JP2015093834A - 組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
12月末頃に苗床に残しておいた種苗を株分けした。株分けは、1株当たり芽が2、3本含まれるようにした。株分けした苗を鉢植用の土を入れたトレイに挿して、本田の片隅においておいた。翌年の3月上旬に根が絡んで新芽が出てきたので畑に植え替えた。8月頃には苗が成長して大きくなったので、苗1株を20株程度に分けて水田(苗床)に手作業で植えた。その後、肥培管理しながら栽培し、その年の11月下旬に株を引き抜いて、株についた泥を落とした後、20センチ×60センチのカセットの中に株を解しながら詰めていった。カセットを20アール分用意したところで、カセットを本田に搬入して、本田に植え替えて、肥培管理しながら栽培した。その後翌年の6月下旬まで栽培して刈り取った。イグサの栽培は全て無農薬で行った。収穫したイグサは泥染めすることなく、そのまま乾燥機に入れて55℃で18時間乾燥させた。この乾燥は天日干しにしてもよい。
上記の乾燥させたイグサを5〜10mm間隔で切断したイグサ25gと25容量%に調整した水エタノール混合液700mlとを注いだビーカーに入れた後、室温においてスターラーでしばらく撹拌してから、4℃に維持して一晩浸漬した。翌朝にはイグサの色素が水エタノール混合液に流出し、液色が薄黄色になっていたので、イグサを取り除いてこれをイグサ抽出液とした。イグサ抽出液の匂いを確認したところ、イグサの芳香が抽出液に移行していた。同様の方法で作製したイグサ抽出液をもう一晩4℃で浸漬したが、液色に大きな変化は見られず、抽出液のイグサの芳香が強くなることもなかった。
ヒト由来の培養細胞を使用した。細胞培養液は、10容量%の牛胎児血清(FBS)を含むE-MEM培地を121℃、15分間に設定したオートクレーブに入れて加圧及び加熱処理をし、これを滅菌フィルターでろ過したものを使用した。96ウェルのプレートに細胞が3×104cells/cm2となるように播種して、37℃、5%CO2の条件下でコンフルーエントになるまで培養した。古い培養液を除去した後、培養細胞に新しい培養液56.7μlと上記ようにして調製したイグサ抽出液6.4μlとを加えてさらに24時間培養した。イグサ抽出液は、原液、1/2希釈、1/4希釈、1/8希釈、1/16希釈、1/32希釈又は1/64希釈してから添加した。希釈はいずれも容量比に基づいて超純水を添加して希釈した。比較対象のためにコントロールとして超純水を使用した。
t-PA活性の測定には、t-PAに特異性の高い合成アミド基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA(S-2288)を使用した。基質濃度は、ジメチルスルホキシド(DMSO)で5×10-3Mに調整した。96ウェルプレートに0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)50μlと前記合成アミド基質10μlを混合して37℃、10分間プレインキュベーションした。さらに前記の各濃度に希釈した培養液を40μl添加して、405nmの吸光度を37℃で10分間測定した。t-PAは下記の式の反応を触媒して、pNA(p-ニトロアラニン)を遊離させる。pNAは吸光度の変化によって定量される。そして、生じたpNA量からt-PA量(unit/ml)を算出した。
[化1]
H-D-Ile-Pro-Arg-pNA→H-D-Ile-Pro-Arg + pNA
次に、上述のようにして得たイグサ抽出液が血小板凝集に与える影響について調べた。ヒトの多血小板血漿(PRR: Platelet Rich Plasma)に上述のようにして得たイグサ抽出液の原液を10μl加えて、これを37℃で、5分間プレインキュベーションした。次に、凝集惹起物質としてコラーゲンを22μl(終濃度4.5μg/ml)又はADPを22μl(終濃度2.5μM)加えた。そして、37℃において5分間、血小板凝集率をアグリゴメーター(PAT-4A)で測定した。測定に際しては、貧血小板血漿の光透過率を100%とした。血小板凝集率の算出は、血小板が凝集していない状態では、血小板が比較的均一に分散していることに起因して光透過率が低いのに対して、血小板が凝集すると、光透過率が高まることを利用している。すなわち、血小板が凝集すると凝集した血小板間の間隙が大きくなり光が透過しやすくなることを利用したものである。比較対照のためにコントロールとして25容量%に調整した水エタノール混合液を使用した。結果を図2に示す。図2から明らかなように、イグサ抽出液には凝集惹起物質であるコラーゲン及びADPのいずれに対しても、血小板の凝集を抑える効果があることが明らかになった。
Claims (9)
- イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有することを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤。
- 芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜30℃に維持して抽出されるものである請求項1に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤。
- イグサは、破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬する請求項2に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤。
- 芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とし、
組織プラスノーゲン活性化因子活性化剤は、30〜70容量%となるように前記抽出原液を含有するものである請求項2又は3に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤。 - 抽出溶媒に浸漬するイグサは、浸漬する前に50〜60℃の低温又は天日干しで乾燥させたものである請求項2ないし4のいずれかに記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤。
- イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有する組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤の製造方法であって、
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜30℃の低温に維持して抽出されることを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤の製造方法。 - イグサは、破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬する請求項6に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤の製造方法。
- 芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とし、
組織プラスノーゲン活性化因子活性化剤は、30〜70容量%となるように前記抽出原液を希釈するものである請求項6又は7に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤の製造方法。 - 抽出溶媒に浸漬するイグサは、浸漬する前に50〜60℃の温度又は天日干しで乾燥させたものである請求項6ないし8のいずれかに記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤の製造方法。
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