CN103814131A - 在肺动脉高血压的治疗中调控microrna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压的方法，即对该受试者施用miR-145表达或活性的抑制剂。还公开了用于治疗肺动脉高血压的包含miR-145抑制剂的药物组合物和试剂盒。

Description

在肺动脉高血压的治疗中调控MICRORNA的方法

发明领域

本发明涉及肺动脉高血压的治疗和预防，即施用调控一种microRNA(miRNA)的活性或表达的药剂。具体地，本发明提供用于治疗或预防肺动脉高血压的方法，即抑制有此需要的受试者的细胞中miR-145的表达或活性。 

发明背景 

肺动脉高血压(PAH)是肺小动脉(PA)的一种疾病，其特征在于PA压和血管重塑的增加，从而导致肺血管阻力的进行性增加(Rich等,1987)。血管闭合(obliteration)的后果是右心衰竭和高死亡率(Jeffery等,2002;Voelkel等,1997)。在约70%的患有可遗传形式的PAH(hPAH)的患者中已鉴定出编码骨形态发生蛋白(BMP)2型受体(BMPR2)(一种针对转化生长因子(TGF)-β超家族的受体)的基因中的种系突变(Morrell等,2001)。而且，在缺乏此基因中突变的情况下，PAH病例中BMPR2表达也显著降低(先天性PAH，iPAH)，表明此受体途径在PAH形成中的更广泛的作用。在肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中，BMPR2中的突变与对BMP和TGF-β的异常生长应答有关。在内皮细胞中，这些突变增加了细胞对凋亡的易感性(PAEC)(Morrell等,2001)。在一些家族中和大多数iPAH病例中不存在BMPR2突变表明，仍然需要鉴定出另外的、可能与TGF-β超家族有关的病理学机制。 

对于所有PAH形式来说共同的一个主要的组织病理学特征是表达平滑肌特异性α-肌动蛋白(SMA)的细胞在周围肺动脉中的积累。这包括SMA阳性细胞在新内膜(neointima)中的出现和SMA阳性细胞到正常没有平滑肌的前毛细管肺微动脉中的扩张(Mandegar等,2004)。负责PA的该远端部分的肌肉化(muscularization)的细胞过程尚不清楚，但这些观察表明PASMC在PAH形成中的重要作用。 

MicroRNA(miRNA)是一类小的内源性非编码RNA，其能够通过靶向特定的信使RNA(mRNA)并诱导它们的降解或翻译抑制来负性调节基因表达(Ambros,2004;Bartel,2009)。最近的研究已将mRNA降解定义为 miRNA:mRNA靶物的主要机制性作用(Guo等,2010)。数项最近的研究评估了miRNA在血管炎症中以及血管病理形成中的直接作用(Kartha和Subramanian,2010;Urbich等,2008)。在一项最近的研究中，显示miR-145在血管壁中丰富表达(Cheng等,2009)。MiR-145被转录为编码人5号染色体上(Lio等,2010)和小鼠18号染色体上的miR-143和miR-145两者的长初始miRNA(pri-miRNA)，其受到保守SRF结合位点的调节(Xin等,2009)。miR-145到血管壁的定位显示在平滑肌层中相比于外膜(adventitial)成纤维细胞和内皮细胞的高表达(Cheng等,2009)。因此，miR-145被视为一种平滑肌细胞表型标志物和调控物，它能够经由它的靶基因KLF-5及其下游信号分子心肌蛋白(myocardin)调节平滑肌细胞(SMC)成熟和增殖，以及血管新内膜损伤形成(Cheng等,2009;Elia等,2009)。已显示TGF-β超家族中的激动剂经由Smad依赖性途径激活miR-143/145簇(Davis-Dusenbery等,2011;Long等,2011)。而且，对miR-145、miR-143和miR-143/145敲除(ko,-/-)小鼠的分析显示主动脉和其它周围动脉的明显更薄的平滑肌层，这是由于肌动蛋白丝的破坏诱导降低的SMC大小(Elia等,2009)。这导致miR-145-/-小鼠中应答损伤产生中度系统性低血压和缺乏新内膜形成(Xin等,2009)。而且，从单ko和双ko动物分离的血管平滑肌细胞(VSMC)显示高增殖活性和更高的向源自血小板的生长因子(PDGF，VSMC的一种已知的化学引诱剂)迁移的能力(Elia等,2009;Xin等,2009)。此外，对miR-143(145)ko小鼠血管系统的药理学分析揭示了对血管加压(vasopressive)刺激的减弱应答(Elia等,2009;Xin等,2009)。总之，这些发现显示VSMC在miR-145ko和miR-143/145双ko小鼠中的去分化表型。 

尽管对基础遗传学的理解有所改善，但PAH仍然是一种严重且经常致命的疾病。小肺动脉的广泛重塑，包括肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖，表征其病理学。目前对PAH的治疗无法适当处理PAH病理学根本性的平滑肌增殖。如此，本领域中需要开发出对PAH的新疗法。据报告在血管重塑中起作用的microRNA代表了一种在开发针对PAH的有效治疗中的潜在的新治疗靶物。 

发明概述 

本发明部分基于以下发现，即miR-145在PAH的小鼠模型中调节异常而在患有PAH的特发性和可遗传形式的人的肺组织中上调。在发育中敲除动物 中消除miR-145表达赋予免于PAH形成的保护。因此，本发明提供一种在有此需要的受试者中治疗或预防PAH的方法，即对该受试者施用miR-145表达或功能的抑制剂。 

在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用包含与miR-145序列(例如初始miR-145、前体miR-145或成熟miR-145)至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与人成熟miR-145序列至少部分互补的序列。反义寡核苷酸可含有一个或多个主链或糖修饰，如硫代磷酸酯连接、2’-O-烃基修饰和双环糖核苷修饰(例如，锁定核酸(LNA))。在一些实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸抑制剂的长度为约8至约18个核苷酸。在具体的实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸抑制剂的长度范围为约12至约16个核苷酸或长度为约10至约14个核苷酸。 

在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸是antimiR。AntimiR是靶向并抑制miR-145的反义寡核苷酸。AntimiR可以是LNA antimiR。在一个实施方案中，antimiR靶向成熟miR-145的碱基2-17。在另一个实施方案中，antimiR长度为16个核苷酸。在又一个实施方案中，antimiR是全部硫代磷酸化的(thiophosphate)。AntimiR可以是全部硫代磷酸化的并与miR-145的5’区完全互补。AntimiR还可以合成为LNA和DNA的混合物。 

在本发明的另一个实施方案中，将miR-145抑制剂施用给诊断为或有风险形成肺高血压或肺动脉高血压(PAH)的受试者。受试者可能诊断为或有风险形成的肺高血压的形式包括但不限于，特发性PAH、遗传性或家族性PAH、和继发性肺高血压(例如起因于肺栓塞、肺气肿、肺纤维化和先天心脏病的高血压)。在一个实施方案中，受试者被诊断为患有特发性PAH或遗传性PAH。在一些实施方案中，有形成PAH风险的受试者在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。在一个具体的实施方案中，受试者是人。 

可以经由各种路径将miR-145抑制剂施用给受试者，包括静脉内、动脉内、鼻、口腔，或经由肺部路径(例如通过经由鼻或口吸入)。在某些实施方案中，通过吸入路径经由肺部投递装置施用miR-145抑制剂。在这类实施方案中，miR-145抑制剂可配制为干粉末或液体气雾剂。 

本发明还包括用于治疗或预防肺动脉高血压的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含如本文中描述的miR-145的抑制剂和施用装置。施用装置可设计为用于肺部投递，如吸入器、喷雾器(nebulizer)、吹入器(insufflator)、 点滴器(dropper)和气雾器(aerosolizer)。在其它实施方案中，施用装置可设计为用于静脉内或动脉内投递，如导管。任选地，miR-145抑制剂可配制为存放在施用装置中。试剂盒还可包含用于对受试者(例如人)施用miR-145抑制剂以治疗或预防PAH的用法说明书。 

附图简述 

图1.MiR145探针对SMC的共定位。处理正常人肺切片用于miR145和SMA染色，如实施例中详述的。(A)miR145探针和SM肌动蛋白，(B)对照探针和SM肌动蛋白。10倍放大。(C)在正常人的肺和来自患有iPAH和fPAH的患者的肺中的分析。 

图2.MiR-145在小鼠肺切片中的定位和在含氧量正常对缺氧小鼠中的表达。(A)显示miR-145在小鼠肺中定位的原位杂交。将石蜡切片再水合并与抗miR-145或作为阴性对照的混杂探针温育。对于共定位，在相同样品中使用免疫组化测定法检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像放大100或400倍=50μm。对含氧量正常和14天缺氧的野生型小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)10周龄小鼠的(B)整个肺或(C)右心室提取总RNA。分析6只小鼠/组。一式三份地测试每份样品。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用不配对t检验分析数据(***p<0.001相对对照样品)。 

图3.含氧量正常相对于缺氧小鼠中的MiR-143。对含氧量正常和14天缺氧的wt小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)10周龄小鼠的(A)整个肺或(B)右心室提取总RNA。分析6只小鼠/组。一式三份地测试每份样品。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用不配对t检验分析数据(*p<0.05,***p<0.001相对含氧量正常样品)。 

图4.在缺氧wt小鼠的脑、肾和脾中的MiR-145表达。(A、B、C分别)为来自含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)小鼠。从每种器官中一式四份地提取总RNA并通过q-PCR分析。使用t检验分析数据但未鉴定出显著性。 

图5.体外暴露于5%缺氧的SMC中的MiR-145表达。将原代远端肺动脉平滑肌细胞暴露于(A)24h或(B)72h，体外5%缺氧，并评估在有和无抑制剂SB203580(p38抑制剂-5μM)；SB431542(TGF-β抑制剂-1μM)；U0126(ERK 抑制剂-1μM)存在下miR145在24的水平。 

图6.对在miR-145-/-小鼠相比于wt小鼠中的miR-145表达的分析。ko小鼠中的miR-145消除由(A)q-PCR和(B)原位分析确认。图像均100倍放大，比例尺=100μm。 

图7.野生型和miR-145-/-小鼠中应答缺氧的MiR-143表达。对含氧量正常和14天缺氧野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(黑色条)或缺氧(条纹条)10周龄小鼠提取总RNA。分析6只小鼠/组。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(***p<0.001相对对照样品)。 

图8.miR-145消除对小鼠中PAH形成和血管重塑的影响。评估(A)右心室收缩压(sRVP,n=9-10)和(B)右心室肥大(RVH,n=9-10)。(C)用Elastic-Van Gieson染色的代表性肺动脉。图像均400倍放大，比例尺=50μm。(D)来自含氧量正常和缺氧野生型(WT)和miR-145-/-小鼠(n=5)的肺动脉重塑。使小鼠经受缺氧达14天。N，小鼠数。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05相对WT含氧量正常小鼠)。 

图9.在含氧量正常或缺氧条件下的野生型和miR-145-/-小鼠中对(A)全身动脉压(systemic arterial pressure，SAP,n=6-9)和(B)心率(HR,n=6-10)的评估。使小鼠经受缺氧达14天。N，小鼠数。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001相对野生型含氧量正常小鼠)。 

图10.对miR-145选定靶物的分析。通过q-PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的整个肺中评估(A)SMAD5，(B)SMAD4，(C)KLF4和(D)KLF5的表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,***p<0.001)。 

图11.对WT和miR-145-/-缺氧雌性小鼠中KLF4和KLF5蛋白表达水平的分析。(A、D)通过western印迹在暴露于长期缺氧达14天的WT和miR-145-/-小鼠的整个肺中评估KLF4和KLF5的表达水平。分析4只小鼠/组，并使用特定软件(Scion Image software)测量western印迹条带的强度。所得定量条示意在(B)、(C)、(E)和(F)的图中。将结果标准化至GAPDH值并表达为倍数增加，其中将任意值1分配给WT组。使用不配对t检验来分析数据(**p<0.005相比于wt小鼠)。 

图12.微阵列数据的验证。通过q-PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的肺动脉中评估(A)WIF1,(B)TGFB2,(C)FRZB,(D)DAB2,(E)ACE,(F)FSCN1,(G)CTGF,(H)Angptl4,(I)AP2B1和(J)ITGBL1I的表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,***p<0.001)。 

图13.在注射miRNA特异性的antimiR之后获得的对miR-145或miR-143的选择性敲低。将8周龄雌性小鼠用与成熟miR-143或miR-145序列之一的5’区完全互补的antimiR皮下注射，并接受长期缺氧达14天。它们在缺氧8天后接受第二次注射。14天后，将小鼠杀死并从肺提取总RNA。含氧量正常的用媒介处理的动物，缺氧的用媒介处理的动物，和用混杂、miR-145或miR-143antimiR注射的缺氧动物中的(A)miR-145和(B)miR-143表达。(C)-(F)通过q-PCR对相同RNA的Northern印迹分析，其显示(C)-(D)miR-145或(E)-(F)miR-143表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,***p<0.001.miR-145和miR-143下调对所有其他组均是统计学显著的)。 

图14.MiR-145或miR-143敲低对小鼠中PAH形成和血管重塑的影响。在用特异于miR-145或miR-143的antimiR、混杂的antimiR或媒介处理并暴露于长期缺氧达14天的C57Bl6小鼠中评估(A)右心室收缩压(sRVP,n=6–10)、(B)右心室肥大(RVH n=7-13)。(C)在相同组(n=4)中测量的肺动脉重塑。n=小鼠数。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001)。(D)用Elastic-Van Gieson染色的代表性肺动脉。图像均40倍放大，比例尺=20μm。 

图15.在用媒介处理的含氧量正常小鼠和用媒介、混杂的、miR-145或miR-143antiMir注射的缺氧小鼠中评估(A)全身动脉压(SAP,n=6–8)和(B)心率(HR,n=7-13)。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据。 

图16.对iPAH和hPAH人肺中miR-145表达水平的评估。(A)对从iPAH(n=6)、hPAH(n=5)和对照患者(n=6)的石蜡包埋的人肺提取的RNA的q-PCR分析，其显示miR-145的表达水平。将所有样品均标准化至Rnu-48值并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05,**p<0.005)。(B)对从用于q-PCR分 析的相同样品获得的石蜡切片中miR-145表达的原位分析。将混杂探针用作阴性对照。对于共定位，在相同样品中使用在连续切片上的免疫组化检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像显示在典型复杂损伤和新肌肉化的微动脉中α肌动蛋白和miR-145的增加的表达。图像均400倍放大，比例尺=50μm。(C)在hPAH患者的新内膜损伤中的miR-145下调。对于共定位，通过免疫组化检测α肌动蛋白表达。 

图17.对人BMPR2突变的PASMC的分析。(A)对PASMC中miR-145表达的qPCR分析。从具有BMPR2基因中突变的hPAH患者的PASMC提取总RNA。使用原代细胞的第4代传代。对于前体miR-145和成熟miR-145表达，相比于不受影响的对照分析cDNA。将结果标准化至(A)GAPDH(对于前体miR-145)和(B)Rnu-48(对于成熟miR-145)，并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用不配对t检验来分析数据(**p<0.005,***p<0.001相对对照样品)。(C)将从野生型和BMPR2突变的细胞提取的相同总RNA还用于northern印迹分析以确认q-PCR结果。印迹定量用Scion Image软件实施：建立感兴趣的miRNA的条带强度并标准化至相应的U6信号(D).使用不配对t检验来分析数据(***p<0.001相对对照样品)。 

图18.在经由siRNA下调BMPR2表达的人PASMC中的miR-143和miR-145上调。将原代人PASMC用能靶向并特异性抑制BMPR2表达的siRNA或用作为阴性对照的si混杂(siScramble)转染。在72h后，从这些样品和用于比较的未经处理细胞提取总RNA。BMPR2下调的效率由(A)TaqMan Real-Time PCR评估。在相同样品中还评估(B)miR-143和(C)miR-145表达。将结果标准化至GAPDH(对于BMPR2)和Rnu-48(对于miR-143和miR-145)，并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据。**p<0.005,***p<0.001相比于CTR或si混杂组，如指示的。 

图19.wt和BMPR2BMPR2R899X小鼠中的miR-145表达。从4只wt或BMPR2突变小鼠的整个肺中提取RNA，并评估miR-145表达，所述评估通过(A)q-PCR，其中一式三份地分析每份样品，将结果标准化至U6并表达为相对倍数变化，其中将任意值1分配给对照组(***p<0.001相对对照样品)；和(B)-(C)通过northern印迹。(D)显示miR-145在相同小鼠的肺中定位的原位杂交。将石蜡切片再水合并与抗miR-145或作为阴性对照的混杂探针温育。 对于共定位，在相同样品中使用免疫组化测定法检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像200倍放大，比例尺=50μm。 

发明详述 

本发明部分基于以下令人惊讶的发现，即miR-145表达和功能在肺动脉高血压(PAH)的形成中起着关键作用。发明人显示，miR-145在应答长期缺氧的小鼠中显著上调，且对miR-145的遗传或药学抑制对小鼠中PAH形成是保护性的。在人组织中，发明人报告了从具有BMPR2基因中突变的PAH患者获得的肺组织和分离的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中前体和成熟miR-145形式相比于对照升高。如此，本发明提供将miR-145作为对PAH治疗干预的新靶物。 

在一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗或预防肺高血压，特别是PAH的方法，包括对受试者施用miR-145表达和/或活性的抑制剂。当肺中的肺动脉变得拥挤、阻塞或受损从而导致动脉压升高时发生肺高血压。右心室增强的工作负载导致心肌劳损并且能导致心力衰竭。PAH的症状包括但不限于，呼吸短促(开始时在运动时出现，最后在休息时也出现)、疲劳、头晕或晕眩(fainting spell)、胸部压迫或疼痛、下肢(踝和腿)和腹部中的肿胀、皮肤和唇带蓝色、以及快速脉搏或心悸。优选地，在患有PAH的受试者中施用miR-145抑制剂后，相比于未接受治疗的受试者，前述症状的一种或多种得到改善或消除，或者PAH的形成延迟。在一些实施方案中，受试者中的右心室收缩压在施用miR-145抑制剂后降低。 

可用本发明的方法治疗的肺高血压的形式包括但不限于，特发性PAH、遗传性或家族性PAH、和继发性肺高血压(例如起因于肺栓塞、肺气肿、肺纤维化和先天心脏病的高血压)。PAH的家族性或遗传性形式与某些基因中的突变相关。例如，70%的具有可遗传形式PAH的患者在编码骨形态发生蛋白(BMP)2型受体(BMPR2)的基因中具有突变(Morrell等,2001)。如此，在一些实施方案中，要用本发明方法治疗的受试者有形成PAH的风险。在一个实施方案中，有风险的受试者(例如人)在编码BMPR2的基因中具有突变。 

如本文中使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如黑猩猩和其它猿和猴物种)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如犬和猫)、实验室动物(例如啮齿 动物如小鼠、大鼠和豚鼠)、以及鸟类(例如家禽、野生鸟类和猎鸟，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类(gallinaceous bird)、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。 

miR-145与miR-143一起位于鼠18号染色体和人5号染色体上基因间区内的簇中。MiR-145和miR-143(彼此不具有同源性)共转录为单一转录本。miR-145的前体miRNA(pre-miRNA)序列被加工为成熟序列和星号(即次要(minor))序列。星号序列从茎环结构的另一臂加工。下面给出了小鼠和人miR-145的前体miRNA(例如茎环序列)、成熟序列和星号序列： 

人成熟miR-145(SEQ ID NO:1) 

5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’ 

人miR-145*(SEQ ID NO:2) 

5’-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’ 

人前体miR-145(SEQ ID NO:3) 

5’-CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGC UAAGAU 

GGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU-3’ 

小鼠成熟miR-145(SEQ ID NO:4) 

5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’ 

小鼠miR-145*(SEQ ID NO:5) 

5’-AUUCCUGGAAAUACUGUUCUUG-3’ 

小鼠前体miR-145(SEQ ID NO:6) 

5’-CUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUGGAUGCUAAGAUGG GGAUUCCU 

GGAAAUACUGUUCUUGAG-3’ 

上文序列可以是核糖核酸序列或脱氧核糖核酸序列或这两者的组合(即包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的核酸)。理解包含任一种本文所述序列的核酸对于DNA序列将会把尿苷碱基替换为胸苷碱基，而对于RNA序列将会把胸苷碱基替换为尿苷碱基。 

适于用在本发明方法中的miR-145表达或活性的抑制剂包括反义寡核苷酸、antagomir、合成性核酶或适体。在某些实施方案中，miR-145的抑制剂是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一个化学修饰(例如糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可包含一个或多个“构象受限的”或双环糖核苷修饰(BSN)，其对含有BSN的寡核苷酸与其互补性microRNA靶链之间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸”。锁定核酸(LNA)含有2’-O,4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块处于“锁定”构象中。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’,4’-C-桥联的2’脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。参见，例如美国专利No.6,403,566和Wang等(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,Vol.9:1147-1150，两者均通过全文提述并入本文。在再一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的具有结构C中显示的结构的核苷。靶向miR-145的反义寡核苷酸可含有BSN(LNA、CDNA等)或其它经修饰核苷酸、和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。在一些实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸包含LNA和DNA核苷酸的组合。 

或者，所述反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链而非糖-磷酸根主链。还涵盖其它经修饰的糖或对反义寡核苷酸的磷酸二酯修饰。例如，反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于，糖修饰如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基)、2’-氟和4’硫代修饰，以及主链修饰如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参见例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，其通过全文提述并入本文)。在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含全部为硫代磷酸酯连接的主链。在一个实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸在每个碱基上含有2’O-甲基糖修饰且通过硫代磷酸酯连接相连。反义寡核苷酸，特别是那些具有较短长度的(例如少于15个核苷酸)可包含一种或多种增强亲和力的修饰，如但不限于LNA、双环核苷、膦酰甲酸、2’O-烃基修饰等。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是在5’和3’两端均含有2’-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸的2’-O-甲氧基乙基“gapmer”，其在中间具有至少10个脱氧核糖核苷酸。这些“gapmer”能够触发RNA靶物的RNase H依赖性降解机制。反义寡核苷酸的其它增强稳定性和改进功效的修饰，如记载于美国专利No.6,838,283的那些(通过全文提述并入本文)，是本领域中已知的且适于用在本发明的方法中。例如，为了协助体内投递和稳定性，反义寡核苷酸可在其3’端与类固醇如胆固醇模块、维生素、脂肪酸、糖或糖苷、肽或其他小分子配体连接。 

可用于抑制miRNA活性的优选的反义寡核苷酸的长度为约5至约25个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约20至约25个核苷酸。在某些实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸、长度为约12至约16个核苷酸、长度为约10至约14个核苷酸、或长度为约11至约15个核苷酸。可以使用任何与miR-145互补的8聚体或更长聚体。 

例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3’的序列(SEQ ID NO:7)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-CCUGGGAAAACUGGAC-3’的序列(SEQ ID NO:8)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-UGGGAAAACUGGAC-3’的序列(SEQ ID NO:9)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-GGAAAACUGGAC-3’的序列(SEQ ID NO:10)。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-AAAACUGGAC-3’的序列(SEQ ID NO:11)。在再一个实施方案中，反义寡核苷酸具有5’-AACUGGAC-3’的序列(SEQ  ID NO:12)。反义寡核苷酸可包含与成熟或次要(即星号)miR-145序列至少部分互补的序列，例如与成熟或次要(即星号)miR-145序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)至少约75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可与成熟或次要miR-145序列基本互补，即与靶多核苷酸序列至少约90%,95%,96%,97%,98%或99%互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与成熟或次要miR-145序列100%互补的序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少部分互补。在其它实施方案中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少部分互补。 

反义可以是antimiR，一种与miR部分或完全互补的反义寡核苷酸。antimiR可以与miRNA的5’端互补并穿过miRNA的完全互补序列前行，如包含或具有SEQ ID NO:7-12的序列。AntimiR可包含与成熟或次要(即星号)miR-145序列至少部分互补的序列，例如与成熟或次要(即星号)miR-145序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)至少约75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%互补的序列。在一些实施方案中，antimiR可与成熟或次要miR-145序列基本互补，即与靶多核苷酸序列至少约90%,95%,96%,97%,98%或99%互补。在一个实施方案中，antimiR包含与成熟或次要miR-145序列100%互补的序列。在某些实施方案中，antimiR与SEQ ID NO:1至少部分互补。在其它实施方案中，antimiR与SEQ ID NO:2至少部分互补。 

antimiR的可以是长度为约5至约25个核苷酸、长度为约10至约30个核苷酸、或长度为约20至约25个核苷酸。在某些实施方案中，靶向miR-145的antimiR是长度为约8至约18个核苷酸、长度为约12至约16个核苷酸、长度为约10至约14个核苷酸、或长度为约11至约15个核苷酸。在一个实施方案中，antimiR是长度为约16个核苷酸。AntimiR可以是全部、部分或未硫代磷酸化的。在一个实施方案中，antimiR是LNA antimiR。在一个实施方案中，antimiR靶向成熟miR-145的碱基2-17。例如，antimiR可具有5’-UCCUGGGAAAACUGGA-3’的序列(SEQ ID NO:13)。在一个实施方案中，antimiR具有SEQ ID NO:13的序列且是完全硫代磷酸化的。在又一个实施方案中，具有SEQ ID NO:13序列的antimiR是LNA antimiR。具有SEQ IDNO:13序列的antimiR可以是LNA和DNA的混合物。在再一个实施方案中，具有SEQ ID NO:13序列的antimiR是全部硫代磷酸化的LNA antimiR。 

在一些实施方案中，反义寡核苷酸是antagomir。“Antagomir”是单链的、 经化学修饰的核糖核苷酸，其与miR-145序列至少部分互补。Antagomir可包含一个或多个经修饰的核苷酸，如2’-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，antagomir仅包含经修饰的核苷酸。Antagomir还可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，产生部分或全部硫代磷酸酯主链。为了协助体内投递和稳定性，antagomir可在其3’端与胆固醇或其他模块连接。适于抑制miR-145的antagomir可以是长度为约15至约50个核苷酸、长度为约18至约30个核苷酸、长度为约20至约25个核苷酸、或长度为约10至约14个核苷酸。Antagomir可与成熟或次要miR-145序列至少约75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%互补。在一些实施方案中，antagomir可与成熟或次要miR-145序列基本互补，即与靶多核苷酸序列至少约95%,96%,97%,98%或99%互补。在其它实施方案中，antagomir与成熟或次要miR-145序列100%互补。 

优选地，本文中描述的抑制性核苷酸分子靶向miR-145的成熟序列(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中，本文中描述的抑制性核苷酸分子靶向miR-145的次要(即星号)序列(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，miR-145的抑制剂是包含与成熟或次要miR-145序列完全互补的序列的antagomir。在一个实施方案中，miR-145的抑制剂是具有与SEQ ID NO:1部分或完全互补的序列的antagomir。在另一个实施方案中，miR-145的抑制剂是具有与SEQ ID NO:2部分或完全互补的序列的antagomir。在一些实施方案中，miR-145的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，miR-145的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1基本互补的序列。在另一个实施方案中，miR-145的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO:2基本互补的序列。如本文中使用的，“基本互补的”指与靶多核苷酸序列(例如成熟的、次要的、或前体miRNA序列)至少约95%,96%,97%,98%,99%或100%互补的序列。 

反义寡核苷酸或antagomir可以包含与miR-145的前体miRNA序列(pre-miRNA)或初始miRNA序列(pri-miRNA)基本互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含与位于前体miR-145序列的茎环区以外的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，miR-145功能的抑制剂是具有与前体miR-145序列(SEQ ID NO:3)基本互补的序列的反义寡核苷酸。 

可以将本文中描述的任何miR-145的抑制剂投递到靶细胞(例如平滑肌细胞)，即向细胞投递编码miR-145抑制剂的表达载体。“载体”是能用于向 细胞内部投递感兴趣核酸的物质的组合物。大量载体是本领域已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物关联的多核苷酸、质粒和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体等。表达构建体可在活细胞中复制，或者其可以合成制备。就本申请目的而言，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可交换使用以在一般的例示性意义上展现本发明的应用，且不意图限制本发明。 

在一个实施方案中，用于表达miR-145抑制剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中表达的反义寡核苷酸序列与miR-145的成熟或次要序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)部分或完全互补。如本文中使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意指启动子相对于多核苷酸处于正确位置和取向以调控通过RNA聚合酶的转录启动和该多核苷酸的表达。 

如本文中使用的，“启动子”指启动基因的特定转录所需的由细胞合成体系或导入的合成体系识别的DNA序列。合适的启动子包括但不限于，RNA pol I、pol II、pol III和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)即早期(immediate early)基因启动子、SV40早期启动子、和Rous肉瘤病毒长末端重复)。在一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。特别感兴趣的是血管特异性启动子，且更具体地，是平滑肌特异性启动子，如alpha平滑肌肌动蛋白启动子。其它合适的启动子包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等(1994)Cardioscience,Vol.5(4):235-43;Kelly等(1995)J.Cell Biol.,Vol.129(2):383-396)、alpha肌动蛋白启动子(Moss等(1996)Biol.Chem.,Vol.271(49):31688-31694)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等(1996)Genomics,Vol.35(1):11-23)；Na+/Ca2+交换蛋白启动子(Barnes等(1997)J.Biol.Chem.,Vol.272(17):11510-11517)、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)启动子(Kimura等(1997)Dev.Growth Differ.,Vol.39(3):257-265)、alpha7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer(1996)J.Bio.Chem.,Vol.271(37):22915-22)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide)启动子(LaPointe等(1996)Hypertension,Vol.27(3Pt2):715-22)和alpha B-晶体蛋白/小热激蛋白启动子(Gopal-Srivastava(1995)J.Mol.Cell.Biol.,Vol.15(12):7081-7090)、alpha肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86(10):3504-3508)和ANF启动子(LaPointe等(1988)J.Biol.Chem.,Vol. 263(19):9075-9078)。 

在某些实施方案中，与编码miR-145抑制剂的多核苷酸可操作连接的启动子可以是可诱导启动子。可诱导启动子是本领域中已知的且包括但不限于，四环素启动子、金属硫蛋白IIA启动子、热激启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸应答元件、腺病毒后期启动子、和可诱导的小鼠哺乳动物肿瘤病毒LTR。 

向细胞投递表达构建体和核酸的方法是本领域中已知的，且包括例如磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、DEAE-葡聚糖、脂转染、采用多胺转染试剂的转染、细胞超声处理、使用高速微发射体的基因轰击、和受体介导的转染。 

本发明还包括用于治疗后净化或清除miR-145抑制剂的方法。该方法可包括在肺组织中过表达针对miR-145抑制剂的结合位点。优选地，结合位点区含有miR-145的种子区序列。该种子区是miRNA跨越碱基2-8的5’部分，其对于靶物识别是重要的。在一些实施方案中，结合位点可含有来自miR-145的一种或多种靶物，如KLF4、KLF-5、Srgap1和Srgap2，的3’UTR的序列。 

本发明还包括包含miR-145的抑制剂的药物组合物。当涵盖临床应用时，会以适于意图施用的形式制备药物组合物。一般地，这将需要制备基本没有致热原以及其它可能对人或动物有害的杂质的组合物。 

在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效剂量的miR-145抑制剂和药学可接受载体。例如，药物组合物包含有效剂量的如本文中描述的靶向miR-145的经修饰的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，药物组合物包含经修饰的反义寡核苷酸，其具有选自下组的序列：SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的合成的反义寡核苷酸，如具有SEQ ID NO:13的序列的antimiR。在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的具有全部硫代磷酸化的SEQ ID NO:13的antimiR。在再一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的具有SEQ ID NO:13的LNA antimiR，其中antimiR全部硫代磷酸化。 

“有效剂量”是足以产生有益或期望的临床结果的量。本发明miRNA抑制剂的有效剂量可以从约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg或约5mg/kg至约25mg/kg。对会视为有效剂量的剂量的准确确定 可基于每位患者的个体因素，包括其个头(size)、年龄、肺动脉高血压的类型和严重程度、和抑制剂的性质(例如antagomir、表达构建体、反义寡核苷酸等)。因此，本领域普通技术人员能容易地从本公开和本领域中知识确定剂量。 

胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统包括水包油乳液、微团、混合的微团和脂质体，可用作miR-145功能的寡核苷酸抑制剂或表达特定miRNA抑制剂的构建体的投递媒介。在某些实施方案中，配制miR-145抑制剂用于肺投递。如本文中使用的，“肺投递”或“呼吸投递”指通过经由口或鼻吸入并进入肺中来对受试者投递miR-145抑制剂。例如，miR-145抑制剂可配制为吸嗅物(snuff)、气雾剂、用于喷雾器的溶液、或用于吹入的微细粉(microfine powder)。在其中将miR-145抑制剂配制为干粉末的实施方案中，活性化合物的颗粒适宜地具有低于50微米，优选地低于10微米，如介于1和5微米之间或介于2和5微米之间的直径。 

一般会期望采用合适的盐和缓冲剂以使得投递媒介稳定并允许其被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的投递媒介，所述媒介包含溶解或分散在药学可接受的载体或水性介质中的抑制剂多核苷酸(例如脂质体或其他复合物或表达载体)。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在施用给动物或人时不产生不利的、变应的或其他不当反应的分子实体和组合物。如本文中使用的，“药学可接受的载体”包括溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂以及类似的可接受用于配制药物如适于对人施用的药物的试剂。将这类介质和试剂用于药学活性物质是本领域中公知的。除非是任何常规介质或试剂与本发明活性成分不相容的情况，否则均涵盖其在治疗组合物中的使用。还可以将辅助活性成分纳入组合物中，只要它们不使组合物的载体或多核苷酸失活。 

本发明的活性组合物可包括经典药物制备物。依照本发明的这些组合物的施用可经由任何常见路径，只要经由该路径可到达靶组织。这包括口服、经鼻或含服。或者，施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内或静脉内注射进行。在某些实施方案中，包含miR-145抑制剂的药物组合物通过吸入施用。包含miRNA抑制剂或含miRNA抑制剂的表达构建体的药物组合物还可通过导管(catheter)系统或分离冠状/肺循环的系统施用以向心和肺投递治疗剂。用于向心和冠状血管系统投递治疗剂的各种导管系统是本领域中已 知的。适用于本发明的基于导管的投递方法或冠状分离方法的一些非限制性例子公开在美国专利No.6,416,510；美国专利No.6,716,196；美国专利No.6,953,466、WO2005/082440、WO2006/089340、美国专利公开No.2007/0203445、美国专利公开No.2006/0148742和美国专利公开No.2007/0060907中，其均通过全文提述并入本文。这类组合物通常会作为如本文中描述的药学可接受的组合物施用。 

活性化合物还可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，活性化合物作为游离根或药理学可接受盐的溶液可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适宜混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备分散物。在普通的存储和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以阻止微生物生长。 

适于注射使用、导管投递或吸入投递的药物形式包括，例如无菌水溶液或分散物、和用于临时制备无菌可注射溶液或分散物(例如气雾剂、喷雾器溶液)的无菌粉末。一般地，这些制备物是无菌的，且流动性达到可容易注射或气雾化(aerosolization)/喷雾化(nebulization)的程度。制备物在制备和存储条件下应是稳定的，且应当免于微生物如细菌和真菌的污染行为而保存。合适的溶剂或分散介质可含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适宜的流动性可例如通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散情况下维持要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如尼泊金类(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thimerosal等进行对微生物作用的阻止。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶进行。 

可通过将活性化合物以适宜量与任何其他成分(例如如上文列举的)一起(如期望的)纳入溶剂中来制备无菌可注射溶液，接着进行过滤灭菌。一般地，通过将各种已灭菌的活性成分纳入含有基础分散介质和期望的其它成分(例如如上文列举的)的无菌媒介中来制备分散物。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冻干技术，该技术从先前其无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其它期望成分的粉末。在一些实施方案中，可将无菌粉末直接施用给受试者(即未在稀释剂中重构)，例如经由吹入器或吸入装置。 

本发明的组合物一般可以中性或盐形式配制。药学可接受的盐包括，例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)。与蛋白质的游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)等)衍生。 

在配制时，优选地，以与剂量配制相容的方式和治疗有效的量施用溶液。配制物可容易地以多种剂量形式如可注射溶液、药物释放胶囊、单位剂量吸入器等施用。对于水性溶液中的胃肠外施用，例如，溶液一般是适宜缓冲的且将液体稀释剂首先用例如充足的盐水或葡萄糖使其等渗。可将这类水性溶液例如用于静脉内、肌内、皮下、动脉内和腹膜内施用。优选地，如本领域普通技术人员已知的，特别是根据本公开来采用无菌水性介质。举例而言，单剂可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注液体或在提出的输注位点注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗的受试者的状况，必要地将在剂量中进行一些变更。负责施用的人无论如何会确定个体受试者的合适剂量。而且，对于人施用，制备物应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of Biological Standards)要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。 

在本发明的另一个实施方案中，miR-145的抑制剂与其他治疗药征(modality)(例如抑制PAH的其它药剂)一起组合使用。组合疗法的例子包括前述任一内容。使用包含两种药剂的单一组合物或药理学配制物，或同时使用两种不同的组合物或配制物(其中一种组合物包含miR-145抑制剂，而另一种包含其它药剂)可以实现组合。或者，使用miR-145抑制剂的疗法可在其它药剂施用的之前或之后，时间间隔从数分钟到数周。在其中对细胞分开应用其它药剂和miR-145抑制剂的实施方案中，一般会确保每次投递时间之间不会相隔相当长的时间，从而使得该药剂和miR-145抑制剂还会能够对细胞施加有利组合的影响。在这类情况下，通常用两种药征在彼此的约12-24小时内、在彼此的约6-12小时内、或在仅约12小时的延迟时间内接触细胞。然而，在一些情况下，可能期望将治疗的时间段显著延长，其中在分别的施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)时间流逝。 

在一个实施方案中，会期望超过一次施用miR-145抑制剂或其他药剂。 在此方面，可采用各种组合。举例而言，当miR-145抑制剂是“A”而另一种药剂是“B”时，提供以下基于3和4次总施用的排列作为例子：A/B/A,B/A/B,B/B/A,A/A/B,B/A/A,A/B/B,B/B/B/A,B/B/A/B,A/A/B/B,A/B/A/B,A/B/B/A,B/B/A/A,B/A/B/A,B/A/A/B,B/B/B/A,A/A/A/B,B/A/A/A,A/B/A/A,A/A/B/A,A/B/B/B,B/A/B/B,B/B/A/B。类似地涵盖其他组合。下文提供其他药剂和治疗的特定的例子。 

在本发明的一个实施方案中，在有此需要的受试者中抑制、预防或治疗PAH的方法包括对受试者施用miR-145抑制剂，如本文中描述的antimiR-145，和抑制、预防或治疗PAH的第二种药剂，以及一种或多种另外的药剂。在一个实施方案中，施用不同miR-145抑制剂的组合，如本文中描述的antimiR-145，和miR-145的小分子抑制剂。 

在一个实施方案中，另外或其他的药剂是miR-204的激动剂。人miR-204-5p序列为5’-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3’(SEQ ID NO:15)。人miR-204-3p序列为5’-GCUGGGAAGGCAAAGGGACGU-3’(SEQ ID NO:16)。miR-204的激动剂可以是包含成熟miR-204序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含miR-204的初始miRNA或前体miRNA序列的序列。包含成熟miR-204、前体miR-204或初始miR-204序列的多核苷酸可以是单链或双链的。在一个实施方案中，miR-204激动剂的可以是长度为约15至约50个核苷酸、长度为约18至约30个核苷酸、长度为约20至约25个核苷酸、或长度为约10至约14个核苷酸。miR-204激动剂与miR-204的成熟的、初始miRNA或前体miRNA序列可以至少约75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同。在一个实施方案中，miR-204激动剂具有SEQ ID NO:15或16的序列。作为多核苷酸的miR204激动剂可含有一个或多个化学修饰如锁定的核酸、肽核酸，糖修饰如2'-O-烃基(例如2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基)、2'-氟和4'硫代修饰，以及主链修饰，如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯连接。在一个实施方案中，包含miR-204序列的多核苷酸缀合于胆固醇。包含miR-204序列的多核苷酸可以在体内从载体表达和/或可操作地连接于启动子，如上文描述的。 

在另一个实施方案中，miR-204的激动剂可以是作用于增加、补充或替换miR-204功能的、与miR-204不同的药剂。例如，抑制PDGF、内皮缩血管肽-1、血管紧张素II和STAT3表达或活性的药剂可与miR-145抑制剂组合使用 来治疗、预防或防止PAH。所述药剂可以多肽、肽、小有机分子、编码感兴趣多肽的核酸等的形式投递。多肽可以是核酸的任何翻译产物，不考虑大小和糖基化。药剂还可以以简单药物、肽、肽片段、DNA、RNA、核酶或核酸与肽或肽片段的工程化杂合体、或每种的衍生物的形式。 

用于治疗、预防或防止PAH的组合还可包含miR-145抑制剂和血管扩张器(血管扩张药)，如但不限于epoprostenol。其它可与miR-145抑制剂一起使用的药剂包括但不限于，内皮缩血管肽受体拮抗剂，如波生坦(bosentan)、西他生坦(sitaxentan)和ambriesentan；磷酸二酯酶抑制剂，如磷酸二酯酶5型抑制剂、昔多芬(sildenafil)和tadalafil；钙通道阻断剂，如氨氯地平(amlodipine)、地尔硫卓(diltiazem)、和硝苯地平(nifedipine)；前列腺素，如treprostinil、伊洛前列素(iloprost)和贝前列素(beraprost)；硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)；和鸟苷酸环化酶激活剂，如cinaciguat和riociguat。 

还可以使用阻断或抑制凝血酶的抗凝血剂或化合物，如华法林(warfarin)和基于三肽基序D-Phe-Pro-Arg的化合物；例如LY287045等。许多化合物，如inogatran和melagatran，是本领域中已知的且也可以使用。对于非限制性例子，参见美国专利No.6,326,386;6,232,315;6,201,006;6,174,855;6,060,451;和5,985,833等。 

可与miR-145抑制剂一起使用的其它药剂包括血管紧张素转化酶抑制剂；烟碱受体激动剂；增加氮氧化物浓度的药剂、抗血管生成剂；TGF-β受体的激动剂；和死亡域(death domain)受体配体。 

可与miR-145抑制剂组合使用来治疗、预防或防止PAH的血管紧张素转化酶抑制剂(ACE-I)包括但不限于，卡托普利(captopril)、贝那普利(benazepril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(Ramipril)、咪达普利(imidapril)、培哚普利(perindopril)、特丁胺(erbumine)、和群多普利(trandolapril)。ACE受体阻断剂还可以替换ACE抑制剂或与ACE抑制剂一同使用，且这些包括但不限于，氯沙坦(losartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、坎地沙坦(candesartan)、cilexetil和缬沙坦(valsartan)。 

烟碱受体激动剂，例如烟碱(S-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶)和其它基本上特异性结合烟碱受体并提供药理学作用的化合物还可与miR-145抑制剂组合使用来治疗、预防或防止PAH。烟碱受体激动剂涵盖天然存在的化合物(包括 但不限于，小分子、多肽、肽等，如天然存在的植物生物碱)、内源性配体(例如从天然来源纯化、重组产生、或合成的，且还包括这类内源性配体的衍生物和变体)，和合成产生的化合物(例如小分子、肽等)。术语“烟碱”还包括任何药理学可接受的烟碱的衍生物或代谢物，其展现出类似于烟碱的药物治疗特性。这类衍生物、代谢物和代谢物的衍生物是本领域中已知的，且包括但无需限于，可替宁(cotinine)、norcotinine、降烟碱(nornicotine)、烟碱N-氧化物、可替宁N-氧化物、3-羟基可替宁和5-羟基可替宁或其药物可接受的盐。 

miR-145抑制剂还可与一种或多种增加一氧化氮的药剂一起使用来治疗、预防或防止PAH。一氧化氮促进剂的例子包括但不限于，S-亚硝基青霉胺(S-nitrosopenicillamine)、硝普钠(sodium nitroprusside)、N-乙基-2-(1-乙基-2-羟基-2-亚硝基肼基)乙胺(NOC12)等。一氧化氮的产生还可由细胞因子，如γ-干扰素、肿瘤坏死因子、IL-1、IL-2和内毒素调控，这是由于其对酶一氧化氮合酶上的作用所致。NO合酶的可诱导形式被细胞因子增加且构成性形式似乎被细胞因子降低。发现HMG-CoA还原酶抑制剂上调内皮细胞NOS活性，如由美国专利No.6,147,109,Liao等描述的。任何一氧化氮合酶的形式可以作为蛋白质或自其衍生的活性片段、或以用于表达的DNA构建体利用。 

具有抗血管生成作用的药剂还可与miR-145抑制剂组合使用来治疗、预防或防止PAH。这些包括但不限于抗血管生成的多肽：血管他丁(angiostatin)；内皮他丁(endostatin)；和抗血管生成的抗凝血酶III等，且进一步包括其功能活性变体和衍生物。其它抗血管生成剂包括基质金属蛋白酶的抑制剂，例如氨磷汀(amifostine)、WR-1065；马立马司他(marimastat)、primomastat、a-1抗胰蛋白酶；鞘氨醇等。 

还对TGF-β受体的激动剂具有兴趣。TGF-β受体I型和II型介导TGF-β的大多数活性。配体包括TGF-β和它的模拟物及生物学活性的衍生物。 

与miR-145抑制剂一起使用的感兴趣的其他药剂包括死亡域受体配体，其为结合哺乳动物细胞表面受体的化合物(通常是多肽化合物)，该受体包含死亡域或其同源物或直向同源物，其通过结合对细胞投递凋亡信号。由这些受体触发的细胞内蛋白质相互作用可归于死亡域的结合相互作用，所述死亡域与TNF-R1C末端附近的约80个氨基酸域同源，且负责信号传导细胞毒性。TNF受体死亡域家族包括TNF-R1、Fas(CD95)、TRAMP(wsI/Apo-3/DR-3)、TRAIL-R1(DR-4)和TRAIL-R2(DR-5、TRICK2、KILLER)。死亡域配体包括 通过结合特定的死亡域受体来调节细胞增殖和分化的蛋白质。这些配体包括TNF家族，例如TNF、淋巴毒素、CD30配体、4-1BB配体、CD40配体、CD27配体和TRAIL(TNF相关的诱导凋亡的配体)，及其同源物和类似物。 

雷帕霉素的类似物，其通常用作免疫抑制剂但最近发现还抑制血管平滑肌细胞增殖，如他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus)，也可以与miR-145抑制剂组合使用。将c-myc(一种对于细胞复制的进行关键性的蛋白质)反义敲低是另一种抑制动脉壁中细胞增殖的办法，且可与miR-145抑制剂组合使用。 

在一个实施方案中，还对抗血小板剂的共价或非共价附接物感兴趣，其包括GPIIb/IIIa抑制剂例如RheoPro，其可与miR-145抑制剂组合使用。治疗或疗法如氧疗法亦可与miR-145抑制剂的施用组合使用。 

本发明还包括用于治疗或预防肺动脉高血压的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含至少一种如本文中描述的miR-145抑制剂和施用装置。在某些实施方案中，施用装置是设计为经由鼻或口向肺投递miR-145抑制剂的装置。例如，用于肺部投递的合适的施用装置包括但不限于，点滴器、拭子、气雾器、吹入器、喷雾器、吸入器(例如基于气雾剂的计量剂量的吸入器)、干粉分散装置和其它肺部投递装置，包括手动激活的、气体推动的、声波驱动的等。在一些实施方案中，将miR-145抑制剂配制为包含在施用装置内的粉末。在其它实施方案中，将miR-145抑制剂配制为包含在施用装置内的液体气雾剂。在一个具体的实施方案中，施用装置是吸入器。在其中待静脉内或动脉内投递miR-145抑制剂的实施方案中，试剂盒可包含导管或其它类似的合适的施用装置。所述试剂盒还可包含用于对受试者施用有效剂量的miR-145抑制剂来治疗肺高血压的用法说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种另外的药剂或疗法，如上文描述的。 

通过以下另外的实施例来进一步例示本发明，其不应理解为限制性的。本领域技术人员根据本公开应领会到，可对公开的特定实施方案进行许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。 

实施例

实施例1.人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的原代培养 

如先前描述的从周围动脉外植PASMC(Yang等,2005)。平滑肌细胞系自 患有已知在BMPR2中携带突变的PAH的4名患者获得。这些包括：1名在BMPR2的激酶域具有突变的患者，其中在位置347的半胱氨酸被取代为精氨酸(C347R)；1名在BMPR2的细胞质尾部具有错义突变的患者，该突变导致在位置903的天冬酰胺替换为丝氨酸(N903S)；1名在氨基酸位置9具有截短突变(W9X)的患者和1名在氨基酸位置899具有截短突变(R899X)的患者。从未受影响的受试者获得3份另外的PASMC制备物。如先前描述的培养细胞(Yang等,2005)。 

实施例2.从冷冻的肺、PASMC提取RNA和逆转录 

使用miRNeasy试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)按照制造商说明书从组织和细胞获得总RNA，用DNA酶1(扩增级；Sigma,St.Louis,MO,USA)处理以消除基因组DNA污染并使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Nano-Drop Technologies,Wilmington,DE,USA)定量。使用茎环逆转录引物依照TaqMan MiRNA Assay方案(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)从总RNA合成用于miRNA分析的cDNA。每反应含有50ng提取的总RNA、50nM茎环状的RT引物、1×RT缓冲液、各0.25mM的dNTP、3.33U/ml Multiscribe逆转录酶和0.25U/ml RNA酶抑制剂。将15ml反应在96孔板中于16℃温育30分钟，于42℃温育30分钟，于85℃温育5分钟，并保持在4℃。使用SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen,Paisley,UK)从总RNA获得用于前体miRNA分析的总cDNA。每反应含有1mg的总RNA、1×SuperScript II缓冲液、10U/ml SuperScript II RT、0.15mg/ml随机六聚体引物(Invitrogen,Paisley,UK)、1U/mlRNA酶抑制剂(Promega,Madison,WI,USA)和各0.25mM的dNTP。循环条件如下：在25℃10分钟，在48℃30分钟，在95℃5分钟。cDNA存储于-20℃。由于GAPDH在所有体内组中的稳定性，选择其作为看家基因。 

实施例3.从石蜡包埋的人肺提取MiRNA 

依照LREC和HTA指南，从Papworth NHS Foundation Trust Hospital Tissue Bank获得福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块。使用来自知情同意患者的肺样品，所述患者在Papworth Hospital针对终末阶段肺高血压经历移植。从包括与突变BMPR2有关的hPAH(n=5)、iPAH(n=6)和对照(n=6)在内的一系列状况获得组织。对照包括取自以下患者的没有肿瘤的肺叶的组织，该患者针对 肺癌瘤进行全肺切除术且由病理学家报告无肿瘤。使用RecoverAll total RNA Isolation试剂盒(Ambion,Streetsville,Canada)从福尔马林固定的、石蜡包埋的FFPE样品提取总RNA(包括miRNA)。将3个10mm切片用二甲苯在50℃脱蜡3分钟，用乙醇清洗2次，并用蛋白酶在50℃消化15分钟，然后在80℃15分钟。将裂解物通过过滤筒并用DNA酶消化，然后将RNA在30ml无RNA酶水中洗脱并使用NanoDrop ND-1000分光光度计定量。 

实施例4.对成熟miRNA和mRNA的TaqMan q-PCR分析 

对于定量PCR(q-PCR)，将10ml反应在386孔光学板中在95℃温育10分钟，接着是40个95℃15秒和60℃1分钟的循环。将结果对于小鼠和人miRNA分别标准化至U6或Rnu-48值而对于前体miR-145表达标准化到GAPDH。使用2-D D Ct方法(1,2)获得每个miRNA表达的倍数变化。一式三份地对每份miRNA运行q-PCR并将结果呈现为样品的均值±标准误差。 

对于所有q-PCR实验，值表达为倍数变化或均值±标准偏差。如适宜的，所有数据均使用双因素ANOVA继之以Bonferroni事后检验，单因素ANOVA继之以Bonferroni事后检验或不配对t检验进行分析，如描述于图注。*p<0.05、**p<0.005、***p<0.001。 

实施例5.野生型(wt)和miR-145-/-肺动脉的微阵列分析 

从每组6只小鼠(10周龄时)切取主支肺动脉并在RNA分离前冻存于-80℃。通过

Spectrophotometer(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)估测RNA数量和品质。使用RNA6000Nano Kit(Santa Clara,CA)用Agilent2100生物分析仪评估RNA完整性。使用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒(Ambion)从500ng输入RNA来生成生物素化的、扩增的RNA用于与Illumina阵列(Applied biosystems Carlsbad,California)杂交。依照制造商方案杂交Illumina小鼠WG-6v2.0Expression beadchip，并用Illumina BeadArray Reader扫描和读入Illumina

软件(版本1.1.1)。对于微阵列数据分析和验证，从

软件导出经分位数标准化和减去背景的强度值用于在R中的数据处理和分析，其中实施排序乘积(rank product)统计学分析。在4组之间实施相邻比较。具有低于0.05的错误发现率的探针被视为显著的。在源自用于微阵列的24份样品的cDNA上，使用Taqman基因表达阵列 (Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行靶物验证(n=18每组)。 

实施例6.Northern印迹分析 

在15%TBE-尿素凝胶(Invitrogen,Paisley,UK)上分离总RNA，使用转印迹半干(trans-blot semi-dry)系统(Bio-Rad Laboratories,Hemel Hempstead,UK)转移至不带电荷的尼龙膜Hybond-NX(Amersham Bioscience UK Ltd,Buckingham,UK)，并UV交联。预杂交在55℃用杂交缓冲液(50%去离子化甲酰胺、5X SSPE、5X Denhardts溶液、0.1%SDS和2μg热变性的鲱鱼精DNA)进行30分钟。然后，加入用5’-洋地黄毒苷(DIG)标记(Exiqon,Denmark)的25pmol miR-145或U6miRCURY LNA^TMDetection探针在相同的预杂交温度过夜。杂交后，将膜在50℃用低严格性清洗溶液(invitrogen,Paisley,UK)清洗30分钟，接着用高严格性清洗溶液(invitrogen,Paisley,UK)清洗30分钟。然后，将膜在封闭溶液(马来酸中1%Blocking试剂)中封闭30分钟并与抗DIG抗体(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)以1:5000在室温温育30分钟。使用CDP Star Chemiluminescent Substrate(Sigma-Aldrich,Poole,UK)来检测膜上感兴趣的miRNA的存在。miRNA定量用Scion Image软件实施：建立感兴趣的miRNA的条带强度并标准化到相应的U6信号。 

实施例7.免疫组织化学 

将人和小鼠肺在40℃固定在4%多聚甲醛中达18小时并包埋在石蜡中。在用分级浓度的二甲苯和乙醇脱石蜡化后，将载玻片在室温浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中3%H2O230分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。然后，将它们与20%正常山羊血清温育30分钟以减少非特异性背景染色。接着，将切片与在PBS中1%(w/v)牛血清清蛋白(BSA)中的针对α-平滑肌肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Dako,Clone1A4,High Wycombe,UK)或同种型匹配的小鼠IgG非免疫性对照(Dako,High Wycombe,UK)温育。然后，将切片与在PBS中1%(w/v)BSA以1:200稀释的适宜生物素化的二抗(Dako,High Wycombe,UK)温育，接着与在PBS中1%(w/v)BSA以1:400稀释的辣根过氧化物酶标记的ExtravidinTM(Sigma,St.Louis,MO,USA)温育。使用3.3二氨基联苯胺使染色显色，并用迈尔(Mayer’s)苏木精将核复染色。 

实施例8.用于检测的miRNA定位的原位杂交 

对于小鼠和人肺中miR-145的检测，将切片用Histoclear和分级浓度的乙醇再水合。然后，将载玻片用10mM柠檬酸钠pH6.0煮沸10分钟，降温至室温(RT)，与10mg/ml蛋白酶K在37℃温育15分钟，并最终在室温固定于4%PFA中10分钟以允许抗原恢复。在抗原恢复后，将载玻片与杂交缓冲液(50%甲酰胺、4X SSC、2.5X Denhadrt’s溶液、2.5mg/ml鲑鱼DNA、0.6mg/ml酵母tRNA、0.025%SDS和0.1%封闭试剂)在60℃温育1小时，接着与相同缓冲液中用5’-DIG标记(Exiqon,Denmark)的混杂mercury LNA^TMDetection探针或40nM miR-145在60℃过夜温育。熔解温度分别为79℃和78℃。实施免疫检测，即将切片在PBS中1%封闭试剂和10%FCS中在RT封闭1小时，接着与1:1000稀释的抗DIG抗体(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)在4℃过夜温育。然后，将载玻片与0.1M Tris pH9.0温育5分钟。为了将miR-145染色，分别向每个人或小鼠切片添加BM紫溶液(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)或NBT/BCIP溶液(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)，并在室温留置3天。 

实施例9.SMA和miR145的共定位 

MicroRNA原位杂交在常规固定的石蜡包埋的6μm人肺切片上实施，如上文描述的。将载玻片用Histoclear脱石蜡化，并用10ug/ml蛋白酶K(Sigma)在37℃处理20分钟，然后用4%多聚甲醛固定10分钟。在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗后，将载玻片与杂交缓冲液在60度温育1小时。然后，将载玻片与40nM用DIG标记的miR145或混杂探针(Exiqon)在60℃过夜杂交。在清洗和封闭后，将载玻片与抗DIG_AP Fab片段(Roche)在封闭缓冲液中在4度过夜温育，并用PBST(PBS加0.1%Tween20)和0.1M Tris-HCL(pH9.5)清洗。在室温使用BM紫溶液(Roche)将miR-145可视化达1-2天直至染色在显微镜下可见。在用PBS清洗后，将载玻片用PBS中0.3%H2O2猝灭10分钟。为了封闭非特异性背景，将10%家兔正常血清应用于载玻片达1小时，然后将载玻片与单克隆抗人alpha平滑肌激动蛋白(DAKO)在10%正常血清中于4℃过夜温育。将载玻片使用3,3’-二氨基联苯胺作为色原体来可视化5分钟。可视化显示于图1。 

实施例10.消除miR-145表达保护小鼠中免于形成肺动脉高血压 

为了评估miR-145是否在肺组织中表达，在野生型(wt)小鼠的肺组织切片上实施原位杂交，如上文描述的。miR-145的阳性染色在小鼠肺中的血管和支气管的平滑肌层中观察到(图2A)。为了评估miR-145表达在对损伤应答期间是否改变，通过定量PCR在来自暴露于缺氧14天的wt小鼠的整个肺和右心室中评估miR-145表达，并将该表达与暴露于含氧量正常条件的小鼠相比较。分析揭示了肺和右心室两者中应答缺氧的miR-145的显著上调(分别于图2B、C)。miR-143水平也上调(图3)。对相同动物的脑、肾和脾中的miR-145表达的分析未揭示任何异常调节(图4)。如此，miR-145在小鼠肺中的平滑肌细胞中表达，且应答缺氧在肺中选择性上调。在分离的人远端肺动脉SMC中，未检测到暴露于缺氧24小时和72小时时miR-145中的变化，表明在多细胞血管区室中的体内复杂调节(图5)。 

接下来，评估遗传消除miR-145对PAH形成的影响。先前已描述过MiR-145敲除小鼠(Xin等(2009)Genes Dev.,Vol.23:2166-2178)。将纯合的miR-145-/-雌性小鼠或年龄匹配的野生型对照(株系C57BL6J/129SVEV，8周龄)暴露于长期缺氧达14天或维持在含氧量正常条件中，并在10周龄时评估。 

将8周龄miR-145敲除(miR-145-/-)小鼠和对照年龄匹配的同窝小鼠暴露于长期缺氧或维持在含氧量正常条件下达14天，并在10周龄时评估PAH的形成。对于所有实验，在异氟烷(isoflurane)(O₂中1.5%)麻醉下的小鼠中经由跨横膈膜进入右心室的针测量右心室收缩压(sRVP)。经由置于颈动脉中的插管记录全身动脉压(SAP)，如先前描述的(Keegan等,2001)。右心室肥大(RVH)确定为右心室壁(RV)重量对左心室加隔膜(LV+S)重量的比率。将肺切片用Elastic-Van Gieson(EVG)染剂染色并如先前描述的以盲测方式评估重塑血管百分比(Keegan等,2001)。如果动脉具有对血管横截面中至少一半直径可见的双弹性薄层(lamina)，那么其被视为肌肉化的。分析每组5只小鼠的重塑。评估来自每个肺切片的约150个动脉。 

研究中使用的敲除动物中miR-145表达的缺乏由定量PCR(q-PCR)和原位杂交确认(图6)。由于miR-145以其与miR-143成簇的初始miRNA形式转录，因此也在含氧量正常和缺氧条件下的野生型和敲除动物中分析miR-143表达以确保miR-143水平在miR-145的遗传消除和应答缺氧攻击之后在肺中基本未变化。对从野生型和miR-145-/-小鼠的整个肺中提取的RNA中miR-143表 达的Q-PCR分析显示，在野生型和miR-145-/-动物中应答缺氧无差异(图7)。如此，miR-145-/-中应答缺氧在PAH形成中的任何变化是特异于miR-145的选择性丧失的。 

接着，量化野生型和miR-145-/-小鼠中PAH的形成。在野生型小鼠中，观察到收缩RVP和RVH中的显著且预期的增加(图8A、B)。与之相对地，miR-145-/-动物展现出收缩RVP或RVH中无增加(图8A、B)。有意思的是，在野生型和miR-145-/-小鼠之间的基线收缩RVP或RVH中无差异(图8A、B)。测量如表1和2中记载： 

表1.WT和miR-145-/-小鼠中的心室重量. 

右心室(RV)重量，左心室加隔膜(LV+S)重量和RV/LV+S比。***P<0.001相对于WT含氧量正常小鼠;

相对于WT缺氧小鼠;数据表示为均值+SEM。n=9-10。 

表2.含氧量正常和缺氧的WT和miR-145-/-小鼠中的血液动力学 

含氧量正常和长期缺氧雌性WT和miR-145-/-小鼠中的右心室收缩压(sRVP)、全身动脉收缩压(SAP)和心率测量。***P<0.001相对于WT含氧量正常小鼠; 

相对于WT缺氧小鼠;数据表示为均值+SEM。n=6-10。 

组织学分析显示在暴露于缺氧后野生型动物的小肺动脉(PA)中肺血管重塑的存在，但这类重塑在从miR-145-/-动物收获的肺中减少，且此发现得到定量评分确认(图8C,D)。因此，miR-145的遗传消除保护小鼠应答缺氧时 免于形成PAH。 

如预期的，平均SAP在miR-145-/-小鼠中相比于对照降低，且与先前公开的工作一致(Elia等,2009;Xin等,2009)。野生型或miR-145-/-小鼠SAP均未被暴露于缺氧改变(图9A)且在暴露于缺氧的wt或miR-145-/-小鼠的心率(HR)中未观察到变化(图9B)。 

这一系列实验的结果显示，miR-145在取自经受含氧量正常或缺氧条件的小鼠的肺中平滑肌细胞区室中专一表达。在缺氧小鼠模型中，miR-145水平相比于对照升高，且miR-145的遗传消除阻止PAH的形成。对miR-145-/-小鼠血管系统的功能分析揭示降低的对缺氧的应答：当这些小鼠暴露于缺氧达2周时，收缩压未显示如野生型小鼠中的显著升高。对于右心室肥大获得类似的结果。另外，重塑血管的百分比在敲除动物中显著降低，强烈表明miR-145消除在PAH形成中的保护性作用。该作用在不存在miR-143的任何调制的情况下发生，由此确认了miR-145在PAH形成中的重要性。如此，这些发现表明miR-145可以是设计用于PAH治疗的可行的治疗靶物。 

实施例11.在miR-145-/-小鼠的肺中相比于对照对miR-145预测的靶物的分析 

为了验证miR-145消除对基因和蛋白质表达的影响，通过q-PCR在wt和miR-145ko动物的肺组织中分析数个miR-145基因靶物，该基因靶物已在文献中得到验证或使用TargetScan和PicTar预测算法鉴定并因其潜在牵涉于PAH而选择。它们包括KLF4和KLF5(Krueppel类因子4和5)(两者均牵涉于SMC增殖和分化)，和SMAD4和SMAD5(TGF-β超家族的信号传导中间物)。对RNA的分析揭示了SMAD4和SMAD5两者在miR-145-/-含氧量正常小鼠中相比于wt含氧量正常小鼠的显著上调(图10A、B)。KLF4在含氧量正常和缺氧miR-145-/-小鼠中均升高，而KLF5表达在wt缺氧相对于miR-145-/-缺氧小鼠中显著上调(图10C、D)。对在缺氧条件中的WT和KO动物中KLF4蛋白表达的Western印迹分析确认了该靶物的显著上调，而在含氧量正常中未观察到显著变化(图11)。与之相对，KLF5蛋白水平在含氧量正常和缺氧条件下的相同样品中没有显著上调(图11)。 

实施例12.对miR-145-/-小鼠PA中相比于WT动物的基因表达概貌的微阵列 分析 

用来自每个miR-145-/-缺氧、WT缺氧miR-145-/-含氧量正常和WT含氧量正常组的6份样品实施全局转录组分析。选择在miRWalk中的至少3个数据库中预测的具有3’UTR miRNA结合区且在miR-145-/-缺氧与WT缺氧比较中有显著错误发现率的潜在miR-145靶物用于进一步分析。使用Ingenuity途径分析软件和Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)来选择存在于与肺高血压相关的途径中的靶物。使用这些选择标准总共选择13个靶物用于通过实时PCR来验证(表3)。 

表3.选择用于验证的靶物的微阵列数据.

选择验证过的miR-145靶物FSCN1、DAB2和ACE用于进一步分析(Cheng等,2009;Boettger等,2009;Kano等,2010;Xu等,2009)。实时PCR验证了从微阵列选择的10个靶物(图12)。WT缺氧组显示对于7个靶物TGFB2、FRZB、ACE、CTGF、ANGPTL4、AP2B1和ITGBL1相对于所有其它组的显著升高的表达(图12)。另外，实时PCR数据反映了在微阵列中对WIF1、CAMK2A、TTN、ACE、DAB2和FSCN1观察到的组间变化(表3)，且显示这些变化是显著的(图12)。微阵列中观察到的变化未对TMOD1和APH1A验证(未显示)。将验证过的靶物分成5组：wnt信号传导的抑制剂(WIF1,FRZB,DAB2)、肌动蛋白细胞骨架的调节(FSCN,TTN)、转录调节(CAMK2A)、细胞粘着(ITGBL1,CTGF)和内皮功能(ACE,ANGPTL4)。来自阵列数据的进一步分析揭示在 

WNT信号传导途径的许多组分中的突出变化(表4)。 

表4:来自微阵列的作为wnt途径组分的重要靶物.

如此，利用在分离的肺动脉上的全转录组微阵列研究来量化对缺氧的转录应答。KLF4和5表达与miR-145调节相关，其中这两种靶物在缺氧miR-145敲除小鼠中均显著上调。来自WT缺氧对miR145-/-缺氧比较的3种验证过的靶物抑制规范wnt/β-catenin信号传导。WIF1和FRZB结合胞外空间中的Wnt蛋白并阻止配体-受体相互作用(Leyns等,1997;Hsieh等,1999;Jiang等,2009;Baldin等,1993;Baranwal等,2009)，而DAB2使磷酸化axin稳定并通过增加β-catenin的蛋白酶体降解来减弱Wnt/β-catenin信号传导(Jiang等,2009)。这些因素抑制wnt信号传导，导致降低的wnt靶基因如cyclin D1(CCND1)和E cadherin(CDH)的表达，这些基因在miR145-/-缺氧组中也发现下调(表2)。CDH和CCND1的下调能分别导致细胞骨架重建(reorganization)和降低的增殖(Baldin等,1993;Baranwal等,2009)。因此，对wnt/β-catenin信号传导的抑制 可能导致了在miR145-/-小鼠的缺氧中观察的表型。 

实施例13.在用miR-145antimiR处理的wt小鼠中相比于对照和用miR-143antimiR处理的wt小鼠，对PAH形成的定量 

为了确定在应答长期缺氧的miR-145消除的小鼠中观察到的针对PAH形成的保护性作用是否能通过miR-145的药理学操作复制，使用了LNA antimiR。 

LNA antimiR长度为16个核苷酸，靶向成熟miR-145(SEQ ID NO:13)或成熟miR-143(5’-TACAGTGCTTCATCTC-3’;SEQ ID NO:14)的碱基2-17，而且是完全硫代磷酸化的寡核苷酸，与miR-143或miR-145的5’区完全互补且作为LNA和DNA的混合物合成。LNA对照寡核苷酸(混杂)由针对秀丽线虫(C.elegans)特异性miRNA的序列组成，其具有可比的LNA/DNA含量。AntimiR和对照寡核苷酸经由皮下注射(0.2ml盐水中25mg/kg)施用给雌性C57Bl6小鼠(8-10周龄)。在14天缺氧暴露的第1天和第8天用寡核苷酸或媒介注射小鼠。 

用特异于miR-145或miR-143的antimiR皮下注射8周龄的雌性C57Bl6小鼠，然后暴露于长期缺氧达2周并与用媒介和混杂处理的小鼠进行比较。在缺氧暴露的第8天注射第2剂。通过q-PCR确认经处理动物在肺中的miR-145或miR-143的选择性和实质性下调(图13A、B)。混杂处理的小鼠在miR-143和miR.145两者的表达中显示无变化(图13A、B)。Northern印迹确认了选择性下调(图13C-F)。然后，评估在经处理小鼠中相比于对照的PAH的形成。在用媒介处理的缺氧小鼠中，观察到相比于用媒介处理的含氧量正常小鼠在收缩RVP和RVH中的显著和预期的升高(图14)。在用混杂处理的和antimiR-143动物中观察到相同的影响，然而，用针对miR-145的antimiR处理的小鼠显示收缩RVP中的显著降低(图14A)。在用antimiR-145或antimiR-143处理的小鼠中未观察到RVH和SAP中的变化(图14B)。组织学分析显示在暴露于长期缺氧的用antimiR-145处理的小鼠的小PA中肺血管重塑相比于在暴露于缺氧的用媒介或混杂处理的小鼠中观察到的重塑百分比的显著降低(图14C、D)。这些数据显示miR-145而非miR-143的选择性药理学操作阻止暴露于缺氧的小鼠中PAH的形成。未观察到平均SAP中的变化(图15A)。未观察到HR中各组间的变化(图15B)。 

实施例14.miR-145表达在患有特发性或遗传性PAH的人患者的肺组织中升高 

为了进一步阐明miR-145在PAH形成中的作用，将取自患有特发性PAH(iPAH)或遗传性PAH(hPAH)的患者的肺组织中的miR-145表达与对照肺组织进行比较。肺样品从针对末期肺高血压经历移植的患者获得。肺组织从诊断为患有与突变BMPR2有关的hPAH(n=5)或患有iPAH(n=6)的患者获得。对照样品(n=6)包含取自以下患者的没有肿瘤的肺叶的组织，该患者针对肺癌瘤进行肺切除术且由病理学家报告无肿瘤。 

提取来自石蜡包埋的肺组织的MiRNA并通过定量PCR评估表达水平，如上文描述的。与对照相比，miR-145在hPAH和iPAH样品中均显著升高(图16A)。接着，利用原位杂交来定位miR-145在选自上述患者组的人肺中的表达(图16B)。与对小鼠肺分析一致，miR-145在对照肺切片中的表达限定为肺中的平滑肌细胞，包括血管和支气管系(图16B)。PAH的特征在于形成牵涉腺泡前和腺泡内(pre-and intra-acinar)肺动脉的同中心和丛状的动脉损伤。在患有iPAH和hPAH的患者中，miR-145由动脉平滑肌细胞表达且在无论何处存在的同中心损伤和丛状血管损伤的肌肉组分中观察到(图16B)。MiR-145阳性细胞也在血管变得肌肉化的腺泡前和腺泡内动脉中观察到(图16B)。另外，新肌肉化的微动脉在肺泡管水平上表达丰富的miR-145mRNA(图16B)。尽管原位定位不是定量的，但miR-145表达在新内膜肌成纤维细胞中相比于位于中间层(medial layer)的更分化的SMC显著降低(例如，见图16C)。总之，在人肺中，miR-145在平滑肌细胞区室中表达。MiR-145表达还在患有hPAH和iPAH的患者中复杂损伤的重塑血管中观察到。在一些血管中，miR-145水平在新内膜细胞中似乎降低。 

由于从具有BMPR2突变的患者分离的PASMC的生长和特征与那些从没有种系突变的患者分离的根本不同，因此使用培养中的人原代细胞来评估BMPR2突变对miR-145调节的影响。培养从PAH患者获得的原代人PASMC，并量化培养细胞中前体miRNA和成熟miRNA水平上的miRNA水平。前体miR-145和成熟miR-145在源自具有已知BMPR2突变的患者的细胞中相比于不受影响的对照显著升高(图17A、B)。实施Northern印迹分析以确认并量化相同样品中成熟miR-145的差异水平。与PCR分析一致，miR-145在从具有BMPR2中突变的患者提取的RNA中相比于未突变的对照PASMC显著升高 (图17C,D)。因此，miR145的基底水平在具有种系BMPR2突变的患者中升高。 

实施例15.BMPR2下调对人PASMC中miR-143和miR-145表达的影响 

为了在体外评估siRNA介导的BMPR2敲低对人WT PASMC中miR-143和miR-145表达水平的影响，将细胞用能靶向并特异性下调BMPR2的短干扰(si)序列或用si混杂作为阴性对照转染。 

将PASMC接种到6孔板(1.5x10⁵细胞/孔)并在DMEM/10%FBS中生长2天。在转染前，将PASMC在Optimem I中温育3h。在第0天将PASMC用最终浓度的10nM siRNA[针对BMPR-II或Smad4的Dharmacon^TMOn-TARGETplus siRNA，或siControl Nontargeting Pool(siCP)(Perbio Science UK Ltd)]转染，其与在Optimem I中稀释的DharmaFECT1^TM(4ml/孔)复合。将Dharmafect以Optimem I的一半最终体积(1孔200ml)温育5分钟，接着添加含有10X最终浓度的相关siRNA的Optimem I(1孔200ml)，使得siRNA为5X最终浓度。将混合物在室温温育20分钟以允许形成lipoplex。将转染混合物(400ml/孔)滴到新鲜Optimem I(1.6ml/孔)中的细胞上，确保完全覆盖孔。将细胞与复合物在37℃温育4小时，接着用DMEM/10%FBS替换24h第1天。 

4天后，从这些样品和从未处理细胞提取RNA。BMPR2的下调诱导miR-143和miR-145两者的显著上调，而在未处理的或用si混杂处理的细胞中未观察到变化(图18)。 

这一系列实验的结果显示，miR-145水平在来自患有hPAH和iPAH的患者的人样品中升高，且miR-145表达定位于复杂损伤的中间和新内膜SMC。该结果还显示肺平滑肌细胞中BMPR2突变与升高的miR-145水平之间的特定关联。有意思的是，尽管miR-145在分析的PAH患者的整个肺中上调，但该miRNA在iPAH和hPAH患者的血管中的原位定位显示在肥大动脉、肺血管损伤和新肌肉化的微动脉中的丰富miR-145表达。miR-145表达的操作似乎对PAH的形成施加实质性影响，如此，miR-145下调是一种针对PAH的新治疗办法。 

实施例16.BMPR2R899X小鼠中的MiR-145表达 

考虑miR-145调节在PAH的小鼠模型和在从具有BMPR2基因中突变的PAH患者提取的PASMC中的重要性，评估截短的BMPR2突变对杂合的 R899X+/-小鼠中miR-145表达的影响。类似于先前描述的R899X转基因小鼠(West等,2008)，这些小鼠产生自发的肺高血压。 

从6月龄小鼠的整个肺提取RNA并通过q-PCR和northern印迹分析miR-145。这揭示了miR-145在突变的小鼠中相比于对照的显著的上调(图19A-C)。miR-145在石蜡肺切片中的原位定位确认了wt和BMPR2突变小鼠的肺血管和支气管的平滑肌层内的阳性染色，其中在突变动物中观察到强染色(图19D)。 

实施例显示了miR-145在小鼠肺中对平滑肌的定位。使用定量PCR(q-PCR)，显示了miR-145在暴露于缺氧的野生型(wt)小鼠中的增加的表达。MiR-145在小鼠中应答长期缺氧显著上调，且miR-145的遗传消除或antimiR驱动的药理学降低保护小鼠中免于PAH的形成。 

对miR-145-/-小鼠的血管系统的功能分析揭示了对长期缺氧的降低的肺血管应答和降低的右心室肥大。经由对右心室收缩压(sRVP)、右心室肥大(RVH)和重塑肺血管百分比的测量来评估miR-145敲除和用antimiR处理的小鼠中的PAH。另外，重塑血管的百分比在敲除动物中显著降低，强烈表明miR-145消除在PAH形成中的保护性作用。类似的保护性效果在用能实质性降低miR-145表达的antimiR处理的wt小鼠中观察到。如此，miR-145缺陷和antimiR介导的降低导致免于PAH形成的显著保护。相比之下，miR-143antimiR没有影响。 

此外，观察到miR-145在患有特发性和可遗传PAH(iPAH,hPAH)的患者的肺组织中相比于不受影响的对照的上调，并显示miR-145在重塑血管的SMC中的表达。在人组织中，miR-145的前体和成熟形式在在从具有BMPR2基因中突变的PAH患者获得的组织中和分离PASMC中相比于对照升高。在从具有BMPR2突变的患者培养的原代PASMC中，而且在bmpr2缺陷性小鼠的肺中存在升高水平的miR-145表达。这种保守的异常调节表明对miR-145的调节和TGF-beta超家族之间存在关联。 

MiR-145在PAH的小鼠模型中异常调节，且miR-145的下调保护免于形成PAH。在hPAH和iPAH的患者样品中，miR-145在重塑血管中表达，且BMPR2中的突变导致miR-145在小鼠和PAH患者中上调。基于这些观察，miR-145在形成PAH中有关键作用且对miR-145的操作代表了PAH治疗中的一种新策略。 

本文中论述和引用的所有出版物、专利和专利申请通过全文提述并入本文。应理解本公开发明不限于描述的特定的方法学、方案和材料，因为这些均可以变化。还应理解本文中使用的术语学目的仅为描述具体的实施方案且不意图限制本发明的范围，所述范围仅由所附权利要求限制。 

本领域中的技术人员会仅使用常规实验法，认可或能确定对本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同体。这类等同体意图涵盖在以下权利要求中。 

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Claims (43)

1.一种在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压(PAH)的方法，包括对所述受试者施用miR-145的抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。

3.权利要求2的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’或5’-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’的序列至少部分互补的序列。

4.权利要求2或3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。

5.权利要求4的方法，其中所述至少一个糖修饰是2’-O-烃基修饰或双环糖核苷修饰。

6.权利要求5的方法，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。

7.权利要求2至6中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。

8.权利要求7的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。

9.权利要求2至8中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。

10.权利要求9的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂。

12.权利要求11的方法，其中所述抑制剂配制为干粉。

13.权利要求11的方法，其中所述抑制剂配制为液体气雾剂。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者是人。

15.权利要求14的方法，其中所述人在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。

16.一种用于治疗或预防肺动脉高血压的试剂盒，其包含miR-145的抑制剂和施用装置。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述施用装置是吸入器。

18.权利要求16或权利要求17的试剂盒，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。

19.权利要求18的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含与5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’或5’-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’的序列至少部分互补的序列。

20.权利要求18或权利要求19的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。

21.权利要求20的试剂盒，其中所述至少一个糖修饰是2’-O-烃基修饰或双环糖核苷修饰。

22.权利要求21的试剂盒，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。

23.权利要求18至22中任一项的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。

24.权利要求23的试剂盒，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。

25.权利要求18至24中任一项的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。

26.权利要求25的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。

27.权利要求16至26中任一项的试剂盒，其中所述抑制剂配制为包含在所述施用装置内的粉末。

28.权利要求16至26中任一项的试剂盒，其中所述抑制剂配制为包含在所述施用装置内的液体气雾剂。

29.miR-145的抑制剂，其用于在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压(PAH)的方法，所述方法包括对所述受试者施用miR-145的抑制剂。

30.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29的用途，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。

31.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30的用途，其中所述反义寡核苷酸包含与5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’或5’-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’的序列至少部分互补的序列。

32.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30或31的用途，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。

33.miR-145的抑制剂，其用于权利要求32的用途，其中所述至少一个糖修饰是2’-O-烃基修饰或双环糖核苷修饰。

34.miR-145的抑制剂，其用于权利要求33的用途，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。

35.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30-34任一项的用途，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。

36.miR-145的抑制剂，其用于权利要求35的用途，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。

37.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30-36任一项的用途，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。

38.miR-145的抑制剂，其用于权利要求37的用途，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。

39.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29-38任一项的用途，其中通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂，或其中适于通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂。

40.miR-145的抑制剂，其用于权利要求39的用途，其中所述抑制剂配制为干粉。

41.miR-145的抑制剂，其用于权利要求39的用途，其中所述抑制剂配制为液体气雾剂。

42.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29-41任一项的用途，其中所述受试者是人。

43.miR-145的抑制剂，其用于权利要求42的用途，其中所述人在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。

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