KR20100102676A

KR20100102676A - 췌장암의 치료를 위한 의약

Info

Publication number: KR20100102676A
Application number: KR1020107016332A
Authority: KR
Inventors: 엠마뉴엘 세실레 뒤푸르; 얀 고드프랑
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2010-09-24
Also published as: AU2008339918A1; HRP20150498T1; EP2224950A1; FR2925339B1; EP2224950B1; IL206563A; US20100310612A1; FR2925339A1; CA2710646A1; CN105617366A; JP5932218B2; KR101605838B1; AU2008339918B2; PL2224950T3; ES2537315T3; SI2224950T1; WO2009080837A1; CN101932335A; PT2224950E; US8974802B2

Abstract

본 발명은 췌장암을 치료하기 위한 의약으로서 아스파라기나아제를 캡슐화하는(encapsulate) 적혈구의 현탁액에 관한 것이다. 본 발명은 특히 그와 같은 적혈구 현탁액의 유효량을 함유하는, 췌장암의 치료를 목적으로 하는 치료적 조성물 또는 의약에 관한 것이다.

Description

췌장암의 치료를 위한 의약{Medicament for the treatment of cancer of the pancreas}

본 발명은 췌장암의 치료적 처치(therapeutic treatment)에 관한 것이다. 본 발명은 특히 췌장암의 치료를 위한 신규한 조성물 및 관련된 치료적 처치 방법에 관한 것이다.

췌장암은 프랑스에서 6번째로 흔한 암에 의한 사망 원인이며 (2000년 7181명 사망), 선진국(industrialized country)에서 5번째로 흔한 암에 의한 사망 원인이고, 미국에서는 남성에서 4번째로 흔한 사망 원인이 되었다. 프랑스에서 그의 발병율은 연간 5 내지 10/100,000명의 거주자이며, 매년 조금씩 (1 내지 2 %) 증가하고 있다. 췌장암은 소화기계 암의 7 %를 차지하며, 여성 (40 %)보다 남성 (60 %)에 더 자주 영향을 미친다. 대부분 진행된 단계 (advanced stage)에서 진단되기 때문에, 절반의 경우에서 전이가 발견되며, 상기 암에서의 평균 생존기간은 단지 수 개월에 불과하고 5년 후 생존율 4 내지 6%라는 결과를 가져온다. 모든 단계를 합쳤을 때 중앙 생존기간(survival median)은 4 내지 7 개월이고, 이는 절제술(resection)을 거친 환자의 경우 15 내지 18 개월까지 증가한다.

종양이 수술치료가 불가능하거나 전이를 나타내는 경우, 양호한 전반적 상태(general condition)에 있는 고지된(informed) 환자에서 화학요법(chemotherapy)이 고려될 수 있다. 반응률은 15 내지 30 %였다. 사용되는 의약은 젬시타빈(gemcitabine) (Burris 등., European Journal of Cancer, 1997, 33:18-22), 젬시타빈과 옥살리플라틴의 조합 (Zhao 등., Chinese-German Journal of Clinical Oncology, 2007, 6 (5) : 461-463), 및 플라티늄 유도체와 조합된 5-플루오로우라실이다. 이러한 화학요법은 전이를 나타내는 환자들의 중앙 생존기간을 적당히 증가시킬 수 있으며, 상기 중앙 생존기간은 치료 없이 4 내지 6 개월이다.

신규한 화학요법에 의한 진척에도 불구하고, 췌장암의 예후는 여전히 매우 나쁘다. 치유 목적으로 수술치료를 받은 환자들에서조차도, 국소 및 전이성 재발로 인해 5년 후 생존률은 약 20 %에 불과하다.

췌장암과 관련한 심각성과 매우 나쁜 예후, 및 특히 서양 국가 인구에 있어서 발병률의 점진적인 증가에 직면하여, 현재 제시된 치료법보다 더욱 효과적인 대안적 치료법을 제시할 실질적인 필요가 있다.

아스파라기나아제(Asparaginase)는 약 30년 동안 항-백혈병 화학요법에서 사용되어 온, 박테리아성 미생물 (E.coli 또는 Erwinia chrysanthemi)로부터 생산되는 효소이다. 이 효소는 세포 생활에 필요한 단백질의 생성에 필수적인 아미노산인, 아스파라긴을 가수분해하고 고갈시킨다. 이제, 정상 세포와는 대조적으로, 일부 암성 림프모구 세포(cancerous lymphoblastic cell)는 스스로 아스파라긴을 생산할 능력을 갖지 않으며, 그의 단백질 합성에 있어서 세포 외부 공급원에 의존한다. 아스파라기나아제를 이용한 치료는 상기 세포들로부터 이 필수 구성성분을 박탈하며, 그로 인해 이들의 사멸을 야기한다. 이러한 유사분열 억제제(antimitotic agent)는 종양 세포 선택적이다.

그러나, 천연 아스파라기나아제는 순환 항체(circulation antibody)의 생산을 유도하여 아스파라기나아제의 클리어런스(clearance) 증가 및 때때로 매우 심각한, 알레르기(allergic) 반응을 야기한다 (Wang B 등., Leukemia, 2003; 17 (8) : 1583-1588). 또한, 상기 효소의 짧은 반감기 (24 시간)는 반복 주사 및 입원을 요하게 된다. 이러한 주요 한계들은 페길화 형태(pegylated form)인 PEG-아스파라기나아제의 개발을 야기했으며, 이는 FDA에 의해 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukaemia, LAL)의 1차 요법(first line treatment)으로서 허가되었다.

1980년대에는, 다양한 저자들이 사람 췌장암 세포주(cell line)에 대한 인 비트로(in vitro) 아스파라기나아제의 효과를 연구하였다.

사람 췌장암 세포주 (MIA Paca-2)에 대한 아스파라기나아제의 효과에 대한 첫 번째 증거는 1977년 Yunis 등에 의해 개시되었다 (Yunis AA 등., Int J Cancer, 1977; 19(1): 128-35). MIA Paca2 세포의 존재 하에서 인큐베이션된 아스파라기나아제는 0.1 IU/ml의 농도에서 세포 성장에 유의한 효과를 가지며, 0.5 및 1 IU/ml의 농도에서 세포 성장의 완전한 억제 및 세포 사멸을 나타낸다.

저자들은 또한 아스파라기나아제 (1 IU/ml의 농도로 사용됨)가 또다른 췌장암 세포주 (PANC-I)에 효과를 나타내므로, 이러한 효과가 췌장 세포에 특이적임을 보여준다. 그러나 사람의 폐세포 및 흑색종 세포의 성장에 대해서는 아스파라기나아제의 아무런 효과도 관찰되지 않는다. 저자들은 아스파라기나아제에 대한 MIA Paca-2 세포의 감수성의 메커니즘을 결정하지 못하였다.

다음 해, Wu 등에 의한 연구는 MIA Paca-2 및 PANC-1 세포에 대한 상기 결과들을 확인해주었다 (Wu M.등., Int J Cancer, 1978 22 (6): 728-33). 메커니즘은 여전히 명확하지 않으나, 상기 저자들은 췌장암 세포에 대한 아스파라기나아제의 작용이 단백질 합성의 억제를 통해 일어난다는 것을 시사하였다.

또한 이러한 결과는 또다른 효소, 아시네토박터 글루타미나아제 아스파라기나아제 (Acinetobacter Glutaminase Asparaginase)(AGA)를 사용하여, 아스파라기나아제보다 뛰어난 효능으로 얻어졌다 (WU MC 등., In Vitro, 1982 Sep; 18(9): 750-4). 저자들은 이 효소가 0.0025 IU/ml (동일 농도의 아스파라기나아제를 이용하는 경우 효과를 나타내지 않음)의 농도에서 MIA Paca-2 및 PANC-1 세포의 세포 성장을 완전히 억제하며, 또한 이러한 활성은 상기 효소의 글루타미나아제 활성을 통해서 일어난다는 것을 보여준다.

1977년 Lessner et coll. (Lessner HE 등., Digestion, 1977, 16(3) :255)은 췌장암종(pancreatic carcinoma)의 치료에 있어 L-Asp의 가능한 역할을 기술하기 위한 임상 시험을 공고하였으나, 이미 환자들 중 2명에서 반응을 보이지 않았으며, 부작용을 나타냈다. 아스파라기나아제를 췌장암종의 치료에 사용하는 것에 대한 관심은, 췌장암의 치료에 있어 아스파라기나아제의 효능을 시험하는 것을 목적으로 한 제Ⅱ상 임상시험 (Lessner HE, 등. Cancer Treat. Rep., 1980; 64:1359-1361) 중에 얻어진 결과의 공개 후 갑작스럽게 중단되었다. 수술이 불가능한(inoperable) 췌장암을 앓고 있는 10명의 환자들에게, E.coli 아스파라기나아제가 1000 IU/kg/일의 양으로 정맥내(IV) 주사되었다. 심각한 부작용이 빠르게 나타났다. 그에 따라 치료가 조기에 중단되었다. 따라서 실시된 유일한 임상 시험은 아스파라기나아제가 췌장암의 경우 치료적 유용성(therapeutic interest)을 갖지 않는 것으로 결론내렸다.

보다 최근에는, 아스파라기나아제의 페길화 형태와 관련한 연구와 함께 다시 관심이 높아지고 있다.

1999년 AACR Congress (Denis LJ 등. Proc Am Assoc Cancer Res, 1999: p.23)에서 소개된 전임상 연구에서, 1 IU/ml 농도의 PEG-아스파라기나아제의 첨가는 세포 성장을 61% (MIA Paca-2), 100% (PANC-I) 및 10 IU/ml의 PEG-아스파라기나아제의 존재 하에서 인큐베이션된 BxPC-3 세포에 대해서는 51% 억제할 수 있었다. MIA Paca-2 및 PANC-1 세포에 대한 PEG-아스파라기나아제의 IC₅₀은 각각 0.13 및 0.25 IU/ml이었다. 또한 저자들은 MIA Paca-2 세포를 누드 마우스에 이식(implant)함으로써 인 비보 실험을 수행하였다. 상기 마우스들에 젬시타빈 (1, 4, 7 및 10 일째, 80 mg/kg i/p 투여)의 존재 또는 부재하에, 14일 동안의 PEG-아스파라기나아제 (1일당 12.5 IU/g 또는 25 IU/g i/p 투여) 주사에 의한 치료 후, 저자들은 59% (PEG-아스파라기나아제 단독), 63.5% (젬시타빈 단독) 및 85.9% (PEG-아스파라기나아제와 젬시타빈)의 세포 성장 억제를 관찰했다.

보충적 결과가 2006 AACR Congress (Supra P.등. AACR Nov, 2006)에서 소개되었다. 본 연구는 고형 종양(췌장 종양, 난소 종양 및 림프종)의 치료에 있어서 PEG-아스파라기나아제 (Oncaspar®, Enzon Pharmaceuticals)의 인 비트로 및 인 비보 평가를 제시한다. PEG-아스파라기나아제의 인 비트로 세포독성 (IC₅₀)은 0.27 IU/ml (PANC-1), 0.66 IU/ml (MIA Paca-2), 0.46 IU/ml (PANC 10.05)이고, 20 IU/ml (CFPAC-2 및 AsPC-I)보다 크다. PEG-아스파라기나아제의 인 비보 효능이 마우스에 이식된 MIA Paca-2 세포 (2.5 x 10⁶ 개의 세포)의 이종이식편(xenograft)에 서 결정되었다. 1회의 PEG-아스파라기나아제 (0.8 kIU/kg) 처리는 종양 체적을 14% 만큼 감소시켰고, 젬시타빈 (80 mg/kg)은 29%의 감소를 야기했으며, 상기 두 가지의 조합은 48%의 감소를 야기하였다. PEG-아스파라기나아제 (Oncaspar®) 및 젬시타빈 (Gemzar®)의 조합은 고형 종양의 성장에 대한 억제 효과를 나타냈다.

아스파라기나아제는 30년 넘게 사용되어 왔으므로, 상기 효소와 관련된 바람직하지 않은(undesirable) 효과들이 잘 알려져 있으며, 주된 것들은 임상 증상을 동반한 특정한 알레르기, 당뇨병 및 췌장염, 정신 장애 및 혈액응고 장애이다.

아스파라기나아제의 투여는 사람에서 과민 반응을 야기한다. 발병의 메커니즘은 복잡하고 현재로서는 완전히 규명되지 않았다. 아스파라기나아제는 그의 높은 분자량 (> 100,000 Da) 및 단백질 속성 (protein nature)으로 인해 직접적인 면역원이다. 과민 반응은 IgE-의존적 메커니즘 (고전적 의미의 아나필락시스(anaphylaxis)) 또는 보체의 활성화로부터 유발될 수 있다. 많은 환자에서, 이는 특이적 항체의 생성을 유도한다. 아스파라기나아제는 상기 효소의 클리어런스 증가 및 그 치료 효능의 감소로 나타나는 중화 특성(neutralizing property)을 갖는, 특이적 순환 IgG의 발현을 야기한다 (Muller HJ, Boos J., Crit Rev Oncol/hematol 1998; (28): 97-113). 이 항체는 3가지 형태의 아스파라기나아제 (E. coli, Erwinia 및 PEG-아스파라기나아제)에 대해 관찰되었으나, PEG 형태가 가장 면역원성이 적은 것으로 보인다.

증상들은 가장 흔하게는 단순한 국소형 홍반 또는 더욱 단순하게는 주사 부위의 통증이며, 후두 부종(laryngeal oedema), 기관지연축(bronchospasm) 및/또는 저혈압, 및 예외적으로, 가장 심각한 경우에는 전신성 아나필락시스 쇼크(generalized anaphylactic shock) (Zubrod CG, Pediatrics, 1970; (45) : 555-9)까지 나타난다.

아스파라기나아제로 인한 면역-알레르기 반응의 발생율은 명확하지 않다: 치료받은 환자의 5 내지 70%에서 나타난다. 평균적으로, 어린이의 1/4에서 중증 반응이 유발된다 (Mathe G, Amiel JL, Clarysse A, Recent Results Cancer Res. 1970 (33): 279-87; Woo MH 등., Leukemia, 1998 Oct; 12(10): 1527-33; Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK, J Clin Oncol, 2000 Apr; 18(7): 1525-32). 다양한 인자들이 이러한 변동성을 설명할 수 있다: 서로 다른 박테리아 균주로부터의 아스파라기나아제 준비, 병행 치료 또는 병행 투여 경로(IV 또는 IM)의 이용. 반응의 발생빈도는 1회의 치료 사이클당 주사 횟수 및 두 치료 과정 사이의 시간 간격과 함께 증가한다 (Mathe 1970).

특이적 항체 또는 과민 반응의 발생은 치료 중단의 일반적 원인이다 (Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK, J Clin Oncol, 2000 Apr; 18(7) : 1525-32). 특이적 항체를 발생시킨 환자에서, 지속시간(duration) 및/또는 완화(remission) 발생율의 감소로 나타나는, 아스파라기나아제의 치료 효능의 감소 및 아스파라기나아제의 약물동태의 변화가 관찰된다.

과민 반응을 나타낸 환자에서, 더욱 심각한 반응에 대한 공포는 이의 예방책으로서 치료의 중단을 야기한다. 알레르기 반응 후 치료의 조기 중단으로 인해, 소정의 기간 동안 혈장 아스파라긴의 고갈을 달성하는 것인 아스파라기나아제의 치료 목적은 종종 달성되지 않는다.

췌장은 아스파라기나아제의 독성에 대한 표적 기관 중 하나이며, 이는 아마도 높은 단백질 합성 수준에 기인한다. 이러한 독성은 급성 췌장염 (가장 흔함) 또는 당뇨병의 형태를 취할 수 있다.

급성 췌장염의 임상 증상은 양성의 자발적으로 치유되는 질환에서부터 합병증(출혈, 가낭포(pseudo-cyst)), 치명적인 전격성(fulminating) 질환에 이르기까지 다양하며, 그의 메커니즘은 거의 알려지지 않았다.

종양학에서 사용되는 화학요법에 의해 유도되는 독성 췌장염은 생소하지 않다. 아스파라기나아제에 기인한 독성 췌장염은 잘 기록되어 있으며 많은 사례들이 문헌에 보고된 바 있다. 췌장염에 있어서 아스파라기나아제로 인한 전체 발생율은, PEG 형태를 포함하여 모든 형태를 합했을 때, 연구에 따라 2에서 16 %까지 다양하다 (Knoderer HM 등., Pediatr Blood Cancer, 25 August. 2006; Muller 1998, 2: 97-113; Alvarez OA 등., Med. Pediatr. Oncol. 2000, 34(3) : 200-5). 이러한 췌장염은 출혈 및 가낭포에 의해 복잡해질 수 있으나 사망자는 드물다. 췌장염의 발병은 아스파라기나아제의 중단 및 췌장염 치료의 개시를 필요로 한다. 전반적인 연구결과에 비추어, 반복적이며 비교적 고용량 (3000 IU 내지 60,000 IU/m²/투여)의 아스파라기나아제의 투여는 췌장염의 소인부여 요인(predisposing factor)이 된다.

아스파라기나아제를 사용한 치료의 다른 가능한 췌장 합병증은, 연구결과에 따르면 사례의 1 내지 14 %에서의 당뇨병의 발병이다. 메커니즘은 랑게르한스 섬(islet of Langerhans)의 β 세포에 의한 인슐린 생성의 감소로 보인다. 과혈당증(hyperglycaemia) 및 케톤증을 동반하지 않은 당뇨(glycosuria)가 가장 흔한 증상이다. 이러한 효과는 가역적이며 치료를 중단하면 사라진다. 과혈당증은 프레드니손과의 병행 투여에 의해 증가할 수 있으나, 그 발생 위험은 더 낮다.

따라서, 췌장암을 치료하는 경우, 췌장이 손상된 환자에서 아스파라기나아제의 사용은 위험할 수 있으며, 상기 바람직하지 않은 효과(undesirable effect)들이 고려되어야 한다.

전술된 아스파라기나아제의 천연 형태를 사용한 사람에서의 임상 시험 (Lessner 등., 1980)은 이러한 두려움이 완전히 정당하다는 것을 입증했다. 한편, 페길화 형태는 췌장암의 치료를 위한 사람의 임상 용도에 적합한지 여부가 아직 확인되지 않았다. 현재까지 얻어진 결과들은 인 비트로 결과 및 마우스 췌장 종양 이종이식 모델에서의 인 비보 결과에 국한된다. 현재, 임상에서의 사용에 있어서 페길화 형태의 적합성은, 상기 분자가 일면에서는 여전히 알레르기를 유발하며 (Muller 등, 1998) 다른 한편으로는 췌장에 독성을 나타낸다는 (Knoderer 2006; Muller 1998; Alvarez 2000) 사실에 비추어볼 때 확립되지 않았다. 게다가, 전술된 바와 같이, 고형 종양의 치료를 위한 Oncaspar^®의 사용과 관련하여 Enzon Pharmacuticals에 의해 실시된 임상 시험은, 효능 이전에 독성에 도달했기 때문에 중지되었다 (Cowen and Company, "Quick Take: Solide Q4 Results, But Oncaspar Solid Tumor Trial Hits A Snag", Specialty Pharmaceuticals, February 14, 2008).

치료 지수를 개선하기 위한 아스파라기나아제의 적혈구(red corpuscle) 내 캡슐화(encapsulation)는 개발 연구의 대상이 되어왔다. 적혈구 내에 캡슐화된 아스파라기나아제에 대한 내약성(tolerance) 연구가 Kravtzoff 등에 의해 수행되었다 (C. Eur J Clin Pharmacol, 1996; 51(3-4): 221-5). 대부분 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)를 앓고 있는 13명의 환자들에 적혈구 내에 캡슐화된 아스파라기나아제 (30 내지 200 IU/kg)를 주사하였다. 본 연구는 아스파라기나아제의 직접 주사시 (27 %)와 비교했을 때 알레르기 반응의 부재를 입증하였다. 또한, 적혈구(erythrocyte) 내에 캡슐화된 아스파라기나아제의 주사는 아스파라긴 고갈이 50일 동안 연속하여 지속될 수 있게 한다.

한편, 다른 연구 (WO-A-2006/016247; Millan C G 등., Journal of Controlled Release, 2004, 95(l): 27-49; Kravtzoff R 등., Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1990, 42 (7): 473-476)는 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병에 대한 적용과 관련하여, 아스파라긴의 적혈구 내 캡슐화 및 상기 캡슐화된 효소의 약동학적 성질의 개선을 개시한다.

아스파라기나아제의 캡슐화 형태가 알레르기 반응의 부재를 보인 반면에, 적혈구 내에 캡슐화된 상태로의 투여는, 적혈구가 파괴되어 혈관 구획(vascular compartment) 내로 그 내용물을 방출한다는 점에서 볼 때, 특히 불량한 전반적 상태(general condition) 또는 진행된 췌장암을 가진 환자에서, 췌장 수준에서의 결과에 대한 일정한 의구심을 남긴다. 또한, 그의 임상적 효능은 입증된 바 없다.

본 발명자들은 마우스 췌장 종양 이종이식 모델에서, 적혈구 내에 캡슐화된 아스파라기나아제의 효능을 최초로 입증하였다. 동시에, 본 발명자들은 혈관 구획 내에 유리 잔류 아스파라기나아제(free residual asparaginase)의 부재를 입증하는 결과를 얻었다. 이들은 또한 적혈구의 사용과 관련된 약물동태의 개선은, 유리 형태 또는 PEG 형태로서의 사용시 필요한 양에 비해 훨씬 감소된 양의 효소를 사용할 수 있게 하여, 췌장 독성 위험을 보다 경감시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 본 발명자들에 의해 얻어진 결과는, 진행된 형태의 췌장암을 갖는 환자 또는 민감한 환자를 포함하여, 췌장암의 치료에서 캡슐화된 아스파라기나아제의 사용에 대한 길을 열어준다.

본 발명의 첫번째 목적은 췌장암의 치료용 의약인, 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다.

본 발명의 두번째 목적은 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구 현탁액의 유효량을 포함하는, 췌장암의 치료를 목적으로 하는 치료용 조성물 또는 의약이다.

일반적으로, 적혈구는 약제학적으로 허용가능한 염수 용액(saline solution) 중의 현탁액 상태이다. 이는 가능하다면 글루코오스, 덱스트로오스, 아데닌 및/또는 만니톨과 같은 첨가 성분을 포함하는 적혈구용 표준 매질(standard medium), 특히 NaCl 용액 (바람직하게는 0.9 %)일 수 있다. 사용될 수 있는 표준 매질은 아데닌, 글루코오스, 만니톨 및 염화나트륨에 기반한 용액인, SAG 만니톨 및 AD솔(ADsol)이다. 상기 용액은 L-카르니틴과 같은 보존제를 더 포함할 수 있다. 상기 용액은 또한, 후술되는 바와 같이 하나 이상의 다른 활성 성분(들), 특히 췌장암의 치료를 목적으로 하는 화학요법제(들), 또는 췌장암에 동반될 수 있는 증상 또는 장애의 치료를 목적으로 하는 활성 성분(들)을 더 함유할 수 있다.

현탁액은 즉시 사용가능한(ready for use) 것일 수 있고, 희석 없이 주사 또는 관류(perfusion)에 의해 투여하기에 적합한 헤마토크리트(haematocrit)를 가질 수 있다.

현탁액은 또한 주사 또는 관류에 의한 투여 전에 희석되도록 포장될 수 있다.

본 발명에 따르면, 즉시 사용가능한 현탁액의 헤마토크리트는 유용하게는 약 40 내지 약 70 %이고, 바람직하게는 약 45 내지 약 55 % 및 보다 양호하게는 약50 %이다.

희석을 위한 형태에서는, 헤마토크리트는 더욱 높을 수 있으며, 특히 약 60 % 내지 약 90 %일 수 있다.

용액은 바람직하게 약 10 내지 약 250 ml의 용량(volume)으로 포장된다. 포장은 바람직하게는 수혈에 적합한 종류의 혈액 백(blood bag)이다. 바람직하게는, 의약 처방에 상응하는 캡슐화 아스파라기나아제의 함량 전부가 혈액 백에 포함된다.

캡슐화 아스파라기나아제의 양은 특히 약 30 내지 약 300 IU/적혈구 현탁액 ml일 수 있다. 이는 바람직하게는 약 70 내지 약 150 IU/ml 이다.

본 발명의 또다른 목적은 췌장암의 치료를 목적으로 하는 의약의 제조를 위한, 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구 또는 그와 같은 적혈구의 현탁액의 용도이다. 상기 용도는 현탁액 및 치료용 조성물 또는 의약에 있어서 제시되는 특성들을 고려한다.

본 발명은 췌장암의 발생 단계, 암의 조직학적 형태 및 보다 높거나 또는 보다 낮은 중증도의 췌장염의 발생가능성과 무관하게, 환자의 치료에 관한 것이다.

본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:

- 원발성 췌장 종양을 가진 환자의 치료;

- 국소 림프 신경절의 침범(affected local lymphatic ganglia)을 동반하거나 동반하지 않은, 국소 선증(adenopathy)을 가진 환자의 치료;

- 원격 전이를 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 췌장두(head of pancreas)의 암을 가진 환자의 치료;

- 관선암종(ductal adenocarcinoma)을 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 점액성 낭선암종(mucinous cystadenocarcinoma)을 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 점액성 내관성 암종(mucinous intraductal carcinoma)을 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 선방세포 선암종(acinar adenocarcinoma)을 동반한 췌장암종을 가진 환자의 치료;

- 낭성 종양 및 가능하게는 낭선암종을 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 췌장 분비관(excretory canal)의 종양을 동반한 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 내분비 췌장암을 가진 환자의 치료;

- 췌장의 부분절제술 또는 전절제술 후 환자의 치료.

추가적인 구체예에서, 본 발명은 환자 생존의 증가에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 췌장암의 치료 방법으로, 상기 방법에서 본 발명에 따른 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 현택액, 또는 치료용 조성물 또는 의약의 유효량이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.

본 방법은 전술된 바와 같은, 췌장암의 다른 형태에 적용될 수 있다.

투여는 혈액 백 등으로부터의 정맥내 또는 동맥내 주사, 및 바람직하게는 관류에 의해 이루어진다. 투여는 일반적으로 팔로 정맥내 투여되거나 또는 중심 정맥도관(central catheter)을 통해 이루어진다.

특히, 약 10 내지 약 250 mL의 본 발명에 따른 현탁액 (1회 투여량), 치료용 조성물 또는 의약이 투여된다. 20 mL를 초과하는 경우, 관류를 이용하는 것이 바람직하다.

캡슐화된 아스파라기나아제의 함량은 특히 적혈구 현탁액 mL 당 약 30 내지 약 300 IU일 수 있다. 바람직하게는 상기 함량은 mL 당 약 70 내지 약 150 IU이다.

치료는 결정된 프로토콜에 따라 1회 투여량 또는 수회 투여량의 투여를 포함한다. 이는 권장되는 치료 기간에 걸쳐, 1개월, 2주, 또는 1주 간격으로 수회 투여를 제공할 수 있다.

상기 치료는 각 회(각 투여)마다 체중 kg 당 20 내지 500 IU의 아스파라기나아제의 동등량(equivalent)의 투여로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여 당 50 내지 150 IU/kg가 투여된다.

본 발명은 또한 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구 및 췌장암의 치료를 위한 표준 화학치료 제품(standard chemotherapeutic product)의 조합을 제공한다. 따라서, 상기 조합은 젬시타빈, 시스플라틴, 옥살리플라틴 또는 백금 유도체, 예를 들어 시스플라틴 또는 옥살리플라틴과 조합된 5-플루오로우라실에 의해 이루어질 수 있다. 제1 양태(mode)에서, 상기 조합은 본 발명에 따른 현탁액, 치료용 조성물 또는 의약 내에서 이루어진다. 제2 양태에서, 상기 조합은 동일한 환자에 대한 개별(seperate) 투여, 동시(concomitant) 투여, 또는 시차(staggered) 투여에 의한 조합이다.

아스파라기나아제 자체는 CAS 번호에 의해 지정된다: 9015-68-3. 그의 관용명은 아스파라기나아제이다; 그에 대한 다른 일반명들은 하기와 같다: 콜라스파아제(colaspase), L-아스파라기나아제 및 L-아스파라긴 아미노히드롤라아제.

본 발명과 관련하여 용어 아스파라기나아제는 모든 기원(origin)의 아스파라기나아제를 포괄하며, 특히 천연 또는 재조합 기원, 및 예를 들어 PEG 형태와 같은, 아스파라기나아제를 내포(incorporate)하는 모든 유도체, 또는 L-아스파라기나아제 활성을 보유하는 단편일 수 있다. 상기 용어는 또한 모든 박테리아 기원의 아스파라기나아제를 포함한다. 따라서, 아스파라기나아제는 E.coli 형, 특히 E. coli HAP-A-l-3형, 에뤼니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)형, 또는 올리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes)형일 수 있다. "형(type)"은 당해 박테리아의 배양으로부터 얻어질 수 있거나, 재조합될 수 있는, 즉 유전 공학에 의해 얻어지는 박테리아의 아스파라기나아제 형태를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 구현 양태에서, 아스파라기나아제는 E. coli HAP-A-1-3 형이다.

용어 아스파라기나아제는 또한, 본 발명과 관련하여 L-아스파라긴 아미노히드롤라아제 활성을 가지는 박테리아성 효소인, 아스파라기나아제-유사 물질을 포함한다. 예를 들면, 아시네토박터 글루타미나아제 아스파라기나아제(Acinetobacter glutaminase asparaginase)(AGA)가 언급될 수 있다.

적혈구 내 활성 성분(active principle)의 캡슐화를 가능하게 하는 기술이 공지되어 있으며, 본 명세서에서 선호되는 용해-재봉합(lysis-resealing)에 의한 기초적인 기술이 특허 EP-A-1O1 341 및 EP-A-679 101에 개시되고, 당업자는 이를 참조할 수 있다. 본 기술에 따르면, 투석 유닛(dialysis unit) (예를 들면, 투석 백 또는 투석 카트리지(catridge))의 제1 구획(compartment)에 지속적으로 적혈구 현탁액이 공급되며, 반면 제2 구획은 적혈구를 용해시키기 위해, 적혈구 현탁액보다 상대적으로 저장성인 수성 용액을 포함한다; 다음으로, 재봉합 유닛에서는, 삼투압(osmotic and/or oncotic pressure)을 증가시킴으로써 아스파라기나아제의 존재 하에서 적혈구의 재봉합이 유도되고, 그 후 아스파라기나아제를 함유하는 적혈구의 현탁액이 수집된다.

현재까지 기술된 변형들 중에서, 효율적이고, 재현가능하며, 신뢰성있고 안정된 방법으로 아스파라기나아제를 캡슐화할 수 있게 하는, WO-A-2006/016247에 개시된 방법이 바람직하다. 본 방법은 다음 단계들을 포함한다:

1 - 65 % 이상의 헤마토크리트 수준으로, 등장 용액 중에 적혈구를 현탁화시키고, +1 내지 +8°C에서 냉장시키는 단계,

2 - 상기 동일한 적혈구 펠렛(corpuscle pellet)에서 유래한 적혈구의 샘플을 이용한 삼투압 취약성(osmotic fragility)을 측정하는 단계로서, 단계 1 및 2는 어떤 순서로든지(병행하는 것을 포함) 수행가능하며,

3 - 동일한 밀폐용기(enclosure) 내에서, +1 내지 +8 ℃로 일정하게 유지되는 온도에서, 용해 및 아스파라기나아제의 내부화(internalization)를 수행하는 단계로서, 65 % 이상의 헤마토크리트 수준의 적혈구 현탁액 및 +1 내지 +8 ℃로 냉장된 저장성 용해 용액을 투석 카트리지에 통과시키는 단계를 포함하며, 용해 파라미터(parameter)는 앞에서 측정된 삼투압 취약성을 바탕으로 하여 조정되는 것인 단계; 및

4 - 내부 온도가 +30 내지 +40 ℃인 제2 밀폐용기에서 고장성 용액의 존재 하에 재봉합 과정을 수행하는 단계.

"내부화(internalization)"는 적혈구 내부로의 아스파라기나아제의 침투를 의미하는 것으로 이해된다.

특히, 투석에 있어서, 적혈구 펠렛은 등장성 용액 중에 65 % 이상, 및 바람직하게는 70 % 이상의 높은 헤마토크리트 수준으로 현탁되고, 이 현탁액은 +1 내지 +8 ℃, 바람직하게는 +2 내지 +6 ℃, 일반적으로 약 +4 ℃로 냉장된다. 특별한 양태에 따르면, 헤마토크리트 수준은 65 내지 80 %, 바람직하게는 70 내지 80 %이다.

삼투압 취약성은 유용하게는 용해 단계 직전에, 현탁액 중 아스파라기나아제의 존재 또는 부재 하에 적혈구에 대해 측정된다. 적혈구 또는 그를 함유하는 현탁액은 유용하게는 용해를 위해 선택된 온도에 근접하거나 또는 동일한 온도이다. 본 발명의 또다른 유용한 특성에 따르면, 실시된 삼투압 취약성의 측정은 신속하게 이용되며, 즉 용해 과정이 샘플을 채취한 직후에 실시된다는 것을 의미한다. 바람직하게, 샘플 채취(sampling) 및 용해 개시 사이의 시간 간격은 30분 이하이며, 더욱 바람직하게 25분 이하, 및 심지어는 20분 이하이다.

삼투압 취약성의 측정 및 허용치(allowance)를 포함하여, 용해-재봉합 과정을 수행하는 방법에 관한 보다 상세한 사항에 대해서, 당업자는 WO-A-2006/016247를 참조할 수 있을 것이다.

이제 본 발명은 비-제한적인(non-limiting) 실시예로서 선택된 구현 양태(implementation mode)에 의해 더욱 상세하게 기술될 것이다.

도 1 및 2는 아스파라기나아제 또는 캡슐화된 아스파라기나아제의 반감기의 계산 방법을 도시하는 그래프이다.
도 3은 다양한 프로토콜에 따라 처리된 마우스에서, 시간에 대한 함수로서 종양 성장 억제를 도시하는 그래프이다.
도 4는 이종이식 모델에서 각각의 마우스 군에 대한, 시간 대비 상대적 종양 체적을 도시한다.
도 5는 이종이식 모델에서 각각의 마우스 처리군에 대한 마우스 생존율의 그래프 표현(graphic representation)이다.

실시예 1 : 마우스( murine ) 적혈구 내 L-아스파라기나아제의 캡슐화 방법

L-아스파라기나아제 (Kidrolase®, OPI-EUSA Limonest France)는 투석 백 내에서의 저장 투석(hypotonic dialysis) 방법에 의해 마우스 적혈구 (OFl 마우스) 내에 캡슐화된다. 혈액을 미리 원심분리시켜 혈장을 제거한 후, 0.9 % NaCl로 3회 세척한다. 투석 시작 전에, 최종 농도 400 IU/적혈구(red corpuscles or red blood cells (RBC)) ml에 도달할 때까지 첨가된 아스파라기나아제의 존재 하에서 헤마토크리트를 70 %로 조절한다. 투석은 낮은 오스몰 농도(osmolarity)의 용해 완충액(lysis buffer)에 대해, 4 ℃에서 50분 동안 지속된다. 그 다음, 높은 오스몰 농도의 용액을 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 마우스 적혈구를 재봉합한다. 0.9 % NaCl로 2회 세척 및 소 혈청 알부민 (Bovine serum albumin) BSA (6 %)가 보강된 Sag-만니톨로 1회 세척한 후에, 적혈구를 헤마토크리트 50 %로 맞춘다. L-아스파라기나아제를 캡슐화하고 있는 적혈구를 L-Aspa RBC라고 부른다. 상기 캡슐화는, 헤마토크리트 50 %인 40 IU 아스파라기나아제/RC mL의 농도로 L-Aspa RBC를 생성한다.

캡슐화 과정 중에, 전혈, 세척된 RBC, L-아스파라기나아제와 혼합된 RBC (투석 전) 및 L-아스파라기나아제가 적재(load)된 RBC (투석 후)를 하기에 대해 시험한다:

- 헤마토크리트 (Ht)

- 평균 적혈구 용적 (average corpuscular volume, ACV)

- 평균 적혈구 헤모글로빈 농도 (average corpuscular haemoglobin concentration, ACHC)

- 총 헤모글로빈 농도 (total haemoglobin concentration) 및

- 세포 계수(cell count).

저장 투석 전과 후에, L-아스파라기나아제 효소 활성의 측정을 위해 세포 현탁액의 분액(aliquot)들을 회수한다. 하기에 공개된 프로토콜에 따라 L-아스파라기나아제의 평가를 수행한다: Orsonneau 등., "Dosage automatique en cinetique de l'activite L-Asparaginase plasmatique en suivi therapeutique des leucemies aigues lymphoblastiques", Ann Biol Clin, 62: 568-572.

실시예 2 : 마우스에서 L- Aspa RBC 의 약동학적 및 약력학적 파라미터의 결정

마우스에서 순환하는 L-Aspa RBC의 반감기를 결정하고, 마우스 혈장 중 L-아스파라긴의 고갈을 입증하기 위해, 마우스의 L-Aspa RBC를 OF1 마우스에 주사하였다. 각각의 마우스에 정맥 내 투여경로로 200 IU/kg의 단일 투여량을 주사했다.

L-Aspa RBC의 반감기는 12.39 ± 0.74일이다 (효소의 활성을 바탕으로 한 계산). 마우스 L-Aspa RBC의 반감기를 세포 표지화(labelling) (CFSE-L-Aspa RBC)를 통해 계산하는 경우, 그 값은 16.52 ± 3.13일이며, 단순히 CFDA-SE로 표지된 RBC (CFSE-RBC)의 경우 15.83 ± 3.31일이다.

혈장 L-아스파라긴은 완전히 고갈되며 (< 2 μM), 이러한 고갈은 L-Aspa RBC의 투여 15분 후에 얻어지고, 20일 이상 지속된다.

표 1: L- Aspa RBC 및 CFDA - SE 로 표지된 마우스 RBC ( CFSE RBC )에 대해 얻어진 약동학적 데이터

	RBC		L-아스파라기나아제
	24시간 후 생존율 (%)	반감기 (일)	24시간 후 생존율 (%)	반감기 (일)
L- Aspa RBC	-	-	57.9 ± 2.5	12.39 ± 0.74
CFSE -L- Aspa RBC	80.7 ± 0.7	16.52 ± 3.13	76.7 ± 1.4	12.20 ± 1.38
CFSE RBC	92.7 ± 2.6	15.83 ± 3.31	-	-

반감기를 다음과 같이 계산하였다:

플롯 식(plot equation)으로부터 얻어진 절편값(intercept point)을 2로 나눈다. 그 다음, 플롯을 이용하여 그에 해당하는 가로축의 값을 계산한다.

계산의 예가 도 1에 표시되며, 계산된 절편값은 2.8461이다.

교차점의 반값 : 1.42

가로축의 상응하는 값의 계산 : 1.42 = (-0.1145 * X) + 2.8

X = (1.42 - 2.8) / -0.1145 = -1.38 / -0.1145 = 12일

도 2에 나타난 것과 같이, 세로축이 로그 스케일(logarithm scale)이고 가로축이 선형 스케일(linear scale)인, 제2 방법을 사용하여 더욱 실제에 가까운 반감기를 계산할 수 있다.

반감기는 다음과 같이 계산한다:

Ln (2) / 곡선의 플롯 계수(plot coefficient).

도 2의 예에서 (도 1에서와 동일한 실시예임) 반감기는 다음과 같다:

Ln (2)/ 0.083 = 8.3 일.

표 2 : L- Aspa RBC 및 유리 L-아스파라기나아제에 대한, 시간에 대한 함수로서 잔류 L-아스파라기나아제 활성의 측정

시간
	15분	24시간	3일	9일	14일	20일	잔류 아스파라기나아제 활성 (%)
L- Aspa RBC	100	57.1	46.9	39.8	24.9	10.6
유리 L- Aspa	100	3.3	0	0	0	0

또한, 순환 혈장 L-아스파라기나아제의 평가는, 마우스에 L-Aspa RBC 주사 24시간 이후에는 얻어진 값들이 분석 검출 한계(assay detection limit) (1 내지 3 IU/리터)에 있다는 것을 보여준다.

실시예 3 : 마우스에서 L- Aspa RBC 주사에 대응한 사람 췌장 종양의 성장 억제

본 실험의 목적은 사람의 췌장 종양을 보유한 마우스에 L-Aspa RBC를 주사하고 종양 성장 억제를 관찰하는 것이다. 인 비트로에서 L-아스파라기나아제에 감수성을 가지며 L-아스파라긴 신타아제(L-asparagine synthase)가 결여된 세포주를 선택하였다: Mia PaCa-2.

L-Aspa RBC의 주사 후 종양 성장 억제를 연구하기 위해, 4군의 마우스 12마리를 사용하는 인 비보 프로토콜을 설계했다. 췌장암에 대한 표준 치료제(reference treatment)인 젬시타빈이 상기 프로토콜에 포함된다.

시험 물질 및 대조 물질의 제조

시험 물질 1 : 마우스 적혈구에 적재된 L-아스파라기나아제(L-Aspa RBC라 명명함). L-Aspa RBC의 제조 방법은 전술되어 있다 (실시예 1 참조).

시험 물질 2 : 젬시타빈

대조 물질 2 : PBS (젬시타빈 흡수 완충액(gemcitabine uptake buffer))

Mia PaCa -2 세포의 배양

지수적 증식기(exponential growth phase)에 있는 사람의 췌장 종양 세포 (Mia PaCa-2) (ATCC 기원: American Type Culture Collection)를 트립신으로 처리 (tryptic digestion)하고, 계수하고, 세척한 후, 48마리의 무흉선 누드/누드 마우스에 피하 주사하기 위해 DMEM 무혈청(serum-free) 매질 중에 재현탁시켰다.

동물

5-6주령, 체중 18 내지 22 g의 무흉선 누드/누드 (누드 balb/c) 마우스 48마리를 Harlan (프랑스)으로부터 공급받았다. 동물들을 치료 전에 특수화된 SPF (무- 특이-병원체(specific-pathogen-free)) 유닛(unit) 중에 7일 동안 있게 하였다.

상기 48마리의 마우스를 무작위로, 각 12마리의 마우스로 이루어진 4개의 군으로 나누었다.

종양 체적이 200 mm³에 도달했을 때, 마우스에 하기를 주사하였다:

- 10 ml/kg를 초과하지 않는 부피로, 정맥내 투여경로에 의해, L-Aspa RBC (200 IU/kg) 1회 주사

- 정맥내 투여경로에 의해, 젬시타빈(60 mg/kg) 4회 주사.

치료 계획

다음과 같이 투여계획을 수립하였다:

- 1 군: 마우스에 PBS를 투여함

- 2 군: 마우스에 젬시타빈 (60 mg/kg)을 주 2회씩 2주 동안, 4회 주사함.

- 3 군: 마우스에 L-Aspa RBC를 1회 주사, 젬시타빈 (60 mg/kg)을 주 2회씩 2주 동안, 4회 주사함

- 4 군: 마우스에 L-Aspa RBC를 1회 주사함.

상기 서로 다른 제품들의 주사는 맹검으로 이루어졌다.

종양의 측정은 규칙적으로 (3 내지 4일 간격으로) 57일 동안 이루어졌다.

결과

도 3은 시간의 함수로서 서로 다른 군에서의 종양 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

두 개의 대조군 (1 및 2)은 각각 0 내지 1058 ± 939 mm³ 및 0 내지 1353 ± 1016 mm³의 규칙적인 종양 성장을 보인다. 2 군(젬시타빈)은 마우스에서의 췌장 종양 성장에 대해 약제의 효과를 나타내지 않는다 (종양 체적 196 ± 57 mm³일 때 주사, 및 57일차 종양 체적 1353 ± 1016 mm³). 대조적으로, 젬시타빈과 조합된 L-Aspa RBC의 주사는 종양 성장을 상당한 정도로 지연시킨다: 본 처리는 종양이 190 ± 43 mm³일 때 주사했으며, 57일 후 종양 체적은 젬시타빈만으로 처리한 2 군의 마우스의 1353 ± 1016 mm³ 과 비교하여, 494 ± 719 mm³이었다. 마지막으로, L-Aspa RBC (4 군)는, 종양 체적 193 ± 46 mm³에서의 주사 후, 57일 경과시 단 285 ± 225 mm³에 불과하여, 젬시타빈과의 조합보다 종양 성장 억제에 더욱 효과적이다.

L-아스파라기나아제를 캡슐화하는 마우스 적혈구 (L-Aspa RBC)가 마우스에 이식된 사람 췌장 종양의 성장을 지연시키는 데 있어서 가장 효과적인 처리였다. 놀랍게도, L-Aspa RBC 단독처리가 젬시타빈과의 조합에 비해 종양 성장 억제에 더 효과적이다.

실시예 4: 췌장 종양 PANC -1을 보유하는 마우스에서, 적혈구 내에 캡슐화된 L-아스파라기나아제의 인 비보 항-종양 연구

본 연구의 목적은 사람 췌장 종양 (PANC-1) 이종이식 모델에 투여된, 적혈구 내 캡슐화된 L-아스파라기나아제 (L-Aspa RBC)의 항종양 효과를 평가하는 것이었다.

PANC-1은 L-아스파라기나아제에 인 비트로 감수성을 갖는 사람 췌장 세포주이다. 본 연구에서는, 각 15마리의 마우스로 이루어진 4개의 군이 적혈구 내에 캡슐화된 L-아스파라기나아제, 젬시타빈 (췌장암에서의 표준 치료제), 상기 두 작용제의 조합 또는 대조 약품(control item)을 투여받았다. 10 마리의 마우스로 이루어진 마지막 군은 아무런 처리도 받지 않았으며, 대조군으로 이용되었다.

시험 약품 및 대조 약품의 제조

시험 약품 1: 마우스 적혈구 내로 캡슐화된 L-아스파라기나아제(L-aspa RBC). L-aspa RBC의 제조 과정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.

시험 약품 2: 젬시타빈 (Gemzar®, Eli Lilly and Company)

대조 약품: PBS (염 용액)

Panc -1 세포주 배양

사람 췌장 종양 세포 PANC-1 (ECCAC, UK에서 제공받음)의 대수적-성장 배양물을 서브클로닝(subclone)하고, 성장 능력 및 아스파라기나아제에 대한 감수성을 바탕으로 클론 no.6sC를 선별했다.

클론 n°6sC를 트립신처리하고(trypsinize), 계수하고, 세척하고, 100 마리의 nu/nu 무흉선 마우스에 피하 주사하기 위해 무-혈청 DMEM 매질 중에 재현탁시켰다.

동물

체중 2Og +/- 3g, 5주령의 무흉선 누드 마우스 100마리를 Harlan France로부터 제공받았다. 동물들을 12일의 환경순응(acclimatization) 기간을 거치게 하고, SPF (무-특이 병원체) 조건 및 계속적으로 통제된 온도, 습도, 광주기 및 환기 조건 하에 두었다.

세포 이식 4일 후에, 종양 체적을 측정하여 크기에 따라 정렬시키고, 중앙값(median)을 계산하였다. 중앙값보다 큰 종양 체적을 갖는 마우스 35마리, 및 중앙값보다 작은 종양 체적을 갖는 마우스 35마리를 본 연구에 포함시켰다 (총 70 마리).

미리 작성해둔 임의화 표(randomization table)에 따라 상기 동물들을 무작위적으로, 각 15마리의 마우스로 이루어진 4개의 군 및 10마리의 마우스로 이루어진 1개의 군으로 나누었다. 마우스들에 하기를 투여했다:

- 1회의 L-aspa RBC (200 IU/kg) i.v. 주사. 투여 용량(ㅍolume)은 8 ml/kg 또는 상기 동물의 혈액량(blood volume)의 10분의 1을 넘지 않았다,

- 4회의 젬시타빈 (80 mg/kg) i.v. 주사

- 4회의 PBS i.v. 주사

처리( treatment ) 계획

- 1 군: 마우스에 3일마다 PBS를 4회 주사했다.

- 2 군: 마우스에 3일마다 젬시타빈을 4회 주사했다.

- 3 군: 마우스에 L-aspa RBC를 1회 주사하고 3일마다 젬시타빈을 4회 주사했다.

- 4 군: 마우스에 L-aspa RBC를 1회 주사했다.

- 5 군: 아무런 처리를 하지 않았다.

종양 측정을 주당 3회 (월요일, 수요일 및 금요일), 43일 동안 기록하였다.

결과

도 4는 각각의 군에 대해 시간 대비 상대적 종양 체적을 도시한다. 상대적 종양 체적은 당해 날짜의 종양 체적을 처리 전 종양 체적으로 나누는 방법으로 계산하여, 주사 당일 군들 사이의 종양 체적의 통계적 차이로 인한 편향(bias)을 배제시킨다.

도 4는 젬시타빈 군 및 젬시타빈과 조합된 L-aspa RBC 군에서 상대적 종양 체적이, PBS 군에 비해 더욱 느리게 증가하는 것을 보여준다 (43일차, 각각 51.8 ± 17.1; 46.3 ± 29.7 및 75.1 ± 31.0). 조합 처리가 젬시타빈 단독의 경우보다 종양 성장 억제에 더 효과적인 것에 주목할 필요가 있다.

상대적 종양 체적이 대조군에서보다 느리게 증가한 것으로 밝혀짐에 따라 (43일차, 49.3 ± 32.2 대 75.1 ± 31.0), 상기 결과는 L-aspa RBC의 1회 주사의 효능을 부각시킨다.

도 5는 각각의 처리군에 대한 마우스 생존율의 그래프 표현이다. L-aspa RBC 또는 젬시타빈 단독 처리는 그래프가 거의 전부 중첩됨에 따라, PBS에 비해 뛰어나지 않았다 (43일차, 젬시타빈 군에서는 20%의 마우스만이 생존했고, L-aspa RBC 군에서 33 % 및 PBS 군에서 13 %의 마우스가 생존함). 군들 사이의 편차는 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나, 마우스 생존률은 젬시타빈과 L-aspa RBC의 조합에 의해 크게 향상되었고 (43일차에 60%의 마우스가 생존함) 그 차이는 유의성이 있는 것으로 나타났다 (p<0.01). 게다가, 젬시타빈 단독인 경우와 비교하여 L-aspa RBC와 조합된 젬시타빈은 마우스 생존에 있어 통계적으로 유의한 향상을 야기했다 (p<0.05).

이러한 결과는 1회의 L-aspa RBC i.v. 주사가 사람 췌장 세포주를 보유한 마우스에서 종양 성장을 억제하며, 젬시타빈 치료효과는 L-aspa RBC의 존재에 의해 상승된다는 것을 시사한다. 이러한 진술은 다른 군들과 비교하여 관찰되는 종양 성장의 최대 억제 및 본 연구의 종료시 생존 동물의 비율에 의해 뒷받침된다.

Claims

췌장암 치료용 의약으로서 아스파라기나아제를 캡슐화(encapsulate)하는 적혈구의 현탁액.
아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는, 췌장암의 치료를 목적으로 하는 치료용 조성물 또는 의약.
제1항 또는 제2항에 있어서, 환자 생존의 증가를 위한 것인, 현탁액, 조성물 또는 의약.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 즉시 사용가능한(ready for use) 것인, 현탁액, 조성물 또는 의약.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사용 전 희석용인 것인, 현탁액, 조성물 또는 의약.
제5항에 있어서, 희석 전의 헤마토크리트(haematocrit)는 60 내지 90%인 것인 현탁액, 조성물 또는 의약.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 즉시 사용가능한 현탁액의 헤마토크리트는 약 40 내지 약 70 %이고, 바람직하게 약 45 내지 약 55 %이며, 더욱 바람직하게는 약 50 %인 것인 현탁액, 조성물 또는 의약.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, mL 당 30 내지 300 IU, 바람직하게는 mL 당 70 내지 150 IU의 아스파라기나아제를 함유하는 것인 현탁액, 조성물 또는 의약.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료제(chemotherapeutic agent)를 더 함유하는 것인 현탁액, 조성물 또는 의약.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료제로서 젬시타빈, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 또는 백금 유도체, 예를 들면 시스플라틴 또는 옥살리플라틴과 조합된 5-플루오로우라실을 함유하는 것인 현탁액, 조성물 또는 의약.
췌장암의 치료를 목적으로 하는 의약의 제조를 위한, 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 용도.
환자 생존의 증가를 목적으로 하는 의약의 제조를 위한, 아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 용도.
제11항 또는 제12항에 있어서, mL 당 30 내지 300 IU, 바람직하게는 mL 당 70 내지 150 IU의 아스파라기나아제를 함유하는 의약의 제조를 위한 것인 용도.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 250 mL의 현탁액 형태의 의약의 제조를 위한 것인 용도.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 체중 kg 당 및 투여(dose) 당 20 내지 500 IU, 바람직하게는 50 내지 500 IU의 아스파라기나아제를 전달하는 것을 목적으로 하는 의약의 제조를 위한 것인 용도.
아스파라기나아제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는 조성물 또는 의약이 환자에게 투여되는 것인, 환자 생존을 증가시키는 방법.