JP2014517929A - 音響光学偏向器を制御するための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、音響光学レンズ（ＡＯＬ）、及び対応する方法を対象とする。本発明のＡＯＬは、第１の音響光学偏向器と第２の音響光学偏向器とを備え、第１の音響光学偏向器と第２の音響光学偏向器のそれぞれが、それぞれの音波をサポートするように構成される。このＡＯＬは、第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器のそれぞれについて第１の駆動信号及び第２の駆動信号を合成するためのドライバを含む。ドライバは、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる関数によって位相変調されるように駆動信号を合成するように構成される。これらの関数は、好ましくは非正弦曲線であり、固定された収差補正、動的収差補正、及びＺ走査のうちの１以上を行うのにより高次で十分な大きさを有する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザビームなど電磁放射のビームを操作することを含む装置及び方法に関する。より詳細には、本発明は、たとえば適切な駆動信号を決定することによって、ビームを望むように偏向させるように音響光学レンズを構成するための装置及び方法に関する。好ましい実施形態では、点、１Ｄ線、２Ｄ平面、又は３Ｄ体積であってよい標的空間内でビームを選択的に集束することによってなど、ビームによって標的空間を撮像する。

レーザビームなど電磁放射を３次元で迅速に操向し集束することができることは、生物学、マイクロファブリケーション、及びデータ記憶におけるいくつかの応用分野にとって非常に魅力的である。

レーザ走査共焦点イメージングは、生物学において重要且つ広く使用されているツールであり、その理由は、像を汚す焦点外の光を排除することによって、細胞下構造の高コントラスト可視化、及び生体組織又は固定された組織内の蛍光インジケータを用いた生理的プロセスの監視が可能になるからである。従来の共焦点法は、光の侵入が良好であり散乱が最小限である比較的浅い深さで最も良好に働く。通常、従来の共焦点イメージングは、組織内深く（１００μｍ超）の生物学的活動（biological activity）を撮像するために使用することができない。しかし、非線形多光子励起に依拠し、より短い波長で２次以上の高調波光を生成する、又は光強度が焦点ボリューム（focal volume）の中央で多光子閾値を超える蛍光体を選択的に活性化する、あるタイプのレーザ走査共焦点顕微鏡法が開発されている。そのような蛍光は、これらの蛍光体によって全方向に放出され、一般に、高開口数のレンズシステム及び光電子増倍管によって拾い上げられる。組織を通して焦点スポットが走査されるとき、高調波プロセス又は蛍光体によって放出される光強度は、それぞれ生物組織の非線形性、又は組織のその部分内の蛍光インジケータによる染色の輝度に従って変わる。光電子増倍管信号を２光子焦点ボリュームの既知の位置と組み合わせることにより、組織内の蛍光強度の点、１Ｄ、２Ｄ、又は３Ｄの像を再構築することができる。

この技法は２光子（又は多光子）顕微鏡法として知られ、多光子励起に使用される励起波長がより長く（７００〜１０００ｎｍの波長）、これらの波長は従来の共焦点イメージングに使用される波長より散乱が少ないので、また、共焦点性が本質的に励起体積から生じ、放出される光子すべてを、像を構築するために使用することができるので、共焦点顕微鏡法よりはるかに深い深さで撮像することができる。その低いレベルの光損傷を達成可能であることと共に、これらの特性により、２光子イメージングは、生理的プロセスを細胞レベル及び細胞下レベルで、試験管内（in vitro）及び生体内（in vivo）の両方において調査するための極めて強力な方法になった。

２光子イメージングは、神経科学で特に普及したが、それは、ニューロンネットワーク活動の動的な特性を、カルシウムインジケータを使用して無傷の脳組織内で撮像することを可能にしたからである。２光子顕微鏡法の空間分解能はこの課題に十分に適しており、ニューロン間の小さなシナプスの接続を解像することさえ可能にする。また、多光子励起は、神経伝達物質を放つ「ケージ化化合物（caged compound）」を光分解するために使用され始めており、細胞上へのシナプス入力を模倣することを可能にする。この技法は、シナプス統合を理解し、したがって個々のニューロンが低レベルの計算をいかに実施するか判定するために非常に重要となる可能性がある。

光顕微鏡法の他の応用例は、形態学的構造を撮像すること、及び遺伝的に符号化された光活性化タンパク質でニューロン活動を制御することを含む。

注目の多数の生理的プロセスは、光を吸収し散乱する組織内の小さな細胞構造内において、１〜１００ｍｓの時間スケールで急速に生じる。２光子顕微鏡法がもたらす深い組織への侵入及びマイクロメートル以下の分解能は、この手法を、そのような生物学的現象を研究するために普及させた。しかし、レーザビームを操向し像を構築するためにガルバノミラーを使用する現行の２光子顕微鏡は、１〜１００ｍｓの時間スケールで生じる多数の高速の、空間的に分布するプロセスを監視するには遅すぎるものである。なぜなら、それらの顕微鏡は、像を形成するために、通常１００ｍｓかかるからである。さらに、今までに開発されている大抵の顕微鏡は、単一のＸＹ平面を撮像するように最適化されている。Ｚ方向での集束は、通常、試料に対して装置を移動することによって（たとえば、対物レンズを試料に近づける、又は試料から遠ざけることによって）行われる。

これらの欠点のいくつかに対処するために従来技術で提案されている一つの有望な手法は、２光子レーザビームを操向するために、ガルバノメータではなく高速の音響光学偏向器（ＡＯＤ）を使用することである。ＡＯＤは、慣性によって制限されない高速の、質量のない走査解決策を提供する。ＡＯＤを使用することの利点は、放射のビームを、ガルバノメータベースのシステムの場合よりはるかに急速に点から点に移動させることを可能にすることである（ＡＯＤでの移動時間５〜２５μｓをガルバノメータでの２００〜４００μｓと比較されたい）。これは、いくつかの潜在的な利点を有する。第１に、像を迅速に走査することができる。第２に、多点測定を、非常に高い時間分解能で、長いドウェル時間（dwell time）で行うことができる（たとえば、移動時間１５μｓのＡＯＤシステムを使用して、３３点をサンプルレート１ｋＨｚで、ドウェル時間１５μｓで同時にサンプリングすることができる、或いは換言すれば、３３個の異なる点を１秒当たり１０００回監視することができる）。これは、ランダムアクセス多光子（ＲＡＭＰ）顕微鏡法として知られている。したがって、ＡＯＤの使用により、部位間でビームを移動させるのに時間を取られるのではなく、はるかに多くの時間を、関心領域から光子を実際に収集するために充てることができる。

ビームをＸＹ平面内で偏向させることに加えて、原理上は、軸ごとの二つのＡＯＤの使用をも使用し、レーザビームをＺ方向で集束することができる。たとえば、カプラン（Ｋａｐｌａｎ）らは、非特許文献１において、二つ又は四つのＡＯＤを使用し、レーザビームをＸＺ平面内で、又はＸＹＺ体積内のどこかで集束することを記載している。３Ｄ体積内での集束を達成するために、ＸＺ平面内で集束するための二つのＡＯＤに、ＹＺ平面内で集束するための二つのＡＯＤが続く。これらの着想は、特許文献１でさらに発展され、ＡＯＤのコンパクトな構成が初めて開示され、これらのＡＯＤを駆動するための実際的な式が初めて与えられている。

いくつかの研究所が、ニューロンから高速の２光子蛍光測定を行うために、また２Ｄでの一光子光分解のために、二つのＡＯＤを有するスキャナを開発した。しかし、この手法の欠点は、像を形成するのが、色分散及び時間的分散によって複雑であること、また走査のスピードが高まるにつれてＡＯＤが集束効果を導入することである。照明点像分布関数（illumination point spread function/iPSF）の結果的な非点収差は、レンズで補正することができるが、単一の走査スピードについてのみであり、その結果、二つのＡＯＤを使用する大抵の顕微鏡は、像を構築するために点測定を使用し、これは低速であり、１像当たり数秒かかる可能性がある。さらに、二つのＡＯＤで３Ｄの信号を監視することは、焦点が走査スピード及びドウェル時間に関連付けられることが不可避であるため制限を受ける。

これらは、高速３Ｄイメージングにおけるいくつかの最近の進歩であった。皮質の２５０μｍ立方体内の多数の位置（約１００個のニューロン）をサンプリングすることが、対物レンズの高速圧電制御を洗練されたガルバノメータベースの走査と組み合わせることによって行われている（非特許文献２参照）。より速い連続集束が、ピストンミラーと、球面収差を補正する独創的な二重対物システムとを使用して実証されている（非特許文献３参照）。ＡＯＤの集束特性もまた、高速集束に使用された。

カプラン（Ｋａｐｌａｎ）らは、対向伝搬するチャープ音波と共に二つのＡＯＤを使用し、高速（４００ｋＨｚ）円筒レンズを作り出すことができることを初めて実証した。また、四つのＡＯＤを使用し、球面レンズを生成することができる可能性があることも提案した。これらの着想がさらに発展され、迅速に集束しＲＡＭＰ測定を実施することができる原理上の３Ｄ ２光子顕微鏡の証明が構築された（非特許文献４参照）。しかし、四つの従来のＡＯＤに基づくこのシステムの限界は、光が対物レンズの自然焦点面（natural focal plane）から±２５μｍを超えて集束した場合、光透過効率が急速に降下することであった。ニューロンプロセスにおけるカルシウムトランジェントを測定することによって、３Ｄ八面体形状の視野内で高速ポインティングが実証されたが、ピコ秒範囲へのレーザパルスの時間的分散により、２光子励起効率は不十分であった。さらに、点測定に制限されていたため、像形成は遅かった（数秒）。ＲＡＭＰ測定は、ＲＯＩを正確に選択することができるように、研究すべき体積の多数の高解像度画像を必要とするので、これは問題である。これらの、また他の技術的難点により、ＡＯＤは、これまで２光子顕微鏡法に適した偏向器として広く受け入れられなかった。

これらの技術的難点の多くが、特許文献１に開示されているように、フェムト秒レーザビームを高速で走査し集束させるために使用することができるコンパクトな球面音響光学レンズ（ＡＯＬ）を使用することによって対処された。この出願における技術革新のいくつかに由来する性能の改善が、非特許文献５で報告されている。このＡＯＬのコアには、特性がそれらの機能のために最適化された四つの音響光学結晶がある。このＡＯＬを従来の２光子顕微鏡に組み込むことにより、ラスタ走査モードで迅速に撮像し、３０ｋＨｚで３ＤのＲＡＭＰ測定を実施することができる高速３Ｄ ２光子顕微鏡を生み出すことができる。

二つのＡＯＤから形成された動的円筒レンズが、特許文献１の図８に示されている。各ＡＯＤ結晶上の音響トランスデューサは、結晶の光開口（optical aperture）を横切って伝搬する超音波を生成する。音波は、結晶の屈折率の変化を誘導し、それにより、入来するレーザビームを、音波の周波数によって決定される角度で回折する。音の周波数を時間と共に変化させることにより（チャーピング）、光波面を湾曲させ、ＸＺ平面内で線状焦点にすることができる。静止焦点は、音が結晶を横切って伝搬するとき音のカーテンによって作り出される動きを打ち消すために、二つの対向伝搬するＡＯＤを必要とする。したがって、二つのＡＯＤ及び関連の対物光学系（たとえば、対物レンズ）を使用し、静止円筒レンズを形成することができる。

特許文献１の図７及び図８に示されているように、負のチャープレートを増大することにより、得られる線状焦点が上に移動し（Ｚを増大する）、一方、ランプ中心周波数間の差を調整することにより、Ｘ位置が調整される。正のチャープレートに変化させることにより、仮想焦点がＡＯＤより上にある発散光波面が生成される。

対向伝搬するＡＯＤの、第１の対に直交する第２の対を使用し、ＹＺ平面内で集束することができる（特許文献１の図１０参照）。これらのＡＯＤは、特許文献１に開示されているように、第１のＡＯＤでインターリーブされ、半波プレート及び偏光子が伴う。これらの四つのＡＯＤは、球状に発散又は収束するビームをもたらすように光波面を形作ることができる。これを使用し、後続の固定レンズシステムの自然焦点面より上又は下の点に集束することができる。

特許文献１のデバイスは、非常に有望な結果を生み出すが、いくつかの欠点がある。

第１の欠点は、連続走査モードで使用されるとき、今までのところ、画定されたＸＹ平面内で完全に走査を実施することが可能であるにすぎなかったことである。したがって、連続走査にＺにおいて移動する成分がある走査を実施することは不可能であった。これは、焦点のＸ位置及びＹ位置が、ＡＯＤに加えられる駆動周波数の絶対差に比例し、一方、焦点のＺ位置が、ＡＯＤ駆動信号のチャープレートに比例するということによる。したがって、ビーム焦点を所与のＸＹ平面内で移動することは、ビーム焦点をＺで走査することよりはるかに容易であった。

これは、多数の応用分野に対して著しい欠点である。その理由は、関心領域が好都合にも純粋なＸＹ平面内にあることはめったにないからである。たとえば、脳組織内の樹状構造を走査するときには、直線でなく、また純粋にＸＹ平面内に配向されていない経路に沿って走査することが望ましい。

したがって、焦点を空間内でより任意に、たとえばある成分がＺ方向にある状態で走査することができる駆動信号を決定するための方法及び装置を工夫することが非常に望ましいであろう。

第２の欠点は、結果の精度が、システム内で使用されている光学構成部品の品質によって制限されていることである。通常、様々なレンズ（たとえば、少なくとも対物レンズ）が顕微鏡に使用され、最高品質の構成部品でさえ、完全なレンズに比べて何らかの固有の収差を有することになる。収差は、最高品質の構成部品だけを使用することによって低減することができるが、これは、顕微鏡全体をより高価なものにする。さらに、最高品質の対物レンズでさえ、完全に平坦なＸＹ平面に対してのみ光を集束するように最適化される。３Ｄ体積内の異なる点に光を迅速に集束するために使用されるときには、市販の対物レンズは完全ではなく、これまで補正することができない収差を導入するように働く。

したがって、固有のシステム収差を何とかして補償することができる駆動信号を決定するための方法及び装置を工夫することが非常に望ましいであろう。これは、同じ構成部品で、より良好な結果を達成することを、或いは、より低級（且つより安価）な構成部品で同様、又はより良好な質の結果を達成することを可能にする。

第３の欠点は、結果の精度が、走査される対象の不均一な性質によってさらに制限され得ることである。脳組織を撮像する例をとると、組織それ自体は、一般に均一な屈折率を有することがなく、撮像が組織の表面より下で行われるということは、その表面と焦点領域との間に介在する脳組織が、ビームを分散させるように働き、点像分布関数（すなわち、３次元すべてにおける焦点のサイズ及び形状であり、ＰＳＦとして知られる）を増大し、結果の質を低下させることを意味する。

したがって、組織によって誘導される収差を何とかして補償することができる駆動信号を決定するための方法及び装置を工夫することが非常に望ましいであろう。これは、より良好な結果を達成することを可能にするはずである。これを達成しようと試みるために、適応光学系として知られる技法が顕微鏡法のために開発されている。そのような方法は、非特許文献６に概説されている。これらの技法はすべて、変形可能なミラー又は位相制御空間光変調器（たとえば、液晶光位相変調器に基づくもの）など何らかの追加の装置を使用し、標本によって誘導される収差を部分的に補償するために顕微鏡の波面を歪める。残念ながら、これらの技法は、すべてＡＯＬＭの敏捷さに比べて非常に遅く、したがって、３Ｄでランダムにアクセスされる各点に必要とされる補正が互いに異なるものになることを予想することができるので、そのポインティングモードでＡＯＬＭと共に使用するに適したものではないことは確かである。

ＷＯ２００８／０３２０６１ ＷＯ２０１０／０７６５７９

カプラン（Ｋａｐｌａｎ）他、「Ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ Ｌｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｖｅｒｙ Ｆａｓｔ Ｆｏｃｕｓ Ｓｃａｎｎｉｎｇ」Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ． ２６、Ｎｏ． １４、２００１年７月１５日、１０７８〜１０８０頁 Ｗ．ゴベル（Ｇｏｂｅｌ）、Ｂ．Ｍ．カンパ（Ｋａｍｐａ）、及びＦ．ヘルムヘン（Ｈｅｌｍｃｈｅｎ）「Ｉｍａｇｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｆａｓｔ ３Ｄ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ」Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４、７３〜７９ （２００７年） Ｅ．Ｊ．ボッチャービー（Ｂｏｔｃｈｅｒｂｙ）、Ｒ．ジャスケイティス（Ｊｕｓｋａｉｔｉｓ）、Ｍ．Ｊ．ブース（Ｂｏｏｔｈ）、及びＴ．ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）「Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ ｈｉｇｈ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｏｐｔ Ｌｅｔｔ ３２、２００７−２００９ （２００７年） Ｇ．レディ（Ｒｅｄｄｙ）、Ｋ．ケレハー（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ）、Ｒ．フィンク（Ｆｉｎｋ）、及びＰ．ザガウ（Ｓａｇｇａｕ）「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１， ７１３〜７２０ （２００８年） ポールＡ．カークビー（Ｐａｕｌ Ａ． Ｋｉｒｋｂｙ）、Ｋ．Ｍ．ナガ・シュリーニヴァス・ナデラ（Ｎａｇａ Ｓｒｉｎｉｖａｓ Ｎａｄｅｌｌａ）、及びＲ．アンガス・シルヴァー（Ａｎｇｕｓ Ｓｉｌｖｅｒ）「Ａ ｃｏｍｐａｃｔ ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ ｌｅｎｓ ｆｏｒ ２Ｄ ａｎｄ ３Ｄ ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ ｂａｓｅｄ ２−ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｏｐｔ． Ｅｘｐｒｅｓｓ １８， １３７２０〜１３７４４ （２０１０年） 「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、マーチンＪ．ブース（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ Ｂｏｏｔｈ）、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ａ．２００７ ３６５ ，２８２９〜２８４３ フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）他、「Ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｆａｓｔ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｃａｎｓ」Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ． ２５、Ｎｏ． ２４、２０００年１２月１５日、１７６２〜１７６４頁 「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」マーチンＪ．ブース（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ Ｂｏｏｔｈ）、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ａ．２００７ ３６５ ，２８２９〜２８４３ カトーナ（Ｋａｔｏｎａ）他、論文「Ｆａｓｔ ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒａｎｄｏｍ−ａｃｃｅｓｓ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ

本発明は、上述の問題に対処し、上記の問題の三つすべてに、同時に高速で対処することができるＡＯＬそれ自体に対する駆動信号を提供する。したがって、本発明は、当技術分野において非常に有意な前進を表す。

特許文献１のデバイスでは、二つのタイプの駆動信号が開示されている。第１のタイプは、純粋な正弦曲線周波数である。信号の周波数は、Ｘ及び／又はＹにおける焦点の位置を制御する。第２のタイプは、線形周波数チャープである。このタイプの駆動信号を印加することにより、ビームを対物レンズの自然焦点面から離れてＺ位置で集束することができる。これらの二つのタイプの信号は、スポットを所与の３Ｄ体積内の任意の点で集束することを可能にするのに十分である。

その核心において、本発明は、ＡＯＤ駆動信号を位相変調型関数とみなすことができるという実現に基礎を置く。さらに、本発明者らは、位相変調関数をテイラー級数として表すことに著しい有用性を見出した。よく知られているように、テイラー級数は、任意の複雑な関数を表すために使用することができ、次数の増大するいくつかの項から構築される。追加されるより高次の各項により、実際の関数に対する近似の精度が改善する。関数をグラフとして見た場合、ゼロ次のテイラー級数項はゼロオフセットを決定し、１次のテイラー級数項は、最も近い線形近似の傾きを決定し、２次のテイラー級数項は、近似の精度をさらに高めるように放物線を加える。本発明者らは、位相変調関数をテイラー級数関数と考えた場合、テイラー級数の次数が物理現象に対応することを見出した。ゼロ次の項は、一定の位相変調に対応し、ＡＯＤ開口を横切る固定された位相（一定振幅）の概念的な駆動信号を与える。この音響信号は、Ｚ伝搬光ビームの位相だけを変えることになり、それを回折させることも偏向させることもない。１次の項は、音速で開口を横切りつつある不変の駆動周波数に対応する。したがって、１次の項だけを有する位相変調関数は、ビームをＸ又はＹで偏向するために使用することができる既知の一定周波数の駆動信号に対応する。２次の項は、ランプ周波数変調に対応し、これは、駆動信号の周波数が時間の関数として線形に変化することを意味する。これは、駆動信号についてのチャープ波形に通ずる。したがって、２次のテイラー級数項を有する位相変調型関数は、既知のチャープ周波数駆動信号に対応する。

過去には、より高次の項（すなわち、３次の項以上）を位相変調関数に導入すべきでないことが暗黙のうちに仮定されていた。フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）らは、非特許文献７において、正弦曲線変調が、解像可能な点の数（ＮＲＰ）を制限する収差として見られる、より高次の項を導入することを記載している。今まで、当技術分野において考えられていることは、正弦曲線位相変調によって内在的に導入されるものなど、より高次の位相変調が、システム内の著しい収差の原因であるということであった。

驚くべきことに、本発明者らは、３次以上のテイラー級数項を、望ましくない収差を生み出さないように、しかし他のところ、たとえば光学システム又は調査される標本内で生じ得る収差を補正するために使用することができることを発見した。

さらに、本発明者らは、純粋な３次の項を使用し、何らかの追加の収差を全く生み出すことなしにＺで滑らかな走査を行うことができることを見出した。

さらに、３次以上の項を含む位相変調の循環的成分が、注目の構造をより正確に突き止め、疎な構造の走査を高速化するために有用となり得る。

したがって、本発明は、一態様では、方法又は装置において、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる関数によって位相変調される駆動信号の使用として表すことができる。

本発明の一実施形態は、第１の音波をサポートするように構成された第１の音響光学偏向器と、対向伝搬する（counter-propagating）第２の音波をサポートするように構成された第２の音響光学偏向器と、前記第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器のそれぞれについて第１の駆動信号及び第２の駆動信号を合成するためのドライバとを備え、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を合成するように構成され、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を合成するように構成されている、音響光学レンズを含む。

２次より大きい成分を有する非正弦曲線関数の使用は、任意の収差、たとえばシステム光学系内、又は調査中の標本内で生じる収差を補正することを可能にする。

任意選択で、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である。

３．２／ｎ！個の波より大きくなるようにより高次の係数を提供することは、無視できない収差の補正が行われることを可能にする。任意選択で、２次より大きいテイラー級数の少なくとも一つは、少なくとも３．５／ｎ！個の波、少なくとも４／ｎ！個の波、少なくとも５／ｎ！個の波、又は少なくとも６／ｎ！個の波の大きさを有する。

本発明の一実施形態は、第１の音波をサポートするように構成された第１の音響光学偏向器と、対向伝搬する第２の音波をサポートするように構成された第２の音響光学偏向器と、前記第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器のそれぞれについて第１の駆動信号及び第２の駆動信号を合成するためのドライバとを備え、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を合成するように構成され、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数であり、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を合成するように構成され、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、音響光学レンズを含む。

３．２／ｎ！個の波より大きくなるようにより高次の係数を提供することは、無視できない収差の補正が行われることを可能にする。

循環的位相変調を使用し、焦点スポットを空間内で、平均位置周りで迅速に移動させることができる。これには、疎な対象に対して走査すること、及び光の飽和又はビーチング（beaching）を防止することを含めて、いくつかの利点がある。

任意選択で、第１の駆動信号は、前記第１の音波が単独で、前記第１の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の１００分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものである。

この特徴は、無視できない収差を補償することを可能にする。

それに加えて、又はその代わりに、第２の駆動信号は、前記第２の音波が単独で、前記第２の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の１００分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものである。

任意選択で、第１の駆動信号及び／又は第２の駆動信号は、それぞれの音波が単独で、それぞれの音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で、少なくとも波長の２０分の１、好ましくは少なくとも波長の１０分の１、より好ましくは少なくとも波長の５分の１、より好ましくは少なくとも波長の２分の１、さらに好ましくは少なくとも１波長の大きさを有する位相エラーを引き起こすことになるようなものである。

電磁放射のビーム内に位相エラーを導入するにもかかわらず、第１の駆動信号及び第２の駆動信号は、任意選択で、それぞれによって個々に導入される位相エラーが、少なくとも部分的に互いに相殺（cancel）するように構成することができる。

任意選択で、前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器を通過した、また後続のレンズによって集束された電磁放射のビームは、１波長より小さい、好ましくは波長の２分の１より小さい、より好ましくは波長の４分の１より小さい、より好ましくは波長の５分の１より小さい、さらに好ましくは波長の１０分の１より小さい位相エラーを有する。

任意選択で、前記第１の駆動信号は、前記第１の音波が単独で、前記第１の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の４分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものであり、前記第２の駆動信号は、前記第２の音波が単独で、前記第２の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の４分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものである。

好都合には、第１の音波及び第２の音波は、以下のようなテイラー級数の形態にあるそれぞれの波動関数によって表すことができる。

式中、
ｘ＝ＡＯＤの中心から測定された横方向距離座標
ｔ＝波動関数の中心から測定された時間
Ｖ_ａｃ＝結晶内の音波のスピード
ｆ＝ＡＯＤドライブの基準中心周波数
Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）（Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ））＝＋ｘ（−ｘ）に向かって伝搬する波動関数
Ａ＝波動関数の振幅
Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
単位はｔ−ｘ／Ｖ_ａｃ＝τ／２で測定された（収差の）波数
Ｎ＝考慮される収差の最高次数
Ｌ＝ＡＯＤの長さ
τ＝Ｌ／Ｖ_ａｃ＝ＡＯＤ充填時間（AOD fill time）
Ｎ≧３
本発明の好ましい態様によれば、駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。

駆動信号は、代替として、又は追加として、調査される標本試料内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。

電磁放射が−Ｚ方向に移動して音響光学レンズに入射するように音響光学レンズが実質的にＸＹ平面内で配向されているとき、任意選択で、前記第１の音波及び前記第２の音波は、対物レンズの後で、少なくとも−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に滑らかに移動する集束された点を形成するように、前記電磁放射を回折させる。

これは、３Ｄ体積内の真に任意の走査を、ＡＯＤシステムにおいて初めて達成することを可能にする。

任意選択で、ドライバは、ある点像分布関数（point spread function）に、電磁放射の入来するビーム（incoming beam）が後続のレンズによって集束されることになるように、駆動信号を合成するように構成されており、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に滑らかに移動し、前記点像分布関数がミニ走査中（mini-scan）にＺ方向に移動するとき、たとえば２０％以内の許容限度で不変である最大ピーク強度を有するものである。

このシステムは、強度が許容限度、たとえばそのピークの５０％内に依然としてあるように、焦点位置をＺで、少ない量の収差で滑らかに移動することが可能である。好ましくは、強度は、そのピークの４０％、より好ましくは３０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％以内に依然としてある。

追加として、又は代替として、ドライバは、ある点像分布関数に、電磁放射の入来するビームが後続のレンズによって集束されることになるように、駆動信号を合成するように構成されており、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に滑らかに移動し、前記点像分布関数がミニ走査中にＺ方向に移動するとき許容限度、たとえば５０％以内で不変であるＦＷＨＭ幅を有するものである。好ましくは、ＦＷＨＭ幅は、４０％、より好ましくは３０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％以内で不変のままである。

このシステムは、ＰＳＦの幅が４０％以内で一定のままであるように、焦点位置をＺで、少ない量の収差で滑らかに移動することが可能である。

任意選択で、ドライバは、３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない駆動信号を合成するように構成されている。

これは、純粋なＺ走査を達成することを可能にし、また、Ｘ及びＹ移動と組み合わされたＺ走査を達成することを可能にする。

任意選択で、ドライバは、関連の光学システム内、又は調査中の標本内で生じる収差を補正するように働く、３次より大きい成分をさらに追加するように構成されている。

これは、システム内で生じるか、それとも調査される標本内で生じるかにかかわらず、収差を、Ｚ成分と共に走査するのと同時に補正することを可能にする。

任意選択で、ドライバは、線形周波数変調された成分に加えて位相変調又は周波数変調の循環的成分をも含む駆動信号を合成するように構成され、その結果、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが、後続のレンズによって集束されたとき、線形周波数変調された成分によって画定される平均焦点位置を中心とする循環的運動を有する焦点を形成する。

これは、システムが疎な対象に沿って自動的に走査し、及び／又は対象が３Ｄ空間内で移動するとき対象を追跡することを可能にする。

任意選択で、線形周波数変調された成分は、循環的運動からの情報を使用するフィードバックアルゴリズムによって制御され、３Ｄ空間内の注目の点又はフィーチャ（feature）の位置を決定する。

この装置は、任意選択で、システム内か、それとも標本からかにかかわらず収差を補正する駆動信号を反復的に推定し、使用するように構成される。

これは、装置を構成するために必要とされる作業の量を削減し、また、より正確な収差補正を実現する。

この反復は、ドライバが、３次以上の第１の既知の収差を含む第１の駆動信号を合成し、これが像を改善したか否か判定するためのものであることを含み得る。次いで、供給される３次以上の収差を反復的に調整し、収差補正を最適化することができる。

この装置は、任意選択で、空間内のそれぞれの焦点位置に関連する駆動パラメータを記憶するためのメモリを含み、前記音響光学レンズは、空間内の関連のそれぞれの位置で電磁放射を集束しようとするとき前記記憶された駆動パラメータを使用するように構成される。

これは、収差が（調査される標本から収差が始まるときのように）焦点位置の関数であるとわかる場合、システムが動的収差補正を事実上達成することを可能にする。

駆動パラメータは、任意選択で、それぞれの第１の音波及び第２の音波の位相変調又は周波数変調を表す波動関数の級数展開の係数である。

これは、必要な駆動信号を容易に決定及び供給することを可能にする、駆動パラメータを記憶するための単純な方法を提供する。

任意選択で、第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器は、それぞれの第１の音波及び第２の音波が同じ結晶内で伝搬するように単一の結晶によって提供される。

これは、このシステムのための代替構造である。

音響光学レンズは、第３の音響光学偏向器及び第４の音響光学偏向器を備えることができ、前記第３の音響光学偏向器及び前記第４の音響光学偏向器は、前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器が電磁放射の前記ビームを偏向する方向に対して直交する成分を有する方向で、電磁放射の前記ビームを偏向するためのものであり、前記ドライバが、前記第３の音響光学偏向器及び第４の音響光学偏向器のそれぞれについて第３の駆動信号及び第４の駆動信号を合成するためのものであり、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第３の関数によって位相変調される第３の駆動信号を合成するように構成され、前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第４の関数によって位相変調される第４の駆動信号を合成するように構成されている。

四つの偏向器の使用により、完全な３Ｄシステムを実装することができる。この場合も、四つの別々のＡＯＤ結晶に対する要件はなく（しかし、これは好ましいものである）、駆動信号のいずれも同じ結晶を駆動するためのものとすることができる。

ドライバは、任意選択で、以下の（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に従って構成される。
（ａ）前記第３の関数及び前記第４の関数は、非正弦曲線である。
（ｂ）前記第３の関数及び前記第４の関数は、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有する２次より大きい係数を含み、式中、ｎは前記係数の次数である。
（ｃ）前記駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。
（ｄ）前記駆動信号は、調査される標本試料内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。
（ｅ）前記駆動信号は、対物レンズの後で、少なくとも−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に滑らかに移動する集束された点をもたらすようなものである。

また、本発明は、音響光学レンズ及び対物光学系を備える顕微鏡を含む。顕微鏡は、任意選択で、レーザ源及び／又は検出器をも含む。対物光学系は、顕微鏡対物レンズを備えることが好ましい。

また、本発明は、音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を決定するステップと、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を決定するステップと、を含む方法を含む。

また、本発明は、音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を決定するステップであって、２次より大きい前記テイラー級数係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、ステップと、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を決定するステップであって、２次より大きい前記テイラー級数係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、ステップと、を含む方法を含む。

前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号は、それぞれの第１の音波及び第２の音波を音響光学レンズ内で伝搬させるためのものであることが好ましい。

任意選択で、第１の音波及び第２の音波は、以下のようなテイラー級数の形態にあるそれぞれの波動関数によって表すことができる。

式中、
ｘ＝ＡＯＤの中心から測定された横方向距離座標
ｔ＝波動関数の中心から測定された時間
Ｖ_ａｃ＝結晶内の音波のスピード
ｆ＝ＡＯＤドライブの基準中心周波数
Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）（Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ））＝＋ｘ（−ｘ）に向かって伝搬する波動関数
Ａ＝波動関数の振幅
Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
単位はｔ−ｘ／Ｖ_ａｃ＝τ／２で測定された（収差の）波数
Ｎ＝考慮される収差の最高次数
Ｌ＝ＡＯＤの長さ
τ＝Ｌ／Ｖ_ａｃ＝ＡＯＤ充填時間
Ｎ≧３

前記決定するステップは、任意選択で、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように前記駆動信号を変調することを含む。

前記決定するステップは、任意選択で、追加として、又は代替として、調査される標本試料内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように前記駆動信号を変調することを含む。

任意選択で、第１の駆動信号及び第２の駆動信号は、それぞれの第１の音波及び第２の音波を音響光学レンズ内で伝搬させるためのものであり、前記方法が、電磁放射を前記音響光学レンズに入射させるステップであって、前記電磁放射が−Ｚ方向に移動している、ステップと、前記第１の音波及び前記第２の音波を使用し、前記電磁放射を回折させるステップと、対物光学系を使用し、前記回折された電磁放射を集束し、それにより−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に移動する集束された点を形成するようにするステップと、をさらに含む。

前記決定するステップは、任意選択で、線形周波数変調された成分に加えて位相変調又は周波数変調の循環的成分をも含む駆動信号を決定し、それにより、線形周波数変調された成分によって画定される平均焦点位置を中心とする、音響光学レンズを通って移動する電磁放射の焦点位置の循環的運動を引き起こすことを含む。

この方法は、前記循環的運動からの情報をフィードバックアルゴリズム内で使用し、３Ｄ空間内の注目の点又はフィーチャの位置を決定することをさらに含むことができる。

この方法は、空間内のそれぞれの焦点位置に関連する駆動パラメータを記憶するステップと、前記記憶された駆動パラメータを使用し、空間内の関連のそれぞれの位置で電磁放射を集束するステップと、をさらに含むことができる。

任意選択で、駆動パラメータは、それぞれの第１の駆動信号及び第２の駆動信号の変調を表す波動関数の級数展開の係数である。

この方法は、前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号をそれぞれの第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器に送り、それにより、電磁放射の入来するビームを集束するためにそれぞれの第１の音波及び第２の音波を前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器内で伝搬させることをさらに含むことができる。

任意選択で、第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器は、それぞれの第１の音波及び第２の音波が同じ結晶内で伝搬するように単一の結晶によって提供される。

この方法は、第１の駆動信号及び第２の駆動信号に加えて音響光学レンズに送られたときに電磁放射の入来するビームを対物光学系によってある期間中に３次元で集束させることになる第３の駆動信号及び第４の駆動信号を決定するステップをさらに含むことができ、前記第３の駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第３の関数によって位相変調され、前記第４の駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第４の関数によって位相変調される。

また、本発明は、音響光学レンズを使用して電磁放射のビームを偏向させるための方法であって、上述のように第１の駆動信号及び第２の駆動信号を決定するステップと、前記第１の駆動信号を適用し、それにより第１の音波を第１の音響光学結晶内で伝搬させるステップと、前記第２の駆動信号を適用し、それにより第２の音波を第２の音響光学結晶内で伝搬させるステップと、電磁放射の入来するビームを前記音響光学レンズに通し、それにより偏向させるステップと、を含む方法を含む。

また、本発明は、音響光学レンズ用の駆動装置であって、３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない第１の駆動信号を合成するための第１の駆動信号シンセサイザと、３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない第２の駆動信号を合成するための第２の駆動信号シンセサイザとを備える駆動装置を含む。

任意選択で、前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号は、前記音響光学レンズに入射する電磁放射のビームが後続の光学系によって少なくとも一つの次元で集束されることになるように合成される。

任意選択で、前記第１の駆動信号シンセサイザ及び前記第２の駆動信号シンセサイザは、光学システム内で生じる収差を補正するように働く、３次より大きい成分をさらに追加するように構成されている。

また、本発明は、音響光学偏向器と、音波を前記音響光学偏向器内で伝搬させるように前記音響光学偏向器に駆動信号を送るためのドライバとを備え、前記ドライバが、２次より大きい次数に位相変調される駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズを含む。

任意選択で、以下の（ａ）〜（ｆ）の１つ以上が適用される。
（ａ）前記駆動信号は、非正弦曲線である関数によって位相変調される。
（ｂ）前記駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができ、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有する２次より大きい係数を含む関数によって位相変調され、式中、ｎは係数の次数である。
（ｃ）前記駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。
（ｄ）前記駆動信号は、調査される標本試料内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される。
（ｅ）前記駆動信号は、ある点像分布関数に、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが後続の光学系によって集束されることになるようなものであり、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に移動し、点像分布関数がＺ方向に移動するとき、たとえば２０％以内の許容限度で不変である最大ピーク強度を有するものである。
（ｆ）前記駆動信号は、ある点像分布関数に、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが集束されることになるようなものであり、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に移動し、前記点像分布関数がＺ方向に移動するとき、たとえば４０％以内で不変であるＦＷＨＭ幅を有するものである。

また、本発明は、２次より大きい次数に位相変調される少なくとも一つの駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズ用の駆動装置を含む。

また、本発明は、音響光学偏向器と、音波を前記音響光学偏向器内で伝搬させるように前記音響光学偏向器に駆動信号を送るためのドライバとを備え、前記ドライバが、２次より大きい次数に位相変調される駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズを含む。

また、本発明は、音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、音響光学レンズに送られたときに電磁放射の入来するビームを後続の光学系によって集束させることになる第１の駆動信号及び第２の駆動信号を決定することを含み、前記駆動信号は、２次より大きい次数に位相変調される、方法を含む。

本発明は、コントローラと、前記音響光学レンズと、顕微鏡光学系と、電磁放射の前記ビームを供給するためのレーザとを備える顕微鏡システムをさらに含む。

このコントローラ装置は、上述、及び本明細書に記載のいずれの装置とすることもできる。ドライバは、コントローラの一部であっても、コントローラから分離されたものであってもよい。

コントローラは、位相感応型検出器及び／又は時間感応型検出器を備えることができる。

コントローラは、収差発生器と、生成された収差を標準的な駆動信号に重畳するための手段とを備えることができる。

コントローラは、検出された像が、生成された収差によって改善されたかどうか判定するための手段を備えることができる。

コントローラは、検出された像が改善されたかどうか判定するための手段の出力に基づいて、更新された収差を生成するための手段を備えることができる。

コントローラは、駆動信号の一つ、いくつか、又はすべてに重畳するために循環的周波数を生成するための周波数発生器を含むことができる。

コントローラは、光が集束されている位置を計算するための手段を備えることができる。

次に、本発明を限定しない例であるが、添付の概略図を参照して、さらに述べる。

本発明による顕微鏡法システムの主な構成要素の図である。 本発明と共に使用されることが好ましい四つのＡＯＤのコンパクトな構成の、二つの正投影図である。 二つのＡＯＤ及びモデル化されたシステム誘導収差の図である。 ４次収差が補正されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 ４次収差が補正され、一方、スポットがＸで偏向されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 ４次収差が補正され、一方、スポットがＸで偏向されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 収差補正が、導入され得るどの集束収差からいかに独立しているかを示す図である。 収差補正が、導入され得るどの集束収差からいかに独立しているかを示す図である。 図４と同様の、しかし図４の大きさの半分の４次収差が補正されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 図４と同様の、しかし６次収差が補正されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 収差を自動的に補正するように適合されている、本発明による顕微鏡法システムの図である。 二つのＡＯＤ及び試料誘導収差の図である。 ＡＯＤ開口に沿った距離の関数として収差の各次数によって誘導される位相エラーをプロットするグラフである。 純粋な３次の項がいかに非線形周波数チャープを引き起こし、Ｚで滑らかに移動するスポットを生み出すかを示す図である。 スポットがＺで走査されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 スポットがＺで走査されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 スポットがＺで走査されたときの２光子強度、及びその強度が時間と共にいかに変動するかを示すグラフである。 本発明を使用して滑らかなＺ走査を達成することができることを示すグラフである。 フィーチャを追跡する際に使用するための循環的スポット変位を実施するように適合されている本発明による顕微鏡法システムの図である。 循環的なより高次の項がいかに非線形周波数チャープを引き起こし、平均位置周りで循環的に移動するスポットを生み出すかを示す図である。

本発明は、特許文献１に記載されている装置及び方法に対する改善であり、それだけには限らないがＡＯＤのコンパクトな構成（任意選択の半波プレート及び偏光子を含む）、色収差補正のための手段、並びに異なる上流及び下流ＡＯＤ構造（ＴｅＯ_２結晶を含む）を含めて、特許文献１で論じられている対策のいずれかと共に実施することができる。特許文献１の開示全体を、参照により本明細書に組み込む。

本発明についてコンパクトなＡＯＤ構成、及びその対応する駆動式を参照して述べるが、本発明は、ＡＯＤを共に接続するためにテレセントリックリレーが使用される構成など、他のＡＯＤ構成にも等しく適用可能である。そのようなテレセントリックにより接続される構成を駆動するための一般式は、コンパクトな構成のためのものより単純であり、当業者に知られている。

本発明は、電磁放射の任意のビームを操作するために実施することができるが、レーザビームなどコヒーレントなビームに対して実施されることが好ましい。特許文献１のように、７００〜１０００ｎｍの典型的なレーザ波長が使用されるが、これは本発明を限定しない。レーザの中心周波数は、４００ｎｍから１２００ｎｍ、好ましくは７００ｎｍから１０００ｎｍの範囲内にあってよく、より好ましくは約８５０ｎｍである。レーザは、典型的にはパルス型であり、パルスは、２ｐｓ以下、好ましくは５００ｆｓ以下、より好ましくは１００ｆｓ以下の長さを有する。

図１は、顕微鏡法、好ましくは２光子顕微鏡法を実施するために使用することができる完全な装置の概略図を示す。本発明は、特に、ＡＯＬの二つ又は四つのＡＯＤを駆動し、画像品質の点で改善された結果をもたらすための駆動信号に関する。本発明は、ＡＯＤの構成にとって適切な式に基づいてＡＯＬ１１を駆動するコンピュータ制御システム１２を備えることが好ましい。

プリチャーパ２を除いて、図１に示されている完全な２光子顕微鏡の他の構成要素は、一般に、標準的な２光子顕微鏡のものと同様であるが、ＡＯＤ用の駆動電子回路及び像再構築ソフトウェアを含むコントローラ１２は、標準的な同等物よりいくぶん複雑である。

レーザ１は、好ましくはＴｉサファイアレーザであるが、実施される実験に従って任意のレーザを使用することができる。レーザは、特許文献１に記載されているように、たとえば１００ｆｓ程度の非常に狭いパルスで放射を放出することが好ましい。

プリチャーパ２は、そうでない場合にはレーザパルスをやがて拡散し、２光子放出効率を大いに低下させるＴｅＯ_２の高い色分散の作用を補償するために含まれることが好ましい（レディ（Ｒｅｄｄｙ）、ケレハー（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ）ら、２００８年）。

任意選択で、レーザ強度に対する制御を行うために、ポッケルスセル３を使用し、またＡＯＬ１１を通過する前にビーム直径を広げるために、ビームエキスパンダ４を使用することができる。図１のＡＯＬには四つのＡＯＤが示されているが、一つの方向（たとえば、Ｘ方向）だけで偏向することが望ましい場合、二つだけを使用してもよい。

電磁放射のビームは、リレー５を通ってＡＯＬを出ることができ、任意選択で、固定されたミラー又はガルバノミラー６によって偏向され、その後、別のリレー７（フィールドレンズ及びチューブレンズを備える）を通過してから、顕微鏡対物光学系９に到達することができる。

対物光学系９は、一般に対物レンズを備え、最終的にビームを所望の位置に集束するために使用される。どの反射光又は散乱光も、対物レンズを上がって戻り、任意選択のダイクロイックミラーによって、ここでは光電子増倍管の形態にあるセンサ１０に経路設定される。

センサ１０からのデータ獲得は、一般に、ＡＯＤの駆動と正確に同期され、それにより、各データ収集タイムスロット（典型的は、長さ１〜１２μｓ）ごとに、コントローラ１２は、そのメモリに、その時間中にＡＯＬが指しているボクセルの３Ｄ座標で測定された光強度を挿入することが可能である。

図２は、ＡＯＬを形成する四つのＡＯＤの順序及び向きを示す。第１のＡＯＤ３０は、第１の駆動信号によって駆動され、第１の音波３１を、第１のＡＯＤ３０の開口を通して伝播させる。第２のＡＯＤ４０は、第２の駆動信号によって駆動され、第２の音波４１を、第２のＡＯＤ４０の開口を通して伝播させる。駆動信号は、一般に、駆動信号と同じ周波数の音波をＡＯＤ開口に適用させる。第３のＡＯＤ及び第４のＡＯＤが（図１及び図２のように）存在するとき、第３の駆動信号が第３の音波５１を生み出し、第４の駆動信号が第４の音波６１を生み出す。第１のＡＯＤ３０は、第２のＡＯＤ４０と共に機能し、Ｘ方向（すなわち、ＸＺ平面内）での偏向をもたらし、一方、第３のＡＯＤ及び第４のＡＯＤは、Ｙ方向（すなわち、ＹＺ平面）での偏向をもたらすためのものである。第１のＡＯＤ及び第２のＡＯＤは、それぞれにおける音波３１、４１が、（図２における矢印によって示される）反対方向に移動するように配置されることが好ましい。しかし、一般に、第１の音波を、第２の音波の解像成分（resolved component）に対して反対に移動する解像成分だけを有するようにすることができる。実際には、これは、音波３１、４１が互いに正確に同じ方向で移動する向きを除いて、第１のＡＯＤ３０及び第２のＡＯＤ４０を互いに任意の向きにすることができることを意味する。したがって、音波は、互いに対向伝搬している成分を少なくとも有するので「対向伝搬（counter-propagating）」していると言われる。しかし好ましくは、第１のＡＯＤ及び第２のＡＯＤは、第１の音波及び第２の音波が純粋な意味で反対向きに伝搬しているように、ＸＹ平面内において１８０度の相対回転で配向される。

第３のＡＯＤ５０は、第４のＡＯＤ６０と共に機能し、Ｙ方向での偏向をもたらす。第３のＡＯＤ５０及び第４のＡＯＤ６０は、それぞれにおける音波５１、６１が反対方向に移動するように配置されることが好ましい。第１のＡＯＤ及び第２のＡＯＤに関して上記で論じたように、対向伝搬のどの成分も十分なものである。また、第３のＡＯＤ及び第４のＡＯＤにおける音波５１、６１は、それぞれ第１のＡＯＤ及び第２のＡＯＤにおける音波３１、４１に垂直であることが好ましい。しかしこの場合も、純粋な直角度は必要とされず、第１の波３１及び第２の波４１の解像成分に対して垂直であるどの第３の波５１及び第４の波６１の解像成分も十分なものになる。好ましい実施形態では、図２に示されているように、第１のＡＯＤ３０が北向き方向で第１の音波３１の伝搬の方向を有すると言われる場合、第２の音波４１は南向き方向に行き、第３の音波５１は東向き方向に行き、第４の音波６１は西向き方向に行く。第３の波及び第４の波は、第３の波５１が西に行き、第４の波６１が東に行くように容易に切り替えることができ、これは、それぞれの駆動信号に対する軽微な調整を必要とするにすぎない。

図のコンパクトな構成では、ＡＯＬのＡＯＤは、（ビーム方向で表して上流から下流にかけて）第１、第２、第３、第４の順番である。特許文献１で論じられているように、これは、ＡＯＤ間で光の偏光を、半波プレート及び／又は偏光子により、必要とされる最小限の補正／フィルタリングで整合するという点で、有利な構造である。図１、２、３、９、１０、１２、１５、１６は、見やすくするために半波プレート及び偏光子を省略しているが、それらは、特許文献１でより詳細に述べられている。ＡＯＤの他の構成をＡＯＬにおいて使用することができ、本発明は、好ましい実施形態に示されている順番に制限されない。

本発明は、二つのＡＯＤしか有していないシステム、たとえばＸＺ平面だけで偏向をもたらすように第１のＡＯＤ３０及び第２のＡＯＤ４０だけを有するシステムにも等しく適用することができる。そのような構成は、第１のＡＯＤ３０と、それに続く第２のＡＯＤ４０とを有することになり、第１のＡＯＤ３０の回折された出力偏光を第２のＡＯＤ４０の必要とされる入力偏光に整合させるための任意選択の半波プレートと、第１のＡＯＤ３０からの非回折光を抑制するための任意選択の偏光子とを備える。当然ながら、そのようなシステムは、ＸＺ平面内でのみ偏向することができ、非点収差を回避しようとする場合、ＹＺ平面が集束される同じＺ平面上で集束するはずである。

特許文献１に開示されているように、ＡＯＤ間の実際の距離、及び介在する構成要素並びにＡＯＤそれ自体の光学的厚さを、駆動信号の正確な形態を決定するときに考慮する必要がある。半波プレート及び偏光子など、他の光学構成要素がＡＯＤ間に差し挟まれる場合には、そのような追加の構成要素の偏向率を考慮することによって、見かけの光学的分離を計算することができる。また、ＡＯＤそれ自体の偏向率が考慮される。光学構成要素を考慮するために駆動信号をいかに構成すべきかについての詳細は、当業者なら特許文献１から容易に入手可能である。

理論上では、ＡＯＬのコンパクトな構成を使用し、視野内の任意の選ばれた値のＺで静止焦点を達成することができる。そのような静止焦点が生み出されるとき、顕微鏡は、「ポインティングモード（pointing mode）」で機能していると言われる。

半透明試料（脳組織など）の３次元像を構築するためには、試料を通る所定の経路に沿ってその焦点でラスタ走査に従うことが可能であることが有用である。最も一般的に使用されるラスタ走査は、焦点をＸ方向に移動し、Ｙ値及びＺ値を一定に保ち、次いでＹ位置をある少ない量だけ増分し、Ｘ方向で別の走査を実施し、走査の２次元グリッドが達成されるまで以下同様に行うことである。次いでＺ方向が増分され、３次元体積が構築されるまで別の２次元グリッドが走査される。このタイプのラスタ走査は、ポインティングモードを使用しあらゆる点に順次対処することによって像を構築するよりはるかに高速である。ポインティングモードは、各点からデータをとるために、１ＡＯＤ充填時間（AOD fill time）に１データ収集時間（ドウェル時間）を加えたものだけかかる。２５μｓのＡＯＤ充填時間と典型的な４μｓのドウェル時間の場合、このプロセスは、ポインティングモードでは、標的システムが解像することが可能な７８０万個のボクセルについてほぼ４分かかる。ラスタ走査の場合、集束されたスポットを連続的なボクセルにわたって１ボクセル当たり１ドウェル時間の速度で移動させることにより、各ＡＯＤ充填時間について多数のデータ点が収集される。ラスタ走査の長さが増大するにつれて、総走査時間は、完全な３Ｄ体積を走査する４μｓドウェル時間について約３０秒である１ボクセル当たり１ドウェル時間の限界に向かって漸近的に減少する。そのようなラスタ走査に関する式は、特許文献１において求められたものであり、それらを参照されたい。

ポインティングモード（光が静止点に集束される）に適用可能であることに加えて、本発明は、走査モード（焦点が絶えず移動している）にも適用可能である。従来、そのような走査は、ＸＹ平面内で走査すること、及びＺを増分し３Ｄピクチャを構築することを必要としており、本発明の収差補正の態様をそのような走査に使用することができる。さらに、本発明は、焦点をＺ方向又は−Ｚ方向の成分と共に滑らかに移動させることができる全く新しいタイプの走査を生み出すことを可能にする。

「常にオン（always-on）」の一定の走査スポットを提供することの一つの限界は、焦点を自然Ｚ平面から外に移動させるために、周波数チャープが必要とされることである。ＡＯＤが限られた動作周波数範囲を有し、Ｚ集束のための周波数ランプレートが高いことは、駆動周波数を動作周波数範囲の他方の側にリセットすることがしばしば必要であることを意味する。これをいかに行い「ミニ走査（mini-scan）」を達成するかが、特許文献１に開示されている。さらに、ミニ走査の長さ及び質を延ばすように駆動周波数を最適化するための方法が、参照により本明細書に組み込む、２０１０年４月２１日に出願された英国特許出願第１００６６７９．３号に開示されている。そこに開示されている最適化された駆動周波数、及びミニ走査の方法は、本発明と共に使用することができる。

特許文献１のＡＯＬは、以下の二つのタイプのうちの一つの駆動信号を備える音響光学偏向器を含む。
・一定周波数信号。Ｚ＝０では、周波数、又はより正確には、各次元（ＸＺ又はＹＺ）について二つのＡＯＤにおける周波数間の差が、焦点のＸ位置及びＹ位置を制御するために調整される。
・線形ランプ周波数信号。ランプレート（又はチャープレートとしても知られる）により、焦点のＺ位置が決定する。

線形周波数ランプを提供することは、駆動信号の線形周波数変調（ＦＭ）に相当し、周波数は位相の差であるため、パラボリック（２次）位相変調に相当する。したがって、ＡＯＬ出力開口を横切って放物線状の同位相波面（phase front）が生成される。特許文献１の図７を参照すると、図７ａは、正の値のＺを有する焦点で最終的に収束する放物線状の波面を示し、図７ｂは、Ｚ＝０にある焦点で最終的に収束する線形の波面を示し、図７ｃは、負の値のＺを有する焦点で最終的に収束する放物線状の波面を示す。これらの場合のそれぞれにおいて、レンズ７０は、最大強度の完全な回折限界点像分布関数に、３Ｄ視界内にあるシステム焦点でビームを集束する。

駆動信号の非線形周波数変調（すなわち、３次以上の位相変調）は、以前には収差エラー源と考えられており、望ましくないものと考えられていた（上記で参照したフリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）ら参照）。一般に、非線形周波数変調は、非放物線状の波面を引き起こし、従来の対物光学系を使用して完全回折限界スポットに集束することを不可能にすることが知られていた。非線形周波数変調は、ＰＳＦにピーク強度を失わせ、（半値全幅（ＦＷＨＭ）法によって測定して）空間内に拡散させた。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、そのような非線形周波数変調を利用し、有利な効果をもたらすことができることを見出した。

ツェルニケモードは、通常、２（ＸＹ）次元の円形開口を横切る第３の次元として位相が定義される円対称光学システムの「収差」を定義するためのものと称される。ここで、「収差」は、ここではＸＹ平面に対して平行の平坦な表面となるようにとられる基準表面に対して、各空間位置に存在する位相エラーを指す。ある点に集束されたビーム内に存在する位相エラーは、一般に、ＡＯＤの二つの直交する対からの位相エラーの積（すなわち、第１のＡＯＤから始まり第４のＡＯＤに進むエラーの積）に等しくなる。以下の説明は、ＸＺ平面内で偏向及び集束することが可能な１対のＡＯＤだけからのエラー（収差）で表したものである。ＹＺのＡＯＤについての式は、全く同じである。

図３を参照すると、各ＡＯＤ内の対向伝搬し移動する波３１、４１は、それぞれプラスＸ方向とマイナスＸ方向に移動する波動関数Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）及びＷ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ）として示すことができる。これらの波は、−Ｚ方向に移動する光波が、結晶内で音波３１又は音波４１を通って伝搬するとき受けることになる位相変調の複素表現である。これらの波動関数は、以下のように数学的に表すことができる。

式中、
ｘ＝ＡＯＤの中心から測定された横方向距離座標
ｔ＝波動関数の中心から測定された時間
Ｖ_ａｃ＝結晶内の音波のスピード
ｆ＝ＡＯＤドライブの基準中心周波数
Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）（Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ））＝＋ｘ（−ｘ）に向かって伝搬する波動関数
Ａ＝波動関数の振幅
Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
単位はｔ−ｘ／Ｖ_ａｃ＝τ／２で測定された（収差の）波数
Ｎ＝考慮される収差の最高次数
Ｌ＝ＡＯＤの長さ
τ＝Ｌ／Ｖ_ａｃ＝ＡＯＤ充填時間
Ｎ≧３
内側の括弧内の第１の項は、速度ＶａｃでＸ方向に移動している移動音響正弦波に関する標準の表現（normal expression）である。第２の項は、テイラー級数を表す、次数ｎ＝０Ｎの収差の級数の和を表す。テイラー級数の異なる次数は、音波によって光ビームに導入されることになる収差（エラー）の異なる次数を表す。これらの次数は、０、１、２、３などの番号を付けることができ、以下のような物理現象、すなわち、０＝位相変位、１＝光波の傾斜、２＝光波の集束又は焦点はずれ、３＝放射形対称の場合における光波のコマに関連する３次収差（cubic aberration）、４＝４次円筒収差（光波の球面収差に類似のもの）を表すことが判明している。上記の式では、考慮される最高次数はＮである。上記ではテイラー級数が使用されているが、任意の代替の基底関数を使用し、収差を表すことができることに留意されたい。たとえば、収差は、テイラー級数ではなくフーリエ級数の和として表すことができよう。

一部の教科書及び論文では、「収差」という用語は、最もよく一致する球状波面に関する収差だけを指し、そのような場合には、ここで使用されるテイラー級数のゼロ次、１次、及び２次の項は「収差」と称されず、波面がいかに偏向され集束するかを説明するだけである。これは代替の専門用語にすぎず、数学的又は物理的に有意なものではない。本発明者らは、テイラー級数におけるすべての項を「収差」と称することを選んだが、その理由は、これらすべてが、平面的なものであるＡＯＤ格子表面に戻って関係付けられることを必要とするからである。当然ながら、上記の式における括弧内の第１の項（ＡＯＤの中心基準周波数で移動する正弦波）は、レーザビームを固定された角度を介して回折する１次傾斜項である。これは、単純に、通常、第２のＡＯＤ内の反対向きに移動する波における同じ項によって相殺されるという理由で、残りの収差の級数から分離されている。

図３は、システム内で固有の固定された収差を、いかに任意の形態のレンズ１００としてモデル化することができるかを示す。この収差は、導入される位相収差の同様の複素指数表現で数学的に表すことができる。ここでは、収差が移動する波に関するｘ及びｔではなく純粋にｘの関数なので、この式は、ＡＯＤのためのものより単純である。

式中、
Ｗ_ｆ（ｘ）＝波面演算子
Ｐ_ｘ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
単位波数（ｘ＝Ｌ／２のとき）
Ｎ＝考慮される収差の最高次数
図３に示されているように、最初に入射する電磁放射１６は、まず第１のＡＯＤ３０に遭遇する。本発明のＡＯＤは、より高次（ｎ≧３）の項を有する駆動信号によって駆動され、その結果、電磁放射は、任意の波面１７を有するように第１の移動する音波３１によって回折を受けることができる。次いで、これは第２のＡＯＤ４０を通過し、第２のＡＯＤ４０で、波面１８を有するように第２の音波４１によって回折される。図３における光もまた、ここでは等価のレンズ１００によって表される光学システム（ビームエキスパンダ４、リレー５、７、及び対物光学系９を備える、図１に示されているものなど）を通って伝搬する。これらの位相変調構成要素の三つすべてを通って−Ｚ方向に伝搬した後、その光波を、３組の収差によって変調された元の平面的な波面の光波として計算することができる。

Ｅ（ｘ，ｔ）＝Ｅ_０×Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）×Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ）×Ｗ_ｆ（ｘ）
この式は、集束レンズ７０の正面における光波の電界を表す。よく知られているように、レンズの効果は、そこを通って伝搬する光波の電界分布のフーリエ変換に比例する像を投影することであり、事実上、光ビームに重畳された変調によって表されるｘ信号のための空間スペクトルアナライザとして働く。この信号は、対向伝搬する波が互いに通り越すにつれて時間と共に変動しているので、このスペクトルもまた時間の関数である。次いで、レンズの下方の位置Ｘの関数としての光波の２光子強度を、複素場とその複素共役の積として計算し、再び２乗して、２光子励起の確率を位置の関数としてモデル化することができる。

式中、ｘ＝集束レンズの下方のｘ方向での変位に比例する、ｘ方向での空間周波数
Ｉ_２Ｐ（ｘ，ｔ）＝（Ｅ（ｘ，ｔ）×Ｅ（ｘ，ｔ）´）^２＝２光子強度
（２光子励起に比例する、２乗された光強度）
本明細書では、このモデルを使用し、モデルの固定された要素１００上で重畳された様々な収差及び／又は移動する波要素について、Ｘ及び時間に対する２光子強度の分布を計算した（モデル化の結果については図４〜７及び図１２並びに下記の説明を参照）。

固定された光学系のための収差補正
図３を参照すると、どの実際の光学システムも完全でないことが理解されよう。レンズ及び他の光透過デバイスは、常に何らかの収差を光に導入することになる。この収差は、図３における固定された要素１００としてモデル化される。本発明者らは、１以上の非線形駆動信号を使用し、たとえば対物レンズ内の球面収差によって引き起こされる、顕微鏡システムの光学系内の固定された収差を補正することができることを見出した。システム収差が既知である場合、システム収差補正を実現するために、その既知の収差を使用して、ＡＯＤ駆動信号を適切に計算することができる。換言すれば、ＡＯＬを通過する光に「逆収差」を入れるように働く３次及び／又は他のより高次のテイラー級数項を関数Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）及びＷ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ）が含むようにすることができる。この逆収差は、光学システムによって導入される収差を正確に無効にし、その結果、対物光学系９の対物レンズ７０が、得られる光を集束すると、鮮明な焦点が得られるように設計される。

そのような収差補正が使用されたとき得られる焦点は、収差補正なしで得られるものより良好（鮮明）である。たとえば、既知の対物レンズ７０が光波に球面収差を導入することが知られていると仮定してみる。これは、駆動信号を表すテイラー級数内の適切な４次の項を使用することによって無効にすることができる。そのような場合には、上記の式中の係数Ｐ_ｘｔ（４）を選択し、適正な量の「事前収差」を光波に与え、その結果、レンズ７０内に存在する望ましくない収差の作用が事前収差を相殺することになるようにし、それにより完全な集束スポットをもたらす。

一般に、テイラー級数係数Ｐ_ｘ（ｎ）を有する固定された収差を、位相収差のマイナス２分の１で駆動される、１対の対向伝搬する波動関数で補償することによって補正することが可能であり、その結果、各駆動信号で使用されるテイラー級数係数は、下式によって与えられる。

Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝±０．５Ｐ_ｘ（ｎ）／（τ／２）^ｎ
式中、
Ｐｘｔの単位は波数／時間^ｎである。

ここでの基準の枠組みによれば、波は、ある負の時間にＡＯＤによって伝搬させられ始め、各ＡＯＤは、時間ｔ＝０で音波のちょうど最大になるように構成される。この時間ｔ＝０では、ＡＯＤ音波内に導入される２組の半振幅収差が空間内で加算し合い、システム内で固有の、これらの固定された収差を正確に相殺する。ｔ＝０以外の時間では、ＡＯＤ収差は、固定された収差を正確に相殺するものではなく、共にＰＳＦの強度の降下を引き起こすが、時間がｔ＝０から（どちらの方向にも）離れるにつれて徐々に降下するものとして見られ、この有害な作用は、最大相殺の正確な時間の周りで測定が行われることを確実にすることによって低減することができる。

この効果は図４に見ることができ、図４は、単一の位置で達成することができる２光子強度のコンピュータシミュレーションを示し、ここでシステム光学系は、収差の４次のテイラー級数係数がＰ_ｘ（４）＝１であるような固有の４次収差を有し、またここで二つのＡＯＤ駆動信号が、係数Ｐ_ｘｔ（４）＝−０．５を使用して４次の駆動項を備える。わかるように、時間ｔ＝０では、完全な相殺が見られる。また、良好な相殺が見られるｔ＝０周りの領域と、２光子信号が０に降下するような実質的に相殺が見られないその外側の領域とがある。２光子強度のこのプロットは、この例ではＦＷＨＭ＝５．４μｓを有する釣り鐘形曲線を形成する。しかし、この期間は、一般に約４μｓのドウェル時間が使用される大抵の実験を実施するのに十分なものである。

図５ａ及び図５ｂは、可能な収差補正の量が、１次のテイラー級数項を使用して達成されるＸ又はＹにおける焦点スポットのどのような移動からも独立したものであることを示す。図５ａでは、Ｘ〜ＺのＡＯＤのシミュレーションに、約−５ｍｒａｄのＸ偏向を生成するように異なる一定周波数を有するいくつかの駆動信号を供給した。図４の例の場合と同様に、４次収差の完全な波がシステム光学系内に存在するようにモデル化され、これが、４次の成分を含む駆動信号によって打ち消されている。図４のように、強度プロファイルは、時間において釣り鐘形曲線を帯び、この曲線のＦＷＨＭは、図４と同じである。図５ｂは、同様の結果を示すが、＋５ｍｒａｄのＸ偏向の場合である。この場合も、曲線の形状は依然として変わらない。これは、１次の項及び４次の項が独立して働くこと、並びに収差補正を適用することができるが、スポットがＸ又はＹで偏向することを示す。

また、収差補正機能に対する２次の項（すなわちＺ集束）の効果を調査するためにモデル化を実施し、可能な収差補正は、２次のテイラー級数項を使用してスポットをＺで移動することによって変更されないことが判明した。図６ａ及び図６ｂは、二つの時間収差補正プロットを示す。この場合もやはり、４次収差の完全な波が補正され、どちらの場合も５ｍｒａｄの傾斜があるが、一方の場合（図６ｂ）には２次のＰｘｔ（２）「焦点」収差の３５個の波を使用し、後続のＮＡ＝０．８の対物レンズの下方で７４μｍのＺ焦点を生成するのに十分なものによって、またＰｘｔ（２）の符号を７４μｍ下げて変更することによって、上向きに集束させる。収差補正の時間的挙動に違いはなく、この場合、Ｚ焦点からの収差補正の独立を示す。

図７は図４と同様であるが、１ではなくＰ_ｘ（４）＝０．５の場合のシステム収差をモデル化している。したがって、図７は、システムによって誘導される収差が図４の例ほど激しくない場合をモデル化している。この場合も、収差補正は時間ｔ＝０で完全に機能し、この段階から離れるにつれて低下する。しかし、低下はより緩やかであり、図７の曲線は、５．４μｓではなく７．８μｓのＦＷＨＭを有する。

図８は図４と同様であるが、４次収差ではなく６次収差をモデル化している。したがって、図８は、Ｐ_ｘ（６）＝１のシステムによって誘導される収差を仮定しており、この収差は、６次の係数Ｐ_ｘｔ（６）がそれぞれ−０．５になるように選択されるテイラー級数によって示される位相変調を有する等しいＡＯＤ駆動信号によって相殺される。この場合も、補正は時間ｔ＝０で完全であり、離れて低下するが、ここでは、離れて低下するのはより急速であり、この場合、得られる曲線のＦＷＨＭは、３．６μｓである。

場合によっては、存在するシステム収差を正確に測定するのは不可能となり得る。したがって、反復方法を使用して固定された収差補正を微調整するためのシステムが、図９に示されている。

このシステム、及び対応する方法によれば、ＡＯＤへの駆動信号には、音波がテイラー級数として表されるときそれ自体を２次より大きい（すなわち３次以上の）１以上のテイラー級数係数として示す意図的収差（intentional aberration）を、選択的に供給することができる。これらの収差は、焦点を所望の位置に、又は所望の走査で移動するために必要とされる通常の駆動信号の上に反復的に重畳され、得られる像に改善が見られるかどうか検査される。このために特別なコントローラ１２が使用される。コントローラ１２は、第１の収差を発生する収差発生器１３を含む。この第１の推測は、システムについて何がすでに既知であるかに基づくことができる。その後、コントローラ１２は、検出器１０の出力を受け取り、これを時間の関数として見る。次いで、コントローラは、収差発生器によって決定され光に導入された収差が像を改善したか否か判定することができる。次いで、この判定が、収差発生器１３による第２の収差の発生に影響を及ぼすために使用され、この第２の収差が、ＡＯＤによって光に適用される。このサイクルが続行し、収差発生器は、徐々に、最良の像を提供する収差の形態に向かって進む。このようにして、システム内に存在する収差を反復的に導出し、打ち消す収差をＡＯＤ駆動信号に与えることによってそれらを自動的に補正しようとするフィードバックシステムがセットアップされる。メモリを使用し、導出される収差を記憶することが好ましい。これらの収差は、各次数ｎに必要とされるテイラー級数係数Ｐ_ｘｔ（ｎ）として表すことができることが好都合である。多数の次数を記憶することができ、又は、システムを、ｎ＝３及びｎ＝４だけなど、いくつかのより高い次数だけでの実験に限定し、それらを記憶させることができる。非常に単純な実施形態は、４次の項Ｐ_ｘｔ（４）だけを使用し、システム内の任意の球面収差を補正することによって機能する。そのような場合には、収差発生器は、観察された効果に応答して係数を減少又は増大するという単純なタスクを有し、メモリは、Ｐ_ｘｔ（４）に関する単一のデータ値を記憶すればよい。

収差補正を行うために、非正弦曲線位相変調が好ましいことが判明している。システム内に存在する収差が正弦曲線位相変調によって完全に補正されることになる可能性は非常に低い。原理上の正弦曲線位相変調は、次数と共に階乗で減少する振幅で無限次数まで位相エラーを導入する。本発明は、各次数について係数の値を故意に選択することに関する。良好な収差補正を行うために必要とされる係数値は、一般に次数が増大するにつれて小さくなることが判明しており、ｎが係数の次数であるとき３．２／ｎ！より大きい係数は、良好な結果をもたらすことが判明している。これらの係数は、さらに大きく、たとえば３．５／ｎ！を超えるもの、４／ｎ！を超えるもの、又は５／ｎ！を超えるものにすることができる。

ＡＯＤ駆動信号を使用する収差補正に加えて、固定されたレンズ又は他の固定されたシステムによる収差補正をさらに使用してもよい。

より鮮明な焦点を達成することができるため、したがってシステム解像度を改善することができる。さらに、より安価な構成部品を使用することができ、システムコストを削減する。また、この反復的な方法は、システムの変更に応答してシステムが自己補正することを可能にする。したがって、構成部品が交換又はアップグレードされた場合、システムは、ある程度、それ自体自動的に再較正することが可能であり、これは、潜在的に単調な作業の数時間を節約することができる。

動的収差制御
システム光学系から生じる固定された収差を補正することに加えて、本発明はまた、焦点分布関数の形状を修正するために、またたとえば、研究中の対象、たとえば脳組織など組織試料において生じる収差を補正するために使用することができる。

そのような組織試料は、不均一な屈折率を有する可能性があるため、その組織試料によって誘導される収差の量は、しばしば、光が集束される試料内の位置の関数である。本発明のこの態様によれば、組織（又は他の標本）内の焦点スポットの位置に応じた形で収差を補正する非線形ＦＭ駆動信号を決定することができる。図１０は、入来する光ビーム１６を偏向する１対のＡＯＤ３０、４０を示す。対物レンズ７０を使用し、組織１９のある領域内において、表面の下の何らかの点で光ビームを集束する。焦点スポット２２が組織１９内に形成される。組織の不均一な屈折率、及び組織が不規則な上面２１を有する可能性があることにより、集束されたスポット２２に対する組織１９によって引き起こされる収差は、スポット２２の位置の関数である。本発明によれば、ＸＹＺ位置（又は二つのＡＯＤだけが使用される場合、ＸＺ位置だけ）に対する組織内の収差のモデルを構築することが可能である。このモデルは、組織内の各位置に存在する収差パラメータを与える。これらはメモリ内に記憶することができることが好都合である。次いで、組織に対して実験を実施するとき、システムは、記憶されたパラメータを参照し、必要な補正をＡＯＤ駆動信号に適用し、組織によって誘導される収差を打ち消すことができる。

このモデルは、最初に、研究すべき組織のラスタ走査を実施することによって作成することができ、組織の上部で走査を開始し、徐々に深く走査する。像の結果を監視することができ、最小限の修正で、スポットが組織内に深く侵入するにつれて各ＸＹＺ位置での最適な補正に向かって増分的に収差を補正することが可能である。

適正な駆動パラメータを計算し、各位置で適正に予め歪まされた波面を生成するために、蛍光信号を最適化するためにすでに実証されている技法の一つを適合させることができる。そのような方法は、非特許文献８に概説されている。ここには、ランダムシーケンス又はさらに高次の収差のシーケンスで波面を実験により修正する最適化ルーチンが開示されている。試験される各収差について、しばしば小さな明るい蛍光ビードから像品質が監視され、最適化ルーチンにより、システムは標本内の各位置について最適な収差補正に反復的に向かって進むことができる。図９に示されているシステムは、これを実施し、初期組織モデルを得るのに好適である。

固定された収差を補正するときのように、非正弦曲線位相変調が好ましく、より高次（すなわち、３次以上）の係数の少なくとも一つが３．２／ｎ！より大きいこともまた好ましい。

組織（又は他の標本）によって誘導される収差を補正することにより、より鮮明な焦点を得ることができ、その結果、システム全体の解像度を高めることができる。

Ｚ方向成分を含む焦点移動
多数の応用例では、三つの方向すべてにおいてねじれ曲がる複雑な経路に沿って走査することができることが非常に望ましいであろう。さらに多数の応用例、特に神経科学におけるものでは、この走査を非常に迅速に実施し、高速で移動するプロセスについて情報を取り込むことが非常に望ましい。そのようなことは、細胞サブコンパートメント（たとえば、ニューロン樹状突起の木）の高速測定、及び信号がプラズマ膜からだけ生じる電圧色素イメージング（voltage dye imaging）にとって有用であろう。したがって、神経科学者は、樹状突起に沿って焦点を迅速に辿ること、又は３Ｄ空間内で移動する点を追跡することに関心がある。

本発明は、任意の方向における非常に高速な走査を、ＡＯＤシステムを使用して初めて達成することを可能にする。本発明者らは、３次のテイラー級数項（また好ましくは、他のより高次の項がない）を駆動信号の位相変調に追加し、Ｚで焦点スポットの純粋な移動を行うことができることを見出した。

従来、そのような３次の項は、収差を波面内に導入すると考えられていた。実際、３次の項は、各個々のＡＯＤを通過するとき収差を波面内に導入する。図１１は、駆動信号の位相変調においてテイラー級数項の各次数によって導入される収差を示す。

ゼロ次の項はＸと共に変動せず、その結果、ＡＯＤの全開口にわたって一定の大きさの位相変位として見える。これは物理的に、ＡＯＤにわたる一定の応力又は歪みに相関され、それ自体は、ビームがいかに回折するかに影響を及ぼさない。

１次の項は、Ｘの一次関数として変動し、その結果、ＡＯＤ開口にわたって線形収差を導入する。これは、それ自体、焦点又は光の他の特性を変えることなしに光を左（又は右）に偏向させるので、「傾斜（tilt）」収差とみなすことができる。この項は、ＡＯＤ開口を横切ってＡＯＤ結晶内を音速で移動する一定周波数の、移動する音響正弦波に対応する。専門家は、従来技術において、ＡＯＤを使用して光を偏向するために、この１次の項をすでに利用している。たとえば、特許文献１のシステムでは、対向伝搬する駆動周波数及び同一の駆動周波数を有する二つのＡＯＤを使用し、Ｚ＝０平面内で集束される静的なスポットを生み出すことができる（その文献の図７ｂ参照）。その図７ｂに示されているように、第１のＡＯＤによって誘導されるどの傾斜も、第２の（対向伝搬する）ＡＯＤによって導入される反対向きの傾斜によって相殺される。Ｘ＝０以外の位置での集束は、同一でない一定周波数駆動波を二つのＡＯＤに適用することによって達成することができる。たとえば、一方のＡＯＤが他方のＡＯＤより高い（一定）周波数を有する場合には、他方のＡＯＤより多くビームを傾斜させることになり、Ｘ＝０以外の点での集束が見られることになる。

２次の項は、図１１に示されているように、平方されたＸとして変動する。したがって、これは、特許文献１の図７ａ及び図７ｃに示されているように、放物線状の波面をもたらす。ここで論じられているように、放物線状の波面は、時間と共に線形に変化する周波数である周波数チャープを有する駆動信号を使用することによって達成される。放物線状の波面は、ビームを収束又は発散させることを可能にし、これは最終的に、対物レンズ７０によって変換され、Ｚの非ゼロ値で集束する。したがって、２次の項は、非ゼロのＺ位置での集束と関係付けられる。より大きなＺ変位については、対物光学系は、完全に放物線状の線形周波数チャープされたＡＯＤ波面から完全に収束する球状波面を生成するように設計される可能性は低いことに留意されたい。したがって、高いＺ変位では、最適な点像分布関数を形成するために、より高次（たとえば、４次Ｐｘ（４））の項が導入されることを必要とし得る。

図１１から、奇数及び偶数の次数の項は、対向伝搬するＡＯＤに適用されたとき異なるように挙動することがわかる。偶数項は、どちらに駆動信号が伝搬していても同じに見える。したがって、偶数の次数の項だけを有する駆動信号が、左から右に伝搬させようと右から左に伝搬させようと同じに見えることになる。これは、図５における偶数項のＸ＝０線周りでの対称性に留意することによってわかる。

しかし奇数項は、伝搬の方向に応じて反対の大きさを有するように見える。１次の項だけによって位相変調される駆動信号は、ＡＯＤ開口にわたって非対称パターンを生み出す。これは図１１でわかる。また、特許文献１の図７ｂでもわかり、１次の傾斜項は、互いに相殺し合う。これは、２次の焦点項が、互いに相殺し合うのではなく強め合うように組み合わされる特許文献１の図７ａ及び図７ｃと対比することができる。

したがって、３次の項が奇数の次数であるため、図１１に示されているように、ＡＯＤの第１の半分にわたる収差は、ＡＯＤの第２の半分にわたる収差と同じ大きさの、しかし反対の符号を有する。したがって、本発明者らは、１対の等しい３次の項を使用し、対向伝搬するＡＯＤ内の駆動信号を位相変調する場合、各ＡＯＤによって導入される収差は、空間内で互いに相殺し合うことを見出した。しかし、時間で変動する２次の（放物線状の）成分は相殺されず、その結果、焦点は、Ｚ方向で滑らか且つ完全に移動される。

特許文献１の図８は、周波数が時間的、及び空間的にマッピングされたとき既知の駆動信号がどのように見えるかを示す。そこでわかるように、周波数の分離によりＸでの焦点スポット位置が制御され、周波数グラフの傾きによりＺでの焦点スポット位置が制御される。

図１２は、同様の図面であるが、３次の項を駆動信号の位相変調に追加する効果を示す。わかるように、３次の項の効果は、既知の線形周波数ランプを非線形ランプに変換することである。図１２では、周波数が時間と共に増大される。この効果は、スポットの位置を滑らかにＺで上向きに移動させることである。

純粋な（すなわち、４次又は他のより高次の項がない）３次の項の使用が、収差のないＺ走査を行うために好ましい。

コントローラ１２は、電磁放射の入来するビームが後続の対物光学系９によって、ある点像分布関数に集束されるように、駆動信号を合成するように構成されており、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に滑らかに移動し、点像分布関数がミニ走査中にＺ方向に移動するとき、たとえば２０％以内の許容限度で不変である最大ピーク強度を有する。これは、本発明により、３次の項を使用することによって事実上達成される。

また、コントローラ１２は、電磁放射の入来するビームが後続の光学系９によって、ある点像分布関数に集束されるように、駆動信号を合成するように構成されており、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に移動し、点像分布関数がミニ走査中にＺ方向に移動するとき、たとえば４０％以内で不変であるＦＷＨＭ幅を有することが好ましい。

比較的一定のピーク強度と比較的一定のＰＳＦ幅は共に、本発明を使用して、３次又はより高次の項の存在により、達成することができる。３次の項は、Ｚで走査するように働き、より高次の項は、収差を補正するように働く。

固定された収差補正、動的収差補正、及びＺ走査のいずれか又は全部を組み合わせることが、本発明に含まれる。これは、単純に、各タスクに必要とされる駆動用の個々の駆動信号を重畳する（足し合わせる）こと、及び得られる信号を使用しＡＯＤを駆動することによって達成することができる。

Ｚ方向で完全に集束されたスポットの移動がコンピュータモデリングによって実証されており、図１３ａ〜１３ｃに示されている。これらの図では、正規化された２光子強度がＹ軸に沿ってプロットされており、時間がＸ軸に沿って示されている。Ｚ軸は、Ｘにおける位置を示す。

図１３ａ〜１３ｃは、三つの異なる焦点深度での時間及びＸ変位に対するシミュレーションされた焦点強度を示す。図１３ａは、ＮＡ＝０．８の対物レンズの自然焦点面の上方で＋１５μｍとなる焦点深度に対応し、図１３ｂは自然焦点面に対応し、図１３ｃは、自然焦点面の下方１５μｍの距離に対応する。三つの場合すべてにおいてピーク強度が１であり、これは完全な回折限界集束に対応すること、また、各焦点面でのピーク強度の時間が＋１４μｓ、０μｓ、及び−１４μｓであり、時間に伴うＺ焦点スポットの線形の移動に一致することがわかる。

Ｗ_ｆ（ｘ，ｔ）に関する以前の式の代数的再構成を使用し、それらを基本的な幾何光学と組み合わせることにより、ＡＯＬが既知の有効開口数ＮＡの光ビームを焦点スポットに投影するように対物レンズの下方でのＺ変位δＺがＡＯＬに結合したことを示すことが簡単であり、これは下式によって与えられる。

式中、
λは光の波長であり、
ｒは、対物レンズの下方の屈折率である。

この式が時間において線形であることは、Ｚ変位が一定の速度にあることを裏付ける。Ｐｘｔ（３）＝１の波、Ｌ＝１５ｍｍ、ＮＡ＝０．８、ｒ＝１．３３（水）について時間に対するＺ変位のプロットが、図１４に示されている。

一般に、３次の項を、既知のゼロ次の項、１次の項、及び２次の項と組み合わせ、３Ｄ空間内で任意に移動する走査経路を生み出すことができる。ゼロ次から２次の項だけ、及び打ち消す３次の項の対を使用するとき、スポット焦点に対する収差は導入されない。これは、３Ｄ空間の特定の部分領域を走査するのに有用であり、細胞サブコンパートメント（たとえば、ニューロン樹状突起の木）の高速測定、及び信号がプラズマ膜からだけ生じる電圧色素イメージングにとって特に有用である。膜領域を走査するだけで、時間分解能がより高くＳＮＲがより良好な記録を達成することができる。

また、このシステムは、高速３Ｄ光ピンセットに有用である。このシステムは、静止スポットを任意の３Ｄ方向で並進させることを可能にし、これは、３Ｄ内の焦点スポット内に捕らえられた対象を移動するために使用することができる。

３Ｄでの焦点の循環的運動
ポインティングモードを使用すべきとき、３Ｄ空間内のいくつかの点が最初に識別され、次いで、ビームが、あるドウェル時間の間、各点で連続的に集束される。典型的には、点を識別することができる前に、通常、ラスタ走査で３Ｄ空間を、そこに何があるか判定するために走査し、次いで走査を調査し、注目の点を見分けることが必要である。これはかなりの時間がかかる可能性があり、これを改善することが望ましい。

本発明のこの態様を使用し、特に疎な（すなわち、可能な総走査体積に比べて体積が小さい）対象が走査されるとき、総走査時間を削減することができる。

たとえば、ニューロンを色素で充填することができ、本発明を使用し、最近測定された点の明るさの結果を用いて次の点の位置を制御するアルゴリズムを使用して、その本体及び樹状突起を描くことができる。

本発明は、明るい対象を見つけた後で、明るい蛍光がすでに見つかっているところに近い局所点だけに行く３Ｄランダム化走査プロセスを含む。これは、完全な走査可能な３Ｄ体積内の点のすべてに行く必要なしに、明るい対象を描くことを可能にする。本発明は、そのような局所的な、疎な走査を高速で行うことを可能にする。

この装置が図１５に示されている。この装置は、図１に示されているものと同様であるが、コントローラ１２が修正されている。標準的な駆動信号を生み出すための上述の手段、及び収差補正又はＺ走査成分を有する駆動信号に加えて、このコントローラは、位相感応型検出器１４、及び４相周波数発生器１５をも含む。実施されている方法によれば、３Ｄ体積内のあるスポットが、コントローラ１２によって、又はユーザがコントローラ１２をプログラムすることによって最初に選択される。これは、対象（オブジェクト）に当たる可能性が高いスポット、さらに望ましくは注目の対象が存在することが既知であるスポットになるように選択されることが好ましい。次いで、その点でポインティングを引き起こすための駆動信号がコントローラ１２によって計算され、ＡＯＬ１１に適用される。４相周波数発生器１５は、好ましくは異なる振幅及び位相を有する四つの循環的な波形（正弦曲線とすることができるが、そうでなくてもよい）を生み出すために使用される。循環的なＦＭ波形は、標準的な駆動信号の上部で重畳される。異なる振幅及び位相の循環的なＦＭ信号は、ＡＯＬ１１を形成する各ＡＯＤに対する線形駆動信号上で重畳されることが好ましい。ＡＯＤ開口充填時間の逆数未満の低い重畳済みＦＭ駆動周波数では、これは、著しい収差なしに３Ｄ空間内で焦点スポットの循環的運動を引き起こす。周波数が前記逆数のＡＯＤ充填時間を超えて増大するにつれて、スポット移動もスピードを増すが、変調の振幅が大きすぎる場合、波面収差が著しいものになり得る。駆動の振幅及び周波数は、コントローラ１２によって、たとえば点像分布関数寸法の０〜１０倍までの直径で、点像分布関数の迅速な循環的運動を生成するように選択される。次いで、検出器１０によって検出された信号が、発生器１５によって導出される循環的変調を入力として有する位相感応型検出器１４で監視される。これは、各サイクルのどの部分が最も明るく、どれが最も暗いか測定するのを容易にする。この情報は、振動する点像分布関数の平均中心に対して局所的な３Ｄ蛍光の傾き及び発散の迅速且つ正確な尺度をもたらす。この情報は、コントローラ１２内に実装された迅速なフィードバックアルゴリズムによって、振動する点像分布関数の中心を次にどこに導くかを計算するために使用される。次いで、それに応じて標準的な駆動信号が、コントローラ１２によって更新される。このようにして、システムが、ニューロンの本体及び樹状突起など、空間内の対象を迅速に描き、撮像することが可能である。また、このシステムを使用し、３Ｄ空間内で移動する小さな粒子を追跡することができる。（高速及び高い変調深度では、焦点収差の循環的な変動に起因する２光子強度の変動がある可能性があり、これは制御システム内で許されることを必要とすることがある。）
位相感応型検出器１４は、繰返し信号の既知のボックスカー検出を使用することができる。この差分検出モードは、照明用のレーザビームの他のあまりぴったりと集束されていない部分からの蛍光など共通モード信号を減算によって解消することを可能にし、微細なフィーチャ（feature）からの必要な蛍光の信号対雑音比をさらに改善する。

図１６は図１２と同様であるが、循環的な項を駆動信号の位相変調に追加する効果を示す。わかるように、循環的な次数の項の効果は、既知の線形周波数ランプを、線形ランプによって画定される平均位置周りで振動する非線形ランプに変換することである。図１６では、周波数は、（おそらくは時変の）平均周波数周りで振動させられ、これは、スポット位置２２を時間と共に何らかの平均位置周りで振動させる。

したがって、本発明は、変形可能な媒体内に埋め込まれた微細な構造の対象、たとえば生きた神経組織内に埋め込まれたシナプスボタン又は樹状突起のリアルタイムに近い追跡を可能にする。したがって、本発明は、組織の変形又は移動にかかわらず、微細なフィーチャから、最も強い、且つ最も高速の蛍光信号を一定に維持することを可能にする。これは、たとえば動物の移動又は拍動する血液供給による組織変形が自然なことであり、そうでない場合には正確な測定を困難又は不可能にするように働く生体内測定を行うとき応用することができる。

本発明はさらに、高ＳＮＲの機能光学イメージングを達成することを可能にする。一部の蛍光色素は容易に白化し、又は過剰な照明で長く続く暗状態に追い込まれ得る。さらに、静止ポインティング中に一つの位置で長期間の間滞在することは、組織の光損傷を引き起こす可能性がある。本発明のこの態様を使用し、ＰＳＦが一定に移動するのを保つことができ、それにより、照明エネルギーが空間的に分配され、次いで未白化の色素が、照明される体積内に拡散するための時間があるので、これらの作用を回避する。３Ｄ空間内の他の疎に分布する点周りに集まった多数の特定の位置から測定するためには、よい解決策は、上述のように各点周りでのＰＳＦの局所的な循環的走査を使用することである。

また、本発明は、局所化された飽和作用を低減することによって、静止ポインティングに比べて光活性化又は光分解の効率を高めるように働く。これは、たとえばチャネルロドプシンなど光遺伝学的タンパク質の２光子活性化に有利となり得る。

他の応用例
本発明は、何らかの理由でシステム内で発生する収差を補正するために広く使用することができる。２０１２年１月８日にオンラインで公開された非特許文献９には、大きな（約４０度の）ウォークオフ角度を有するＡＯＤの第２の対を使用するシステムが記載されている。これは、より小さなウォークオフ角度（約２０度）を使用する特許文献１のシステムに匹敵する。ＡＯＤの第２の対におけるより大きなウォークオフ角度は、より大きな角度全体を走査することを可能にするが、特に強いＺ集束で著しい収差を生み出す。この作用は、拡大鏡を傾斜させることに似ており、その結果は、補正されないままにした場合、点像分布関数のサイズを増大することになり、システム解像度を低下させる。

本発明者らは、大きなウォークオフ角度によって引き起こされるこの収差がコマ（３次）収差であることを見出した。この収差は、本発明により、適切な符号をもちスケーリングされた（すなわち、収差を打ち消す）３次又は４次の位相収差をＲＦ駆動波動関数に導入することによって補正することができる。

たとえば、ＮＡ＝０．８及び開口が１５ｍｍであるシステムの場合、２０度のウォークオフ角度を４０度のウォークオフ角度に変更する作用は、１２５μｍの比較的小さいＺ焦点に対してさえ、コマ収差を波長の０．２５より大きいものに増大することである。この収差は、原理上、適切な大きさの３次成分を駆動信号に適用することによってゼロに低減することができる。

したがって、本発明は、ＡＯＤがテレセントリックリレーによって結合されるもの、特許文献１に開示されているＡＯＤのコンパクトな構成を使用するもの、並びに特許文献２及び上述のカトーナ（Ｋａｔｏｎａ）らによる論文に記載されているＡＯＤ構成を使用するものを含めて、広範な物理的構成に適用可能である。さらに、本発明は、特許文献１のより狭い角度、並びにカトーナ（Ｋａｔｏｎａ）らの論文におけるより広い角度を含めて、広範なＡＯＤウォークオフ角度にわたって適用可能である。

したがって、本発明は、顕微鏡システム、及び対象を撮像するための方法を含むことがわかる。また、本発明は、ドライバそれ自体、及び駆動信号を決定するための方法をも含む。放射を偏向する方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。

Claims (44)

1. 第１の音波をサポートするように構成された第１の音響光学偏向器と、
   対向伝搬する第２の音波をサポートするように構成された第２の音響光学偏向器と、
   前記第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器のそれぞれについて第１の駆動信号及び第２の駆動信号を合成するためのドライバとを備え、
   前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を合成するように構成され、
   前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を合成するように構成されている、音響光学レンズ。
2. ２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、請求項１に記載の音響光学レンズ。
3. 第１の音波をサポートするように構成された第１の音響光学偏向器と、
   対向伝搬する第２の音波をサポートするように構成された第２の音響光学偏向器と、
   前記第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器のそれぞれについて第１の駆動信号及び第２の駆動信号を合成するためのドライバとを備え、
   前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を合成するように構成され、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数であり、
   前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を合成するように構成され、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、音響光学レンズ。
4. 前記第１の駆動信号は、前記第１の音波が単独で、前記第１の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の１００分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものであり、
   前記第２の駆動信号は、前記第２の音波が単独で、前記第２の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の１００分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
5. 前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器を通過した、かつ、後続のレンズによって集束された電磁放射のビームは、波長の２分の１より小さい位相エラーを有する、請求項４に記載の音響光学レンズ。
6. 前記第１の駆動信号は、前記第１の音波が単独で、前記第１の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の４分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものであり、
   前記第２の駆動信号は、前記第２の音波が単独で、前記第２の音響光学偏向器を通過する電磁放射のビーム内で少なくとも波長の４分の１の位相エラーを引き起こすことになるようなものである、請求項４又は５に記載の音響光学レンズ。
7. 前記第１の音波及び前記第２の音波は、以下のようなテイラー級数の形態にあるそれぞれの波動関数によって表すことができ、
   

   

   式中、
   ｘ＝ＡＯＤの中心から測定された横方向距離座標
   ｔ＝波動関数の中心から測定された時間
   Ｖ_ａｃ＝結晶内の音波のスピード
   ｆ＝ＡＯＤドライブの基準中心周波数
   Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）（Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ））＝＋ｘ（−ｘ）に向かって伝搬する波動関数
   Ａ＝波動関数の振幅
   Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
   単位はｔ−ｘ／Ｖ_ａｃ＝τ／２で測定された（収差の）波数
   Ｎ＝考慮される収差の最高次数
   Ｌ＝ＡＯＤの長さ
   τ＝Ｌ／Ｖ_ａｃ＝ＡＯＤ充填時間
   Ｎ≧３
   である、請求項１から６のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
8. 前記駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される、請求項１から７のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
9. 前記駆動信号は、調査される組織試料などの標本内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調される、請求項１から８のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
10. 電磁放射が−Ｚ方向に移動して当該音響光学レンズに入射するように当該音響光学レンズが実質的にＸＹ平面内で配向されているとき、前記第１の音波及び前記第２の音波は、対物レンズの後で、少なくとも−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に滑らかに移動する集束された点を形成するように、前記電磁放射を回折させることになる、請求項１から９のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
11. 前記ドライバは、ある点像分布関数に、電磁放射の入来するビームが後続のレンズによって集束されることになるように、駆動信号を合成するように構成されており、ここで、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に滑らかに移動し、前記点像分布関数がミニ走査中にＺ方向に移動するとき、２０％以内で不変である最大ピーク強度を有するものである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
12. 前記ドライバは、ある点像分布関数に、電磁放射の入来するビームが後続のレンズによって集束されることになるように、駆動信号を合成するように構成されており、ここで、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に移動し、前記点像分布関数がミニ走査中にＺ方向に移動するとき、４０％以内で不変であるＦＷＨＭを有するものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
13. 前記ドライバは、３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない駆動信号を合成するように構成されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
14. 前記ドライバは、関連の光学システム内、又は調査中の標本内で生じる収差を補正するように働く、３次より大きい成分をさらに追加するように構成されている、請求項１３に記載の音響光学レンズ。
15. 前記ドライバは、線形周波数変調された成分に加えて位相変調又は周波数変調の循環的成分をも含む駆動信号を合成するように構成され、その結果、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが、後続のレンズによって集束されたとき、前記線形周波数変調された成分によって画定される平均焦点位置を中心とする循環的運動を有する焦点を形成する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
16. 前記線形周波数変調された成分は、前記循環的運動からの情報を使用するフィードバックアルゴリズムによって制御され、３Ｄ空間内の注目の点又はフィーチャの位置を決定する、請求項１５に記載の音響光学レンズ。
17. 空間内のそれぞれの焦点位置に関連する駆動パラメータを記憶するためのメモリを含み、当該音響光学レンズは、空間内の関連のそれぞれの位置で電磁放射を集束しようとするとき前記記憶された駆動パラメータを使用するように構成される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
18. 前記駆動パラメータは、前記第１の音波及び第２の音波のそれぞれの位相変調又は周波数変調を表す波動関数の級数展開の係数である、請求項１７に記載の音響光学レンズ。
19. 前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器は、前記第１の音波及び第２の音波のそれぞれが同じ結晶内で伝搬するように単一の結晶によって提供される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
20. 第３の音響光学偏向器と、
    第４の音響光学偏向器とをさらに備え、
    前記第３の音響光学偏向器及び前記第４の音響光学偏向器は、前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器が電磁放射のビームを偏向する方向に対して直交する成分を有する方向で、電磁放射の前記ビームを偏向するためのものであり、
    前記ドライバが、前記第３の音響光学偏向器及び第４の音響光学偏向器のそれぞれについて第３の駆動信号及び第４の駆動信号を合成するためのものであり、
    前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第３の関数によって位相変調される第３の駆動信号を合成するように構成され、
    前記ドライバが、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第４の関数によって位相変調される第４の駆動信号を合成するように構成されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の音響光学レンズ。
21. 前記ドライバが、以下の（ｆ）〜（ｊ）の１つ以上に従って構成され、
    （ｆ）前記第３の関数及び前記第４の関数は、非正弦曲線であり、
    （ｇ）前記第３の関数及び前記第４の関数は、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有する２次より大きい係数を含み、式中、ｎは係数の次数であり、
    （ｈ）前記駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調され、
    （ｉ）前記駆動信号は、調査される組織試料など標本内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調され、
    （ｊ）前記駆動信号は、対物レンズの後で、少なくとも−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に滑らかに移動する集束された点をもたらすようなものである、
    請求項２０に記載の音響光学レンズ。
22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の音響光学レンズと、対物光学系とを備える顕微鏡。
23. 音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、
    ２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を決定するステップと、
    ２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる非正弦曲線の第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を決定するステップと
    を含む方法。
24. 音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、
    ２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第１の関数によって位相変調される第１の駆動信号を決定するステップであって、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、ステップと、
    ２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第２の関数によって位相変調される第２の駆動信号を決定するステップであって、２次より大きい前記テイラー級数の係数の少なくとも一つは、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有し、式中、ｎは前記係数の次数である、ステップと
    を含む方法。
25. 前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号は、それぞれの第１の音波及び第２の音波を音響光学レンズ内で伝搬させるためのものである、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 前記第１の音波及び前記第２の音波は、以下のようなテイラー級数の形態にあるそれぞれの波動関数によって表すことができ、
    

    

    式中、
    ｘ＝ＡＯＤの中心から測定された横方向距離座標
    ｔ＝波動関数の中心から測定された時間
    Ｖ_ａｃ＝結晶内の音波のスピード
    ｆ＝ＡＯＤドライブの基準中心周波数
    Ｗ^＋ _ｆ（ｘ，ｔ）（Ｗ⁻ _ｆ（ｘ，ｔ））＝＋ｘ（−ｘ）に向かって伝搬する波動関数
    Ａ＝波動関数の振幅
    Ｐ_ｘｔ（ｎ）＝テイラー級数の係数ｎ
    単位はｔ−ｘ／Ｖ_ａｃ＝τ／２で測定された（収差の）波数
    Ｎ＝考慮される収差の最高次数
    Ｌ＝ＡＯＤの長さ
    τ＝Ｌ／Ｖ_ａｃ＝ＡＯＤ充填時間
    Ｎ≧３
    である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記決定するステップが、
    関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように前記駆動信号を変調することを含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記決定するステップが、
    調査される組織試料などの標本内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように前記駆動信号を変調することを含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号は、それぞれの第１の音波及び第２の音波を前記音響光学レンズ内で伝搬させるためのものであり、
    電磁放射を前記音響光学レンズに入射させるステップであって、前記電磁放射が−Ｚ方向に移動している、ステップと、
    前記第１の音波及び前記第２の音波を使用し、前記電磁放射を回折させるステップと、
    対物光学系を使用し、前記回折された電磁放射を集束し、それにより−Ｚ方向又はＺ方向の成分と共に移動する集束された点を形成するステップと
    をさらに含む、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記決定するステップが、
    線形周波数変調された成分に加えて位相変調又は周波数変調の循環的成分をも含む駆動信号を決定し、それにより、前記線形周波数変調された成分によって画定される平均焦点位置を中心とする、音響光学レンズを通って移動する前記電磁放射の焦点位置の循環的運動を引き起こすことを含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記循環的運動からの情報をフィードバックアルゴリズム内で使用し、３Ｄ空間内の注目の点又はフィーチャの位置を決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 空間内のそれぞれの焦点位置に関連する駆動パラメータを記憶するステップと、
    前記記憶された駆動パラメータを使用し、空間内の関連のそれぞれの位置で電磁放射を集束するステップと
    をさらに含む、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記駆動パラメータは、それぞれの第１の駆動信号及び第２の駆動信号の変調を表す波動関数の級数展開の係数である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号をそれぞれの第１の音響光学偏向器及び第２の音響光学偏向器に送り、それにより、電磁放射の入来するビームを集束するためにそれぞれの第１の音波及び第２の音波を前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器内で伝搬させるステップをさらに含む、請求項２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第１の音響光学偏向器及び前記第２の音響光学偏向器は、それぞれの第１の音波及び第２の音波が同じ結晶内で伝搬するように単一の結晶によって提供される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号に加えて前記音響光学レンズに送られたときに電磁放射の入来するビームを対物光学系によってある期間中に３次元で集束させることになる第３の駆動信号及び第４の駆動信号を決定するステップをさらに含み、
    前記第３の駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第３の関数によって位相変調され、
    前記第４の駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができる第４の関数によって位相変調される、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 音響光学レンズを使用して電磁放射のビームを偏向させるための方法であって、
    請求項２３から３６のいずれか一項に記載の方法に従って第１の駆動信号及び第２の駆動信号を決定するステップと、
    前記第１の駆動信号を適用し、それにより第１の音波を第１の音響光学結晶内で伝搬させるステップと、
    前記第２の駆動信号を適用し、それにより第２の音波を第２の音響光学結晶内で伝搬させるステップと、
    電磁放射の入来するビームを前記音響光学レンズに通し、それにより偏向させるステップと
    を含む方法。
38. 音響光学レンズ用の駆動装置であって、
    ３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない第１の駆動信号を合成するための第１の駆動信号シンセサイザと、
    ３次に位相変調されるが３次より大きい成分が実質的にない第２の駆動信号を合成するための第２の駆動信号シンセサイザと
    を備える駆動装置。
39. 前記第１の駆動信号及び前記第２の駆動信号は、前記音響光学レンズに入射する電磁放射のビームが後続の光学系によって少なくとも一つの次元で集束されるように合成される、請求項３８に記載の駆動装置。
40. 前記第１の駆動信号シンセサイザ及び前記第２の駆動信号シンセサイザは、光学システム内で生じる収差を補正するように働く、３次より大きい成分をさらに追加するように構成されている、請求項３８又は３９に記載の駆動装置。
41. 音響光学偏向器と、
    音波を前記音響光学偏向器内で伝搬させるように前記音響光学偏向器に駆動信号を送るためのドライバとを備え、
    前記ドライバが、２次より大きい次数に位相変調される駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズであって、
    （ｇ）前記駆動信号は、非正弦曲線である関数によって位相変調され、
    （ｈ）前記駆動信号は、２次より大きい１以上の係数を有するテイラー級数として表すことができ、少なくとも３．２／ｎ！個の波の大きさを有する２次より大きい係数を含む関数によって位相変調され、式中、ｎは係数の次数であり、
    （ｉ）前記駆動信号は、関連の光学システム内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調され、
    （ｊ）前記駆動信号は、調査される組織試料など標本内で生じる収差を部分的又は実質的に補正するように位相変調又は周波数変調され、
    （ｋ）前記駆動信号は、Ｚ方向における成分と共に移動し、点像分布関数がＺ方向に移動するとき、２０％以内で不変である最大ピーク強度を有する前記点像分布関数に、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが後続の光学系によって集束されることになるようなものであり、
    （ｌ）前記駆動信号は、ある点像分布関数に、前記音響光学レンズを通って移動する電磁放射のビームが集束されることになるようなものであり、前記点像分布関数は、Ｚ方向における成分と共に移動し、前記点像分布関数がＺ方向に移動するとき、４０％以内で不変であるＦＷＨＭ幅を有するものである、
    の１つ以上に当てはまる、音響光学レンズ。
42. ２次より大きい次数に位相変調される少なくとも一つの駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズ用の駆動装置。
43. 音響光学偏向器と、
    音波を前記音響光学偏向器内で伝搬させるように前記音響光学偏向器に駆動信号を送るためのドライバとを備え、
    前記ドライバが、２次より大きい次数に位相変調される駆動信号を送るように構成されている、音響光学レンズ。
44. 音響光学レンズで電磁放射のビームを偏向させる際に使用するために、前記音響光学レンズの駆動信号を決定するための方法であって、
    音響光学レンズに送られたときに電磁放射の入来するビームを後続の光学系によって集束させることになる第１の駆動信号及び第２の駆動信号を決定することを含み、前記駆動信号は、２次より大きい次数に位相変調される、方法。

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