CN113332306A

CN113332306A - 用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN113332306A
Application number: CN202110467888.XA
Authority: CN
Inventors: 邱志华; 马文瑞; 廖梦阳; 周子华
Original assignee: Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肺动脉高血压的microRNA‑30a抑制剂及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该microRNA‑30a抑制剂用于PAH血管重塑，其通过气道滴注的给药方式靶向治疗PAH，能够降低PAH右心室收缩压和改善肺动脉重构。该miRNA‑30a抑制物可以应用于制备治疗肺动脉高压药物。

Description

用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂及其应用。

背景技术

肺动脉高压(PAH)是以肺小动脉本身病变导致肺血管阻力进行性增加的一类肺高血压，肺小动脉的收缩、不良重构和顺应性下降使肺血管阻力升高，增加右心负荷并最终导致右心衰竭，后者是 PAH的首要死因。PAH发病率相对较低，但预后极差，我国5年的生存率20.8％。近20年来治疗PAH药物取得了一定的疗效，如内皮素受体拮抗剂，使PAH中位生存时间由80年代的2.8年，延长到5年，但该类药价格昂贵，主要针对肺动脉的过度收缩，而不能逆转肺动脉的重塑。因此，迫切需要针对肺动脉重塑的PAH的治疗方法。

MicroRNA(miRNA)在PAH的发病机制中发挥重要作用，针对miRNA的研究是PAH肺动脉重塑治疗的新的方向和靶点，但 miRNA-30a在PAH中的作用仍不清楚。另外，相比于静脉给药和腹腔给药，经气道滴注给药需要的药物剂量小，免疫毒性反应低，具有更高的肺组织特异性，

因此，miRNA经气道滴注给药在PAH靶向治疗中有巨大潜力。本发明针对PAH血管重塑，开创性地研制出一种miRNA-30a抑制剂，通过气道滴注的给药方式靶向治疗PAH，能够降低PAH右心室收缩压和改善肺动脉重构。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂及其应用，该microRNA-30a抑制剂用于PAH血管重塑，其通过气道滴注的给药方式靶向治疗PAH，能够降低PAH右心室收缩压和改善肺动脉重构。

为实现上述目的，本发明所设计一种用于治疗肺动脉高血压的 microRNA-30a抑制剂，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述microRNA-30a抑制剂为经化学修饰的核苷酸序列。

再进一步地，所述核苷酸序列5’端经两个硫代磷酸位点修饰(S 代)；3’端(最边上)经发生四个硫代磷酸位点修饰(S代)；3’端还有经胆固醇的修饰(胆固醇)；全链的所有核糖分子的2号位碳原子上的羟基被甲氧基取代(甲基化)。

本发明还提供一种上述microRNA-30a抑制剂在制备治疗肺动脉高血压的药品中的应用。

本发明还提供一种治疗肺动脉高血压的药品，所述药品含有上述的microRNA-30a抑制剂以及药学上可接受的载体。

上述药品可选择靶向肺组织给药，即经气管内滴注给药。

本发明的有益效果：

1、本发明根据miRNA-30a的核苷酸序列，综合生物信息学、药理学方法，本发明设计出了的miRNA-30a抑制物，并通过验证出这种抑制物能有效抑制miRNA-30a的表达水平。

2、本发明的miRNA-30a抑制物通过气管内滴注的给药方法分别给药于雄性C57品系鼠，利用RT-PCR法测定小鼠肺组织 miRNA-30a的表达水平，从而得到miRNA-30a抑制物的抑制效率。

3、本发明将野生型和miRNA-30a基因敲除小鼠分别构建野百合碱诱导的肺动脉高压小鼠模型，研究miRNA-30a基因敲除是否降低野百合碱诱导的肺动脉高压模型小鼠的肺动脉压力，实验结果表明miRNA-30a基因敲除能降低野百合碱诱导的肺动脉高压模型小鼠的肺动脉压力，因此，抑制miRNA-30a的表达水平是治疗肺动脉高压的新靶点。

4、本发明的针对miRNA-30a抑制物通过气管内滴注的给药方法分别给药于雄性C57品系鼠，研究miRNA-30a抑制物是否降低低氧诱导的肺动脉高压模型小鼠的肺动脉压力，实验结果表明 miRNA-30a抑制物能降低低氧诱导的肺动脉高压模型小鼠的肺动脉压力，因此，此类miRNA-30a抑制物可以应用于制备治疗肺动脉高压药物。

附图说明

图1为实施例2、3中miRNA-30a抑制物气管内滴注的药物剂量、频率、抑制效率实验示意图；

其中，图1A为miRNA-30a抑制物气管内滴注实验周期示意图，肺动脉高压模型小鼠21天实验周期中，miRNA-30a抑制物分别在第0、7、14天通过气管内滴注给药，miRNA-30a抑制物给药剂量为5nmol；

图1B为miRNA-30a抑制物气管内滴注抑制效率结果图，在实验第21天将小鼠处死，检测小鼠肺组织miRNA-30a的表达水平。共分为4组：(1)Con(n＝6)：不做任何处理；(2)Hx/Su组(n＝6)：三次皮下注射SU5416药物20mg/kg并放置于10％氧气浓度缺氧箱；(3)Hx/Su+Anti-miR-30a组(n＝6)：三次皮下注射SU5416 药物20mg/kg并放置于10％氧气浓度缺氧箱,同时三次气管内滴注给药miRNA-30a抑制物；(4)Hx/Su+Anti-NC组(n＝6)：三次皮下注射SU5416药物20mg/kg并放置于10％氧气浓度缺氧箱，同时三次气管内滴注给药miRNA-30a抑制物的NC对照。

图2为实施例4中测量miRNA-30a基因敲除对野百合碱诱导的肺动脉高压小鼠右心室收缩压的变化图，共分为4组：

(1)WT组(n＝6)：WT老鼠不做任何处理；

(2)WT+MCT组(n＝6)：WT老鼠持续四周每周皮下注射野百合碱600mg/kg；

(3)KO组(n＝6)：KO老鼠不做任何处理；

(4)KO+MCT组(n＝6)：KO老鼠持续四周每周皮下注射野百合碱600mg/kg。

图3为实施例5中测量miRNA-30a抑制物对Hx/Su诱导的肺动脉高压小鼠右心室收缩压的变化图，共分为4组：

(1)Con(n＝6)：不做任何处理；

(2)Hx/Su组(n＝6)：三次皮下注射SU5416药物20mg/kg 并放置于10％氧气浓度缺氧箱；

(3)Hx/Su+Anti-miR-30a组(n＝6)：三次皮下注射SU5416 药物20mg/kg并放置于10％氧气浓度缺氧箱,同时三次气管内滴注给药miRNA-30a抑制物；

(4)Hx/Su+Anti-NC组(n＝6)：三次皮下注射SU5416药物 20mg/kg并放置于10％氧气浓度缺氧箱,同时三次气管内滴注给药 miRNA-30a抑制物的NC对照。

图4为实施例5中测量miRNA-30a抑制物对Hx/Su诱导的肺动脉高压小鼠肺动脉血管重构的变化图；

其中，图4A肺组织HE染色和α-SMA免疫组化染色图；

图4B表示肺组织HE染色后计算的中膜面积百分比图；

图4C表示肺组织HE染色后计算的厚度百分比图；

图4D表示肺组织α-SMA免疫组化染色后血管肌化率百分比图，共分为4组：

(1)Con(n＝6)：不做任何处理；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1：microRNA-30a抑制剂的制备

根据miRNA-30a的核苷酸序列，综合生物信息学、药理学方法，设计得到microRNA-30a抑制剂的核苷酸序列，如SEQ ID No.1 所示(即为RNA序列)；

上述核苷酸序列经过特殊化学修饰的即为microRNA-30a抑制剂，即5’端(最边上)发生两个硫代磷酸位点修饰(S代)；3’端(最边上)发生四个硫代磷酸位点修饰(S代)；3’端还有胆固醇的修饰 (胆固醇)；全链的所有核糖分子的2号位碳原子上的羟基被甲氧基取代(甲基化)，

上述miRNA-30a抑制物分装后置于冻存管中，-80℃冻存备用。

microRNA-30a抑制剂通过与体内的成熟miRNA-30a强竞争性结合，阻止miRNA-30a与其靶基因mRNA的互补配对，抑制 miRNA-30a发挥作用。

实施例2：microRNA-30a抑制剂气管内滴注治疗对低氧诱导的肺动脉高压模型小鼠的操作流程。

成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)，注射miRNA-30a抑制剂。将小鼠随机分为4组：

1)正常对照组(Con)(n＝6)；

2)Su5416低氧组(Su/Hx)(n＝6)；

3)Su541低氧组+miR-30a抑制剂组(Su/Hx+Anti-miR-30a) (n＝6)；

4)Su5416低氧组+miR-30a抑制剂阴性对照组 (Su/Hx+Anti-NC)(n＝6)。

肺动脉高压模型小鼠21天实验周期中，miRNA-30a抑制物分别在第0、7、14天通过气管内滴注给药，miRNA-30a抑制物给药剂量为5nmol。操作如下：

1)小鼠用氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，在平台上以60°仰卧位放置；

2)用标准的啮齿动物呼吸机给小鼠插管并通气；

3)将miRNA-30a antagomir/NC对照(5nmol)置于液体状态的PBS中(体积为10μL)；

4)用p20微管快速将液体注入导管；

5)为尽量减少导管内或上气道内残留液体，在导管末端安装 1ml注射器通气3次；

6)老鼠与呼吸机连接至少3分钟，然后再回到笼子里。

实施例3：microRNA-30a抑制剂气管内滴注治疗在小鼠抑制效率的检测流程。

在实验结束后，迅速取出小鼠肺脏，在PBS中漂洗两遍后提取RNA，逆转录成cDNA并通过Real-time PCR检测microRNA-30a 抑制剂的抑制效率。

1、酚-氯仿抽提法提取总RNA。

1)提取肺组织总RNA加1ml Trizol；

2)将Trizol混合液转入1.5ml离心管中，加入氯仿，严密关闭离心管盖，用力摇晃试管20秒，使内容物充分混匀，冰上静置 15min使之分层，后4℃条件下12000转/分，离心15min；

3)将上层水相小心吸取后转入新的1.5ml离心管中(约 400-500ul，切记勿吸取白色中间层和红色下层)，加入0.5ml异丙醇(等体积)，混匀，在4℃条件下12000转/分离心15min；

4)小心倾倒掉上清，留取沉淀，加1ml现配并预的75％的乙醇振荡混匀，4℃条件下7500转/分离心10min；

5)小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台，开风机吹干，在管中加入10ul的无酶水溶解总RNA；

6)检测总RNA的纯度和浓度：取1ul提取的总RNA稀释于 99ul无酶水中，使用紫外分光光度计测定A260和A280吸光度，根据A260/A280比值判断RNA纯度，一般要求在1.8—2.0之间， RNA的浓度计算公式为A260×稀释倍数×40(ng/μl)。

2、逆转录反应：使用TaKaRa公司的逆转录试剂盒，将上诉步骤提取的总RNA经逆转录过程生成cDNA，具体操作按其说明书进行。

1)反应体系的配置如下：

RT Master Mix(for Real Time)4μl

Prime Script RT Enzyme Mix*1 1ul

基因特异RT引物(2um)1ul

Total RNA(20ul反应体系最多可加1ug RNA)Xμl

RNase Free dH2O 14-Xμl

总体积20μl

2)microRNA逆转录反应条件如下：

16℃30min 42℃45min

85℃10min

4℃

将逆转录反应产物cDNA保存于-20℃。

3、Real-time PCR反应：使用TaKaRa公司的Real-time PCR 试剂盒，对上一步合成的cDNA中目的基因的表达量进行检测。所有目标引物由深圳锐博生物公司设计并合成：

1)PCR反应体系配置如下：

Premix(2×)5μl

PCR Forward Primer(10μM)0.2μl

PCR Reverse Primer(10μM)0.2μl

RT反应液(cDNA溶液)1μl

Rox dye(50×)0.2μl

总体积10μl

2)在美国ABI公司的stepone型实时荧光定量PCR仪上进行 Real-time PCR反应：

Stage 1

94℃20s

Stage2

94℃3s

60℃30s

循环45次

Stage3溶解曲线计算

3)计算目的基因的相对表达量：microRNA-30a对照基因为 U6，待测样品相对值＝2^-△△Ct。

实施例4：microRNA-30a基因敲除小鼠在野百合碱诱导的肺动脉高压模型中作用的研究。

microRNA-30a基因敲除小鼠(miRNA-30a KO)经南京大学南京生物医学研究所许可获得(项目编号:XM001304)。miRNA-30a KO小鼠或年龄匹配的野生型(WT)对照组(品系C57BL/6，8周龄)随机分为4组:

1)野生型对照组(WT)(n＝6)；

2)野生型+野百合碱组(WT+MCT)(n＝6)；

3)miRNA-30a KO组(KO)(n＝6)；

4)miRNA-30a KO+野百合碱组(KO+MCT)(n＝6)。

将野百合碱溶解在0.1N的HCl中，用0.1N的NaOH调整pH 至7.4。小鼠每周接受野百合碱皮下注射(600mg/kg)，连续4周。所有小鼠于第28天处死并测量肺动脉压力。

1)麻醉：野百合碱处理后第28天，用1％戊巴比妥钠生理盐水(4ml/kg)腹腔注射麻醉；

2)固定：待动物麻醉成功后，采取仰卧法将动物牙齿、四肢进行固定；

3)分离右侧颈静脉：将右侧颈部皮肤剪掉，采用顿性性分法分离出右侧颈静脉，并将其表面的结缔组织剥离；

4)压力测量：将millar导管(sci美国)插入右侧颈静脉，然后逆行插入右心室，待感到强烈的心跳时连接压力传感器 (adinstruments公司，澳大利亚)，观察压力记录仪(adinstruments 公司，澳大利亚)上面出现的波形，直至测出右心室压力波形。

结果如图2：结果显示WT+MCT组较WT组肺动脉压力明显升高，KO+MCT组较WT+MCT组比较有所降低。

实施例5：肺动脉压力测定低氧处理后第21天小鼠右心导管法测量右心室收缩压，具体操作如下：

1)麻醉：低氧处理后第21天，用1％戊巴比妥钠生理盐水 (4ml/kg)腹腔注射麻醉；

4)压力测量：将millar导管(sci美国)插入右侧颈静脉，然后逆行插入右心室，待感到强烈的心跳时连接压力传感器 (adinstruments公司，澳大利亚)，观察压力记录仪(adinstruments 公司，澳大利亚)上面出现的波形，直至测出右心室压力波形。结果如图3：结果显示低氧Hx/Su组和Anti-NC组较空白对照组肺动脉压力明显升高，microRNA-30a抑制剂治疗组较空白对照组升高但是和MCT组和空载组比较有所降低。

5)标本留取：在右心室收缩压测定后，迅速取出肺脏，在PBS 中漂洗两遍后切勿一小块肺脏浸泡在4％多聚甲醛中，组织经常规脱水，石蜡切片，行HE和α-SMA染色，观察肺细小动脉血管重构，如图4A所示。

6)统计学分析数据以均数±标准误表示，用SPSS23.0软件进行统计处理，组间差异比较采用方差分析(ANOVA)，以P<0.05 具有显著性差异。

结果如图4B～4D所示：图4B-4C表明低氧Hx/Su组和Anti-NC 组的细小动脉管腔面积和厚度占细小动脉横截面积的百分比较空白对照组明显降低，而microRNA-30a抑制剂治疗组较低氧Hx/Su 组和Anti-NC组细小动脉管腔面积和厚度占细小动脉横截面积的百分比升高。图4D表明低氧Hx/Su组和Anti-NC组细小动脉肌化率百分比较空白对照组明显增高，而microRNA-30a抑制剂治疗组较低氧Hx/Su组和Anti-NC组肌化率百分比较空白对照组降低。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 武汉华纪元生物技术开发有限公司

<120> 用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uguaaacauc cucgacugga ag 22

Claims

1.一种用于治疗肺动脉高血压的microRNA-30a抑制剂，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述microRNA-30a抑制剂，其特征在于：所述microRNA-30a抑制剂为经化学修饰的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述microRNA-30a抑制剂，其特征在于：所述核苷酸序列5’端经两个硫代磷酸位点修饰；3’端经发生四个硫代磷酸位点修饰；3’端还有经胆固醇的修饰；全链的所有核糖分子的2号位碳原子上的羟基被甲氧基取代。

4.一种权利要求1所述microRNA-30a抑制剂在制备治疗肺动脉高血压的药品中的应用。

5.一种治疗肺动脉高血压的药品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述的microRNA-30a抑制剂以及药学上可接受的载体。