JP2015043706A - ポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを、迅速かつ精度よく評価する方法の提供。
【解決手段】ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体から採取されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することを特徴とする、ポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法、前記分析が、ラテックス中のポリイソプレンの定量であることを特徴とする前記記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法、並びに、前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする前記いずれか記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを、迅速かつ精度よく評価する方法に関する。

天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、ゴム製品の主原料として様々な用途において幅広く、かつ大量に用いられている。天然ゴムは、ゴムノキ等のラテックス産生植物が分泌するラテックス（Ｌａｔｅｘ、乳液）を採取し、これに所望の加工をすることにより製造される。このため、主にタイ・マレーシア・インドネシア等の熱帯諸国において、ラテックスを回収するためのゴムノキ、特にパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が、商業的に植樹されている。

近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に、好ましい外来遺伝子を導入することによって、形質を改変することができるようになった。天然ゴムの製造分野においても、ラテックス産生植物を遺伝学的に改良し、より高品質のラテックスを産生し得る植物体や、より大量のラテックスを産生し得る植物体等の所望の形質を有する植物体を作成する方法が研究されている。

例えば、植物の遺伝子導入法としては、植物病原菌の１種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入するアグロバクテリウム法、遺伝子を担持させた金粒子をパーティクルガンにより植物細胞内に撃ち込むパーティクルガン法、エレクトロポレーション法が主として用いられている（例えば、特許文献１参照。）。

アグロバクテリウム法により、パラゴムノキの形質転換体作成に成功している事例が幾つかある。例えば、パラゴムノキの葯由来カルスに、アグロバクテリウム属細菌のベクター系を用いて所望の遺伝子を導入し、この植物組織から植物を再生することにより、形質転換されたパラゴムノキを作成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。また、パラゴムノキの珠皮由来カルスからアグロバクテリウム法により形質転換体が得られたという報告もある（例えば、非特許文献１参照。）。

例えば、天然ゴムの主成分たるシス型ポリイソプレンの生合成を促進し得るような機能を有する遺伝子を、パラゴムノキに導入することにより、よりラテックス産生能に優れた形質転換体が作製できることが期待される。ここで、ある遺伝子がシス型ポリイソプレンの生合成に関与しているかどうかは、実際にその遺伝子を対象植物に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体から採取されたラテックス量を測定することにより、はじめて確認することができる。しかしながら、パラゴムノキでは、他の種類の植物と比較して、再分化や形質転換の効率が非常に低く、形質転換体の作製が困難であるという問題がある。

そこで、パラゴムノキと同様に乳管を有しており、かつ、質転換体の作製効率の高い植物をモデル植物として用いることにより、ポリイソプレン生合成経路の解明や、より高品質のラテックスを産出し得る遺伝子組み換えパラゴムノキの作製を、より短期間で効率よく行えることが期待できる。

これまでに、パラゴムノキの代替となるモデル植物として、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）を利用した技術が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。ペリプロカは、ガガイモ科の半木本植物であって、パラゴムノキと同様に乳管を有し、シス型ポリイソプレンを生産する。非特許文献２では、具体的には、パラゴムノキのＲＥＦプロモーターをクローニングし、ＧＵＳ遺伝子をマーカー遺伝子としたベクターを作製して、これをペリプロカへ導入し、ＧＵＳ活性を確認している。

このように、再分化及び形質転換系が確立しており、かつ、パラゴムノキよりも遥かに生育が早いため、ペリプロカは、パラゴムノキのモデル植物として非常に好適である。このため、ある遺伝子がパラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する際に、当該遺伝子をペリプロカに導入し、得られた形質転換体を分析することにより、当該遺伝子を直接パラゴムノキに導入して分析するよりも、迅速に評価することができる。

特開２００５−１３０８１５号公報 特許第３２８９０２１号公報

ブラン（Blanc）、外４名、プラント・セル・レポート（Plant cell Report）、２００６年、第２４巻、第７２４〜７３３ページ。 長井ら、第１１７回日本森林学会大会予稿集（２００７）ｐ５２０。

形質転換体のポリイソプレン及びその生合成経路に関与する代謝物の分析は、当該形質転換体から回収されたラテックスを試料として行うことができる。
しかしながら、一般的に、植物組織中の代謝物を分析するためには、有機溶媒を用いて当該植物組織から目的物質を抽出する等、煩雑で時間のかかる前処理が必要であった。さらに、分析には多量の試料を要するため、十分量の試料が回収できる程度に形質転換体が生長するまで分析することができず、評価に長期間を要するという問題もあった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、評価対象である遺伝子がパラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与しているか否かの評価を、迅速かつ精度よく行うための方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、パラゴムノキの替わりに、形質転換体の作製効率の高いペリプロカをモデル植物とし、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、この形質転換体から回収されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することによって、当該遺伝子がパラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを、迅速かつ精度よく評価し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
（１） ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体から採取されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することを特徴とする、ポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法、
（２） 前記分析が、ラテックス中のポリイソプレンの定量であることを特徴とする前記（１）記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法、
（３） 前記定量を、濃度既知のポリイソプレンの標準品を、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することによって作成された検量線に基づき行うことを特徴とする前記（２）記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法
（４） 前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法、
を提供することを目的とする。

本発明のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法を用いることにより、評価対象である遺伝子をパラゴムノキに直接導入することによって作製された形質転換体を評価する方法や、形質転換体から回収されたラテックスから有機溶媒を用いて抽出したポリイソプレンを定量する方法等の従来法よりも、パラゴムノキのポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子を、効率よく評価することができる。

ペリプロカとは、アフリカ、欧州、北米、アジアなどに自生するガガイモ科ペリプロカ属に属する蔓性の低木（半木本植物）である。乳管を有し、天然ゴムの原料となる乳液を生産する植物であり、植物体を傷つけることで乳液を出すものである。具体的には、ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ グラエカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｇｒａｅｃａ）、ペリプロカ ラエヴィガタ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｌａｅｖｉｇａｔａ）等が例示できる。

トウダイグサ科の木本植物であるパラゴムノキと、ペリプロカとは、分類学上は全く異なる。しかしながら、ペリプロカは、パラゴムノキと同様のラテックスを生産する乳管構造を有している。さらに、本願発明者らが、ペリプロカから採取したラテックス中の成分を分析したところ、分子量が１０００００オーダーという、天然ゴムに匹敵する大きさのシス型ポリイソプレンを含有することが判明した。つまり、ペリプロカは、パラゴムノキと同様の乳管構造を有し、かつパラゴムノキと同様の成分を有するラテックスを産生する植物であり、ラテックス産生という点においては、パラゴムノキのモデル植物として有用である

乳管等の器官構造とラテックスの成分とがともに近似していることから明らかであるように、少なくとも乳管におけるポリイソプレン生合成経路は、ペリプロカとパラゴムノキとでは非常に近似している。すなわち、ペリプロカに導入することにより、当該植物体のラテックス中のポリイソプレンの量や構造を変化させられる遺伝子であれば、パラゴムノキに導入した場合においても、ラテックス中のポリイソプレンに対して同様の変化を起こし得ると推定される。

本発明のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体から採取されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析（熱分解ＧＣ／ＭＳ）法により分析することを特徴とする。

本発明及び本願明細書において、「ポリイソプレン生合成遺伝子」とは、ポリイソプレンの生合成経路において機能するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。なお、本発明においては、ポリイソプレン生合成遺伝子とは、ポリイソプレンの生合成経路において機能するタンパク質をコードするものであればよく、生物由来の天然の遺伝子に限られるものではなく、天然の遺伝子を改変した改変遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。改変遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数のヌクレオチドが欠損、置換又は付加された変異遺伝子、遺伝子を構成するＤＮＡの一部分のみからなるＤＮＡや、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数の領域が欠損、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、複数の遺伝子を組み合わせたキメラ遺伝子等が挙げられる。

本発明において評価対象となる遺伝子は、生物由来の天然の遺伝子であってもよく、天然の遺伝子を改変した遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。また、パラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、ペリプロカ由来の遺伝子であってもよく、その他のラテックス産生植物由来の遺伝子であってもよく、動物や微生物由来の遺伝子であってもよく、これらの遺伝子の改変遺伝子であってもよい。

なお、その他のラテックス産生植物としては、例えば、トウダイグサ科のセアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ラゴスゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｕｔｅａ Ｖａｈｌ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）、ガガイモ科のオオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｔｅｇｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、トチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。

評価対象とする遺伝子は、パラゴムノキを含むラテックス産生植物由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることが好ましく、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ由来の遺伝子であって、ポリイソプレン生合成経路に関与している可能性の高い遺伝子又はその変異遺伝子であることがより好ましい。

評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、植物の形質転換体を作製する場合に用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、評価対象である遺伝子を構成するＤＮＡを組み込んだベクターを、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いてプロペリカへ導入することによって、当該遺伝子が導入された形質転換体を作製することができる。

本発明においては、アグロバクテリウム法を用いて形質転換体を作製することが好ましい。プロペリカは、アグロバクテリウム菌による感染効率が高く、かつ、再分化効率が良好であり、アグロバクテリウム法による形質転換体の作製に好適であるためである。

アグロバクテリウム法は、植物体に導入する遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを、アグロバクテリウム属菌に導入し、この遺伝子導入されたアグロバクテリウム属菌を、常法により培養し増殖させた後、カルス又は幼植物体に感染させることによって、植物体に遺伝子を導入する方法である。評価対象たる遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、評価対象たる遺伝子等を組み込んだ遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに、評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えバイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。なお、感染に用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。

評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えベクターは、当該分野において公知のいずれの手法を用いて作製してもよい。一般的に、評価対象とする遺伝子を構成するＤＮＡの前後にプロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む状態で、ベクターに組み込まれているが、これらの制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入される植物中で機能し得るものであればよく、ペリプロカ由来の遺伝子やパラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。その他、乳管特異的プロモーターを用いることも好ましい。

評価対象とする遺伝子は、好適には、マーカー遺伝子とともにベクターに組み込まれることが好ましい。
選抜用マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。また、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、選抜用マーカーとして用いることも好ましい。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＤｓＲｅｄ等の、通常タンパク質発現ベクター等に組み込んで用いられる蛍光タンパク質の中から、適宜選択して用いることができる。

ペリプロカの形質転換体は、例えば、前記ベクターを含む感染液に、ペリプロカの根、茎、葉又は花等の組織、あるいはカルス等の細胞を接触させた後、組織培養することにより得られる。なお、選抜用マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、さらに抗生物質を含有する選択培地で培養することにより、形質転換体を効率よく選抜することができる。

組織や細胞は、殺菌又は滅菌してから組織培養に供する。殺菌又は滅菌は、公知の殺菌剤・滅菌剤を使用して行えば良く、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を使用するのが好ましい。

組織培養は、遮光条件下、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、好ましくは２〜４日程度、同じ組成の培地上で行えば良い。
選択培地での培養は、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２０日間で行う。培養温度は、上記組織培養の場合と同様で良い。

作製した形質転換体は、再分化培地上で培養を継続することにより、シュートを伸長させることができる。伸長したシュートを発根させることにより、幼植物体を取得することができる。その後、この幼植物体を馴化用土に移植し、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、育成することにより、成体の形質転換体を得ることができる。

このようにして得られたペリプロカの形質転換体（以下、「形質転換ペリプロカ」ということがある。）からラテックスを採取し、これを分析する。具体的には、ラテックス中のポリイソプレンの含有量を分析し、遺伝子導入前のペリプロカと比較することにより、導入された遺伝子が、ポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価することができる。すなわち、形質転換ペリプロカから回収されたラテックス中のポリイソプレンの含有量や構造、組成比等が、遺伝子導入前のペリプロカから回収されたラテックスとは有意に相違する場合には、導入された遺伝子は、ポリイソプレンの生合成経路に関与する遺伝子であると評価することができる。

本発明の評価方法においては、ラテックス中のポリイソプレンの含有量を定量することが好ましい。例えば、形質転換ペリプロカから回収されるラテックス中のポリイソプレンの含有量が、遺伝子導入前のペリプロカよりも増大していた場合には、当該遺伝子の発現量を増大させることにより、ポリイソプレンの生合成が促進されることが分かり、導入された遺伝子は、ポリイソプレンの生合成経路に関与する遺伝子であると評価することができる。

本発明の評価方法においては、ラテックスを熱分解ＧＣ／ＭＳ法により分析する。分析に供されるラテックスは、形質転換ペリプロカが産出したものであればよく、植物体から採取されたままのものであってもよく、回収後にアンモニアの添加・濃縮・凝固・冷凍等の処理がなされたものであってもよく、その後さらに加工処理がなされたものであってもよい。例えば、形質転換ペリプロカから採取した後に乾燥したものを、そのまま熱分解ＧＣ／ＭＳに供することができる。

熱分解ＧＣ／ＭＳ法は、例えば、試料を瞬間的に加熱し、分解生成された化合物をＧＣにより分離した後にＭＳで同定することが可能な装置を用いて、常法により行うことができる。また、ポリイソプレンの同定は、ポリイソプレンの標準品（ポリイソプレン標準物）から得られたデータに基づいて行うことができるが、得られたクロマトグラムやマススペクトルに対して、公知のライブラリに格納されているデータを参照して行ってもよい。

本発明においては、濃度既知のポリイソプレン標準物を用いて作成し、この作成された検量線を用いて、ラテックス中のポリイソプレンを定量することが好ましい。検量線を用いることにより、より正確にポリイソプレン含有量を定量することができる。このような検量線は、例えば、濃度既知のポリイソプレン標準物から得られたクロマトグラムのピーク高さ又はピーク面積から作成することができる。

なお、形質転換ペリプロカからのラテックスの採取方法は、ペリプロカが産出するラテックスを回収できる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、ペリプロカの茎を傷つけるだけの操作により、簡単にラテックスを回収することができる。一般的に、生体分子の評価試験に植物組織を用いる場合には、当該植物組織に対して前処理を行うことが必要であるが、ペリプロカのラテックスは、多くの場合、ほぼ前処理なしで利用できる。

特に、本発明においては、ラテックスを熱分解ＧＣ／ＭＳ法により分析するため、分析に要する試料は極少量でよい。このため、本発明の評価方法に用いるラテックスは、生育の早い段階にある形質転換ペリプロカから回収することもできる。すなわち、ラテックスを回収する形質転換ペリプロカは、乳管が形成される程度にまで成育していれば十分であり、シュートであってもよい。

本発明の評価方法により、パラゴムノキのポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することにより、非常に高い確率で、当該遺伝子が導入された形質転換ペリプロカで観察されたものと同様の変化が、パラゴムノキのラテックスにおいても起こることが期待できる。例えば、本発明の評価方法によりポリイソプレンの生合成の促進に関与する遺伝子であると評価された遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、植物体中のポリイソプレン生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を効率よく作製することができる。

なお、パラゴムノキの形質転換体の作製は、前述のペリプロカと同様に、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。例えば、ゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をすることにより、本発明の評価方法によってパラゴムノキのポリイソプレン生合成遺伝子であると評価された遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体を作製することができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
ポリイソプレンの生合成に関与していることが公知である遺伝子を過剰発現させた形質転換体を作製し、当該遺伝子の機能評価を行った。
＜形質転換ペリプロカの作製＞
まず、ＩＰＰをコードするＩＰＰ遺伝子のＣ末端にＣＰＴをコードするＣＰＴ遺伝子を結合させたＩＰＰ−ＣＰＴキメラ遺伝子と、カナマイシン耐性遺伝子であるｎｐｔII遺伝子とを組み込んだＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子含有バイナリーベクターを作製し、これを、アグロバクテリウムにおいて汎用されているアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入し、ＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを作製した。
次いで、ペリプロカの無菌苗の胚軸部分を５ｍｍ程度に切断し、これをＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを含む感染液に接触させて感染させた後、これを培地で遮光条件下、２５℃で３日間培養した。
感染により遺伝子を導入したペリプロカは、カナマイシン耐性選択培地で、さらに２５℃、明期１６時間の条件下で培養した。これらのペリプロカの胚軸の切り口部分に発生するカルスのうちの幾つかのカルスを選抜し、培養を継続してシュートを伸長させた。
伸長したシュートを試験管内で発根させ、形質転換体の幼植物体を取得した。これらの幼植物体は、１０ｃｍ程度に生長した時点で、馴化用土に移植し、隔離温室で馴化栽培を実施した。なお、隔離温室栽培は、日本植生株式会社（岡山県津山市）に依頼し、室温２５℃、照度制御した隔離温室下で育成した。

得られた形質転換体に、実際にＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子が導入されているかどうかを、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ分析により確認した。具体的には、再分化した幼植物体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により検出することによって、ＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子の有無を確認した。

＜検量線の作成＞
ポリイソプレン標準物又は合成イソプレンゴムを標準品として用い、これらを精製した後、熱分解温度５９０℃の条件で熱分解ＧＣ／ＭＳ分析を行った。ポリイソプレンの２量体に帰属されるクロマトグラムのピーク面積から、検量線を作成した。

＜ラテックスの分析＞
ＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子の導入が確認された形質転換体を、数１０ｃｍの高さの株になるまで成育させた後、当該形質転換体の茎を傷つけ、傷口から数１０μｌ以上のラテックスを採取した。得られたラテックスを凍結乾燥させた後、上記検量線の作成時と同じ条件で熱分解ＧＣ／ＭＳ分析を行い、得られたクロマトグラムのピーク面積から、ポリイソプレン含有量を測定した。また、対照として、野生株のペリプロカから採取されたラテックスについても同様に測定した。
この結果、形質転換体は野生株に比べ、ラテックス中のポリイソプレン含有量が多いことがわかった。

［実施例２］
ポリイソプレンの生合成に関与していることが公知である遺伝子のアンチセンスを導入した形質転換体を作製し、当該遺伝子の機能評価を行った。
＜形質転換ペリプロカの作製＞
実施例１において用いたＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子のアンチセンス（ＩＰＰ−ＣＰＴキメラ遺伝子を構成するポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド）と、カナマイシン耐性遺伝子であるｎｐｔII遺伝子とを組み込んだＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子アンチセンス含有バイナリーベクターを作製し、これをＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子含有バイナリーベクターに替えて用いた以外は、実施例１と同様にして、ＩＰＰ−ＣＰＴ遺伝子のアンチセンスが導入された形質転換体を作製した。
実施例１と同様にして、得られた形質転換体を成育させた後、ラテックスを採取し、ポリイソプレン含有量を測定した。
この結果、ラテックス中のポリイソプレン含有量に有意差は認められなかった。

以上より、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカから採取されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法を用いて分析することにより、ポリイソプレン生合成における当該遺伝子の機能を評価し得ることが確認された。

本発明のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキにおいてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子の機能を迅速かつ精度よく評価することができるため、本発明のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法は、特に天然ゴムの産生の分野で有用である。

Claims (4)

1. ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてポリイソプレンの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
   評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体から採取されたラテックスを、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することを特徴とする、ポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法。
2. 前記分析が、ラテックス中のポリイソプレンの定量であることを特徴とする請求項１記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法。
3. 前記定量を、濃度既知のポリイソプレンの標準品を、熱分解ガスクロマトグラフ質量分析法により分析することによって作成された検量線に基づき行うことを特徴とする請求項２記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法。
4. 前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のポリイソプレン生合成遺伝子の評価方法。