JP2014523405A - 標的分子精製におけるdna除去法 - Google Patents
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Abstract
Description
DNAは、プロセス溶液の夾雑物であり、治療用タンパク質およびワクチンを含む精製された生物工学生成物の潜在的夾雑物である。世界中の規制機関が、妥当な患者の安全性を保証するために低いDNAレベルを規定している。夾雑DNAは、濾過および精製を含むバイオプロセス操作の効率を妨げる障害となることも、明らかになってきている。DNAはまた、生成物凝集体の形成の原因であり得ることが、最近示唆されている(Gagnon, 2010, Bioprocessing Journal, 9(2) 14-24(非特許文献1))。凝集体は、精製を非常に複雑化し、かつ、除去されない場合は治療を受ける患者の安全性を脅かし得る。
本発明は、標的分子を含む生物学的試料からゲノムDNAを除去する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)該試料由来のゲノムDNAを含む正に荷電した複合体が、陽イオン交換リガンドに結合し、かつ(b)該標的分子が、該陽イオン交換リガンドに実質的に結合しないような条件下で、該試料を該陽イオン交換リガンドに接触させる工程;および、減少した量のゲノムDNAを有する試料を生成するために、該陽イオン交換リガンドに結合した該正に荷電した複合体から該試料を分離する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、該分離する工程の後に、減少した量のゲノムDNAを有する該試料に対して、少なくとももう1つの標的分子精製段階を実施する工程をさらに含む。
(a)試料由来の負に荷電したDNAが、陰イオン交換リガンドに結合し、かつ
(b)標的分子が、該陰イオン交換リガンドに実質的に結合しない
ような条件下で該試料を該陰イオン交換リガンドに接触させ、それにより、該試料中の負に荷電したDNAから該標的分子を分離する工程をさらに含む。
「イオン交換」材料は、非共有結合で結合した対イオンを周囲の溶液の電荷を同様に有するイオンと交換する能力を持つ。「イオン交換リガンド」は、その交換可能な対イオンの電荷に応じて、陽イオン交換リガンドまたは陰イオン交換リガンドと呼ばれる。陽イオン交換材料は混合型(すなわち、陰イオン交換体および陽イオン交換体の混合物)材料を含み得るが、いくつかの態様において、「陽イオン交換」樹脂とは、陽イオン交換リガンドを有するが陰イオン交換リガンドを有さない樹脂または他の材料を指す。同様に、陰イオン交換樹脂は混合型(すなわち、陰イオン交換体および陽イオン交換体の混合物)を含み得るが、いくつかの態様において、「陰イオン交換」樹脂とは、陰イオン交換リガンドを有するが陽イオン交換リガンドを有さない樹脂または他の材料を指す。「イオン交換リガンド」とは、非共有結合で結合した対イオンを交換するイオン交換材料の化学的部分を指す。いくつかの態様において、イオン交換リガンドは、イオン交換クロマトグラフィーにおいて固定相として使用される共有結合で結合した電荷を有する置換体を保有する、高分子量マトリクスに固定化される。あるいは、イオン交換リガンドは、移動性のビーズまたは粒子に連結され得る。ビーズまたは粒子は、所望する通りに、水溶液に可溶性または不溶性であり得る。いくつかの態様において、陽イオン交換体は、粒子、膜、もしくはモノリスなどの固相上に固定化された負電荷を含み得るか、または、天然もしくは合成の可溶性ポリマー上に負電荷を含み得る。
I. 序論
驚くべきことに、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂が生物学的試料中のゲノムDNA夾雑物の除去に有用であることが発見された。ゲノムDNAを除去するための陽イオンクロマトグラフィーの使用は、DNAの負電荷およびDNAを試料から除去するための以前の陰イオン交換の使用から考えると、直感的には正反対である。しかしながら、いくつかの状況では、陰イオン交換が精製標的からのDNAの適した除去には十分ではないかまたは利用可能ではないことが発見されている。DNA/クロマチン複合体は、DNAに結合した正に荷電したクロマチンタンパク質(例えば、ヒストン)のために正電荷を有するので、ゲノムDNAは、いくつかの状況では陰イオン交換樹脂によって完全には除去されないと考えられる。
生物学的試料は、生物学的供給源由来の任意の試料を含み得る。生物学的試料は、生物から得られる様々な試料タイプを包含する。用語は、尿、尿沈降物、血液、唾液、および生物学的起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物もしくはそれに由来する細胞およびその子孫を包含する。用語は、試薬での処理、可溶化、沈降分離、またはある特定の成分の濃縮などにより、獲得後に任意の方法で操作されている試料を包含する。用語は、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的体液、および組織試料、ならびに臨床試料を包含する。
標的分子は、試料中の精製される分子である。標的分子の様々なレベルの精製は、所望する通りに達成され得る。試料中の本質的に任意の標的分子が、本明細書において記載される方法によって精製され得ると考えられる。一般的に、標的分子は、使用される陽イオン交換リガンドに結合しないか、または、タンパク質およびゲノムDNAの正に荷電した複合体の競合的結合のために陽イオン交換リガンドへの結合が十分に妨害されているかのいずれかである。いくつかの態様において、標的分子は、接触させると、陰イオン交換リガンドに結合し、それにより、陰イオン交換を用いたDNAの効率的な除去を妨害すると考えられる。標的分子の例は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、または核酸を含む。
本発明は、正に荷電したタンパク質-DNA複合体が陽イオン交換体に結合するが、標的分子を含む試料の少なくともいくつかの他の成分が、結合されず、従って正に荷電したタンパク質-DNA複合体から分離され得るように、試料を陽イオン交換体、すなわち陽イオン交換リガンドに接触させることを提供する。
陽イオン交換リガンドは、正に荷電したタンパク質-DNA複合体を除去するために、多数の異なるフォーマットにおいて試料に提示されることができる。例えば、いくつかの態様において、例えば、充填カラム中にある、充填床カラム中にある、流動床/膨張床カラム中にある、および/またはバッチ操作の一部であるクロマトグラフィー樹脂に、陽イオン交換リガンドは連結されている。陽イオン交換樹脂は、正に荷電したタンパク質/DNA複合体を除去するために必要とされる任意の寸法のカラム中に充填することができる。特定の適用の必要に応じて、カラムの直径は、例えば、1cm未満から1メートル超までにわたってもよく、かつ、カラムの高さは、1cm未満から30cm超までにわたってもよい。本発明は上記の高さおよび直径に限定されないことが認識されると考えられる。適切なカラムの寸法は、当業者が決定することができる。
正に荷電したタンパク質-DNA複合体の試料からの除去の前または後に、試料中の標的分子をさらに精製することができる。さらなる精製法の例は、親和性クロマトグラフィー(例えば、抗体の精製のためのプロテインA親和性クロマトグラフィーなど)、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー、混合型クロマトグラフィー、沈殿、濾過、結晶化、または相分配を含むが、それらに限定されない。
以下の実施例は、モノクローナルIgMの調製物からのDNAの除去を記載する。収集時の高い細胞死亡率のために、細胞培養上清中にはDNAが高レベルで存在した。DNAが、陰イオン交換リガンドおよびヒドロキシアパタイトにIgMよりも強く結合し、従って大部分の有効な結合能力を消費したため、DNAの存在により、陰イオン交換またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのいずれかによるIgMの効率的な捕捉が妨げられた。
本実施例は、固相陽イオン交換体を、大量の細胞培養上清に直接添加し、適切な時間インキュベーションすることができ、かつ、その後、濾過により結合したDNAと共に除去することができることを実証している。具体的には、リン酸緩衝生理食塩水であらかじめ平衡化したDowex 50WX8 2-00-400メッシュを、2% Dowexの体積比で細胞培養上清(生理学的条件)に添加した。混合物を、一晩冷所で撹拌した。混合物をその後、Dowexおよび結合したDNAを除去するために、0.22μmのフィルターで濾過した。
以下の仮説実施例は、正に荷電したDNA複合体を除去するためのIgGモノクローナル抗体の陽イオン交換カラムへのアプライを記載する。モノクローナルIgGを含有する細胞上清は、通例、DNA含量を減少させるために陰イオン交換材料で処理される。大部分のIgGモノクローナル抗体は、生理学的条件下で陽イオン交換体に結合しない。正に荷電したDNA複合体が陽イオン交換リガンドに結合し、かつ標的IgGがカラムを通過する条件下で、細胞上清を陽イオン交換リガンドに(例えば、クロマトグラフィーカラム中で)接触させる。任意で、混合物をまた、陰イオン交換体と組み合わせて、すなわち、陽イオン交換段階の前または後のいずれかに、適用し、それにより、正に荷電した複合体および負に荷電した核酸の両方を除去することもできる。
以下の仮説実施例は、抗体を含有する活性哺乳動物または非哺乳動物(例えば、細菌、酵母など)細胞培養物への適用を記載する。DNAが瀕死の細胞によって排出されるため、DNAを非常に効果的に除去するように、ビーズに連結された陽イオン交換リガンドが生細胞培養物にアプライされる。細胞は、負に荷電しているため、陽イオン交換体により反発され、かつ、損なわれない。反対に、培養物中の正に荷電したDNA(例えば、溶解した細胞または死細胞由来)は、陽イオン交換リガンドに結合する。活性培養物からDNAを隔離することによって、そうしなければDNAの周囲の核形成により引き起こされる抗体(または他の標的細胞生成物)凝集体形成を妨害する可能性がもたらされる。
Claims (23)
- 標的分子を含む生物学的試料からゲノムDNAを除去する方法であって、
(a)該試料由来のゲノムDNAを含む正に荷電した複合体が、陽イオン交換リガンドに結合し、かつ
(b)該標的分子が、該陽イオン交換リガンドに実質的に結合しない
ような条件下で、該試料を該陽イオン交換リガンドに接触させる工程;
減少した量のゲノムDNAを有する試料を生成するために、該陽イオン交換リガンドに結合した該正に荷電した複合体から該試料を分離する工程;および
減少した量のゲノムDNAを有する該試料に対して、少なくとももう1つの標的分子精製段階を実施する工程
を含む、方法。 - 前記標的分子がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 前記タンパク質が、細胞中において発現された異種タンパク質である、請求項2記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体である、請求項2記載の方法。
- 前記抗体がIgG抗体およびIgM抗体から選択される、請求項4記載の方法。
- 前記標的分子が核酸である、請求項1記載の方法。
- 前記核酸がプラスミドである、請求項6記載の方法。
- 前記陽イオン交換リガンドが、カルボン酸部分、またはスルホン酸部分、またリン酸部分を含む、請求項1記載の方法。
- 前記陽イオン交換リガンドが固体支持体に結合している、請求項1記載の方法。
- 前記固体支持体がクロマトグラフィーカラムである、請求項9記載の方法。
- 前記固体支持体がビーズまたは粒子である、請求項9記載の方法。
- 前記陽イオン交換リガンドが可溶性ポリマーに結合している、請求項1記載の方法。
- 可溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロースまたはデキストラン硫酸を含む、請求項12記載の方法。
- 前記生物学的試料が細胞培養物由来である、請求項1記載の方法。
- 前記生物学的試料が細胞培養上清である、請求項14記載の方法。
- 前記細胞培養物が、哺乳動物細胞培養物、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、および昆虫細胞培養物からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記生物学的試料が細胞培養物である、請求項1記載の方法。
- 前記陽イオン交換リガンドがビーズまたは粒子に連結され、かつ、前記細胞培養物における該ビーズまたは該粒子の存在により標的分子の凝集が減少する、請求項17記載の方法。
- 前記細胞培養物中の細胞が前記標的分子を分泌する、請求項17記載の方法。
- 前記接触させる工程の前または後のいずれかに、
(a)前記試料由来の負に荷電したDNAが、陰イオン交換リガンドに結合し、かつ
(b)前記標的分子が、該陰イオン交換リガンドに実質的に結合しない
ような条件下で該試料を該陰イオン交換リガンドに接触させ、それにより、該試料中の負に荷電したDNAから該標的分子を分離する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記標的分子精製段階が、減少した量のゲノムDNAを有する前記試料を、陽イオン交換リガンド、陰イオン交換リガンド、混合型リガンド、親和性作用物質、または疎水性リガンドに接触させることを含む、請求項1または20記載の方法。
- 前記標的分子精製段階が、
減少したゲノムDNAを有する前記試料を、陽イオン交換リガンド、陰イオン交換リガンド、混合型リガンド、親和性作用物質、または疎水性リガンドに、該標的分子が該リガンドまたは該作用物質に結合するように接触させること;
該リガンドから該試料の他の成分を洗い流すこと;および
該リガンドまたは該作用物質から該標的分子を溶出すること
を含む、請求項21記載の方法。 - 前記標的分子精製段階が、減少した量のゲノムDNAを有する前記試料を、陽イオン交換リガンド、陰イオン交換リガンド、混合型リガンド、親和性作用物質、または疎水性リガンドに、該標的分子は該リガンドまたは該作用物質に実質的に結合しないが該試料の別の成分は該作用物質または該リガンドに結合するようなフロースルーモードで接触させることを含む、請求項21記載の方法。
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