体試料であり、例えば生物から切開や穿刺によって取得した組織片、細胞、微小生物などが例示されるが、これらに限定されるものではない。

また、蛍光検出システム１００は、穿刺や切り出しによって得られる細胞組織Ｓを外部に（生体外に）設置された透明基板１０に載置して測定を行うように構成されたが、透明基板１０をプローブ状の光ファイバの一部分に形成すると共に、ＧＡＰやＮＡＤ＋を供給するラインや、光ファイバを介して透明基板１０に対向する位置にＣＣＤを設けたカテーテルとし、生体内に挿入された状態で測定を行う構成としても良い。

尚、請求項に記載の光学観察方法としては、上記実施形態において説明した蛍光検出システム１００を利用して実行させた生理活性物質を検出する一連の工程、即ち、上記各実施形態において、透明基板１０に載置した細胞組織Ｓに向かって、光源ユニット７から照射角度の異なる励起光を照射してＣＣＤカメラユニット１３で撮像した第１、第２画像データを記憶する工程と、少なくともαの値を手動、または自動で求め、そのαと、複数の撮影画像（第１画像データ（観察画像）、第２画像データ（比較画像）とを用いて、標的光とした画像情報を分離し、観察対象の本来の観察像（近似像）の画像を形成して表示する一連の工程が該当する。

更に、上記各実施形態は、２の入射角にて取得した画像比較して、観察対象面の観察像を取得するものであったが、これに代えて、３以上の入射角に対応する画像を撮影し、順次、画像補正処理を行うことで断層写真の鮮鋭化を行うものとしてもよい。
また、入射角の異なる入射光を得るために、異なる角度でセットされた複数のＬＥＤ８を設けたが、これに代えて、例えば、ピエゾ素子などを用いて角度変更を自動で行うことができるものとし、１のＬＥＤで複数入射光の画像を撮影するものとしても良い。

次に、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）

実施例においては、図１に示した検出システムを用いて、小脳皮質細胞からのガンマアミノ酪酸放出の空間分布を測定した。

生後一週間の新生仔ラットを用意し、７０％エタノールにて全身の消毒を行い、滅菌下にて断頭した。小脳を傷付けないように、延髄側より頭皮及び頭蓋骨を切り、切開した。その後、全脳を先曲ピンセットにて持ち上げ摘出し、生理食塩水内で血液等を洗浄した。この後に全脳をシャーレ上に移し、スカルペルナイフによって延髄及び大脳や間脳を切り離し、小脳を摘出した。小脳に付着したクモ膜及び血管を、先細ピンセットを用いて剥がし取り、再度生理食塩水にて洗浄した後、単離した小脳をロータリースライサーもしくはクリオスタット等にてサジタル方向に２００μｍにスライスした。これらのスライスの内、小脳虫部を選別し、充分な酸素供給下のＰＢＳにおいて１時間浸し、断面表層の組織処理を行った。

このサンプル組織を広口スポイトですくい取り、本実施形態の装置上に乗せ、余分な水分を吸い取とった後、測定装置の基板上に載置した。試料を載置する基板である石英ガラスの表面には、ＧＡＢＡ分解酵素ＧＡＢａｓｅを固定化し、蛍光元物質にＮＡＤＰを添加した。そして、基板側方に設けた照射角度の異なる２のＬＥＤ（紫外波長のＬＥＤ（日亜化学ＮＳＨＵ５５０Ｂ（紫外発光ＬＥＤ）、発光スペクトルのピークは３６５ｎｍ）からＵＶ励起光を交互に照射すると共に、前記基板の下方から、５１５ｎｍバンドパスフィルター及びピンホール機能を有するＣＣＤカメラを装備した倒立型蛍光顕微鏡にて観察を行った。なお、基板としては、石英ガラス板（２５ｍｍｘ２５ｍｍｘ１ｍｍ）を用いた。

そして、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラで、側面光の作用で発生した蛍光を撮像した。図１０に観察結果を示す。

この例では分子層および顆粒層と呼ばれる層からＧＡＢＡが放出されることが知られている。図１０（ａ）は、石英基板の表面に照準をあてて励起光を照射して得られた画像データである。輝度の強い２重の層（図１０（ａ）中、白く表示される部位）がこれに相当している。しかしながらその周辺にも輝度の強い部分があり、暈けた画像となっている。

図１０（ｂ）は、僅かにタイムラグを経て、入射角を深くして撮影された同じサンプルの画像データである。おぼろげながら、輝度の強い２重の層が確認できる。即ち、暈けの様相が異なる２枚目の画像を得ることができた。

図１０（ｃ）は、図１０（ａ），（ｂ）に示した画像の画像データを用い、第１の実施形態で説明した手法でαを設定して、両画像の混合比を調整することにより、形成された画像である。図９（ｃ）から解るように、暈けのない画像、すなわち酵素担持面（サンプル表面）からの蛍光がクリアに検出されており、分子層および顆粒層と呼ばれる層からＧＡＢＡが放出されている様子が鮮明に観察された。

８，ＬＥＤ（照明手段）
８ａ第１ＬＥＤ（照明手段）
８ｂ第２ＬＥＤ（照明手段）
１０透明基板（載置台）
１３ＣＣＤカメラユニット（撮像手段）
２１ＣＰＵ（演算手段の一部）
２３ｃ第１画像メモリ（記憶手段）
２３ｄ第２画像メモリ（記憶手段）
２４ａ測定制御プログラム（画像処理プログラム）
２７ＬＣＤ（表示手段）
２８キーボード（数値入力手段の一部）
１００検出システム（光学観察装置）
Ｓ９（撮像記憶工程の一部）
Ｓ１１，Ｓ１２０画像補正処理（演算手段の一部、演算工程、演算ステップ）
Ｓ２７（画像形成手段の一部，画像形成ステップ）
Ｓ２７，Ｓ１２１，Ｓ１２２（評価手段）
Ｓ２５（数値入力手段の一部）
Ｓ２６（設定手段）

Claims

標本の観察対象面に対し、複数の異なる入射角度で光を照射する照明手段と、
前記照明手段により照明された標本の観察対象面を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段によって撮像されると共に、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを前記照明手段からの光の入射角度に対応づけて記憶する記憶手段と、
前記記憶手段に記憶された撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分との混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算手段と、
前記演算手段による演算により得られたデータを用いて、前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成手段とを備えたことを特徴とする光学観察装置。
前記演算手段が行う演算は、対応づけられた光の入射角度が大きい撮像画像データを観察画像として用いるとともに、対応づけられた光の入射角度が小さい撮像画像データを比較画像として用い、
前記演算手段は、前記観察画像から前記背景光成分を除去する演算を行うことを特徴とする請求項１に記載の光学観察装置。
前記演算手段による演算は、分離係数で重みづけをした比較画像と観察画像とを加減算する演算を含むものであり、
前記分離係数を設定する設定手段を備えたことを特徴とする請求項１又は２に記載の光学観察装置。
前記設定手段により設定された分離係数を用いた前記演算手段による演算の結果として、前記標的光成分と前記背景光成分との分離がどの程度行われたかを評価する評価手段を備えたことを特徴とする請求項３に記載の光学観察装置。
前記設定手段は前記分離係数を入力する数値入力手段を備え、
前記評価手段は、前記画像形成手段により形成された画像を表示する表示手段を備えることを特徴とする請求項４に記載の光学観察装置。
前記設定手段は、前記観察画像上の座標（ｘ，ｙ）に対応する画素値群Ｆ_１（ｘ，ｙ）および前記比較画像上の座標（ｘ，ｙ）に対応する画素値群Ｆ_２（ｘ，ｙ）と、標的光成分の画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）および背景光成分の画素値群ｆ_２’（ｘ，ｙ）との関係が以下の数１であるとして、分離係数であるα、βのうち、少なくともαを観察画像における背景光成分の分離係数として設定し、
前記画像形成手段は、前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を標的光成分ｆ_１’（ｘ，ｙ）の画素値群により形成することを特徴とする請求項３乃至５に記載の光学観察装置。
前記設定手段は、観察画像における背景光成分の分離係数としてαを設定すると共に、比較画像における標的光成分の分離係数としてβを設定するものであり、
前記評価手段は前記数１を用いて標的光成分の画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）と背景光成分の画素値群ｆ_２’（ｘ，ｙ）を算出し、算出された画素値群ｆ_１’（ｘ，ｙ）とｆ_２’（ｘ，ｙ）から画素値の確率密度分布であるｐ（ｙ_１ｉ）とｐ（ｙ_２ｊ）を算出し、算出された画素値の確率密度分布であるｐ（ｙ_１ｉ）とｐ（ｙ_２ｊ）から周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）を算出し、算出された周辺確率ｐ（ｙ_１ｉ）ｐ（ｙ_２ｊ）と同時確率ｐ（ｙ_１ｉ，ｙ_２ｊ）から以下の数２を用いてＫＬ情報量を算出するＫＬ情報量算出手段を備え、
前記設定手段は、前記ＫＬ情報量算出手段によりＫＬ情報量が算出された場合は、前記ＫＬ情報量が小さくなる方向に、次の前記αまたはβの少なくとも１つを変更して設定することを特徴とする、請求項６に記載の光学観察装置。
前記照明手段は、前記標本の観察対象面に対する入射角度が異なる光源を複数有しており、発光させる光源を変更することにより入射角度を変更することを特徴とする請求項１乃至７に記載の光学観察装置。
前記標本を載置する透光性の載置台を備え、
前記照明手段は、前記載置台に載置された標本を、前記載置台の内部側から複数の入射角度で照明するものであることを特徴とする請求項１乃至８に記載の光学観察装置。
前記照明手段は、前記載置台の側方に設けられ、前記載置台の側面または裏面から前記標本の観察対象面へ励起光を、前記載置台の表面の内側にて全反射させるように入射させるものであることを特徴とする請求項９に記載の光学観察装置。
前記載置台の表面には酵素が固定されており、前記載置台に載置させた標本の表面に存在する化学物質を前記酵素の作用下で反応させ、生成される前記化学物質に由来する蛍光物質を前記照明手段から入射される励起光にて発光させることを特徴とする請求項１０に記載の光学観察装置。
前記酵素は、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼとコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の混合物）、乳酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素のいずれかであり、前記載置台に載置させた標本に蛍光元物質を存在させることにより、前記化学物質と蛍光元物質とを前記酵素の作用下で反応させて蛍光物質を生成させることを特徴とする請求項１１に記載の光学観察装置。
前記撮像手段は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラもしくはＣＭＯＳカメラであることを特徴とする請求項１乃至１２に記載の光学観察装置。
標本の観察対象面に対し、複数の異なる入射角度で光を照射し、照明された標本の観察対象面を撮像して、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを前記入射角度に対応づけて記憶する撮像記憶工程と、
前記撮像記憶工程にて記憶された撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分とは混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算工程と、
前記演算工程にて得られたデータを用いて前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成工程とを備えることを特徴とする標本の光学観察方法。
標本の観察対象面に対し複数の異なる入射角度で光を照射し、照明された標本の観察対象面を撮像して、前記入射角度に対応づけて記憶された、前記観察対象面の本来の画像に対応する標的光成分と前記標的光成分以外の光成分である背景光成分とが混合された撮像画像データを処理する画像処理プログラムであって、
前記撮像画像データについて、１の入射角度に対応つけられた観察画像と前記１の入射角度とは異なる入射角度に対応つけられた比較画像との間で、各々に含まれる前記標的光成分と前記背景光成分とは混合割合が異なることに基づいて、前記観察画像と前記比較画像とを用いて前記標的光成分と前記背景光成分とを分離させる演算を行う演算ステップと、
前記演算ステップにて得られたデータを用いて前記標本の観察対象面の本来の画像に近似した画像を形成する画像形成ステップとを備えることを特徴とする画像処理プログラム。