JP2014519512A - Cetp断片 - Google Patents
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Abstract
Description
ワクチン
該ペプチドをヘテロ二機能性リンカーGMBS(4-マレイミド酪酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を介してKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)と結合させた。
5匹のBalb/cマウスの皮下に免疫した。マウスに不断給餌および給水し、12時間の明暗周期下においた。実験開始時のマウスの年齢は通常8〜10週間であった。
マウスに、KLHと結合させた正味ペプチド15μgをアジュバントとしてアラムに吸着させたもの総容量1mlを2週間間隔で3回、s.c.経路で注射した。
最終注射から約2週間後に血液を採取した。
該ワクチンの免疫原性を測定するために、96ウェルNunc-Maxisorbプレートを0.1M NaHCO3中ウシ血清アルブミン(BSA)(pH 9.2〜9.4)と結合させた各ペプチド1μMでコートした。無関係なペプチドを陰性コントロールに用いた。KLHを陽性コントロールとして含め、1μg/mlの濃度でコートした。非特異的結合を、ブロッキング緩衝液(PBS中5%BSA)とインキュベーションしてブロックした。適切な血清希釈をウェルに加え、1:2倍に連続希釈し、37℃で約1時間インキュベーションした。すべてのELISAプレート上で標準血清を内部コントロールとして含めた。結合した抗体をビオチン化ヤギ抗マウスIgG、次いでストレプトアビジン結合ホースラディッシュパーオキシダーゼとインキュベーションして検出した。基質としてABTSを加え、Microwellプレートリーダーを用いて吸光度(OD)405nmで測定した。力価を、アッセイでODmaxの50%に達する血清希釈で定義した。
「ペプチドELISA」の項に記載したプロトコールを用いて、ワクチネーションにより誘導された抗体のN末端にGSTが融合した組換え発現ヒトCETP(「GST-CETP」)と結合する能力を測定した。
CETP活性は、Roar CETP活性アッセイキット(RB-CETP;Roar Biomedical)を用い、製造業者が提供するプロトコールにしたがって蛍光標識した基質の変換を測定することにより測定した。マウスは内因性CETP活性を持たないので、このプロトコールの修飾を導入した。ヒト血清をCETP供給源として用い、受容体粒子および供与体粒子(CETP活性アッセイキットの成分)とともに、ワクチネーションしたマウス由来の血清の同量と混合した。
CETP阻害抗体を含むマウス血清は本アッセイにおけるシグナルの低下をもたらす。無関係のペプチドを注射したマウス由来の血清を陰性コントロールとして用いた。
モノクローナル抗体による阻害を試験するために、示した量の精製抗体をヒト血清に加えた。
モノクローナル抗体:
Balb/cマウスを、KLH結合正味ペプチド配列番号10 15μgでワクチネーションした。アルヒドロゲルをアジュバントとして用いた。高抗CETPタンパク質力価のマウスの脾臓細胞を標準的技術によりマウスミエローマ細胞と融合させた(Koehler、G.およびMilstein、C. Nature. 256(1975): 495-497に記載のプロトコール)。ハイブリドーマクローンの、注射したペプチドおよび組換え発現ヒトCETPタンパク質を特異的に認識する抗体の産生を標準的ELISAで試験した。選択したクローンを培養し、標準的プロトコールに従ってモノクローナル抗体を組織培養上清から精製した。
RNAをハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNAをオリゴ(dT)プライマーを用いる逆転写により作製した。次に、モノクローナル抗体DNAのVHおよびVL両領域を増幅する可変ドメインプライマーを用いるPCR反応を行った。VHおよびVL産物を抽出し、ゲル精製し、シーケンシングベクター中にクローンし、次いでTOP10中に形質転換した。選択したクローンを採取し、シーケンシングで分析した。
クローンCJ7-6-B7、5/C7-6-C8、12/B3-5-B11、およびBTS4-1。
ヒトCETPタンパク質ELISAおよびCETP活性阻害は上記のごとく行った。
モノクローナル抗体によるヒトCETPタンパク質の認識(図5参照)。
これらのデータは、4つすべての抗体がコートされたCETPタンパク質を認識することを示した。ELISAによる力価測定は、すべての抗体について同量で出発した(2mg/ml希釈)。予期したように、モノクローナル抗体はそのELISAシグナルが異なり、これはコートしたタンパク質に対するアフィニティが異なることにより説明されるかもしれない。
モノクローナル抗体によるヒト血清中のCETP活性の阻害(図6参照)。
これらのデータは、4つすべての抗体がCETPと結合するだけでなく、CETP活性を阻害することを示した。加える抗体の量が多くなると、CETP活性はより低下する。
CJ7-6-B7
重鎖:
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA
軽鎖:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK
重鎖:
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK
重鎖:
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖:
DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK
重鎖:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS
軽鎖:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK
Claims (15)
- アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)由来の6〜20アミノ酸残基からなるペプチドであって、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含むペプチド。
- 請求項1記載のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸配列が、YTTAWWLGIDQS(配列番号1)、YGYTTAWWLGIDQSID(配列番号7)、TTAWWLGIDQS(配列番号8)、TAWWLGIDQS(配列番号9)、AWWLGIDQS(配列番号10)、WWLGIDQS(配列番号11)、YTTAWWLGIDQ(配列番号13)、YTTAWWLGID(配列番号14)、TTAWWLGIDQ(配列番号18)、およびTTAWWLGID(配列番号19)からなる群から選ばれることを特徴とする、ペプチド。
- 請求項1または2記載のペプチドであって、そのCおよび/またはN末端にシステイン残基を含むことを特徴とする、ペプチド。
- アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するために用いる請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- アテローム性動脈硬化症関連疾患が、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれることを特徴とする請求項4記載のペプチド。
- 0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg/免疫の量で個体に投与することを特徴とする請求項4または5記載のペプチド。
- 少なくとも1の、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチドを含むワクチン。
- 少なくとも1のペプチドが、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)と結合または融合していることを特徴とする請求項7記載のワクチン。
- 少なくとも1のペプチドが皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化されることを特徴とする請求項7または8に記載のワクチン。
- 少なくとも1のペプチドが、アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムと共に製剤化されることを特徴とする請求項7〜9のいずれかに記載のワクチン。
- 0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg/免疫の量の少なくとも1のペプチドを含むことを特徴とする請求項7〜10のいずれかに記載のワクチン。
- アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するために用いる請求項7〜11のいずれかに記載のワクチン。
- アテローム性動脈硬化症関連疾患が、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれることを特徴とする請求項12記載のワクチン。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のペプチドと結合する抗体。
- 重鎖可変(「VH」)領域および抗体軽鎖可変(「VL」)領域を含み、各領域が相補性決定領域を含むことを特徴とする請求項14記載の抗体であって、
VH領域の相補性決定領域が、アミノ酸配列NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(配列番号104)、EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号105)、DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号106)、またはQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(配列番号107)の1またはそれ以上を有し、
該VL領域が、アミノ酸配列DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(配列番号108)、QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(配列番号109)、DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(配列番号110)、またはDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(配列番号111)の1またはそれ以上を有する、抗体。
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