JP2015017094A - 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法 - Google Patents

蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2015017094A
JP2015017094A JP2014157304A JP2014157304A JP2015017094A JP 2015017094 A JP2015017094 A JP 2015017094A JP 2014157304 A JP2014157304 A JP 2014157304A JP 2014157304 A JP2014157304 A JP 2014157304A JP 2015017094 A JP2015017094 A JP 2015017094A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substituted
compound
alkyl
group
aryl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2014157304A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5847257B2 (ja
Inventor
ジェフリー ズベイ
Dzubay Jeffrey
ジェフリー ズベイ
カイル ギー
Kyle R Gee
カイル ギー
ヴラディミール マルティン
Martin Vladimir
ヴラディミール マルティン
アレクセイ ルカビシニコヴ
Rukavishnikov Aleksey
アレクセイ ルカビシニコヴ
ダニエル ビーチアム
Beacham Daniel
ダニエル ビーチアム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Technologies Corp
Original Assignee
Life Technologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Life Technologies Corp filed Critical Life Technologies Corp
Publication of JP2015017094A publication Critical patent/JP2015017094A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5847257B2 publication Critical patent/JP5847257B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/90—Xanthenes with hydrocarbon radicals, substituted by amino radicals, directly attached in position 9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/12—Amino derivatives of triarylmethanes without any OH group bound to an aryl nucleus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/28—Pyronines ; Xanthon, thioxanthon, selenoxanthan, telluroxanthon dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B7/00—Indigoid dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】新しい種類のｐＨ感受性蛍光性色素と、関連するアッセイ法の提供。
【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物。
Figure 2015017094

（Ｒ１〜Ｒ３及びＲ６は各々独立にＨ、Ｚ、又は電子供与性基（ＥＤＧ）、但し、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシルとチオールの両方ではなく、かつそれらの脱プロトン化形態でもなく；Ｒ４はＨ、アルキル、アシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル等、Ｒ５はＹ、アルキル、アルケニル、アシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、又は置換された有機基；Ｘはフルオロフォア；Ｙは＝ＣＲｂＲｃ又は＝ＣＲｂＲｄ；Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃ；ＲｂはＨ、アルキル等；Ｒｃはアルキル等；Ｒｄはアミノ等）
【効果】前記色素及びアッセイ法は、食作用及び細胞プロセスのモニターに好適である。
【選択図】なし

Description

発明の分野
新規のｐＨ感受性蛍光性色素、および細胞プロセスをモニターすることを含めた様々な応用で使用するためのアッセイ法を開示する。
発明の背景
生物学的研究および医療診断で用いられるｐＨ感受性蛍光性色素は、ｐＨの変化に対する蛍光反応の始まりによって各々区別される２つの群に属する。第１の群には、フルオロフォア中のフェノール性ヒドロキシル基のイオン化によって制御される蛍光を有する化合物が含まれる。例としては、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、オレゴングリーン（登録商標）、ＳＮＡＲＦ（登録商標）、ＳＮＡＦＬ（登録商標）、およびＨＰＴＳ指示薬が挙げられる。
米国特許出願公開第２００６／００５１８７４号（Ｍ．Ｗ．Ｒｅｅｄら）（特許文献1）は、バンク貯蔵物の血液のｐＨをモニターするための蛍光検出器に組み込まれたフルオレセイン様構造物を記載する。これらのタイプの分子のイオン化度は環境の酸性が低下すると増大するため、それらは、ｐＨが大きくなるにつれてより蛍光を発する。
第２の群の蛍光性ｐＨセンサーは、レポーター蛍光性色素部分とともに、指示部分としてのアミノ基（脂肪族または芳香族）を含む。かかる分子が光子を吸収する場合、励起された電子状態が生成され、アミノ基の非共有電子対は励起によって空いた軌道へと移動する。光誘起電子移動（ＰＥＴ）と呼ばれるかかる電子移動は、励起された分子が発光遷移することを妨げ、従ってその色素の蛍光は消光される。そのアミノ基のプロトン化は、対の軌道の特質およびエネルギーを変え、ＰＥＴを停止させる。結果として、この蛍光性レポーター部分はｐＨ変化に反応する。このアミノ基のプロトン化によって消光は打ち消されるため、ＰＥＴベースのセンサーは、ｐＨが低下するにつれてより蛍光性となる。
ＰＥＴベースのｐＨセンサーの例としては、指示部分としてジメチルアミノ基を含有するＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ色素、およびインドレニン指示基を有するＣｙｐＨｅｒ（登録商標）５Ｅ色素が挙げられる。これらのセンサーの１つの不都合な点は、指示アミノ基の低ｐＫａに起因して作用範囲が酸性側にシフトしていることである。
一群のローダミン系ｐＨセンサーが国際公開公報第２００５／０９８４３７号（特許文献2）に記載されている。これらの色素はキサンテン部分のオルト位で−ＯＨもしくは−ＳＨ（またはそれらの脱プロトン化形態）によって置換されたベンゼン環を有し、国際公開公報第２００５／０９８４３７号は、−ＯＨまたは−ＳＨがこれらの色素のｐＨ反応を担っていると考えられると述べている。これらの色素はアミンＰＥＴ指示薬と類似のｐＨ依存性を呈するが、これらは、６未満のｐＨの細胞区画を標的にしたｐＨセンサーに対する周知のニーズに基づいて、６未満のｐＫａ値を有するように設計されたものである。国際公開公報第２００５／０９８４３７号の出願は、上記色素中のテトラメチルローダミン部分の強い電子吸引性特性が指示基のｐＫａを著しく低下させ、従ってセンサーの作用範囲を非常に酸性のｐＨ値にシフトさせていることを意味する。しかしながら、これは、国際公開公報第２００５／０９８号に記載されている色素の応用可能性、特に生物系における生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ６−７）での可能性を限定する。これらの先行技術の化合物は、溶液中で不都合な不安定性を呈する可能性のあることが本発明者らによって見出されている。
従って、少なくともいくつかの化合物においては生物系におけるｐＨ変化を検出する能力を含め、改善された特性を好都合に備えたさらに別のｐＨ感受性蛍光性色素へのニーズが存在する。当該技術分野で公知の化合物の不都合を望ましくは軽減または解消する新規の種類の蛍光性ｐＨセンサーを開発することが本発明の目的である。特に、好ましくは中性および他の生物学的に関連したｐＨ値方向に作用範囲を有する、比較的安定な種類のｐＨセンサーを提供することが、本発明の態様の目的である。
米国特許出願公開第２００６／００５１８７４号 国際公開公報第２００５／０９８４３７号
本発明は、一態様では、国際公開公報第２００５／０９８４３７号（これに関してより詳細には、「発明を実施するための形態」という見出しに続くすぐ下の段落を参照）により必要とされるヒドロキシルまたはチオール基がないことを特徴とするｐＨ感受性蛍光性色素に関する。その態様のうちの１つにおける本発明では、既存の蛍光性ｐＨセンサーよりも顕著な優位性を有する新しい一群のｐＨ感受性蛍光性色素が導入される。
本発明は、その範囲内に、例えば蛍光性ｐＨセンサーとして使用するための、以下の式Ａを有する化合物であって、Ｒ１およびＲ２がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする化合物を包含する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１−Ｒ６は水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
Ｘはフルオロフォアであるか、あるいは
Ｒ１およびＲ３−Ｒ６は水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつＸおよびＲ２は一緒になって、位置ＸとＲ２との間で式Ａのベンゼン環に縮合した５員もしくは６員の複素環式環を含む部分を形成する。
本発明の一態様は、以下の式Ｉの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は独立に、Ｙ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘはフルオロフォアであり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただしＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。
本発明の一実施形態は、以下の式ＩＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立に、Ｙ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただしＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。
本発明の一実施形態は、以下の式ＩＩＩの化合物を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ３は電子供与性基（ＥＤＧ）であり、かつ
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、および＝ＣＨ（置換されたアルキル）からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態は、以下の式ＩＶの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４はＨ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立にＨ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
本発明の別の実施形態は、以下の式Ｖの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
本発明の別の態様は、以下の式ＶＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ａは５員または６員の芳香族複素環であり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
Ｒａは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであり、かつ
ｎは０、１、２、または３である。
本発明の一実施形態は、以下の式ＶＩＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
Ｒａ１およびＲａ２は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
本発明の別の実施形態は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩ、および式ＶＩＩの化合物のうちのいずれか１つの蛍光性ｐＨ感受性色素を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）試料を上述の実施形態のいずれかの化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた試料を適切な時間インキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
（ｃ）前記インキュベーションされた試料を適切な波長を用いて照射し、照射された試料を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、前記試料のｐＨを測定するための方法であって、前記蛍光性発光が前記試料のｐＨを測定するために使用される、
方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）細胞を上述の実施形態のいずれかの化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記標識された細胞を適切な波長を用いて照射し、照射された細胞を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された細胞からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法であって、前記蛍光性発光が細胞内部のｐＨをモニターするために使用される方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）担体分子を化合物に結合し、担体結合体を形成する段階と、
（ｂ）前記担体結合体を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｅ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）本願明細書に記載する実施形態のうちのいずれか１つの化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｃ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、ｐＨに関連する細胞プロセスを検出する方法であって、蛍光性発光の増加が細胞プロセスの活性化を示す方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式ＩＩ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
Ｒｂは、Ｈ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただしＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する：
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＩＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＩＣ：
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式ＩＩの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式ＩＶ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立に、Ｙ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立にＨ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＶＢ：
Figure 2015017094
および／または式ＩＶＣ：
Figure 2015017094
の化合物、ならびに２，３，５，６−テトラクロロシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（クロラニル）、およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏと接触させ、式ＩＶの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式Ｖ：
Figure 2015017094
Ｖ
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物をＰ（ＯＥｔ）３と接触させ、式Ｖの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）本願明細書に提供される実施形態のうちのいずれか１つの化合物と、
（ｂ）検体と
を含む組成物を提供する。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）本願明細書に提供される実施形態のうちのいずれか１つの化合物と、
（ｂ）担体分子と
を含む組成物を提供する。
本発明の別の実施形態は、試料のｐＨを測定するためのキットであって、
（ａ）本願明細書に提供される実施形態のうちのいずれか１つの化合物と、
（ｂ）前記試料のｐＨを測定するための指示書と
を含むキットを提供する。
本発明の態様および実施形態は、特許請求の範囲に開示される。
[請求項101]
蛍光性pHセンサーとして使用するための化合物であって、
以下の式Aを有し、R1およびR2がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする、化合物:
Figure 2015017094
式中、
R1-R6は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
Xはフルオロフォアであるか、あるいは
R1およびR3-R6は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつXおよびR2は一緒になって、位置XとR2との間で式Aのベンゼン環に縮合した5員もしくは6員の複素環式環を含む部分を形成する。
[請求項102]
R1、R2、R3およびR6のいずれも、ヒドロキシルでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもない、請求項101に記載の化合物。
[請求項103]
R1-R6が、
水素、
ヒドロカルビル、または-O-、-S-もしくは-NRb-から選択される1つまたは複数の結合によって遮られたヒドロカルビル;またはR1、R2、R3およびR6ついて言えば、-O-、-S-もしくは-NRb-結合を介して式Aのベンゼン環に結合され、かつ-O-、-S-もしくは-NRb-から選択される1つまたは複数の結合によって任意で遮られたヒドロカルビル
から選択され、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは-L-Rxもしくは-LR-Scによって置換されており、かつ
ヒドロカルビルが1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有し、
Rbが、H、OH、C1-C6ヒドロカルビル、または-O-結合を介して隣接するNに結合されかつ/または1つまたは複数の-O-結合によって遮られたC1-C6ヒドロカルビルであり、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは-L-Rxもしくは-LR-Scによって置換されており、
-Lが、共有単結合であるリンカー、または一連の安定な共有結合を含みかつC、N、O、SおよびPから選択される多価の原子を組み込む部分であり、
-Rxが反応基であり、
-LRが、-LをScに結合している反応基の残基を任意でさらに含むリンカー-Lであり、
-Scが結合された物質であり、
任意でR1、R2、R3およびR6のうちの少なくとも1つ(例えばそれらのうちの2つ)がHではない、
請求項101または請求項102に記載の化合物。
[請求項104]
R1およびR2のうちの少なくとも1つがアルコキシまたは-L-Rxもしくは-LR-Scによって置換されたアルコキシであり、アルコキシが1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有し、他の記号が請求項103で定義されたとおりである、請求項101または請求項102に記載の化合物。
[請求項105]
R1、ならびにR2、R3およびR6のうちの1つ、2つまたは3つが、-O-もしくは-NRb-結合を介して前記ベンゼンに結合されたヒドロカルビルであり、
前記ヒドロカルビルが、前記結合の1つまたは複数によって遮られていないかまたは遮られており、かつ非置換であるかまたは-L-Rxもしくは-L-Scによって置換されており、
前記R1、R2、R3およびR6のうちの1つ、2つまたは3つが、互いに同じであるかまたは異なる、
請求項103または請求項104に記載の化合物。
[請求項106]
R1およびR3が請求項105で定義されたとおりであるが、R2およびR6が、請求項105で定義されたものではなく、かつ任意でともに水素である、請求項105に記載の化合物。
[請求項107]
Xがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項101から請求項106のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項108]
以下の式Iを有する、請求項101に記載の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩:
Figure 2015017094
式中、
R1、R2、R3およびR6は、各々独立に、H、Z、または電子供与性基(EDG)であるが、ただし、R1およびR2はヒドロキシルでもなく、かつチオールでもなく、かつそれらの脱プロトン化形態でもなく、
R4は、H、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
R5は、独立にY、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Xはフルオロフォアであり、
Yは=CRbRcまたは=CRbRdであり、
Zは-ORc、-SRc、-NRbRcであり、
RbはH、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Rcはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Rdはアミノまたは置換されたアミノである。
[請求項109]
Xがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項108に記載の化合物。
[請求項110]
Xが、
Figure 2015017094
である、請求項108に記載の化合物:
式中、
R7、R8、R9およびR10は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
R11、R12、R13およびR14は、各々独立に、H、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、-SO3H、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
R11およびR14はR7およびR8と一緒になって縮合環を形成し、かつR12およびR13はR9およびR10と一緒になって縮合環を形成する。
[請求項111]
R7、R8、R9およびR10がアルキルである、請求項109に記載の化合物。
[請求項112]
R7、R8、R9およびR10がメチルである、請求項110に記載の化合物。
[請求項113]
R11、R12、R13およびR14がHである、請求項109から請求項112のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項114]
R11およびR14がR7およびR8と一緒になって縮合環を形成し、R12およびR13がR9およびR10と一緒になって縮合環を形成し、各縮合環が以下の構造を有する、請求項109に記載の化合物:
Figure 2015017094
式中、
R27およびR28は、各々独立に、H、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3 -、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
[請求項115]
Xが、
Figure 2015017094
であり、
R15、R16、R17、R18、R19およびR20が、各々独立に、H、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、-SO3H、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
請求項108に記載の化合物。
[請求項116]
R16およびR19がHである、請求項115に記載の化合物。
[請求項117]
R15、R17、R18およびR20がメチルである、請求項115または請求項116に記載の化合物。
[請求項118]
Xが、
Figure 2015017094
であり、
R21が、H、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
R22、R23、R24、R25およびR26が、各々独立に、H、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、-SO3H、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
請求項108に記載の化合物。
[請求項119]
R21、R22、R24、R25およびR26がHである、請求項118に記載の化合物。
[請求項120]
R23がカルボキシルエステルである、請求項118または請求項119に記載の化合物。
[請求項121]
R23が-CO2CH3である、請求項118または請求項119に記載の化合物。
[請求項122]
前記EDGが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および(カルボキシルエステル)オキシからなる群から選択される、請求項108から請求項121のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項123]
前記EDGが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、および(カルボキシルエステル)オキシからなる群から選択される、請求項122に記載の化合物。
[請求項124]
Z部分が存在する、請求項108から請求項121のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項125]
Y部分が存在する、請求項108から請求項121のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項126]
R1にZを含み、少なくとも1つのさらなるEDGを含む、請求項124に記載の化合物。
[請求項127]
R1がアルコキシである、請求項124または請求項125に記載の化合物。
[請求項128]
R1が-OCH3である、請求項120に記載の化合物。
[請求項129]
R1およびR3が-OCH3または-N(CH3)2である、請求項108から請求項125のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項130]
R2およびR6がHである、請求項108から請求項121のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項131]
前記EDGが、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される、請求項108から請求項121のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項132]
R4およびR5がアルキルまたは置換されたアルキルである、請求項108から請求項131のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項133]
R5が、-(CH2)n-CO2(CH2)mHであり、
式中、nが0、1、2、3、4または5であり、かつmが0、1、2または3である、
請求項132に記載の化合物。
[請求項134]
R5が=CH(置換されたアミノ)である、請求項133に記載の化合物。
[請求項135]
R4がエチルである、請求項132に記載の化合物。
[請求項136]
前記化合物のpKaが約5〜約8である、請求項101から請求項135のいずれか一項に記載の化合物。
[請求項137]
以下の式IIIの化合物:
Figure 2015017094
式中、
R3は電子供与性基(EDG)であり、かつ
R4およびR5は、各々独立に、H、アルキル、置換されたアルキル、アシル、=CH(アミノ)、=CH(置換されたアミノ)、=CH(アルキル)、および=CH(置換されたアルキル)からなる群から選択される。
[請求項138]
R4およびR5が、各々独立にH、アルキルおよび置換されたアルキルから選択される、請求項137に記載の化合物。
[請求項139]
(a)試料を請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
(b)前記接触させた試料をインキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
(c)前記インキュベーションされた試料を照射し、照射された試料を形成する段階と、
(d)前記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、試料のpHを測定する方法であって、
前記蛍光性発光が前記試料のpHを測定するために使用される方法。
[請求項140]
前記試料が細胞を含む、請求項139に記載の方法。
[請求項141]
前記試料が、生細胞、細胞内液、細胞外液、血清、生体液、生物学的発酵培地、環境試料、工業試料、タンパク質、ペプチド、緩衝液、生体液もしくは化学反応器、血液細胞、免疫細胞、培養細胞、筋肉組織、ニューロン、細胞外小胞、脈管組織、血液、唾液、尿、水、土壌、廃水、海水、薬剤、食品または飲料を含む、請求項138に記載の方法。
[請求項142]
前記試料が、ポリマー膜上、ポリマーゲル内、微小粒子上、マイクロアレイ上、シリコンチップ上、スライドガラス上、マイクロウェルプレート上、および微小流体チップ上に固定化されている、請求項139、請求項140および請求項141のいずれか一項に記載の方法。
[請求項143]
前記接触させる段階が、前記試料を第2の色素と接触させることをさらに含む、請求項139から請求項142のいずれか一項に記載の方法。
[請求項144]
前記第2の色素が、前記色素とまたは化合物と異なる蛍光性発光スペクトルを有しかつ前記化合物のpKaと異なるpKaを有するpH感受性色素である、請求項136に記載の方法。
[請求項145]
(a)前記細胞を請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
(b)前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するためにインキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
(c)前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞内部のpHをモニターする段階と
を含む、生細胞内部のpHをモニターするための方法。
[請求項146]
前記細胞内部のpHの変化が細胞プロセスに対応する、請求項145に記載の方法。
[請求項147]
前記化合物がタンパク質、核酸または脂質に結合されている、請求項145または請求項146に記載の方法。
[請求項148]
前記細胞がニューロンである、請求項145、請求項146および請求項147のいずれか一項に記載の方法。
[請求項149]
(a)担体分子を蛍光性pH感受性色素に結合し、担体結合体を形成する段階と、
(b)前記担体結合体を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
(c)前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
(d)前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
(e)前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、
蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法。
[請求項150]
前記担体分子が大腸菌(E.coli)生体粒子である、請求項147に記載の方法。
[請求項151]
前記色素が、請求項101から請求項138のいずれか一項で特許請求される色素である、請求項149または請求項150に記載の方法。
[請求項152]
(a)請求項101から請求項138にいずれか一項に記載の化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
(b)前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
(c)前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
(d)前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、pHに関連する細胞プロセスを検出する方法であって、
蛍光性発光の増加が前記細胞プロセスの活性化を示す方法。
[請求項153]
前記細胞プロセスがイオンチャネルの開口である、請求項152に記載の方法。
[請求項154]
前記イオンチャネルがカルシウムチャネルである、請求項153に記載の方法。
[請求項155]
請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物を細胞の集団と接触させ、接触させた細胞集団を形成する段階と、
前記接触させた細胞集団を、前記化合物が前記標的細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、それによってインキュベーションされた細胞集団を形成する段階と、
前記インキュベーションされた細胞集団を照射する段階を含む、標的細胞が集団内の隣接する細胞とは異なって標識される、前記細胞の集団内の標的細胞を同定する方法であって、
前記標的細胞が、前記集団内の隣接する細胞と異なる標識によって同定される、
方法。
[請求項156]
前記標的細胞が神経細胞である、請求項155に記載の方法。
[請求項157]
前記異なる標識が蛍光の増加を含む、請求項156に記載の方法。
[請求項158]
請求項110から請求項114のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
(a)式IIA:
Figure 2015017094
の化合物を、式IIC:
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
[請求項159]
式IIAの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項158に記載の方法であって、該方法が、
(b)式IIB:
Figure 2015017094
の化合物を塩素化剤、例えば塩化オキサリルと接触させ、式IIAの化合物を形成する段階を含む、方法。
[請求項160]
請求項115から請求項117のいずれか一項に記載の化合物または請求項115に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項122から請求項136のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
IV
(a)式IVA:
Figure 2015017094
の化合物を、式IVB:
Figure 2015017094
および/またはIVC:
Figure 2015017094
の化合物、ならびに2,3,5,6-テトラクロロシクロヘキサ-2,5-ジエン-1,4-ジオン(クロラニル)、およびBF3・Et2Oと接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
[請求項161]
請求項118から請求項121のいずれか一項に記載の化合物、または請求項118に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項122から請求項136のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
Figure 2015017094
(a)式VA:
Figure 2015017094
の化合物をP(OEt)3と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
[請求項162]
式VAの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項161に記載の方法であって、該方法が、
(a)式IVA:
Figure 2015017094
の化合物を式VB:
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式VAの化合物を形成する段階を含む、方法。
[請求項163]
(a)請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物と、
(b)検体と
を含む、組成物。
[請求項164]
前記検体が細胞であり、前記化合物が前記細胞内部に位置する、請求項163に記載の組成物。
[請求項165]
前記検体がタンパク質、脂質または核酸である、請求項163に記載の組成物。
[請求項166]
前記化合物が担体分子に結合されている、請求項165に記載の組成物。
[請求項167]
試料のpHを測定するためのキットであって、
(a)請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物と、
(b)前記試料のpHを測定するための指示書と
を含むキット。
[請求項168]
緩衝剤、精製培地、前記試料を含むバイアル、または有機溶媒のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項167に記載のキット。
[請求項169]
任意で、生細胞に関する、または生物学的実体もしくは物質、例えば生細胞、細胞内液、細胞外液、体液、血清、発酵培地、細胞培養液、もしくは組織を含むかまたは含むと思われる試料における、請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物のpHセンサーとしての使用。
[請求項170]
バイオアッセイ法における、請求項101から請求項138のいずれか一項に記載の化合物の使用。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、例示のためとしてのみ提示されていることを理解されたい。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内での種々の変更および修正は、この詳細な説明から当業者には明らかとなるからである。
[図面の簡単な説明]
図１は、ｐＨセンサー（化合物１２７）の滴定曲線を示す図であり、プロトン化によって蛍光が顕著に増加することを示す。
図２は、アミジンおよびフルオレセイン指示基の両方を有する化合物１７３の滴定曲線を示す図である。これは、フルオレセイン滴定曲線（ｐＫａ約５．５で蛍光の増加）およびアミジン滴定曲線（ｐＫａ約８．０で蛍光の急激な低下）に似ている。得られた曲線は、ｐＨ７．２に明確な極大を有する。
図３は、化合物１１１に結合されたトランスフェリンとともにインキュベーションした後の、ＨｅＬａ細胞のエンドサイトーシス再循環区画の核周辺部の染色パターンを示す図である。
図４は、ｐＨ色素標識された（化合物１１１および化合物１２９）生体粒子についての蛍光強度測定値対ｐＨを示す図であり、それらを、テトラメチルローダミン標識された生体粒子および未標識の生体粒子と比較する。この色素結合体は、酸性ｐＨで大きな蛍光の増加を示す。記号（○）は化合物番号１２９に対応する。記号（△）は化合物１１１に対応する。記号（□）テトラメチルローダミンに対応する。記号（●）は化合物１８９に対応する。記号（□）は陰性対照に対応する。
図５は、未標識大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも（化合物１２９で）標識された大腸菌を取り込んだ、白血球細胞（顆粒球）の蛍光の増加を示すフローサイトメトリー実験を示し、氷冷した陰性対照試料と比較した図である。図５Ａは生体粒子がない陰性対照に対応し、図５Ｂは氷上の陰性対照に対応し、図５Ｃは極大反応に対応する。
図６は、細胞内の抱き込まれた大腸菌で満たされた食胞の明るい小胞染色を示す図である。図６Ａは、ｐＨ感受性色素（化合物１２９）を用いて見出された染色を示す。図６Ｂでは、ＴＭＲ標識された大腸菌が使用され、抱き込まれなかった大腸菌の小さい点が見られる。
図７Ａは、化合物１０９のＣ１６バージョンが細胞を標識することを示し、図７Ｂは、未標識大腸菌を加えて膜染色剤が酸性小胞に内部移行されたのちの膜染色剤の信号の増加を示す。
図８は、混合細胞培養液中でニューロンを特異的に染色する色素のスクシンイミジルエステル体を示す図である。低強度画像（図８Ａ）は、この調製物中のニューロンの非常に特異的な染色を示す。高強度画像（図８Ｂ）は、ニューロンの特異的染色およびこの混合培養液中のニューロンのために支持細胞層を形成する、グリア細胞の比較的おぼろげな染色を示す。
図９Ａは、化合物１２９よりも高標識度のレシオメトリックなローダミングリーンとのデキストラン結合体からの蛍光反応を示す。この結合体は、調製され、指示されたｐＨ値に調整された５０ｍＭ リン酸塩緩衝液中で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈され、蛍光プレートリーダーで走査され、１）ｐＨとともに変化しないローダミングリーン（４８８で励起、５２５で発光、カットオフ５１５）からの蛍光、および２）蛍光がｐＨとともに変化する赤チャネル（励起５４０、発光６００、カットオフ５９０）の化合物１２９からの蛍光を測定した。図９Ｂは、図９Ａのプロットの棒グラフを示す。これは、４〜８のｐＨ範囲にわたって、２種の異なる構築物についてのローダミングリーンの蛍光／化合物１２９の蛍光の比を描いている。
図１０Ａは、１０，０００ＭＷ デキストラン結合体からの蛍光反応を示す。この結合体は、調製され、指示されたｐＨ値に調整された５０ｍＭ リン酸塩緩衝液中で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈され、蛍光プレートリーダーで走査され、１）ｐＨとともに変化しないローダミングリーン（４８８で励起、５２５で発光、カットオフ５１５）からの蛍光、および２）蛍光がｐＨとともに変化する赤チャネル（励起５４０、発光６００、カットオフ５９０）の化合物１２９からの蛍光を測定した。図１０Ｂは、図１０Ａのプロットの棒グラフを示す。これは、４〜８のｐＨ範囲にわたって、２種の異なる構築物についてのローダミングリーンの蛍光／化合物１２９の蛍光の比を描いている。
図１１は、様々な細胞外ｐＨの溶液中の色素の蛍光のアウトプットを示す図であり、信号は特定のｐＨ値に対して較正されている。細胞は、生理食塩水溶液中５ｕＭで細胞質区画を負荷するために化合物１９０とともにインキュベーションされ、この細胞のインキュベーションは３７℃で３０分間、および室温で３０分間で行われた。この細胞は、生理食塩水で１回洗浄され、様々なｐＨでナイジェリシンを加えまたは差し引いた高カリウムの生理食塩水で処理された。このナイジェリシンは溶液中の高いカリウムを使用するプロトン／カリウム交換体であり（それはナトリウムの代わりに用いられている）、細胞質のｐＨが細胞外溶液のｐＨと一致するまで、膜を横切ってプロトンを運ぶ。図１１Ａでは細胞外ｐＨは５．４７であり、図１１ＢではｐＨは６．８であり、図１１ＣではｐＨは７．５７であり、図１１ＤではｐＨは８．０４である。各チャートでは、右側の棒はナイジェリシンありであり、左側の棒はナイジェリシンなしである。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、Ｏｐｔｉｍｅｍ中で一晩、化合物１２９−βアミロイドとともにインキュベーションしたマウスマクロファージ（Ｊ７７４）細胞を示す。中央の細胞は、化合物１２９に結合されたβアミロイドの取り込みに由来する特異的信号を示す。
発明の詳細な説明
序論
一群のローダミン系ｐＨセンサー（Ｇ．Ａ．Ｓｍｉｔｈら、国際公開公報第２００５／０９８４３７号パンフレット）は、アミンＰＥＴ指示薬と類似のｐＨ依存性を示す。Ｓｍｉｔｈらによれば、蛍光消光の機構は、他のＰＥＴセンサーと異なる。特に、消光の原因は、指示ヒドロキシルまたはチオール基のイオン化の際に生成するアニオンのＰＥＴ特性に起因することが明記されており、従ってＸ置換基は（一部は）、スキーム１に図示されているように、この色素のｐＨ反応を担うと考えられる。
Figure 2015017094
しかしながら、本発明者らは、対応するＸの位置でのアルコキシ置換が、ｐＨの変化に反応して変調された蛍光を依然として示すことができることを見出した。このように、理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、蛍光を変調するのはアリール環の４位の窒素のプロトン化であると仮定している。いずれにせよ、本発明は、置換基の窒素が保持されていれば、これまでは不可欠であったヒドロキシまたはチオール基Ｘは無くてもよいという洞察を前提とする。
さらに、Ｓｍｉｔｈらが記載する色素は、おそらく酸化の結果として、溶液中で安定でないことを観察した。レポーターのテトラメチルローダミン部分の強い電子吸引性は、その指示基のｐＫａを著しく低下させ、従ってセンサーの作用範囲を酸性ｐＨ値へとシフトさせる。
それゆえ、いくつかの実施形態では、本発明は、アニリン部分（そのアミノ基は、本願明細書に開示されるように置換されていてもよく、または修飾されていてもよい）を有し、そのアニリンのベンゼン環はフルオロフォアのオルトにヒドロキシおよびチオール置換基が存在しないか、またはある実施形態では、すべての位置にヒドロキシおよびチオールが存在しないｐＨ感受性色素を提供する。特に、これらの化合物は、Ｇ．Ａ．Ｓｍｉｔｈらが必要とするヒドロキシまたはチオール置換基の代わりに、ヒドロキシまたはチオール基の酸素または硫黄が、例えばアルコキシ基もしくはフラン部分、またはこれらの硫黄類似体の一部としてエーテルまたはチオエーテル結合に組み込まれている部分を有していてもよい。別の見方をすれば、酸素または硫黄をエーテルの形で保持するそれらの化合物は、電子供与性基をベンゼン環に戦略的に導入して電子豊富なアニリンを生成することを通して、その分子の電子密度の増加をもたらし、これによってｐＫａを生理的領域に近づける化合物である。従って、このベンゼン環は、同じであっても異なっていてもよい電子供与性基によって１回または複数回（１回、２回、３回または４回）置換されていてもよい。一種の化合物では、このエーテル化されたＯまたはＳは、別の電子供与性基で置き換えられる。このエーテル化されたＯまたはＳが別のＥＤＧによって置き換えられていると否とによらず、ｐＫａをさらに高めるために、補助的な電子供与性基がそのベンゼン環に提供されてもよい。一種の化合物では、全部で２つの電子供与性基、特に、ベンゼン環のすぐ隣で利用可能な孤立電子対を有するタイプの２つの電子供与性基（例えば、本願明細書に記載されるように任意で置換されたアルコキシまたはジアルキルアミノ）がベンゼン環に提供される。加えて、その分子の量子収率を高めるための修飾がなされていてもよい。このように、本発明のｐＨセンサーは他のＰＥＴベースの色素よりも顕著な利点を有し、有利なことに、改善された安定性および／または生理学的応用の範囲のｐＫａを有するという恩恵を提供する。
アミノ基をより塩基性の窒素官能基、特にアミジンなどに修飾することによってアニリンのアミノ基のｐＫａが高められている実施形態もまた、本発明に包含される。この特徴は、省かれたヒドロキシまたはチオール基を別の電子供与性基で置き換えることに代わる方法として採用すると有利であるかも知れない。あるいは、そのアミノ基をより塩基性の基に修飾することが、ヒドロキシまたはチオール基以外の少なくとも１つ電子供与性基によるベンゼン環の置換と組み合わされてもよい。
本発明が目的とする具体的な特徴としては、（１）生理的範囲内の解離定数ｐＫａ；（２）より高い安定性（酸化に対してのものと考えられる）；（３）反応基とともにｐＫａを高める置換基を導入することができる柔軟な合成方法；（４）異なるスペクトル特性を備えた指示薬を作製するために、異なるフルオロフォアレポーター部分を導入する可能性、の１つまたは複数が挙げられる。説明したとおり、本発明は特に、以前は不可欠であったＸのヒドロキシまたはチオールを不要にすることにより、望ましくは高められた安定性を有する化合物を提供する。このヒドロキシまたはチオール基は、同じ位置で別の電子供与性基に置き換えられることが有利である。加えて、またはあるいは、かかる他の電子供与性基は、そのベンゼン環の他の位置で置換されていてもよい。
これらの目標を達成するために、新規の種類のｐＨ感受性化合物が設計され、合成され、かつ分析的用途および生物学的応用で試験された。好ましい化合物の構造としては、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩおよび式ＶＩＩが挙げられる。
電子供与性基／電子吸引性基および芳香族系
電子供与性基および電子吸引性基というテーマは、大学の化学のあらゆる学部学生に熟知されているであろうが、手短に考察することが適切かも知れない。
芳香環上の置換基は、その環に結合した水素原子と比べて、その芳香環に電子を供与するか、またはその芳香環から電子を吸引するかのいずれかであるかも知れない。それゆえ、置換基は、電子供与性基または電子吸引性基として分類してよい。
多くの電子供与性基はその芳香環のπ系に隣接した原子上に孤立電子対を有する。アルキル基、芳香族基およびアルケニル基は、さらなる電子供与性基の例である。電子吸引性基は、一般に、芳香族π系に隣接する原子が正の形式電荷を有するか、または（例えば、より電気陰性の原子に連結されていることに起因して）δ正電荷を有するものである。電子供与性基は、その環系のさらなる置換に関して活性化効果を有し、さらなる置換をオルト／パラに配向させる傾向があり、他方、電子吸引性基は不活性化し、メタ配向させる傾向がある。この例外はハロゲン置換基であり、これは、全体としては電子吸引性であり不活性化するが、共鳴（孤立電子対）による供与のために、オルト／パラ配向させる傾向がある。表Ｘは、いくつかの一般的な置換基の相対的電子吸引性および供与性を示す。
（表Ｘ）最も電子供与性から最も電子吸引性までランク付けした、様々な芳香族置換基の相対的電子供与性／電子吸引性
Figure 2015017094
上記の表の中の記号Ｒは、特に、アルキルを表すが、それはアルキルの電子的効果を供与性から吸引性へと、または吸引性から供与性へと変換しない任意の妥当な方法で置換されていてもよい。本願明細書はさらに、本願明細書に記載されるアニリンまたはアニリン様環のフェニル置換のための適切な電子供与性基を記載する。
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の組成物またはプロセス段階には限定されない、従って様々であってもよいことを理解されたい。本願明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈から明らかにそうではないと分かる場合を除き、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は複数形の指示対象を含むことに留意されたい。このように、例えば、「１つの蛍光性ｐＨ感受性色素」という場合は、複数の色素を含み、「１つの細胞」という場合は複数の細胞を含む、などである。
別段の定義がない限り、本願明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。以下の用語は、本願明細書に記載する本発明の目的のために定義される。
「アルキル」とは、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、例として、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、およびネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）などの直鎖状および分枝状のヒドロカルビル基を含む。
「置換されたアルキル」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の置換基を有するアルキル基を指し、この置換基は、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、アリールチオ、置換されたアリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換されたシクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換されたシクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換されたシクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換されたシクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換されたグアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換されたヘテロアリールチオ、複素環式、置換された複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換されたヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換されたヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換されたアルキルチオ（上記置換基は本願明細書に定義されている）からなる群から選択される。特定の置換されたアルキル基は、担体分子または固体支持体に直接または間接的に結合するための反応基を含み、例としては、カルボキシルまたはカルボキシルエステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化エステル）により置換されたアルキル、およびアミノカルボニル−ＣＯＮＨＲａ（式中、Ｒａは以下で用語「アミノカルボニル」に言及して定義される有機部分であり、例えばカルボキシル、カルボキシルエステル、マレイミドなどの反応基によって末端で置換されたＣ１−Ｃ１０（例えばＣ１−Ｃ６）アルキルである）によって置換されたアルキルを挙げることができる。
「アルコキシ」とは、基−Ｏ−アルキル（アルキルは本願明細書に定義されている）を指す。アルコキシとしては、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｎ−ペントキシが挙げられる。
「置換されたアルコキシ」とは、基−Ｏ−（置換されたアルキル）を指す（置換されたアルキルは本願明細書に定義されている）。
「アシル」とは、基Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換されたアルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換されたアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換されたアルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換されたシクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換されたシクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換されたアリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換されたヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、複素環式−Ｃ（Ｏ）−、および置換された複素環式−Ｃ（Ｏ）−（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。アシルは、「アセチル」基ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−を包含する。
「アシルアミノ」とは、基−ＮＲＣ（Ｏ）アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたシクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたシクロアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたアルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換されたヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）複素環式、および−ＮＲＣ（Ｏ）置換された複素環式（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アシルオキシ」とは、基アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたアルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたアルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたシクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたシクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換されたヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、複素環式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および置換された複素環式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノ」とは基−ＮＨ２を指す。
「置換されたアミノ」とは、基−ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、置換された複素環式、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換されたアルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換されたアルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換されたシクロアルキル、−ＳＯ２−シクロアルケニル、−ＳＯ２−置換されたシクロアルケニル，−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換されたアリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換されたヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環式、および−ＳＯ２−置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成するが、ただしＲ’およびＲ”は両方が水素ではなく、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。Ｒ’が水素であり、Ｒ”がアルキルである場合、この置換されたアミノ基は、本願明細書でアルキルアミノと呼ばれることがある。Ｒ’およびＲ”がアルキルである場合、この置換されたアミノ基は、本願明細書でジアルキルアミノと呼ばれることがある。一置換アミノに言及する場合は、Ｒ’またはＲ”のいずれかは水素であるが両方が水素ではないことを意味する。二置換アミノに言及する場合は、Ｒ’もＲ”も水素ではないことを意味する。
「アミノカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”はそれらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノチオカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノカルボニルアミノ」とは、基−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”はそれらに結合する窒素と任意で一緒になって、複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノチオカルボニルアミノ」とは、基−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノカルボニルオキシ」とは、基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノスルホニル」とは、基−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノスルホニルオキシ」とは、基−Ｏ−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミノスルホニルアミノ」とは、基−ＮＲ−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、Ｒ１０およびＲ１１は独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アミジノ」とは、基−Ｃ（＝ＮＲ’’’）Ｒ’Ｒ”（式中、Ｒ’、Ｒ”、およびＲ’”は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合する窒素と任意で一緒になって複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成し、かつアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「アリール」または「Ａｒ」とは、単環（例えば、フェニル）または多環の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、６〜１４個の炭素原子を有する一価の芳香族炭素環式基を指し、この縮合環は、結合点が芳香族炭素原子上にあれば、芳香族であってもよく、なくてもよい（例えば、２−ベンゾオキサゾリノン、２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−３（４Ｈ）−オン−７−イルなど）。好ましいアリール基としてはフェニルおよびナフチルが挙げられる。
「置換されたアリール」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の置換基で置換されたアリール基を指し、この置換基は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、アリールチオ、置換されたアリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換されたシクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換されたシクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換されたシクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換されたシクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換されたグアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換されたヘテロアリールチオ、複素環式、置換された複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換されたヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換されたヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換されたアルキルチオ（上記置換基は本願明細書に定義されている）からなる群から選択される。
「アリールオキシ」とは、基−Ｏ−アリール（アリールは本願明細書に定義したとおりである）を指し、例としては、フェノキシおよびナフトキシが挙げられる。
「置換されたアリールオキシ」とは、基−Ｏ−（置換されたアリール）を指す（置換されたアリールは本願明細書に定義したとおりである）。
「アリールチオ」とは、基−Ｓ−アリール（アリールは本願明細書に定義したとおりである）を指す。
「置換されたアリールチオ」とは、基−Ｓ−（置換されたアリール）を指す（置換されたアリールは本願明細書に定義したとおりである）。
「アルケニル」とは、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つ、好ましくは１〜２つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基を指す。かかる基の例としては、例えば、ビニル、アリル、およびブタ−３−エン−１−イルが挙げられる。
「置換されたアルケニル」とは、１〜３個の置換基、好ましくは１〜２個の置換基を有するアルケニル基を指し、この置換基は、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、アリールチオ、置換されたアリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換されたシクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換されたシクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換されたシクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換されたシクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換されたグアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換されたヘテロアリールチオ、複素環式、置換された複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換されたヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換されたヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換されたアルキルチオ（上記置換基は本願明細書に定義されているが、ただしいかなるヒドロキシ置換もビニル（不飽和）炭素原子に結合していない）からなる群から選択される。
「アルキニル」とは、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜３個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つ、好ましくは１〜２個のアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基を指す。
「置換されたアルキニル」とは、１〜３個の置換基、好ましくは１〜２個の置換基を有するアルキニル基を指し、この置換基は、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、アリールチオ、置換されたアリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換されたシクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換されたシクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換されたシクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換されたシクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換されたグアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換されたヘテロアリールチオ、複素環式、置換された複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換されたヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換されたヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換されたアルキルチオ（上記置換基は本願明細書に定義されているが、ただしいかなるヒドロキシ置換もアセチレン炭素原子に結合していない）からなる群から選択される。
「カルボニル」とは、二価の基−Ｃ（Ｏ）−を指し、これは−Ｃ（＝Ｏ）−と等価である。
「カルボキシル」または「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨまたはその塩を指す。
「カルボキシルエステル」または「カルボキシエステル」とは、基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換された複素環式（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「（カルボキシルエステル）アミノ」とは、基−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、置換された−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルキニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたヘテロアリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、および−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換された複素環式（式中、Ｒはアルキルまたは水素であり、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「（カルボキシルエステル）オキシ」とは、基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、置換された−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたシクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換されたヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換された複素環式（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「シアノ」とは、基−ＣＮを指す。
「シクロアルキル」とは、縮合環系、架橋環系およびスピロ環系を含めた単環式環または多環式環を有する、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキル基を指す。適切なシクロアルキル基の例としては、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
「シクロアルケニル」とは、単環式環または多環式環を有し、かつ少なくとも１つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和、好ましくは１〜２つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和部位を有する、３〜１０個の炭素原子を有する非芳香族環式アルキル基を指す。
「置換されたシクロアルキル」および「置換されたシクロアルケニル」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個の置換基を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル基を指し、この置換基は、オキソ、チオン、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、アリールチオ、置換されたアリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換されたシクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換されたシクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換されたシクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換されたシクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換されたグアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換されたヘテロアリールチオ、複素環式、置換された複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換されたヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換されたヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換されたアルキルチオ（上記置換基は本願明細書に定義されている）からなる群から選択される。
「シクロアルキルオキシ」とは、−Ｏ−シクロアルキルを指す。
「置換されたシクロアルキルオキシ」とは、−Ｏ−（置換されたシクロアルキル）を指す。
「シクロアルキルチオ」とは、−Ｓ−シクロアルキルを指す。
「置換されたシクロアルキルチオ」とは、−Ｓ−（置換されたシクロアルキル）を指す。
「シクロアルケニルオキシ」とは、−Ｏ−シクロアルケニルを指す。
「置換されたシクロアルケニルオキシ」とは、−Ｏ−（置換されたシクロアルケニル）を指す。
「シクロアルケニルチオ」とは、−Ｓ−シクロアルケニルを指す。
「置換されたシクロアルケニルチオ」とは、−Ｓ−（置換されたシクロアルケニル）を指す。
「グアニジノ」とは、基−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を指す。
「置換されたグアニジノ」とは、−ＮＲ１３Ｃ（＝ＮＲ１３）Ｎ（Ｒ１３）２（式中、各Ｒ１３は、独立に水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式、および置換された複素環式からなる群から選択され、共通のグアニジノ窒素原子に結合した２つのＲ１３基は、それらに結合した窒素と任意で一緒になって、複素環式基もしくは置換された複素環式基を形成するが、ただし少なくとも１つのＲ１３は水素ではなく、かつ上記置換基は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「Ｈ」は水素を表す。
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、基−ＯＨを指す。
「ヘテロアリール」とは、環内に、１〜１０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する芳香族基を指す。かかるヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジニルもしくはフリル）または多環の縮合環（例えば、インドリジニルもしくはベンゾチエニル）を有することができ、この縮合環は、結合点がその芳香族ヘテロアリール基の原子を介してであれば、芳香族であっても芳香族でなくてもよく、かつ／あるいはヘテロ原子を含有していてもよく、含有していなくてもよい。一実施形態では、このヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子（複数個であってもよい）は、任意で酸化され、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分を与える。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルが挙げられる。
「置換されたヘテロアリール」とは、置換されたアリールについて定義された置換基と同じ基からなる群から選択される１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の置換基で置換されたヘテロアリール基を指す。
「ヘテロアリールオキシ」とは、−Ｏ−ヘテロアリールを指す。
「置換されたヘテロアリールオキシ」とは、基−Ｏ−（置換されたヘテロアリール）を指す。
「ヘテロアリールチオ」とは、基−Ｓ−ヘテロアリールを指す。
「置換されたヘテロアリールチオ」とは、基−Ｓ−（置換されたヘテロアリール）を指す。
「複素環」または「複素環式」または「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」とは、縮合環系、架橋環系およびスピロ環系を含めた単環もしくは多環の縮合環、環内に１〜１０個の炭素原子、ならびに窒素、硫黄または酸素からなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する飽和もしくは不飽和基を指し、縮合環系では、結合点が非芳香環を介してのものであれば、１つまたは複数のその環はシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであってよい。一実施形態では、この複素環式基の窒素および／または硫黄原子は、任意で酸化され、Ｎ−オキシド、スルフィニル、スルホニル部分を与える。
「置換された複素環式」または「置換されたヘテロシクロアルキル」または「置換されたヘテロシクリル」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個の、置換されたシクロアルキルについて定義したのと同じ置換基で置換されたヘテロシクリル基を指す。
「ヘテロシクリルオキシ」とは、基−Ｏ−ヘテロシクリルを指す。
「置換されたヘテロシクリルオキシ」とは、基−Ｏ−（置換されたヘテロシクリル）を指す。
「ヘテロシクリルチオ」とは、基−Ｓ−ヘテロシクリルを指す。
「置換されたヘテロシクリルチオ」とは、基−Ｓ−（置換されたヘテロシクリル）を指す。
複素環およびヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも呼ばれる）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、およびテトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヒドラジニル」とは、基−ＮＨＮＨ２−または＝ＮＮＨ−を指す。
「置換されたヒドラジニル」とは、アルキル基などの非水素原子がヒドラジニルアミン基の一方または両方に付加されているヒドラジニル基を指す。置換されたヒドラジニルの例は、−Ｎ（アルキル）−ＮＨ２または＝Ｎ＋（アルキル）−ＮＨ２である。
「ニトロ」とは、基−ＮＯ２を指す。
「オキソ」とは、原子（＝Ｏ）または（−Ｏ−）を指す。
「スピロシクリル」とは、以下の構造：
Figure 2015017094
によって例示されるような、スピロ連結部分（その環の唯一の共通のメンバーである１つの原子によって形成される連結部分）を備えたシクロアルキルまたはヘテロシクリル環を有する、３〜１０個の炭素原子を有する二価の飽和環式基を指す。
「スルホニル」とは、二価の基−Ｓ（Ｏ）２−を指す。
「置換されたスルホニル」とは、基−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換されたアルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換されたアルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換されたシクロアルキル、−ＳＯ２−シクロアルケニル、−ＳＯ２−置換されたシクロアルケニル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換されたアリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換されたヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環式、−ＳＯ２−置換された複素環式（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。置換されたスルホニルとしては、メチル−ＳＯ２−、フェニル−ＳＯ２−、および４−メチルフェニル−ＳＯ２−などの基が挙げられる。
「スルホニルオキシ」とは、基−ＯＳＯ２−アルキル、−ＯＳＯ２−置換されたアルキル、−ＯＳＯ２−アルケニル、−ＯＳＯ２−置換されたアルケニル、−ＯＳＯ２−シクロアルキル、−ＯＳＯ２−置換されたシクロアルキル、−ＯＳＯ２−シクロアルケニル、−ＯＳＯ２−置換されたシクロアルケニル，−ＯＳＯ２−アリール、−ＯＳＯ２−置換されたアリール、−ＯＳＯ２−ヘテロアリール、−ＯＳＯ２−置換されたヘテロアリール、−ＯＳＯ２−複素環式、−ＯＳＯ２−置換された複素環式（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「チオアシル」とは、基Ｈ−Ｃ（Ｓ）−、アルキル−Ｃ（Ｓ）−、置換されたアルキル−Ｃ（Ｓ）−、アルケニル−Ｃ（Ｓ）−、置換されたアルケニル−Ｃ（Ｓ）−、アルキニル−Ｃ（Ｓ）−、置換されたアルキニル−Ｃ（Ｓ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｓ）−、置換されたシクロアルキル−Ｃ（Ｓ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｓ）−、置換されたシクロアルケニル−Ｃ（Ｓ）−、アリール−Ｃ（Ｓ）−、置換されたアリール−Ｃ（Ｓ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｓ）−、置換されたヘテロアリール−Ｃ（Ｓ）−、複素環式−Ｃ（Ｓ）−、および置換された複素環式−Ｃ（Ｓ）−（式中、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環式および置換された複素環式は本願明細書に定義されたとおりである）を指す。
「チオール」とは、基−ＳＨを指す。
「チオカルボニル」とは、二価の基−Ｃ（Ｓ）−を指し、これは−Ｃ（＝Ｓ）−と等価である。
「チオン」とは、原子（＝Ｓ）を指す。
「アルキルチオ」とは、基−Ｓ−アルキルを指す（アルキルは本願明細書に定義したとおりである）。
「置換されたアルキルチオ」とは、基−Ｓ−（置換されたアルキル）を指す（置換されたアルキルは本願明細書に定義したとおりである）。
Figure 2015017094
のように、置換基から突き出ている破線は基本となる分子への結合点を示す。縮合環については、破線は、
Figure 2015017094
のように、その縮合環が結合している基本となる分子の部分を示し、分子全体では、以下の構造をもつことになる。
Figure 2015017094
特記しない限り、本願明細書に明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能性の末端部分を名付け、次に結合点に向かって隣接する官能性を名付けることによって、到達される。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」とは、基（アリール）−（アルキル）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−を指す。
上で定義したすべての置換された基において、自身へのさらなる置換基で置換基を限定することによって到達されるポリマー（例えば、置換されたアリール基を置換基として有する置換されたアリール基であり、その置換基はそれ自身置換されたアリール基で置換され、それはまた置換されたアリール基で置換されている等々）は、本願明細書に包含することは意図されていないことを理解されたい。かかる場合、かかる置換の最大数は３である。例えば、２つの他の置換されたアリール基による置換されたアリール基の一連の置換は、−置換されたアリール−（置換されたアリール）−置換されたアリールに限定される。
同様に、上記の定義は、容認できない置換パターン（例えば、５個のフルオロ基で置換されたメチル）を含むことは意図していないことを理解されたい。かかる容認できない置換パターンは、当業者には周知である。
用語「担体分子」は、本願明細書で使用する場合、本発明の化合物に共有結合されているか、または共有結合されるようになる生物学的または非生物学的構成成分を指す。かかる構成成分としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微小粒子、生物学的細胞、ウイルスおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。担体分子が、少なくとも４個の多価原子およびしばしば１０個を超える多価原子（すなわち、水素およびハロ以外の原子）、例えば少なくとも２０個のかかる原子を有する部分の場合のように、少なくとも１５個のかかる原子を有する有機部分を含む一実施形態がこれに含まれる。
用語「結合された物質」または「Ｓｃ」とは、担体分子または固体支持体を指す。
本願明細書で使用する場合の用語「検出可能な反応」とは、観察または計測のいずれかによって直接または間接的に検出可能な信号の発生または変化を指す。典型的には、検出可能な反応は、波長分布パターンまたは吸光度もしくは蛍光の強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光の変化、あるいはこれらのパラメータの組合せをもたらす光学的反応である。
本願明細書で使用する場合の用語「色素」とは、光を発して観察可能で検出可能な信号を生成する化合物を指す。
「電子供与性基」または「ＥＤＧ」とは、芳香環（フェニルなど）に隣接し、かつ共鳴による供与効果によってその環の電子密度を高める、孤立電子対を有する置換基を指す。本発明の電子供与性基としては、例えば、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシが挙げられる。アルコキシは、具体的なＥＤＧである。置換されたアルコキシは、別の具体的なＥＤＧである。ジアルキルアミノもまた言及すべきものである。さらなる例は、置換されたアルキル基を有するジアルキルアミノである。好ましいＥＤＧは、−ＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、および−Ｎ（ＣＨ３）２であり、特に−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、および−Ｎ（ＣＨ３）２である。いずれの例においても、アルキル置換基を有しかつそのアルキル部が部分−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されている、アルコキシ、アルキルチオおよびジアルキルアミノもまた言及すべきものである。本願明細書はまた、芳香環に隣接した孤立電子対を有するもの以外のＥＤＧを含む特定の化合物または化合物の種類も開示する。
「蛍光性ｐＨ感受性色素」とは、蛍光スペクトルまたは強度がｐＨによって影響を受ける化合物を指す。
本願明細書で使用する場合の用語「フルオロフォア」または「蛍光発生性」とは、生来的に蛍光性であるか、またはプロトン化、生物学的化合物または金属イオンへの結合、もしくは酵素による代謝の際に蛍光の変化を示す組成物を指す。本発明の好ましいフルオロフォアとしては、水系媒体中において高量子収率を有する蛍光性色素が挙げられる。フルオロフォアの例としては、とりわけ、キサンテン、インドール、ボラポリアザインダセン、フラン、およびベンゾフランが挙げられる。本発明のフルオロフォアは、そのフルオロフォアの溶解性、スペクトル特性または物理的特性を変えるために置換されていてもよい。
本願明細書で使用する場合の用語「リンカー」または「Ｌ」とは、共有単結合、または一連の安定な共有結合を含む部分を指し、この部分は、蛍光発生性もしくは蛍光性化合物を別の部分（化学的に反応性の基または生物学的および非生物学的な構成要素など）に共有結合する、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１−４０個の多原子価原子を組込んでいることが多い。リンカー中の多原子価原子の数は、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０もしくは最高４０またはより大きな値の数であってよい。リンカーは、直鎖状または非直鎖状であってよく、いくつかのリンカーはペンダント側鎖またはペンダント官能基（あるいはその両方とも）を有する。かかるペンダント部分の例は、親水性改質部分、例えばスルホ（−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３ −）のような可溶化基である。一実施形態では、Ｌは、単結合、二重結合、三重結合または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合の任意の組合せから構成される。連結メンバーの例としては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などを含む部分が挙げられる。リンカーは、例として、アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは０、１または２である）、−Ｏ−、５員もしくは６員の単環式環ならびに任意のペンダント官能基（例えばスルホ、ヒドロキシおよびカルボキシ）から選択される部分の組合せからなっていてもよい。反応基に結合したリンカーによって形成される部分は、−Ｌ−Ｒｘと表現される場合がある。この反応基は、それと反応性の物質と反応し、それによりそのリンカーが結合された物質（Ｓｃ）に結合することになってもよく、この場合、このリンカーは典型的には反応基の残基（例えば、エステルのカルボニル基）を含み、「−ＬＲ」と表現されることがある。「開裂可能なリンカー」は、反応もしくは条件の結果によって切断され得る１つまたは複数の開裂可能な基を有するリンカーである。用語「開裂可能な基」とは、放出される部分を結合体の残りに連結する結合を開裂することにより、結合体の残りから結合体のある部分、例えば蛍光発生性部分もしくは蛍光性部分の放出を可能にする部分を指す。かかる開裂は、本質的に化学的であるか、または酵素により媒介されるかのいずれかである。酵素により開裂可能な基の例としては、天然アミノ酸または天然アミノ酸で終結するペプチド配列が挙げられる。
酵素により開裂可能な基に加えて、酵素以外の因子の作用によって開裂される１つまたは複数の部位を含むことは本発明の範囲内である。非酵素的開裂因子の例としては、酸、塩基、光、（例えば、ニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステル）、および熱が挙げられるが、これらに限定されない。多くの開裂可能な基が当該技術分野で公知である。例えば、Ｊｕｎｇら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２−１６２（１９８３）；Ｊｏｓｈｉら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８−１４５２５（１９９０）；Ｚａｒｌｉｎｇら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３−９２０（１９８０）；Ｂｏｕｉｚａｒら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１−１４７（１９８６）；Ｐａｒｋら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５−２１０（１９８６）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９−１８６７（１９８９）を参照。さらに、広範な範囲の開裂可能な、二官能性（同種二官能性および異種二官能性ともに）スペーサアームが市販されている。
例示的な開裂可能な基であるエステルは、試薬、例えば水酸化ナトリウムによって開裂させることができる開裂可能な基であり、カルボキシレート含有断片およびヒドロキシル含有生成物を与える。
このリンカーは、その化合物を結合体の別の構成要素（標的部分（例えば、抗体、リガンド、非共有結合的タンパク質結合基など）、検体、生体分子、薬物など）に結合するために使用することができる。
本発明は、−Ｌ−が式−Ｌ１−（Ｌ２）ｐ−（Ｌ３）ｒ− である一種類の化合物を包含し、
式中、
ｐは０または１であり、
ｑは０または１であり、
Ｌ１は結合、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、または少なくとも２つのアミノ酸を含む部分であり、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−、または１〜３０個の炭素原子を有しかつ非置換であるかもしくは少なくとも１つのＲａ、例えば１、２、３、４、５または６個のＲａによって置換されたアルキレンであり、
Ｌ３は、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｔ−または少なくとも２つのアミノ酸を含む部分であり、
式中
ｒは１〜３０、例えば１〜１０（例えば１、２、３、４、５または６など）の場合のように１〜２０であり、
ｓは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、例えば１〜７であり、
ｔは１〜３０、例えば１〜１０（例えば１、２、３、４、５または６など）の場合のように１〜２０であり、
Ｒａはスルホ（−ＳＯ３Ｈおよび／もしくは−ＳＯ３ −）、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ、特にスルホである。通常、Ｌのアルキレン部分に含まれる炭素原子の総数は、４０以下、例えば３５まで、３０まで、２５まで、２０まで、１５まで、まはた１０までである。
通常、少なくとも２つのアミノ酸を含む部分を含むＬ１およびＬ３のうちのただ１つが存在する。
一種類のリンカーでは、ｐおよびｒはともに０である。
さらなる種類のリンカーでは、ｐは１であり、ｒは０である。
一種類のリンカーでは、ｐおよびｒはともに１である。
複数の実施形態では、Ｌ１は、結合、−ＣＯＮＨ−または−ＣＯＯ−である。特定の化合物では、Ｌ１は結合である。特定の他の化合物では、Ｌ１は−ＣＯＮＨ−である。
一種の化合物では、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｕ−（式中、ｕは１〜１０、例えば１、２、３、４、５または６である）である。別の種類の化合物では、Ｌ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（ｓはたいてい１〜７）である。異なる種類の化合物では、Ｌ２は、１〜１０個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有しかつ非置換であるかまたは１、２、３、４、５または６個のスルホ基、例えば１〜４個のスルホ基で置換された、アルキレンである。この段落で言及するすべてのＬ２部分について、Ｌ１は、特定の種類の化合物では、−ＣＯＮＨ−である。この段落で言及するすべてのＬ２部分およびこの段落で言及するすべての−Ｌ１−Ｌ２−の組合せでは、ｒは、一種の化合物では、０である。
複数の実施形態では、（ｒ＋ｔ）は１〜３０、例えば１〜１０（例えば１、２、３、４、５または６など）の場合のように１〜２０である。
例示的なリンカーとして、（例えば、アルキルとカルボキシ基またはカルボキシ基のエステル、または他の反応基との間の）共有単結合；（例えば、実施例１０７に図示するような、アルキル基を結合された親油性部分に連結する）アミノカルボニル；（例えば、実施例１０８に図示するような、アルキル基をＮＨＳ−エステルまたは他の反応基に連結する）ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−部分；（例えば、実施例１０９または実施例１１０に図示するような、アルキル基をＮＨＳ−エステル、アミンまたは他の反応基に連結する）アルキルアミノカルボニル基；（例えば、実施例１２３に図示するように、アルキル基をＮＨＳ−エステルもしくは他の反応基または親油性基に連結する）スルホを含むペンダント基、例えばペンダントスルホアルキル基を有するアルキルアミノカルボニル基；あるいはアルキル基を反応基（カルボキシ基またはそのエステル）に連結する共有単結合（実施例１２６に図示されるが、この場合、カルボキシ基はＡｃＯＨＣ２Ｂｒと反応し、ＡｃＯＣＨ２Ｂｒの残基に結合したカルボキシ基の残基を含むリンカーＬＲを形成する）が言及されてよい。
「患者」「被験者」または「個体」とは哺乳動物を指し、これにはヒトおよび非ヒトの哺乳動物（サル、イヌ、ネコ、ポケットペット、ウマ、ウシ、ブタまたはラットなど）が含まれる。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、あらゆる長さのアミノ酸残渣のポリマーを包含するように、包括的な意味で本願明細書において使用される。用語「ペプチド」は、本願明細書において、２５０未満のアミノ酸残基、典型的には１００未満のアミノ酸残基を有するポリペプチドを指すために使用される。この用語は、１つまたは複数アミノ酸残基が天然に存在する対応するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。
本願明細書で使用する場合、用語「反応基」（または「Ｒｘ」）とは、適切な反応条件下で別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち共有結合形成反応性であり、かつ一般に別の物質への結合点を表す基を指す。この反応基は、異なる化合物上の官能基と化学反応して共有結合を形成することができる、本発明の化合物上の部分（カルボン酸またはスクシンイミジルエステルなど）である。反応基には、一般に求核剤、求電子剤および光活性化可能な基が含まれる。
反応基の例としては、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ナイトレン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、サルファイト、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が挙げられるが、これらに限定されない。反応性官能基としては、バイオコンジュゲートを調製するために使用されるもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなども挙げられる。これらの官能基の各々を調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、特定の目的のためにそれらを適用することまたは修正することは、当業者の能力の範囲内である（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照）。
「塩」とは、化合物の許容できる塩を指す。この塩は、当該技術分野で周知の様々な有機および無機の対イオンから誘導され、かつ例としてのみであるが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムが挙げられる。この分子が塩基性官能性を含む場合、有機酸または無機酸の塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、およびシュウ酸塩）が挙げられる。
本願明細書で使用する場合の用語「試料」とは、注目する検体または細胞を含有しているかも知れない任意の物質を指す。典型的には、この試料は、生細胞または内在性宿主細胞を含む生体液である。あるいは、この試料は、緩衝液またはｐＨ測定が必要とされる環境試料であってよい。この試料は、水溶液中、生存細胞培養液中にあってもよく、固体もしくは半固体の表面（ポリアクリルアミドゲル、膜ブロットなど）またはマイクロアレイに固定化されていてもよい。
本願明細書で使用する場合、用語「固体支持体」とは、液体相に実質的に不溶であり、かつ注目する分子または粒子を結合することができるマトリクスまたは培地を指す。本発明の固体支持体には半固体支持体も含まれるが、特定の種類の支持体には限定されない。有用な固体支持体としては、エアロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コーティングされたバイオチップを含む）、微小流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレートまたはマイクロプレートとも呼ばれる）、膜、導電性金属および非導電性金属、ガラス（顕微鏡用スライドを含む）ならびに磁気支持体などの固体ならびに半固体マトリクスが挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖（セファロースなど）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。
「立体異性体」とは、１つまたは複数の立体中心のキラリティが異なる化合物を指す。立体異性体としては、鏡像異性体およびジアステレオマーが挙げられる。
「互変異性体」とは、エノール−ケト互変異性体およびイミン−エナミン互変異性体、または環−ＮＨ−部分および環＝Ｎ−部分の両方に結合した環原子を含むヘテロアリール基（ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾールなど）の互変異性体など、プロトンの位置が異なる化合物の代替形を指す。
患者の疾患を「治療すること」またはその「治療」とは、１）その疾患が、その疾患に罹患しやすいか、またはその疾患の症状をまだ示していない患者において発生を予防すること；２）その疾患を阻害すること、またはその発症を止めること；または３）その疾患を改善することまたはその疾患を退行させることを指す。
本発明の化合物
全体的に、本発明の理解を容易にするために、ｐＨ感受性化合物および対応する置換基が、最初に詳細に記載され、続いてその化合物が使用される多くの様々な方法が記載され、続いて本発明の方法とともに使用するのが特に有利である、特定の新規化合物を使用および合成する方法の例が記載される。
本発明の化合物は、試料中のｐＨをモニターすることに有用性を見出す。例えば、本発明者らは、電子供与性基（ＥＤＧ）を蛍光発生性ｐＨ感受性化合物の４−アミノ−２−ヒドロキシフェニル環に導入することによって、その化合物（式Ｉを参照）の蛍光性特性を調整できることを見出した。特に、本発明者らは、ｐＫａ値を調整して、生細胞の細胞内での応用に適合するｐＫａ値を有するｐＨ感受性化合物を得ることができた。本発明者らは、ヒドロキシルをアルコキシ部分で置き換えることで、水系環境における化合物の安定性が高まるだけでなく、ｐＨ感受性である化合物が得られることを見出した。これは、Ｓｍｉｔｈらによる教示（前出）を考慮すると、予想外の利点である。
好ましくは、ｐＫａ値は約６−７である。式Ｉの化合物などのアニリン部分のアミノ基のｐＫａは、酸素原子上の孤立電子対を芳香族系が共有できる能力に依存する。この能力は、その芳香族系に導入されるさらなる官能基によって影響され、このため、このｐＫａは、電子豊富なアニリン部分を含むｐＨ感受性色素にＥＤＧ基を付加することにより調整される。
この試料としては、生細胞または内在性宿主細胞タンパク質を含む生体液、緩衝液および環境試料が挙げられる。それゆえ、本発明の化合物は、フルオロフォアを含む場合、ｐＨ変化およびｐＨの変化に直接または間接的に関連する事象をモニターする上での有用性を見出す。ｐＨのモニタリングは、生細胞においてもなすことができる。この場合は、本発明の化合物は、受動的機構および細胞媒介性機構の両方を含めた多くの異なる機構を通して生細胞によって内部移行される。例えば、本発明のｐＨ感受性化合物は、生細胞膜を横切って侵入することを可能にするＡＭ（アセトキシメトキシ）または酢酸エステルなどの親油性基を含むことができる。ひとたび細胞内部で非特異的エステラーゼがＡＭまたは酢酸エステルを開裂すると、細胞に十分保持される電荷を帯びた分子が生成される。あるいは、本発明の化合物は、上記化合物が生細胞によって取り込まれるようにする担体分子に結合されていてもよい。例としては、食作用の間の内部移行（この場合、上記化合物は、マクロファージまたは単球による食作用を誘導する細菌粒子または他のタンパク質（もしくはペプチド）に結合される）、あるいは本発明の化合物が、受容体を結合し、かつ内部移行を誘導する担体分子に結合されている場合には、受容体内部移行を介した取り込みなどが挙げられる。
アニリン部分
本発明の化合物のｐＨを感受する、または電子豊富なアニリン部分は、プロトン化された場合に、蛍光性である化合物を生成するあらゆる部分であるが、その化合物は、このアニリン部分がプロトン化された状態にない場合は消光されている。このアニリン部分は、たいてい、約２−１０、例えば３−１０の範囲のｐＫａ値を有する。特定の態様では、この化合物のｐＫａは、約５〜約８である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６〜約８である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６〜約７である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６．５である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約３〜約１０である。好ましくは、本発明の化合物のｐＫａは約６〜７である。
このｐＫａを約６−７に調製するために、電子供与性基（ＥＤＧ）が、アリール基上のアニリン部分に導入された。これは、−ＯＨまたは−ＳＨが存在しない場合にアリール上のアルコキシなどの置換基の存在と組み合わさって、水系環境で安定でかつ所望の範囲のｐＫａを提供するｐＨ感受性色素を、予想外にもたらした。本願明細書中の式に開示されるように、かつそれらを参照して、このアニリン部分のアミノ基は、より高いｐＫａをもつ別の塩基性部分により代用または置換されていてもよい。
このように、本発明の一実施形態は、Ｒ１およびＲ２がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする、以下の式Ａの化合物を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１−Ｒ６は、水素または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
Ｘは、フルオロフォアであるか、あるいは
Ｒ１およびＲ３−Ｒ６は水素または電子吸引性基以外の置換基であり、かつＸおよびＲ２は一緒に、位置ＸとＲ２との間で式Ａのベンゼン環に縮合した５員または６員の複素環式環を含む部分を形成する。
Ｒ１−Ｒ６の正確な同一性は重要ではない。適切に、それらはＨおよび電子供与性基から選択されてよい。当然、当業者は、実際的な優れた感覚を使って、上記化合物の所望の用途に適合する部分を選択するであろう。
複数の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のいずれも、ヒドロキシルでも、チオールでも、またそれらのいずれの脱プロトン化形態でもない。
一種の化合物では、Ｒ１−Ｒ６は、
水素、
ヒドロカルビル、または−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって遮られたヒドロカルビル；またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６について言えば、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介して式Ａのベンゼン環に結合され、かつ−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって任意で遮られたヒドロカルビル
から選択され、このヒドロカルビルは非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、かつ
ヒドロカルビルは１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、
Ｒｂは、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、または−Ｏ−結合を介して隣接するＮに結合されかつ／または１つまたは複数の−Ｏ−結合によって遮られたＣ１−Ｃ６ヒドロカルビルであり、このヒドロカルビルは、非置換であるか、または−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、
−Ｌは、共有単結合であるリンカー、または一連の安定な共有結合を含みかつＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される多価の原子（例えば、１〜４０個のかかる原子）を組み込む部分であり、
−Ｒｘは反応基であり、
−ＬＲは、−ＬをＳｃに結合している反応基の残基を任意でさらに含むリンカー−Ｌであり、
−Ｓｃは結合された物質である。
これまでに定義したように、結合された物質は、本願明細書に記載する担体分子または固体支持体である。
下位種類では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つはＨではなく、例えばそれらのうちの２つはＨではない。
特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のヒドロカルビルは、アルキルおよびアルケニルから選択され、より具体的には、ヒドロカルビルは、アルキルであり、それは非置換であってもよく、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されていてもよい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ６がヒドロカルビル、例えばアルキルを含む場合、それは特にエチルまたはメチルであり、とりわけメチルである。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ６がヒドロカルビルを含む場合、それはたいていアルコキシまたはジアルキルアミノであり、このアルキルは例えばエチルまたはメチルであり、特にメチルであり、かかる基は非置換であってもよいが、ある特定の実施形態では、それらの少なくとも１つ、および通常は正確にそれらのうちの１つが−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されている。
一種類の本発明の化合物は、ジアルキルアミノ基を有し、このジアルキルアミノ基の２つのアルキル部分は、同じであってもよく、異なっていてもよく、例えば同じである。この種類の化合物の下位種類のうちの１つでは、１つのアルキル部分は−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されている。
一実施形態では、Ｒ１およびＲ３は例えば前の２つの段落に記載したヒドロカルビル含有基であるが、一方、Ｒ２およびＲ６はヒドロカルビル含有基ではなく、多くの実施形態では、ともに水素である。
Ｒｂは、典型的には、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するヒドロカルビルから選択され、特にアルキルおよびアルケニルから選択され、最も特定すればアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂとしてのヒドロカルビルは、−Ｏ−結合によって遮断されているが、他の実施形態では、遮断されていない。従って、Ｒｂは、特にアルキルである。Ｒｂがヒドロカルビル、例えばアルキルである場合、それは非置換であってもよく、あるいはそれは−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されていてもよい。
Ｒｂは、最も多くの場合、アルキル基、例えばメチルまたはエチルであり、特にメチルである。このアルキル基は、最も多くの場合、非置換である。
特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはアルコキシ、または−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されたアルコキシであり、このアルコキシは１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する。多くの場合、Ｒ１は、前の文章に記載したとおりであるが、Ｒ２はそうではなく、例えば、Ｒ２はＨ、またはそれほど多くはないがアルキル（例えば、メチルまたはエチルなど）である。
Ｒ１、ならびにＲ２、Ｒ３およびＲ６のうちの１つ、２つまたは３つ（例えばそれらのうちの１つ）が−Ｏ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介してベンゼンに結合されたヒドロカルビルであり、このヒドロカルビルが、−Ｏ−および−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって遮断されていないかまたは遮断されており、かつ非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−Ｌ−Ｓｃによって置換されており、このＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６の前記のものが互いに同じであるかまたは異なる、一種類の化合物が包含される。この種類の化合物では、ヒドロカルビルおよびＲｂは典型的には、アルキル、例えばメチルまたはエチル、例えばメチルである。いくつかの化合物では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つ、および通常はそれらのうちの正確に１つは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、通常、Ｒｂは（それが存在する場合）ヒドロカルビルであり、すべてのヒドロカルビルは、特にアルキルであるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のヒドロカルビルのうちのただ１つは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されている。他の化合物では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のいずれも−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されておらず、通常、これらの化合物では、Ｒｂは（それが存在する場合）ヒドロカルビルであり、すべてのヒドロカルビルは、特にアルキルであり、例えばメチルまたはエチル、特にメチルである。
一実施形態では、Ｒ１およびＲ３はこの前の段落で定義されたとおりであるが、Ｒ２およびＲ６はこの前の段落で定義されたとおりではなく、多くの実施形態では、両方とも水素である。
Ｒ４およびＲ５は、同じであってもよく、異なっていてもよい。通常、それらはともに、非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されたヒドロカルビルである。ヒドロカルビルは、典型的にはアルキルおよびアルケニルから選択され、最も多くの場合、それはアルキル、例えばメチル、エチルまたはｎ−プロピルである。ヒドロカルビルは、−Ｏ−結合、例えば正確に１つのかかる結合によって遮断されていてもよく、より多くの場合、それは遮断されていない。Ｒ４およびＲ５がヒドロカルビルである一種の化合物では、Ｒ４およびＲ５のうちの正確に１つは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されているが、他方は非置換であり、これらの化合物では、Ｒ４およびＲ５は、通常、アルキルまたはアルケニルであり、この段落ですでに触れたように、例えばアルキルである。
本発明は、すべての上記ヒドロカルビル部分がいずれの場合も１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル、特にアルキルである一種類の化合物を包含する。
一実施形態では、本発明の化合物は、１つの−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃ基を有する。別の実施形態では、その化合物は複数のかかる基、例えばそれらの２つまたは３つを含み、かかる基は互いに同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。一実施形態では、この化合物は正確に１つの−Ｌ−Ｒｘ基を有し、他の実施形態では、それらは正確に１つの−ＬＲ−Ｓｃ基を有する。それらは、２つの−Ｌ−Ｒｘ基または２つの−ＬＲ−Ｓｃ基、または各々のうちの１つを有してもよい。
多くの化合物では、いずれの−Ｌ−Ｒｘ基も−ＬＲ−Ｓｃ基も専らＲ４および／またはＲ５に含まれ、多くの場合、Ｒ４およびＲ５のうちの正確に１つのは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含む。ある場合には、Ｒ４およびＲ５はともに−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含む。
いくつかの化合物では、いずれの−Ｌ−Ｒｘ基も−ＬＲ−Ｓｃ基も、専らＲ１、Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ６に含まれ、この場合には、しばしばこれらの基の正確に１つ、例えばＲ３およびＲ６のうちの１つは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含む。例えば、Ｒ１はＨ以外の部分（例えばアルコキシまたはジアルキルアミン）であってよく、Ｒ３は−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含んでいてよく、例えばかかる基によって置換されたアルキルであってよく、Ｒ２およびＲ６はともにＨである。
Ｒ４およびＲ５のうちの１つまたは２つ、例えばそれらのうちの正確に１つは、−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つ、例えばそれらのうちの正確に１つ、例えばＲ３も−Ｌ−Ｒｘまたは−ＬＲ−Ｓｃを含む化合物がこれに包含される。
一実施形態の化合物は、キサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンであるＸを含む。他の実施形態の化合物は、式ＩＩ；式ＩＩＩ；式ＩＶ、式Ｖ；または式ＶＩの化合物のフルオロフォア、例えば式ＩＩの化合物のフルオロフォアであるＸを有する。
本発明はまた、以下の式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を包含する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、反応基、担体分子、固体支持体、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、固体支持体、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘはフルオロフォアであり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
複数の実施形態では、より特定すると、ＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。さらにより特定すると、Ｒ１はヒドロキシでもチオールでもない。Ｒ１にヒドロキシルまたはチオール（およびそれらの電荷を帯びた種）が存在しないことで、特にアルコキシ基で置き換えた場合に、本発明の化合物の安定性が高まる。
別の実施形態では、Ｒ１−Ｒ５は、ＡＭ（アセトキシメトキシ）エステルなどの親油性基であってもよい。
本発明は、一部は、アニリン基にＥＤＧを付加することに基づいており、本発明のこの部分を構成する特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つはＥＤＧである必要があり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つはＺである必要がある。好ましくは、Ｚはフルオロフォアのオルトにあり、それはヒドロキシルまたはチオールであることは許されない。Ｒ１にヒドロキシまたはチオール（およびそれらの電荷を帯びた種）が存在しないことで、特にアルコキシ基で置き換えた場合に、本発明の化合物の安定性が高まる。好ましいＺ基は、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）または−Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２であり、このアルキル部分は、アミノ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシまたはハロゲンによってさらに置換されていてもよい。
本発明の特定の種類の分子のｐＨ指示薬としての機能は、以下のスキーム２に示される。
Figure 2015017094
このＥＤＧは、典型的にはＲ３にあるが、このアリール基上の任意の位置にあってもよい。本発明の電子供与性基としては、例えば、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシが挙げられる。好ましいＥＤＧは、−ＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、および−Ｎ（ＣＨ３）２である。
そのより特定の実施形態では、ＺはＯ−アルキルである。
そのより特定の実施形態では、ＺはＮである。さらにより特定すれば、ＲｂはＨである。より特定すれば、Ｒｃはアルキルである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ１は−ＯＣＨ３である。
そのより特定された実施形態では、Ｒ２およびＲ６はＨである。
別のより特定された実施形態では、上記ＥＤＧは、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される。１つの下位種類では、ＥＤＧはヒドロキシでもチオールでもない。
特定の実施形態では、ＺがＲ１に存在し、かつ少なくとも１つのさらなるＥＤＧが存在する。
一種類の化合物は、アルコキシであるＲ１置換基を有する。いくつかの他の化合物では、Ｒ１は置換されたアルコキシである。
別のより特定された実施形態では、Ｒ１およびＲ３は−ＯＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２である。
別のより特定された実施形態では、上記ＥＤＧは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。
別のより特定された実施形態では、Ｒ４およびＲ５はアルキルまたは置換されたアルキルである。そのより特定された実施形態では、Ｒ５は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、式中、ｎは０、１、２、３、４または５であり、ｍは０、１、２または３である。さらにより特定すれば、Ｒ５は−（ＣＨ２）３−ＣＯ２ＣＨ３である。
その別の実施形態では、Ｒ４はエチルである。
別の実施形態では、Ｒ４はＨであるか、または存在しない。その別の実施形態では、Ｒ５はＺである。より特定すれば、Ｚは＝ＣＨ（置換されたアミノ）である。より特定すれば、Ｚは＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）２である。
別の実施形態では、Ｒ５は、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（置換されたアルキル）、または−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（アルキル）２である。強い有機塩基であることが公知であるアミジン（または関連するグアニジン）基（Ｏｓｚｃｚａｐｏｗｉｃｚ，Ｊ．；Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋａ−Ｍａｎａｊ，Ｊ．；Ｇｏｌｉｍｏｗｓｋａ，Ｋ． Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．２，２０００，２３４３−２３４６）は、ｐＫａが高められるべき場合に、さらなるｐＫａ向上基の存在を必要としないという利点をもたらす。
上述の実施形態のうちのいずれかの別のより特定された実施形態では、この化合物のｐＫａは約５〜約８である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６〜約８である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６〜約７である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約６．５である。別の実施形態では、この化合物のｐＫａは約３〜約１０である。
本発明の化合物のアニリンまたはアニリン様環の４位の窒素は、当然、常に許容できる原子価を有する。
本発明の別の実施形態では、上記アニリン部分は、フルオロフォアＸでもあり、以下の式ＶＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩である。
Figure 2015017094
式中、
Ａは５員または６員の芳香族複素環であり、
Ｒａは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
ｎは０、１、２、または３である。
より特定された実施形態では、Ａは、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、およびイソオキサゾリルからなる群から選択される５員環である。さらにより特定すれば、Ａはフラニルである。
別のより特定された実施形態では、Ａは、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニルおよびピリダジニルからなる群から選択される６員環である。
別のより特定された実施形態では、Ａはフラニルであり、ｎは１であり、かつＲａは置換されたヘテロアリール基である。そのより特定された実施形態では、その置換されたヘテロアリール基はオキサゾールである。さらにより特定すれば、そのオキサゾールは、カルボキシル基で置換されている。
フルオロフォア
本発明のフルオロフォアは、ｐＨの変化の結果として検出可能な信号を、直接または間接的に、その試料に送るためのレポーター分子として機能する。これによって、試料中のｐＨ変化を測定しモニターして、直接または間接的にｐＨの変化に関連する具体的な事象を検出する能力がもたらされる。
この検出可能な反応が蛍光反応である場合、典型的には、それは蛍光の変化（強度、励起波長または発光波長、蛍光の分布、蛍光寿命、蛍光偏光、またはこれらの組合せなど）である。好ましくは、プロトン化の際の検出可能な光学的反応は、アニリン部分の窒素がプロトン化されていない同じ化合物と比べておよそ１５０％大きい蛍光強度の変化であり、より好ましくは５倍大きく、もっとも好ましくは１０倍大きい。
本発明のフルオロフォアは、当業者に公知の任意のフルオロフォアでよい。本発明のｐＨ感受性化合物への導入に適しているかも知れない様々なフルオロフォアが、すでに当該技術分野で公知である（ＲＩＣＨＡＲＤ Ｐ． ＨＡＵＧＬＡＮＤ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ（２００２））。アニリン部分の窒素がプロトン化されるまでは、このフルオロフォアは、消光されているか、または実質的に非蛍光性であることが好ましい。
本発明の蛍光性色素は、２８０ｎｍより長波長で吸収極大を示し、かつ本発明の電子豊富なアニリン部分に共有結合されている場合に，本発明の蛍光発生性ｐＨ感受性化合物を形成する、任意の化学部分である。本発明の色素としては、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンゾインドール、オキサゾールもしくはベンゾオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７，２７５号、同第０９／９６８，４０１号および同第０９／９６９，８５３号ならびに米国特許第６，４０３，８０７号、同第６，３４８，５９９号、同第５，４８６，６１６号、同第５，２６８，４８６号、同第５，５６９，５８７号、同第５，５６９，７６６号、同第５，６２７，０２７号、および同第６，０４８，９８２号の任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ）、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４，７７４，３３９号、同第５，１８７，２８８号、同第５，２４８，７８２号、同第５，２７４，１１３号、および同第５，４３３，８９６号に開示される任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号、同第６，１３０，１０１号、同第６，２２９，０５５号、同第６，３３９，３９２号、同第５，４５１，３４３号および米国特許出願第０９／９２２，３３３号に開示される任意の対応する化合物を含む）、オキサジンもしくはベンゾオキサジン、カルバジン（ｃａｒｂａｚｉｎｅ）（米国特許第４，８１０，６３６号に開示される任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号、同第５，４５９，２７６号、同第５，５０１，９８０号、および同第５，８３０，９１２号に開示される任意の対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号、および同第４，８４９，３６２号に開示される任意の対応する化合物を含む）およびベンゾフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号に開示される任意の対応する化合物を含む）ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書で使用する場合、オキサジンには、レソルフィン（５，２４２，８０５に開示される任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
この色素がキサンテンである場合、この色素は、必要に応じて、フルオレセイン、ロドール（米国特許第５，２２７，４８７号および同第５，４４２，０４５号に開示される任意の対応する化合物を含む）、ロサミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）またはローダミン（米国特許第５，７９８，２７６号、同第５，８４６，７３７号、同第５，８４７，１６２号、同第６，０１７，７１２号、同第６，０２５，５０５号、同第６，０８０，８５２号、同第６，７１６，９７９号および同第６，５６２，６３２号の任意の対応する化合物を含む）である。本願明細書で使用する場合、フルオレセインには、ベンゾフルオレセインもしくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、またはナフトフルオレセインが含まれる。同様に、本願明細書で使用する場合、ロドールには、セミナフトロダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）（米国特許第４，９４５，１７１号に開示される任意の対応する化合物を含む）が含まれる。フッ素化キサンテン色素は、特に有用な蛍光特性を有するものとしてこれまでに記載されている（国際公開公報第９７／３９０６４号および米国特許第６，１６２，９３１号）。
本発明の好ましい色素としては、キサンテン、ボラポリアザインダセン、およびインドールならびにこれらの誘導体が挙げられる。好ましいキサンテンはフルオレセイン、ローダミンおよびこれらの誘導体である。
一態様では、このフルオロフォアは、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当該技術分野で公知の発色団もしくはフルオロフォ上に典型的に存在する他の置換基を含むがこれらに限定されない様々な置換基によって、１回または複数回以上任意で置換された１つまたは複数の芳香族環または芳香族複素環を含有する。一態様では、このフルオロフォアは、１つまたは複数のジュロイジン（ｊｕｌｏｉｄｉｎｅ）環を含むキサンテンである。
例示的な実施形態では、上記色素は、水素、ハロゲン、アミノ、置換されたアミノ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アルコキシ、スルホ、反応基、固体支持体および担体分子からなる群から選択される置換基によって独立に置換されている。別の実施形態では、本発明のキサンテン色素は、キサンテンの中心の環の炭素原子上で、キサンテン系色素に典型的に見出される置換基（フェニルおよび置換されたフェニル部分など）によって置換されている化合物および非置換の化合物の両方を含む。最も好ましい色素は、ローダミン、フルオレセイン、ボラポリアザインダセン、インドールおよひこれらの誘導体である。このアニリン部分に結合したフルオロフォアの選択が、ｐＨ感受性化合物の吸収および蛍光発光特性、ならびにその生細胞特性、すなわち細胞内に局在する能力を決定するであろう。
選択されたスルホン化レポーター部分は有利な特性をも示し、それにはスルホン化ピレン、クマリン、カルボシアニン、およびキサンテン（米国特許第５，１３２，４３２号、同第５，６９６，１５７号、同第５，２６８，４８６号、および同第６，１３０，１０１号に記載されるもの）などが含まれる。スルホン化ピレンおよびクマリンは、典型的には、約４５０ｎｍより短波長で励起される（米国特許第５，１３２，４３２号および同第５，６９６，１５７号）。
一実施形態では、このフルオロフォアは、本発明のリンカーを介してアニリン部分に結合されている。このフルオロフォア（および反応基、担体分子、および固体支持体）は、置換基を本発明の化合物のアニリン部分に共有結合させるのに使用されるリンカーを含む。このフルオロフォア（および固体支持体、担体分子または反応基）は、その部分に直接結合されていてもよく（リンカーが単結合である場合）、一連の安定な結合を介して結合されていてもよい。好ましくは、このフルオロフォアは、共有単結合によってアニリン部分に直接結合されるが、反応基、担体分子、および固体支持体に後述するリンカーを介して結合されていてもよい。リンカーが一連の安定な共有結合である場合、そのリンカーは、典型的には、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１−３０個の非水素原子を組込む。リンカーが共有単結合ではない場合、このリンカーは、任意で単結合、二重結合、三重結合または芳香族炭素−炭素結合、ならびに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、硫黄−硫黄結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、および窒素−白金結合を含めた安定な化学結合の任意の組合せであってよい。典型的には、このリンカーは、１５未満の非水素原子を組込み、エーテル、チオエーテル、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合および芳香族または複素環式芳香族結合の任意の組合せで構成される。典型的には、このリンカーは、炭素−炭素単結合およびカルボキサミド、スルホンアミドまたはチオエーテル結合の組合せである。リンカーの結合によって、典型的には、リンカーに見出すことができる部分、すなわちエーテル、チオエーテル、カルボキサミド、チオ尿素、スルホンアミド、尿素、ウレタン、ヒドラジン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルキルおよびアミン部分を生成する。リンカーの例としては、置換または非置換のポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキル、またはアリールチオが挙げられる。
一実施形態では、このリンカーは１−６個の炭素原子を含有し、別の実施形態では、このリンカーはチオエーテル結合を含む。連結メンバーの例としては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などを含む部分が挙げられる。別の実施形態では、リンカーは、式−（ＣＨ２）ｄ（ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｅ）ｚ−（式中、ｄは０−５の整数であり、ｅは１−５の整数であり、ｚは０または１である）であるか、またはこれを組込む。さらなる実施形態では、このリンカーは式−Ｏ−（ＣＨ２）−であるか、またはこれを組込む。さらに別の実施形態では、このリンカーは、フェニレンもしくは２−カルボキシ置換フェニレンであるか、またはこれらを組込む。
担体分子、固体支持体または反応基および本発明の化合物を一緒に結合するのに、リンカーの任意の組合せが使用されてよい。このリンカーは、フルオロフォアまたはアニリン部分の物理的特性（その色素のスペクトル特性など）を変えるために置換されていてもよい。
このリンカーの別の重要な特徴は、担体分子、反応基または固体支持体とアニリン部分またはフルオロフォアとの間に十分な空間を提供して、立体障害を防いでいることである。それゆえ、本発明の化合物のリンカーは、（１）担体分子、反応基または固体支持体を上記化合物に結合し、フルオロフォアをアニリン部分に結合するため、（２）担体分子、反応基または固体支持体と上記化合物との間に十分な空間を提供して、この化合物の作用を立体的に妨害しないようにするため、ならびに（３）本発明の化合物の物理的特性を変えるために重要である。
一実施形態では、このフルオロフォアは、キサンテン、インドールおよびボラポリアザインダシンからなる群から選択され、これらのフルオロフォアは、水系媒体中で高量子収率を有する。
１つの特定の態様では、フルオロフォアＸは、
Figure 2015017094
であり、
式中、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつ／またはＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成する。
そのより特定された実施形態では、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はアルキルである。さらにより特定すれば、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はメチルである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はＨである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、この縮合環は以下の構造を有する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ２７およびＲ２８は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３ −、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
別の実施形態では、フルオロフォアＸは、
Figure 2015017094
であり、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
そのより特定された実施形態では、Ｒ１６およびＲ１９はＨである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ２０はメチルである。
別の実施形態では、フルオロフォアＸは、
Figure 2015017094
であり、
Ｒ２１は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
そのより特定された実施形態では、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６はＨである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ２３はカルボキシルエステルである。
そのより特定された実施形態では、Ｒ２３は−ＣＯ２ＣＨ３である。
本発明の特定の実施形態では、そのｐＨ感受性化合物は、以下の式ＩＩ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を有する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１−Ｒ１４は上に記載したとおりである。
特定の実施形態では、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はアルキルであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はＨであり、ＺはＯ−アルキルである。Ｒ１は−ＯＣＨ３であり、Ｒ２およびＲ６はＨであり、かつＲ４およびＲ５はアルキルまたは置換されたアルキルである。そのより特定された実施形態では、Ｒ５は、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、式中、ｎは０、１、２、３、４または５であり、かつｍは０、１、２または３である。さらにより特定すれば、Ｒ５は−（ＣＨ２）３−ＣＯ２ＣＨ３である。
別の実施形態では、Ｒ４はＨであるか、または存在しない。その別の実施形態では、Ｒ５はＺである。より特定すれば、Ｚは＝ＣＨ（置換されたアミノ）である。より特定すれば、Ｚは＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）２である。
別の実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（置換されたアルキル）、または−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（アルキル）２である。
本発明の別の実施形態は、以下の式ＩＩＩの化合物を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ３は電子供与性基（ＥＤＧ）であり、かつ
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、および＝ＣＨ（置換されたアルキル）からなる群から選択されるが、ただしこの結合した窒素は許容できる原子価を有する。
式ＩＩＩの構造の別の別個の実施形態では、Ｒ３はＨ、Ｚまたは電子供与性基（ＥＤＧ）であり、Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつＲｄはアミノまたは置換されたアミノである。
別のより特定された実施形態では、上記ＥＤＧは、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される。
別のより特定された実施形態では、Ｒ３は−ＯＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２である。
別のより特定された実施形態では、上記ＥＤＧは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。
別のより特定された実施形態では、Ｒ４およびＲ５はアルキルまたは置換されたアルキルである。そのより特定された実施形態では、Ｒ５は、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、式中、ｎは０、１、２、３、４または５であり、かつｍは０、１、２または３である。さらにより特定すれば、Ｒ５は−（ＣＨ２）３−ＣＯ２ＣＨ３である。
その別の実施形態では、Ｒ４はエチルである。
別の実施形態では、Ｒ５は＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、または＝ＣＨ（置換されたアルキル）である。
別の実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（置換されたアルキル）、または−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（アルキル）２である。
本発明の別の実施形態は、以下の式ＩＶの化合物を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１−Ｒ６およびＲ１５−Ｒ２０は、上に記載したとおりである。
本発明の別の実施形態は、以下の式Ｖの化合物を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１−Ｒ６およびＲ２１−Ｒ２６は上に記載したとおりである。
ＶＩ
本発明の別の実施形態は、以下の式ＶＩＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩を提供する。
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
Ｒａ１およびＲａ２は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
別のより特定された実施形態では、Ｒａ２は置換されたヘテロアリール基である。そのより特定された実施形態では、この置換されたヘテロアリール基はオキサゾールである。さらにより特定すれば、このオキサゾールはカルボキシル基で置換されている。
別のより特定された実施形態では、Ｒａ１はＨである。
前述のもののいずれかの別の実施形態では、上記化合物（特に、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩ、または式ＶＩＩの化合物）は、蛍光発生性ｐＨ感受性色素である。
反応基
本発明の別の例示的な実施形態では、本発明の化合物は、化学的に反応性であり、少なくとも１つ反応基によって置換されている、この反応基は、別の部分（担体分子または固体支持体など）のための結合部位として機能し、この反応基は、担体分子または固体支持体上の適切な反応基または官能基と化学的に反応する。このように、本発明の別の態様では、上記化合物は、アニリン部分、リンカー、フルオロフォア、反応基部分ならびに必要に応じて担体分子および／または固体支持体を含む。
例示的な実施形態では，本発明の化合物は、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、カルボン酸エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、無水物、アニリン、アミン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロン酸エステル、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロアルキル、ハロトリアジン、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、光活性化可能な基、反応性白金錯体、シリルハライド、スルホニルハライド、およびチオールから選択されるメンバーである反応基をさらに含む。特定の実施形態では、この反応基は、カルボン酸、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ヒドラジド、アミンおよびマレイミドからなる群から選択される。反応基は、レポーター分子またはアニリン部分上の任意の適切な部位に結合されていてよい。例示的な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６から選択される少なくとも１つのメンバーは反応基である。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの少なくとも１つは反応基であり、Ｒ４またはＲ５のうちの少なくとも１つが最も好ましい。あるいは、本発明の化合物が担体分子または固体支持体を含む場合、反応基は独立にそれらの置換基に共有結合されて、フルオロフォア、担体分子または固体支持体へのさらなる結合を可能にしてもよい。
これらの反応基は、本発明の化合物、ならびに担体分子および固体支持体含有化合物の形成中に合成され、化学的に反応性のｐＨ感受性化合物が提供される。このようにして、反応基を組込む化合物を、適切な反応性を有する官能基を含有するか含有するように修飾された様々な担体分子または固体支持体に共有結合させ、その結果この構成要素を化学的に結合させることができる。例示的な実施形態では、本発明の化合物の反応基、および担体分子または固体支持体の官能基は、それらの間に共有結合を生成することができる求電子剤および求核剤を含む。あるいは、この反応基は、適切な波長の光で照射した後にのみ化学的に反応性となる光活性化可能な基を含む。典型的には、反応基と担体分子または固体支持体との間の結合反応により、その反応基の１つまたは複数の原子が、本発明の化合物をその担体分子または固体支持体に結合させる新しい結合に組込まれる。求電子基および求核性基の反応により共有結合を与える官能基および結合の選別された例が表１に示されている。
（表１）有用な共有結合へのいくつかの経路の例
Figure 2015017094
Figure 2015017094
Figure 2015017094
＊当該技術分野で理解されるように、活性化エステルは、一般に式−ＣＯΩ（式中、Ωは優れた脱離基（例えば、スクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、−１−オキシベンゾトリアゾリル（−ＯＣ６Ｈ４Ｎ３）；あるいはアリールオキシ基、または活性化アリールエステルを形成するために使用される電子吸引性置換基（ニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、もしくはトリフルオロメチル、またはこれらの組合せなど）によって１回または複数回置換されたアリールオキシ；あるいはカルボジイミドによって活性化され無水物または混合無水物−ＯＣＯＲｘもしくは−ＯＣＮＲｘＮＨＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは同じであってもよく、また異なっていてもよく、これらはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、またはＣ１−Ｃ６アルコキシ；またはシクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、またはＮ−モルホリノエチルである）を形成するカルボン酸）を有する。
＊＊アシルアジドもまた、イソシアネートに転位することができる。
本発明の化合物を結合されるべき物質に結合させるのに使用される反応基の選択は、通常、結合されるべき物質上の反応基または官能基および所望の共有結合の種類または長さに依存する。有機物質または無機物質（生体分子または非生体分子）上に典型的に存在する官能基の種類としては、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、シリルハライド、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一種類の反応性部位が、その物質（典型的には多糖類またはシリカ）上で利用可能かも知れないし、またはタンパク質について典型的であるように、様々な部位（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）が存在してもよい。
典型的には、この反応基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、ケトン、またはシリカと反応するであろう。好ましくは、反応基はアミンもしくはチオール官能基、またはシリカと反応する。一実施形態では、この反応基は、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、シリルハライド、無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロン酸エステル、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、反応性白金錯体、スルホニルハライド、またはチオール基である。「反応性白金錯体」とは、特に、米国特許第５，７１４，３２７号に記載されているような化学的に反応性の白金錯体を意味する。
一態様では、上記化合物は、アミン基と選択的に反応する少なくとも１つ反応基を含む。このアミン反応基は、スクシンイミジルエステル、スルホニルハライド、テトラフルオロフェニルエステルおよびイソチオシアネートからなる群から選択される。このように、一態様では、本発明の化合物は、試料中のアミン含有分子と共有結合を形成する。別の態様では、上記化合物は、チオール基と選択的に反応する少なくとも１つ反応基を含む。このチオール反応基は、マレイミド、ハロアルキルおよびハロアセトアミド（５，３６２，６２８；５，３５２，８０３および５，５７３，９０４に開示される任意の反応基を含む）からなる群から選択される。
反応基がカルボン酸の活性化エステル（カルボン酸のスクシンイミジルエステルなど）、スルホニルハライド、テトラフルオロフェニルエステルまたはイソチオシアネートである場合、生成した化合物は、担体分子（タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンなど）の結合体を調製するために特に有用である。反応基がマレイミド、ハロアルキルまたはハロアセトアミド（５，３６２，６２８；５，３５２，８０３および５，５７３，９０４（前出）に開示される任意の反応基を含む）である場合、生成した化合物は、チオール含有物質に結合するために特に有用である。反応基がヒドラジドである場合、生成した化合物は、過ヨウ素酸で酸化された炭水化物および糖タンパク質に結合するために特に有用であり、加えて、それは細胞マイクロインジェクションのためのアルデヒド固定可能な極性トレーサである。反応基がシリルハライドである場合、生成した化合物は、シリカ表面への結合に有用であり、特に、後で遠隔イオン検出または定量化に使用される光ファイバーのプローブにシリカ表面が組込まれている場合に有用である。
１つの特定の態様では、この反応基は、適切な波長を用いた照射後にのみ反応性の種に変換されるような、光活性化可能な基である。適切な波長は、一般に４００ｎｍ未満のＵＶ波長である。この方法は、溶液中の標的分子、または固体もしくは半固体マトリクス上へ固定化された標的分子のみへの特異的な結合を提供する。光活性化可能な反応基としては、ベンゾフェノン、アリールアジドおよびジアジリンが挙げられるがこれらに限定されない。
好ましくは、この反応基は、光活性化可能な基、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ハロアルキル、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、シリルハライド、カダベリンまたはソラレンである。より好ましくは、この反応基は、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、またはシリルハライドである。特定の実施形態では、この反応基は、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、スルホニルハライド、テトラフルオロフェニルエステル、イソチオシアネートまたはマレイミドである。
担体分子
例示的な実施形態では、本発明の化合物は担体分子に共有結合されている。この化合物が反応基を有する場合、この担体分子は、あるいは、反応基を介してその化合物に結合されていてもよい。この反応基は、反応性官能性部分およびリンカーの両方を含んでいてもよいし、または反応性官能性部分のみを含んでいてもよい。
様々な担体分子が本発明で有用である。担体分子の例としては、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸ポリマー、炭水化物、脂質、ポリマーおよび細菌粒子が挙げられる。例示的な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６から選択される少なくとも１つのメンバーは担体分子である。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの少なくとも１つが担体分子であり、最も好ましくはＲ４またはＲ５のうちの少なくとも１つが担体分子である。
例示的な実施形態では、この担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微小粒子、生物学的細胞、ウイルスおよびこれらの組合せを含む。別の例示的な実施形態では、この担体分子は、ハプテン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、タンパク質、ペプチドまたは多糖類から選択される。好ましい実施形態では、この担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、チラミン、合成ポリマー、ポリマー微小粒子、生物学的細胞、細胞構成要素、イオンキレート性部分、酵素基質またはウイルスである。別の好ましい実施形態では、この担体分子は、抗体またはその断片、抗原、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン、デキストラン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光性タンパク質、アガロース、および非生物学的微小粒子である。
担体分子は、標識または蛍光性色素または消光剤を含んでいてもよい。
別の例示的な実施形態では、この担体分子は、アミノ酸（保護されているかまたはホスフェート、炭水化物、もしくはＣ１〜Ｃ２２カルボン酸によって置換されたたアミノ酸を含む）、またはアミノ酸のポリマー（ペプチドもしくはタンパク質など）である。関連する実施形態では、この担体分子は、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは５〜３６個のアミノ酸を含む。ペプチドの例としては、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なペプチドは、細胞小器官局在化ペプチド、すなわち、細胞輸送機構による特定の細胞下部構造内での局在化のために、結合された化合物を標的とする働きをするペプチドとして機能してもよい。好ましいタンパク質担体分子としては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、フィコビリタンパク質および他の蛍光性タンパク質、ホルモン、毒素ならびに成長因子が挙げられる。典型的には、このタンパク質担体分子は、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン、成長因子、細菌粒子または細胞受容体の結合パートナーである。
別の例示的な実施形態では、この担体分子は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸ポリマーを含み、これらは任意で、フルオロフォアもしくは他のリガンドの結合のためのさらなるリンカーまたはスペーサ（アルキニル結合（米国特許第５，０４７，５１９号）、アミノアリル結合（米国特許第４，７１１，９５５号）または他の結合など）を含む。別の例示的な実施形態では、このヌクレオチド担体分子は、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドまたはジデオキシヌクレオシドである。
核酸ポリマー担体分子の例は、一本鎖もしくは多鎖の、天然もしくは合成のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、あるいは珍しいリンカー（モルホリン誘導体化ホスフェート（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州、コーバリス）、あるいはペプチド核酸（Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位など）を組込んだものであり、上記核酸は５０個未満のヌクレオチド、より典型的には２５個未満のヌクレオチドを含有する。
別の例示的な実施形態では、この担体分子は、典型的にはデキストラン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロースなどの多糖類、またはポリ（エチレングリコール）などのポリマーである炭水化物またはポリオールを含む。関連する実施形態では、この多糖類担体分子としてはデキストラン、アガロースまたはＦＩＣＯＬＬが挙げられる。
別の例示的な実施形態では、この担体分子は、糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴ脂質を含めた脂質（典型的には、６−２５個の炭素を含む）を含む。あるいは、この担体分子は脂質小胞（リポソームなど）を含むか、またはそれはリポタンパク質である（下記を参照）。いくつかの親油性置換基は、結合された色素を細胞または細胞小器官に輸送するのを容易にするのに有用である。
あるいは、この担体分子は、細胞、細胞系、細胞断片、または細胞レベル下の粒子（ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス構成要素、生物学的細胞（動物細胞、植物細胞、細菌、もしくは酵母など）、または細胞構成要素を含む）である。担体分子として有用である細胞構成要素の例としては、リソソーム、エンドソーム、細胞質、核、ヒストン、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体および液胞が挙げられる。
別の例示的な実施形態では、この担体分子は、有機材料または無機材料と非共有結合的に会合する。親油性置換基を保有する担体分子の例示的な実施形態は、例えば、膜構造のためのプローブ、またはリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、親油性ミクロスフェアもしくは類似の材料への組込みのためのプローブとして使用するため、つまり色素化合物を膜内に非共有結合的に組込むことによって、脂質集合体（生物学的膜またはリポソームなど）を標的にするのに使用することができる。
例示的な実施形態では、この担体分子は、特異的結合対のメンバーを含み、本発明の化合物は特異的結合対のメンバーに結合され、結合した対の形成に使用される。あるいは、標識された特異的結合対のメンバーの存在は、その特異的結合対の相補的メンバーの所在を示し、他のメンバーの特定の空間および極性組織と特異的に結合しそれを相補する各特異的結合対のメンバーは、表面上または空隙内に、ある面積を有している。この例では、本発明の色素化合物は、特異的結合対に対するレポーター分子として機能する。結合対の例を表２に示す。
（表２）代表的な特異的結合対
Figure 2015017094
＊ IgGは免疫グロブリンである。
† cDNAおよびcRNAは、ハイブリダイゼーションに使用される相補鎖である。
固体支持体
例示的な実施形態では、本発明の化合物は固体支持体に共有結合されている。この固体支持体は、アニリン部分、フルオロフォア、反応基（存在する場合）、または担体分子（存在する場合）のいずれかを介して、化合物に結合されてよい。反応基および／または担体分子が存在するとしても、この固体支持体は、アニリン部分またはフルオロフォアを介して結合されていてよい。例示的な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６から選択される少なくとも１つのメンバーは固体支持体である。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの少なくとも１つは固体支持体であり、最も好ましくはＲ４またはＲ５のうちの少なくとも１つは固体支持体である。
本発明での使用に適切な固体支持体は、典型的には、液相に実質的に不溶である。本発明の固体支持体は、特定の種類の支持体に限定されるものではない。むしろ、非常に多くの支持体が利用でき、当業者に公知である。従って、有用な固体支持体としては、エアロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コーティングされたバイオチップを含む）、微小流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレートまたはマイクロプレートとも呼ばれる）、膜、導電性金属および非導電性金属、ガラス（顕微鏡用スライドを含む）ならびに磁気支持体などの固体ならびに半固体マトリクスが挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖（セファロースなど）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスーズ、電磁ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、この固体支持体は、本発明の化合物を結合させるための固体支持体反応性官能基（ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなどが挙げられるが、これらに限定されない）を含んでよい。有用な反応基は上に開示され、本願明細書の固体支持体反応性官能基に等しく適用できる。
適切な固相支持体は、所望の最終用途および種々の合成手順への適性に基づいて選択することができる。例えば、本発明の化合物を固体支持体に結合するのにアミド結合形成が望ましい場合は、ペプチド合成に一般的に有用な樹脂を用いてよく、その例としては、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから入手されるＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、カナダから入手される）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手される）、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ、チュービンゲン）、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、カリフォルニアから入手できる）、またはＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手される）が挙げられる。
結合体の調製
構成要素（担体分子または固体支持体）、例えば、薬物、ペプチド、毒素、ヌクレオチド、リン脂質、タンパク質および他の有機分子の結合体は、本発明の反応性色素を使用する有機合成法によって調製され、一般に、当該技術分野で周知の手段（Ｈａｕｇｌａｎｄ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ、前出、（２００２））によって調製される。好ましくは、共有結合を形成する結合は、本発明の反応性化合物をその反応性化合物および結合されるべき物質がともに可溶である適切な溶媒中で単に混合することにより施行される。この反応は、試薬を加えることなく、室温以下で自発的に進行することが好ましい。光活性化される反応性化合物に関しては、結合は、その反応性化合物の活性化のため、その反応混合物を照射することによって促進される。所望の化合物の結合体を調製するために行われる水不溶性物質の化学修飾は、非プロトン性溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、酢酸エチル、トルエン、またはクロロホルムなど）中で行われるのが好ましい。水溶性材料の同様の修飾は、有機溶媒に溶解しやすくするため、即時反応性化合物を使用することによって容易に実現できる。
ペプチドまたはタンパク質結合体の調製は、典型的には、結合されるべきタンパク質を、約１−１０ｍｇ／ｍＬで、室温以下で水系緩衝液にまず溶解させる段階を含む。炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ約８．３）はスクシンイミジルエステルとの反応に特に適しており、リン酸塩緩衝液（ｐＨ約７．２−８）はチオール反応性官能基との反応に特に適しており、炭酸塩またはホウ酸塩緩衝液（ｐＨ約９）はイソチオシアネートおよびジクロロトリアジンとの反応に特に適している。次いでこの適切な反応性化合物は、結合されるべきタンパク質の溶液に加えられた場合に、適切な結合度を与えるのに十分な量で、ヒドロキシル不含溶媒（通常は、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）に溶解される。任意のタンパク質または他の構成要素への化合物の適切な量は、様々な量の化合物がそのタンパク質に加えられる実験によって便宜的に予め決定され、結合体はクロマトグラフィによって精製され、結合されなかった化合物は分離され、化合物−タンパク質結合体はその所望の適用において試験される。
この反応性化合物を構成要素溶液に加えた後、その混合物は適切な期間（通常、室温で約１時間〜氷上で数時間）インキュベーションされ、過剰の化合物はゲル濾過、透析、ＨＰＬＣ、イオン交換性ポリマーまたは疎水性ポリマーへの吸着または他の適切な手段によって除去される。この化合物結合体は、溶液として使用されるか、または凍結乾燥される。このようにして、適切な結合体は、抗体、抗体断片、アビジン、レクチン、酵素、プロテインＡおよびプロテインＧ、細胞タンパク質、アルブミン、ヒストン、成長因子、ホルモン、および他のタンパク質から調製することができる。
生体高分子および他の高分子量ポリマーを含むポリマーの結合体は、典型的には、当該技術分野で周知の手段（例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：２（１９９２））によって調製される。これらの実施形態において、多糖類が典型的であるように、一種類の反応性部位が利用可能であってよいし、またはタンパク質が典型的であるように、複数種の反応性部位（例えばアミン、チオール、アルコール、フェノール）が利用可能であってもよい。標識の選択性は、適切な反応性色素を選択することによって、最良に得られる。例えば、チオール選択的試薬（ハロアセトアミドもしくはマレイミドなど）によるチオールの修飾、またはアミン反応性試薬（活性化エステル、アシルアジド、イソチオシアネートもしくは３，５−ジクロロ−２，４，６−トリアジンなど）によるアミンの修飾。部分的選択性は、反応条件を慎重に制御することによっても得られる。
ポリマーを上記化合物で修飾する場合、予想される化合物置換の程度よりも過剰の化合物が通常使用される。任意の残留する未反応の化合物、または化合物の加水分解生成物は、通常は、透析、クロマトグラフィまたは沈殿によって除去される。残留する未結合の色素の存在は、その色素をその結合体から溶出する溶媒を使用して、薄層クロマトグラフィによって検出することができる。すべての場合において、試薬は、十分な結合速度を得るため、現実的に可能な限り濃縮した状態を保つことが通常は好ましい。
例示的な実施形態では、本発明の結合体は、非共有結合的相互作用を介して、フルオロフォアまたは結合された物質（担体分子もしくは固体支持体）のいずれかに結合するさらなる物質と結びつけられる。別の例示的な実施形態では、このさらなる物質は、抗体、酵素、ハプテン、レクチン、受容体、オリゴヌクレオチド、核酸、リポソーム、またはポリマーである。このさらなる物質は、例えば、色素−結合体の信号を高める手段として、つまり色素−結合体の所在を探るために、任意で使用される。
合成
本発明の一実施形態は、式ＩＩ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただしＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する：
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＩＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＩＣ：
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式ＩＩの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
別のより特定された実施形態は、式ＩＩＡの化合物を合成する段階をさらに含み、上記方法は、
（ｂ）式ＩＩＢ：
Figure 2015017094
の化合物を塩素化剤と接触させ、式ＩＩＡの化合物を形成する段階を含む。
別の実施形態では、上記塩素化剤は塩化オキサリルである。
本発明の別の実施形態は、式ＩＶ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリルおよび置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＶＢ：
Figure 2015017094
および／または式ＩＶＣの化合物：
Figure 2015017094
、ならびに２，３，５，６−テトラクロロシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（クロラニル）、およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏと接触させ、式ＩＶの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式Ｖ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を合成する方法であって、
（ａ）式ＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物をＰ（ＯＥｔ）３と接触させ、式Ｖの化合物を形成する段階を含む方法を提供する。
別のより特定された実施形態は、式ＶＡの化合物を合成する段階をさらに含み、前記方法は、
（ａ）式ＩＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＶＢ：
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式ＶＡの化合物を形成する段階を含む。
上記の合成方法のうちのいずれか１つの別のより特定された実施形態は、精製する段階をさらに含む。より特定された実施形態では、上記精製する段階は、カラムクロマトグラフィ、粉末化、再結晶、濾過、または水系分離のうちの少なくとも１つを含む。
方法
本発明の色素および複合体は、生細胞または細胞区画のｐＨ、細胞によって引き起こされる局所的環境によるｐＨの変化を測定するため、およびｐＨの変化に伴う具体的細胞事象を直接または間接的に検出するために使用することができる。本発明の１つの方法は、細胞培養液中または寒天プレート上の雑菌混入を検出することを含む。より具体的には、試料は、生細胞および細胞区画以外の物質（細胞培養培地、生体液、診断用材料など）、および細菌培地（寒天プレートなど）をも含む。「細胞区画」によって、通常、本発明者らは、細胞の細胞質に懸濁した多くの小器官のうちの１つを意味する。細胞または細胞区画のｐＨは、色素または色素結合体を細胞または細胞区画に導入し、この色素または結合体を適切な光源を用いて照射し、色素または結合体の蛍光の強度を観察することによって測定できる。観察された蛍光強度は、次いで、当該技術分野で公知で、色素または結合体の蓄積方法に従って選択される様々な方法によって、ｐＨを測定するために使用することができる。例えば、観察された蛍光は、既知の標品、例えばｐＨに対する蛍光強度の検量線と比較されてよいし、または存在する色素もしくは結合体全量を示す蛍光強度測定値と比較されてもよい。あらゆる従来の蛍光測定装置が、その試料を照射し、かつ生成した蛍光反応を測定するために使用できる。
上述のとおり、試料は、生細胞、細胞内液、細胞外液、生体液、血清、生物学的発酵培地、環境試料、工業試料、タンパク質、ペプチド、緩衝液、生体液もしくは化学反応器、血液細胞、免疫細胞、培養細胞、筋肉組織、ニューロン、細胞外小胞、脈管組織、血液、唾液、尿、水、土壌、廃水、海水、薬剤、食品または飲料を含む。一態様では、試料は、ポリマーゲル内、微小粒子上、マイクロアレイ上、シリコンチップ上、スライドガラス上、マイクロウェルプレート上、および微小流体チップ上に固定化されている。
それゆえ、上記化合物は、生物学的実体もしくは生物学的物質を含むかまたは含むと思われる試料に関する、ｐＨセンサーとしてとして使用してよい。この化合物は、生物学的実体または生物学的物質が関与するアッセイ法で使用してよい。本発明は、本願明細書に記載する目的のための生物学的アッセイ法、特にｐＨセンサーとして、上記化合物の使用を提供する。
このように、一実施形態では、本発明の方法は、試料のｐＨを測定する段階を含み、上記方法は、
（ａ）この試料を上述の実施形態のいずれかの化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
（ｂ）この接触させた試料を適切な時間インキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
（ｃ）インキュベーションされた試料を適切な波長を用いて照射し、照射された試料を形成する段階と、
（ｄ）この照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含み、この蛍光性発光は上記試料のｐＨを測定するために使用される方法である。
本発明の別の態様では、上記化合物は、雑菌混入の検出のために細胞培養液中で使用される。本発明の別の態様では、上記化合物は、雑菌混入の検出のために、寒天プレート上で使用される。
別の特定の実施形態では、細胞内部のｐＨの変化は、細胞プロセスに対応する。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、タンパク質、核酸または脂質に結合されている。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、トランスフェリンに結合されている。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、スクシンイミジルエステルを介して担体分子に結合されている。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、ＥＧＦまたはＥＧＦＲに結合されている。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、細胞に侵入するまでは非蛍光性である。より特定すれば、上記化合物は、細胞に侵入した後に蛍光性となる。別のより特定された実施形態では、上記化合物は、食作用によって細胞に侵入する。
別の態様では、本発明は、
（ａ）細胞を上述の実施形態のいずれかの化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）上記接触させた細胞を、上記化合物が上記細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
（ｃ）上記標識された細胞を適切な波長を用いて照射し、照射された細胞を形成する段階と、
（ｄ）上記照射された細胞からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法であって、この蛍光性発光は上記細胞内部のｐＨをモニターするために使用される方法を提供する。
典型的には、この色素および／または結合体は、細胞または細胞区画を含む試料と混合し、次いでこの混合物を、この色素または結合体がその細胞または細胞区画に侵入することができるのに十分な時間インキュベーションすることにより、生細胞または細胞区画の中に導入される。この間に、この色素または結合体は、細胞膜を通って受動的に拡散するか、または細胞媒介性機構によって、細胞または細胞区画により取り込まれる。
結合体の場合には、典型的には、細胞受容体を結合して受容体内部移行を誘導する特異的結合パターンおよび食作用を誘導する細菌粒子を含め、標的分子は、一般に細胞または細胞区画に特異的であり、従って特異的結合体は一般にただ一種の細胞または細胞区画に結合する。ひとたび細胞または細胞区画に結合すると、上記色素結合体は、その細胞または細胞区画の膜を通って拡散するかも知れないし、または受容体媒介性エンドサイトーシスによって特定の細胞区画へと移動するかも知れず、従って、色素結合体自身が細胞または細胞区画の内部ｐＨに曝露される。
本発明の色素および結合体のｐＫａは、設計により、置換によって様々なｐＫａ値に調整できるため、本発明の色素および結合体は、既存の色素と比べてより正確なｐＨ測定を可能にする。これは、ＥＤＧ基をアニリン部分に付加すること、および残りのＲ１−Ｒ６のうちの１つで、−ＯＨまたは−ＳＨではない基で置換することによって成し遂げられる。このように、いくつかは、注目する細胞または細胞区画のｐＨに調整され、その結果、受容体媒介性エンドサイトーシスまたは任意の非受動的蓄積機構ならびに受動的蓄積により蓄積された場合、その細胞または細胞区画のｐＨを測定するのに理想的なものとなるであろう。あるいは細胞培地または細胞外マトリックスのｐＨとはかけ離れたｐＫａを有するのもあるであろう。本発明の色素は、試料のｐＨが本発明の化合物のｐＫａ未満に低下した場合その化合物が蛍光性になることを理解した上で、選択した試料に適合するように調整される。
色素または結合体のｐＨに関する一形態（電荷を帯びていない形態）は注目する細胞または細胞区画を自由に貫通し、他方の形態（電荷を帯びた形態）は非貫通性である場合に、蓄積は受動的に起こるであろう。蓄積されたその色素の形態が蛍光性形態であり、平衡までの蓄積が起こっていれば、蛍光はその平衡位置に近づくであろう。次いで、観察された蛍光強度は、公知の方法のいずれかに従って、例えば較正データを参照することにより、または観察された蛍光強度を、すべての色素または結合体が蛍光を発するように試験試料を酸性にして観察した蛍光強度と比較することによって（この２つの蛍光強度の比は既知のｐＫａと関連しており、ｐＨ測定を可能にする）、ｐＨ測定用に使用できる。受動的蓄積は、担体分子もしくは固体支持体に結合されていない色素、または細胞膜を通って拡散することができる低分子の、比較的疎水性の標的分子（１つまたは複数のＡＭエステル基など）に結合された色素を使用することによって実現することができる。しかしながら、本発明者らは、反応基（スクシンイミジルエステルなど）を含む色素もまた細胞中に受動的に蓄積するようであることを見出した。
本発明者らは、受動的蓄積を使用する場合、本発明のｐＨ感受性色素が優先的にニューロンを検出することを観察した。理論に拘束されることは望まないが、ニューロンは周囲の培地または細胞よりも酸性のｐＨを有し、ニューロンで蓄積された色素の蛍光反応をもたらすようである。本発明者らは、周囲の培地または細胞外マトリックスが酸性にされる場合、ニューロンに蓄積されていない色素の蛍光反応が起こることを示したが、これは上記色素が酸性環境へ受動的に蓄積されることをさらに支持し、かつニューロンを選択的に標識するための方法を提供する。実施例３０７を参照。
本発明の１つの好ましい実施形態は、神経細胞型および非神経細胞型を含む異種混合物である神経組織の切片、または神経細胞において、第１のニューロンまたは複数のニューロンを同定する方法を提供する。本発明はまた、回路を形成するニューロンまたは複数のニューロン間の接続への神経修飾物質の効果を検出する方法、ニューロン間またはニューロン上での阻害性接続を同定する方法、およびニューロンを生体内または生体外で同定する方法を提供する。
特定の実施形態では、正常なニューロンは、生細胞の混合培養物または細胞調製物（組織切片または全組織標本など）において同定される。ニューロンまたは他の代謝活性細胞（心筋細胞および骨格筋細胞など）の生体内での同定は、本発明の化合物を用いる特に好ましい方法である。
本発明の別の実施形態は、
本願明細書に記載される化合物を上記細胞の集団と接触させ、接触させた細胞集団を形成する段階と、
上記接触させた細胞集団を、上記化合物が上記標的細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、それによってインキュベーションされた細胞集団を形成する段階と、
上記インキュベーションされた細胞集団を照射し、上記標的細胞が、上記集団内の隣接する細胞に対して異なる標識によって同定される段階と
を含む、集団内の隣接する細胞とは異なって標識される細胞集団内の標的細胞を同定するための方法を提供する。
より特定された実施形態では、この標的細胞は神経細胞である。さらにより特定すれば、この神経細胞は、隣接する細胞と比べて増加した蛍光によって同定される。別の実施形態では、この細胞の集団は組織の一部である。より特定すれば、この組織は、腫瘍組織、表皮組織、筋肉組織、骨髄組織、神経組織、脳組織、臓器組織、およびヒト生検組織からなる群から選択される。
非受動的蓄積は、典型的には、本発明の化合物が細胞受容体によって結合された担体分子または固体支持体を含む場合に、細胞媒介性機構（食作用およびエンドサイトーシスなど）によって起こる。この例では、本発明の化合物が単に受動的蓄積のみには依存しない機構によって細胞または細胞区画に蓄積される場合はいつでも、その色素のｐＫａが測定されるべきｐＨに近い場合にｐＨ測定の精度は最も高いであろう。この状況において本発明の化合物を用いて享受できる精度の向上は、このｐＫａは、ある種が５０％プロトン化された場合のその種を含有する水系媒体のｐＨであり、かつこのｐＨでプロトン強度の変化はその種の特性に最も大きい影響を及ぼすであろうという事実に基づいている。従って、蛍光強度の最も大きい変化は色素のそのｐＫａで起き、特定の細胞または細胞区画を分析するために使用される本発明の化合物がその細胞または細胞区画のｐＨを含むようにして、このｐＨで絶対的蛍光強度を測定すれば、一般的にそれで十分である。本発明の化合物は、細胞内に大腸菌を取り込んだ食胞で明るい小胞染色を示すことが証明された（図６）。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）本願明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つの化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）上記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｃ）上記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｄ）上記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、ｐＨに関連する細胞プロセスを検出するための方法であって、蛍光性発光の増加が細胞プロセスの活性化を示す方法を提供する。
より特定された実施形態では、この細胞プロセスはイオンチャネルの開口である。さらにより特定すれば、このイオンチャネルはカルシウムである。
別のより特定された実施形態では、上記化合物は、インキュベーションされた後で上記細胞のサイトゾルへ内部移行される。
本発明のさらなる実施形態は、新規のｐＨ感受性色素を用いて作製した蛍光発生性生体粒子に基づき、食作用のための無洗浄無消光アッセイ法を提供する。蛍光性生体粒子を使用する、食作用を測定するための現在の手順は、数回の洗浄を伴うトリパンブルー消光段階を必要とする。これらの段階は、アッセイ法の有意な変動性を生む可能性がある。この問題に対処するために、本発明は、本願明細書に記載するｐＨ感受性、蛍光発生性色素に結合された大腸菌生体粒子を使用する無洗浄食作用キットを記載する。これらの生体粒子結合体は、細胞外ｐＨでは弱蛍光性である。しかしながら、食細胞のＪ７７４．２マウスマクロファージに加えた場合、それらは酸性区画の中へ摂取され、その細胞内部から蛍光を発し、本発明者らがよく知っているＶｙｂｒａｎｔ（商標）食作用アッセイキットの明るさに匹敵するかまたはそれを超える特異的信号を与える。これらの結合体を用いた食作用係数の定量化は、洗浄または消光段階を必要とせず、この生体粒子の取込みは、公知の食作用遮断薬であるサイトカラシンＤ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｉｓｉｎ Ｄ）によって強力に阻害される。本願明細書に記載するｐＨ感受性生体粒子は、食作用のプレートベースのアッセイ法、ならびに撮像アッセイ法およびフローサイトメトリーアッセイ法で使用することができる。この色素は、内部移行を追跡するために様々な標的分子を標識するのに使用できるアミン反応性形態でも利用できる。
従って、本発明の別の実施形態は、
（ａ）担体分子を蛍光性ｐＨ感受性色素に結合し、担体結合体を形成する段階と、
（ｂ）上記担体結合体を細胞に接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｃ）上記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｄ）上記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と
（ｅ）上記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階を含み、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法を提供する。
そのより特定された実施形態では、この蛍光性ｐＨ感受性色素は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩ、または式ＶＩＩの化合物である。
より特定された実施形態では、この担体分子は大腸菌生体粒子である。
１つの特定の実施形態では、この担体分子はβ−アミロイドである。研究者らは、アルツハイマー病患者由来の単球／マクロファージは、正常な患者の試料に比べてβアミロイドを食菌する能力が低下していることを示している（Ｆｉａｌａら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ７（２００５）２２１−２３２；Ｚｈａｎｇら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １０（２００６）１−７１ ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ）。本発明者らは、本発明のｐＨ感受性色素に結合されたβアミロイドは食菌され、フローサイトメトリーおよび顕微鏡観察によって撮像できることを示した。このように、本発明の一実施形態は、食菌されたβアミロイドおよびその後の単球／マクロファージの検出である。特に重要な態様は、正常な単球に比べ、本発明のｐＨ感受性色素に結合されたβアミロイドを食菌する能力が低下している単球を有するアルツハイマー病検出用の血液ベース診断アッセイ法である。その単球が全体としてはそれらの食作用の機能の障害を示していないということを示す重要な対照は、本発明のｐＨ感受性色素の大腸菌または他の生体粒子結合体である。本発明の色素は、この応用に特に適している。なぜなら、この結合体は結合することなく、かつ細胞表面で蛍光を発することなく食菌され、かつそれらはフローサイトメトリー法を使用して容易に検出されるからである。
このように、本発明の別の実施形態は、
（ａ）疾患を有すると推測される被験者から得られた試料を上述の実施形態のいずれかの化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
（ｂ）上記接触させた試料を、適切な時間インキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
（ｃ）上記インキュベーションされた試料を、適切な波長を用いて照射し、照射された試料を形成する段階と、
（ｄ）上記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、被験者において疾患を診断または検出する方法であって、この蛍光性発光は上記疾患を診断または検出するために使用される方法である。
より特定された実施形態では、この疾患は中枢神経系に関連する。別の実施形態では、この疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。より特定された実施形態では、上記化合物は、上記疾患に関連する担体分子に結合される。より特定された実施形態では、上記化合物は、β−アミロイドまたはその断片に結合される。
従って、本発明はさらに、βアミロイドタンパク質に結合された本発明の化合物の食作用に基づいて、アルツハイマー病のための血液ベースのアッセイ法を提供する。
本発明はさらに、ｐＨに影響するかまたは細胞のｐＨに直接影響する細胞プロセスを調節することができる標的分子を検出するための方法を提供する。特定の実施形態では、この標的分子は低分子である。別の実施形態では、この細胞は神経細胞である。
本発明の別の実施形態は、本願明細書に記載する化合物を用いて、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンホカイン、代謝産物，受容体、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、核酸、誘導体化デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、誘導体化ＤＮＡ断片、誘導体化ＲＮＡ断片、ヌクレオシド、ヌクレオチド、天然薬物、合成薬物、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス構成要素、酵母構成要素、血液細胞、血液細胞構成要素、血漿構成要素、血清構成要素、生物学的細胞、神経細胞、非細胞血液構成要素、細菌、細菌構成要素、天然脂質小胞もしくは合成脂質小胞、毒、環境汚染物質、ポリマー、ポリマー粒子、ガラス粒子、ガラス表面、プラスチック粒子、プラスチック表面、ポリマー膜、導体または半導体のいずれか１つを検出する方法であって、上記抗体、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンホカイン、代謝産物、受容体、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、核酸、誘導体化デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、誘導体化ＤＮＡ断片、誘導体化ＲＮＡ断片、ヌクレオシド、ヌクレオチド、天然薬物、合成薬物、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス構成要素、酵母構成要素、血液細胞、血液細胞構成要素、血漿構成要素、血清構成要素、生物学的細胞、非細胞血液構成要素、細菌、細菌構成要素、天然脂質小胞もしくは合成脂質小胞、毒、環境汚染物質、ポリマー、ポリマー粒子、ガラス粒子、ガラス表面、プラスチック粒子、プラスチック表面、ポリマー膜、導体または半導体に結合された請求項４に記載の化合物を検出する段階を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、本願明細書に記載する化合物を酸性または塩基性であると推測される組成物と接触させる段階と、この化合物の蛍光を、上記酸性条件または塩基性条件の指示薬として検出する段階とを含む、酸性条件または塩基性条件を検出するための方法を提供する。より特定された実施形態では、この組成物は細胞内環境を含む。
ｐＨを測定する一般的手段の精度は、異なる蛍光反応を有する複数の本発明の化合物を使用することによって、さらに高めることができる。例えば、同一の担体分子または固体支持体に任意で結合された複数種の本発明に係る色素を使用してもよいし、あるいは本発明に係る色素と別の色素とを使用してもよい。一実施形態では、第２の蛍光性色素は、ｐＨの増加に伴う陽性の蛍光反応（これによって、本発明者らは、その色素または複合体が呈する蛍光の強度がｐＨの増加とともに増加することを意味する）を有する。この複数種の色素が重なる滴定範囲を有することが好ましく、より好ましくはこの異なる色素または結合体は互いのｐＫａ値の違いは約１単位内である。各色素または結合体の蛍光の強度が次に測定され、第１の化合物の蛍光強度：第２の化合物の蛍光強度の比を算出し、得た値を検量線と比較することによって、ｐＨが測定される。
本発明の別の実施形態によれば、本発明の化合物は、細胞もしくは細胞区画の中への、またはそれを通過する、ある種の遊走の動態を分析するために使用することができる。これは、本発明の化合物の蛍光の強度をある時間モニターすることによってなされる。ｐＨが既知の場合、この化合物は、分析されるべき経路の出発点でのｐＨと終点のｐＨとの間の範囲のｐＫａを有するように、選択されるべきである。ある場合には、各色素または複合体が分析されるべき経路の異なる部分に対して調整されている、様々なｐＫａ値を有する複数の化合物を使用することが望ましいかも知れない。
分析または検出のための、本願明細書に記載する化合物、またはそれを含む構成要素の結合体の使用がさらに提供される。より特定すれば、この検出は光学的手段によるものである。
本発明のさらなる態様は、本願明細書に記載する実施形態のいずれかの組合せを包含する。
種々の補助材料が、本発明に係るアッセイ法でしばしば用いられるであろう。例示的な実施形態では、緩衝液および／または安定剤がキット構成要素の中に存在する。別の例示的な実施形態では、このキットは、指示薬溶液または指示薬「計量棒」、瓶詰め装置、培養培地、キュベットなどを含む。さらに別の例示的な実施形態では、このキットは、自動検出器で使用するための指示薬カートリッジ（キット構成要素が固体支持体に結合されている）を含む。別の例示的な実施形態では、このキットは、リン酸化ポリペプチドおよび非リン酸化ポリペプチド、カルシウム結合ポリペプチドおよび非カルシウム結合ポリペプチド、スルホン化ポリペプチドおよび非スルホン化ポリペプチド、ならびにシアル酸付加ポリペプチドおよび非シアル酸付加ポリペプチドから選択される分子量マーカーをさらに含む。別の例示的な実施形態では、このキットは、定着液、検出試薬、標品、洗浄液、およびこれらの組合せから選択されるメンバーをさらに含む。
本発明の別の実施形態は、
（ａ）本願明細書に提供された実施形態のうちのいずれか１つの化合物と、
（ｂ）検体と
を含む組成物を提供する。
より特定された実施形態では、この検体は細胞であり、かつ上記化合物はその細胞内部に位置する。
より特定された実施形態では、この検体はタンパク質、脂質または核酸である。
より特定された実施形態では、上記化合物は担体分子に結合されている。
さらなる方法は、添付の特許請求の範囲に記載される。
照射
上記ｐＨ感受性色素が存在する試料または培地は、検出可能な光学的反応を与えるように選択された光の波長で照射され、その光学的反応を検出するための手段で観察される。本発明の化合物および本発明の組成物を照射するのに有用な装置としては、手持ち式の紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射光源は、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダーまたは標準的蛍光光度計もしくはマイクロ蛍光光度計に光学的に一体化される。
本発明の色素は、アッセイ法の後またはアッセイ法の間いつでも、検出可能な光学的反応をもたらす光の波長で照射されて、その光学的反応を検出するための手段を用いて観察してよい。照射（例えば、紫外もしくは可視光の波長の発光ランプ、アーク灯、レーザー、または太陽光もしくは通常の室内の光でもよい）の際に、相補的特異的結合対のメンバーに結合されたものを含めて、上記蛍光性化合物は、強い可視光の吸収および蛍光発光を呈する。本発明の蛍光性化合物を照射するのに有用な選択された装置としては、手持ち式の紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオードおよびＹＡＧレーザーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射光源は、必要に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的蛍光光度計もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフによる検出器に一体化される。この蛍光発光は、必要に応じて、目視検査により、あるいは以下の装置：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャン装置、蛍光光度計、ホトダイオード、量子カウンタ、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのうちのいずれかの使用により、あるいはその信号を増幅するための手段（光電子増倍管など）により検出される。上記試料がフローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光光度計を使用して検査される場合、その機器は、必要に応じて、典型的には本発明の蛍光性化合物の蛍光反応をその第２のフルオロフォアの蛍光反応から見分けることによって、本発明の蛍光性化合物と検出可能に異なる光学特性を備えた第２のフルオロフォアとの間を見分け、判別するために使用される。試料がフローサイトメーターを使用して検査される場合、その試料の検査は、必要に応じて、選別装置を使用し、蛍光反応に基づいて、その試料内の粒子を単離することを含む。別の実施形態では、照射光源は、本発明の色素と注目する検体との間の共有結合を形成するために使用される。この例では、色素は、上で考察したような光活性化可能な反応基を含む。
キット
本発明の別の実施形態は、試料のｐＨを測定するためのキットであって、
（ａ）本願明細書に提供される実施形態のうちのいずれか１つの化合物と、
（ｂ）その試料のｐＨを決定するための指示書と
を含むキットを提供する。
別の実施形態は、緩衝剤、精製培地、その試料を含むバイアル、または有機溶媒のうちの１つまたは複数をさらに含む。
本発明の詳細な説明を上で提供してきたが、以下の実施例を、本発明を例示する目的で提示する。それら実施例は、本発明の範囲および特許請求の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
以下の実施例を参照して、本願明細書に記載する方法、または当該技術分野で公知の他の方法を使用して、本発明の化合物を合成した。
本発明に係る有機化合物は、互変異性の現象を呈する可能性があることを理解されたい。本願明細書中の化学構造は可能な互変異性体のうちの１つを表すことができるにすぎないので、本発明は、描かれている構造のあらゆる互変異性体を包含することを理解されたい。
実施例１０１ メトキシｐＫａ向上基を有するｐＨセンサー１０４の合成（スキーム１０１）
Figure 2015017094
化合物１０４
無水クロロホルム（１０ｍＬ）中のケトン１０１（９４ｍｇ、０．３３３ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（３０μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。生成した赤色溶液を１時間撹拌し、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン（６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を室温まで加温し、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（６０ｍＬ）で希釈した。クロロホルム溶液を、水層がほとんど無色に変わるまで、飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）とともに振盪した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ ＨＣｌ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた酸抽出液をＣＨＣｌ３（２×１５ｍＬ；捨てた）で洗浄し、この水溶液を、酢酸ナトリウムで飽和させ、ＣＨＣｌ３（４×３０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（２×４０ｃｍのベッド、１０％ ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ３中１％ ＡｃＯＨで充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：１０％ ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ３中１％ ＡｃＯＨ）によって精製し、生成物１０４（３ｍｇ、２％）を紫色ワックスとして得た。
実施例１０２ ２つのメトキシｐＫａ向上基を有するｐＨセンサー１０９および標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１１１の合成（スキーム１０２）
Figure 2015017094
（２，５−ジメトキシフェニル）アセトアミド（１０６）
ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中の２，５−ジメトキシアニリン（１０５）（１．００ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７１ｍＬ、９．８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、無水酢酸（０．９３ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を、１．５時間撹拌し、水（５０ｍＬ）、５％ＨＣｌ（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、アセテート１０６（１．３３ｇ、１００％）を暗色油状物として得た。
２，５−ジメトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１０７）
無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のアセトアミド１０６（１．２７ｇ、６．５ｍｍｏｌ）の溶液に、氷水で冷却して、ボラン−ＴＨＦ錯体（１Ｍ ＴＨＦ溶液、５８．５ｍＬ、５８．５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温まで加温し、還流下で１６時間撹拌した。この混合物を０℃まで冷却し、ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）を用いて慎重に分解し、次いでこの混合物を還流状態に加熱し、１時間撹拌した。冷却後、この溶液を濃縮し、残渣をＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）と同時蒸発させ、アミン１０７（１．２２ｇ、１００％）を暗色油状物として得た。
４−（（２，５−ジメトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１０８）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２．５−ジメトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１０７）（１．２２ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）、４−ブロモ酪酸エチル（４．８６ｍＬ、３３．６ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（０．５０４ｇ、３．３４ｍｍｏｌ、触媒）を７０℃で１６時間撹拌した。この反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、水（４×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２．５×４０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：４）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：４））によって精製し、化合物１０８（１．３９ｇ、７０％）を黄色がかった油状物として得た。
化合物１０９
無水ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中のケトン１０２（０．６００ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（０．１９ｍＬ、２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。生成した赤色溶液を０．５時間撹拌し、エステル１０８（０．６２９ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を室温まで加熱し、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（３００ｍＬ）で希釈した。クロロホルム溶液を、水層がほとんど無色に変わるまで、飽和ＮａＨＣＯ３（約２５０ｍＬ）とともに振盪した。有機層を１０％ ＨＣｌ（４×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた酸抽出液を酢酸ナトリウムで飽和させ、ＣＨＣｌ３（１０×１００ｍＬ）で抽出した。抽出液を、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。この粗生成物を、シリカゲルカラム（５×５０ｃｍのベッド、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５））によって精製し、生成物１０９（０．４１９ｇ、３３％）を紫色固体として得た。
酸１１０
４５ｍＬのＭｅＯＨ中のエステル１０９（０．４００ｇ、０．７１０ｍｍｏｌ）および１Ｍ ＫＯＨ（３５ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）の溶液を１時間撹拌し、酢酸（８ｍＬ）を加え、この混合物を１００ｍＬのブラインで希釈した。生成物をＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ／トルエンと同時蒸発させ、真空中で乾燥し、酸１１０（０．０７９ｇ、２１％）を紫色固体として得た。
スクシンイミジルエステル１１１
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の酸１１０（７９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７８μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドトリフルオロアセテート（９４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で３０分間撹拌し、ＣＨＣｌ３（１２０ｍＬ）で希釈し、水（５×４０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。この溶液を蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３／トルエン混合物と同時蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）に溶解させ、１ｍＬの酢酸および５ｍＬのトルエンを加え、この混合物を蒸発させた。残渣をクロロホルム（２０ｍＬ）に再溶解し、この溶液を濾過し、約１ｍＬまで濃縮した。エーテル（２０ｍＬ）を加え、紫色沈殿物を濾過し、真空中で乾燥し、エステル１１１（７２ｍｇ、７３％）を得た。
実施例１０３ メトキシｐＫａ向上基を有するｐＨセンサー１１８および標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１２０の合成（スキーム１０３）
Figure 2015017094
４−（４−ベンジルオキシ−２−ニトロフェニルオキシ）ブタン酸エチル（１１３）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４−（ベンジルオキシ）−２−ニトロフェノール（１１２）（２．００ｇ、９．３９ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１．３０ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（０．７０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）および４−ブロモ酪酸エチル（２．７０ｍＬ、１８．７ｍｍｏｌ）を７０℃で３時間撹拌した。この反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水（４×４０ｍＬ）、５％ ＨＣｌ（３×４０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、エステル１１３（２．１０ｇ、６２％）を褐色油状物として得た。
４−（４−ヒドロキシ−２−ニトロフェニルオキシ）ブタン酸（１１４）
エステル１１３（１．５０ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの水および３０ｍＬの濃ＨＣｌとともに、還流下で１．５時間撹拌した。冷却して、この混合物を水（１５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。この粗生成物を１Ｍ ＫＯＨ（３０ｍＬ）に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ；捨てた）で抽出し、１０％ ＨＣｌでｐＨ４まで酸性にし、ＥｔＯＡｃ（４×４０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、酸１１４（１．３０ｇ）を褐色固体として得た。
４−（４−メトキシ−２−ニトロフェニルオキシ）ブタン酸メチル（１１５）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の酸１１４（１．３０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末にしたＫ２ＣＯ３（１．５０ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）を加え、次いでＭｅＩ（１．４ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を加えた。生成した混合物を２．５時間撹拌し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を水（４×４０ｍＬ）、１Ｍ ＫＯＨ（５０ｍＬ）、水（２×４０ｍＬ）、１０ ＨＣｌ（２×３０ｍＬ）、水（２×４０ｍＬ）、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄した。この溶液を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、エステル１１５（１．３６ｇ）を褐色油状物として得た。
４−（２−アミノ−４−メトキシフェニルオキシ）ブタン酸メチル（１１６）
化合物１１５（１．３６ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）を、Ｐａｒｒ装置中、１０％ Ｐｔ／Ｃ（２０ｍｇ、触媒）で、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中、５０ｐｓｉの水素圧にて１６時間水素化した。触媒を濾別し、この溶液を蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×３０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２））によって精製し、アニリン１１６（１．０７ｇ、エステル１１３から１００％）を黄色油状物として得た。
４−（２−ジメチルアミノ−４−メトキシフェニルオキシ）ブタン酸メチル（１１７）
ＭｅＣＮ（１５ｍＬ）中のアニリン１１６（０．６１７ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１．６１ｍＬ、９．２４ｍｍｏｌ）を加え、次いで硫酸ジメチル（ＤＭＳ）（１．７５ｍＬ、１８．５ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を５時間撹拌した。過剰のＤＭＳを、水酸化アンモニウム（５ｍＬ）と１６時間撹拌することによってクエンチした。生成した混合物を水（１００ｍＬ）で希釈し、生成物をＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、水（２×３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×３５ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：３）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：３））によって精製し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン誘導体１１７（０．１８９ｇ、３１％）を透明な油状物として得た。
化合物１１８
無水ＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）中のケトン１０１（０．２００ｇ、０．７０９ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（６０μＬ、０．７１ｍｍｏｌ）を加えた。生成した赤色溶液を０．５時間撹拌し、エステル１１７（０．１８９ｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を室温まで加熱し、７２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（８０ｍＬ）で希釈した。クロロホルム溶液を、水層がほとんど無色に変わるまで、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）とともに振盪した。有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（２×４０ｃｍのベッド、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５））によって精製し、化合物１１８（０．１３７ｇ、３３％）を紫色固体として得た。
酸１１９
２０ｍＬのＭｅＯＨ中のエステル１１８（０．１３７ｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）および１Ｍ ＫＯＨ（１２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を０．５時間撹拌し、酢酸（４ｍＬ）を加え、この混合物を１００ｍＬのブラインで希釈した。生成物をＣＨＣｌ３（４×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３／トルエンとともに同時蒸発させ、真空中で乾燥し、酸１１９（２８ｍｇ、２３％）を紫色固体として得た。
スクシンイミジルエステル１２０
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の酸１１９（２８ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２８μＬ、０．１４９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドトリフルオロアセテート（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を０．５時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（８０ｍＬ）で希釈し、水（５×３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。この溶液を蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３／トルエン混合物とともに同時蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に再溶解し、０．５ｍＬのＡｃＯＨおよび３ｍＬのトルエンを加え、混合物を蒸発させた。残渣をクロロホルム（２０ｍＬ）に再溶解し、この溶液を濾過し、約１ｍＬにまで濃縮した。エーテル（２０ｍＬ）を加え、紫色沈殿物を濾過し、真空中で乾燥し、エステル１２０（２５ｍｇ、７５％）を暗紫色固体として得た。
実施例１０４ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基を有するｐＨセンサー１２７ならびに標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１２９の合成（スキーム１０４）
Figure 2015017094
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニシジン（１２２）
ＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）中のｐ−アニシジン１２１（２０．０ｇ、１６２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１１３ｍＬ、６５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、氷／水浴で冷却して、ＤＭＳ（３１ｍＬ、３２５ｍｍｏｌ）を加えた。２時間撹拌した後、もう１回ＤＭＳ（３１ｍＬ、３２５ｍｍｏｌ）を導入し、この反応をさらに０．５時間続けた。この混合物を、ヘキサン（６×５００ｍＬ）で抽出した。合わせたヘキサン抽出液を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラム（６×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ（１０：１）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ（１０：１））によって精製し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニシジン１２２（４．５４ｇ、１９％）を褐色固体として得た。
４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−３−ニトロソアニソール（１２３）
５％ ＨＣｌ（３０ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルアニシジン１２２（３．０９ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、氷／水浴で冷却して、１０ｍＬの水中のＮａＮＯ２（１．９４ｇ、２８．２ｍｍｏｌ）を滴下し、この反応液を１５分間撹拌した。この混合物を２００ｍＬの３Ｎ ＮａＯＡｃ（２００ｍＬ）に注ぎこみ、ＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、ニトロソ誘導体１２３（３．６８ｇ、１００％）を褐色固体として得た。
Ｎ−（２−ジメチルアミノ−５−メトキシフェニル）アセトアミド（１２４）
ニトロソ誘導体１２３（１．３６ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）を、Ｐａｒｒ装置中、１０％ Ｐｔ／Ｃ（３６０ｍｇ、触媒）で、ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中４５ｐｓｉの水素圧にて２時間水素化した。水素化フラスコを装置から取り外し、撹拌棒を挿入した。このフラスコを氷／水浴で冷却し、Ｋ２ＣＯ３（８．４５ｇ、６１．３ｍｍｏｌ）を導入し、次いで塩化アセチル（２．９ｍＬ、４０．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を０．５時間撹拌し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）を加え、固体を濾別し、濾液を蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×３０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：２）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：２））によって精製し、アミド１２４（３．０８ｇ、７２％）をガラス状発泡体として得た。
２−ジメチルアミノ−５−メトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１２５）
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＮ−（２−ジメチルアミノ−５−メトキシフェニル）アセトアミド（１２４）（３．７０ｇ、１７．８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＨ３−ＴＨＦ錯体（１Ｎ、８９ｍＬ、８９ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を撹拌しながら１６時間還流させた。６０℃まで冷却した後、これを、メタノール（１００ｍＬ）をゆっくり加えることにより慎重に分解し、穏やかな還流状態（７０℃）まで再度加熱した。この混合物を、１時間還流させてアミン−ボラン錯体を分解し、室温まで冷却し、蒸発させ、メタノール（２×１００ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム溶液（３×２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、化合物１２５（３．３０ｇ、９６％）を黄褐色油状物として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸メチル（１２６）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２−ジメチルアミノ−５−メトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１２５）（１．７０ｇ、８．８０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３．１ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）、および４−ヨード酪酸メチル（２．４ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を７０℃で２４時間撹拌した。この反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、水（４×５０ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２．５×３０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：５％ ＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１２６（２．２４ｇ、８６％）を暗琥珀色油状物として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸メチル（１２７）
５０ｍＬの無水クロロホルム中のテトラメチルローダミンケトン１０１（０．９６ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（０．３０ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を加えた。生成した赤色溶液を５℃で０．５時間撹拌し、無水クロロホルム（５ｍＬ）中の化合物１２６（１．００ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）の溶液を導入した。この反応液を室温まで加熱し、７２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（３００ｍＬ）および固体ＮａＨＣＯ３（１０ｇ）とともに３０分間撹拌した。有機層を１０％ ＨＣｌ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた酸抽出液をＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ；捨てた）で洗浄し、酢酸ナトリウムで飽和させ、ＣＨＣｌ３（５×５０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（２×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１００：２０：５：１）で充填した）でのクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１００：２０：５：１））によって精製し、生成物１２７（０．７６ｇ、３７％）を紫色固体として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸（１２８）
２５ｍＬのメタノール中のメチルエステル１３２（７５ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）の１Ｍ ＫＯＨを加えた。この反応液を３０分間撹拌し、酢酸（１０ｍＬ）を加えた。この混合物をＣＨＣｌ３（３×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出液を、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ／トルエン混合物と同時蒸発させ、化合物１２８（１９ｍｇ、１３％）を紫色固体として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸スクシンイミジル（１２９）
ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）中の酸１２８（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドトリフルオロアセテート（７０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を３０分間撹拌し、クロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、水（５×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物を、ＣＨＣｌ３溶液（５ｍＬ）からエーテル（２０ｍＬ）を用いて沈殿させることによって精製し、化合物１２９（６０ｍｇ、８３％）を紫色粉末として得た。
実施例１０５ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基を有するｐＨセンサー１３３ならびに標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１２９の合成（スキーム１０５）
Figure 2015017094
４−メトキシ−２−ニトロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１３１）
ＭｅＣＮ（１００ｍＬ）中の４−メトキシ−２−ニトロアニリン１３０（８．４１ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１７．５ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）、およびＤＭＳ（２８．５ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）を、還流下で６時間撹拌した。室温まで冷却した後、濃水酸化アンモニウム溶液（１００ｍＬ）を加え、この反応混合物を２時間撹拌して、過剰のＤＭＳを分解した。この混合物を蒸発させて油状残渣を得て、これをＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）との間で分配した。水相をＣＨＣｌ３（５×５０ｍＬ）で抽出し、合わせたクロロホルム溶液を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、化合物１３１（６．２０ｇ、６３％）を赤色油状物として得た。これは静置後に固化した。
Ｎ−（２−ジメチルアミノ−５−メトキシフェニル）アセトアミド（１２４）
４−メトキシ−２−ニトロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１３１）（８．００ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）を、Ｐａｒｒ装置で、１０％ Ｐｄ／Ｃ触媒（１．８ｇ）を用い、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）および無水酢酸（５０ｍＬ）中４０−４５ｐｓｉの水素圧にて２０時間水素化した。触媒を濾別し、２０ｍｍ〜５ｍｍＨｇの減圧を使用して濾液をロータリーエバポレーターにかけた。粗生成物を、シリカゲルカラム（１２×６０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２：３）で充填した）でのクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１））によって精製し、化合物１２４（５．０５ｇ、６０％）を黄色がかった油状物として得た。
２−ジメチルアミノ−５−メトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１２５）を、Ｎ−（２−ジメチルアミノ−５−メトキシフェニル）アセトアミド（１２４）から、実施例１０４に記載したようにして調製した。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１３２）
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の２−ジメチルアミノ−５−メトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１２５）（４．１３ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１２．０ｍＬ、６８．４ｍｍｏｌ）、４−ブロモ酪酸エチル（１６．５ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（１．７１ｇ、１．１４ｍｍｏｌ、触媒）を７０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、水（４×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（４．５×４０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：４）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：４））によって精製し、化合物１３２（５．５０ｇ、７６％）を黄色がかった油状物として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１３３）
５０ｍＬの無水クロロホルム中のテトラメチルローダミンケトン１０１（０．９６ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（０．３０ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を５℃で１時間撹拌し、無水クロロホルム（５ｍＬ）中の化合物１３２（１．００ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）の溶液を導入した。この反応混合物を室温まで加熱し、７２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（３００ｍＬ）および固体ＮａＨＣＯ３（１０ｇ）とともに３０分間撹拌した。
有機層を、分離し、水（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（２．５×４０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（８００：８０：４０：５）で充填した）のクロマトグラフィ（同じ混合物を溶離液として使用した）によって精製し、化合物１３３（０．１６９ｇ、８％）を暗紫色−赤色油状物として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸（１２８）
２０ｍＬのメタノール中のエチルエステル１３３（０．１５１ｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の溶液に１４ｍｌ（１４ｍｍｏｌ）の１Ｍ ＫＯＨを加えた。この反応液を３０分間撹拌し、酢酸（５ｍＬ）を加え、次いでブライン（８０ｍＬ）を加えた。この混合物をＣＨＣｌ３（５×４０ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出液を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、化合物１２８（０．１１６ｇ、７７％）を紫色固体として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸スクシンイミジル（１２９）を、実施例１０４に記載したようにして酸１２８から調製した。
実施例１０６ マレイミド標識部分を有するｐＨセンサー１３４の合成（スキーム１０６）
Figure 2015017094
マレイミド誘導体１３４
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のスクシンイミジルエステル１１１（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）の溶液に、１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオントリフルオロアセテート（３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を、４０分間撹拌し、乾固するまで蒸発させた。残渣を、（Ｈ２Ｏ／２−ＰｒＯＨ（１：１）＋０．４％ ＴＦＡ）混合物を溶離液として使用して分取逆相ＴＬＣによって精製し、化合物１３４（５ｍｇ、９５％）を紫色固体として得た。
実施例１０７ 炭化水素親油性部分を有するｐＨセンサー１３５の合成（スキーム１０７）
Figure 2015017094
化合物１３５
ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＣＨＣｌ３（２ｍＬ）中のスクシンイミジルエステル１２９（４．６ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２４μＬ、０．０１３８ｍｍｏｌ）および１−ヘキサデシルアミン（２１ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の混合物を、３０分間撹拌し、クロロホルム（８０ｍＬ）で希釈し、水（４×４０ｍＬ）、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（０．５×８ｃｍ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（２０：５：５：１）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（２０：５：５：１）によって精製し、アミド１３５（４ｍｇ、７３％）を紫色ガム状物質として得た。
実施例１０８ ＰＥＧリンカーを有するｐＨセンサー１３６および標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１３７の合成（スキーム１０８）
Figure 2015017094
ＰＥＧ−カルボキシレート１３６
１ｍＬのＤＭＦ中のスクシンイミジルエステル１１１（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、アミノ−ｄＰＥＧ８−酸（５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（４μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）の混合物を、０．５時間撹拌し、乾固するまで蒸発させた。残渣を水（５０ｍＬ）に溶解させ、クロロホルム（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、化合物１３６（６ｍｇ、８６％）を紫色粉末として得た。
スクシンイミジルエステル１３７
化合物１３６（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中でＤＩＥＡ（４μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（０．００４４ｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）とともに２０分間撹拌した。この反応混合物を、クロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、水（６×４０ｍＬ）、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、蒸発させた。残渣を、クロロホルム／トルエンと同時蒸発させ、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１ｍＬ）に再溶解し、トルエン（５ｍＬ）で希釈し、蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、乾燥して、化合物１３７（６ｍｇ、７９％）を紫色ガム状物質として得た。
実施例１０９ Ｃ５−アミドリンカーを有するｐＨセンサー１３８および標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１３９の合成（スキーム１０９）
Figure 2015017094
カルボキシレート１３８
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のスクシンイミジルエステル１２９（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（０．２ｍＬ）中の６−アミノカプロン酸（１５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を、２０分間撹拌し、ブライン（５０ｍＬ）で希釈し、クロロホルム（４×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣をクロロホルム／トルエンと同時蒸発させ、化合物１３８（４ｍｇ、８２％）を紫色固体として得た。
スクシンイミジルエステル１３９
化合物１３８（５ｍｇ、０．００７３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中でＤＩＥＡ（４μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（０．００４６ｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）とともに３０分間撹拌した。この反応混合物を、クロロホルム（８０ｍＬ）で希釈し、水（５×４５ｍＬ）、ブライン（４５ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、クロロホルム／トルエンと同時蒸発させ、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１ｍＬ）に再溶解し、トルエン（５ｍＬ）で希釈し、蒸発させた。粗生成物をクロロホルム（２５ｍＬ）に再溶解し、濾過し、真空中で濃縮した。残渣を超音波処理しながらエーテル（２０ｍＬ）で処理し、遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットを真空中で乾燥し、エステル１３９（５ｍｇ、８６％）を紫色固体として得た。
実施例１１０ 脂肪族アミノ基を有するｐＨセンサー１４１の合成（スキーム１１０）
Figure 2015017094
Ｎ−［４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタノイル］ジアミノペンタン（１４１）
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１２９（１８ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２５μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）およびＢＯＣ−ジアミノペンタン（２０μＬ、０．０４０ｍｍｏｌ）の混合物を、１時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、化合物１４０を得た。この粗生成物を、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）およびＴＦＡ（２ｍＬ）の中で１時間撹拌した。揮発分をエバポレーションした後、生成物を、（Ｈ２Ｏ／２−ＰｒＯＨ（１：１）＋０．２％ ＴＦＡ）混合物を溶離液として使用して、分取逆相ＴＬＣによって精製し、化合物１４１（７ｍｇ、４０％）を暗紫色−赤色固体として得た。
実施例１１１ メトキシｐＫａ向上基およびＦＵＲＡフルオロフォア部分を有するｐＨセンサー１５１および１５２の合成（スキーム１１１）
Figure 2015017094
４−ベンジルオキシ−２−ニトロアニソール（１４３）
４−ベンジルオキシ−２−ニトロフェノール（１４２）（２．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）、粉末にしたＫ２ＣＯ３（１．６９ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（０．８３ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中、８０℃で１．５時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、水（５０ｍＬ）、１％ ＨＣｌ（８×５０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、メチルエーテル１４３（２．１ｇ、９９％）を褐色油状物として得た。
５−ベンジルオキシ−２−メトキシアニリン（１４４）
４−ベンジルオキシ−２−ニトロアニソール（１４３）（２．１ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を、Ｐａｒｒ装置中、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒（０．１０ｇ）を用い、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中で４０−４５ｐｓｉの水素圧にて２時間水素化した。触媒を濾別し、濾液を蒸発させ、化合物１４４（１．８５ｇ、１００％）を褐色油状物として得た。
Ｎ−（５−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）アセトアミド（１４５）
アニリン１４４（０．８３５ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．９５ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中で無水酢酸（０．５２ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）とともに１時間撹拌した。この反応混合物を、ＣＨＣｌ３（８０ｍＬ）で希釈し、５％ ＨＣｌ（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、アセトアミド１４５（０．９５８ｇ、９９％）を褐色固体として得た。
５−ベンジルオキシ−２−メトキシ−Ｎ−エチルアニリン（１４６）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ−（２−ジメチルアミノ−５−メトキシフェニル）アセトアミド（１４５）（０．９５８ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＨ３−ＴＨＦ錯体（１Ｎ、３２ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を撹拌しながら１６時間還流させた。室温まで冷却して、これを、メタノール（２０ｍＬ）をゆっくり加えることにより慎重に分解し、穏やかに還流するまで再度加熱した（７０℃）。この混合物を１時間還流させてアミン−ボラン錯体を分解し、室温まで冷却し、蒸発させ、メタノール（３×５０ｍＬ）と同時蒸発させ、化合物１４６（０．９１ｇ、１００％）を褐色油状物として得た。
Ｎ−（５−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−Ｎ−エチルアセトアミド（１４７）
アミン１４６（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．９５ｍＬ、５．４５ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中で無水酢酸（０．５２ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）とともに１時間撹拌した。この反応混合物を、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、５％ ＨＣｌ（３×３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、アセトアミド１４７（１．０ｇ、８８％）を褐色油状物として得た。
５−ベンジルオキシ−２−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（１４８）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ−（５−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−Ｎ−エチルアセトアミド（１４７）（１．０ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＨ３−ＴＨＦ錯体（１Ｎ、３２ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を撹拌しながら１６時間還流させた。室温まで冷却して、これを、メタノール（２０ｍＬ）をゆっくり加えることにより慎重に分解し、穏やかに還流するまで再度加熱した（７０℃）。この混合物を、１時間還流させてアミン−ボラン錯体を分解し、室温まで冷却し、蒸発させ、メタノール（３×５０ｍＬ）と同時蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（３×４０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：５）で充填した。溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：５））で精製し、化合物１４８（０．３１７ｇ、３３％）を無色の油状物として得た。
５−ベンジルオキシ−４−ホルミル−２−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（１４８）
化合物１４８（０．３１７ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を、ＰＯＣｌ３（０．５６ｍＬ、６．１２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）から調製したＶｉｌｓｍｅｉｅｒ試薬の溶液に加え、この反応液を４５℃で一晩撹拌した。これを室温まで冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、水（３×３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、アルデヒド１４９（０．３０４ｇ、７９％）を黄色油状物として得た。
４−ホルミル−５−ヒドロキシ−２−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（１４８）
アルデヒド１４９（０．３０ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、Ｐａｒｒ装置中、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．０５ｇ）を用い、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中で、５０ｐｓｉの水素圧にて１６時間水素化した。触媒を濾別し、濾液を蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×２０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：５）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：５））によって精製し、化合物１５０（０．１０６ｇ、４９％）を無色の粘性の油状物として得た。
エチルエステル１５１
フェノール１５０（０．１２３ｇ、０．５５１ｍｍｏｌ）、２−（クロロメチル）オキサゾール−５−カルボン酸エチル（０．１２５ｇ、０．６６１ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．１５２ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、１２０℃で２．５時間撹拌した。この混合物を室温まで冷却し、ブライン（８０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（６×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、水（６×５０ｍＬ）、ブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、エステル１５１（０．１５０ｇ、７６％）を褐色固体として得た。
酸１５２
エステル１５１（０．０５ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（８ｍＬ）中で１Ｍ ＫＯＨ（０．７ｍＬ、０．７ｍｍｏｌ）とともに１６時間撹拌した。この反応混合物を蒸発させ、この残渣を水（５０ｍＬ）に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ；捨てた）で抽出した。水溶液を酢酸（３ｍＬ）で酸性にし、ＥｔＯＡｃ（１０×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出液を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、酸１５２（０．０１ｇ、２２％）を黄色発泡体として得た。
実施例１１２ ２つのメトキシｐＫａ向上基およびＸ−ローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１５５の合成（スキーム１１２）
Figure 2015017094
４−（（（２，５−ジメトキシ）−４−ホルミルフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１５３）
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の４−（（２，５−ジメトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１０８）（０．７２ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）および塩化（クロロメチレン）ジメチルイミニウム（２．５０ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）を４５℃で１８時間撹拌し、室温まで冷却し、１：１ 混合物の飽和Ｋ２ＣＯ３−氷（３００ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（５×５０ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブラインで洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（３×５０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：３）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：３））によって精製し、化合物１３２（０．６８０ｇ、８６％）を橙色油状物として得た。これは静置後に固化した。
Ｘ−Ｐｈｏｄａｍｉｎｅ ｐＨセンサー１５５
アルデヒド１５３（６５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、８−ヒドロキシジュロリジン（８３ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、および１０−カンファースルホン酸（５ｍｇ、触媒）を、プロピオン酸（２ｍＬ）中、６５−７０℃で１８時間撹拌し、室温まで冷却し、３Ｎ ＮａＯＡｃ水溶液（１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（５×２５ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、粗ジヒドロ誘導体１５４を得た。これをＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）に溶解させ、ローズベンガル（５０ｍｇ、触媒）を加え、この混合物を、開放系のビーカー中、太陽灯の照射下で１８時間激しく撹拌した。エバポレーション後、残渣を、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（９：１）を溶離液として使用して、２つのシリカゲルプレート上で分取ＴＬＣによって精製し、化合物１５５（２０ｍｇ、１４％）を暗赤色固体として得た。
実施例１１３ ２つのメトキシｐＫａ向上基およびＩＮＤＯフルオロフォアを有するｐＨセンサー１５７の合成（スキーム１１３）
Figure 2015017094
スチルベン誘導体１５６
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のアルデヒド１５３（０．２３５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、４−メトキシカルボニル−２−ニトロメチレントリフェニルホスホニウムブロミド（０．５８７ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（０．２５２ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を９５−１００℃で２０時間撹拌し、室温まで冷却し、２００ｍＬのＨ２Ｏに注ぎ込んだ。ｐＨ３．０まで１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加え、この混合物をＣＨＣｌ３（７×２５ｍＬ）で抽出した。抽出液を、ブラインで洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×４０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１５６（０．２９０ｇ、７９％）を黄色油状物として得た。これは静置後に固化した。
ＩＮＤＯ ｐＨセンサー１５７
スチルベン１５６（０．２８０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、Ｐ（ＯＥｔ）３とともに１３０℃で４時間加熱し、室温まで冷却し、３ｍｍＨｇの減圧で蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２×４０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２））によって精製し、化合物１５７（０．１６０ｇ、６１％）を緑色がかった黄色油状物として得た。
実施例１１４ ２つのメトキシｐＫａ向上基およびＢＯＤＩＰＹ−ＦＩフルオロフォアを有するｐＨセンサー１５８の合成（スキーム１１４）
Figure 2015017094
ＢＯＤＩＰＹ ｐＨセンサー１５８
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中のアルデヒド１５３（０．３２３ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に２，４−ジメチルピロール（０．２５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、次いでＴＦＡ（０．０９ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で希釈し、１％ Ｍｅ４ＮＯＨ（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）の順に洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、トルエン（２×３０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をトルエン（２５ｍＬ）に溶解させ、クロラニル（０．２９５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）とともに２時間撹拌し、次いでＤＩＥＡ（１．７４ｍｍｏｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔ２ＯＢＦ３（１．０ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を４時間撹拌し、蒸発させ、残渣を、シリカゲルカラム（４×５０ｃｍのベッド、３％ ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３で充填した）（溶離液：３％ ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３）で精製した。上記化合物を含む画分を蒸発させ、トルエン（３×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）に溶解させ、２時間静置し、沈殿するシリケートを濾別し、蒸発させ、化合物１５８（０．２１０ｇ、３９％）を橙色油状物として得た。
実施例１１５ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基ならびにテトラメチルローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１３３の合成（スキーム１１５）
Figure 2015017094
４−（（（２−ジメチルアミノ）−４−ホルミル−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１５９）
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１３２）（１．７４ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）および塩化（クロロメチレン）ジメチルイミニウム（５．７８ｇ、４５．１９ｍｍｏｌ）を４５℃で７２時間撹拌し、室温まで冷却し、１：１混合物の飽和Ｋ２ＣＯ３／氷（４００ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（６×８０ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブラインで洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（３×５０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：７）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：７））によって精製し、化合物１５９（１．２１０ｇ、６７％）を橙色油状物として得た。これは静置後に固化した。
４−（（２−ジメチルアミノ）−５−メトキシフェニル−４−テトラメチルローダミニル）（エチル）アミノ）ブタン酸エチル（１３３）
アルデヒド１５９（０．５００ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、２−ジメチルアミノフェノール（０．５１０ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）、および１０−カンファースルホン酸（３０ｍｇ、触媒）をプロピオン酸（１５ｍＬ）中、６５−７０℃で１８時間撹拌し、室温まで冷却し、３Ｎ ＮａＯＡｃ水溶液（４００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（６×５０ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、粗ジヒドロ誘導体１６０を得た。この生成物の一部（３０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＣＨＣｌ３および２ｍＬのＭｅＯＨの中でクロラニル（１６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）とともに２．５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この混合物を、ＭｅＣＮ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１６：４：３）を溶離液として使用して、シリカゲルプレート上で分取ＴＬＣを用いて精製し、化合物１３２（４ｍｇ、１３％）を暗紫色油状物として得た。
実施例１１６ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基ならびにＸ−ローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１６２の合成（スキーム１１６）
Figure 2015017094
Ｘ−Ｐｈｏｄａｍｉｎｅ ｐＨセンサー１６２
アルデヒド１５９（０．３３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、８−ヒドロキシジュロリジン（０．４１６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、および１０−カンファースルホン酸（２０ｍｇ、触媒）を、プロピオン酸（１０ｍＬ）中、６５−７０℃で１８時間撹拌し、室温まで冷却し、３Ｎ ＮａＯＡｃ水溶液（２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（７×４０ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、粗ジヒドロ誘導体１６１を得た。この化合物の試料（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を、開放系ビーカー中、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中でローズベンガル（１０ｍｇ、触媒）とともに太陽灯の照射下で１８時間激しく撹拌した。エバポレーション後、残渣を、７％ Ｈ２Ｏを含むＭｅＣＮを溶離液として使用して、２つのシリカゲルプレート上で分取ＴＬＣによって精製し、化合物１６２（１１ｍｇ、２４％）を暗赤色固体として得た。
実施例１１７ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基ならびにＢＯＤＩＰＹ−ＦＩフルオロフォアを有するｐＨセンサー１６３の合成（スキーム１１７）
Figure 2015017094
ＢＯＤＩＰＹ ｐＨセンサー１６３
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中のアルデヒド１５９（０．３３６ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジメチルピロール（０．２５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、次いでＴＦＡ（０．０９ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で希釈し、１％ Ｍｅ４ＮＯＨ（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）の順に洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、トルエン（２×３０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をトルエン（２５ｍＬ）に溶解させ、クロラニル（０．２９５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）とともに２時間撹拌し、次いでＤＩＥＡ（１．７４ｍｍｏｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔ２ＯＢＦ３（１．０ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を４時間撹拌し、蒸発させ、残渣を、シリカゲルカラム（３×４５ｃｍのベッド、５％ ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３で充填した）（溶離液：５％ ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３）で精製した。上記化合物を含む画分を蒸発させ、第２のシリカゲルカラム（４×５０ｃｍのベッド、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）で充填した）（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１））で再度クロマトグラフにかけ、化合物１６３（０．１８０ｇ、３２％）を橙色油状物として得た。
実施例１１８ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基ならびにＢＯＤＩＰＹ−ＦＩフルオロフォアを有するｐＨセンサー１６６、ならびに標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１６８の合成（スキーム１１８）
Figure 2015017094
４−（（２−ジメチルアミノ）−４−ホルミル−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸（１６４）
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）中の化合物１５９（２．４０ｇ、７．１ｍｍｏｌ）および１Ｎ ＫＯＨ（７１ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）の混合物を５時間撹拌し、蒸発させ、水（１００ｍＬ）に再溶解した。ｐＨ５にまるまで１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加え、この混合物をＣＨＣｌ３（１０×４０ｍＬ）で抽出した。抽出液をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、酸１６４（２．２０ｇ、９７％）を橙色固体として得た。
４−（（２−ジメチルアミノ）−４−ホルミル−５−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸ジフェニルメチル（１６５）
アセトン（５ｍＬ）中の酸１６４（０．３０８ｇ、１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ベンゾフェノンヒドラゾン（０．３９２ｇ、２ｍｍｏｌ）から作製したジフェニルジアゾメタンのアセトン溶液（５ｍＬ）を加えた。この混合物を４０℃で１６時間撹拌し、０．５ｍＬの酢酸を加え、撹拌を２時間続けて過剰のジフェニルジアゾメタンを分解した。この混合物を蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルカラム（３×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１６５（０．３８２ｇ、８１％）を橙色油状物として得た。これは静置後に固化した。
ジフェニルメチルエステル１６６
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のアルデヒド１６５（０．２３０ｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジメチルピロール（０．１２ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、次いでＴＦＡ（０．０５ｍＬ、０．５８０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、１％ Ｍｅ４ＮＯＨ（２×３０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）の順に洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、トルエン（２×３０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をトルエン（１５ｍＬ）に溶解させ、クロラニル（０．１４３ｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）とともに２時間撹拌し、次いでＤＩＥＡ（０．８４ｍｍｏｌ、４．８５ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔ２ＯＢＦ３（０．５５ｍＬ、３．８８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を４時間撹拌し、蒸発させ、残渣を、シリカゲルカラム（４×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）（溶離液：ＣＨＣｌ３）で精製し、化合物１６６（０．２４０ｇ、７１％）を暗赤色油状物として得た。
ＢＯＤＩＰＹ−酸１６７
ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中の化合物１６６（０．２００ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（５ｍＬ）を加えた。この混合物を３分間撹拌し、ＣＨＣｌ３で希釈し、３Ｎ ＮａＯＡｃ（２００ｍｌ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄した。クロロホルム溶液を蒸発させ、残渣を、７．５％ Ｈ２Ｏを含むＭｅＣＮを溶離液として使用して、４つのシリカゲルプレート上で分取ＴＬＣによって精製し、化合物１６７（０．０２５ｇ、１６％）を暗赤色固体として得た。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル１６８
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）中の酸１６７（２２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（８４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１６時間撹拌し、蒸発させ、残渣を、シリカゲルカラム（０．５×２５ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１６８（２０ｍｇ、８０％）を暗橙色半固体として得た。
実施例１１９ メトキシおよびジメチルアミノｐＫａ向上基、標識スクシンイミジルエステル部分およびＢＯＤＩＰＹＩフルオロフォアを有するｐＨセンサー１７１の合成（スキーム１１９）
Figure 2015017094
ジフェニルメチルエステル１６９
ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中のアルデヒド１６５（０．１４２ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（４−メトキシフェニル）ルピロール（０．１２５ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、次いでＴＦＡ（０．０３ｍＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、１６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、１％ Ｍｅ４ＮＯＨ（２×３０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）の順に洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させ、トルエン（２×３０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をトルエン（１０ｍＬ）に溶解させ、クロラニル（０．０８９ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）とともに２時間撹拌し、次いでＤＩＥＡ（０．５２ｍｍｏｌ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔ２ＯＢＦ３（０．３０ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を４時間撹拌し、蒸発させ、残渣を、シリカゲルカラム（４×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）（溶離液：ＣＨＣｌ３）で精製し、化合物１６９（０．１５０ｇ、５９％）を暗赤色半固体として得た。
ＢＯＤＩＰＹ−酸１７０
ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中の化合物１６９（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（５ｍＬ）を加えた。この混合物を３分間撹拌し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、３Ｎ ＮａＯＡｃ（２００ｍｌ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄した。このクロロホルム溶液を蒸発させ、残渣を、７．５％ Ｈ２Ｏを含むＭｅＣＮを溶離液として使用して、２つのシリカゲルプレート上で分取ＴＬＣによって精製し、化合物１７０（０．２８ｇ、６８％）を暗赤色固体として得た。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル１７１
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（６０ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）中の酸１７０（２３ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（７２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、１％ ＡｃＯＨ（５０ｍＬ）、水（３×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。このＣＨＣｌ３溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、化合物１７１（２２ｍｇ、８３％）を暗赤色半固体として得た。
実施例１２０ アミジン指示基およびフルオレセインフルオロフォアを有するｐＨセンサー１７３の合成（スキーム１２０）
Figure 2015017094
フルオレセインホルムアミジン１７３
５−アミノフルオレセイン（１７２）（０．１００ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）および塩化（クロロメチレン）ジメチルイミニウム（０．１３５ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中で１６時間撹拌した。この反応混合物を蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルカラム（１．５×２５ｃｍのベッド、１０％ Ｈ２Ｏを含むＭｅＣＮで充填した）（溶離液：１０％ Ｈ２Ｏを含むＭｅＣＮ）で精製し、アミジン１７３（０．０４９ｇ、４２％）を黄色固体として得た。
実施例１２１ アミジン指示基およびテトラメチルローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１７５の合成（スキーム１２１）
Figure 2015017094
ローダミンホルムアミジン１７５
５−アミノローダミン１７４（０．１００ｇ、０．２４９ｍｍｏｌ）、塩化（クロロメチレン）ジメチルイミニウム（０．３０４ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．５０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を、４ｍＬのＤＭＦ中で１６時間撹拌した。この反応混合物を蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルカラム（１．５×２５ｃｍのベッド、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５）で充填した）（溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５））で精製し、アミジン１７５（０．０５０ｇ、４４％）を赤色固体として得た。
実施例１２２ アミジン指示基およびテトラメチルローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１７７の合成（スキーム１２２）
Figure 2015017094
テトラメチルローダミンホルムアミジン１７７
５−アミノ（テトラメチル）ローダミン１７６（０．１００ｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）、塩化（クロロメチレン）ジメチルイミニウム（０．１５５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．２２ｍＬ、１．２６ｍｍｏｌ）を４ｍＬのＤＭＦ中で１６時間撹拌した。この反応混合物を蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルカラム（１．５×２５ｃｍのベッド、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５）で充填した）（溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（８：２：２．５））で精製し、アミジン１７７（０．０５０ｇ、４８％）を赤色固体として得た。
実施例１２３ スルホン酸基を有するｐＨセンサー１７８、標識スクシンイミジルエステル部分を有する化合物１７９、およびＣ１６−誘導体１８０の合成（スキーム１２３）
Figure 2015017094
スルホン酸誘導体１７８
３７μＬ（０．０３７ｍｍｏｌ）の１Ｍ Ｅｔ３ＮＨ２ＣＯ３緩衝剤を含む１ｍＬの水中のＤ，Ｌ−ホモシステイン酸（１６ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、スクシンイミジルエステル１２９（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を２時間撹拌し、蒸発させた。残渣を水（３×１０ｍＬ）と同時蒸発させ、粗生成物を逆相分取ＴＬＣプレート（溶離液：０．２％ＴＦＡを含有する５０％ ２−ＰｒＯＨ）で精製し、スルホン酸誘導体１７８（５ｍｇ、８１％）を紫色粉末として得た。
スクシンイミジルエステル（１７９）
酸１７８（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネート（２ｍｇ、０．００７４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１ｍｇ、触媒）を、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）中で４０分間撹拌し、蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（１ｍＬ）に溶解させ、エーテル（２０ｍＬ）で希釈した。この混合物を遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットをエーテル（２０ｍＬ）に懸濁させ、この懸濁液を再度遠心分離した。上澄みを除去した後、この手順を繰り返し、固体を真空中で乾燥し、スクシンイミジルエステル１７９（５ｍｇ、８４％）を紫色固体として得た。
ヘキサデシルアミド（１８０）
スクシンイミジルエステル１７９（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２μＬ、０．０１ｍｍｏｌ）、およびヘキサデシルアミン（２ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（２ｍＬ）中で２５分間撹拌し、蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（１ｍＬ）に溶解させ、エーテル（２０ｍＬ）で希釈した。紫色沈殿物を濾過し、真空中で乾燥し、アミド１８０（５ｍｇ、８９％）を紫色固体として得た。
実施例１２４ 過剰な負電荷を有するテトラメチルローダミンフルオロフォアを有するｐＨセンサー１８３の合成（スキーム１２４）
Figure 2015017094
テトラメトキシカルボニル誘導体１８２
プロピオン酸（２０ｍＬ）中のアルデヒド１５９（０．３３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、３−Ｎ，Ｎ−ビス（２−メトキシカルボニルエチル）アミノフェノール（０．６７４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、および１０−カンファースルホン酸（２０ｍｇ、触媒）を６５−７０℃で１８時間撹拌し、室温まで冷却し、３Ｎ ＮａＯＡｃ水溶液（２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）に注ぎ込んだ。この混合物をＣＨＣｌ３（７×３０ｍＬ）で抽出し、抽出液を、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、粗ジヒドロ誘導体１８１を得た。これを、ＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１５ＭＬ）に溶解させ、クロラニル（０．２７１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）とともに３時間撹拌し、過剰の酸化剤から濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（４×５０ｃｍのベッド、３％ ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３で充填した）（溶離液：３％〜６％勾配ＭｅＯＨおよび１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３）で精製した。上記化合物を含む画分を蒸発させ、トルエン（３×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（２５０ｍＬ）に溶解させ、２時間静置し、沈殿するシリケートを濾別し、蒸発させ、化合物１８２（０．３２０ｇ、３６％）を暗赤色半固体として得た。
ペンタカルボン酸誘導体１８３
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）および１Ｎ ＫＯＨ（０．３ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）の中の化合物１７２（１７ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液を１６時間撹拌し、水（１０ｍＬ）で希釈した。ｐＨ９．５となるまで０．２Ｎ ＨＣｌ水溶液を加え、この混合物を蒸発させた。残渣を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（２×６０ｃｍのベッド、Ｈ２Ｏで充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：水）によって精製した。生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥し、化合物１８３（７ｍｇ、３８％）を暗紫色のフレーク状物質として得た。
実施例１２５ ヒドロキシルおよびメトキシ向上基を有するｐＨセンサー１８９の合成
Figure 2015017094
４−（（５−（ベンジルオキシ）−２−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸メチル（１８４）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の５−（ベンジルオキシ）−Ｎ−エチル−２−メトキシアニリン（１４６）（０．６８１ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．９２ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）、および４−ヨード酪酸メチル（０．７２ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を、７０℃で５日間撹拌した。この反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、水（４×５０ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム（２．５×３０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：５％ ＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１８４（０．７２ｇ、７６％）を暗琥珀色油状物として得た。
４−（エチル（５−ヒドロキシ−２−メトキシフェニル）アミノ）ブタン酸メチル（１８６）
エステル１８４（０．７２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、６ｍＬの水および６ｍＬの濃ＨＣｌとともに還流下で１．５時間撹拌し、乾固するまで蒸発させ、酸１８５を褐色ガム状物質として得た。この粗酸化合物を、１滴（触媒）のメタンスルホン酸を含む５０ｍＬのメタノールに溶解させ、この溶液を室温で２時間保持した。この後、この混合物を真空中で濃縮し、残渣を２０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３と混合した。生成物をＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。抽出液を、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム（２．５×３０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：５％ ＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ３）によって精製し、化合物１８６（０．４４４ｇ、８３％）を褐色油状物として得た。
Ｎ−（６−（ジメチルアミノ）−９−（４−（エチル（４−メトキシ−４−オキソブチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−メチルメタンアミニウムクロリド（１８７）
１０ｍＬの無水クロロホルム中のテトラメチルローダミンケトン１０１（０．２３４ｇ、０．８３０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、０−５℃に冷却して、塩化オキサリル（７２μＬ、０．８２ｍｍｏｌ）を加えた。生成した赤色溶液を、５℃で０．５時間撹拌し、無水クロロホルム（５ｍＬ）中の化合物１８６（０．２２２ｇ、０．８３１ｍｍｏｌ）の溶液を導入した。この反応液を室温まで加熱し、７２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を５％ ＨＣｌ（３×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた酸抽出液を、ＣＨＣｌ３（２×１５ｍＬ；捨てた）で洗浄し、酢酸ナトリウムで飽和させ、ＣＨＣｌ３（５×３０ｍＬ）で抽出した。この抽出液を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（２×５０ｃｍのベッド、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１００：２０：５：１）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１００：２０：５：１））によって精製し、生成物１８７（０．１３８ｇ、２９％）を紫色固体として得た。
４−（（４−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−ヒドロキシ−２−メトキシフェニル）（エチル）アミノ）ブタン酸（１８８）
メチルエステル１８７（０．１３６ｇ、０．２４０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの１Ｍ ＫＯＨ（５ｍｍｏｌ）に溶解させた。この反応混合物を室温で１．５時間保持し、酢酸（１ｍＬ）を加えた。この混合物をＣＨＣｌ３（４×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出液をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過した。粗生成物を、シリカゲルカラム（２×５０ｃｍのベッド、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（４：１）で充填した）のクロマトグラフィ（溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ／（４：１：１））によって精製し、生成物１８８（０．０６９ｇ、９８％）を紫色固体として得た。
Ｎ−（６−（ジメチルアミノ）−９−（４−（（４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−４−オキソブチル）（エチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−メチルメタンアミニウムクロリド（１８９）
ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）中の酸１８８（６９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドトリフルオロアセテート（７０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を、３０分間撹拌し、クロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、水（５×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物を、ＣＨＣｌ３溶液（５ｍＬ）からエーテル（２０ｍＬ）を用いて沈殿させることによって精製し、化合物１８９（５５ｍｇ、６７％）を紫色粉末として得た。
実施例１２６ ＡＭエステル合成
Figure 2015017094
Ｎ−（９−（４−（（４−（アセトキシメトキシ）−４−オキソブチル）（エチル）アミノ）−５−（ジメチルアミノ）−２−メトキシフェニル）−６−（ジメチルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−メチルメタンアミニウムクロリド（１９０）
１ｍＬの無水ＤＭＦ中のカルボン酸１２８（０．０４３ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０４１ｍＬ、０．２３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、酢酸ブロモメチル（０．０２３ｍＬ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。生成した溶液を室温で２時間保持し、９０ｍＬのクロロホルムで希釈した。この溶液を、水（５×２０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、ろ紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を、クロロホルム−トルエン混合物とともに再蒸発させ、２ｍＬのクロロホルムに再溶解した。この溶液を５０ｍＬのエーテルで希釈し、生成した沈殿物をガラスフリット漏斗で集めた。生成物をエーテルで洗浄し、真空中で乾燥し、ＡＭエステル１９０を暗紫色固体（０．０１８７ｇ、３６％）として得た。
センサー分子の蛍光測定によるｐＨ滴定
実施例２０１ 蛍光測定によるｐＨ滴定
ｐＨの変化に対する上記センサー分子の蛍光反応の研究を、水系緩衝液中の溶液で（約１０μｍｏｌ／Ｌの濃度で）行った。この滴定の結果を表３に列挙する。
アミジン指示基とフルオレセイン指示基との両方を有する化合物１７３の滴定曲線は、フルオレセイン滴定曲線（ｐＫａ約５．５で蛍光の増加）とアミジン滴定曲線（ｐＫａ約８．０で蛍光の急激な低下）との重ね合わせに似ている。生成した曲線はｐＨ７．２に明確な極大を有する（図２）。
（表３）ｐＨの変化に対するセンサー分子の蛍光反応
Figure 2015017094
実施例２０２ 量子収率測定
ｐＨ＝２．０およびｐＨ＝１０．０における量子収率を、化合物１７８および化合物１７９について、統合した吸収および発光スペクトル曲線を比較することによりｐＨ非感受性標品１８０と比較して測定した。
Figure 2015017094
化合物１７８および１７９は、対応するスクシンイミジルエステル１１１および１２９をメトキシエチルアミンで処理することにより調製した。基準の標品１８０を、市販のスクシンイミジル５−カルボキシ−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ−５−ＳＥ）と同じアミンとの反応で得た。結果を表４に列挙する。
（表４）低ｐＨ値および高ｐＨ値におけるｐＨセンサーの相対的量子収率
Figure 2015017094
ｐＨセンサー分子の生物学的応用
実施例３０１
本願明細書に記載する新規のｐＨ指示薬の蛍光発生性は、細胞内で起こる様々な内部移行プロセス（食作用およびエンドサイトーシスなど）を研究するために非常に有用なものとなる。これは、内部移行の際に、食胞またはエンドソーム内部でｐＨの急激な低下が存在し、これが上記ｐＨ指示薬からの蛍光の増加をもたらすためである。このｐＨセンサーを注目する生体分子に結合することで、これらの分子の内部移行の便利なアッセイ法が提供される。例としては、受容体媒介性エンドサイトーシスを研究するためのトランスフェリン、ｅｇｆ、ｌｄｌ、ならびに食作用を研究するための標識された生体粒子（大腸菌、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびザイモサン）が挙げられる。これらの蛍光発生性バイオコンジュゲートを使用するアッセイ法は、この指示薬が細胞の外部の中性のｐＨで比較的非蛍光性であるという事実に起因して、既存の技術よりも大きな利点を提供する。これにより、細胞の外部でバイオコンジュゲートからのバックグラウンド信号を減少させるために通常必要とされる洗浄段階および消光剤色素の必要性は低下し、または排除される。
ｐＨ検知色素を用いたトランスフェリンの標識
特に明記しない限り、すべての材料をインビトロジェンから入手した。ヒト血清由来のトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ４１３２）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。この色素のスクシンイミジルエステルの無水ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬ溶液を作製し、短時間、超音波処理してこの色素の溶解を促進させた。１０〜３０倍モル過剰の反応性色素溶液を、撹拌しながら、このトランスフェリン溶液に滴下した。加えた色素の量は、具体的な色素および標識すべきトランスフェリンの量に依存することに留意されたい。この反応容器を光から保護し、室温で約１時間撹拌した。この結合体を、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中のＰ−３０Ｍゲル濾過カラム（ＢｉｏＲａｄ、１５０−４１５０）で精製した。この結合体を１９，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、存在する場合、凝集体を除去した。Ａ５６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍを測定することにより、標識の程度を決定した。
（表５）結果
Figure 2015017094
ｐＨ検知色素（化合物１２９）と結合したトランスフェリンを用いたエンドサイトーシス再循環区画の染色
ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）細胞を、９６ウェルのマイクロプレートで、５％ ＦＢＳおよび４μＭ デフェロキサミン（Ｓｉｇｍａ）を含むマッコイ５Ａ培地中に１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングした。細胞を一晩増殖させ、０．５％ ＦＢＳを加えた無フェノールレッドのＤＭＥＭで２回リンスした。トランスフェリン結合体を同じ培地に、２０μｇ／ｍＬで、３７℃で４５分間加えた。次いで細胞をＤＭＥＭで１回リンスし、４０×対物レンズ、ＴＲＩＴＣフィルター、ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）ｃｃｄカメラ、およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）収集ソフトウェアを使用するＺｅｉｓｓ ２００Ｍ倒立蛍光顕微鏡で撮像した。図３は、エンドサイトーシス再循環区画の特徴的な核周辺部の染色パターンを示す。
実施例３０３ 食作用のアッセイ法に使用するための大腸菌生体粒子の標識
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ１２、凍結乾燥細胞（Ｓｉｇｍａ、ＥＣ１−５Ｇ）を、２０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに再懸濁し、激しくボルテックスにかけ、数分間超音波処理した。この懸濁液を１００μＬのアリコートに分割し、１０，０００×ｇで２分間沈降させ、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。これを２回行って、大腸菌を浄化した。この新規のｐＨ色素のアミン反応性ＳＥバージョンを、１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に作製した。標識のために、１００μＬのこの大腸菌懸濁液を１００μＬの上記色素原液と合わせ、これで２ｍｇの大腸菌が１μｍｏｌの色素で標識された。この標識を、３７℃で４５分間行い、次いで上記と同じ沈降および再懸濁手順を５回行って、遊離した色素を除去した。この最終再懸濁液は１０ｍｇ／ｍＬであった。
標識された大腸菌のｐＨ滴定
標識された大腸菌の蛍光を、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダーを使用して、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中でｐＨ１〜１０の範囲のｐＨ値で測定した。この結合体を、リン酸カリウム緩衝液へ１：５０に希釈し、これで標識された生体粒子の最終濃度は０．２ｍｇ／ｍＬとなった。図４は、３種の新規のｐＨ色素標識された生体粒子について、ｐＨ対蛍光強度測定値を示し、それらをテトラメチルローダミン標識された生体粒子および未標識の生体粒子と比較する。これらの色素は、酸性ｐＨで大きな蛍光の増加を示す。
ｐＨ検知色素で標識された生体粒子を用いた食作用活性のアッセイ法
全血試料を、ナトリウムヘパリンチューブに採取した。１２×７５ｍｍのフローサイトメトリー用Ｆａｌｃｏｎチューブの中で全血のアリコート（１００μＬ）を標識された大腸菌（１０ｍｇ／ｍＬを２０μＬ）と合わせ、この試料を３７℃の水浴中で１５分間インキュベーションした。陰性対照を氷の上に置いた。インキュベーション後、このチューブを棚に置き、赤血球を、１ｍＬの塩化アンモニウム溶菌液（０．１８７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．０９５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて室温で１０分間溶解させた。この試料を１２００ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。この再懸濁した細胞を９６ウェルのマイクロプレートに入れ（各ウェルあたり１００μＬ）、このプレートを回転させて、細胞をウェルの底に沈降させた。撮像を、４０×対物レンズ、ＴＲＩＴＣフィルター、ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）ｃｃｄカメラ、およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）収集ソフトウェアを使用するＺｅｉｓｓ ２００Ｍ倒立蛍光顕微鏡で行った。図５は、氷冷した陰性対照試料と比較して蛍光の増加を示すフローサイトメトリー実験を示している。図６は、細胞内に抱き込まれた大腸菌で満たされた食胞の明るい小胞染色を示す。左側のパネルは、ｐＨ感受性色素（化合物１２９）を用いて見出された染色を示す。右側ではＴＭＲ標識された大腸菌が使用され、それらは細胞の外部で蛍光性であるため、抱き込まれなかった大腸菌の小さい点が見られる。消光剤色素を含めるなどの他の段階が採用されなければ、これは、プレートリーダー実験において食作用活性の過大評価を与えるであろう。
実施例３０４ ｐＨセンサーを膜に局在化させるためのＣ１６鎖
この膜のより一般的な標識は、様々な内部移行事象をモニターするための受動的機構を提供するかも知れない。膜が陥入し、小胞区画を形成するにつれて、この色素は追随し、酸性化に際して蛍光の増加を示すはずである。化合物１２９のｃ１６バージョンを、１０μＭで、室温で２０分間、Ｊ７７４．２細胞とインキュベーションし、次いで４０×対物レンズ、ＴＲＩＴＣフィルター、ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）ｃｃｄカメラ、およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）収集ソフトウェアを使用するＺｅｉｓｓ ２００Ｍ倒立蛍光顕微鏡で可視化した。図７Ａは、この色素が細胞を標識することを示し、図７Ｂは、未標識の大腸菌を加えて、この膜染色剤が酸性小胞に内部移行した後の、膜染色剤の信号の増加を示す。
実施例３０５ イオンチャネルまたは輸送体活性化に関連する細胞質酸性化のモニタリング
上記ｐＨ感受性色素の細胞質局在化バージョンは、イオンチャネルまたは輸送体を通るプロトン流入の有用な指標となるはずである。これは、拮抗薬、作用薬、およびチャネル／輸送体機能の他の調節因子のスクリーニングに使用することができるであろう。
実施例３０６ 受容体内部移行アッセイ法
β−２−アドレナリン受容体（β２ＡＲ）を、Ｎ末端にエピトープタグ（ＶＳＶ−ＧタグＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）を組み込むように改変した。この受容体を発現する、クローンの安定なＨＥＫ２９３細胞株を確立した（およそ１．８ｐｍｏｌ／ｍｇの細胞ホモジネート）。本願明細書に記載する化合物で標識された抗ＶＳＶ−Ｇ抗体を使用して、これらの生細胞における作用薬媒介性受容体内部移行をモニターした。このアッセイ法を、特異的作用薬であるイソプロテレノールの存在下および非存在下で行った。
ＶＳＶ−Ｇ−Ｂ２アドレナリン作用性細胞におけるイソプロテレノールに誘導される受容体内部移行
ＨＥＫ２９３細胞は、細胞を播種する前にプレートをポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−６４０７、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳ中５ｍｇ）でコーティングすることが好ましい。３０−８０μｌ／ウェルを加え、室温で４５分間維持した。このコーティング溶液を吸引し、１００μｌの滅菌ＰＢＳで４回（またはそれ以上）洗浄した。プレートを、予め処理して、（最終のＰＢＳ洗浄液をウェル中に入れたままにして）最長一週間４℃で保管することができる。培養細胞は、最初にプレートを乾燥することなく、直接ウェルの中に播種してよい。培養細胞を、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有する完全ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ Ｍ２２７９）に約１．６×１０５細胞／ｍＬに希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を、ポリ−Ｄ−リジン処理した９６ウェルのＰａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗｐｌａｔｅの各アッセイウェルにピペットで移した（細胞密度＝１ウェルあたり１６０００細胞）。次いでプレートを、５％ ＣＯ２で、３７℃で２４−４８時間インキュベーションした。凍結乾燥した化合物で標識した抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（ＰＡ４５４０７）２５０μｇを、０．５ｍＬの滅菌した脱イオン水を用いて再構成し、十分に混合した（原液の濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）。この混合物を遠心分離して、あらゆる沈殿物を除去した。この化合物で標識した抗ＶＳＶ−Ｇ抗体を、無血清、無フェノールレッドのＭＥＭ培地を用いて、２．５−５μｇ／ｍＬの濃度までさらに希釈した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色剤は、この２．５−５μｇ／ｍＬの抗体溶液に、５μＭの最終濃度になるまで加えてよい。この後、培地をこの細胞から除去し、１００μｌの抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ溶液を各ウェルに加えた。この溶液を室温で１５分間インキュベーションした。イソプロテレノール作用薬（滅菌水中１０ｍＭの原液から；Ｓｉｇｍａ １５６２７）の３μＭの作業用希釈溶液をこの溶液に加え、次いで５０μｌを必要なウェルに加えて１μＭの最終濃度にした。これらのウェルを、（ＣＯ２インキュベーター中またはＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００で）３７℃で３０分間インキュベーションした。この細胞を、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００または共焦点顕微鏡のいずれかで撮像した。
化合物で標識した抗ＶＳＶ−Ｇ抗体の内部移行
ＶＳＶ−Ｇ−β２−アドレナリン受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体−化合物結合体とともに予めインキュベーションし、１μＭイソプロテレノールで刺激した。この細胞を、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００を使用して撮像した。作用薬媒介性反応の定量化を、粒度アルゴリズム（これは、粒を、明確な強度差を有する細胞内のはっきりとした焦点域として、そのすぐ周囲を取り巻く細胞領域から区別する）を使用して達成した。操作者は、様々なパラメータを調整して、どのサイズおよび強度の粒をカウントし解析するかをコントロールすることができる。
化合物で標識した抗ＶＳＶ−Ｇ抗体の内部移行
ＨＥＫ ＶＳＶ−Ｇ−β２−アドレナリン受容体細胞を、化合物で標識した抗ＶＳＶ−Ｇ抗体とともに予めインキュベーションし、次いで、イソプロテレノールを、濃度を高めながら（０−１μＭ）この細胞に加えた。３７℃で３０分後、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００および上記粒度解析アルゴリズムを使用して、化合物の蛍光の増加を測定することによって、作用薬媒介性内部移行を分析した。
実施例３０７ 本発明の化合物を用いたニューロン細胞の検出
アストログリア支持細胞層を、ガラス底の培養皿（直径３５ｍｍで、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたもの）上の培養液中で１週間確立した。胎生期１８日目のラットの海馬由来のニューロンを培養培地中で解離させ、１ｍＬあたり２５−３５，０００細胞の密度、１つの皿あたり２ｍＬで支持細胞層上に播種し、グリア細胞増殖を防止するための分裂抑制剤を加えた神経培養培地中で増殖させた。
核の中のＤＮＡを可視化するための２００ｎｇ／ｍＬ Ｈｏｅｒｃｓｈｔ、および細胞質を可視化するための５０ｎｇ／ｍＬ カルセイン（ｃａｌｃｉｅｎ）ＡＭエステルを用いた１５分間の細胞の予備染色を、これらの化合物の１０００×ＤＭＳＯ原液を完全培地中で細胞に加え、それらを３７℃で１５分間細胞培養液インキュベーターに戻すことにより行った。細胞を除去し、培地を静かに注ぎ出した。この細胞を、すぐに５μＭの化合物１２９の中に入れ、１ｍＭ ＤＭＳＯ原液から、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２０ｍＭ ブドウ糖を加えた生理食塩水中に希釈し、ＮａＯＨで最終ｐＨを７．４に設定した。この細胞を、標識溶液中、室温で１０分間インキュベーションし、撮像のため、色素を除いた生理食塩水（上記のもの）で静かに２回洗浄した。
化合物１２９で標識したニューロンは、ＴＲＩＴＣチャネルにおいて、薄暗く標識された星状膠細胞よりも明るく見えた。これは、支持細胞よりも代謝レベルが高く、その結果としてニューロンのｐＨが酸性であることに起因する。カルセイン（ｃａｌｃｉｅｎ）ＡＭでの標識は、ニューロンでは、グリアよりもわずかにより明るい信号を示したが、これは、平坦なグリア支持細胞層の上に存在する神経細胞体が相対的に濃いことによる。０．５μＭ未満の濃さの神経突起は、本発明の化合物の特異性を示した。これは、それらはカルセイン中ではほとんど見えないが、本発明の化合物を用いると非常に明瞭に現れるためである。
この調製物を酸性にすると、グリア細胞が実際に化合物１２９を取り込むことが示されたが、それは、ｐＨのために見えなかった。
実施例３０８ βアミロイド結合体の食作用
１ｍｇのβアミロイド１−４２をカリフォルニアペプチド社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ）（＃６４１−１５）から購入し、化合物１２９で標識して化合物１２９−βアミロイド結合体を得て、これをゲル濾過によって精製し、およそ２００ｎｇ／ｍＬ、βアミロイド１分子あたり１〜２個の色素分子の標識度を有する溶液を得た。
２ｍＬのＪ７７４Ａ．１細胞を、研究の１日前に、３５ｍｍの、ポリ−Ｄ−リジンコーティングしたガラス底培養皿に、無血清ＯｐｔｉＭｅｍ培養培地中１ｍＬあたり３５，０００細胞の密度で播種した。化合物１２９−βアミロイド結合体を、０．２μｍシリンジフィルタを通して濾過し、２０μＬの上記溶液をこの細胞に加えた。一晩インキュベーションするために、この培養液をインキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）に戻し、翌日撮像した。
左側の代表的な明視野像は、データ収集日に４０×の視野で、いくつかのＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞を示す。撮像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（商標）撮像ソフトウェアを用いて、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡で行った。細胞を、それらを標識した同じ培地中で、化合物１２９−βアミロイド結合体をその培地から除去することなく、撮像した。右側の蛍光画像を、標準的なＴＲＩＴＣフィルターセットを用いて２００マイクロ秒の露光で、同じ視野から収集したが、これは、このマクロファージのうちの１つが化合物１２９−βアミロイド結合体で標識され、結合体が細胞によって食菌され、酸性の食胞へと区画化されたことを示す。
この視野における単独の細胞の標識は、以下の事柄を示す。１）マクロファージに供給された化合物１２９ βアミロイドは特異的に標識し、アミロイド標識反応からの溶液の中には、残留する遊離の化合物１２９スクシンイミジルエステル色素は全く残っていない。遊離の色素があれば、この培養液中の細胞のすべてを非特異的に標識したであろう。２）溶液中の細胞の外に存在する化合物１２９ βアミロイドは中性のｐＨの培養培地では見えないが、食菌された化合物１２９で標識されたβアミロイドは、明るく標識され、これは、マクロファージによる化合物１２９−βアミロイドの取り込みおよび酸性化の特異的かつ高忠実度の指標となる。３）蛍光は細胞表面からではなく細胞内部から発生しており、これは内部移行の特異的標識を与える。蛍光標識されたβアミロイド（ＦＩＴＣ標識された）の食作用のこれまでの測定は、結果として、その結合体の細胞内表面および細胞外表面の標識の組み合わせとなっており、βアミロイドの特異的内部移行および食作用をフローサイトメトリーによって測定しようとする試みを混乱させていた（Ｆｉａｌａら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ７（２００５）２２１−２３２；Ｚｈａｎｇら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １０（２００６）１−７１ ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ，前出）。それゆえ、化合物１２９−βアミロイドで標識した細胞は、フローサイトメトリーで見えるはずである。化合物１２９ 大腸菌生体粒子結合体で同程度に標識したＪ７７４Ａ．１マクロファージは、前述の具体例においてフローサイトメトリーによって容易に確認され、定量された（実施例３０３を参照）。
以下の段落の発明主題は、本発明に包含される。
１．以下の式Ｉの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘはフルオロフォアであり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただし、ＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。
２．Ｘがキサンテン、インドールおよびボラポリアザインダシンからなる群から選択される、段落１に記載の化合物。
３．Ｘが、
Figure 2015017094
である、段落１に記載の化合物：
式中、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１０およびＲ１１が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか；あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成する。
４．Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がアルキルである、段落３に記載の化合物。
５．Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がメチルである、段落４に記載の化合物。
６．Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４がＨである、段落３に記載の化合物。
７．Ｒ１１およびＲ１４がＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３がＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、前記縮合環が以下の構造を有する、段落３に記載の化合物：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ２７およびＲ２８は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３ −、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
８．Ｘが、
Figure 2015017094
であり、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
段落１に記載の化合物。
９．Ｒ１６およびＲ１９がＨである、段落８に記載の化合物。
１０．Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ２０がメチルである、段落８に記載の化合物。
１１．Ｘが、
Figure 2015017094
であり、
Ｒ２１が、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
段落１に記載の化合物。
１２．Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６がＨである、段落１１に記載の化合物。
１３．Ｒ２３がカルボキシルエステルである、段落１１に記載の化合物。
１４．Ｒ２３が−ＣＯ２ＣＨ３である、段落１１に記載の化合物。
１５．Ｒ１が−ＯＣＨ３である、段落１に記載の化合物。
１６．Ｒ２およびＲ６がＨである、段落１５に記載の化合物。
１７．前記ＥＤＧが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される、段落１に記載の化合物。
１８．Ｒ１およびＲ３が−ＯＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２である、段落１に記載の化合物。
１９．前記ＥＤＧが、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される、段落１に記載の化合物。
２０．Ｒ４およびＲ５がアルキルまたは置換されたアルキルである、段落１に記載の化合物。
２１．Ｒ５が、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、
式中、ｎは０、１、２、３、４または５であり、かつｍは０、１、２または３である、
段落２０に記載の化合物。
２２．Ｒ５が＝ＣＨ（置換されたアミノ）である、段落２１に記載の化合物。
２３．Ｒ４がエチルである、段落２０に記載の化合物。
２４．前記化合物のｐＫａが約５〜約８である、段落１に記載の化合物。
２５．以下の式ＩＩの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただし、ＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。
２６．以下の式ＩＩＩの化合物：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ３は電子供与性基（ＥＤＧ）であり、かつ
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、および＝ＣＨ（置換されたアルキル）からなる群から選択される。
２７．以下の式ＩＶの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立に、Ｙ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
２８．以下の式Ｖの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
２９．
（ａ）試料を前述の段落のいずれかに記載の化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた試料を適切な時間インキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
（ｃ）インキュベーションされた試料を適切な波長を用いて照射し、照射された試料を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、試料のｐＨを測定する方法であって、
前記蛍光性発光は前記試料のｐＨを測定するために使用される方法。
３０．前記試料が細胞を含む、段落２９に記載の方法。
３１．前記接触させた試料が、前記色素または化合物が前記細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションされる、段落３０に記載の方法。
３２．前記試料が、生細胞、細胞内液、細胞外液、血清、生体液、生物学的発酵培地、環境試料、工業試料、タンパク質、ペプチド、緩衝液、生体液または化学反応器、血液細胞、免疫細胞、培養細胞、筋肉組織、ニューロン、細胞外小胞、脈管組織、血液、唾液、尿、水、土壌、廃水、海水、薬剤、食品または飲料を含む、段落２９に記載の方法。
３３．前記試料のｐＨが前記化合物のｐＫａ未満に低下した場合に、前記化合物が蛍光性となる、段落２９に記載の方法。
３５．前記試料が、ポリマー膜上、ポリマーゲル内、微小粒子上、マイクロアレイ上、シリコンチップ上、スライドガラス上、マイクロウェルプレート上、および微小流体チップ上に固定化されている、段落２９に記載の方法。
３６．前記接触させる段階が、前記試料を第２の色素に接触させることをさらに含む、段落２９に記載の方法。
３７．前記第２の色素が、前記色素とまたは化合物と異なる蛍光性発光スペクトルを有するｐＨ感受性色素である、段落３６に記載の方法。
３８．前記第２の色素が、前記化合物のｐＫａと異なるｐＫａを有する、段落３７に記載の方法。
３９．
（ａ）前記細胞を前述の段落のいずれかに記載の化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって細胞内部のｐＨをモニターする段階と
を含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法。
４０．前記細胞内部のｐＨの変化が細胞プロセスに対応する、段落３９に記載の方法。
４１．前記化合物がタンパク質、核酸または脂質に結合されている、段落３９に記載の方法。
４２．式ＩＩ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、
Ｒ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって、縮合環を形成し、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノであるが、
ただしＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する：
の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＩＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＩＣ：
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式ＩＩの化合物を形成する段階を含む方法。
４３．式ＩＩＡの化合物を合成する段階をさらに含む、段落４２に記載の方法であって、かつ該方法が、
（ｂ）式ＩＩＢ：
Figure 2015017094
の化合物を塩素化剤と接触させ、式ＩＩＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
４４．前記塩素化剤が塩化オキサリルである、段落４３に記載の方法。
４５．式ＩＶ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物を、式ＩＶＢ：
Figure 2015017094
および／または式ＩＶＣ：
Figure 2015017094
の化合物、ならびに２，３，５，６−テトラクロロシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（クロラニル）、およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏと接触させ、式ＩＶの化合物を形成する段階を含む方法。
４６．式Ｖ：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、独立にＨ、Ｚ，または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ２１はＨであり、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキル、または置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである：
の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物をＰ（ＯＥｔ）３と接触させ、式Ｖの化合物を形成する段階を含む方法。
４７．式ＶＡの化合物を合成する段階をさらに含む、段落４６に記載の方法であって、かつ該方法が、
（ａ）式ＩＶＡ：
Figure 2015017094
の化合物を式ＶＢ：
Figure 2015017094
の化合物と接触させ、式ＶＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
４８．精製する段階をさらに含む、段落４２から段落４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．前記精製する段階が、カラムクロマトグラフィ、粉末化、再結晶、濾過、または水系分離のうちの少なくとも１つを含む、段落４８に記載の方法。
５０．
（ａ）段落１から段落２８のいずれか１つに記載の化合物と、
（ｂ）検体と
を含む、組成物。
５１．前記検体が、細胞であり、前記化合物が細胞内部に位置する、段落５０に記載の組成物。
５２．前記検体がタンパク質、脂質または核酸である、段落５０に記載の組成物。
５３．前記化合物が担体分子に結合されている、段落５２に記載の組成物。
５４．試料のｐＨを測定するためのキットであって、
（ａ）段落１から段落２８のいずれか１つに記載の化合物と、
（ｂ）前記試料のｐＨを測定するための指示書と
を含む、キット。
５５．緩衝剤、精製培地、前記試料を含むバイアル、有機溶媒のうちの１つまたは複数をさらに含む、段落４０に記載のキット。
５６．段落１から段落２８のいずれか１つに記載の化合物を含む、蛍光性ｐＨ感受性色素。
５７．前記化合物のｐＫａが約５〜約８である、段落５６に記載の蛍光性ｐＨ感受性色素。
５８．前記化合物のｐＫａが約６から約７である、段落５６に記載の蛍光性ｐＨ感受性色素。
５９．
（ａ）担体分子を蛍光性ｐＨ感受性色素に結合し、担体結合体を形成する段階と、
（ｂ）前記担体結合体を細胞に接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｅ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、溶液中の担体分子の食作用を検出する方法であって、
蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法。
６０．前記担体分子が大腸菌生体粒子である、段落５９に記載の方法。
６１．
（ａ）段落１から段落２８のいずれか１つに記載の化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｃ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、ｐＨに関連する細胞プロセスを検出するための方法であって、
蛍光性発光の増加が前記細胞プロセスの活性化を示す方法。
６２．前記細胞プロセスがイオンチャネルの開口である、段落６１に記載の方法。
６３．前記イオンチャネルがカルシウムである、段落６２に記載の方法。
６４．前記化合物が、インキュベーションされた後で前記細胞のサイトゾルへ内部移行される、段落６１に記載の方法。
６５．以下の式Ｉの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
Figure 2015017094
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘはフルオロフォアであり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
より具体的には、ＹまたはＺのうちの少なくとも１つは存在する。さらにより具体的には、Ｒ１はヒドロキシルまたはチオールではない。Ｒ１にヒドロキシまたはチオール（およびそれらの電荷を帯びた種）が存在しないことにより、特にアルコキシ基で置き換えた場合、本発明の化合物の安定性が高まる。
上で引用した引用文献の各々は、それらが本願明細書にすべて示されたかのごとくに、参照により本願明細書に援用される。
本発明の好ましい実施形態を図示し説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらに対して種々の変更を為し得ることを理解されたい。

Claims (70)

  1. 蛍光性ｐＨセンサーとして使用するための化合物であって、
    以下の式Ａを有し、Ｒ１およびＲ２がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする、化合物：
    Figure 2015017094
    式中、
    Ｒ１−Ｒ６は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
    Ｘはフルオロフォアであるか、あるいは
    Ｒ１およびＲ３−Ｒ６は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつＸおよびＲ２は一緒になって、位置ＸとＲ２との間で式Ａのベンゼン環に縮合した５員もしくは６員の複素環式環を含む部分を形成する。
  2. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のいずれも、ヒドロキシルでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもない、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ１−Ｒ６が、
    水素、
    ヒドロカルビル、または−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって遮られたヒドロカルビル；またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６ついて言えば、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介して式Ａのベンゼン環に結合され、かつ−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって任意で遮られたヒドロカルビル
    から選択され、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、かつ
    ヒドロカルビルが１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、
    Ｒｂが、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、または−Ｏ−結合を介して隣接するＮに結合されかつ／または１つまたは複数の−Ｏ−結合によって遮られたＣ１−Ｃ６ヒドロカルビルであり、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、
    −Ｌが、共有単結合であるリンカー、または一連の安定な共有結合を含みかつＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される多価の原子を組み込む部分であり、
    −Ｒｘが反応基であり、
    −ＬＲが、−ＬをＳｃに結合している反応基の残基を任意でさらに含むリンカー−Ｌであり、
    −Ｓｃが結合された物質であり、
    任意でＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つ（例えばそれらのうちの２つ）がＨではない、
    請求項１または請求項２に記載の化合物。
  4. Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがアルコキシまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されたアルコキシであり、アルコキシが１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、他の記号が請求項３で定義されたとおりである、請求項１または請求項２に記載の化合物。
  5. Ｒ１、ならびにＲ２、Ｒ３およびＲ６のうちの１つ、２つまたは３つが、−Ｏ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介して前記ベンゼンに結合されたヒドロカルビルであり、
    前記ヒドロカルビルが、前記結合の１つまたは複数によって遮られていないかまたは遮られており、かつ非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−Ｌ−Ｓｃによって置換されており、
    前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの１つ、２つまたは３つが、互いに同じであるかまたは異なる、
    請求項３または請求項４に記載の化合物。
  6. Ｒ１およびＲ３が請求項５で定義されたとおりであるが、Ｒ２およびＲ６が、請求項５で定義されたものではなく、かつ任意でともに水素である、請求項５に記載の化合物。
  7. Ｘがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 以下の式Ｉを有する、請求項１に記載の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
    Figure 2015017094
    式中、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシルでもなく、かつチオールでもなく、かつそれらの脱プロトン化形態でもなく、
    Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｘはフルオロフォアであり、
    Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
    Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
    ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
    Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
    Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
  9. Ｘがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項８に記載の化合物。
  10. Ｘが、
    Figure 2015017094
    である、請求項８に記載の化合物：
    式中、
    Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
    Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
    Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成する。
  11. Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がアルキルである、請求項９に記載の化合物。
  12. Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がメチルである、請求項１０に記載の化合物。
  13. Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４がＨである、請求項９から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. Ｒ１１およびＲ１４がＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３がＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、各縮合環が以下の構造を有する、請求項９に記載の化合物：
    Figure 2015017094
    式中、
    Ｒ２７およびＲ２８は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３ −、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
  15. Ｘが、
    Figure 2015017094
    であり、
    Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
    請求項８に記載の化合物。
  16. Ｒ１６およびＲ１９がＨである、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ２０がメチルである、請求項１５または請求項１６に記載の化合物。
  18. Ｘが、
    Figure 2015017094
    であり、
    Ｒ２１が、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
    Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
    請求項８に記載の化合物。
  19. Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６がＨである、請求項１８に記載の化合物。
  20. Ｒ２３がカルボキシルエステルである、請求項１８または請求項１９に記載の化合物。
  21. Ｒ２３が−ＣＯ２ＣＨ３である、請求項１８または請求項１９に記載の化合物。
  22. 前記ＥＤＧが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. 前記ＥＤＧが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される、請求項２２に記載の化合物。
  24. Ｚ部分が存在する、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
  25. Ｙ部分が存在する、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
  26. Ｒ１にＺを含み、少なくとも１つのさらなるＥＤＧを含む、請求項２４に記載の化合物。
  27. Ｒ１がアルコキシである、請求項２４または請求項２５に記載の化合物。
  28. Ｒ１が−ＯＣＨ３である、請求項２０に記載の化合物。
  29. Ｒ１およびＲ３が−ＯＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項８から請求項２５のいずれか一項に記載の化合物。
  30. Ｒ２およびＲ６がＨである、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
  31. 前記ＥＤＧが、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
  32. Ｒ４およびＲ５がアルキルまたは置換されたアルキルである、請求項８から請求項３１のいずれか一項に記載の化合物。
  33. Ｒ５が、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、
    式中、ｎが０、１、２、３、４または５であり、かつｍが０、１、２または３である、
    請求項３２に記載の化合物。
  34. Ｒ５が＝ＣＨ（置換されたアミノ）である、請求項３３に記載の化合物。
  35. Ｒ４がエチルである、請求項３２に記載の化合物。
  36. 前記化合物のｐＫａが約５〜約８である、請求項１から請求項３５のいずれか一項に記載の化合物。
  37. 以下の式ＩＩＩの化合物：
    Figure 2015017094
    式中、
    Ｒ３は電子供与性基（ＥＤＧ）であり、かつ
    Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、および＝ＣＨ（置換されたアルキル）からなる群から選択される。
  38. Ｒ４およびＲ５が、各々独立にＨ、アルキルおよび置換されたアルキルから選択される、請求項３７に記載の化合物。
  39. （ａ）試料を請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
    （ｂ）前記接触させた試料をインキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
    （ｃ）前記インキュベーションされた試料を照射し、照射された試料を形成する段階と、
    （ｄ）前記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
    を含む、試料のｐＨを測定する方法であって、
    前記蛍光性発光が前記試料のｐＨを測定するために使用される方法。
  40. 前記試料が細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記試料が、生細胞、細胞内液、細胞外液、血清、生体液、生物学的発酵培地、環境試料、工業試料、タンパク質、ペプチド、緩衝液、生体液もしくは化学反応器、血液細胞、免疫細胞、培養細胞、筋肉組織、ニューロン、細胞外小胞、脈管組織、血液、唾液、尿、水、土壌、廃水、海水、薬剤、食品または飲料を含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記試料が、ポリマー膜上、ポリマーゲル内、微小粒子上、マイクロアレイ上、シリコンチップ上、スライドガラス上、マイクロウェルプレート上、および微小流体チップ上に固定化されている、請求項３９、請求項４０および請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記接触させる段階が、前記試料を第２の色素と接触させることをさらに含む、請求項３９から請求項４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第２の色素が、前記色素とまたは化合物と異なる蛍光性発光スペクトルを有しかつ前記化合物のｐＫａと異なるｐＫａを有するｐＨ感受性色素である、請求項３６に記載の方法。
  45. （ａ）前記細胞を請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
    （ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するためにインキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
    （ｃ）前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞内部のｐＨをモニターする段階と
    を含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法。
  46. 前記細胞内部のｐＨの変化が細胞プロセスに対応する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記化合物がタンパク質、核酸または脂質に結合されている、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
  48. 前記細胞がニューロンである、請求項４５、請求項４６および請求項４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. （ａ）担体分子を蛍光性ｐＨ感受性色素に結合し、担体結合体を形成する段階と、
    （ｂ）前記担体結合体を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
    （ｃ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
    （ｄ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
    （ｅ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
    を含む、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、
    蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法。
  50. 前記担体分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生体粒子である、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記色素が、請求項１から請求項３８のいずれか一項で特許請求される色素である、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
  52. （ａ）請求項１から請求項３８にいずれか一項に記載の化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
    （ｂ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
    （ｃ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
    （ｄ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
    を含む、ｐＨに関連する細胞プロセスを検出する方法であって、
    蛍光性発光の増加が前記細胞プロセスの活性化を示す方法。
  53. 前記細胞プロセスがイオンチャネルの開口である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記イオンチャネルがカルシウムチャネルである、請求項５３に記載の方法。
  55. 請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物を細胞の集団と接触させ、接触させた細胞集団を形成する段階と、
    前記接触させた細胞集団を、前記化合物が前記標的細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、それによってインキュベーションされた細胞集団を形成する段階と、
    前記インキュベーションされた細胞集団を照射する段階を含む、標的細胞が集団内の隣接する細胞とは異なって標識される、前記細胞の集団内の標的細胞を同定する方法であって、
    前記標的細胞が、前記集団内の隣接する細胞と異なる標識によって同定される、
    方法。
  56. 前記標的細胞が神経細胞である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記異なる標識が蛍光の増加を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
    （ａ）式ＩＩＡ：
    Figure 2015017094
    の化合物を、式ＩＩＣ：
    Figure 2015017094
    の化合物と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
  59. 式ＩＩＡの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項５８に記載の方法であって、該方法が、
    （ｂ）式ＩＩＢ：
    Figure 2015017094
    の化合物を塩素化剤、例えば塩化オキサリルと接触させ、式ＩＩＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
  60. 請求項１５から請求項１７のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項２２から請求項３６のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
    ＩＶ
    （ａ）式ＩＶＡ：
    Figure 2015017094
    の化合物を、式ＩＶＢ：
    Figure 2015017094
    および／またはＩＶＣ：
    Figure 2015017094
    の化合物、ならびに２，３，５，６−テトラクロロシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（クロラニル）、およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏと接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
  61. 請求項１８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１８に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項２２から請求項３６のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
    Figure 2015017094
    （ａ）式ＶＡ：
    Figure 2015017094
    の化合物をＰ（ＯＥｔ）３と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
  62. 式ＶＡの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項６１に記載の方法であって、該方法が、
    （ａ）式ＩＶＡ：
    Figure 2015017094
    の化合物を式ＶＢ：
    Figure 2015017094
    の化合物と接触させ、式ＶＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
  63. （ａ）請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と、
    （ｂ）検体と
    を含む、組成物。
  64. 前記検体が細胞であり、前記化合物が前記細胞内部に位置する、請求項６３に記載の組成物。
  65. 前記検体がタンパク質、脂質または核酸である、請求項６３に記載の組成物。
  66. 前記化合物が担体分子に結合されている、請求項６５に記載の組成物。
  67. 試料のｐＨを測定するためのキットであって、
    （ａ）請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と、
    （ｂ）前記試料のｐＨを測定するための指示書と
    を含むキット。
  68. 緩衝剤、精製培地、前記試料を含むバイアル、または有機溶媒のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項６７に記載のキット。
  69. 任意で、生細胞に関する、または生物学的実体もしくは物質、例えば生細胞、細胞内液、細胞外液、体液、血清、発酵培地、細胞培養液、もしくは組織を含むかまたは含むと思われる試料における、請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物のｐＨセンサーとしての使用。
  70. バイオアッセイ法における、請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
JP2014157304A 2006-10-27 2014-08-01 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法 Active JP5847257B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86331806P 2006-10-27 2006-10-27
US60/863,318 2006-10-27
US94032307P 2007-05-25 2007-05-25
US60/940,323 2007-05-25

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009534880A Division JP5636189B2 (ja) 2006-10-27 2007-10-26 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2015017094A true JP2015017094A (ja) 2015-01-29
JP5847257B2 JP5847257B2 (ja) 2016-01-20

Family

ID=39536938

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009534880A Active JP5636189B2 (ja) 2006-10-27 2007-10-26 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法
JP2014157304A Active JP5847257B2 (ja) 2006-10-27 2014-08-01 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009534880A Active JP5636189B2 (ja) 2006-10-27 2007-10-26 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法

Country Status (4)

Country Link
US (6) US20080274907A1 (ja)
EP (2) EP2727965B1 (ja)
JP (2) JP5636189B2 (ja)
WO (1) WO2008076524A2 (ja)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076524A2 (en) 2006-10-27 2008-06-26 Life Technologies Corporation Fluorogenic ph sensitive dyes and their method of use
JP5895297B2 (ja) * 2012-02-10 2016-03-30 国立大学法人京都工芸繊維大学 蛍光体およびその利用
US9702824B2 (en) 2012-03-09 2017-07-11 Promega Corporation pH sensors
EP2875075A1 (en) * 2012-05-30 2015-05-27 Life Technologies Corporation Fluorogenic ph-sensitive dyes and their methods of use (ii)
US9023998B2 (en) * 2013-02-25 2015-05-05 Carnegie Mellon University Near infrared fluorogen and fluorescent activating proteins for in vivo imaging and live-cell biosensing
EP3019559A4 (en) 2013-08-22 2017-04-05 Sony Corporation Water soluble fluorescent or colored dyes and methods for their use
EP3702783A1 (en) * 2013-12-11 2020-09-02 Analiza, Inc. Methods for determining cells such as circulating cancer or fetal cells
US20150160246A1 (en) 2013-12-11 2015-06-11 Analiza, Inc. Devices and methods for determining and/or isolating cells such as circulating cancer or fetal cells
US9709556B2 (en) 2013-12-11 2017-07-18 Analiza, Inc. Devices and methods for determining and/or isolating circulating cancer cells
EP2889299A1 (en) * 2013-12-24 2015-07-01 Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin Fluorescent red emitting functionalizable pH probes
CN105874012B (zh) * 2014-01-16 2018-06-15 索尼公司 水溶性荧光染料或有色染料
EP3143400B1 (en) * 2014-05-16 2019-03-06 Life Technologies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use
JP6806694B2 (ja) 2015-02-26 2021-01-06 ソニー株式会社 共役基を含む水溶性蛍光染料または有色染料
US11084932B2 (en) 2015-02-26 2021-08-10 Sony Group Corporation Phenylethynylnaphthalene dyes and methods for their use
US10865434B2 (en) * 2015-04-21 2020-12-15 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
KR20180005650A (ko) 2015-05-11 2018-01-16 소니 주식회사 초휘도 이량체성 또는 중합체성 염료
JP6600527B2 (ja) 2015-10-15 2019-10-30 自然免疫制御技術研究組合 貪食能評価方法及び蛍光測定方法
WO2017173348A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Sony Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes with rigid spacing groups
CN114806218A (zh) 2016-04-01 2022-07-29 索尼公司 超亮二聚或多聚染料
CA3019951A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Sony Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes with spacing linker groups
JP2019519490A (ja) 2016-05-10 2019-07-11 ソニー株式会社 ペプチド骨格を有する超明色ポリマー染料
JP7068192B2 (ja) 2016-05-10 2022-05-16 ソニーグループ株式会社 ポリマー染料およびシクロデキストリンを含む組成物、ならびにその使用
BR112018073199A2 (pt) 2016-05-11 2019-04-16 Sony Corporation corantes diméricos ou poliméricos ultrabrilhantes
WO2017214165A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Sony Corporation Ionic polymers comprising fluorescent or colored reporter groups
JP2018018251A (ja) * 2016-07-27 2018-02-01 ファナック株式会社 数値制御装置
US20210032277A1 (en) 2017-10-05 2021-02-04 Sony Corporation Programmable polymeric drugs
KR20200083605A (ko) 2017-11-16 2020-07-08 소니 주식회사 프로그램가능한 중합체성 약물
WO2019182765A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Sony Corporation Use of divalent metals for enhancement of fluorescent signals
CN112119083B (zh) 2018-03-21 2024-05-24 索尼公司 具有连接体基团的聚合串联染料
JP2021529194A (ja) 2018-06-27 2021-10-28 ソニーグループ株式会社 デオキシリボースを含むリンカー基を有するポリマー色素
WO2020018946A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 University Of Washington Systems and methods for accurate optical ph sensing of biofilms
WO2020162335A1 (ja) * 2019-02-05 2020-08-13 株式会社Adeka キサンテン化合物
WO2020205465A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Purdue Research Foundation Ph-dependent composition matters useful for study and diagnosis of alzheimer's disease
WO2021045890A1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 The Regents Of The University Of California Cellular potassium imaging using a ratiometric fluorescent sensor
JP7239904B2 (ja) 2019-09-26 2023-03-15 ソニーグループ株式会社 リンカー基を有するポリマータンデム色素
GB2593878B (en) * 2020-03-31 2024-02-21 Sumitomo Chemical Co Light-emitting marker
CN112939957B (zh) * 2021-02-03 2022-09-23 山西大学 一种苯并吲哚衍生物In-XY1及其合成方法和应用
CN116003448B (zh) * 2022-11-07 2024-06-11 淮阴工学院 一种含吲哚啉多烯键识别Aβ纤维的BODIPY近红外荧光探针及其制备方法
CN115710190A (zh) * 2022-11-16 2023-02-24 常州佳德医药科技有限公司 4-甲氧基-2-氨基-n,n-二甲基苯胺、制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004025259A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Molecular Probes, Inc. Site-specific labeling of affinity tags in fusion proteins

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB320345A (en) * 1928-07-07 1929-10-07 Ici Ltd Process for the manufacture of new xanthen dyes and their use
FR1391547A (fr) * 1963-05-02 1965-03-05 Kodak Pathe Nouveau produit photographique portant une marque d'identification
FR2275461A1 (fr) * 1974-06-18 1976-01-16 Labaz Nouveaux stabilisants des polymeres et copolymeres du chlorure de vinyle
GB1574959A (en) * 1977-04-05 1980-09-10 Lepetit Spa Benzofuran derivatives
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4603209A (en) 1984-09-07 1986-07-29 The Regents Of The University Of California Fluorescent indicator dyes for calcium ions
US4812409A (en) 1986-01-31 1989-03-14 Eastman Kodak Company Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
JPS62216792A (ja) * 1986-03-19 1987-09-24 Mitsubishi Chem Ind Ltd 光学記録媒体
US5627027A (en) 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5569587A (en) 1986-04-18 1996-10-29 Carnegie Mellon University Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes
US5268486A (en) 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US6048982A (en) 1986-04-18 2000-04-11 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US4810636A (en) 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
US4774339A (en) 1987-08-10 1988-09-27 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes
US4945171A (en) * 1987-08-10 1990-07-31 Molecular Probes, Inc. Xanthene dyes having a fused (C) benzo ring
US5049673A (en) 1987-10-30 1991-09-17 The Regents Of The University Of California Fluorescent indicator dyes for calcium working at long wavelengths
JPH01161106A (ja) 1987-12-17 1989-06-23 Hitachi Ltd 電気容量型歪ゲージ
US4849362A (en) 1988-05-19 1989-07-18 Smithkline Beckman Corporation Fluorescent intracellular calcium indicators
JPH0262875A (ja) * 1988-05-23 1990-03-02 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 新規イソインドリン誘導体
US5132432A (en) 1989-09-22 1992-07-21 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive pyrenyloxy sulfonic acid dyes
LU87611A1 (fr) * 1989-10-20 1991-05-07 Oreal Composition tinctoriale pour fibres keratiniques contenant des precurseurs de colorants par oxydation et des coupleurs amino indoliques,procedes de teinture mettant en oeuvre ces compositions et composes nouveaux
US5501980A (en) * 1994-05-20 1996-03-26 Molecular Probes, Inc. Benzazolylcoumarin-based ion indicators
US5227487A (en) 1990-04-16 1993-07-13 Molecular Probes, Inc. Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5453517A (en) 1992-02-25 1995-09-26 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of bapta used to make ion-selective chelators
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5459276A (en) * 1994-05-20 1995-10-17 Molecular Probes, Inc. Benzazolylcoumarin-based ion indicators for heavy metals
US5648270A (en) 1995-02-06 1997-07-15 Molecular Probes, Inc. Methods of sensing with fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles
US5405975A (en) 1993-03-29 1995-04-11 Molecular Probes, Inc. Fluorescent ion-selective diaryldiaza crown ether conjugates
US5714327A (en) 1990-07-19 1998-02-03 Kreatech Diagnostics Platinum-containing compounds, methods for their preparation and applications thereof
US5248782A (en) 1990-12-18 1993-09-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5451343A (en) 1991-05-20 1995-09-19 Spectra Group Limited, Inc. Fluorone and pyronin y derivatives
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5242805A (en) 1991-08-23 1993-09-07 Molecular Probes, Inc. Long wavelength lipophilic fluorogenic glycosidase substrates
EP0603266B1 (en) 1991-08-23 1999-05-12 Molecular Probes, Inc. Use of haloalkyl derivatives of reporter molecules to analyze metabolic activity in cells
JP3093848B2 (ja) * 1991-12-10 2000-10-03 三菱化学株式会社 チアゾ−ル系化合物
EP0552108B1 (en) * 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5278644A (en) 1992-02-03 1994-01-11 Hughes Aircraft Company Pseudo cross-couple for non-linear detectors
US5352803A (en) 1992-03-30 1994-10-04 Abbott Laboratories 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
US5773227A (en) * 1993-06-23 1998-06-30 Molecular Probes, Inc. Bifunctional chelating polysaccharides
US5798276A (en) 1995-06-07 1998-08-25 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
US5847162A (en) 1996-06-27 1998-12-08 The Perkin Elmer Corporation 4, 7-Dichlororhodamine dyes
US6017712A (en) 1996-06-27 2000-01-25 Lee; Linda 4,7-dichlororhodamine dyes
US6080852A (en) 1996-06-27 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlororhodamine dyes
ES2116229B1 (es) * 1996-07-19 1999-03-01 Consejo Superior Investigacion Metodo de diferenciacion bacteriana basado en la determinacion de actividades aminopeptidasicas.
US5846737A (en) 1996-07-26 1998-12-08 Molecular Probes, Inc. Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence
US5696157A (en) 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
EP1000941B1 (en) * 1997-07-02 2003-08-13 Nagano, Testuo Diaminorhodamine derivatives
US6348599B1 (en) 1997-07-28 2002-02-19 Nycomed Amersham Plc Cyanine dyes
JPH1161062A (ja) 1997-08-20 1999-03-05 Oji Paper Co Ltd クラフト粘着テープ
US6130101A (en) 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
JP3983404B2 (ja) 1999-01-13 2007-09-26 本田技研工業株式会社 レーダ搭載車両用ゲート
US6664047B1 (en) 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
US6403807B1 (en) 1999-07-06 2002-06-11 Surromed, Inc. Bridged fluorescent dyes, their preparation and their use in assays
US6441197B1 (en) * 2000-01-20 2002-08-27 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Diaminofluorescein derivative
EP1311487B1 (en) 2000-08-04 2008-11-26 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
US6756231B1 (en) * 2000-08-18 2004-06-29 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Diaminorhodamine derivative
ATE352586T2 (de) 2000-09-29 2007-02-15 Molecular Probes Inc Modifizierte carbocyaninfarbstoffe und deren konjugate
JP2005539243A (ja) * 2002-05-03 2005-12-22 モレキュラー プローブス， インコーポレイテッド リン酸化分子の検出および分離のための組成物および方法
EP1553408A4 (en) * 2002-07-08 2005-08-17 Tetsuo Nagano FLUORESCENT PROBE
US7005518B2 (en) * 2002-10-25 2006-02-28 Li-Cor, Inc. Phthalocyanine dyes
GB0307855D0 (en) * 2003-04-04 2003-05-14 Novartis Ag Organic compounds
TWI351961B (en) 2003-05-16 2011-11-11 Sinphar Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutical composition for enhancing immunity,
EP3305919A1 (en) 2003-06-10 2018-04-11 The Trustees of Boston University Detection methods for disorders of the lung
WO2005013966A1 (ja) * 2003-08-06 2005-02-17 Signal Creation Inc. マクロファージ活性化阻害剤
JP5090731B2 (ja) * 2004-03-04 2012-12-05 哲雄 長野 蛍光プローブ
GB0407836D0 (en) * 2004-04-06 2004-05-12 Univ Cambridge Tech Fluorescent dyes and complexes
CA2577340A1 (en) 2004-08-19 2006-03-02 Blood Cell Storage, Inc. Fluorescent ph detector system and related methods
CN1660783A (zh) * 2004-12-13 2005-08-31 大连理工大学 多酰胺荧光化合物及其在正离子超敏光信号识别中的应用
JP4920192B2 (ja) * 2005-02-28 2012-04-18 パイロットインキ株式会社 可逆熱変色性マイクロカプセル顔料
WO2008076524A2 (en) 2006-10-27 2008-06-26 Life Technologies Corporation Fluorogenic ph sensitive dyes and their method of use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004025259A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Molecular Probes, Inc. Site-specific labeling of affinity tags in fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP2064290A4 (en) 2011-10-05
US20160139158A1 (en) 2016-05-19
WO2008076524A3 (en) 2008-10-16
US9939454B2 (en) 2018-04-10
US20180238912A1 (en) 2018-08-23
EP2064290A2 (en) 2009-06-03
EP2727965B1 (en) 2019-03-06
US11867698B2 (en) 2024-01-09
JP5847257B2 (ja) 2016-01-20
JP5636189B2 (ja) 2014-12-03
EP2727965A1 (en) 2014-05-07
US20130102021A1 (en) 2013-04-25
US20210041465A1 (en) 2021-02-11
EP2064290B1 (en) 2013-10-09
JP2010508295A (ja) 2010-03-18
US20150037834A1 (en) 2015-02-05
US9910051B2 (en) 2018-03-06
US20080274907A1 (en) 2008-11-06
WO2008076524A2 (en) 2008-06-26
US10845373B2 (en) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5847257B2 (ja) 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法
US10253185B2 (en) Fluorogenic pH-sensitive dyes and their methods of use (II)
US10006918B2 (en) Fluorogenic hydrazine-substituted compounds
US20200408739A1 (en) Carbopyronone Compounds Useful as Diagnostic Adjuvants
EP3143400B1 (en) Cell tracking reagents and their methods of use
WO2016116111A1 (en) Substituted acridine-like and xanthenium-like fluorescent dyes
EP1252236A1 (en) Detection reagent
US11952495B1 (en) Fluorogenic pH-sensitive compounds and their methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20150323

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150406

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150619

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150804

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20151109

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151124

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5847257

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250