CN103635204B - Cetp片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由6至20个氨基酸残基组成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQ？ID？No.23)衍生的肽和结合这些肽的抗体，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQ？ID？No.24)。

Description

CETP片段
发明领域
本发明涉及能影响CETP体内活性的肽。
发明背景
与动脉粥样硬化有关的疾病，如心血管疾病(CVD)以及中风和周围动脉闭塞性疾病(peripheralarterialocclusiondisease)，是在美国、欧洲和亚洲大部分地区最主要的死亡起因。与1990年相比，CVD引起的死亡率在2020年将增加90%。
有多种风险因子对形成动脉粥样硬化损伤负责。循环中的脂蛋白谱、动脉高血压和滥用烟碱在此方面尤其具有重要性。
在综合性流行病学研究中，可以证明血清胆固醇水平和冠心病发生之间的正向相关。较高的低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)水平构成较高的心血管风险，并且直接与增加的动脉粥样硬化风险相关。通常使用他汀类(Statins)如HMG-CoA还原酶抑制剂，其成功地降低循环中的LDLc水平。然而，尽管由于积极的他汀治疗减少了冠心病事件，但相当大的剩余心血管风险仍然是一项挑战。如此，迫切需要新的治疗学。
除了LDL胆固醇以外，血管保护性高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)的水平在估测心血管疾病的风险概况时也起着重要作用。流行病学研究已证明HDLc水平和动脉粥样硬化之间的反向关系。HDLc水平是独立于LDLc值的强预测物。因此，假定HDLc水平具有动脉粥样硬化保护性效果。升高的HDLc水平因而是一个主要目的和另外的靶物。
使用他汀类的单一疗法不有效升高HDLc水平，用此类型的药理学化合物来治疗和预防动脉粥样硬化是不充分的。目前针对升高HDLc水平的选择是贝特类(fibrates)和烟酸(niacin)。烟酸尤为有效，然而其使用受到不良作用的限制，该不良作用导致患者的低依从性。迫切需要用于通过他汀类升高HDLc水平以补偿LDL降低的有效且安全的方法。在这一方面，将对CETP的抑制作为单一疗法或作为附加疗法是一个有吸引力的目标。
胆固醇酯转移蛋白(CETP)是负责包括胆固醇酯和甘油三酸酯(TG)在内的中性脂质在脂蛋白之间转移的一种血浆糖蛋白。来自动脉粥样硬化保护性HDL的胆固醇酯被转移至促动脉粥样硬化生成性载脂蛋白(apo)B脂蛋白(LDL和VLDL)以交换TG。这导致更低的HDL水平并升高LDL和VLDL的水平。
据假定，CETP(最可能依赖于代谢背景)是用于实现增加HDL血浆水平的目标的有价值的治疗性靶物。
许多物种不具有CETP。在易感于动脉粥样硬化的物种如家兔和人中，CETP活性较高。其它对动脉粥样硬化为抗性的物种不具有CETP且具有较高的HDLc水平。
在使用家兔和仓鼠的动物实验中，用抗CETP单克隆抗体、反义寡核苷酸或CETP抑制剂对CETP的短暂抑制导致HDL水平增加。
已描述了数类CETP抑制剂，其中一些已经处于后期临床试验中(例如dalcetrapib(SteinEA,EurHeartJ.31(4)(2010):480-8)anacetrapib(CannonCP,NEnglJMed.363(25)(2010):2406-15和torcetrapib(NissenSE,NEnglJMed.356(13)(2007):1304-16)。
在US5,512,548和WO93/011782中，描述了能抑制CETP的多肽及其类似物，所述CETP是催化胆固醇酯从HDL到VLDL和LDL的转移，因此所述多肽及其类似物若对患者施用时具有抗动脉粥样硬化活性。依照这些文献，这类CETP多肽抑制剂衍生自各种来源的apoC-I，其中尤其是多个最长至第36位氨基酸的N末端片段已鉴定为CETP抑制剂。
还有，在US5,880,095A中披露了结合CETP的肽，其能抑制个体中CETP的活性。所述CETP抑制性蛋白质包含猪apoC-III的N末端片段。
在US2006/0276400和WO96/034888中披露了自CETP衍生且包含T细胞和/或B细胞表位的肽。这些肽能在体内诱导CETP特异性抗体的形成。
在US2004/0087481和US6,410,022B1中披露了由于诱导CETP特异性免疫应答，能用于治疗和预防心血管疾病诸如例如动脉粥样硬化的多种肽。这些肽包含并非衍生自CETP的T辅助细胞表位和至少一个来自CETP的B细胞表位，并且可以直接自后者衍生。T辅助细胞表位有利地自破伤风类毒素衍生，并共价结合CETP的至少一个B细胞表位。通过使用对该生物体而言外来的T辅助细胞表位，可以在个体体内诱导抗体，这些抗体针对由至少一个CETP-B细胞表位组成的肽部分。
在WO2006/029982中，描述了要用于制备供治疗或预防动脉粥样硬化的药物的CETP模拟表位。
已有多个关于CETP的疫苗接种办法建议。有人用含有自CETP的C末端衍生的肽作为抗原的疫苗来处理家兔。免疫后的家兔具有降低的CETP活性和改变的脂蛋白水平，具有增加的HDL和降低的LDL值。此外，动脉粥样硬化模型动物经处理还显示出比对照动物的动脉粥样硬化损伤减少(RittershausCW,ArteriosclerThrombVascBiol20(2000):2106-12)。
由AmericanBiotechnologyCompanyAvant用疫苗CETi-1实施的II期临床研究的结果已被公开(BioCenturyExtraForWednesday,October22,2003)。在此II期研究中，与在先前I期研究中一样，证实了非常好的安全性概况而没有任何可疑的副作用，从而允许得出结论，即预期没有因抗CETP疫苗接种法引起的副作用。然而，就功效而言，Avant疫苗令人失望，因为它并不比安慰剂治疗引起显著更好的HDL水平增加。
本发明的一个目的是提供用于降低个体中CETP活性的工具(means)和方法。
本发明涉及由6至20个氨基酸残基组成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生的肽，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQIDNo.24)。
令人惊讶地，发现包含氨基酸序列WWLGID的肽能诱导哺乳动物特别是小鼠中针对CETP的抗体。这些抗体能够结合CETP，并且降低所述蛋白质的活性。公知的是，在具有CETP活性的哺乳动物中，通过例如接种疫苗(Thomaseta1,HumanVaccines5(2009):79-84)或小分子抑制剂(Luschereta1.,EurHeartJ33(2012):857-865;Krausseta1.,JLipidRes53(2012):540-547)来降低此活性导致HDL水平的升高。哺乳动物中HDL水平的升高导致动脉粥样硬化和其它与动脉粥样硬化有关的疾病(特别是心血管疾病)的减轻。
本发明的包含氨基酸序列WWLGID的肽是从具有氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)的肽(其为人CETP的片段(ProteinDataBank登录号2OBD_AGI:126031487))衍生的。具有氨基酸序列SEQIDNo.23的肽包含成熟CETP蛋白的氨基酸残基92至121。此CETP蛋白片段及其包含氨基酸序列WWLGID的截短变体诱导(如前文所述)特异性结合CETP的抗体的形成。然而，其它自CETP衍生的包含成熟CETP蛋白的氨基酸残基47至55、152至165、290至300、300至316和403至415的片段尽管存在于全长CETP蛋白表面，却不导致针对(即结合)CETP蛋白的抗体的形成，尽管对哺乳动物施用这类片段诱导路片段特异性抗体的形成。这是令人惊讶地，因为本领域技术人员明显地会预期暴露于CETP蛋白表面的各种CETP片段会是诱导针对CETP蛋白的抗体的形成所必需的。
本领域中公知更长的肽更有可能包含一个或多个这类疫苗中不想要的T细胞表位。对细胞毒性T细胞表位(CD4和CD8)的激活能导致诱导出引起不想要的不良事件(AE)的自体反应性T细胞。因此，熟练技术人员为了避免疫苗中不想要的表位，会使用尽可能短的肽作为抗原以诱导抗原特异性体液免疫应答。因此优选更短的肽-而且事实上化学合成更短的肽能容易得多。
在WO02/098915中披露了具有少于100个氨基酸的多肽，其包含本发明的氨基酸序列SEQIDNo.23。WO02/098915的多肽用于生成针对CETP的抗体。由于WO02/098915中披露的肽的长度，还诱导了可能不能用于治疗或预防动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病的抗体，因为这类抗体可能特异于CETP的与其作用模式不相关的部分。
如本文中使用的，术语“肽”指具有至少6个彼此通过肽键连接的氨基酸残基的聚合分子。
如在本发明的肽的背景中使用的，术语“自…衍生”意指本发明的肽是具有氨基酸序列SEQIDNo.23的肽片段。因此，术语“自…衍生”可与“是…的片段”交换使用。
依照本发明的一个优选的实施方案，由6至20个氨基酸残基组成且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生的肽可包含6至16个氨基酸残基或由其组成。
依照本发明的一个特别优选的实施方案，所述肽包含8至20，优选8至16个氨基酸残基。如果本发明的肽包含C和/或N末端半胱氨酸残基，那么所述肽可包含9至21，优选9至17，或10至22，优选10至18个氨基酸残基。
当本发明的肽包含氨基酸序列SEQIDNo.23的至少8个连续的氨基酸残基，那么所述肽优选地包含氨基酸序列SEQIDNo.10,SEQIDNo.11,SEQIDNo.18和/或SEQIDNo.19，或由其组成。
依照本发明的另一个优选的实施方案，所述肽的氨基酸序列选自下组：YTTAWWLGIDQS(SEQIDNo.1),YGYTTAWWLGIDQSID(SEQIDNo.7),TTAWWLGIDQS(SEQIDNo.8),TAWWLGIDQS(SEQIDNo.9),AWWLGIDQS(SEQIDNo.10),WWLGIDQS(SEQIDNo.11),YTTAWWLGIDQ(SEQIDNo.13),YTTAWWLGID(SEQIDNo.14),TTAWWLGIDQ(SEQIDNo.18)和TTAWWLGID(SEQIDNo.19)，特别优选选自下组：TAWWLGIDQS(SEQIDNo.9),AWWLGIDQS(SEQIDNo.10)和WWLGIDQS(SEQIDNo.11)。
本发明的肽可通过本领域中公知的方法化学合成。当然还可以使用重组方法生成本发明的肽。所述肽可在微生物如细菌、酵母或真菌中生成，在真核生物细胞如哺乳动物或昆虫细胞中生成，或在重组病毒载体如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、Simliki森林病毒(forestvirus)、杆状病毒、噬菌体、辛德比斯病毒(sindbisvirus)或仙台病毒(sendaivirus)中生成。用于生成所述肽的合适细菌包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或任何其它能表达这类肽的细菌。用于表达本发明的肽的合适的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、假丝酵母(Candida)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或任何其它能表达肽的酵母。相应的工具和方法是本领域中公知的。还有，用于纯化并分离重组生成的肽的方法是本领域中公知的，且包括例如凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析等。
为了有助于纯化本发明的肽，可以制备融合多肽，其中将所述肽翻译性地融合(共价连接)至异源多肽，其使得能够通过亲和层析来进行分离。典型的异源多肽是His标签(例如His6；6组氨酸残基)、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不仅帮助肽纯化，还能预防纯化步骤期间肽的降解。如果期望在纯化后移除异源多肽，那么该融合多肽可在肽和异源多肽之间的接合处包含切割位点。所述切割位点可由用酶切割的氨基酸序列组成，所述酶对于该位点处的氨基酸序列是特异性的(例如蛋白酶)。
本发明的肽还可在其N和/或C末端包含与其结合的半胱氨酸残基。
提供在肽的N和/或C末端处的半胱氨酸残基可以促进其对载体的偶联和/或可以增强肽的免疫原性。如果向本发明的肽的C和/或N末端添加半胱氨酸残基，那么本文中提述的氨基酸残基的数目明显增加1或2个氨基酸残基。因此，所述由6至20个氨基酸残基组成并且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生的肽(其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQIDNo.24))可以由7至21个或8至22个氨基酸残基组成。
本发明的特别优选的具有C或N末端半胱氨酸残基的肽选自下组：C-YTTAWWLGIDQS,C-YGYTTAWWLGIDQSID,C-TTAWWLGIDQS,C-TAWWLGIDQS,C-AWWLGIDQS,C-WWLGIDQS,C-YTTAWWLGIDQ,C-YTTAWWLGID,C-TTAWWLGIDQ和TTAWWLGID-C。
依照本发明的一个优选的实施方案，所述肽用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病。
如上文列出的，本发明的肽能诱导抗体的形成，所述抗体能特异性结合尤其在人中存在的CETP。这些抗体对CETP的结合导致CETP在体内活性的降低。其结果是HDL的水平升高。
优选地，与动脉粥样硬化有关的疾病选自下组：周围动脉闭塞性疾病、冠心病、中风性脑发作(apoplecticcerebralinsultus)和中风。
术语“与动脉粥样硬化有关的疾病”指作为动脉粥样硬化的结果的疾病。这些疾病包括周围动脉闭塞性疾病、冠心病和中风性脑发作(参见例如SteinbergD.,J.LipidRes.46(2005):179-190;SteinbergDetal.,J.LipidRes.47(2006):1339-1351)。
依照本发明的一个优选的实施方案，所述肽以每次免疫0.5至500μg，优选1至100μg的量对个体施用。然而，本发明的肽或可以每kg体重0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至300μg的量对个体施用。
可与载体材料组合以产生单剂形式的肽的量将根据所治疗的宿主和特定施用模式而有不同。疫苗的剂量可依照多种因素如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，和抗体在个体中引发所需应答的能力而有不同。可以调整剂量方案以提供最优治疗性应答。例如，可以每日施用数个分开的剂量，或者剂量可以成比例降低，如由治疗情况的紧急性所指示的。还可以根据情况改变疫苗的剂量以提供最优预防性剂量应答。例如，可以总是根据针对CETP的抗体水平，以数天、一周或两周、或甚至数月为时间间隔对个体施用本发明的肽和疫苗。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述肽/疫苗应用2至10次，优选2至7次，甚至更优选多达5次，且最优选多达3次。在一个特别优选的实施方案中，后续疫苗接种之间的时间间隔选定为2周至5年或更长，优选为1个月至长达3年，更优选2个月至1.5年。本发明肽/疫苗的重复施用可以将治疗型疫苗接种的最终效果最大化。
本发明的另一个方面涉及包含至少一种如上文限定的肽的疫苗，所述肽包含6至30个氨基酸残基且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQIDNo.24)。
本发明的疫苗可包含一种或多种，优选2,3,4,5,6,7,8,9或10种选自下组的肽：YTTAWWLGIDQS(SEQIDNo.1),YGYTTAWWLGIDQSID(SEQIDNo.7),TTAWWLGIDQS(SEQIDNo.8),TAWWLGIDQS(SEQIDNo.9),AWWLGIDQS(SEQIDNo.10),WWLGIDQS(SEQIDNo.11),YTTAWWLGIDQ(SEQIDNo.13),YTTAWWLGID(SEQIDNo.14),TTAWWLGIDQ(SEQIDNo.18)和TTAWWLGID(SEQIDNo.19)。
肽的特别优选的组合包括：SEQIDNo.10和11;SEQIDNo.8和9;SEQIDNo.8和10;SEQIDNo.8和11;SEQIDNo.9和10;SEQIDNo.9和11;SEQIDNo.8,9和10;SEQIDNo.8,9和11;SEQIDNo.8,9,10和11;SEQIDNo.10,11和18;SEQIDNo.8,9和18;SEQIDNo.8,10和18;SEQIDNo.8,11和18;SEQIDNo.9,10和18;SEQIDNo.9,11和18;SEQIDNo.8,9,10和18;SEQIDNo.8,9,11和18;SEQIDNo.8,9,10,11和18;SEQIDNo.8和18;SEQIDNo.9和18;SEQIDNo.10和18;SEQIDNo.11和18。
本发明的疫苗还可包含CETP的其它肽片段或其变体或任何能诱导针对CETP(特别是人CETP)的抗体的体内形成的其它肽。尤其合适的是在WO2009/021254中披露的肽。其中披露的肽具有氨基酸序列FX8(F)oPX9HX10X11X12DX2X3X4X5X6X7，其中X8选自下组：G、A、F、Y和K，X9选自下组：E、Y、A、Q、K和S，X10选自下组：H、V、L、F和I，X11选自下组：L、W、S、I、F和Y，X12是V、T、F或I，X2是选自下组的氨基酸残基：F、A、W、R、S、L、Q、V和M，X3是选自下组的氨基酸残基：L、A、S、W、E、R、I和H，X4是选自下组的氨基酸残基：Q、A、H、D、K、R、S和E，X5是S或Y，X6是L、A或I，X7是S、N或T，且o是0或1。优选的组合包含本发明的肽和一种或多种选自下组的肽：FGFPEHLLVDFLQSLS,FPEHLLVDFLQSL,AGFPEHLLVDFLQSLS,FAFPEHLLVDFLQSLS,FGAPEHLLVDFLQSLS,FGFAEHLLVDFLQSLS,FGFPAHLLVDFLQSLS,FGFPEALLVDFLQSLS,FGFPEHALVDFLQSLS,FGFPEHLAVDFLQSLS,FGFPEHLLADFLQSLS,FGFPEHLLVAFLQSLS,FGFPEHLLVDALQSLS,FGFPEHLLVDFAQSLS,FGFPEHLLVDFLASLS,FGFPEHLLVDFLQALS,FGFPEHLLVDFLQSAS,FGFPEHLLVDFLQSLA,FAFPAHLLVDFLQALA,FGFPGHLIWDSLHSLS,FGFPYHHLVDQLHSLS,FGFPYHVQVDVLQSLS,FGFPSHHLQDSLQSLS,FGFPLHFRSDRIQSLS,FGFPKHLYADMSQSLS,FGFPAHLSRDLRQSLS,FGFPFHFAQDSWQSLS,FGFPQHLTTDRAQSLS,FGFPQHLTTDWAQSLS,FGFPQHLTTDRLQSLS,FGFPQHLTTDWLQSLS,ATPSHLIIDRAQ,ATPSHLIIDRAQSLS,FGFPSHLIIDRAQSLS,FGFPSHLIIDWAQSLS,FGFPSHLIIDWLQSLS,FGFPSHLIIDWSQSLS,FAFPAHVSIDWLQSLS,FGFPAHVSIDWLQLLS,FGFPAHVSIDWLQWLS,FGFPAHVSIDWLQNLS,FGFPAHVSIDWLQTLS,FGFPAHVSIDWLQYLS,FGFPAHVSIDWLQSIS,FGFPAHVSIDWLQSLT,FGFPAHVSIDWLQSLY,FAFPAHVSIDWLQALA,FGFPAHVSIDRAQSLS,FGFPTHVSIDWLQSLS,FGFPFHVSIDWLQSLS,FGFPAHISIDWLQSLS,FGFPAHIIIDWLQSLS,FGFPAHLTTDWLQSLS,FGFPAHVFIDWLQSLS,FGFPAHVYIDWLQSLS,FGFPAHVSLDWLQSLS,FGFPAHVSADWLQSLS,FGFPAHVWIDWLQSLS,FGFPAHVFIDWLQSLN,FGFPAHFSIDWLQSLS,FGFPAHVSFDWLQSLS,FGFPEHVFIDWLQSLS,FGFPQHLFTDWLQSLS,FGFPKHLLVDFLQSLS,FGFPAHVSIDWSQSLS,FGFPAHVSIDFSQSLS,FGFPSHIIIDWLQSLS,FGFPSHLIIEWLQSLS,FAFPAHVFIDWLQSLS,FGFPAHVFIDWLQALS,FGFPAHVFIDWLQSLA,FAFPAHVFIDWLQALA,FGFPEHLFVDFLQSLS,FGFPAHVHIDWLQSLS,FGFPAHVPIDWLQSLS,FGFPSHLFIDWAQSLS,FGFPAHVYIDWLQ和FGFPAHVFIDWLQ。
本发明的疫苗还可包含自其它与调节人体内LDL和/或HDL水平有关的蛋白质衍生的抗原。例如，本发明的CETP片段可组合从PCSK9(蛋白质原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin第9型)衍生的表位，如WO2008/125623、WO2010/057242和WO2011/027257所述。
依照本发明的一个优选的实施方案，所述至少一种肽偶联或融合至药学可接受的载体，优选为KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin))。
依照本发明的一个优选的实施方案，所述肽偶联或融合至药学可接受的载体，优选为KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白)、破伤风类毒素、结合清蛋白的蛋白质、乙肝核心抗原、牛血清清蛋白、dendrimer(MAP)、肽接头(或侧翼区)或CRM，优选为CRM197，以及与Singhetal.,Nat.Biotech.17(1999):1075-1081(特别是在该文献表1中的那些)，和O'Haganetal.,NatureReviews,DrugDiscovery2(9)(2003):727-735(特别是其中描述的内源性免疫加强化合物和投递系统)中描述的佐剂物质或其混合物组合。此背景中的偶联化学(例如经由异型双功能化合物如GMBS，以及当然还有其他的如在"BioconjugateTechniques",GregT.Hermanson中描述的化合物)可以选自本领域技术人员已知的反应。此外，疫苗组合物可与佐剂，优选低可溶性铝组合物，特别是氢氧化铝一起配制。当然，可以使用其他佐剂如MF59磷酸铝、磷酸钙、细胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、皂苷类(例如QS21)、MDP衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、聚磷腈(polyphosphazene)、乳剂(例如弗氏(Freund's)、SAF)、脂质体、脂肽、病毒颗粒、iscoms、cochleate、PLG微粒、泊洛沙姆(poloxamer)颗粒、病毒样颗粒、热不稳定性肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、突变体毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合的脂质体。
优选地，本发明的肽经由接头结合载体或佐剂，所述接头选自下组：NHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PEO4-马来酰亚胺)。
包含本发明的肽和药学可接受的载体的疫苗可通过任何合适的应用模式例如皮内(i.d.)、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、鼻内、口腔、皮下(s.c.)等并在任何合适的投递装置中施用(O'Haganetal.,NatureReviews,DrugDiscovery2(9)(2003):727-735)。优选地，将本发明的化合物配制用于s.c.、i.d.或i.m.施用(参见例如"HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulations",SarfarazNiazi,CRCPressInc,2004)。
依照本发明的疫苗包含至少一种肽，其优选地配制为用于i.d.、s.c.或i.m.施用。
优选地，疫苗中的至少一种肽与佐剂(优选为氢氧化铝)一起配制。
通常地，疫苗以0.5至500μg，优选1至100μg，或者0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者例如100fmol至10μmol，优选10pmol至1μmol，特别是100pmol至100nmol的量含有依照本发明的肽。优选地，所述疫苗还可以含有辅助性物质，例如缓冲剂、稳定剂等。
依照本发明的一个特别优选的实施方案，所述疫苗可包含以下组分中的两种或更多种：
依照本发明的一个优选的实施方案，所述疫苗用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病，其中所述与动脉粥样硬化有关的疾病优选地选自下组：周围动脉闭塞性疾病、冠心病、中风性脑发作和中风。
本发明的另一个方面涉及依照本发明的至少一种肽用于制备供预防和/或治疗动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病的疫苗的用途。
本发明的又一个方面涉及用于治疗患有或有风险患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬化有关疾病的个体的方法，在此过程中可对所述个体施用依照本发明的肽或疫苗。
在本发明的疫苗后，待治疗的个体还可以接受其他已知影响人和哺乳动物中LDL和/或HDL水平的活性成分，如他汀类、贝特类、烟酸、胆固醇摄取抑制剂(例如ezetimibe)、ApoA1Milano、去脂化的HDL、植物固醇、PCSK9抑制剂等。
如本文中使用的“治疗”意指治疗已经存在的疾病状态或状况。治疗还可包括抑制(即，使疾病状态或状况的进展停滞)和改善(即，引起疾病衰退)。
如本文中使用的，术语“预防”意指完全或几乎完全停止疾病状态或状况在患者或受试者中发生，尤其是在该患者或受试者先倾向于有染上疾病状态或状况的这类风险的时候。
本发明的另一个方面涉及结合或针对本发明的肽的抗体，所述肽由6至20个氨基酸残基组成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQIDNo.24)。
针对本发明的肽的抗体可用于抑制人或动物体内的CETP活性。因此，这些抗体可用于对人和动物的被动疫苗接种。
可以如本领域中已知的制备依照本发明的抗体(可以是单克隆或多克隆的)。可通过多种技术生成单克隆抗体，所述技术包括常规的单克隆抗体技术，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256:495的标准的体细胞杂交技术。还可以采用用于生成单克隆抗体的其它技术，如对B淋巴细胞的病毒或致瘤性转化。
依照一个优选的实施方案，所述抗体包含重链可变("VH")区和抗体轻链可变("VL")区，每个区包含互补决定区，其中VH区的互补决定区具有以下一种或多种氨基酸序列：NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(SEQIDNo.104),EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.105),DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.106)或QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(SEQIDNo.107)，且VL区的互补决定区具有以下一种或多种氨基酸序列：DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo108),QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(SEQIDNo.109),DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo.110)或DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(SEQIDNo.111)。
特别优选的是这样的抗体，其包括包含NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(SEQIDNo.104)的VH区与包含DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo108)的VL区组合，或者包含EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.105)的VH区与包含QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(SEQIDNo.109)的VL区组合，或包含DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.106)的VH区与包含DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo.110)的VL区组合，或包含QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(SEQIDNo.107)的VH区与包含DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(SEQIDNo.111)的VL区组合。
为了创建单链抗体(scFv)，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接于另一个编码柔性接头的片段，从而使得VH和VL序列表达为连续的单链蛋白，VL和VH域由柔性接头连接(例如Birdetal.,Science242:423-426(1988);Hustonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988);McCaffertyetal.,Nature348:552-554(1990))。所述单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个VH和VL的话，可以是二价的，如果使用两个VH和VL的话，或者可以是多价的，如果使用超过两个VH和VL的话。可以生成双特异性或多价抗体，其特异性结合CETP和另一分子。
在另一个方面，可以使用编码抗体的核酸分子制备其它经修饰的抗体。例如，可以按照本说明书的教导使用标准的分子生物学技术制备“Kappa抗体”(IIIetal.,ProteinEng.10:949-57(1997)),“微抗体(Minibody)”(Martinetal.,EMBOJ.13:5303-9(1994)),“双抗体”(Holligeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)),或“Janusins”(Trauneckeretal.,EMBOJ.10:3655-3659(1991)和Trauneckeretal.,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992))。
优选地，本发明的抗体是人源化的。获得这类抗体的方法是本领域中公知的。一种方法是将本文中公开的可变区插入到人抗体支架中(参见例如HouS,etal.JBiochem144(2008):115–20)。
附图简述
在下列附图和实施例中进一步例示了本发明，然而，其不对本发明进行限制。
图1显示针对肽的中值抗-肽滴度(图1A)和中值抗-蛋白滴度(n=5只小鼠每组)(图1B)，所述肽具有自CETP氨基酸序列衍生的SEQIDNo1至6和22。
图2显示针对具有SEQIDNo.1和7至21的肽(截短的肽)的中值抗-肽滴度(图2A)和中值抗-蛋白滴度(图2B)(n=5只小鼠每组)。
图3显示具有抑制CETP活性的抗体的小鼠数目(n=5只小鼠每组)，所述抗体针对具有SEQIDNo.1和7至21的肽(截短的肽)。
图4显示小鼠(n=5只小鼠每组)血清的百分比CETP活性抑制，所述小鼠用具有氨基酸序列SEQIDNo.1,7,8,9,10,11,13,14,15,18和19的肽接种。
图5显示本发明的单克隆抗体对人CETP蛋白的识别。
图6显示依照本发明的单克隆抗体对人血清中CETP活性的抑制。
实施例
材料和方法
疫苗
经由异型双功能接头GMBS(4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)将肽偶联至KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白)。
将15μg的肽与氢氧化铝重悬(氢氧化铝的终浓度为0.2%)。作为缓冲剂，使用甘露醇/磷酸盐。
动物实验
将5只Balb/c小鼠皮下免疫。小鼠可随意获得食物和水，并保持在12h光照/黑暗周期下。实验开始时小鼠通常为8至10周龄。
将小鼠以2周的时间间隔经由s.c.(皮下)路径注射3次，其使用总体积1ml中净含量为15μg的肽，所述肽偶联至KLH并吸附至作为佐剂的明矾。
在末次注射的约2周后取血液。
肽ELISA
为了测定疫苗的免疫原性，将96孔Nunc-Maxisorb板用0.1MNaHCO3，pH9.2-9.4中偶联至牛血清清蛋白(BSA)的1μM相应肽包被。将一种不相关的肽用作阴性对照。将KLH作为阳性对照纳入并以1μg/ml的浓度包被。通过与封闭缓冲液(PBS中5%BSA)温育来阻断非特异性结合。向各孔添加以1:2倍系列稀释的适宜的血清稀释物，并在37℃温育约1小时。在每个ELISA板上，纳入标准血清作为内部对照。所结合的抗体通过与生物素化的山羊抗小鼠IgG温育，接着与偶联至链霉亲合素的辣根过氧化物酶温育来检测。作为底物加入ABTS，并在微孔板阅读器中测量405nm处的光学密度(OD)。滴度定义为该测定法中达到OD最大的50%时的血清稀释度。
蛋白质ELISA
使用在“肽ELISA”章节描述的方案，测试由疫苗接种所诱导的抗体结合重组表达的经N末端融合至GST的人CETP("GST-CETP")的能力。
CETP活性抑制测定法
使用RoarCETP活性测定试剂盒(RB-CETP;RoarBiomedical)测定CETP活性，其通过依照制造商提供的方案测量经荧光标记的底物的转移来测定。小鼠不具有内源性CETP活性，因此引入对此方案的修改。将人血清用作CETP来源，并与来自经疫苗接种小鼠的相同量的血清连同供体和受体颗粒(CETP活性测定试剂盒的组分)一起混合。
含有CETP抑制性抗体的小鼠血清在此测定法中导致信号降低。来自用不相关肽注射的小鼠的血清充当阴性对照。
为测试单克隆抗体造成的抑制，将指示量的纯化抗体添加到人血清中。
实施例1：数种潜在CETP表位的比较
抗注射的肽和抗CETP的中值抗体滴度(参见图1A和1B)
这些数据清楚地显示，施用包含氨基酸序列SEQIDNo.1或由其组成的肽导致不仅形成针对肽本身的抗体，而且还形成针对成熟CETP蛋白的抗体。其它CETP片段的施用仅诱导针对相应片段的抗体的形成，而未诱导针对成熟CETP蛋白的抗体的形成。
实施例2：对SEQIDNo.1及其截短型的免疫应答的比较
抗注射的肽和抗CETP的中值抗体滴度，以及具有降低人血清CETP活性的抗体的小鼠数目和在添加来自单个经接种小鼠的血清时在人血清中的百分比CETP活性抑制(参见图2A、2B、3和4)。
这些数据揭示，包含WWLGID(SEQIDNo.24)的CETP片段能够诱导针对成熟CETP的抗体的形成。与之相对，自SEQIDNo.23衍生的不包含氨基酸序列SEQIDNo.24的其它CETP片段不显示这些效果。
实施例3：对CETP活性的抑制
n.t.由于抗-蛋白的滴度太低而未测试
实施例4：
单克隆抗体：
将Balb/c小鼠用偶联至KLH的净含量15μg的肽SeqIDNo.10接种。将铝胶(Alhydrogel)用作佐剂。依照标准技术将具有高水平抗CETP蛋白滴度的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合(方案改编自G.和Milstein,C.Nature.256(1975):495–497)。在标准ELISA中测试杂交瘤克隆中特异性识别被注射的肽的抗体以及重组表达的人CETP蛋白的生成。依照标准方案培养选定的克隆并从组织培养上清液纯化出单克隆抗体。
对单克隆抗体的测序：
从杂交瘤细胞提取RNA并通过用寡聚(dT)引物逆转录创建cDNA。接着，实施PCR反应，其使用不同的域引物来扩增单克隆抗体DNA的VH和VL区两者。提取VH和VL产物并经凝胶纯化，克隆到测序载体中并转化到TOP10中。挑取选择的菌落并经由测序分析。
来自4种选定的单克隆抗体的数据：
克隆CJ7-6-B7、5/C7-6-C8、12/B3-5-B11和BTS4-1。
如上文描述的实施人CETP蛋白ELISA和CETP活性抑制。
单克隆抗体对人CETP蛋白的识别(参见图5)。
这些数据揭示，所有4种抗体均识别包被的CETP蛋白。对于所有抗体，ELISA中的滴定均以相同量开始(2mg/ml稀释液)。如预期的，单克隆抗体在其ELISA信号中有差异，这可用对包被蛋白的不同亲和力解释。
单克隆抗体对人血清中CETP活性的抑制(参见图6)。
这些数据揭示，所有4种抗体不仅结合CETP，而且还抑制CETP活性。添加的抗体量越高，观察到对CETP活性降低更多。
单克隆抗体的序列(仅给出可变域)：
CJ7-6-B7
重链：
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA
轻链：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK
5C7-6-C8
重链：
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS
轻链：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK
12B3-5-B11
重链：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS
轻链：
DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK
BTS4-1
重链：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS
轻链：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK

Claims (19)

1.由6至20个氨基酸残基组成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQIDNo.23)衍生的肽，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQIDNo.24)。
2.依照权利要求1的肽，其特征在于所述肽的氨基酸序列选自下组：YTTAWWLGIDQS(SEQIDNo.1),YGYTTAWWLGIDQSID(SEQIDNo.7),TTAWWLGIDQS(SEQIDNo.8),TAWWLGIDQS(SEQIDNo.9),AWWLGIDQS(SEQIDNo.10),WWLGIDQS(SEQIDNo.11),YTTAWWLGIDQ(SEQIDNo.13),YTTAWWLGID(SEQIDNo.14),TTAWWLGIDQ(SEQIDNo.18)和TTAWWLGID(SEQIDNo.19)。
3.依照权利要求1或2的肽，其特征在于所述肽在其C和/或N末端包含半胱氨酸残基。
4.依照权利要求1或2的肽，其用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病。
5.依照权利要求4的肽，其特征在于所述与动脉粥样硬化有关的疾病选自下组：周围动脉闭塞性疾病、冠心病、中风性脑发作和中风。
6.依照权利要求1或2的肽，其特征在于所述肽以每次免疫0.5至500μg的量对个体施用。
7.依照权利要求6的肽，其特征在于所述肽以每次免疫1至100μg的量对个体施用。
8.包含至少一种依照权利要求1-3中任一项的肽的疫苗。
9.依照权利要求8的疫苗，其特征在于至少一种肽偶联或融合至药学可接受的载体。
10.依照依照权利要求9的疫苗，其特征在于所述的药学可接受的载体为KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白)。
11.依照权利要求8-10中任一项的疫苗，其特征在于将至少一种肽配制成用于皮内、皮下或肌内施用。
12.依照权利要求8-10中任一项的疫苗，其特征在于将至少一种肽与佐剂一起配制。
13.依照权利要求12的疫苗，其特征在于所述佐剂为氢氧化铝。
14.依照权利要求8-10中任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗以每次免疫0.5至500μg的量包含所述至少一种多肽。
15.依照权利要求14的疫苗，其特征在于所述疫苗以每次免疫1至100μg的量包含所述至少一种多肽。
16.依照权利要求8-10中任一项的疫苗，其用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和与动脉粥样硬化有关的疾病。
17.依照权利要求16的疫苗，其特征在于所述与动脉粥样硬化有关的疾病选自下组：周围动脉闭塞性疾病、冠心病、中风性脑发作和中风。
18.结合依照权利要求1-3中任一项的肽的抗体。
19.依照权利要求18的抗体，其特征在于所述抗体包含的重链可变("VH")区和抗体轻链可变("VL")区分别如下所示：
(1)VH：
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(SEQIDNo.104),
VL：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo108)；
(2)VH：
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.105),
VL：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(SEQIDNo.109)；
(3)VH：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNo.106),
VL：
DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(SEQIDNo.110)；
或(4)VH：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(SEQIDNo.107)，
VL：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(SEQIDNo.111)。
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