JP2015041007A - 顕微鏡システムおよび測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる顕微鏡システムおよび測定方法を提供すること。【解決手段】標本を照明する照明光を出射する光源と、標本、および照明光の強度を検出する第１検出部のいずれかを選択的に照明光の光路上に配置可能に保持する保持手段と、照明光の光路を、保持手段が保持する標本に導く第１の光路および／または該第１の光路とは異なる第２の光路に変更する光路変更／分岐手段と、第２の光路上であって、第１検出部と光学的に共役な位置に設けられ、光路変更／分岐手段により第２の光路に光路が変更、または分岐された照明光の強度を検出する第２検出部と、第１および第２検出部が検出した各強度と、標本の照明光の照射面における照射面積とをもとに、放射照度を演算し、放射照度をもとに第２検出部が検出した強度に基づく放射照度を補正する演算補正部と、を備えた。【選択図】図１

Description

本発明は、例えば、照明光を標本に照射し、標本が発した光を受光して標本の観察を行う顕微鏡に用いられる顕微鏡システムおよび測定方法に関するものである。

従来、医学や生物学等の分野では、細胞等の観察に、標本を照明して観察する顕微鏡システムが用いられている。また、工業分野においても、金属組織等の品質管理や、新素材の研究開発、電子デバイスや磁気ヘッドの検査等、種々の用途で顕微鏡が利用されている。顕微鏡システムによる標本の観察としては、目視による観察の他、ＣＣＤイメージセンサまたはＣＭＯＳイメージセンサ等の撮像素子を用いて標本像を撮像した画像や、光強度等の数値のモニタ表示による観察が知られている。

一般に、顕微鏡システムは、土台をなす本体部と、接眼レンズが取り付けられる鏡筒を有する観察部と、を備える。本体部には、例えば標本を載置するステージ、倍率の異なる複数の対物レンズを標本に対して交換可能に保持するレボルバ、落射照明光を出射する光源などが取り付けられる。

顕微鏡システムでは、対物レンズを介して標本に落射照明光を照射し、この照明光が標本で反射した反射光、もしくは照明光の照射によって標本に標識された蛍光色素が励起されて生じた蛍光を、対物レンズが取り込んで観察光として取得し、この観察光を結像することで標本像が形成される。

ところで、励起光としての照明光を蛍光色素が標識された標本に照射して、この照明光により励起された蛍光色素からの蛍光を観察する場合、励起光の強度によって、その蛍光の強度も変化するため、再現性のある測定データを取得するには標本に照射される励起光の強度を把握する必要がある。

ここで、励起光の強度が一定であれば、同一の観察条件における蛍光特性の再現性をとることは可能である。しかしながら、光源は経時的な強度変動を伴うため、光源の強度変動に応じて標本に照射される励起光の強度も変動する。また、同じ測定結果が得られたとしても、標本における照射面積が異なっていると、単純にそれらの測定結果を比較することができない。このため、標本面の単位面積当たりに照射される励起光の強度、すなわち放射照度を経時的に把握することが重要となる。細胞特性の研究において、細胞の定性的なデータを蛍光の強度プロファイルとして取得する場合、測定時の励起光の強度（放射照度）などの条件と、この励起光による測定結果との対応付けがデータの信頼性にも結びつく。

このような励起光の強度に関する技術として、標本の近傍に光を受光する受光部（検出器）を設けて、標本近傍で照射される光の強度を測定する技術が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１では、励起光の強度測定装置の受光部が、ステージまたはレボルバ部、あるいは透過コンデンサ部に装着された構成になっている。

また、光源と一体的に配置され、光源から出射された励起光の強度を測定する第１の光強度検出器と、観測位置において励起光の強度を測定する第２の光強度検出器と、を備え、第１および第２の光強度検出器によって測定された強度をもとに励起光の強度を制御する技術が開示されている（例えば、特許文献２を参照）。

特許第４６８９９７５号公報 特開２００５−９１７０１号公報

しかしながら、特許文献１の構成では、標本面における励起光の放射照度を測定することはできない。さらに、蛍光観察中に励起光の強度を測定することができないため、励起光の経時変化の把握ができない。

また、特許文献２が開示する技術は、特許文献１と同様、標本面における励起光の放射照度を測定することはできない。その一方、蛍光観察中に、光源から出射された励起光の強度を測定することは可能であるが、アーク光源の場合、一般的に動作時間の経過とともに、陰極先端部が消耗してアーク発光点が徐々に移動するため、光源から出射された光の強度からでは、標本面に照射される励起光の強度を正確に測定できないおそれがある。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる顕微鏡システムおよび測定方法を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる顕微鏡システムは、標本を照明する照明光を出射する光源と、少なくとも前記標本、および前記照明光の強度を検出する第１検出部のいずれかを選択的に前記照明光の光路上に配置可能に保持する保持手段と、前記照明光の光路を、前記保持手段が保持する前記標本に導く第１の光路および／または該第１の光路とは異なる第２の光路に変更する光路変更／分岐手段と、前記第２の光路上であって、前記第１検出部と光学的に共役な位置に設けられ、前記光路変更／分岐手段により前記第２の光路に光路が変更、または分岐された前記照明光の強度を検出する第２検出部と、前記第１および第２検出部が検出した各強度と、前記標本の前記照明光の照射面における照射面積とをもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である放射照度を演算し、前記放射照度をもとに前記第２検出部が検出した強度に基づく放射照度を補正する演算補正部と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡システムは、上記の発明において、前記第２の光路上であって、前記照射面と光学的に共役な位置に設けられ、前記照明光の一部を通過させて該照明光の前記照射面における照射範囲を絞る開口が形成された視野絞りを有することを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡システムは、上記の発明において、前記視野絞りは、前記開口の面積が変更可能であることを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡システムは、上記の発明において、少なくとも前記標本からの観察光を取り込む対物レンズと、該対物レンズが取り込んだ観察光の像を観察する接眼レンズとをさらに備え、前記視野絞りは、前記開口を通過した前記照明光の前記照射範囲が前記接眼レンズの視野に対して小さい第１態様と、前記照射範囲が前記接眼レンズの視野に対して大きい第２態様と、の間で変更可能であることを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光路変更／分岐手段は、全反射および全透過を含む前記照明光の分岐態様を変更可能であることを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光源は、放射状の光を発する光源を有することを特徴とする。

また、本発明にかかる測定方法は、標本を照明する照明光を出射する光源と、少なくとも前記標本、および前記照明光の強度を検出する第１検出部のいずれかを選択的に前記照明光の光路上に配置可能に保持する保持手段と、を少なくとも備えた顕微鏡システムにおける前記照明光の強度を測定する測定方法であって、前記保持手段に保持され、かつ前記照明光を前記保持手段が保持する前記標本に導く第１の光路上にある第１検出部、および第１の光路とは異なる第２の光路上であって前記第１検出部と光学的に共役な位置に設けられた第２検出部によって、前記照明光の強度をそれぞれ検出する第１検出ステップと、前記第１および第２検出部が検出した各強度と、前記標本の照射面における照射面積とをもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である第１放射照度を演算する第１放射照度演算ステップと、前記演算ステップで得られた各第１放射照度をもとに、補正値を算出する補正値演算ステップと、前記標本を前記光路上に配置する配置ステップと、前記標本の照射面に前記照明光が照射されている状態で、前記第２検出部による前記照明光の強度を検出する第２検出ステップと、前記第２検出ステップで得られた前記照明光の強度をもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である第２放射照度を演算する第２放射照度演算ステップと、前記補正値演算ステップで得られた前記補正値に基づいて、前記第２放射照度演算ステップで得られた前記第２放射照度を補正する補正ステップと、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、光学的に共役な位置にそれぞれ設けられる第１検出部および第２検出部の各受光面において測定された照明光の強度をもとに補正値を求め、蛍光観察中、第２検出部による測定値および補正値をもとに、標本に照射されている照明光の放射照度を算出するようにしたので、蛍光観察中においても標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができるという効果を奏する。

図１は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。 図２は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。 図３は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡システムが行う補正値取得処理を示すフローチャートである。 図４は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡システムが行う放射照度算出処理を示すフローチャートである。 図５は、本発明の実施の形態１の変形例１−１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。 図６は、本発明の実施の形態１の変形例１−２にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。 図７は、本発明の実施の形態１の変形例１−２にかかる顕微鏡システムが行う補正値取得処理を示すフローチャートである。 図８は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。 図９は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡システムの要部の構成を示す模式図である。

以下、本発明を実施するための形態を図面と共に詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解し得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。すなわち、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。同図に示す顕微鏡システム１は、土台をなす本体部２を備え、本体部２には、標本Ｓを載置するステージ３などが取り付けられている。標本Ｓは、例えばディッシュ、スライドガラスまたはビーカなどの収容容器に保持されている。また、標本Ｓは、生物組織切片などの生体試料、生体試料から分離された細胞、セルラインなどの培養細胞、生体試料から分離された細胞の培養物、および培養細胞の培養物などが挙げられる。標本Ｓは、蛍光色素により蛍光標識されており、励起光が標本Ｓに照射されることによって標識された蛍光色素が励起されて蛍光を発する。顕微鏡システム１では、標本Ｓからの蛍光を取り込むことにより標本像が形成される。

本体部２は、ステージ３を支持する筐体部２ａと、筐体部２ａの側面のうち、顕微鏡システム１のユーザと対向する側面である前面側（図１の右側面側）に設けられる鏡筒部２ｂと、を有する。

筐体部２ａは、本体部２の上面に取り付けられるステージ３と、少なくともステージ３上の標本Ｓからの観察光を取り込む対物レンズ４と、対物レンズ４を交換可能に保持するレボルバ５と、レボルバ５を保持するとともに、光路Ｎ１上に配置された対物レンズ４の光軸に沿って上下動可能に設けられるレボルバ保持部６と、レボルバ保持部６を上下動させることによってレボルバ５に取り付けられた対物レンズ４の焦準操作を手動、あるいは電動で行う焦準操作部７と、を有する。

また、ステージ３には、標本Ｓのほか、光の強度を検出する第１検出部１００が載置されている。第１検出部１００は、対物レンズ４を通過した照明光を受光し、この受光した光の強度を電気信号に変換する受光部１０１を有する。受光部１０１の受光面は、ステージ３に対して標本Ｓにおける照明光の照射面と同一の高さとなるように配置されている。受光部１０１は、例えばＳｉフォトダイオードなどの受光素子を用いることによって実現される。ここで、本実施の形態１において、標本Ｓにおける照射面とは、対物レンズ４の光軸と直交する平面であって、例えば凹凸形状をなす表面を有する標本Ｓでは、標本Ｓにおける照明光の照射範囲の中心を通過し、対物レンズ４の光軸と直交する平面とする。

また、筐体部２ａの背面側（図１の左側面側）には、水銀ランプなどのアーク光源を用いて実現され、落射用の照明光を発生する光源８ａを有するランプハウス８が取り付けられる。筐体部２ａには、ランプハウス８から出射された落射用の照明光の光路を対物レンズ４の光軸方向に変える蛍光用の二つの光学ユニット９，１０を収容可能なミラーカセット１１が設けられている。ミラーカセット１１において、光学ユニット９，１０は、対物レンズ４の光軸に平行な軸を中心軸として回転可能に配設され、この回転動作によって所望の光学ユニットのいずれかを光路Ｎ１上に配置する。光学ユニット９，１０は、光学特性が互いに異なっている。

ランプハウス８は、照明光の光路上に設けられて該照明光を投光する投光管８ｂ（投光手段）を介して光源８ａからの光をミラーカセット１１に入射する。投光管８ｂには、投光管８ｂの視野絞り位置（ステージ３の標本載置面と光学的に共役な位置）に設けられ、円形の開口を有する絞り孔８０ａが形成された視野絞り８０と、視野絞り８０と光源８ａ側の端部との間に設けられ、光源８ａからの光を集光するレンズ８１と、レンズ８１からの光の光量を調節する１または複数の調光フィルタ８２と、視野絞り８０に対して光源８ａ側と異なる側に設けられ、視野絞り８０の絞り孔８０ａを通過した光を集光するレンズ８３と、が設けられている。なお、光源８ａは、単一の波長で直線状の光を発するレーザ光源を除く光源であって、放射状の光を発する光源であれば適用可能である。

視野絞り８０は、絞り孔８０ａに光源８ａからの照明光の一部を通過させることによって、照射面における照射範囲を絞る。絞り孔８０ａの開口の径は、絞り孔８０ａの像が接眼レンズ１７に投影された際、この投影された像の外縁（照射範囲）が接眼レンズ１７の視野に外接するような大きさとなっている。

光学ユニット９，１０は、照明光（励起光）として所定の波長の光のみを透過させる励起フィルタ９ａ，１０ａと、励起光に応じた波長の光を反射して標本Ｓへ照射するとともに、標本Ｓからの観察光のうち特定の波長の光を透過させるダイクロイックミラー９ｂ，１０ｂと、ダイクロイックミラー９ｂ，１０ｂを透過した観察光のうち所定の蛍光成分のみを透過する吸収フィルタ９ｃ，１０ｃと、をそれぞれ有する。

また、筐体部２ａは、ミラーカセット１１を透過した標本Ｓからの観察光（蛍光）を結像する結像レンズ１２と、結像レンズ１２が結像した光のうち、一部の光を透過するとともに、残りの光を反射して分岐するビームスプリッタの一例であるハーフミラー１３と、ハーフミラー１３を透過した光を反射する複数のミラー１４と、ミラー１４が反射した光をリレーするリレーレンズ１５と、からなる観察光学系を有する。

ハーフミラー１３は、例えば光路Ｎ１と直交する方向に光を反射する。ハーフミラー１３によって反射された光は、筐体部２ａに接続され、ＣＣＤイメージセンサや、ＣＭＯＳイメージセンサからなる画像取得部（図示せず）に取り込まれる。これにより、対物レンズ４が取り込んだ標本像を画像化し、この画像に応じた画像データとして記憶することができる。

また、焦準操作部７が電動であるなど、電気的な制御が必要な際、筐体部２ａには、顕微鏡システム１全体の動作を統括的に制御する制御部（図示せず）が設けられる。制御部は、顕微鏡システム１の本体部２の内部に設置されていてもよいし、顕微鏡システム１の本体部２の外部に別途設置され、信号ケーブルなどを介して顕微鏡システム１の本体部２と電気的に接続されていてもよい。

鏡筒部２ｂは、リレーレンズ１５を通過した光を結像する結像レンズ１６と、結像レンズ１６を通過した光を集光する接眼レンズ１７と、を有する。接眼レンズ１７は、対物レンズ４を通過し、結像レンズ１２によって結像された観察光を中間像として拡大して見るためのレンズである。

また、筐体部２ａには、対物レンズ４とミラーカセット１１との間に設けられ、光を検出する第２検出ユニット１８を有する。第２検出ユニット１８は、ダイクロイックミラー９ｂ，１０ｂにより反射された光のうち、所定の割合、例えば５０％の光を透過するとともに、５０％の光を所定の方向に反射するビームスプリッタ１８ａ（光路変更／分岐手段）と、ビームスプリッタ１８ａにより反射された光を集光するレンズ１８ｂと、レンズ１８ｂにより集光された光を検出する第２検出部１８ｃとを有する。なお、レンズ１８ｂは、ビームスプリッタ１８ａにより反射された光を所定のＮＡおよび照野を有した状態で導くために用いられ、複数のレンズを用いて構成される光学系からなるものであってもよい。

第２検出部１８ｃは、ビームスプリッタ１８ａにより分岐された光路Ｎ２の光を受光し、この受光した光の強度を電気信号に変換する受光部１８１を有する。受光部１８１は、第１検出部１００の受光部１０１（標本Ｓにおける照明光の照射面）と光学的に共役な位置に設けられ、例えばＳｉフォトダイオードなどの受光素子を用いることによって実現される。また、ビームスプリッタ１８ａは、例えばハーフミラーを用いて実現される。

本実施の形態１において、ビームスプリッタ１８ａは、例えばダイクロイックミラー９ｂにより反射された照明光の光路を、標本Ｓの照射面（ステージ３）に導く第１光路（光路Ｎ１）と、該第１光路とは異なる第２光路（光路Ｎ２）とに分岐する。なお、第２光路は、第１光路と直交している。これにより、標本Ｓの照射面（または受光部１０１の受光面）および受光部１８１の受光面には、絞り孔８０ａの像が投影される。

ステージ３は、標本Ｓや第１検出部１００を載置して保持する載置部３０を有する。載置部３０は、板状をなす第１部材３０ａ、第２部材３０ｂおよび第３部材３０ｃが順に積層されてなる。載置部３０において、例えば、第３部材３０ｃを基準（固定）とし、ステージ操作部３１によって第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂを第３部材３０ｃの板面を平面とする面上を移動させる。このとき、標本Ｓおよび第１検出部１００が第１部材３０ａに載置され、第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂは、主面に平行な平面上で互いに直交する方向に移動する。これにより、標本Ｓまたは第１検出部１００のいずれかを選択的に照明光の光路Ｎ１上に配置することができる。また、第１部材３０ａ〜第３部材３０ｃには、筐体部２ａに取り付けられた際に、光路Ｎ１が通過する開口をなす開口部（図示せず）がそれぞれ形成されている。なお、第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂに形成される開口は、第１部材３０ａおよび第２部材２０ｂの移動に関わらず光路Ｎ１を含むような大きさに形成されている。

また、ステージ操作部３１は、第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂの移動量をそれぞれ入力可能な入力部３１ａ，３１ｂと、入力部３１ａ，３１ｂを支持し、入力部３１ａ，３１ｂによって入力された移動量を第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂにそれぞれ伝達する支持部材３１ｃと、を有する。本実施の形態１において、入力部３１ａ，３１ｂは、例えばラックアンドピニオンによって実現され、自身の回転量に応じた第１部材３０ａおよび第２部材３０ｂの移動量をそれぞれ入力する。

ここで、第１検出部１００および第２検出部１８ｃは、それぞれが演算装置４０と通信可能に接続されている。第１検出部１００および第２検出部１８ｃは、生成した電気信号を演算装置４０に出力する。

演算装置４０は、第１検出部１００および／または第２検出部１８ｃから取得した光の強度をもとに、標本面（照射面）の単位面積（ｍ^２）当たりに照射される励起光（Ｗ）の強度である放射照度（Ｗ／ｍ^２）を演算する演算部４１と、演算部４１により得られた放射照度をもとに、第２検出部１８ｃによる放射照度を補正するための補正値を算出するとともに、該補正値を用いて第２検出部１８ｂによる放射照度を補正する補正部４２と、演算装置４０を動作させるための各種プログラム、および演算装置４０の動作に必要な各種パラメータ等を含むデータを記憶する記憶部４３と、ＣＰＵ等を用いて構成され、演算装置４０の動作を統括的に制御する制御部４４と、を有する。なお、図１に示すように、演算部４１と補正部４２とは、まとめて演算補正部４００として機能してもよい。

記憶部４３は、上述したプログラムなどのほか、絞り孔８０ａの開口の面積や、受光部１０１，１８１の各受光面に投影される絞り孔８０ａの像の面積（照射面積）に関する情報を使用する対物レンズ４ごとにそれぞれ記憶している。

演算装置４０は、表示装置５０と接続し、演算部４１の演算により得られた放射照度や、補正部４２の補正により得られた補正後の放射照度などを表示装置５０に表示させる。また、表示装置５０は、上述した画像取得部によって取り込まれて生成された画像データを表示してもよい。

顕微鏡システム１では、例えば、光源８ａからの照明光が励起フィルタ９ａで波長選択され、ダイクロイックミラー９ｂによって対物レンズ４に向けて照明光が反射される。ダイクロイックミラー９ｂによって反射された照明光が、対物レンズ４を介して標本Ｓに照射されると、標本Ｓに標識された蛍光色素が励起されて蛍光を発する。標本Ｓから発せられた蛍光が、対物レンズ４、ダイクロイックミラー９ｂおよび吸収フィルタ９ｃを透過して、観察光として鏡筒部２ｂに入射する。

このとき、ダイクロイックミラー９ｂによって反射された照明光は、ビームスプリッタ１８ａによって対物レンズ４側（第１光路）と第２検出部１８ｃ側（第２光路）とに光路が分岐される。対物レンズ４および第２検出部１８ｃには、ダイクロイックミラー９ｂによって反射された照明光の強度の半分程度の照明光がそれぞれ入射する。すなわち、標本Ｓ（または第１検出部１００）および第２検出部１８ｃには、ほぼ同等の強度の照明光が入射することとなる。

続いて、第１検出部１００および第２検出部１８ｃにより取得された光の強度から標本Ｓに照射されている照明光の放射照度を取得する測定処理について説明する。この処理では、第１検出部１００および第２検出部１８ｃにより取得された光の強度から、第２検出部１８ｃにより得られた放射照度を補正するための補正値を取得する補正値取得処理を行った後、補正値取得処理により得られた補正値を用いて標本Ｓに照射されている放射照度を算出する放射照度算出処理が行われる。本実施の形態１では、放射照度算出処理が、標本Ｓの蛍光観察と同時に行われる。

図２は、本実施の形態１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。顕微鏡システム１では、ステージ操作部３１の入力部３１ａ，３１ｂを操作（回転）することにより、図２に示すように、第１検出部１００の受光部１０１を光路Ｎ１上に配置することで、標本Ｓに照射される照明光の強度を検出することができる。

まず、第１検出部１００および第２検出部１８ｃにより取得された光の強度から放射照度を算出するための補正値を取得する処理について説明する。図３は、本実施の形態１にかかる顕微鏡システムが行う補正値取得処理を示すフローチャートである。ステージ３の第１部材３０ａが図２に示す位置にあって、第１検出部１００の受光部１０１が対物レンズ４からの照明光を受光可能な状態において、第１検出部１００および第２検出部１８ｃにより、それぞれ照明光の強度を測定値として取得する（ステップＳ１０１）。

その後、演算部４１は、第１検出部１００および第２検出部１８ｃから測定値を取得すると、それぞれの受光面における放射照度を算出する（ステップＳ１０２）。演算部４１は、記憶部４３を参照して各受光面に投影される絞り孔８０ａの像の面積（照射面積）を取得し、測定値をもとに、各受光面の放射照度（第１放射照度）を算出する。

第１検出部１００および第２検出部１８ｃのそれぞれの受光面における放射照度を算出後、補正部４２が、各放射照度をもとに第２検出部１８ｃの放射照度の値が第１検出部の放射照度の値と一致するような補正値を算出する（ステップＳ１０３）。この補正値をもとに第２検出部１８ｃの受光面の放射照度を補正する。なお、補正部４２は、各放射照度の比を算出して、第２検出部１８ｃの受光面の放射照度の補正値として補正係数を得るものであってもよいし、各放射照度の差分をとり、この差分値を上述した補正値としてもよい。

その後、制御部４４は、演算部４１により算出された放射照度、および補正部４２により算出された第２検出部１８ｃの受光面の放射照度にかかる補正値を記憶部４３に記憶させる（ステップＳ１０４）。上述した処理により、第２検出部１８ｃの受光面における放射照度から、標本Ｓに照射される照明光の放射照度を正確に算出するための補正値を取得することができる。この際、演算装置４０は、実際の測定値や、算出された放射照度および上述した補正値を表示装置５０に表示させるようにしてもよい。

次に、補正値取得処理により得られた補正値を用いた標本Ｓの蛍光観察を行う場合の処理を説明する。図４は、本実施の形態１にかかる顕微鏡システムが行う放射照度算出処理を示すフローチャートである。実際の蛍光観察では、図１に示すように、標本Ｓが光路Ｎ１上に配置された状態で観察が行われる。補正値取得処理に連続して放射照度算出処理を行う際や、光路Ｎ１上に第１検出部１００が配置されている際は、ステージ操作部３１の入力部３１ａ，３１ｂを操作して、光路Ｎ１上に標本Ｓを配置する（配置ステップ）。

光源８ａからの照明光は、波長選択された後、上述したようにビームスプリッタ８１ａにより、標本Ｓ（対物レンズ４）および第２検出部１８ｃに入射する。演算装置４０は、第２検出部１８ｃ（受光部１８１）に入射した照明光の強度（電気信号）を測定値として取得する（ステップＳ２０１）。

その後、演算部４１が、記憶部４３に記憶されている絞り孔８０ａの像の面積（照射面積）と、測定値とをもとに、受光部１８１の受光面における放射照度（第２放射照度）を算出する（ステップＳ２０２）。放射照度を算出後、補正部４２は、記憶部４３に記憶されている補正値を参照して、ステップＳ２０２で得られた放射照度を補正して補正後の放射照度を算出する（ステップＳ２０３）。

その後、制御部４４は、補正された第２検出部１８ｃの受光面の放射照度を取得して、この補正後の放射照度を記憶部４３に記憶させるとともに、表示装置５０に表示させる（ステップＳ２０４）。補正された第２検出部１８ｃの受光面の放射照度を表示装置５０に表示させることによって、現在蛍光観察中の標本Ｓにどの程度の励起光が照射されているかを把握することができる。

ここで、顕微鏡システム１において、蛍光の強度を測定した場合、補正後の放射照度は、測定した蛍光強度に対応付けて記憶される。また、これらの情報を表示させることにより、各蛍光強度を測定した際の第２検出部１８ｃの受光面の放射照度を確認することが可能となる。

上述した本実施の形態１によれば、共役な位置にそれぞれ設けられる第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面において測定された照明光の強度をもとに補正値を求め、蛍光観察中、第２検出部１８ｃによる測定値および補正値をもとに、標本Ｓに照射されている照明光の放射照度を算出するようしたので、蛍光観察中においても標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる。

また、上述した本実施の形態１によれば、蛍光観察中、標本Ｓと第１検出部１００との配置を変えることなく、第２検出部１８ｃで測定された照明光の強度をもとに放射照度を算出できるため、標本に照射される照明光の放射照度を容易に確認することができ、操作性にも優れる。

図５は、本実施の形態１の変形例１−１にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。上述した実施の形態１では、倒立型であるものとして説明したが、変形例１−１に示す顕微鏡システム１ａのような正立型であっても同様に適用可能である。なお、図５において、上述した顕微鏡システム１と同様の構成要素には、同一の符号が付してある。

図５に示す顕微鏡システム１ａは、土台をなす本体部２ｃを備え、本体部２ｃには標本Ｓを載置するステージ３などが取り付けられている。本体部２ｃは、ステージ３を支持する筐体部２ｄと、筐体部２ｄの側面のうち、顕微鏡１のユーザと対向する側面である前面側に設けられる鏡筒部２ｅと、筐体部２ｄと鏡筒部２ｅとの間に設けられ、照明光を標本Ｓ側に導く投光部２ｆと、を有する。

筐体部２ｄは、Ｌ字状をなし、標本Ｓおよび第１検出部１００を載置するステージ３を保持するとともに、レボルバ５を保持するレボルバ保持部６を保持している。また、レボルバ５と投光部２ｆとの間には、入射する光の強度を検出する第２検出ユニット１８が配置されている。なお、筐体部２ｄには、ステージ３の焦準操作を手動、あるいは電動で行う焦準操作部７ａが設けられている。

本変形例１−１において、ビームスプリッタ１８ａは、ダイクロイックミラー９ｂにより反射された照明光の光路を、標本Ｓの照射面（ステージ３）に達する第１光路（光路Ｎ３）と、該第１光路とは異なる第２光路（光路Ｎ４）とに分岐する。

また、投光部２ｆには、上述した光源８ａ、視野絞り８０、レンズ８１、調光フィルタ８２、レンズ８３や、光学ユニット９，１０を回転自在に保持するミラーカセット１１が設けられている。

鏡筒部２ｅは、例えば光学ユニット９を透過した標本からの観察光（蛍光）を結像する結像レンズ１２と、結像レンズ１２が結像した光を反射するミラー１４と、結像レンズ１２を通過した光を集光する接眼レンズ１７と、を有する。

ここで、第１検出部１００および第２検出部１８ｃは、それぞれが演算装置４０と通信可能に接続されている。第１検出部１００および第２検出部１８ｃは、生成した電気信号を演算装置４０に出力する。

上述した本変形例１−１においても、上述した実施の形態１のように、共役な位置にそれぞれ設けられる第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面において測定された照明光の強度をもとに補正値を求め、蛍光観察中は、第２検出部１８ｃによる測定値および補正値をもとに、標本Ｓに照射されている照明光の放射照度を算出するようしたので、蛍光観察中においても標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる。

図６は、本実施の形態１の変形例１−２にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。変形例１−２にかかる顕微鏡システム１ｂでは、上述した実施の形態１にかかる顕微鏡システム１の視野絞り８０に代えて、交換可能に設けられる第１視野絞り８４および第２視野絞り８５を備える。

第１視野絞り８４および第２視野絞り８５は、それぞれが投光管８ｂの視野絞り位置（ステージ３の標本載置面と共役な位置）に交換自在に設けられる。第１視野絞り８４および第２視野絞り８５には、円形の開口を有する第１絞り孔８４ａおよび第２絞り孔８５ａがそれぞれ形成されている。第１絞り孔８４ａの開口の径は、第２絞り孔８５ａの開口の径よりも小さく、第１絞り孔８４ａの像が接眼レンズ１７に投影された際、この投影面積（照明光の照射範囲）が接眼レンズ１７の視野よりも小さくなるような大きさとなっている。また、第２絞り孔８５ａの開口の径は、第２絞り孔８５ａの像が接眼レンズ１７に投影された際、この投影面積（照明光の照射範囲）が接眼レンズ１７の視野よりも若干大きくなるような大きさとなっている。ここで、第１視野絞り８４は放射照度の補正値を測定するための測定用の視野絞りであって、第２視野絞り８５は標本Ｓに励起光を照射して蛍光観察を行う際に用いる観察用の視野絞りである。

なお、第１視野絞り８４および第２視野絞り８５の交換、または切り換え動作は、筐体部２ｄの内部において制御部の制御のもと自動で行われるものであってもよいし、使用者によって手動で交換、または切り換えを行なうようにするものであってもよい。また、絞り孔の開口の径を変更可能な構成、例えば複数枚の板（絞り羽根）を重ね合わせてなり、絞り羽根を制御して第１絞り孔８４ａおよび第２絞り孔８５ａを形成するものを用いてもよい。

また、記憶部４３には、第１絞り孔８４ａおよび第２絞り８５ａの開口の径や、第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面に投影される第１絞り孔８４ａおよび第２絞り８５ａの像の面積（照射面積）などの情報が記憶されている。

図７は、本実施の形態１の変形例１−２にかかる顕微鏡システムが行う補正値取得処理を示すフローチャートである。補正値取得処理では、顕微鏡システム１ｂにおいて、図６に示すように、第１検出部１００の受光部１０１を光路Ｎ１上に配置する。

まず、視野絞り位置に測定用の視野絞り（第１視野絞り８４）を配置する（ステップＳ３０１）。視野絞りは、図示しない視野絞り識別手段により、光路上に配置された視野絞りの判別を行なうようにしてもよい。

その後、第１視野絞り８４が配置された状態（第１態様）で、第１検出部１００による照明光の強度の検出を行い、演算装置４０は、第１検出部１００による測定値を取得する（ステップＳ３０２）。

第１検出部１００による測定値を取得後、視野絞り位置に観察用の視野絞り（第２視野絞り８５）を配置する（ステップＳ３０３）。ステップＳ３０１と同様、視野絞りは、図示しない識別手段により、配置された視野絞りを判断するようにしてもよい。

その後、第２視野絞り８５が配置された状態（第２態様）で、第２検出部１８ｃによる照明光の強度の検出を行い、演算装置４０は、第２検出部１８ｃによる測定値を取得する（ステップＳ３０４）。

演算装置４０は、第１検出部１００および第２検出部１８ｃからそれぞれ測定値を取得すると、演算部４１が、それぞれの受光面における放射照度を算出する（ステップＳ３０５）。演算部４１は、記憶部４３を参照して各受光面に投影される第１絞り孔８４ａおよび第２絞り８５ａの像の面積（照射面積）を取得し、測定値をもとに、各受光面の放射照度を算出する。このとき、第１検出部１００による測定値から放射照度を求める際は、第１絞り孔８４ａの照射面積を使用し、第２検出部１８ｃによる測定値から放射照度を求める際は、第２絞り孔８５ａの照射面積を使用する。

第１検出部１００および第２検出部１８ｃのそれぞれの受光面における放射照度を算出後、補正部４２が、各放射照度をもとに第２検出部１８ｃの放射照度の値が第１検出部１００の放射照度の値と一致するような補正値を算出する（ステップＳ３０６）。この補正値をもとに第２検出部１８ｃの受光面の放射照度を補正する。なお、補正部４２は、各放射照度の比を算出して、第２検出部１８ｃの受光面の放射照度の補正値として補正係数を得るものであってもよいし、各放射照度の差分をとり、この差分値を上述した補正値としてもよい。

その後、制御部４４は、演算部４１により算出された放射照度、および補正部４２により算出された補正値を記憶部４３に記憶させる（ステップＳ３０７）。上述した処理により、放射照度を正確に算出するための補正値を取得することができる。この際、演算装置４０は、実際の測定値や、算出された放射照度および補正値を表示装置５０に表示させるようにしてもよい。なお、上述したように、演算部４１と補正部４２とは、まとめて演算補正部４００として機能してもよい。

上述した本変形例１−２によれば、上述した実施の形態１と同様、共役な位置にそれぞれ設けられる第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面において測定された照明光の強度をもとに補正値を求め、蛍光観察中は、第２検出部１８ｃによる測定値および補正値をもとに、標本Ｓに照射されている照明光の放射照度を算出するようしたので、蛍光観察中においても標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる。

さらに、本変形例１−２によれば、補正値を取得する処理において、接眼レンズ１７の視野よりも若干小さい径の第１絞り孔８４ａを用いて、標本Ｓに照射される照明光の強度を検出するようにしたので、接眼レンズ１７の視野の内側に第１絞り孔８４ａの像が形成される。一般に、水銀ランプなどのアーク光源は、接眼レンズ１７の視野の周辺で光量が低下する傾向があり、視野の中心付近の方が比較的照明ムラが少ない。このため、接眼レンズ１７の視野周辺の照明ムラは測定値に影響を及ぼすため、接眼レンズ１７の視野よりも若干小さい径の第１絞り孔８４ａを用いることによって、一層正確な放射照度（測定値）を得ることができる。

（実施の形態２）
図８は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡システムの全体構成を示す模式図である。図９は、本実施の形態２にかかる顕微鏡システムの要部の構成を示す模式図であって、切替ターレットの構成を示す上面図である。なお、図１等で説明した構成と同一の構成要素には、同一の符号が付してある。本実施の形態２にかかる顕微鏡システム１ｃでは、上述した実施の形態１にかかる顕微鏡システム１のビームスプリッタ１８ａに代えて、光路Ｎ１に対する光学特性を切り替える切替ターレット１８２を（光路変更／分岐手段）備える。

切替ターレット１８２は、円盤状をなし、主面の中心を通過する軸を中心軸として回転可能な回転テーブル１８３と、回転テーブル１８３に保持され、上述したビームスプリッタ１８ａを内部に保持する第１保持部材１８４と、回転テーブル１８３に保持され、全反射ミラー１８ｄを内部に保持する第２保持部材１８５と、を有する。また、回転テーブル１８３には、主面と直交する方向（板厚方向）に貫通する貫通孔１８６が形成されている。なお、回転テーブル１８３には、第１保持部材１８４、第２保持部材１８５の配設位置においても、貫通孔１８６と同様の貫通孔が形成されている。

ここで、第１保持部材１８４、第２保持部材１８５および貫通孔１８６は、例えば回転テーブル１８３の主面を３等分する位置、すなわち隣接する構成間の角度が、回転テーブル１８３の中心に対して１２０°となる位置に設けられている。なお、第１保持部材１８４、第２保持部材１８５を回転テーブル１８３の中心に対して対向する側にそれぞれ配置するなど、回転方向以外に加わるモーメントを考慮した配置としてもよい。

回転テーブル１８３は、主面の中心を通過する軸を中心軸として回転するための回転機構（図示せず）を有する。回転機構としては、例えば、歯車、またはプーリおよびベルトにより回転を伝達し、弾性部材などで係り止めして所定の位置で位置決めするような構成が挙げられる。また、回転テーブル１８３は、制御部の制御のもと自動で回転する構成であってもよいし、手動で回転させる構成であってもよい。さらに、回転テーブル１８３に代えて、第１保持部材１８４、第２保持部材１８５および貫通孔１８６を、光路Ｎ１に対して直交する方向に進退自在なスライド式のテーブルであってもよい。また、分割比率の異なる複数のビームスプリッタを配置してもよい。

また、記憶部４３には、絞り孔８０ａの開口の径や、第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面に投影される絞り孔８０ａの像の面積（照射面積）などの情報が記憶されている。なお、上述した変形例１−２のように第１視野絞り８４および第２視野絞り８５を有する場合は、第１絞り孔８４ａおよび第２絞り８５ａの開口の径や、第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面に投影される第１絞り孔８４ａおよび第２絞り８５ａの像の面積（照射面積）などの情報が記憶される。

顕微鏡システム１ｃにおいて、補正値取得処理および放射照度算出処理は、第１保持部材１８４を光路Ｎ１上に配置して、ビームスプリッタ１８ａを用いて照明光を分岐することによって、上述した実施の形態１と同様の処理が行われ、放射照度の確認が可能である。

また、回転テーブル１８３を回転させて、貫通孔１８６を光路Ｎ１上に配置することにより、ダイクロイックミラー９ｂによって反射された全ての照明光を標本Ｓに照射することができる。一方で、第２保持部材１８５の全反射ミラー１８ｄを光路Ｎ１上に配置することにより、ダイクロイックミラー９ｂによって反射された全ての照明光を光路Ｎ２側に向かわせて第２検出部１８ｃに入射させることができる。

補正値取得処理において、上述した貫通孔１８６および全反射ミラー１８ｄを交互に光路Ｎ１上に配置して、第１検出部１００および第２検出部１８ｃにより測定値をそれぞれ取得することで、ダイクロイックミラー９ｂにより反射されたすべての照明光に基づく各測定値を用いて放射照度および補正値を求めることができる。この補正値取得処理は、同時に照明光の強度を取得することはできないものの、照明光の強度が小さく、ビームスプリッタ１８ａによって分岐させて測定値を取得することが難しい場合に有効である。

また、標本Ｓの蛍光観察を行う際、ダイクロイックミラー９ｂにより反射されたすべての照明光を、貫通孔１８６を介して標本Ｓに照射して観察するとともに、放射照度の確認を行うタイミングに応じて光路Ｎ１上に全反射ミラー１８ｄを配置することで、第２検出部１８ｃによる照明光の強度を取得して、標本Ｓに照射されている放射照度を得ることができる。また、標本Ｓへの照明光の照射と、放射照度の確認とを同時に行う場合は、ビームスプリッタ１８ａを光路Ｎ１上に配置すればよい。

上述した本実施の形態２によれば、上述した実施の形態１と同様、共役な位置にそれぞれ設けられる第１検出部１００および第２検出部１８ｃの各受光面において測定された照明光の強度をもとに補正値を求め、蛍光観察中は、第２検出部１８ｃによる測定値および補正値をもとに、標本Ｓに照射されている照明光の放射照度を算出するようしたので、標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することができる。

さらに、上述した本実施の形態２によれば、切替ターレット１８２を設けることにより、ダイクロイックミラー９ｂにより反射された照明光の入射経路を選択的に変更することができ、照明光の強度が小さい場合など、観察態様に応じて照明光の照射パターンを適宜変更することができる。

なお、上述した実施の形態１，２では、倒立型または正立型の顕微鏡を例に説明したが、例えば、ステージに載置した標本に照明光を照射し、標本からの観察光を取り込んで標本像を拡大する対物レンズ、対物レンズを介して標本の像を撮像する撮像機能および画像を表示する表示機能を備えた撮像装置、例えば、ビデオマイクロスコープ等を用いても、本発明を適用することができる。

また、上述した実施の形態１，２では、本体部の外部に演算装置が設けられているものとして説明したが、例えば、本体部（筐体部）の内部に、上述した演算部、補正部、記憶部および制御部が設けられているものであってもよい。

また、上述した実施の形態１，２は、本発明を実施するための例にすぎず、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本発明は、各実施の形態や変形例に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成できる。本発明は、仕様等に応じて種々変形することが可能であり、更に本発明の範囲内において、他の様々な実施の形態が可能であることは、上記記載から自明である。

以上のように、本発明にかかる顕微鏡システムおよび測定方法は、標本に照射される照明光の放射照度を正確に測定することに有用である。

１，１ａ，１ｂ，１ｃ 顕微鏡システム
２，２ｃ 本体部
２ａ，２ｄ 筐体部
２ｂ，２ｅ 鏡筒部
２ｆ 投光部
３ ステージ
４ 対物レンズ
５ レボルバ
６ レボルバ保持部
７，７ａ 焦準操作部
８ ランプハウス
８ａ 光源
８ｂ 投光管
９，１０ 光学ユニット
９ａ，１０ａ 励起フィルタ
９ｂ，１０ｂ ダイクロイックミラー
９ｃ，１０ｃ 吸収フィルタ
１１ ミラーカセット
１２，１６ 結像レンズ
１３ ハーフミラー
１４ ミラー
１５ リレーレンズ
１７ 接眼レンズ
１８ 第２検出ユニット
１８ａ ビームスプリッタ
１８ｂ，８１，８３ レンズ
１８ｃ 第２検出部
１８ｄ 全反射ミラー
３０ 載置部
３０ａ 第１部材
３０ｂ 第２部材
３０ｃ 第３部材
３１ ステージ操作部
３１ａ，３１ｂ 入力部
４０ 演算装置
４１ 演算部
４２ 補正部
４３ 記憶部
４４ 制御部
５０ 表示装置
８０ 視野絞り
８０ａ 絞り孔
８２ 調光フィルタ
８４ 第１視野絞り
８４ａ 第１絞り孔
８５ 第２視野絞り
８５ａ 第２絞り孔
１００ 第１検出部
１０１，１８１ 受光部
１８２ 切替ターレット
１８３ 回転テーブル
１８４ 第１保持部材
１８５ 第２保持部材
１８６ 貫通孔
４００ 演算補正部

Claims (7)

1. 標本を照明する照明光を出射する光源と、
   少なくとも前記標本、および前記照明光の強度を検出する第１検出部のいずれかを選択的に前記照明光の光路上に配置可能に保持する保持手段と、
   前記照明光の光路を、前記保持手段が保持する前記標本に導く第１の光路および／または該第１の光路とは異なる第２の光路に変更する光路変更／分岐手段と、
   前記第２の光路上であって、前記第１検出部と光学的に共役な位置に設けられ、前記光路変更／分岐手段により前記第２の光路に光路が変更、または分岐された前記照明光の強度を検出する第２検出部と、
   前記第１および第２検出部が検出した各強度と、前記標本の前記照明光の照射面における照射面積とをもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である放射照度を演算し、前記放射照度をもとに前記第２検出部が検出した強度に基づく放射照度を補正する演算補正部と、
   を備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 前記第２の光路上であって、前記照射面と光学的に共役な位置に設けられ、前記照明光の一部を通過させて該照明光の前記照射面における照射範囲を絞る開口が形成された視野絞りを有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記視野絞りは、前記開口の面積が変更可能であることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 少なくとも前記標本からの観察光を取り込む対物レンズと、該対物レンズが取り込んだ観察光の像を観察する接眼レンズとをさらに備え、
   前記視野絞りは、前記開口を通過した前記照明光の前記照射範囲が前記接眼レンズの視野に対して小さい第１態様と、前記照射範囲が前記接眼レンズの視野に対して大きい第２態様と、の間で変更可能であることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡システム。
5. 前記光路変更／分岐手段は、全反射および全透過を含む前記照明光の分岐態様を変更可能であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の顕微鏡システム。
6. 前記光源は、放射状の光を発する光源を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の顕微鏡システム。
7. 標本を照明する照明光を出射する光源と、少なくとも前記標本、および前記照明光の強度を検出する第１検出部のいずれかを選択的に前記照明光の光路上に配置可能に保持する保持手段と、を少なくとも備えた顕微鏡システムにおける前記照明光の強度を測定する測定方法であって、
   前記保持手段に保持され、かつ前記照明光を前記保持手段が保持する前記標本に導く第１の光路上にある第１検出部、および第１の光路とは異なる第２の光路上であって前記第１検出部と光学的に共役な位置に設けられた第２検出部によって、前記照明光の強度をそれぞれ検出する第１検出ステップと、
   前記第１および第２検出部が検出した各強度と、前記標本の照射面における照射面積とをもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である第１放射照度を演算する第１放射照度演算ステップと、
   前記演算ステップで得られた各第１放射照度をもとに、補正値を算出する補正値演算ステップと、
   前記標本を前記光路上に配置する配置ステップと、
   前記標本の照射面に前記照明光が照射されている状態で、前記第２検出部による前記照明光の強度を検出する第２検出ステップと、
   前記第２検出ステップで得られた前記照明光の強度をもとに、単位面積当たりに照射される前記照明光の強度である第２放射照度を演算する第２放射照度演算ステップと、
   前記補正値演算ステップで得られた前記補正値に基づいて、前記第２放射照度演算ステップで得られた前記第２放射照度を補正する補正ステップと、
   を含むことを特徴とする測定方法。

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