MX2013009521A - Fragmentos de proteina de transferencia de esteres de colesterol (cetp). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23), en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24) j anticuerpos que se unen a estos péptidos.

Description

FRAGMENTOS DE PROTEINA DE TRANSFERENCIA DE ESTERES COLESTEROL (CETP) Descripción de la Invención La presente invención se refiere a péptidos que son capaces de tener influencia en la actividad in vivo de la proteina de transferencia de ásteres de colesterol (CETP, por sus siglas en inglés) .

Las enfermedades asociadas con la aterosclerosis , tal como enfermedad cardiovascular (CVD, por sus siglas en inglés) asi como ataque y enfermedad por oclusión arterial periférica, están entre las causas principales de muerte en los Estados Unidos de América, Europa y en gran parte de Asia. En comparación al año 1990, la mortalidad por la CVD se habrá incrementado por 90 % en 2020.

Se mantienen varios factores de riesgo como los responsables de formar lesiones ateroscleróticas . Son especialmente importantes, a este respecto, los perfiles en circulación de las lipoproteinas, la hipertensión arterial y el abuso de nicotina.

En estudios epidemiológicos comprensivos, se puede demostrar una correlación positiva entre el nivel del colesterol en suero y la ocurrencia de enfermedad cardiaca coronaria. Los altos niveles de- colesterol de Lipoproteina de baja Densidad (LDLc, por sus siglas en inglés) constituyen un Ref.243072 alto riesgo cardiovascular, y correlacionan directamente con riesgo incrementado de aterosclerosis . Comúnmente, se usan estatinas como inhibidores de HMG-CoA-Reductasa y están reduciendo exitosamente los niveles en circulación de LDLc. sin embargo, a pesar de la reducción de eventos coronarios debido a tratamiento agresivo con estatinas, permanece como un reto el riesgo cardiovascular residual considerable. De esta manera, se necesitan urgentemente nuevos productos terapéuticos .

Además del nivel del colesterol LDL, también el nivel del colesterol de Lipoproteina de Alta Densidad (HDLc, por sus siglas en inglés) protector de los vasos, juega un papel importante cuando se estima el perfil de riesgo para enfermedades cardiovasculares. Los estudios epidemiológicos han demostrado una relación inversa entre los niveles de HDLc y la aterosclerosis. Los niveles de HDLc son fuertes predictores, independientes de los valores de LDLc. Por lo tanto, se asume que los niveles de HDLc tienen efectos ateroprotectores . Por lo tanto, la elevación de los niveles de HDLc es un objetivo principal y un objetivo adicional.

La monoterapia con estatinas no aumenta de manera eficaz los niveles de HDLc, no es suficiente el tratamiento y prevención de la aterosclerosis con este tipo de compuestos farmacológicos. Las opciones actuales para aumentar los niveles de HDLc son fibratos y niacina. Especialmente es efectiva la niacina, sin embargo, su uso se limita por los efectos adversos que conducen a bajo acatamiento de los pacientes. Se necesita de manera urgente un método eficaz y seguro para aumentar los niveles de HDLc para complementar la reducción de LDL pos las estatinas. A este respecto, es un objetivo atractivo a la inhibición de la CETP como monoterapia o como una terapia adicional.

La proteina de transferencia de ésteres de colesterol (CETP, por sus siglas en inglés) es una glicoproteina de plasma que es responsable de la transferencia de lipidos neutrales, incluyendo éster de colesterilo y triglicérido (TG) , entre las lipoproteinas . Los ésteres de colesterilo de la HDL ateroprotectora se transfieren a la apolipoproteina pro-aterogénica (apo) lipoproteina B (LDL y VLDL) en intercambio por TG. Esto conduce a menores niveles de HDL y aumenta los niveles de LDL y VLDL.

Se asume que la CETP, más probablemente que depende del fondo metabólico, es un objetivo terapéutico valioso para el objetivo de incrementar el nivel en plasma de HDL.

Muchas especies no tienen CETP. En especies con susceptibilidad a la aterosclerosis, tal como conejos y ' hombres , es alta la actividad de CETP. Otros que son resistentes a la aterosclerosis no poseen la CETP y tienen altos niveles de HDLc.

En experimentos animales con conejos y hámsteres, la inhibición transciente de CETP con anticuerpos monoclonales anti-CETP, oligonucleótidos antisentido o inhibidores de CETP conduce a un incremento de los niveles de HDL.

Se han descrito varias clases de inhibidores de CETP, algunos de los cuales están ya en ensayos clínicos avanzados (por ejemplo dalce-trapib (Stein EA, Eur Heart J. 31(4) (2010): 480-8) anacetrapib (Cannon CP, N Engl J Med. 363(25) (2010): 2406-15 y torcetrapib (Nissen SE, N Engl J Med. 356(13) (2007 ): 1304-16) .

En US 5,512,548 y WO 93/011782 se describen polipéptidos y sus análogos que son capaces de inhibir la CETP que cataliza la transferencia de ésteres de colesterol desde HDL a VLDL y LDL, y por lo tanto, tienen actividad anti-aterosclerótica si se administran a un paciente. De acuerdo a estos documentos, este inhibidor polipeptídico de CETP se deriva de apoC-I de varias fuentes, en donde especialmente los fragmentos N-terminales hasta el aminoácido 36 se han identificado como inhibidores de CETP.

También, en US 5,880,095 A, se describe un péptido que se une a CETP que es capaz de inhibir la actividad de CETP en un individuo. La proteína inhibitoria de CETP comprende un fragmento N-terminal de apoC-III porcina.

En US 2006/0276400 y WO 96/034888, se describen péptidos que se derivan de CETP y comprenden epítopos de células T y/o de células B. Estos péptidos son capaces de inducir in vivo la formación de anticuerpos específicos de CETP.

En US 2004/0087481 y US 6, 410, 022 Bl, se describen péptidos que, debido a la inducción de una respuesta inmunitaria especifica a CETP, se pueden usar para el tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares, tal como por ejemplo, aterosclerosis . Estos péptidos comprenden un epítopo de células T auxiliares que no se deriva de CETP, y al menos un epítopo de células B que viene de la CETP y se puede derivar directamente de esta última. El epítopo de células T auxiliar se deriva ventajosamente del toxoide de tétano y se une covalentemente al menos un epítopo de células B de la CETP. Al usar un epítopo de células T auxiliares que es extraño al organismo, llega a ser posible inducir a anticuerpos en el cuerpo de un individuo, anticuerpos que se dirigen contra aquella porción peptídica que consiste de al menos un epítopo de células B de CETP.

En WO 2006/029982, se describen mimotopos de CETP que se van a usar para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de aterosclerosis.

Han habido ya sugerencias para un planteamiento de vacuna con respecto a la CETP. Se han tratado conejos con una vacuna que contuvo un péptido derivado del C-terminal de CETP como un antígeno. Los conejos inmunizados tienen una actividad reducida de CETP y niveles alterados de lipoproteínas con valores incrementados de HDL y valores reducidos de LDL. Sin embargo, los animales de prueba, tratados, del modelo de aterosclerosis también mostraron lesiones ateroscleróticas reducidas en comparación con los animales de control (Rittershaus CW, Arterioscler Thromb Vase Biol 20 (2000) : 2106-12) .

Los resultados de un estudio clínico de fase II con la vacuna CETi-1, que se llevó a cabo por la compañía biotecnológica Americana Avant, se publicaron (BioCentury Extra For Wednesday, 22 de Octubre del 2003) . En este estudio de fase II, tal como en el estudio de fase I precedente, se probó un perfil de seguridad muy bueno sin ningún efecto secundario cuestionable, permitiendo que se llegara a la conclusión que no se van a esperar efectos secundarios de un planteamiento de vacunación anti-CETP. Con respecto a la eficiencia, sin embargo, la vacuna de Avant fue decepcionante puesto que no conduce a niveles incrementados de · HDL significativamente mejores que aquellos logrados por un tratamiento con placebo.

Es un objeto de la presente invención proporcionar medios y métodos para reducir la actividad de CETP en un individuo.

La presente invención se refiere a un péptido que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23), en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24).

De manera sorprendente, resulta que los péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos WWLGID son capaces de inducir en un mamífero, en particular en ratón, anticuerpos dirigidos a CETP. Estos anticuerpos son capaces de unirse a CETP y además son reductores de la actividad de la proteina. Es bien conocido que en mamíferos que tienen actividad de CETP, la reducción de esta actividad, por ejemplo, por vacunación (Thomas et al, Human Vacunas 5(2009): 79-84) o inhibidores de molécula pequeña (Luscher et al., Eur Heart J 33(2012): 857-865; Krauss et al., J Lipid Res 53(2012): 540-547) conduce a un incremento de los niveles de HDL. El incremento de los niveles de HDL en un mamífero conduce a un alivio de la aterosclerosis y otras enfermedades asociadas con aterosclerosis, en particular enfermedades cardiovasculares .

Los péptidos de la presente invención que comprenden la secuencia de aminoácido WWLGID se derivan del péptido que tienen la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23) que es un fragmento de CETP humana (Protein Data Bank Acceso No. 20BD_A GI : 126031487). El péptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 23 comprende los residuos de aminoácido 92 a 121 de aminoácido de la proteina CETP madura. Este fragmento de la proteina CETP y variantes truncadas del mismo que comprenden la secuencia de aminoácidos WWLGID inducen, como se menciona antes, la formación de anticuerpos que se unen específicamente a CETP. Sin embargo, otros fragmentos derivados de CETP incluyendo los residuos de aminoácido 47 a 55, 152 a 165, 290 a 300, 300 a 316 y 403 a 415 de la proteína CETP madura, aunque están presentes en la superficie de la proteína CETP de longitud completa, no conducen a la formación de anticuerpos dirigidos a (es decir que se unen a) la proteína CETP, aunque la administración de estos fragmentos son mamífero induce la formación de anticuerpos específicos del fragmento. Esto es sorprendente puesto que una persona experta en la técnica esperaría obviamente que los fragmentos de CETP expuestos en la superficie de la proteína CETP serían necesarios para inducir la formación de anticuerpos dirigidos a la proteína CETP.

Es bien conocido en la técnica que los péptidos más largos muestran una mayor probabilidad de comprender uno o más epítopos de células T que no se desean en esta vacuna. La activación de epítopos (CD4 y CD8) de células T citotóxicas conduciría a la inducción de células T autoreactivas induciendo eventos adversos (AE, por sus siglas en inglés) indeseados. Por lo tanto, el experto en la técnica, a fin de evitar epitopos indeseados en una vacuna, usaría péptidos como antígenos que son tan cortos como sea posible a fin de inducir una respuesta inmunitaria, humoral, específica al antígeno. Por lo tanto, se prefieren péptidos más cortos, además del hecho que los péptidos más cortos pueden ser sintetizados químicamente de forma más fácil.

En la WO 02/098915, se describen polipéptidos de al menos 100 aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 23 de la presente invención. Los polipéptidos de la WO 02/098915 se usan para producir anticuerpos dirigidos a CETP. Debido a la longitud de los péptidos descritos en la WO 02/098915 también se inducen anticuerpos que pueden no ser útiles para tratar o prevenir la aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis debido a que esos anticuerpos pueden ser específicos para partes de la CETP no pertinentes para su modo de acción.

Como se usa en la presente, el término "péptido" se refiere a una molécula polimérica que tiene al menos 6 residuos de aminoácido que se enlazan entre sí por enlaces peptídicos.

El término "derivado de", como se usa en el contexto de los péptidos de la presente invención, significa que los péptidos de la presente invención son fragmentos del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 23. Por lo tanto, el término "derivado de" se puede usar de manera indistinta con "que es un fragmento de".

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el péptido que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGI DQSIDFEI DSAI (SEQ ID No. 23) puede comprender o consistir de 6 a 16 residuos de aminoácido.

De acuerdo a una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el péptido comprende de 8 a 20, de manera preferente 8 a 16, residuos de aminoácido. Si los péptidos de la presente invención comprenden un residuo C- y/o N-terminal de cisteina, el péptido puede comprender de 9 a 21, de manera preferente 9 a 17, o 10 a 22, de manera preferente 10 a 18, residuos de aminoácido.

En caso que el péptido de la presente invención comprende al menos 8 residuos consecutivos de aminoácido de la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 23, el péptido comprende de manera de manera preferente o consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 18 y/o SEQ ID No. 19.

De acuerdo a otra modalidad preferida de la presente invención la secuencia de aminoácidos del péptido se selecciona del grupo que consiste de YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGI DQSI D (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) y TTAW LGID (SEQ ID No. 19), particularmente preferida del grupo que consiste de TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), A WLGIDQS (SEQ ID No. 10) y WWLGIDQS (SEQ ID No. 11) .

Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar químicamente por métodos que son bien conocidos en la técnica. Por supuesto, también es posible producir los péptidos de la presente invención usando métodos recombinantes . -Los péptidos se pueden producir en microorganismos tal como bacterias, levadura u hongos, en células eucarióticas tal tal células mamíferas o insectiles, en o en un vector de virus recombinante tal como adenovirus, virus de viruela, virus de herpes, virus selvático de Simliki, baculovirus, bacteriófago, virus sindbis o virus sen-dai. Las bacterias adecuadas para producir los péptidos incluyen E. coli, B. subtilis otra bacteria que sea capaz de expresar estos péptidos. Las células adecuadas de levadura para expresar los péptidos de la presente invención incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Candida, Pichiapastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar los péptidos. En la técnica son bien conocidos los medios y métodos correspondientes. En la técnica son bien conocidos también los métodos para aislar y purificar los péptidos producidos de forma recombinante, e incluyen, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.

Para facilitar el aislamiento de los péptidos de la presente invención, se pueden producir polipéptidos de fusión en donde los péptidos se fusionan de manera transduccional (enlazan covalentemente) a una polipéptido heterólogo que permite el aislamiento por cromatografía por afinidad. Los polipéptidos heterólogos típicos son His-Tag (por ejemplo His6; 6 residuos de histidina) , GST-Tag (Glutationa-S-transferasa) etc. El polipéptido* y fusión facilita no solo la purificación de los péptidos sino también puede impedir la degradación de los péptidos durante los pasos de purificación. Si se desea remover el polipéptido heterólogo después de la purificación, el polipéptido puede comprender un sitio de escisión en la unión entre el péptido y el polipéptido heterólogo. El sitio de escisión puede consistir de una secuencia de aminoácidos que se escinde con una enzima específica para la secuencia de aminoácidos en el sitio (por ejemplo proteasas) .

Los péptidos de la presente invención también pueden comprender en su N- y/o C-terminal un residuo de cisteína unido a estos.

La provisión de un residuo de cisteína en el N- y/o C-terminal de un péptido puede facilitar su conjugación a un portador y/o puede mejorar la inmunogenicidad del péptido. Si se adiciona un residuo de la C- y/o N-terminal de los péptidos de la presente invención, el número de residuos de aminoácido mencionados en la presente se incrementa obviamente por 1 o 2 residuos de aminoácido. Por lo tanto, el péptido que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23), en donde el péptido compren la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24), puede consistir de 7 a 21 o 8 a 22 residuos de aminoácido .

Los péptidos particularmente preferidos de la presente invención que tienen un residuo de cisteina C- o N-terminal se seleccionan del grupo que consiste de C-YTTAWWLGIDQS , ' C-YGYTTAWWLGIDQSID, C-TTAWWLGI DQS , C- TAWWLGIDQS, C-AWWLGIDQS, C-WWLGIDQS, C-YTTAWWLGIDQ, C-YTTAWWLGID, C-TTAWWLGIDQ y TTAWWLGID-C.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el péptido se usa para prevenir y/o tratar aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis .

Como se resume anteriormente, los péptidos de la presente invención son capaces de inducir la formación de anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a CETP particularmente presente en humanos. La unión de estos anticuerpos a CETP conduce a una reducción de la actividad de CETP in vivo. Como una consecuencia de esto, se incrementa el nivel de HDL.

La enfermedad asociada con aterosclerosis se selecciona de manera preferente del grupo que consiste de enfermedad oclusiva arterial periférica, enfermedad cardíaca coronaria, ataque e insulto cerebral apopléctico.

El término - "enfermedades asociadas con aterosclerosis" se refiere a enfermedades que son una consecuencia de la aterosclerosis. Estas enfermedades incluyen, entre otras, enfermedad oclusiva arterial periférica, enfermedad cardíaca coronaria e insulto cerebral apopléctico (ver, por ejemplo Steinberg D., J. Lipid Res. 46 (2005): 179-190; Steinberg D et al., J. Lipid Res. 47 (2006): 1339-1351) .

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el péptido se administra a un individuo en una cantidad de 0.5 a 500 µq, de manera preferente 1 a 100 g, por inmunización. Sin embargo, el péptido de la presente invención se puede administrar de manera alternativa a un individuo en una cantidad de 0.1 ng a 10 mg, de manera preferente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 300 pg/kg de peso corporal.

La cantidad de péptidos que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual, variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración. La dosis de la vacuna puede variar de acuerdo a factores tal como el estado de la enfermedad, edad, género y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosis se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima, por ejemplo, se puede administrar diariamente varias dosis divididas o la dosis se puede reducir en proporción como se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La dosis de la vacuna también se puede variar para proporcionar una respuesta preventiva, óptima de la dosis dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, los péptidos y la vacuna de la presente invención se pueden administrar a un individuo en intervalos de varios días, una o dos' semanas o meses dependiendo siempre del nivel de anticuerpos dirigidos a CETP.

En una modalidad preferida de la presente invención el péptido/vacuna se aplica entre 2 a 10, de manera preferente entre 2 y 7, de manera aún más preferente hasta 5 y de mucho más preferente hasta 3 veces. En una modalidad particularmente ' preferida, el intervalo de tiempo entre las vacunaciones subsiguientes eligen que sea entre 2 semanas y 5 años o más, de manera preferente entre 1 mes y hasta 3 años. De manera más preferente entre 2 meses y 1.5 años. La administración repetida del péptido/vacuna de la presente invención puede aumentar al máximo el efecto final de una vacunación terapéutica.

Otro aspecto de la presente invención se refiere. a una vacuna que comprende al menos un péptido como se define anteriormente que comprende 6 a 30 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23), en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24) .

La vacuna de la presente invención puede comprender uno o más, de manera preferente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, de los péptidos seleccionados del grupo que consiste de YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGIDQSID (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) y TTAWWLGID (SEQ ID No. 19).

Las combinaciones particularmente preferidas de péptidos incluyen: SEQ ID No. 10 y 11; SEQ ID No. 8 y 9; SEQ ID No. 8 y 10; SEQ ID No. 8 y 11; SEQ ID No. 9 -y 10; SEQ ID No. 9 y 11; SEQ ID No. 8, 9 y 10; SEQ ID No. 8, 9, y 11; SEQ ID No. 8, 9, 10 y 11; SEQ ID No. 10, 11 y 18; SEQ ID No. 8, 9 y 18; SEQ ID No. 8, 10 y 18; SEQ ID No. 8, 11 y 18; SEQ ID No. 9, 10 y 18; SEQ ID No. 9, 11 y 18; SEQ ID No. 8, 9, 10 y 18; SEQ ID No. 8, 9, 11 y 18; SEQ ID No. 8, 9, 10, 11 y 18; SEQ ID No. 8 y 18; SEQ ID No. 9 y 18; SEQ ID No. 10 y 18; SEQ ID No. 11 y 18.

La vacuna de la presente invención también puede comprender otros fragmentos peptídicos de CETP o variantes de los mismos o cualquier otro péptido que sea capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos a CETP, particularmente CETP humana. Particularmente adecuados son los péptidos descritos en WO 2009/021254. Los péptidos descritos en la misma tienen la secuencia de aminoácidos FX8 (F)o PX9HX10X11X12 DX2X3X4X5X6X7 en donde X8 se selecciona del grupo que consiste de G, A, F, Y y K, X9 se selecciona del grupo que consiste de E, Y, A, Q, K y S, Xi0 se selecciona- del grupo que consiste de H, V, L, F y I, Xn se selecciona del grupo que consiste de L, W, S, I, F y Y, X12 es V, T, F o I, X2 es un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de F, A, W, R, S, L, Q, ' V y , X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de L, A, S, W, E, R, I y H, X4 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q, A, H, D, K, R, S ay E, X5 es S o Y, X6, es L, A o I, X7 es S, N o T, y o es 0 o 1. Las combinaciones preferidas comprenden los péptidos de la presente invención y uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFLQSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS , FGAPEHLLVDFLQSLS , FGFAEHLLVDFLQSLS , FGFPAHLLVDFLQSLS , FGFPEALLVDFLQSLS , FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHLAVDFLQSLS , FGFPEHLLADFLQSLS , FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS', FGFPEHLLVDFAQSLS , FGFPEHLLVDFLASLS , FGFPEHLLVDFLQALS , FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, FGFPGHLIWDSLHSLS, FGFPYHHLVDQLHSLS , FGFPYHVQVDVLQSLS , FGFPSHHLQDSLQSLS , FGFPLHFRSDRIQSLS, FGFPKHLYADMSQSLS, FGFPAHLSRDLRQSLS, FGFPFHFAQDS QSLS , FGFPQHLTTDRAQSLS , FGFPQHLTTDWAQSLS , FGFPQHLTTDRLQSLS , FGFPQHLTTDWLQSLS , ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLI I DRAQSLS, FGFPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLI IDWAQSLS , FGFPSHLIID LQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS , FGFPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS , FGFPAHVSI DWLQYLS , FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT , FGFPAHVSIDWLQSLY, FAFPAHVSI DWLQALA, FGFPAHVSI DRAQSLS , FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS , FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHI IIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS , FGFPAHVYI DWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSAD LQSLS , FGFPAHVWI DWLQSLS , FGFPAHVFI DWLQSLN , FGFPAHFSID LQSLS , FGFPAHVSFDWLQSLS , FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTD LQSLS , FGFPKHLLVDFLQSLS , FGFPAHVSI DWSQSLS , FGFPAHVSIDFSQSLS, FGFPSHIIIDWLQSLS, FGFPSHLI IEWLQSLS, FAFPAHVFIDWLQSLS , FGFPAHVFI DWLQALS", FGFPAHVFIDWLQSLA, FAFPAHVFIDWLQALA, FGFPEHLFVDFLQSLS , FGFPAHVHI DWLQSLS, FGFPAHVPI DWLQSLS, FGFPSHLFIDWAQSLS, FGFPAHVYIDWLQ y FGFPAHVFIDWLQ.

La vacuna de la presente invención también puede comprender antigenos derivados de otras proteínas que también están comprendidas eni la regulación de los niveles de LDL y/o HDL dentro del cuerpo humano. Por ejemplo, los fragmentos de CETP de la presente invención se pueden combinar con epitopos derivados de PCSK9 (pro-proteina-convertasa subtilisina/kexina tipo 9) como se describe en WO 2008/125623, WO 2010/057242 y WO 2011/027257.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el por lo menos un péptido se acopla o fusiona a un portador farmacéuticamente aceptable, de manera preferente KLH (Hemocianina de lapa californiana) .

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el péptido se acopla o fusiona a un portador farmacéuticamente aceptable, tal como KLH (Hemocianina de Lapa) , toxoide de tétano, proteina de unión a albúmina, antigeno núcleo de hepatitis B, albúmina de suero bovino, un dendrimero (MAP) , ligadores peptidicos (o regiones de flanqueo) , o CR , de manera preferente CRM197, asi como combinado con sustancias adyuvantes descritas en Singh et al., Nat . Biotech. 17 (1999): 1075-1081 (en particular aquellos en la Tabla 1 en este documento) , y O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003): 727-735 (en particular los compuestos inmunopotenciadores endógenos y sistemas de distribución descritos en el mismo) , o mezclas de los mismos. La química de conjugación (por ejemplo mediante compuestos hetero-bifuncionales tal como G BS y por su puesto también otros como se describe en "Bioconjugate Techniques", Greg T.. Hermanson) en este contexto se pueden seleccionar de reacciones conocidas por los expertos en la técnica. Además la composición de vacuna se puede formular con un adyuvante, de manera preferente una composición de aluminio poco soluble, en particular, hidróxido de aluminio. Por supuesto, también se pueden usar adyuvantes tal como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citocinas (por ejemplo IL-2, IL-12, GM-CSF) , saponinas (por ejemplo QS21), derivados de MDP, oligonucleótidos de CpG, LPS, MPL, polifosfazenos , emulsiones (por ejemplo (Freund's, SAF) , liposomas, lipopéptidos , virosomes, iscomas, cocleatos, microparbtiuclas de PLG, partículas de poloxámero, partículas tipo virus, enterotoxina térmicamente lábil (LT) , toxina de cólera (CT, por sus siglas en inglés), toxinas mutantes (por ejemplo LTK63 y LTR72), micropartítulas y/o liposomas polimerizados .

Los péptidos de la presente invención se unen de manera preferente al portador o adyuvante mediante un ligador, que se selecciona del grupo que consiste de NHS-poli (óxido de etileno) (PEO) (por- ejemplo NHS-PE04-maleimida) .

Una vacuna que comprende un péptido de la presente invención y el portador farmacéuticamente aceptable se puede administrar por cualquier modo adecuado de aplicación, por ejemplo, de manera intradérmica (i.d.), de manera intravenosa (i.v.), de manera intraperitoneal (i.p.), intramuscularmente (i.m.), de manera intranasal, oralmente, de manera subcutánea (s.c), etc., y en cualquier vehículo adecuado de distribución (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003): 727-735) . El compuesto de la presente invención se formula de manera preferente para administración s.c, i.d. o i.m. (ver por ejemplo "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004) .

La vacuna de acuerdo a la presente invención comprende al menos un péptido que se formula de manera preferente para administración.

Al menos un péptido en la vacuna se formula de manera preferente con un adyuvante, de manera preferente hidróxido de aluminio.

Típicamente, la vacuna contiene el péptido de acuerdo- a la presente invención en una cantidad de 0.5 a 500 pg, de manera preferente 1 a 100 \ig y de manera alternativa de 0.1 ng a 10 mg, de manera preferente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 g, o de manera alternativa, por ejemplo 100 fmol a 10 pmol, de manera preferente 10 mol a 1 µp???, en particular 100 pmol a 100 nmol. Típicamente, la vacuna también puede contener sustancias auxiliares, por ejemplo, amortiguadores, estabilizadores, etc.

De acuerdo a una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la vacuna puede comprender dos o más de los siguientes componentes: De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, la vacuna se usa para prevenir y/o tratar aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis , en donde la enfermedad asociada con ateroesclerosis se selecciona de manera preferente del grupo que consiste de enfermedad oclusiva arterial periférica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque e insulto cerebral apopléctico.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos un péptido de acuerdo a la presente invención para la elaboración de una vacuna para prevenir y/o tratar aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis .

Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para tratar un individuo que padece o está en riesgo de padecer de aterosclerosis o una enfermedad asociada con aterosclerosis en el transcurso de lo cual al individuo se administra un péptido o vacuna de acuerdo a la presente invención.

Junto con la vacuna de la presente invención, el individuo que se va a tratar también puede recibir otros ingredientes activos que se conoce que tienen influencia en los niveles de LDL y/o HDL en humanos y mamíferos tal como estatinas, fibratos, ácido nicotínico, inhibidor de la captación de colesterol (por ejemplo ezetimiba) , ApoAl Milano, HDL deslipidado, esteróles vegetales, inhibidores PCSK9 etc.

"Tratar" como se usa en la presente significa curar una condición o estado de enfermedad ya presente. Tratar también puede incluir inhibir, es decir, detener el desarrollo de una condición o estado de enfermedad, y mejorar, es decir, provocar la regresión de una enfermedad.

El término "prevenir" como se usa en la presente significa detener completamente o casi completamente una condición o estado de enfermedad de que se presente en un paciente o sujeto, especialmente cuando el paciente o sujeto está predispuesto a este riesgo de contraer una condición o estado de enfermedad.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a o que se dirigen a un péptido de la presente invención que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSI DFEIDSAI (SEQ ID No. 23) , en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24) .

Los anticuerpos dirigidos a los péptidos de la presente invención se pueden usar para inhibir la actividad de CETP en un cuerpo humano o animal. Por lo tanto, estos anticuerpos se pueden usar para vacunación pasiva de humanos y animales.

Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención, que pueden ser monoclonales o policlonales , se pueden elaborar como se conoce en la técnica. Se pueden producir anticuerpos monoclonales por una variedad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica normal de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. También se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales tal como transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

De acuerdo a una modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada ("VH") una región variable de cadena ligera ("VL") de anticuerpo, cada región que comprende regiones determinantes de complementariedad, en donde las regiones determinantes de complementariedad de la región VH tienen una o más de las secuencias de aminoácidos NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSYNP SLKSRISITRDSKNQFFLQLNSVEDAYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104) , EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPER-RLEWVAAI SNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGT TLTVSS (SEQ ID No. 105), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYA WNWIRQFPGNKLEW GYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSA TYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106) o QIQLVQSGPELKK PGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLK MGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLET SASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSV VSS (SEQ ID No. 107) y la región VL tienen una o más de las secuencias de aminoácidos DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSTCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPK LLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGT LEL K (SEQ ID No 108), QIVLTQSPAIMSASGEKVTMTCSASSSISYMHWY QQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTF GSGTKLEIK (SEQ ID No. 109), DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQ SLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAED LADYFCQQQYNTPLTFGAGT LELK (SEQ ID No. 110) o DVLMTQTPLSL PVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111) .

Particularmente preferido son los anticuerpos que comprenden una región VH que comprende NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEW- ' MGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPY- WGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104) en combinación con una región VL que comprende DIVMTQSQKF STSVGDRVS ITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSE DLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No 108), o una región VH que comprende EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAI SNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTL TVSS (SEQ ID No. 105), en combinación con una región VL que comprende QI- VLTQSPAI SASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLAS- GVPARFSGSGSGTSYSLTI SSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK (SEQ ID No. 109) , o una región VH que comprende DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEW GYI SYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTED- SATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106) en combinación con una región VL que comprende DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSS- QSLLSSKNQKNFLA YQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTI SSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No. 110), o una región VH que comprende QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLK-WMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATY-FCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID No . 107) en combinación con una región VL que comprende DVLMTQTPLSLPVSLGDQASI SCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRI SRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111) .

Para crear un anticuerpo de cadena individual (scFv) , los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL se enlazan operativamente a otro fragmento que codifica para un ligador flexible, tal que la secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteina contigua de cadena individual con los dominios de VL y VH unidos por el ligador flexible (por ejemplo Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)). EL anticuerpo de cadena individual puede ser monovalente, si solo se usan una VH y VL individual, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos biespecificos o polivalentes que se unes específicamente a CETP y a otra molécula.

En otro aspecto, se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico /que codifican para anticuerpos. Por ejemplo, "cuerpos Kappa" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), " inicuerpos" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) se pueden preparar usando técnicas de tecnología molecular normales siguiendo las enseñanzas de la especificación.

El anticuerpo de la presente invención está preferentemente humanizado. En la técnica son bien conocidos los métodos para obtener esos anticuerpos. Un método va a ser insertar las regiones variables descritas en la presente en una estructura de anticuerpo humano (ver por ejemplo Hou S, et al., J Biochem 144 (2008): 115-20).

La presente invención se ilustra adicionalmente en las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin que se restrinja a esto.

Las Figuras 1A-1B muestran títulos medios anti-péptido (Figura 1A) y títulos medios anti-proteína (n=5 ratones por grupo) (Figura IB) para péptidos con SEQ ID Nos 1 a 6 y 22 delineadas de la secuencia de aminoácidos de CETP.

Las Figuras 2A-2B muestran títulos medios anti-péptido (Figura 2A) y títulos medios anti-proteína (Figura 2B) (n=5 ratones por grupo) para péptidos con SEQ ID No. 1 y 7 a 21 (péptidos truncados) .

La Figura 3 muestra el número de ratones con anticuerpos gue inhiben la actividad de CETP (n=5 ratones por grupo) para péptidos con SEQ ID No. 1 y 7 a 21 (péptidos truncados) .

La Figura 4 muestra el por ciento de inhibición de actividad de CETP de sueros de ratones (n=5 ratones por grupo) vacunados con péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18 y 19.

La Figura 5 muestra el reconocimiento de la proteina CETP por los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

La Figura 6 muestra la inhibición de la actividad de CETP de suero humano por los anticuerpos monoclonales de acuerdo a la presente invención.

Ejemplos Materiales y Métodos Vacuna Los péptidos se conjugaron mediante ligador heterobifuncional GMBS (éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-Maleimidobutirico) a KLH (Hemocianina de Lapa) .

Suspendieron 15 de los péptidos con hidróxido de aluminio (concentración final de hidróxido de aluminio fue 0.2 %) . Como amortiguador se usó mannitol/fosfato .

Experimentos en Animales 5 ratones Balb/c se inmunizaron de manera subcutánea. Los ratones sin acceso a alimento y agua ad libitum y se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La edad de los ratones al comienzo de los experimentos usualmente fue e 8 a 10 semanas.

Los ratones se inyectaron tres veces en intervalos de 2 semanas con 15 µg de péptido puro acoplado a KLH y se adsorbieron con Alumbre como adyuvante en un volumen de 1 mi en total mediante la ruta s.c.

Se tomó sangre aproximadamente 2 semanas después de la inyección final.

ELISA de Péptido Para determinar la inmunogenicidad de las vacunas, placas Nunc-Maxisorb de 96 concavidades se revistieron con 1 µ de los respectivos péptidos acoplados al albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) en NaHC03 0.1 , pH 9.2-9.4. Se usó un péptido irrelevante como control negativo. Se incluyó KLH como control positivo y se revistió a una concentración de 1 µg ml. La unión no especifica se bloqueó por incubación con amortiguador bloqueador (BSA al 5 % en PBS) . Se adicionaron diluciones apropiadas de suero a las concavidades, se diluyeron en serie 1:2 veces y se incubó durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. En cada placa ELISA se incluyó un suero normal como control interno. Los anticuerpos unidos se detectaron por incubación con IgG anti-ratón de cabra biotinilada, seguido por peroxidasa de rábano acoplada en Estreptavidina . Como substrato sé adicionó ABTS y la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 405 nm se midió en un lector de placa Microwell. Los títulos se definieron como la dilución del suero donde se alcanzó 50 % del ODmax en el ensayo.

ELISA de Proteina Los anticuerpos inducidos por la vacunación se probaron para su capacidad para unirse a CETP humana recombinantemente expresada N-terminalmente fusionada a GST ("GST-CETP") usando el protocolo descrito bajo "ELISA de péptido" .

Ensayo de Inhibición de Actividad de CETP La actividad de CETP se determinó con el equipo de ensayo de actividad de CETP Roar (RB-CETP; Roar Biomedical) al medir la transferencia de un substrato fluorescentemente marcado de acuerdo al protocolo proporcionado por el fabricante. Los ratones no tienen actividad endógena de CETP, por lo tanto se introdujo una modificación de este protocolo. Como la fuente de CETP se usó suero humano y se mezcló con la misma cantidad de suero de ratones vacunados conjuntamente con partículas donadoras y aceptoras (componentes del equipo de ensayo de actividad de CETP) .

Los sueros de ratones que contienen anticuerpos inhibidores de CETP condujeron a una disminución de la señal en este ensayo. Los sueros de ratones inyectados con péptido irrelevante sirvieron como control negativo.

Para la prueba de inhibición por anticuerpos monoclonales, se adicionaron las cantidades indicadas de anticuerpos purificados al suero humano.

Ejemplo 1: Comparación de varios epitopos potenciales de CETP Títulos medios de anticuerpos a pé tido inyectado y a. CETP (ver Figuras 1A y IB) Estos datos muestran claramente que la administración de un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 1 conduce a la formación de no solo anticuerpos dirigidos al péptido mismo sino también a la proteína CETP madura. La administración de estos fragmentos de CETP sólo indujo la formación de anticuerpos dirigidos al fragmento respetivo y no a la proteína CETP madura.

Ejemplo 2: Comparación de respuesta inmunitaria SEQ ID No. 1 versiones truncadas de la misma Títulos medios de anticuerpos a péptido inyectado y a CETP asi como el número de ratones anticuerpos que disminuyen la actividad de CETP de suero humano y por ciento de inhibición de actividad de CETP en suero humano en la adición de sueros de ratones vacunados individuales Figuras 2A, 2B, 3 y 4) .

Estos datos revelaron que los fragmentos de CETP que comprenden WWLGID (SEQ ID No. 24) son capaces de inducir la formación de anticuerpos dirigidos a CETP madura. En contraste a esto, otros fragmentos de CETP derivados de SEQ ID No. 23 que no comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 24 no muestran estos efectos.

Ejemplo 3: Inhibición de Actividad de CETP n.t. no probado debido a bajos títulos anti-proteina Ejemplo 4 : Anticuerpos Monoclonales : Se vacunaron ratones Balb/c con 15 µq de péptido puro Seq ID No. 10 acoplado a KLH. Se usó al hidrogel como adyuvante. Las células del bazo de ratones con altos títulos de proteina anti-CETP se fusionaron con células de mieloma de ratón de acuerdo a técnicas normales (protocolo adaptado de Kohler, G. y Milstein, C. Nature. 256 (1975): 495-497). Los clones de hibridomas se probaron en ELISA normales para la producción de anticuerpos que reconocen específicamente el péptido inyectado así como proteína CETP humana recombinantemente expresada. Se cultivaron los clones seleccionados y los anticuerpos monoclonales se purificaron de sobrenadantes de cultivo de tejido de acuerdo a protocolos normales .

Secuenciacion de anticuerpos monoclonales : Se extrajo el ARN de células de hibridoma y el ADNc se creó por transcripción inversa con un cebador oligo (dT) . Subsiguientemente, se realizaron reacciones PCR usando cebadores de dominio variable para amplificar tanto las regiones VH como VL del ADN de anticuerpo monoclonal. Los productos de VH y VL se extrajeron y purificaron en gel y se clonaron en un vector de secuenciacion y se transformaron en TOP10. Las colonias seleccionadas se recolectaron y analizaron a través de la secuenciacion.

Datos de cuatro anticuerpos monoclonal seleccionados : Clones CJ7-6-B7, 5/C7-6-C8, 12/B3-5-B11, y BTS4-1. La inhibición de la proteina CETP y el ELISA de proteina CETP humana se realizaron como se describe anteriormente.

Reconocimiento de Proteina CETP Humana por Anticuerpos Monoclonales (ver Figura 5) .

Estos datos revelaron que los 4 anticuerpos están reconociendo la proteina CETP revestida. La titulación en el ELISA se inició con las mismas cantidades para todos los anticuerpos (dilución de 2 mg/ml) . Como 1 se espera, los anticuerpos monoclonales difieren en su señal de ELISA que se puede explicar por las diferentes afinidades a la proteina revestida .

Inhibición de Actividad de CETP en Suero Humano por Anticuerpos Monoclonales (ver Figura 6) .

Estos datos revelaron que los 4 anticuerpos no solo se unen a la CETP sino también que inhiben la actividad de CETP. Entre mayor sea la cantidad de anticuerpo adicionada, se observa más disminución de la actividad de CETP.

Secuencias de Anticuerpos Monoclonales (Sólo se Dan los Dominios Variables) : CJ7-6-B7 Cadena pesada: NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYIT- NSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPY GQGTLVTVSA Cadena ligera: DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVV YQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVP-DRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK 5C7-6-C8 Cadena pesada: EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAiiSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQN-SYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS Cadena ligera QIVLTQSPAI SASPGEKVTMTCSASSSISYMH YQQKPGTSPKRWIFDTSKLAS-GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGT LEIK 12B3-5-B11 Cadena pesada: DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWN IRQFPGNKLE -MGYI SYSGTTTYNPSLKSRI S ITRHTS NQFFLQLNSVTTEDSATYYC-TRLGYYFDYWGQGTTLTVSS Cadena ligera DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSP VLVY FASTRASGVPDRFIGSGSGDFTLISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLFGAGTKLELK BTS4-1 Cadena pesada: QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMH VKQAPGQGLK MGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATY-FCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS Cadena ligera DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLI-YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPFGGGTKLEIK Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Péptido que consiste de 6 a 20 residuos de aminoácido y que se deriva de la secuencia de aminoácidos VFKGTLKYGYTTAWWLGI DQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23), caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos WWLGID (SEQ ID No. 24) .

2. Péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del péptido se selecciona del grupo que consiste de YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGIDQSID (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) y TTAWWLGID (SEQ ID No. 19) .

3. Péptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el péptido comprende en su C- y/o N-terminal un residuo de cisteina.

4. Péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usarse en la prevención y/o tratamiento de aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis.

5. Péptido de conformidad con la reivindicación 4, en donde la enfermedad asociada con aterosclerosis se selecciona del grupo que consiste de .enfermedad oclusiva arterial periférica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque e insulto cerebral apopléctico.

6. Péptido de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, en donde el péptido se administra a un individuo en una cantidad de 0.5 a 500 iq , de manera preferente 1 a 100 µq, por inmunización.

7. Vacuna, caracterizada porque comprende al menos un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada en que al menos un péptido se acopla o fusiona a un portador farmacéuticamente aceptable, de manera preferente KLH (Hemocianina de lapa californiana ) .

9. Vacuna de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque al menos un péptido se formula para administración intradérmica, subcutánea o intramuscular.

10. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque al menos un péptido se formula con un adyuvante, de manera preferente hidróxido de aluminio.

11. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque la vacuna comprende al menos un péptido en una cantidad de 0.5 a 500 µ?, de manera preferente de 1 a 100 µ?, por inmunización.

12. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, para usarse en la prevención y/o el tratamiento de aterosclerosis y enfermedades asociadas con aterosclerosis.

13. Vacuna de conformidad con la reivindicación 12, en donde la enfermedad asociada con aterosclerosis se selecciona del grupo que consiste de enfermedad oclusiva arterial periférica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque e insulto cerebral apopléctico.

14. Anticuerpo, caracterizado porque se une a un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

15. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada ("VH") y una región variable de cadena ligera ("VL") , de anticuerpo, cada región que comprende regiones determinantes de complementariedad, en donde las regiones determinantes de complementariedad de la región VH tienen una o más de las secuencias de aminoácidos NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITS DYAWNWIRQFPGNKLEW GYITNSGSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTAT YYCTRGGPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104), EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNS YPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 105), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQ FPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGY YFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106) o QIQLVQSGPELKKPGETVKISC KASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQ INILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID No. 107) y la región VL que tiene una o más .de las secuencias de aminoácidos DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPK LLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLINMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No 108), QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTS PKR IFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLE IK (SEQ ID No. 109), DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKN FLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQ YNTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No. 110) o DVLMTQTPLSLPVSLGDQ ASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLR I SRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111) .