JP2015091859A - 膵臓癌を処置するための医薬 - Google Patents

Abstract

【課題】膵臓癌を処置するための医薬の提供。【解決手段】膵臓癌の処置を意図した治療用組成物又は医薬であって、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液を含む治療用組成物又は医薬。【選択図】なし

Description

本発明は膵臓癌の治療的処置に関する。具体的には、この癌を処置するための新規組成物、及び関連する治療的処置方法に関する。

膵臓癌は、フランスでは癌による死因の第６位であり（２０００年に７１８１人が死亡）、先進工業国では癌による死因の第５位、米国では男性の死因の第４位になっている。フランスでは、その発生数は年間１００，０００人当たり５〜１０人であり、この数は毎年少しずつ（１〜２％）増えている。膵臓癌は消化器系の癌の７％を占め、女性（４０％）よりも男性（６０％）の方が多く疾患する。進行した段階で診断が行われる場合が多いので、半分の症例で転移が検出され、その結果、この癌の平均生存期間は数カ月に過ぎず、５年生存者は４〜６％である。全病期を合わせた場合の生存期間中央値は４〜７カ月であり、切除術を受けた患者では、１５〜１８カ月延長する。

腫瘍が手術不能であるか、又は転移が見られる場合には、全身状態の良い告知患者において化学療法が検討されることがある。その奏功率は約１５〜３０％である。用いられる医薬はゲムシタビン（Burris et al., European Journal of Cancer, 1997, 33:18-22）、ゲムシタビンとオキサリプラチンとの組み合わせ（Zhao et al., Chinese-German Journal of Clinical Oncology, 2007, 6(5): 461-463）、及び白金誘導体と組み合わせた５−フルオロウラシルである。これらの化学療法によって、転移のある患者の生存期間中央値をわずかに上昇させることができ、無処置の場合にはこの生存期間中央値は４〜６カ月である。

新規な化学療法で記録された進歩にもかかわらず、膵臓癌の予後は依然として非常に悪い。治癒目的で手術を行った患者でさえも、局所再発及び転移性再発のせいで、５年生存率は約２５％に過ぎない。

膵臓癌に付随する重篤性及び非常に悪い予後、並びに、特に西洋諸国の人々におけるその発生数の漸進的増加に直面して、現在提案されている処置方法よりも有効な代替的処置方法を提案する真の必要性が存在する。

アスパラギナーゼは、細菌性微生物（大腸菌又はエルビニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi））から生成される酵素であり、約３０年にわたり白血病に対する化学療法で使われてきている。この酵素は、細胞の生存のために必要なタンパクの産生に不可欠なアミノ酸であるアスパラギンを加水分解して枯渇させる。正常細胞とは対照的に、特定の癌性リンパ芽球細胞は、それ自体でアスパラギンを合成する能力を持たず、タンパクの合成を細胞外の供給源に依存している。アスパラギナーゼによる処置によって、癌性リンパ芽球細胞からこの不可欠な構成要素を奪い、その結果、癌性リンパ芽球細胞の死滅をもたらす。この抗有糸分裂剤は腫瘍細胞に対して選択的である。

しかしながら、天然のアスパラギナーゼは循環抗体の産生を誘発し、アスパラギナーゼのクリアランスの上昇、及びアレルギー反応（非常に重篤な場合もある）を引き起こす（Wang B et al., Leukemia, 2003; 17(8): 1583-1588）。更には、この酵素の短い半減期（２４時間）によって、反復注射と入院が必要になる。これらの大きな短所は、ペグ化形態であるＰＥＧ−アスパラギナーゼの開発を導き、このＰＥＧ−アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病（ＬＡＬ）の一次処置用としてＦＤＡから承認されている。

１９８０年代、インビトロにおけるアスパラギナーゼのヒト膵臓癌細胞株に対する作用を様々な研究者が研究した。

アスパラギナーゼのヒト膵臓癌細胞株（ＭＩＡ Ｐａｃａ−２）に対する作用の最初の証拠は、１９７７年にYunisらによって説明が行われた（Yunis AA et al., Int J Cancer, 1977; 19(1): 128-35）。ＭＩＡ Ｐａｃａ２株の存在下でインキュベートしたアスパラギナーゼは、０．１ＩＵ／ｍｌの濃度で上記の細胞の増殖に対して有意な作用を及ぼし、０．５及び１ＩＵ／ｍｌの濃度で細胞増殖を完全に阻害し、細胞死を招く。

アスパラギナーゼ（１ＩＵ／ｍｌの濃度で使用）は別の膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ−１）に対する作用を有するので、上記の作用が膵臓細胞に特異的であることも上記の研究者らは示している。しかし、アスパラギナーゼのヒト肺細胞及びメラノーマ細胞の増殖に対する作用は観察されていない。上記の研究者らは、ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞のアスパラギナーゼに対する感受性のメカニズムは特定しなかった。

翌年、Wuらの研究によって、ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞及びＰＡＮＣ−１細胞におけるこれらの成果が確認された（Wu M. et al., Int J Cancer, 1978 22(6): 728-33）。そのメカニズムは依然として不明であるが、これらの研究者は、アスパラギナーゼの膵臓癌細胞に対する作用がタンパク合成の阻害を介して生じることを示唆した。

これらの成果は、アシネトバクター・グルタミナーゼ・アスパラギナーゼ（ＡＧＡ）という別の酵素によっても得られ、この酵素はアスパラギナーゼよりも効果が高かった（WU MC et al., In Vitro, 1982 Sep; 18(9): 750-4）。この研究者は、この酵素が０．００２５ＩＵ／ｍｌの濃度で（アスパラギナーゼはこの濃度では作用を有さない）ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞とＰＡＮＣ−１細胞の細胞増殖を完全に阻害することと、この活性がこの酵素のグルタミナーゼ活性によっても起きることとを示している。

１９７７年には、Lessnerら（Lessner HE, et al., Digestion, 1977, 16(3): 255）が、膵臓癌の処置におけるＬ−Ａｓｐの考え得る役割を明らかにするための臨床試験を発表したが、患者のうちの２人において反応が見られず、副作用が観察されたことを彼らは既に示していた。膵臓癌の処置におけるアスパラギナーゼの効果を試験することを目的とした第二相臨床試験中に得られた結果の発表（Lessner HE, et al. Cancer Treat. Rep., 1980; 64: 1359-1361）を受けて、膵臓癌の処置でアスパラギナーゼを用いることへの関心は突然中断した。手術不能の膵臓癌患者１０人に大腸菌アスパラギナーゼを１０００ＩＵ／ｋｇ／日で静脈内注射した。重篤な副作用が即座に現れた。このため、この処置を早期に停止した。したがって、実施された唯一の臨床試験では、アスパラギナーゼには、膵臓癌の症例においては治療上の利点はないと結論付けられた。

最近になって、アスパラギナーゼのペグ化形態に関する研究を受け、関心が回復してきている。

１９９９年にＡＡＣＲ会議（AACR Congress）で発表された前臨床試験（Denis LJ et al. Proc Am Assoc Cancer Res, 1999: p.23）において、１ＩＵ／ｍｌのＰＥＧ−アスパラギナーゼの付加によって、細胞増殖を６１％（ＭＩＡ Ｐａｃａ−２）、１００％（ＰＡＮＣ−１）阻害するのが可能になり、１０ＩＵ／ｍｌのＰＥＧ−アスパラギナーゼの存在下でインキュベートしたＢｘＰＣ−３細胞では５１％阻害するのが可能になった。ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞でのＰＥＧ−アスパラギナーゼのＩＣ₅₀は０．１３ＩＵ／ｍｌ、ＰＡＮＣ−１細胞では０．２５ＩＵ／ｍｌである。上記の著者は、ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞をヌードマウスに移植することによって、インビボ実験も行った。ゲムシタビン（１日目、４日目、７日目、及び１０日目に８０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）と共に、又はゲムシタビンなしに、ＰＥＧ−アスパラギナーゼを１４日間注射することによって（１日当たり１２．５ＩＵ／ｇ又は２５ＩＵ／ｇ、腹腔内）、これらのマウスを処置した後、著者は、５９％（ＰＥＧ−アスパラギナーゼのみの場合）、６３．５％（ゲムシタビンのみの場合）、及び８５．９％（ＰＥＧ−アスパラギナーゼとゲムシタビンの場合）の細胞増殖の阻害を観察する。

２００６年のＡＡＣＲ会議（AACR Congress）で、補足的な結果が発表された（Supra P. et al. AACR November 2006）。この研究は、固形腫瘍（膵臓、卵巣、及びリンパ腫）の処置用のＰＥＧ−アスパラギナーゼ（Oncaspar（登録商標）、エンゾン・ファーマシューティカルズ）のインビトロ及びインビボでの評価を示している。ＰＥＧ−アスパラギナーゼのインビトロでの細胞毒性（ＩＣ₅₀）は０．２７ＩＵ／ｍｌ（ＰＡＮＣ−１）、０．６６ＩＵ／ｍｌ（ＭＩＡ Ｐａｃａ−２）、０．４６ＩＵ／ｍｌ（ＰＡＮＣ １０．０５）、及び２０ＩＵ／ｍｌ超（ＣＦＰＡＣ−２及びＡｓＰＣ−１）である。ＰＥＧ−アスパラギナーゼのインビボでの効果は、マウスに移植したＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞（２．５×１０⁶個の細胞）の異種移植片上で測定した。つまり、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ（０．８ｋＩＵ／ｋｇ）で１回処置すると、腫瘍体積を１４％減少させることが可能になり、ゲムシタビン（８０ｍｇ／ｋｇ）によって２９％の減少が可能になり、これらの２つを組み合わせると、４８％の減少が可能になる。ＰＥＧ−アスパラギナーゼ（Oncaspar（登録商標））とゲムシタビン（Gemzar（登録商標））との組み合わせは、固形腫瘍の成長に対する阻害作用を有する。

アスパラギナーゼは３０年よりも長期にわたって使われてきているので、この酵素に付随する望ましくない作用は周知であり、その主たるものは、臨床症状を伴うある種のアレルギー、糖尿病及び膵炎、精神障害、並びに、凝固障害である。

アスパラギナーゼの投与は、ヒトにおいて過敏性反応を引き起こす。発生のメカニズムは複雑で、現時点では完全には解明されていない。アスパラギナーゼは、その高い分子量（＞１０，０００Ｄａ）とタンパク特性ゆえに、直接的な免疫原である。過敏性反応は、ＩｇＥ依存メカニズム（規範的な意味ではアナフィラキシー）、又は補体の活性化のいずれかに由来する場合がある。多くの患者では、特異抗体の形成に至る。アスパラギナーゼは、アスパラギナーゼのクリアランスの上昇と、その治療効果の低下とによって現れる中和特性を有する特異的な循環ＩｇＧの出現を引き起こす（Muller HJ, Boos J., Crit Rev Oncol/hematol 1998; (28): 97-113）。これらの抗体は、３つの形態のアスパラギナーゼ（大腸菌アスパラギナーゼ、エルビニアアスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ）によって観察されているが、ＰＥＧ形態の免疫原性が最も低いようである。

症状には、最も一般的なものとして注射部位における単純な限局性紅斑、又は更には単純な痛みから、喉頭浮腫、気管支痙攣、及び／又は低血圧症があり、例外的に、最も重篤なケースでは、全身性アナフィラキシーショックを起こす（Zubrod CG, Pediatrics, 1970; (45): 555-9）。

アスパラギナーゼによる免疫アレルギー反応の発生率は不明瞭で、処置した患者の５〜７０％である。平均で、小児の４分の１が重篤な反応を示す（Mathe G, Amiel JL, Clarysse A, Recent Results Cancer Res. 1970 (33): 279-87、Woo MH et al., Leukemia, 1998 Oct; 12(10): 1527-33、Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK, J Clin Oncol, 2000 Apr; 18(7): 1525-32）。異なる菌株からのアスパラギナーゼの調製、併用療法の利用、又は投与経路（静脈内又は筋肉内）といった様々な要因によって、この変動性を説明することができる。アレルギー反応の頻度は、１サイクルの処置における注射の回数、及び２回の処置間の間隔と共に上昇する（Mathe 1970）。

特異抗体又は過敏性反応の発生は、処置中断の一般的原因である（Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK, J Clin Oncol, 2000 Apr; 18(7): 1525-32）。特異抗体を産生した患者では、持続期間の短縮によって現れる、アスパラギナーゼの治療効力の低下、並びに／又は、アスパラギナーゼの薬物動態の低下及び変化の発生が観察される。過敏性反応を示した患者では、更に重篤な反応を示す恐れから、予防策として処置が中断される。アレルギー反応を受けて処置が早期に停止されるので、規定の期間中に血漿中のアスパラギンを枯渇させるというアスパラギナーゼの治療目的は達成されない場合が非常に多い。

膵臓は、おそらく高レベルのタンパク合成が原因で、アスパラギナーゼの毒性の標的器官の１つとなっている。この毒性は、急性膵炎（最も一般的）又は糖尿病のいずれかの形で現れ得る。

急性膵炎の臨床症状は、自然に消散する良性の疾患から、合併症（出血、偽嚢胞）、致命的な劇症疾患までに及ぶが、急性膵炎のメカニズムは不明のところが多い。

腫瘍学で用いられる化学療法によって誘発される中毒性膵炎は珍しいものではない。アスパラギナーゼによる中毒性膵炎はかなり文書化されており、多くの症例が文献に報告されている。ＰＥＧ形態も含め、全ての形態を合わせたアスパラギナーゼによる膵炎の総発生率は、研究に応じて２％から１６％まで幅がある（Knoderer HM et al., Pediatr Blood Cancer, 25 August 2006、Muller 1998, 2: 97-113、Alvarez OA et al., Med. Pediatr. Oncol. 2000, 34(3): 200-5）。この膵炎は、出血及び偽嚢胞によって併発し得るが、死亡するケースは依然として稀である。膵炎の発症は、アスパラギナーゼの投与の中断と、膵炎の処置の開始を余儀なくさせる。上記の研究を総体的に考慮すると、比較的高用量のアスパラギナーゼ（３０００ＩＵ〜６０，０００ＩＵ／ｍ²／ｄｏｓｅ）を反復的に投与することが素因である。

アスパラギナーゼによる処置の他の考え得る膵合併症は、糖尿病の発症であり、その発生率は、研究に応じて症例の１〜１４％である。このメカニズムは、ランゲルハンス島のβ細胞によるインスリン産生量の低下と見られる。ケトーシスを伴わない高血糖及び糖尿が、最も一般的な症状である。この作用は可逆的であり、処置を中断すると消失する。プレドニゾンとの同時投与により、高血糖が増大することもあるが、その発症リスクは低くなる。

したがって、膵臓癌の治療の場合には、膵臓が損傷している患者にアスパラギナーゼを使用すると危険を伴う場合があり、これらの望ましくない作用を考慮しなければならない。

上記（Lessner et al., 1980）のような、天然形態のアスパラギナーゼによるヒト臨床試験では、これらの懸念が完全に正しいことが示された。その一方で、ペグ化形態がヒトの膵臓癌治療での使用に適しているかは未だ示されていない。現在までに得られている成果は、インビトロ、及び膵腫瘍異種移植モデルのマウスにおけるインビボでのものに限られている。現在は、ペグ化形態の分子が一方では依然としてアレルギーを起こすものであり（Muller et al., 1998）、他方では膵臓毒性がある（Knoderer 2006; Muller 1998、Alvarez 2000）という事実を考えると、ペグ化形態が臨床での使用に適しているかの立証には程遠い。更には、上記のように、エンゾン・ファーマシューティカルズが、固形腫瘍の治療でのOncaspar（登録商標）の使用に関して実施した臨床試験は、効果が現れる前に毒性が生じたために中断されている（Cowen and Company, "Quick Take: Solide Q4 Results, But Oncaspar Solid Tumor Trial Hits A Snag", Specialty Pharmaceuticals, February 14, 2008）。

アスパラギナーゼの治療指数を向上させる目的で、アスパラギナーゼを赤血球に封入することは、開発研究の主題となっている。赤血球に封入したアスパラギナーゼの耐性研究をKravtzoffらが行った（C. Eur J Clin Pharmacol, 1996; 51(3-4): 221-5）。非ホジキンリンパ腫を主に患った患者１３人に、赤血球に封入したアスパラギナーゼを注射した（３０〜２００ＩＵ／ｋｇ）。この研究では、アスパラギナーゼの直接注射時（２７％）と対照して、アレルギー反応が見られないことが示されている。加えて、赤血球に封入したアスパラギナーゼの注射によって、アスパラギンの枯渇が連続５０日間持続可能になる。

その一方で、様々な研究（国際公開第Ａ−２００６／０１６２４７号、Millan C G et al., Journal of Controlled Release, 2004, 95(l):27-49、Kravtzoff R et al., Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1990, 42(7): 473-476）には、アスパラギナーゼの赤血球への封入と、リンパ腫と急性リンパ芽球性白血病への適用という背景における、この封入酵素の薬物動態特性の向上について記載されている。

封入形態のアスパラギナーゼではアレルギー反応が見られないが、赤血球中に封入した状態での投与には、赤血球が最終的に破壊され、その内容物が血管内腔に流れ出すという点で、特に全身状態が悪いか、又は進行膵臓癌をもつ患者における膵臓レベルでの結果に関して、ある種の疑念が残る。同様に、臨床効果も立証されていない。

本発明者は、膵腫瘍異種移植モデルマウスにおいて、赤血球に封入したアスパラギナーゼの効果を初めて立証した。それと同時に、本発明者は、血管内腔に遊離残留アスパラギナーゼが存在しないことを示す結果を得た。また、本発明者は、赤血球の利用とリンクした薬物動態の向上によって、遊離形態又はＰＥＧ形態で用いる場合に必要となる酵素の量に比べて、酵素の使用量をかなり少なくできるようになり、膵臓毒性リスクが更に低下することを立証した。本発明者によって得られた成果は、進行膵臓癌をもつ患者、又は過敏症患者も含め、膵臓癌の処置に封入アスパラギナーゼを使用することへの道を開く。

すなわち、本発明の第１の目的は、膵臓癌を処置するための医薬としての、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液である。

本発明の第２の目的は、膵臓癌の処置を意図した治療用組成物又は医薬であって、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液を有効量含む治療用組成物又は医薬である。

典型的には赤血球は、薬理学的に許容できる食塩水中に懸濁状態で存在する。これは、赤血球用の標準培地、具体的には、グルコース、デキストロース、アデニン、及び／又はマンニトールのような成分がおそらくは添加されたＮａＣｌ（好ましくは０．９％）の溶液であることができる。用いることができる標準培地は、アデニン、グルコース、マンニトール、及び塩化ナトリウムを基剤とする溶液であるＳＡＧマンニトール及びＡＤｓｏｌである。この溶液は、Ｌ−カルニチンのような保存剤を更に含むことができる。この溶液は、１種以上の他の有効成分、具体的には、後述されているような、膵臓癌の処置を意図した化学療法剤、又は、膵臓癌に付随することのある症状若しくは障害の処置を意図とした有効成分も含むことができる。

上記の懸濁液は、使用できる状態であることができ、希釈なしでも注射又は灌流による投与に適したヘマトクリットを有することができる。

上記の懸濁液は、注射又は灌流による投与の前に希釈する必要がある形でパッケージングすることもできる。

本発明によれば、使用できる状態である懸濁液のヘマトクリットは、有益には約４０〜約７０％、好ましくは約４５〜約５５％、更に良好には約５０％である。

希釈する形態では、ヘマトクリットは更に高く、具体的には約６０〜約９０％であることができる。

上記の溶液は、約１０〜約２５０ｍｌの体積でパッケージングするのが好ましい。パッケージングは、輸血に適したタイプの血液バッグに行うのが好ましい。処方箋に対応する封入アスパラギナーゼの全量を血液バッグに入れるのが好ましい。

封入アスパラギナーゼの量は、具体的には、赤血球の懸濁液１ｍｌ当たり約３０〜約３００ＩＵであることができる。この量は、１ｍｌ当たり約７０〜約１５０ＩＵであるのが好ましい。

本発明の更なる目的は、膵臓癌の処置を意図とした医薬の調製のために、アスパラギナーゼを封入した赤血球、又はこの赤血球の懸濁液を使用することである。このような使用の際には、上記の懸濁液、及び治療用組成物又は医薬に関して示した特徴を考慮に入れる。

本発明は、膵臓癌の進行ステージ、膵臓癌の組織学的形態、膵炎（重症度は様々である）の発症の可能性に拘らず、膵臓癌患者の処置に関する。

本発明は具体的には、
−一次性の膵腫瘍をもつ患者の処置と、
−局所性アデノパシーの患者（感染した局所リンパ神経節の有無は問わない）の処置と、
−遠隔転移をきたした膵臓癌をもつ患者の処置と、
−膵頭部癌をもつ患者の処置と、
−導管腺癌を伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−ムチン性嚢胞腺癌を伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−ムチン性腺管内癌を伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−腺房腺癌を伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−嚢胞性腫瘍と、場合により嚢胞腺癌とを伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−膵臓の排出管の腫瘍を伴う膵臓癌をもつ患者の処置と、
−膵臓内分泌部の癌をもつ患者の処置と、
−膵臓の部分切除又は全切除後の患者の処置と、
に関する。

更なる実施形態では、本発明は、患者の生存期間の改善に関する。

本発明の更なる目的は、膵臓癌の処置方法であり、この方法では、本発明による、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液、又は、治療用組成物若しくは医薬を有効量、それを必要とする患者に投与する。

この方法は、上述のように、様々な形態の疾患に適用することができる。

投与は、静脈内注射又は動脈内注射によって、好ましくは血液バッグ等からの灌流によって行う。投与は典型的には、腕の静脈内に行うか、又は中心静脈カテーテルを介して行う。

具体的には、本発明による、約１０〜約２５０ｍｌの懸濁液（１回量）、治療用組成物、又は医薬を投与する。２０ｍｌを超える場合には、灌流の使用が好ましい。

封入アスパラギナーゼの量は具体的には、赤血球懸濁液１ｍｌ当たり約３０〜約３００ＩＵであることができる。この量は、１ｍｌ当たり約７０〜約１５０ＩＵであるのが好ましい。

処置は、決定したプロトコールに従って、１回量又は数回分の量を投与することを含む。この処置では、推奨される処置継続時間にわたり、月に１度、２週間に１度、又は１週間に一度の間隔で、数回の投与を行うことができる。

この処置は、毎回（１回量服用のたびに）、体重１ｋｇ当たり２０〜５００ＩＵ当量のアスパラギナーゼを投与することに存することができる。１回量当たり５０〜１５０ＩＵ／ｋｇを投与するのが好ましい。

本発明は、膵臓癌の処置用に、アスパラギナーゼを封入した赤血球と標準的な化学療法製品とを組み合わせたものも提供する。つまり、この組み合わせは、ゲムシタビン、シスプラチン、オキサリプラチン、又は、白金誘導体、例えばシスプラチン若しくはオキサリプラチンと組み合わせた５−フルオロウラシルによってもたらすことができる。第１の形態では、本発明による懸濁液、治療用組成物、又は医薬内でこの組み合わせをもたらす。第２の形態によれば、この組み合わせは、同一の患者に別々に、同時に、又は時間差を設けて投与することによる組み合わせである。

アスパラギナーゼ自体には、９０１５−６８−３というＣＡＳ番号が割り当てられている。その慣用名はアスパラギナーゼであり、その他の一般名はコラスパーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼである。

本発明の意味におけるアスパラギナーゼという用語は、あらゆる起源のアスパラギナーゼも網羅し、具体的には、天然若しくは組み換え体由来のもの、並びに、例えばＰＥＧ形態のように、アスパラギナーゼを組み込んだあらゆる誘導体、又は、Ｌ−アスパラギナーゼの活性を保持するフラグメントであることができる。また、あらゆる細菌に由来するアスパラギナーゼも網羅する。つまり、アスパラギナーゼは、大腸菌型のもの、具体的には大腸菌ＨＡＰ−Ａ−１−３、エルビニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）型のもの、又はウォリネラ・スシノゲネス（Wolinella succinogenes）型のものであってよい。「型」とは、当該細菌の培養液から得ることができること、又は、組み換え体、換言すると、遺伝子工学によって得られる当該細菌のアスパラギナーゼの形態であることができることを意味するものとして理解する。好ましい実施形態では、アスパラギナーゼは大腸菌ＨＡＰ−Ａ−１−３型である。

アスパラギナーゼという用語は、本発明の意味においては、Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有する細菌酵素であるアスパラギナーゼ様物質も網羅する。例としては、アシネトバクター・グルタミナーゼ・アスパラギナーゼ（Acinetobacter glutaminase asparaginase）（ＡＧＡ）を挙げてよい。

有効成分の赤血球への封入を可能にする技法は既知であり、本発明において好ましい溶解・再封による基本的な技法は、欧州特許第Ａ−１０１ ３４１号、及び欧州特許第Ａ−６７９ １０１号に記載されており、当業者であれば、これらの特許を参照することができるであろう。この技法によれば、透析ユニット（例えば透析バッグ、又は透析カートリッジ）の第１の区画には、赤血球の懸濁液が連続的に供給され、第２の区画は、赤血球を溶解する目的で、赤血球の懸濁液に比べて低張の水溶液を含む。続いて、再封ユニットにおいて、浸透圧及び／又はコロイド浸透圧を上昇させることによって、アスパラギナーゼの存在下で赤血球の再封を誘導してから、アスパラギナーゼを含む赤血球の懸濁液を回収する。

現時点で示されている変形形態の中でも、国際公開第Ａ−２００６／０１６２４７号に記載されている、効率的で再現可能、かつ信頼性があり安定した形でアスパラギナーゼを封入可能にする方法が好ましい。この方法は以下の段階を含む。
１−６５％以上のヘマトクリットレベルで、等張溶液中に赤血球ペレットを懸濁させ、＋１〜８℃で冷却する段階
２−この同じ赤血球ペレットから採った赤血球サンプルを用いて浸透圧脆弱性を測定する段階。段階１及び２はいずれの順番でも行うことができる（並行して行うことも含む）
３−同じ容器内で、常に＋１〜＋８℃に保たれた温度にて、アスパラギナーゼを溶解及びインターナリゼーションする手順であって、６５％以上のヘマトクリットレベルの赤血球の懸濁液と、＋１〜＋８℃まで冷却した低張性溶解用溶液とを透析カートリッジに通すことと、先ほど測定した浸透圧脆弱性に基づき、溶解パラメーターを調節することとを含む手順
４−内部の温度が＋３０〜＋４０℃である第２の容器内で、高張溶液の存在下で行われる再封手順

「インターナリゼーション」とは、赤血球の内部にアスパラギナーゼを浸透させることを意味するものと理解する。

具体的には、透析のために、６５％以上、好ましくは７０％以上の高いヘマトクリットレベルで、赤血球ペレットを等張溶液中に懸濁させ、この懸濁液を＋１〜＋８℃、好ましくは＋２〜＋６℃、典型的には＋４℃前後まで冷却する。ある特定の態様によれば、ヘマトクリットレベルは６５〜８０％、好ましくは７０〜８０％である。

浸透圧脆弱性は、溶解段階の直前に、懸濁液中にアスパラギナーゼが存在しているか、又は存在していない状態で、赤血球に関して測定するのが有益である。赤血球、又は赤血球を含む縣濁液は、溶解用に選択した温度に近いか、又はこれと同じ温度であるのが有益である。本発明の別の有益な特徴によれば、実施した浸透圧脆弱性測定の値を即座に利用する。換言すれば、サンプル採取の直後に、溶解手順を行う。サンプル採取と溶解開始との間の時間間隔は３０分以内、更に良好には２５分以内、更には２０分であるのが好ましい。

溶解・再封手順を行う方法と、浸透圧脆弱性の測定及び割当に関する更なる詳細については、当業者であれば、国際公開第Ａ−２００６／０１６２７４号を参照することができるであろう。

以下では、非限定的な例として解釈される実施形態によって、本発明について更に詳細に説明していく。

図１は、アスパラギナーゼ又は封入アスパラギナーゼの半減期の計算方法をしているグラフである。 図２は、アスパラギナーゼ又は封入アスパラギナーゼの半減期の計算方法を示しているグラフである。 図３は、各種のプロトコールに従って処置したマウスにおける、時間の関数としての腫瘍成長阻害性を示しているグラフである。 図４は、異種移植モデルの各マウスグループの時間に対する相対腫瘍体積を示している。 図５は、異種移植モデルの各処置マウスグループのマウス生存率を表しているグラフである。

実施例１：Ｌ−アスパラギナーゼをマウス赤血球に封入する方法
透析バッグ内での低張透析法によって、Ｌ−アスパラギナーゼ（Kidrolase（登録商標）、フランス、リモネストのＯＰＩ−ユーサ）をマウス赤血球（ＯＦ1マウス）に封入する。血液を前もって遠心分離して血漿を除去してから、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。透析開始の前に、アスパラギナーゼの存在下でヘマトクリットを７０％に調節し、赤血球（ＲＢＣ）の最終濃度が４００ＩＵ／ｍｌになるように加える。低オスモル濃度の透析バッファーに対して、透析を４℃にて５０分続ける。続いて、高オスモル濃度溶液を添加すると共に、３０分間３７℃でインキュベートすることを通じて、マウス赤血球を再封する。０．９％ＮａＣｌで２回、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（６％）を添加したＳａｇ−マンニトールで１回洗浄した後、赤血球をヘマトクリット５０％に調節する。Ｌ−アスパラギナーゼを封入したこの赤血球は、Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣと称する。この封入によって、ＲＣ１ｍｌ当たり４０ＩＵのアスパラギナーゼという濃度、ヘマトクリット５０％のＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣが生成される。

封入手順中、血液全体、洗浄したＲＢＣ、Ｌ−アスパラギナーゼと混合したＲＢＣ（透析前）、及びＬ−アスパラギナーゼを挿入したＲＢＣ（透析後）の以下の項目について試験した。
−ヘマトクリット（Ｈｔ）
−平均血球体積（ＡＣＶ）
−平均血球ヘモグロビン濃度（ＡＣＨＣ）
−総ヘモグロビン濃度
−細胞計数

Ｌ−アスパラギナーゼ酵素活性の測定のために、低張透析の前後に細胞懸濁液のアリコートを回収する。Ｌ−アスパラギナーゼの評価は、Orsonneau et al., “Dosage automatique en cinetique de l'activite L-Asparaginase plasmatique en suivi therapeutique des leucemies aigues lymphoblastiques”, Ann Biol Clin, 62: 568-572に公開されているプロトコールに従って行った。

実施例２：マウスＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣの薬物動態学的パラメーターと薬物力学的パラメーターの測定
マウスの循環血液中のＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣの半減期を測定する目的、及び、マウスの血漿中のＬ−アスパラギンの枯渇を立証する目的で、マウスＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣをＯＦ１マウスに注射した。２００ＩＵ／ｋｇを１回、各マウスに静脈内注射した。

Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣの半減期は１２．３９±０．７４日である（酵素の活性に基づいて計算）。細胞標識（ＣＦＳＥ−Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ）を介して、マウスＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣの半減期を計算すると、その値は１６．５２±３．１３日であり、ＣＦＤＡ−ＳＥで標識したＲＢＣのみでは、１５．８３±３．３１日である。

血漿中のＬ−アスパラギンは全面的に枯渇し（＜２μＭ）、この枯渇は、Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣの注射から１５分後に実現し、少なくとも２０日間持続する。

表１：Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ、及びＣＦＤＡ−ＳＥで標識したマウスＲＢＣ（ＣＦＳＥ ＲＢＣ）について得られた薬物動態学的データ

半減期は以下のように計算した。
プロット方程式から得られた切片を２で割る。続いて、プロットによって、横座標の対応する値を計算する。
この計算の例は図１に示されており、図中、切片の計算値は２．８４６１である。
切片を２で割った値は１．４２である。
横座標の対応する値の計算法：１．４２＝（−０．１１４５×Ｘ）＋２．８
Ｘ＝（１．４２−２．８）／−０．１１４５＝−１．３８／−０．１１４５＝１２日

より実数に近い半減期は、第２の方法で計算することができ、この方法では、図２に示されているように、縦座標の目盛は対数目盛であり、横座標の目盛りは均等目盛である。
半減期は以下のように計算する。
Ｌｎ（２）／曲線のプロット係数
図２の例（図１と同じ例である）では、半減期は以下のとおりである。
Ｌｎ（２）／０．０８３＝８．３日

表２：Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣと遊離Ｌ−アスパラギナーゼの、時間の関数としての残存Ｌ−アスパラギナーゼ活性の測定

更には、循環血漿のＬ−アスパラギナーゼの評価によって、マウスにＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣを注射してから２４時間を過ぎると、得られる値がアッセイ検出限度（１〜３ＩＵ／リットル）になることが示されている。

実施例３：Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣのマウスへの注射によるヒト膵腫瘍成長阻害性
この実験の目的は、ヒト膵腫瘍をもつマウスにＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣを注射して、腫瘍成長阻害性を観察することである。インビトロにおいてＬ−アスパラギナーゼに対して感受性があり、かつＬ−アスパラギンシンターゼが欠損した細胞株、すなわちＭｉａ Ｐａｃａ−２を選択した。

Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣを注射後の腫瘍成長阻害性を調べるために、１２匹のマウスからなるグループ４つと共に、インビトロプロトコールを定めた。このプロトコールには、膵臓癌向けの対照処置（ゲムシタビン）が含まれている。

試験物質とコントロールの調製
試験物質１：マウス赤血球中に組み込んだＬ−アスパラギナーゼ（Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣと称する）。Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣの調製手順は上述されている（実施例１参照）。

試験物質２：ゲムシタビン

コントロール物質２：ＰＢＳ（ゲムシタビン取り込みバッファー）

Ｍｉａ Ｐａｃａ−２細胞の培養
無胸腺ヌードマウス／ヌードマウス４８匹に皮下注射する目的で、指数増殖期のヒト膵腫瘍細胞（Ｍｉａ Ｐａｃａ−２）（供給源：ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）をトリプシン消化してから、計数、洗浄した後、最後に無血清ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。

動物
５〜６週齢、体重１８〜２２ｇの無胸腺ヌードマウス／ヌード（ＢＡＬＢ／ｃヌード）マウス４８匹をハーラン（フランス）から入手した。処置の前に、これらの動物を特殊なＳＰＦ（特定病原体未感染）ユニット内に７日間置いた。

これら４８匹のマウスをランダムに、１２匹からなる４つのグループに分けた。

腫瘍体積が２００ｍｍ³に達したら、以下のようにマウスに注射した。
−Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ（２００ＩＵ／ｋｇ）を１回、１０ｍｌ／ｋｇ未満の体積で静脈内注射
−ゲムシタビン（６０ｍｇ／ｋｇ）を４回、静脈内注射

処置計画
処置計画は以下のように定めた。
−グループ１：マウスにＰＢＳを投与した。
−グループ２：マウスにゲムシタビン（６０ｍｇ／ｋｇ）を４回注射した（１週間に２回の割合で２週間にわたって注射）。
−グループ３：マウスにＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣを１回注射すると共に、ゲムシタビン（６０ｍｇ／ｋｇ）を４回注射した（１週間に２回の割合で２週間にわたって注射）。
−グループ４：マウスにＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣを１回注射した。

このそれぞれ異なる製品の注射は盲検で行った。

５７日間にわたり腫瘍の測定を定期的に（３〜４日おきに）行った。

結果
図３は、時間の関数として、それぞれに異なるグループの腫瘍成長阻害性を示しているグラフである。

コントロールグループ１では、０ｍｍ³から１０５８±９３９ｍｍ³までの規則的な腫瘍成長、コントロールグループ２では、０ｍｍ³から１３５３±１０１６ｍｍ³までの規則的な腫瘍成長を示している。グループ２（ゲムシタビン）では、マウス内の膵腫瘍の成長に対する医薬の作用は示されていない（腫瘍体積１９６±５７ｍｍ³で注射。５７日目時点で１３５３±１０１６ｍｍ³）。これに対して、ゲムシタビンと併せてＬ−Ａｓｐａ ＲＢＣを注射したケースでは、腫瘍の成長がかなり遅延した。この処置は、腫瘍が１９０±４３ｍｍ³であったときに注射した。また、５７日後の腫瘍体積は、ゲムシタビンのみで処置したグループ２のマウスの１３５３±１０１６ｍｍ³に対して、４９４±７１９ｍｍ³である。最後に、Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ（グループ４）は、腫瘍体積１９３±４６ｍｍ³で注射後、５７日目には２８５±２２５ｍｍ³にしか到達していないので、ゲムシタビンと併用する場合よりも更に、腫瘍成長阻害に有効である。

Ｌ−アスパラギナーゼを封入したマウス赤血球（Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ）が、マウスに移植したヒト膵腫瘍の成長を遅延させるのに最も効果的な処置剤であった。驚くべきことに、Ｌ−Ａｓｐａ ＲＢＣ単独の方が、ゲムシタビンと併用するよりも、腫瘍成長阻害に有効である。

実施例４：膵腫瘍ＰＡＮＣ−１をもつマウスにおける、赤血球に封入したＬ−アスパラギナーゼのインビボでの抗腫瘍性調査

この調査の目的は、赤血球に封入したＬ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣ）をヒト膵腫瘍（ＰＮＣ−１）異種移植モデルに投与したものの抗腫瘍作用をアセスメントすることであった。

ＰＡＮＣ−１は、Ｌ−アスパラギナーゼに対してインビトロ感受性のあるヒト膵臓細胞株である。この調査では、１５匹のマウスからなる４つのグループに、赤血球に封入したＬ−アスパラギナーゼ、ゲムシタビン（膵癌の対照処置）、これら２つの薬剤の組み合わせ、又はコントロールアイテムのいずれかを接種した。１０匹のマウスからなる最後のグループには、何も処置をせず、コントロールグループとして使用した。

試験アイテムとコントロールアイテムの調製

試験アイテム１：マウス赤血球中に封入したＬ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣ）。Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣの製造手順は、実施例１に記載のとおりに行った。
試験アイテム２：ゲムシタビン（Gemzar（登録商標）、イーライ・リリー・アンド・カンパニー）
コントロールアイテム：ＰＢＳ（食塩水）

Ｐａｎｃ−１細胞株の培養

ヒト膵腫瘍細胞ＰＡＮＣ−１（英国のＥＣＣＡＣから入手）の対数増殖培養液をサブクローニングし、その増殖能とアスパラギナーゼに対する感受性に基づき、クローン番号６ｓＣを選択した。
１００匹のｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射するために、クローン番号６ｓＣをトリプシン処理、計数、洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。

動物

５週齢、体重２０ｇ＋／−３ｇの無胸腺ヌードマウス１００匹をハーラン・フランスから入手した。この動物を１２日間環境順化させ、ＳＰＦ（特定病原体未感染）条件、並びに、連続制御した温度条件、湿度条件、光周期条件、及び換気条件に置いた。

細胞移植から４日後、腫瘍体積を測定し、サイズに従ってランク付けし、中央値を計算した。腫瘍体積が中央値よりも大きい３５匹のマウスと、腫瘍体積が中央値よりも小さい３５匹のマウスを調査に含めた（合わせて７０匹のマウス）。

事前に設定したランダム化表に従って、これらの動物をランダムに、１５匹のマウスからなる４つのグループと、１０匹のマウスからなる１グループとに割り当てた。マウスに以下のように接種した。
−Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣ（２００ＩＵ／ｋｇ）を１回、静脈内注射した。投与量は８ｍｌ／ｋｇ以下、又は動物の血液量の１０分の１以下であった。
−ゲムシタビン（８０ｍｇ／ｋｇ）を４回、静脈内注射した。
−ＰＢＳを４回、静脈内注射した。

処置スケジュール
グループ１：マウスにＰＢＳを４回、３日おきに注射した。
グループ２：マウスにゲムシタビンを４回、３日おきに注射した。
グループ３：マウスにＬ−ａｓｐａ ＲＢＣを１回注射すると共に、ゲムシタビンを４回、３日おきに注射した。
グループ４：マウスにＬ−ａｓｐａ ＲＢＣを１回注射した。
グループ５：無処置
４３日間、腫瘍の測定値を１週間に３回（月曜、水曜、及び金曜）記録した。

結果

図４は、各グループの、時間に対する相対腫瘍体積を示している。相対腫瘍体積は、特定の日の腫瘍体積を処置前の腫瘍体積で除することによって計算し、注射日のグループ間における腫瘍体積の統計的差異による偏りを防ぐ。

図４は、ゲムシタビンのグループと、ゲムシタビンとＬ−ａｓｐａ ＲＢＣとを組み合わせたグループの相対腫瘍体積が、ＰＢＳのグループよりもゆっくり増大したことを示している（４３日目において、ゲムシタビンのグループは５１．８±１７．１、ゲムシタビンとＬ−ａｓｐａ ＲＢＣとを組み合わせたグループは４６．３±２９．７、ＰＢＳのグループは７５．１±３１．０）。併用処置の方が、ゲムシタビン単独よりも腫瘍成長阻害に有効である傾向があることに注目すべきである。

この図では、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣの単回注射の方が、コントロールグループよりも相対腫瘍体積がゆっくり増大することが明らかなったので（４３日目において、４９．３±３２．２と７５．１±３１．０）、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣの単回注射の効果を浮き彫りにしている。

図５は、各処置グループのマウスの生存率をグラフで示したものである。Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣ又はゲムシタビン単独で処置したものは、ＰＢＳよりも優れていた訳ではなく、グラフはほぼ、全体的に似通っている（４３日目において、ゲムシタビンのグループでは２０％のマウスしか残らず、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣのグループでは３３％のマウス、ＰＢＳのグループでは１３％のマウスが残った）。グループ間の差異は、統計的には有意ではなかった。しかし、マウスの生存率は、ゲムシタビンをＬ−ａｓｐａ ＲＢＣと組み合わせたことによって大きく上昇し（４３日目において６０％のマウスが依然として生存していた）、その差異は有意であることが明らかになった（ｐ＜０．０１）。更には、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣと組み合わせたゲムシタビンでは、ゲムシタビン単独の場合に比べて、マウスの生存率が統計的に有意な上昇を見せた（ｐ＜０．０５）。

これらの結果によって、ヒト膵臓細胞株をもつマウスにおいては、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣを１回静脈内注射すると、腫瘍の成長が阻害されること、及び、Ｌ−ａｓｐａ ＲＢＣの存在によって、ゲムシタビン処置が強化されることが示されている。この所説は、他のグループよりも高い腫瘍成長阻害性が観察されたことと、調査の最後に生存していた動物の割合によって裏付けられている。

Claims (16)

1. 膵臓癌を処置するための医薬としての、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液。
2. 膵臓癌の処置を意図した治療用組成物又は医薬であって、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液を含む治療用組成物又は医薬。
3. 患者の生存期間を改善するための、請求項１又は２に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
4. 使用できる状態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
5. 使用する前に希釈する、請求項１又は２に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
6. 希釈前のヘマトクリットが６０〜９０％である、請求項５に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
7. 使用できる状態である前記懸濁液のヘマトクリットが約４０〜約７０％、好ましくは約４５〜約５５％、更に良好には約５０％である、請求項３、４、５、又は６に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
8. アスパラギナーゼを１ｍｌ当たり３０〜３００ＩＵ、好ましくは１ｍｌ当たり７０〜１５０ＩＵ含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
9. 化学療法剤を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
10. 前記化学療法剤として、ゲムシタビン、シスプラチン、オキサリプラチン、又は、白金誘導体、例えばシスプラチン若しくはオキサリプラチンと組み合わせた５−フルオロウラシルを含む、請求項９に記載の懸濁液、組成物、又は医薬。
11. 膵臓癌の処置を意図した医薬の調製のための、アスパラギナーゼを封入した赤血球の使用。
12. 患者の生存期間の改善を意図した医薬の調製のための、アスパラギナーゼを封入した赤血球の使用。
13. アスパラギナーゼを１ｍｌ当たり３０〜３００ＩＵ、好ましくは１ｍｌ当たり７０〜１５０ＩＵ含む医薬の調製を目的とする、請求項１１又は１２に記載の使用。
14. １０〜２５０ｍｌの懸濁液の形態である医薬の調製を目的とする、請求項１１、１２、又は１３に記載の使用。
15. アスパラギナーゼを体重１ｋｇ当たり、かつ１回量当たり２０〜５００ＩＵ、好ましくは５０〜５００ＩＵ投与することを意図した医薬の調製を目的とする、請求項１１、１２、１３、又は１４に記載の使用。
16. 患者の生存期間を改善するための方法であって、アスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液を含む組成物又は医薬を該患者に投与する方法。

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