KR20140026390A

KR20140026390A - Ｃｅｔｐ 단편

Info

Publication number: KR20140026390A
Application number: KR1020137025945A
Authority: KR
Inventors: 질비아 브룬너; 마티아스 겝하르트; 에리카 빌치코바; 클라우디아 유노; 폴라 린츠마이어-히르트; 비르기트 슈
Original assignee: 아피리스 아게
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2014-03-05
Also published as: RU2014100115A; CN103635204B; IL227821A0; JP6336901B2; US9085636B2; SG194425A1; BR112013022164A2; EP2717908B1; DK2717908T3; AU2012266245A1; AU2012266245B2; WO2012168486A1; ES2545458T3; JP2014519512A; NZ613913A; CA2837767A1; US20140147456A1; MX2013009521A; EP2532359A1; EP2717908A1

Abstract

본 발명은 6 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 펩티드로서, 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)을 포함하는 펩티드, 및 이러한 펩티드에 결합하는 항체에 관한 것이다.

Description

ＣＥＴＰ 단편{CETP FRAGMENTS}

본 발명은 CETP의 생체내 활성에 영향을 줄 수 있는 펩티드에 관한 것이다.

죽상경화증과 관련된 질환, 예컨대 심혈관 질환 (CVD)뿐 아니라 뇌졸중 및 말초 동맥 폐쇄 질환은 미국, 유럽 및 아시아 대부분에서 주 사망 원인 중의 하나이다. 1990년에 비해, CVD로 인한 사망률은 2020년에 90%만큼 증가할 것이다.

죽상경화증 병변의 형성을 담당하는 다양한 위험 인자가 있다. 순환하는 지질단백질 프로파일, 동맥 고혈압 및 니코틴 남용이 이와 관련하여 특히 중요하다.

포괄적인 역학 연구에서, 혈청 콜레스테롤 수준과 관상동맥 심질환의 발병율 사이의 양성 상관관계가 입증될 수 있었다. 높은 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDLc) 수준은 높은 심혈관 위험을 구성하며, 죽상경화증에 대한 위험의 증가와 직접 관련된다. HMG-CoA 리덕타제 억제제와 같은 스타틴이 보통 이용되며 순환하는 LDLc 수준을 성공적으로 감소시킨다. 그러나, 적극적인 스타틴 치료로 인한 관상동맥 사건의 감소에도 불구하고, 상당한 잔여 심혈관 위험이 여전히 난제로 남아 있다. 따라서, 새로운 치료법이 시급히 요구된다.

LDL 콜레스테롤 수준 이외에도, 혈관 보호성 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDLc)의 수준이 또한 심혈관 질환에 대한 위험 프로파일을 예측함에 있어 중요한 역할을 한다. 역학 연구는 HDLc 수준과 죽상경화증 사이의 역상관관계를 입증하였다. HDLc 수준은 LDLc 값과 무관한 강력한 예측변수이다. 따라서, HDLc 수준이 죽상경화 예방효과를 지니는 것으로 추정된다, 따라서 HDLc 수준을 상승시키는 것이 주 목적이며 추가의 목표이다.

스타틴을 이용한 단일요법은 HDLc 수준을 효과적으로 상승시키지 않으므로, 이러한 유형의 약리적 화합물을 이용한 죽상경화증의 치료 및 예방은 충분치 않다. HDLc 수준을 상승시키기 위한 현행 옵션은 피브레이트(fibrate) 및 니아신(niacin)이다. 특히 니아신이 효과적이나, 낮은 환자 순응도를 초래하는 부작용으로 인해 이의 이용은 제한적이다. 스타틴에 의한 LDL 감소를 보완하기 위해 HDLc 수준을 상승시키는 효과적이고 안전한 방법이 시급하게 요구된다. 이에 관해, 단일요법 또는 추가 요법으로서 CETP의 억제가 매력적인 목표이다.

콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP)은 지질단백질 사이에서 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 포함하는 중성 지질의 전달을 담당하는 혈장 당단백질이다. 죽상경화예방용 HDL로부터의 콜레스테릴 에스테르는 TG 대신 전-죽종형성 아포지질단백질 (apo) B 지질단백질 (LDL 및 VLDL)로 전달된다. 이는 보다 낮은 수준의 HDL을 초래하고 LDL 및 VLDL의 수준을 상승시킨다.

대사 배경에 가장 의존적일 것 같은 CETP는 HDL 혈장 수준을 증가시키고자 하는 목표에 가치 있는 치료적 표적인 것으로 추정된다.

다수의 종들은 CETP를 지니지 않는다. 토끼 및 인간과 같이 죽상경화증에 감수성(susceptibility)을 지니는 종에서, CETP 활성이 높다. 죽상경화증에 내성인 그 밖의 종들은 CETP를 소유하지 않고 높은 HDLc 수준을 지닌다.

토끼 및 햄스터를 이용한 동물 실험에서, 항-CETP 모노클로날 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 CETP 억제제를 이용한 CETP의 일시적 억제는 HDL 수준에서의 증가를 발생시켰다.

여러 부류의 CETP 억제제가 기재되어 있으며, 이 중 일부는 이미 임상 시험이 진행중이다 (예컨대, 달세트라피브(dalcetrapib)(Stein EA, Eur Heart J. 31(4) (2010):480-8), 아나세트라피브(anacetrapib)(Cannon CP, N Engl J Med. 363(25)(2010):2406-15) 및 토르세트라피브(torcetrapib)(Nissen SE, N Engl J Med. 356(13)(2007):1304-16)).

US 5,512,548호 및 WO 93/011782호에는, HDL로부터 VLDL 및 LDL로의 콜레스테롤 에스테르의 전달을 촉매하는 CETP를 억제할 수 있어, 환자에게 투여되는 경우에 항-죽상경화증 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이의 유사체가 기재되어 있다. 상기 문헌에 따르면, 이러한 CETP 폴리펩티드 억제제는 다양한 공급원의 apoC-I로부터 유래하며, 여기서 특히 아미노산 36까지의 N-말단 단편이 CETP 억제제로서 확인되었다.

또한 US 5,880,095 A호에는 개체에서 CETP의 활성을 억제할 수 있는 CETP-결합 펩티드가 기재되어 있다. CETP-억제 단백질은 돼지의 apoC-III의 N-말단 단편을 포함한다.

US 2006/0276400호 및 WO 96/034888호에는 CETP로부터 유래되고, T-세포 및/또는 B-세포 에피토프를 포함하는 펩티드가 기재되어 있다. 이러한 펩티드는 생체내에서 CETP 특이적 항체의 형성을 유도할 수 있다.

US 2004/0087481호 및 US 6,410,022 B1호에는 CETP-특이적인 면역 반응의 유도 때문에 심혈관 질환, 예를 들어, 죽상경화증의 치료 및 예방에 사용될 수 있는 펩티드가 기재되어 있다. 이들 펩티드는 CETP로부터 유래하지 않은 T 헬퍼 세포 에피토프, 및 CETP로부터 발생하며 CETP로부터 직접 유래될 수 있는 하나 이상의 B-세포 에피토프를 포함한다. T 헬퍼 세포 에피토프는 유리하게는 파상풍 톡소이드로부터 유래하며, CETP의 적어도 하나의 B-세포 에피토프에 공유 결합한다. 유기체에 대해 이물질인 T 헬퍼 세포 에피토프를 사용함으로써, 개체의 체내에서 항체가 유도되고, 이로써 하나 이상의 CETP-B-세포 에피토프로 구성되는 펩티드 부분에 대해 항체가 유도되는 것이 가능하다.

WO 2006/029982호에는 죽상경화증의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용되는 CETP 미모토프(mimotope)가 기재되어 있다.

CETP에 관한 백신 접근법에 대한 제안이 이미 이루어졌다. 토끼가 항원으로서 CETP의 C-말단으로부터 유래된 펩티드를 함유하는 백신으로 처리되었다. 면역화된 토끼는 감소된 CETP 활성, 및 증가된 HDL 및 감소된 LDL 값의 변경된 지질단백질 수준을 가졌다. 더욱이, 죽상경화증 모델의 처리된 시험 동물은 또한 대조 동물과 비교하여 감소된 죽상경화증 병변을 나타내었다 (Rittershaus CW, Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(2000): 2106-12).

Ⅱ기 임상 연구의 결과가 공개되었으며, 이러한 연구는 백신 CETi-1을 이용하여 미국 생명공학 회사 애번트(Avant)사에 의해 수행되었다 (BioCentury Extra For Wednesday, October 22, 2003). 이러한 Ⅱ기 연구에서, 선행 Ⅰ기 연구에서와 같이, 임의의 의심스러운 부작용이 없이 매우 우수한 안전성 프로파일이 입증되었으며, 이는 항-CETP 백신화 접근법으로부터 부작용이 예상되지 않는다는 결론이 도출되는 것을 가능케 한다. 그러나, 효능과 관련하여, 애번트사의 백신은 실망스러웠는데, 이는 상기 백신이 위약 치료에 의해 달성되는 것보다 현저하게 나은 증가된 HDL 수준을 야기시키지 않았기 때문이다.

본 발명의 목적은 개체에서 CETP의 활성을 감소시키는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 6 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 펩티드에 관한 것이며, 상기 펩티드는 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)을 포함한다.

놀랍게도 아미노산 서열 WWLGID를 포함하는 펩티드는 포유동물, 특히 마우스에서 CETP에 관한 항체를 유도할 수 있는 것으로 판명되었다. 이들 항체는 CETP에 결합할 수 있고 추가로 상기 단백질의 활성을 감소시킨다. CETP 활성을 지니는 포유동물에서, 예를 들어 백신화 (Thomas et al., Human Vaccines 5(2009); 79-84) 또는 소분자 억제제 (Luscher et al., Eur Heart J 33(2012); 857-865; Krauss et al., J Lipid Res 53(2012): 540-547)에 의한 이러한 활성의 감소는 HDL 수준을 증가시키는 것이 잘 알려져 있다. 포유동물에서 HDL 수준의 증가는 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 다른 질환, 특히 심혈관 질환을 완화시킨다.

아미노산 서열 WWLGID을 포함하는 본 발명의 펩티드는 인간 CETP (단백질 데이터 뱅크 수탁 번호 2OBD_A GI:126031487)의 단편인 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)을 지니는 펩티드로부터 유래된다. 아미노산 서열 SEQ ID No. 23을 지니는 펩티드는 성숙 CETP 단백질의 아미노산 잔기 92 내지 121을 포함한다. 아미노산 서열 WWLGID를 포함하는 이러한 CETP 단백질 단편 및 트렁케이션된 (truncated) 이의 변이체는 앞서 언급한 대로 CETP에 특이적으로 결합하는 항체의 형성을 유도한다. 그러나, 성숙 CETP 단백질의 아미노산 잔기 47 내지 55, 152 내지 165, 290 내지 300, 300 내지 316 및 403 내지 415를 포함하는 CETP로부터 유래된 그 밖의 단편은, 비록 전장 CETP 단백질의 표면 상에 존재한다 하더라도, CETP 단백질에 관한 (즉, 결합하는) 항체의 형성을 유도하지 않지만, 포유동물로의 그러한 단편의 투여는 단편 특이적 항체의 형성을 유도한다. 이는, 당업자라면 분명히 CETP 단백질에 관한 항체의 형성을 유도하기 위해 CETP 단백질의 표면 상에 노출된 CETP 단편이 필요할 것이라고 예상할 것이기 때문에 놀라운 것이다.

펩티드의 길이가 길수록 그러한 백신에 요망되지 않는 하나 이상의 T-세포 에피토프가 포함될 가능성이 더 높아진다는 것은 당 분야에 잘 알려져 있다. 세포독성 T 세포 에피토프 (CD4 및 CD8)의 활성화는 원치 않는 부작용 (AE)을 일으킬 자가-반응성 T 세포의 유도를 초래할 수 있었다. 따라서, 당업자는 -백신에서 요망되지 않는 에피토프를 피하기 위해- 가능한 한 짧은 펩티드를 항원으로서 이용하여 항원 특이적 체액 면역 반응을 유도할 것이다. 따라서, 짧은 펩티드는 -짧은 펩티드일수록 화학적으로 훨씬 더 용이하게 합성될 수 있다는 사실 외에도- 바람직하다.

WO 02/098915호에는 본 발명의 아미노산 서열 SEQ ID No. 23을 포함하는 100개 미만의 아미노산의 폴리펩티드가 기재되어 있다. WO 02/098915호의 폴리펩티드를 이용하여 CETP에 관한 항체를 생성한다. WO 02/098915호에 기재되어 있는 펩티드의 길이로 인해, 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하지 않을 수 있는 항체가 또한 유도되는데, 이는 그러한 항체가 CETP의 작용 방식과 관련이 없는 CETP의 부분에 특이적일 수 있기 때문이다.

본원에서 사용된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 6개 이상의 아미노산 잔기를 지니는 중합성 분자를 언급한다.

본원의 펩티드에 관해 사용된 용어 "~로부터 유래된다"는 것은 본 발명의 펩티드가 아미노산 서열 SEQ ID No. 23을 지니는 펩티드의 단편임을 의미한다. 따라서, "~로부터 유래된다"는 용어는 "~의 단편이다"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 6개 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 펩티드는 6 내지 16개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드는 8개 내지 20개, 바람직하게는 8개 내지 16개의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 펩티드가 C-말단 및/또는 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 경우, 펩티드는 9개 내지 21개, 바람직하게는 9개 내지 17개, 또는 10개 내지 22개, 바람직하게는 10개 내지 18개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드가 아미노산 서열 SEQ ID No. 23의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 경우에, 상기 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 18 및/또는 SEQ ID No. 19를 포함하거나 이로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGIDQSID (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) 및 TTAWWLGID (SEQ ID No. 19)로 구성되는 군으로부터 선택되고, TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10) 및 WWLGIDQS (SEQ ID No. 11)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 펩티드는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 재조합 방법을 이용하여 본 발명의 펩티드를 생성하는 것도 물론 가능하다. 펩티드는 미생물, 예를 들어, 박테리아, 효소 또는 진균, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Simliki forest virus), 배큘로바이러스, 박테리오파아지, 신드비스 바이러스 또는 센다이 바이러스 벡터에서 생성될 수 있다. 펩티드를 생성하기에 적합한 박테리아는 대장균(E. coli), B. 섭틸리스(B. subtilis) 또는 그러한 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 박테리아를 포함한다. 본 발명의 펩티드를 발현하기에 적합한 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 캔디다(Candida), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모를 포함한다. 해당 수단과 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 재조합적으로 생성된 펩티드를 분리하고 정제하는 방법도 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.

본 발명의 펩티드의 분리를 촉진하기 위해, 펩티드가 친화성 크로마토그래피에 의한 분리를 가능하게 하는 이종성 폴리펩티드에 번역적으로 융합(공유 결합)된 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있다. 통상적인 이종성 폴리펩티드는 His-Tag(예를 들어, His₆; 6개의 히스티딘 잔기), GST-Tag(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 등이다. 융합 폴리펩티드는 펩티드의 정제를 촉진할 뿐만 아니라 정제 단계 동안 펩티드가 분해되는 것을 방지할 수 있다. 정제 후에 이종성 폴리펩티드를 제거하는 것이 요망되는 경우, 융합 폴리펩티드는 펩티드와 이종성 폴리펩티드 사이의 접합부에 절단 부위를 포함할 수 있다. 절단 부위는 상기 부위의 아미노산 서열에 특이적인 효소(예를 들어, 프로테아제)로 절단되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 또한 이들의 N-말단 및/또는 C-말단에 이에 결합된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.

펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기의 제공은 담체에 대한 이의 컨쥬게이션을 촉진시킬 수 있고/거나 펩티드의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 시스테인 잔기가 본 발명의 펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에 첨가되면, 본원에 언급된 아미노산 잔기의 수는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기만큼 명백하게 증가된다. 따라서 6개 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 펩티드로서, 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)을 포함하는 상기 펩티드는 7개 내지 21개 또는 8개 내지 22개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

특히 바람직한 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기를 지니는 본 발명의 펩티드는 C-YTTAWWLGIDQS, C-YGYTTAWWLGIDQSID, C-TTAWWLGIDQS, C-TAWWLGIDQS, C-AWWLGIDQS, C-WWLGIDQS, C-YTTAWWLGIDQ, C-YTTAWWLGID, C-TTAWWLGIDQ 및 TTAWWLGID-C로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드는 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용된다.

상기 개요된 대로, 본 발명의 펩티드는 인간에 특히 존재하는 CETP에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있다. CETP에 대한 이러한 항체의 결합은 생체내 CETP의 활성을 감소시킨다. 그 결과, HDL의 수준이 증가한다.

죽상경화증과 관련된 질환은 바람직하게는 말초 동맥 폐쇄 질환, 관상동맥 심질환, 중풍성 뇌졸중(apoplectic cerebral insultus) 및 뇌졸중으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

"죽상경화증과 관련된 질환"이라는 용어는 죽상경화증의 결과인 질환을 의미한다. 이러한 질환은 특히 말초 동맥 폐쇄 질환, 관상동맥 심질환 및 중풍성 뇌졸중을 포함한다 (예컨대, 참조: Steinberg D., J. Lipid Res. 46 (2005): 179-190; Steinberg D et al., J. Lipid Res. 47 (2006): 1339-1351).

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드는 면역화당 0.5 내지 500 ㎍, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍의 양으로 개체에게 투여된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 대안적으로 체중 1kg 당 0.1 ng 내지 10 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 1 mg, 특히 100 ng 내지 300 ㎍의 양으로 개체에게 투여될 수 있다.

단일 정량 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 펩티드의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 것이다. 백신의 용량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 정량 섭생은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 세분된 여러 용량을 하루에 투여할 수 있거나 급박한 치료 상황에 의해 지시되는 대로 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다. 백신의 용량은 또한 상황에 따라 최적의 예방 용량 반응을 제공하도록 변화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 백신은 항상 CETP에 관한 항체의 수준에 따라 며칠, 1 또는 2주 또는 심지어 수 개월의 간격으로 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 펩티드/백신은 2 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회, 심지어 더욱 바람직하게는 5회 이하, 가장 바람직하게는 3회 이하로 적용된다. 특히 바람직한 구체예에서, 후속 백신화들간의 시간 간격은 2주 내지 5년 또는 그 초과, 바람직하게는 1개월 내지 3년 이하, 보다 바람직하게는 2개월 내지 1.5년이 되도록 선택된다. 본 발명의 펩티드/백신의 반복 투여는 치료용 백신화의 최종 효과를 최대화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 6 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 상기 정의된 하나 이상의 펩티드로서, 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)를 포함하는 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 백신은 YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGIDQSID (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) 및 TTAWWLGID (SEQ ID No. 19)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드 중 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개를 포함할 수 있다.

특히 바람직한 펩티드의 조합물은 SEQ ID No. 10 및 11; SEQ ID No. 8 및 9; SEQ ID No. 8 및 10; SEQ ID No. 8 및 11; SEQ ID No. 9 및 10; SEQ ID No. 9 및 11; SEQ ID No. 8, 9 및 10; SEQ ID No. 8, 9 및 11; SEQ ID No. 8, 9, 10 및 11; SEQ ID No. 10, 11 및 18; SEQ ID No. 8, 9 및 18; SEQ ID No. 8, 10 및 18; SEQ ID No. 8, 11 및 18; SEQ ID No. 9, 10 및 18; SEQ ID No. 9, 11 및 18; SEQ ID No. 8, 9, 10 및 18; SEQ ID No. 8, 9, 11 및 18; SEQ ID No. 8, 9, 10, 11 및 18; SEQ ID No. 8 및 18; SEQ ID No. 9 및 18; SEQ ID No. 10 및 18; SEQ ID No. 11 및 18을 포함한다.

본 발명의 백신은 또한 CETP의 그 밖의 펩티드 단편 또는 이의 변이체, 또는 CETP, 특히 인간 CETP에 관한 항체의 생체내 형성을 유도할 수 있는 어떠한 그 밖의 펩티드를 포함할 수 있다. WO 2009/021254호에 기재되어 있는 펩티드가 특히 적합하다. 여기에 기재되어 있는 펩티드는 아미노산 서열 FX₈(F)_oPX₉HX₁₀X₁₁X₁₂DX₂X₃X₄X₅X₆X₇을 지니며, 여기서 X₈은 G, A, F, Y 및 K로 구성되는 군으로부터 선택되고, X₉는 E, Y, A, Q, K 및 S로 구성되는 군으로부터 선택되며, X₁₀은 H, V, L, F 및 I로 구성되는 군으로부터 선택되고, X₁₁은 L, W, S, I, F 및 Y로 구성되는 군으로부터 선택되며, X₁₂는 V, T, F 또는 I이고, X₂는 F, A, W, R, S, L, Q, V 및 M으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고, X₃은 L, A, S, W, E, R, I 및 H로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고, X₄는 Q, A, H, D, K, R, S 및 E로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고, X₅는 S 또는 Y이고, X₆은 L, A 또는 I이고, X₇은 S, N 또는 T이고, o는 0 또는 1이다. 바람직한 조합물은 본 발명의 펩티드 및 FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFLQSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHLAVDFLQSLS, FGFPEHLLADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, FGFPGHLIWDSLHSLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, FGFPSHHLQDSLQSLS, FGFPLHFRSDRIQSLS, FGFPKHLYADMSQSLS, FGFPAHLSRDLRQSLS, FGFPFHFAQDSWQSLS, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTTDRLQSLS, FGFPQHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDWAQSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS, FGFPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVSIDWLQSLY, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSIDRAQSLS, FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFPKHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS, FGFPAHVSIDFSQSLS, FGFPSHIIIDWLQSLS, FGFPSHLIIEWLQSLS, FAFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQALS, FGFPAHVFIDWLQSLA, FAFPAHVFIDWLQALA, FGFPEHLFVDFLQSLS, FGFPAHVHIDWLQSLS, FGFPAHVPIDWLQSLS, FGFPSHLFIDWAQSLS, FGFPAHVYIDWLQ 및 FGFPAHVFIDWLQ로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 백신은 또한 인체내에서 LDL 및/또는 HDL 수준의 조절에 또한 수반되는 그 밖의 단백질로부터 유래되는 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CETP 단편은 WO 2008/125623호, WO 2010/057242호 및 WO 2011/027257호에 기재된 대로 PCSK9 (프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신(kexin) 유형 9)로부터 유래되는 에피토프와 조합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 하나 이상의 펩티드는 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 커플링되거나 융합된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드는 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌), 파상풍 톡소이드, 알부민-결합 단백질, B형 간염 코어 항원, 우혈청 알부민, 덴드리머(dendrimer)(MAP), 펩티드 링커(또는 플랭킹(flanking) 영역), 또는 CRM, 바람직하게는 CRM197에 커플링되거나 융합될 뿐만 아니라 문헌[Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999): 1075-1081 (특히, 이의 표 1에 기재된 것), 및 O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003): 727-735 (특히, 이에 기재된 내인성 면역증강 화합물 및 전달 시스템)]에 기재된 애쥬번트 물질, 또는 이의 혼합물과 조합될 수 있다. 이러한 상황에서 컨쥬게이션 화학(예를 들어, 이종이작용성 화합물, 예를 들어, GMBS, 및 당연히 또한 문헌["Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson]에 기재된 다른 것들을 통함)이 당업자에게 공지된 반응으로부터 선택될 수 있다. 더욱이, 백신 조성물은 애쥬번트, 바람직하게는 저 가용성 알루미늄 조성물, 특히 수산화알루미늄과 함께 제형화될 수 있다. 물론, MF59 인산알루미늄, 인산칼슘, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사포닌(예를 들어, QS21), MDP 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, LPS, MPL, 폴리포스파젠, 에멀젼(예를 들어, 프로인트(Freund's), SAF), 리포솜, 지질펩티드, 바이로솜, 이스콤(iscom), 코클리에이트(cochleate), PLG 마이크로입자, 폴록사머 입자, 바이러스-유사 입자, 이열성 장독소(LT), 콜레라 독소(CT), 돌연변이 독소(예를 들어, LTK63 및 LTR72), 마이크로입자 및/또는 중합화된 리포솜과 같은 애쥬번트가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 NHS-폴리 (에틸렌 옥시드)(PEO)(예를 들어, NHS-PEO₄-말레이미드)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커를 통해 담체 또는 애쥬번트에 결합된다.

본 발명의 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신은 임의의 적합한 적용 방법, 예를 들어, 피내(i.d.), 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 근내(i.m.), 비내, 경구, 피하(s.c.) 등, 및 임의의 적합한 전달 장치(O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 s.c., i.d. 또는 i.m. 투여용으로 제형화된다(예를 들어, 참조:"Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

본 발명에 따른 백신은 i.d., s.c. 또는 i.m. 투여용으로 바람직하게 제형화된 하나 이상의 펩티드를 포함한다.

백신에 있는 하나 이상의 펩티드는 애쥬번트, 바람직하게는 수산화알루미늄과 함께 제형화되는 것이 바람직하다.

통상적으로, 백신은 본 발명에 따른 펩티드를 0.5 내지 500 ㎍, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍ 및 대안적으로 0.1 ng 내지 10 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 1 mg, 특히 100 ng 내지 100 ㎍, 또는, 대안적으로, 예를 들어, 100 fmol 내지 10 μmol, 바람직하게는 10 pmol 내지 1 μmol, 특히 100 pmol 내지 100 nmol의 양으로 함유한다. 통상적으로, 백신은 또한 보조 물질, 예를 들어, 완충액, 안정화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 백신은 하기 성분들 중 둘 이상을 포함할 수 있다:

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 백신은 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는데 이용되고, 죽상경화증과 관련된 질환은 바람직하게는 말초 동맥 폐쇄 질환, 관상동맥 심질환, 중풍성 뇌졸중 및 뇌졸중으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 양태는 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신의 제조에서 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 죽상경화증 또는 죽상경화증과 관련된 질환에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법 동안 본 발명에 따른 펩티드 또는 백신을 상기 개체에게 투여하는 방법에 관한 것이다.

치료되는 개체는 본 발명의 백신에 이어서 인간 및 포유동물에서 LDL 및/또는 HDL 수준에 영향을 주는 것으로 알려진 그 밖의 활성 성분, 예를 들어 스타틴, 피브레이트, 니코틴산, 콜레스테롤 흡수 억제제 (예컨대, 에제티미베(ezetimibe)), ApoA1 Milano, 탈지질화된 HDL, 플랜트 스테롤(plant sterol), PCSK9 억제제 등도 투여받을 수 있다.

본원에서 사용된 "치료"는 이미 존재하는 질병 상태 또는 조건을 치유하는 것을 의미한다. 치료는 또한 질병 상태 또는 조건의 발생을 억제, 즉 저지하는 것과 질병의 개선, 즉 퇴행을 야기시키는 것을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "예방"은, 특히 환자 또는 피검체가 질병 상태 또는 질환에 걸리기 쉬운 그러한 위험에 놓여 있을 때 질병 상태 또는 질환이 환자 또는 피검체에서 발생하는 것을 완전히 또는 거의 완전히 방지하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태는 6개 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 본 발명의 펩티드로서, 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)를 포함하는 펩티드에 결합하거나 이에 대해 유도된 항체에 관한 것이다.

본 발명의 펩티드에 대해 유도된 항체를 이용하여 인체 또는 동물체에서 CETP 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 이러한 항체를 인간 및 동물의 수동적 백신화에 이용할 수 있다.

모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있는 본 발명에 따른 항체는 당 분야에 공지된 대로 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 하이브리드화 기법을 포함하는 다양한 기법에 의해 생성될 수 있다. B 림프구의 바이러스 또는 종양발생 형질전환과 같은 모노클로날 항체를 생성하기 위한 그 밖의 기법도 이용할 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 항체는 중쇄 가변 ("VH") 영역 및 항체 경쇄 가변 ("VL") 영역을 포함하며, 각 영역은 상보성 결정 영역을 포함하고, VH 영역의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열

NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104), EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 105), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106) 또는 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID No. 107) 중 하나 이상을 지니고 VL 영역은 아미노산 서열

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No 108), QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK (SEQ ID No. 109), DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No. 110) 또는 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111) 중 하나 이상을 지닌다.

NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104)을 포함하는 VH 영역을 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No 108)을 포함하는 VL 영역과 함께 포함하거나, EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 105)을 포함하는 VH 영역을 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK (SEQ ID No. 109)을 포함하는 VL 영역과 함께 포함하거나, DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106)을 포함하는 VH 영역을 DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No. 110)을 포함하는 VL 영역과 함께 포함하거나, QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID No. 107)을 포함하는 VH 영역을 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111)을 포함하는 VL 영역과 함께 포함하는 항체가 특히 바람직하다.

단일 쇄 항체 (scFv)를 생성하기 위해, DNA 단편을 엔코딩하는 VH- 및 VL-은 가요성 링커를 엔코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL 도메인이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 연속적인 단일-쇄 단백질로서 발현되도록 할 수 있다 (예를 들어, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)). 단일 VH 및 VL만을 이용한 경우 단일 쇄 항체는 일가일 수 있거나, 2개의 VH 및 VL을 이용한 경우 이가일 수 있거나, 둘을 초과하는 VH 및 VL을 이용한 경우 다가일 수 있다. CETP 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.

또 다른 양태에서, 항체 엔코딩 핵산 분자를 이용하여 그 밖의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 "카파 바디(Kappa bodies)"(III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "미니바디(Minibodies)"(Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "디아바디(Diabodies)"(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), 또는 "자뉴신(Janusins)"(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992))을 제조할 수 있다.

본 발명의 항체는 인간화되는 것이 바람직하다. 그러한 항체를 얻는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 한 방법은 인간 항체 골격에 본원에 기재된 가변 영역을 삽입하는 것이다 (예컨대, 참조: Hou S, et al. J Biochem 144 (2008): 115-20).

본 발명은 하기 도면 및 실시예에서 추가로 예시되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
도 1은 CETP 아미노산 서열로부터 기술된 SEQ ID No. 1 내지 6 및 22를 지니는 펩티드에 대한 중간 항-펩티드 (도 1a) 및 중간 항-단백질 역가 (그룹 당 n=5마리 마우스)(도 1b)를 도시한다.
도 2는 SEQ ID No. 1 및 7 내지 21을 지니는 펩티드 (트렁케이션된 펩티드)에 대한 중간 항-펩티드 (도 2a) 및 중간 항-단백질 역가 (도 2b) (그룹 당 n=5마리 마우스)를 도시한다.
도 3은 SEQ ID No. 1 및 7 내지 21을 지니는 펩티드 (트렁케이션된 펩티드)에 대한 CETP 활성을 억제하는 항체를 지니는 마우스의 수 (그룹 당 n=5마리 마우스)를 도시한다.
도 4는 아미노산 서열 SEQ ID No. 1, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18 및 19를 지니는 펩티드로 백신화된 마우스 (그룹 당 n=5마리 마우스)로부터의 혈청의 CETP 활성 억제 퍼센트를 도시한다.
도 5는 본 발명의 모노클로날 항체에 의한 인간 CETP 단백질의 인지를 도시한다.
도 6은 본 발명에 따른 모노클로날 항체에 의한 인간 혈청에서의 CETP 활성의 억제를 도시한다.

실시예 :

물질 및 방법

백신

펩티드는 이종이작용성 링커 GMBS (4-말레이미도부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 통해 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 컨쥬게이션되었다.

15 ㎍의 펩티드를 수산화알루미늄으로 현탁시켰다 (수산화알루미늄의 최종 농도는 0.2%였다). 완충액으로서 만니톨/포스페이트를 이용하였다.

동물 실험

5 Balb/c 마우스를 피하 면역시켰다. 마우스는 사료와 물에 자유롭게 접근하였고 12h 명/암 주기하에 유지되었다. 실험 시작시에 마우스의 연령은 보통 8 내지 10주령이었다.

마우스에게 애쥬번트로서 KLH에 커플링되고 알룸(Alum)에 흡착된 15 ㎍의 순 펩티드를 통틀어 1 ml의 부피로 s.c. 경로를 통해 2주 간격으로 3회 주입하였다.

최종 주입한 지 약 2주 후에 채혈하였다.

펩티드 ELISA

백신의 면역원성을 측정하기 위해, 96-웰 Nunc-Maxisorb 플레이트를 0.1 M NaHCO₃, pH 9.2-9.4에서 우혈청 알부민 (BSA)에 커플링된 1 μM의 개개 펩티드로 코팅하였다. 무관한 펩티드를 음성 대조군으로서 이용하였다. KLH를 양성 대조군으로서 포함시켰고 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 차단 완충액 (PBS 중 5% BSA)과 인큐베이션시킴에 의해 비특이적 결합을 차단하였다. 1:2배 연속 희석된 적절한 혈청 희석액을 웰에 첨가하고 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트마다 표준 혈청을 내부 대조군으로서 포함시켰다. 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG에 이어서 스트렙타비딘에 커플링된 호스래디쉬 퍼옥시다제와 인큐베이션시킴에 의해 결합된 항체를 검출하였다. 기질로서 ABTS를 첨가하였고, 405 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 마이크로웰 플레이트-리더에서 측정하였다. 역가는 검정에서 ODmax의 50%에 도달하는 혈청의 희석율로서 정의되었다.

단백질 ELISA

백신화에 의해 유도된 항체를, "펩티드 ELISA" 하에 기재된 프로토콜을 이용하여 N-말단에서 GST에 융합된 재조합적으로 발현되는 인간 CETP ("GST-CETP")에 결합하는 이의 능력에 대해 시험하였다.

CETP 활성 억제 검정

제조사가 제공한 프로토콜에 따라 형광으로 표지된 기질의 전달을 측정함에 의해 CETP 활성을 Roar CETP 활성 검정 키트 (RB-CETP; Roar Biomedical)로 측정하였다. 마우스는 내인성 CETP 활성을 지니지 않으므로, 이러한 프로토콜의 변형이 도입되었다. 인간 혈청을 CETP 공급원으로서 이용하였고 공여체 및 억셉터 입자와 함께 (CETP 활성 검정 키트의 성분) 백신화된 마우스로부터의 동일한 양의 혈청과 혼합시켰다.

CETP-억제 항체를 함유하는 마우스 혈청은 이러한 검정에서 신호의 감소를 발생시켰다. 무관한 펩티드가 주입된 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군으로서 이용되었다.

모노클로날 항체에 의한 억제의 시험을 위해, 지시된 양의 정제된 항체를 인간 혈청에 첨가시켰다.

실시예 1: 여러 잠재적인 CETP 에피토프의 비교

주입된 펩티드 및 CETP 에 대한 중간 항체 역가 (도 1a 및 1b 참조).

이러한 데이터는 아미노산 서열 SEQ ID No. 1을 포함하거나 이로 구성되는 펩티드의 투여가 펩티드 자체에 대한 항체는 물론 성숙 CETP 단백질에 대한 항체도 형성함을 명백히 나타낸다. 그 밖의 CETP 단편의 투여는 개개 단편에 대한 항체의 형성만을 유도하였고 성숙 CETP 단백질에 대해서는 항체의 형성을 유도하지 않았다.

실시예 2: SEQ ID No . 1 및 이의 트렁케이션된 변이체에 대한 면역 반응의 비교

단일 백신화된 마우스로부터의 혈청 첨가시 인간 혈청에서 주입된 펩티드 및 CETP 에 대한 중간 항체 역가 뿐만 아니라 인간 혈청의 CETP 활성을 감소시키는 항체를 지니는 마우스의 수 및 CETP 활성 억제 퍼센트 (도 2a, 2b, 3 및 4 참조).

이러한 데이터는, WWLGID (SEQ ID No. 24)를 포함하는 CETP 단편이 성숙 CETP에 대한 항체의 형성을 유도할 수 있음을 나타내었다. 이와 대조적으로, SEQ ID No. 23으로부터 유래되며 아미노산 서열 SEQ ID No. 24를 포함하지 않는 그 밖의 CETP 단편은 이러한 효과를 나타내지 않았다.

실시예 3: CETP 활성의 억제

실시예 4:

모노클로날 항체:

Balb/c 마우스를 KLH에 커플링된 15 ㎍의 순 펩티드 SEQ ID No. 10으로 백신화시켰다. 알히드로겔(alhydrogel)을 애쥬번트로서 이용하였다. 높은 항-CETP 단백질 역가를 지니는 마우스의 비장 세포를 표준 기법 (문헌[Kohler, G. and Milstein, C. Nature. 256 (1975): 495-497]으로부터 구성된 프로토콜)에 따라 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 주입된 펩티드 뿐만 아니라 재조합적으로 발현된 인간 CETP 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 생성에 대해 하이브리도마 클론을 표준 ELISA에서 시험하였다. 선택된 클론을 배양하고 모노클로날 항체를 표준 프로토콜에 따라 조직 배양 상청액으로부터 정제하였다.

모노클로날 항체의 서열화:

RNA를 하이브리도마 세포로부터 추출하고 올리고(dT) 프라이머를 이용한 역전사에 의해 cDNA을 생성하였다. 이어서 모노클로날 항체 DNA의 VH 및 VL 영역 둘 모두를 증폭시키기 위한 가변 도메인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

VH 및 VL 생성물을 추출하고, 겔 여과시키고, 서열화 벡터로 클로닝하고, TOP10으로 형질전환시켰다. 선택된 콜로니를 골라내어 서열화를 통해 분석하였다.

4개의 선택된 모노클로날 항체로부터의 데이터:

클론 CJ7-6-B7, 5/C7-6-C8, 12/B3-5-B11, 및 BTS4-1.

인간 CETP 단백질 ELISA 및 CETP 활성 억제를 상기 기재된 대로 수행하였다.

모노클로날 항체에 의한 인간 CETP 단백질의 인지 (도 5 참조).

이러한 데이터는, 4개 모두의 항체가 코팅된 CETP 단백질을 인지하고 있음을 나타내었다. ELISA에서의 적정을 모든 항체에 대해 동일한 양으로 시작하였다 (2 mg/ml 희석). 예상된 바와 같이, 모노클로날 항체는 이들의 ELISA 신호에 있어서 차이를 나타내었는데, 이는 코팅된 단백질에 대한 상이한 친화성으로 설명될 수 있다.

인간 혈청에서 모노클로날 항체에 의한 CETP 활성의 억제 (도 6 참조).

이러한 데이터는 4개 모두의 항체가 CETP에 결합할 뿐 아니라 CETP 활성도 억제함을 나타내었다. 첨가되는 항체의 양이 높을수록, CETP 활성의 더 큰 하락이 관찰되었다.

모노클로날 항체의 서열 (가변 도메인만이 제공됨):

CJ7 -6-B7

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5 C7 -6- C8

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12B3-5-B11

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BTS4 -1

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Asp Trp Leu Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 89 Phe Gly Phe Pro Lys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 90 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Ser Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 91 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Phe Ser Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 92 Phe Gly Phe Pro Ser His Ile Ile Ile Asp Trp Leu Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 93 Phe Gly Phe Pro Ser His Leu Ile Ile Glu Trp Leu Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of 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16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 100 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Pro Ile Asp Trp Leu Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 101 Phe Gly Phe Pro Ser His Leu Phe Ile Asp Trp Ala Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 102 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 102 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Tyr Ile Asp Trp Leu Gln 1 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope of a CETP fragment <400> 103 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Phe Ile Asp Trp Leu Gln 1 5 10 <210> 104 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 104 Asn Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly His Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 105 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Leu Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Asn Gly Gly Ser Gln Asn Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Asn Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 106 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 106 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg His Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 107 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 107 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Cys 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ile Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ala His Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 108 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 109 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 109 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 110 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Lys Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Val Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Gln Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 111 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 111 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Gln Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

6 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되고 아미노산 서열 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID No. 23)로부터 유래되는 펩티드로서, 아미노산 서열 WWLGID (SEQ ID No. 24)을 포함하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열이 YTTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 1), YGYTTAWWLGIDQSID (SEQ ID No. 7), TTAWWLGIDQS (SEQ ID No. 8), TAWWLGIDQS (SEQ ID No. 9), AWWLGIDQS (SEQ ID No. 10), WWLGIDQS (SEQ ID No. 11), YTTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 13), YTTAWWLGID (SEQ ID No. 14), TTAWWLGIDQ (SEQ ID No. 18) 및 TTAWWLGID (SEQ ID No. 19)로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 펩티드가 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 시스테인 잔기를 포함함을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 이용하기 위한 펩티드.
제 4항에 있어서, 죽상경화증과 관련된 질환이 말초 동맥 폐쇄 질환(peripheral arterial occlusive disease), 관상동맥 심질환(coronary heart disease), 중풍성 뇌졸중(apoplectic cerebral insultus) 및 뇌졸중(stroke)으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 펩티드.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 펩티드가 면역화 당 0.5 내지 500 ㎍, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍의 양으로 개체에게 투여됨을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드를 포함하는 백신.
제 7항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 커플링되거나 융합되어 있음을 특징으로 하는 백신.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 피내, 피하 또는 근내 투여용으로 제형화됨을 특징으로 하는 백신.
제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 애쥬번트, 바람직하게는 수산화알루미늄으로 제형화됨을 특징으로 하는 백신.
제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 상기 하나 이상의 펩티드를 면역화 당 0.5 내지 500 ㎍, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍의 양으로 포함함을 특징으로 하는 백신.
제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 이용하기 위한 백신.
제 12항에 있어서, 죽상경화증과 관련된 질환이 말초 동맥 폐쇄 질환, 관상동맥 심질환, 중풍성 뇌졸중 및 뇌졸중으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드에 결합하는 항체.
제 14항에 있어서, 항체가 중쇄 가변 ("VH") 영역 및 항체 경쇄 가변 ("VL") 영역을 포함하고, 각각의 영역이 상보성 결정 영역을 포함하며, VH 영역의 상보성 결정 영역이 아미노산 서열 NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID No. 104), EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 105), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID No. 106) 또는 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID No. 107) 중의 하나 이상을 지니고, VL 영역이 아미노산 서열 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No 108), QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK (SEQ ID No. 109), DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID No. 110) 또는 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID No. 111) 중의 하나 이상을 지님을 특징으로 하는 항체.