JP2014516027A - 肺動脈高血圧の治療におけるmicroRNAの調節方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、miR−145の発現または活性の阻害剤を対象に投与することにより、肺動脈高血圧の治療または予防を必要とする対象において肺動脈高血圧を治療または予防する方法を提供する。肺動脈高血圧を治療するためのmiR−145阻害剤を含む医薬組成物およびキットをも開示する。
【選択図】なし
Description
本発明は、microRNA(miRNA)の活性または発現を調節する作用剤を投与することによる肺動脈高血圧の治療および予防に関する。特定的には、本発明は、肺動脈高血圧の治療または予防を必要とする対象の細胞内のmiR−145の発現または活性を阻害することにより肺動脈高血圧を治療または予防する方法を提供する。
肺動脈高血圧(PAH)は、肺血管抵抗の漸進的増加をもたらすPA圧増加および血管リモデリングにより特徴付けられる肺小動脈(PA)の疾患である(Rich et al., 1987)。血管閉塞の結果、右心不全および高い死亡率になる(Jeffery et al., 2002、Voelkel et al., 1997)。骨形成タンパク質(BMP)2型レセプター(BMPR2)(トランスフォーミング増殖因子(TGF)−βスーパーファミリーに対するレセプター)をコードする遺伝子の生殖系列変異は、遺伝型PAH(hPAH)の患者の約70%で同定されている(Morrell et al., 2001)。さらに、BMPR2発現はまた、この遺伝子の変異が不在であるPAH症例(特発性PAH、iPAH)では著しく低減されることから、PAHの発症におけるこのレセプター経路のより広い役割が示唆される。肺動脈平滑筋細胞(PASMC)では、BMPR2の変異は、BMPおよびTGF−βに対する異常増殖反応に関連する。内皮細胞では、この変異は、アポトーシスに対する細胞(PAEC)の感受性を増大させる(Morrell et al., 2001)。いくつかのファミリーおよび大多数のiPAH症例ではBMPR2変異が不在であることから、依然としてさらなる病理学的機序(おそらくTGF−βスーパーファミリーに関連する)を同定する必要があることが示唆される。
傷害に対する反応による新生内膜形成が不在になる(Xin et al., 2009)。さらに、単一および二重ko動物から単離された血管平滑筋細胞(VSMC)は、過増殖活性および血小板由来増殖因子(PDGF)(VSMCに対する既知の化学誘引物質)へのより高い遊走能を示した(Elia et al., 2009、Xin et al., 2009)。さらにまた、miR−143(145)koマウスの血管系の薬理学的分析から、血圧上昇刺激に対する反応が弱められることが明らかにされた(Elia et al., 2009、Xin et al., 2009)。まとめると、これらの知見からmiR−145koマウスおよびmiR143/145二重koマウスではVSMCの表現型の脱分化が示される。
本発明は、部分的には、miR−145の発現および機能が肺動脈高血圧(PAH)の発症に決定的な役割を果たすという驚くべき発見に基づく。本発明者らは、miR−145が慢性低酸素に対する反応によりマウスにおいて有意にアップレギュレートされることおよびmiR−145の遺伝子的または薬理学的な阻害がマウスにおいてPAHの発症を防ぐことを示した。ヒト組織において、本発明者らは、対照と比較してBMPR2遺伝子に変異を有するPAH患者から取得した肺組織および単離肺動脈平滑筋細胞(PASMC)におけるpre−miR−145および成熟型miR−145の増加を報告する。したがって、本発明は、PAHの治療的介入のための新しい標的としてmiR−145を提供する。
実施例1。ヒト肺動脈平滑筋細胞(PASMC)の初代培養。
既報のように、PASMCを末梢動脈から外植した(Yang et al., 2005)。BMPR2に変異を有することがわかっている4名のPAH患者から平滑筋細胞系を取得した。これらには、位置347でシステインがアルギニンと置き換わってBMPR2のキナーゼドメインに変異を有する1名の患者(C347R)、BMPR2の細胞質テールにミスセンス変異を有して903位でアスパラギンの代わりにセリンが入った1名の患者(N903S)、アミノ酸位置9に短縮(truncating)変異を有する1名の患者(W9X)、およびアミノ酸位置899に短縮変異を有する1名の患者(R899X)が含まれる。さらに3つのPASMC調製物を非罹患対象から取得した。既報のように細胞を培養した(Yang et al., 2005)。
製造業者の説明書に従ってmiRNeasyキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて組織および細胞からの全RNAを取得し、ゲノムDNA汚染を排除するためにDNAse1(増幅グレード、Sigma, St. Louis, MO, USA)で処理し、そしてNanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE, USA)を用いて定量した。TaqMan miRNAアッセイプロトコル(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)に従ってステムループ逆転写プライマーを用いて、miRNA分析のためのcDNAを全RNAから合成した。各反応系には、50ngの抽出全RNA、50nMのステムループRTプライマー、1×RT緩衝液、各0.25mMのdNTP、3.33U/mlのMultiscribe逆転写酵素、および0.25U/mlのRNアーゼ阻害剤が含まれていた。96ウェルプレート中で、15mlの反応系を16℃で30分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、次いで、4℃に保持した。Superscript II逆転写酵素(Invitrogen, Paisley, UK)を用いて、全RNAからpremiRNA分析用の全cDNAを取得した。各反応系には、1mgの全RNA、1×Superscript II緩衝液、10U/mlのSuperscript II RT、0.15mg/mlのランダムヘキサマープライマー(Invitrogen, Paisley, UK)、1U/mlのRNase阻害剤(Promega, Madison, WI, USA)、および各0.25mMのdNTPが含まれていた。サイクル条件は、次のとおり、すなわち、25℃で10分間、48℃で30分間、95℃で5分間であった。−20℃でcDNAを貯蔵した。すべてのin vivoグループにわたり安定であるので、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として選択した。
LRECおよびHTAのガイドラインに準拠して、Papworth NHS Foundation Trust Hospital Tissue Bankからホルマリン固定パラフィンワックス包埋組織ブロックを取得した。末期肺高血圧のためにPapworth Hospitalで移植を受けたインフォームドコンセントが得られた患者からの肺サンプルを使用した。変異BMPR2を伴うhPAH(n=5)、iPAH(n=6)、および対照(n=6)を含む一連の病状の組織を取得した。対照は、肺癌のために肺切除を受けた患者からの腫瘍のない肺葉から採取され、かつ病理学者により腫瘍がないと報告された組織で構成された。RecoverAll全RNA単離キット(Ambion, Streetsville, Canada)を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルから全RNA(miRNAを含む)を抽出した。3つの10mmスライスをキシレンにより50℃で3分間脱蝋し、エタノールで2回洗浄し、そしてプロテアーゼにより50℃で15分間、次いで、80℃で15分間消化させた。溶解物をフィルターカートリッジに通し、そしてDNAseにより消化させ、次いで、RNAseを含まない30mlの水中にRNAを溶出させ、そしてNanoDrop ND-1000分光光度計を用いて定量した。
定量的PCR(q−PCR)では、10mlの反応系を386ウェル光学プレート中、95℃で10分間インキュベートし、続いて、95℃で15秒間および60℃で1分間を40サイクル行った。結果をマウスおよびヒトのmiRNAではそれぞれU6またはRnu−48の値に、pre−miR−145発現ではGAPDHに規格化した。2D D Ct法(1、2)を用いて、すべてのmiRNA発現に関して変化倍率を得た。各miRNAに対するq−PCRを三重試験方式で行い、結果をサンプルの平均±標準誤差として提示する。
各グループから10週齢の6匹のマウスの主分岐肺動脈を切除し、RNA単離前、−80℃で凍結保存した。RNAの量および質をNanoDrop(登録商標)分光光度計(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)により評価した。RNA 6000 Nanoキット(Santa Clara, CA)を用いて、Agilent 2100バイオアナライザーにより、RNA完全性を評価した。Illuminaアレイ(Applied biosystems Carlsbad, California)を用いたハイブリダイゼーションのために、Illumina TotalPrep RNA増幅キット(Ambion)を用いて、500ngの供給RNAからビオチン化増幅RNAを作製した。製造業者のプロトコルに従ってIllumina mouseWG-6 v2.0発現ビーズチップをハイブリダイズし、Illumina BeadArrayリーダーにより走査し、Illumina GenomeStudio(登録商標)ソフトウェア(バージョン1.1.1)に読み込んだ。マイクロアレイデータの解析および確認では、データ処理およびR解析(ランクプロダクト統計解析が行われる)のために、分位点規格化バックグラウンド除去強度値をGenomeStudio(登録商標)ソフトウェアからエクスポートした。4グループ間で隣接比較を行った。0.05未満の偽陽性率のプローブを有意であるとみなした。マイクロアレイで使用された24サンプルから誘導されたcDNAに関する標的確認のために、Taqman遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用した(n=18/グループ)。
全RNAを15%TBE−尿素ゲル(Invitrogen, Paisley, UK)上で分離し、トランスブロットセミドライシステム(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK)を用いて非荷電ナイロン膜Hybond-NX(Amersham Bioscience UK Ltd, Buckingham, UK)に移し、そしてUV架橋した。ハイブリダイゼーション緩衝液(50%脱イオン化ホルムアミド、5×SSPE、5×デンハート溶液、0.1%SDS、および2μg熱変性ニシン精子DNA)を用いて55℃でプレハイブリダイゼーションを30分間行った。次いで、25pmolのmiR−145検出プローブまたはU6 miRCURY LNA(商標)検出プローブ5’−ジゴキシゲニン(DIG)標識(Exiqon, Denmark)を同一プレハイブリダイゼーション温度で一晩添加した。ハイブリダイゼーション後、膜を低ストリンジェンシー洗浄溶液(invitrogen, Paisley, UK)により50℃で30分間洗浄し、続いて、高ストリンジェンシー洗浄溶液(invitrogen, Paisley, UK)により30分間洗浄した。その後、膜をブロッキング溶液(マレイン酸中の1%ブロッキング試薬)中でブロックし、そして室温で抗DIG抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)と共に1:5000で30分間インキュベートした。CDP Star化学発光基質(Sigma-Aldrich, Poole, UK)を用いて膜上で関心対象のmiRNAの存在を検出した。Scion Imageソフトウェアを用いてmiRNA定量を行い、関心対象のmiRNAのバンド強度を確定して相対U6シグナルに規格化した。
ヒトおよびマウスの肺を4%パラホルムアルデヒド溶液により40℃で18時間固定し、そしてパラフィン中に包埋した。段階的濃度のキシレンおよびエタノールで脱パラフィン化した後、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、スライドを3%H2O2入りのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に室温で30分間浸漬した。次いで、非特異的バックグラウンド染色を低減するために、20%正常ヤギ血清と共に30分間インキュベートした。次いで、1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)入りのPBS中で、切片をα−平滑筋アクチンに対するマウスモノクローナル抗体(Dako, Clone 1A4, High Wycombe, UK)またはアイソタイプが一致したマウスIgG非免疫対照(Dako, High Wycombe, UK)と共にインキュベートした。次いで、1%(w/v)BSA入りのPBS中に1:200を希釈された切片を適切なビオチン化二次抗体(Dako, High Wycombe, UK)と共にインキュベートし、次いで、1%(w/v)BSA入りのPBS中に1:400を希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ標識Extravidin(商標)(Sigma, St. Louis, MO, USA)と共にインキュベートした。3.3ジアミノベンジジンを用いて染色を可視化し、そして核をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。
マウスおよびヒトの肺においてmiR−145を検出するために、histoclearおよび段階的濃度のエタノールを用いて切片を再水和した。次いで、スライドを10mMクエン酸ナトリウムpH6.0中で10分間煮沸し、室温(RT)に冷却し、10mg/mlプロテイナーゼKと共に37℃で15分間インキュベートし、最後に抗原回復させるために4%PFA中、室温で10分間固定した。抗原回復後、スライドをハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、4×SSC、2.5×デンハルト溶液、2.5mg/mlサケDNA、0.6mg/ml酵母tRNA、0.025%SDS、および0.1%ブロッキング試薬)と共に60℃で1時間インキュベートし、続いて、同一の緩衝液中で40nM miR−145またはスクランブルmercury LNA(商標)検出プローブ(5’−DIG標識)(Exiqon, Denmark)と共に60℃で一晩インキュベートした。融解温度は、それぞれ、79℃および78℃であった。1%ブロッキング試薬入りのPBSおよび10%FCS中、室温で切片を1時間ブロックし、続いて、1:1000希釈された抗DIG抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)と共に4℃で一晩インキュベートすることにより、免疫検出を行った。次いで、スライドを0.1MトリスpH9.0と共に5分間インキュベートした。miR−145を染色するために、BM紫色溶液(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)またはNBT/BCIP溶液(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)をそれぞれヒトまたはマウスの切片に添加し、そして室温で3日間放置した。
上述したように、慣例に従って固定されたパラフィン包埋6μmヒト肺切片上でmicroRNA in situハイブリダイゼーションを行った。スライドをhistoclearにより脱パラフィン化し、そして10μg/mlプロテイナーゼ(Sigma)により37℃で20分間処理し、次いで、4%パラホルムアルデヒドにより10分間固定した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄後、スライドをハイブリダイゼーション緩衝液と共に60度で1時間インキュベートした。次いで、スライドを60℃で40nM DIG標識miR145またはスクランブルプローブ(Exiqon)により一晩ハイブリダイズした。洗浄およびブロッキングの後、スライドをブロッキング緩衝液中で抗DIG_AP Fabフラグメント(Roche)と共に4度で一晩インキュベートし、そしてPBST(PBS+0.1%Tween 20)および0.1MトリスHCL(pH9.5)で洗浄した。染色が顕微鏡下で見えるようになるまで、BM紫色溶液(Roche)によりmiR−145を室温で1〜2日間可視化した。PBSで洗浄した後、スライドを0.3%H2O2入りのPBSで10分間クエンチした。非特異的バックグラウンドをブロックするために、10%ウサギ正常血清をスライド上に1時間適用し、次いでスライドを、10%正常血清中、4℃でモノクローナル抗ヒトα平滑筋アクチン(DAKO)と共に一晩インキュベートした。色素原として3,3’−ジアミノベンジジンを用いてスライドを5分間可視化した。可視化を図1に示す。
miR−145が肺組織中で発現されたかを評価するために、以上に記載したように、野生型(wt)マウスの肺組織切片上でin situハイブリダイゼーションを行った。マウスの肺の血管および気管支の平滑筋層内にmiR−145の陽性染色が観察された(図2A)。miR−145発現が傷害に対する反応時に変化されたかを評価するために、14日間低酸素暴露されたwtマウスからの全肺および右室においてmiR−145の発現を定量的PCRにより評価し、この発現を正常酸素条件に暴露されたマウスと比較した。分析の結果、低酸素に対する反応により肺および右室の両方でmiR−145の有意なアップレギュレーションが明らかにされた(それぞれ図2B、C)。miR−143レベルもまたアップレギュレートされた(図3)。同一動物の脳、腎臓、および脾臓におけるmiR−145発現の分析の結果、いかなる異常制御も明らかにされなかった(図4)。したがって、miR−145は、マウスの肺の平滑筋細胞内で発現され、低酸素に対する反応により肺において選択的にアップレギュレートされる。単離されたヒト遠位肺動脈SMCにおいて、24時間および72時間の低酸素暴露時にmiR−145の変化が検出されなかったことから、複数の細胞の血管区画(図5)におけるin vivoでの複雑な制御が示唆される。
遺伝子およびタンパク質の発現に対するmiR−145破壊の効果を確認するために、文献ですでに確認されたまたはTargetScanおよびPicTarの予測アルゴリズムを用いて同定されたかつPAHに関与する可能があるとして選択されたいくつかのmiR−145遺伝子標的を、wt動物およびmiR−145 ko動物の肺組織において、q−PCRにより分析した。それらは、KLF4およびKLF5(クルッペル様因子4および5)(両方ともSMCの増殖および分化に関与する)ならびにSMAD4およびSMAD5(TGF−βスーパーファミリーのシグナリング媒介物)を含んでいた。RNA分析の結果、miR−145−/−正常酸素マウスでは、wt正常酸素マウスと比較して、SMAD4およびのSMAD5の両方の有意なアップレギュレーションが明らかにされた(図10A、B)。KLF4は、正常酸素および低酸素の両方のmiR−145−/−マウスで増加し、KLF5発現は、miR−145−/−低酸素マウスと対比してwt低酸素マウスで有意にアップレギュレートされた(図10C、D)。低酸素条件でのWT動物およびKO動物におけるKLF4タンパク質発現のウェスタンブロット分析の結果、この標的の有意なアップレギュレーションが確認されたが、正常酸素では有意な変化が観測されなかった(図11)。これとは対照的に、KLF5タンパク質レベルは、正常酸素条件および低酸素条件のいずれでも同一サンプルで有意にアップレギュレートされなかった(図11)。
miR−145−/−低酸素グループ、WT低酸素グループ、miR−145−/−正常酸素グループ、およびWT正常酸素グループのそれぞれから6つのサンプルを用いて、グローバルトランスクリプトーム分析を行った。miRWalk中のデータベースの少なくとも3つで予想された3’UTR miRNA結合領域を有し、かつmiR−145−/−低酸素とWT低酸素との比較で有意な偽陽性率を有する潜在的miR−145標的をさらなる分析に供すべく選択した。Ingenuity経路分析ソフトウェアおよびDatabase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID)を用いて、肺高血圧に関連する経路中に存在する標的を選択した。これらの選択基準を用いてリアルタイムPCRにより確認すべく、合計13の標的を選択した(表3)。
慢性低酸素に対する反応でmiR−145破壊マウスにおいて観測されたPAHの発症に対する保護効果が、miR−145の薬理学的操作により再現可能であることを決定するために、LNA antimiRを使用した。
PAHの発症におけるmiR−145の役割をさらに解明するために、特発性PAH(iPAH)または遺伝性PAH(hPAH)の患者から採取された肺組織におけるmiR−145発現を対照肺組織と比較した。末期肺高血圧のために移植を受けた患者から肺サンプルを取得した。変異BMPR2(n=5)に関連するhPAHまたはiPAH(n=6)と診断された患者から肺組織を取得した。対照(n=6)は、肺癌のために肺切除を受けた患者からの腫瘍のない肺葉から採取されたかつ病理学者により腫瘍がないと報告された組織で構成された。
ヒトWT PASMCにおいてmiR−143およびmiR−145の発現レベルに対するBMPR2のsiRNA媒介ノックダウンの効果をインビトロで評価するために、BMPR2を標的として特異的にダウンレギュレート可能な低分子干渉(si)配列または陰性対照としてのsiスクランブルを細胞にトランスフェクトした。
PAHのマウスモデルにおけるおよびBMPR2遺伝子に変異を有するPAH患者から抽出されたPASMCにおけるmiR−145制御の重要性を考慮して、ヘテロ接合R899+/−マウスにおけるmiR−145発現に対する短縮BMPR2変異の効果を評価した。このマウスは、既報のR899Xトランスジェニックマウス(West et al., 2008)に類似して、自然肺高血圧を発症する。
Claims (43)
- miR−145の阻害剤を対象に投与することを含む、肺動脈高血圧(PAH)の治療または予防を必要とする対象において肺動脈高血圧(PAH)を治療または予防する方法。
- miR−145の阻害剤が、成熟miR−145配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’−GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU−3’または5’−GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU−3’の配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの糖修飾を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの糖修飾が2’−O−アルキル修飾または二環式糖ヌクレオシド修飾である、請求項4に記載の方法。
- 前記二環式糖ヌクレオシド修飾がロックド核酸である、請求項5に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの骨格修飾を含む、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記骨格修飾がホスホロチオエートリンケージである、請求項7に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約8〜約18ヌクレオチド長である、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約12〜約16ヌクレオチド長である、請求項9に記載の方法。
- 前記阻害剤が吸入投与経路により前記対象に投与される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記阻害剤が乾燥粉末剤として製剤化される、請求項11に記載の方法。
- 前記阻害剤が液体エアロゾル剤として製剤化される、請求項11に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒトが、骨形成タンパク質2型レセプターをコードする遺伝子に変異を有する、請求項14に記載の方法。
- miR−145の阻害剤と投与デバイスとを含む、肺動脈高血圧を治療または予防するためのキット。
- 前記投与デバイスがインヘラーである、請求項16に記載のキット。
- miR−145の阻害剤が、成熟miR−145配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項16または請求項17に記載のキット。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’−GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU−3’または5’−GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU−3’の配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項18に記載のキット。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの糖修飾を含む、請求項18または請求項19に記載のキット。
- 前記少なくとも1つの糖修飾が2’−O−アルキル修飾または二環式糖ヌクレオシド修飾である、請求項20に記載のキット。
- 前記二環式糖ヌクレオシド修飾がロックド核酸である、請求項21に記載のキット。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの骨格修飾を含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載のキット。
- 前記骨格修飾がホスホロチオエートリンケージである、請求項23に記載のキット。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約8〜約18ヌクレオチド長である、請求項18〜24のいずれか1項に記載のキット。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約12〜約16ヌクレオチド長である、請求項25に記載のキット。
- 前記阻害剤が、前記投与デバイス内に含有される粉末剤として製剤化される、請求項16〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 前記阻害剤が、前記投与デバイス内に含有される液体エアロゾル剤として製剤化される、請求項16〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 肺動脈高血圧(PAH)の治療または予防を必要とする対象において肺動脈高血圧(PAH)を治療または予防する方法に使用するための、miR−145の阻害剤であって、前記方法が、miR−145の阻害剤を前記対象に投与することを含む、miR−145の阻害剤。
- miR−145の阻害剤が、成熟miR−145配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項29に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’−GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU−3’または5’−GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU−3’の配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項30に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの糖修飾を含む、請求項30または31に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記少なくとも1つの糖修飾が2’−O−アルキル修飾または二環式糖ヌクレオシド修飾である、請求項32に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記二環式糖ヌクレオシド修飾がロックド核酸である、請求項33に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの骨格修飾を含む、請求項30〜34のいずれか1項に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記骨格修飾がホスホロチオエートリンケージである、請求項35に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約8〜約18ヌクレオチド長である、請求項30〜36のいずれか1項に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約12〜約16ヌクレオチド長である、請求項37に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記阻害剤が、吸入投与経路により前記対象に投与されるか、または前記阻害剤が、吸入投与経路により前記対象に投与するのに好適である、請求項29〜38のいずれか1項に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記阻害剤が乾燥粉末剤として製剤化される、請求項39に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記阻害剤が液体エアロゾル剤として製剤化される、請求項39に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記対象がヒトである、請求項29〜41のいずれか1項に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
- 前記ヒトが、骨形成タンパク質2型レセプターをコードする遺伝子に変異を有する、請求項42に記載の使用のためのmiR−145の阻害剤。
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