CN108096268B

CN108096268B - microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的应用

Info

Publication number: CN108096268B
Application number: CN201711275886.0A
Authority: CN
Inventors: 范骁辉; 陆晓燕
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN108096268A

Abstract

本发明公开了microRNA‑106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的应用。本发明首次通过实验发现microRNA‑106b，尤其是microRNA‑106b‑5p，在肝损伤的适应性反应中起到关键性作用，既能作为诊断和预测肝损伤转归的诊断标志物，也能作为预防和治疗肝损伤的药物和新靶点。

Description

microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的应用。

背景技术

肝脏是人体物质合成、生物转化及解毒的重要器官，通常也是毒副作用最先发生、最主要的靶器官。原发性肝癌、肝炎、肝硬化、脂肪肝和药物性肝损伤等已成为最常见的肝脏疾病，严重困扰着欧美发达国家和中国等发展中国家，迄今为止仍缺乏有效防治手段。

我国最新的2015版《药物性肝损伤诊治指南》中指出：“恢复性组织修复”是肝损伤进展或消退的内在决定性因素。在药物性肝损伤中，适应性反应正是这样一种现象，表明了恢复性组织修复在肝损伤进程中的关键作用；它是指药物治疗期间出现肝损伤的生化学证据，但继续用药肝损伤恢复的现象。

近年来利用适应性反应已成为防治疾病及靶器官损伤的新方向，它的核心是充分发挥机体内源性保护机制，从而增强机体适应性和抗损伤的能力，如应用于临床的缺血性预保护等。但至今尚未有利用肝损伤适应性反应治疗肝脏疾病的临床报道，究其原因是目前对该现象的内在保护机制认识十分匮乏。

因此，深入认识肝损伤适应性反应发生发展的机制，阐明恢复性组织修复的确切分子事件，从中发现机体内源性保护机制，对治疗肝损伤、肝脏疾病具有十分重要的科学意义及临床价值。

研究表明，microRNA这种非编码的小RNA分子在组织修复与再生中具有尤为重要的功能，胎儿组织发育与成人组织修复的多个关键方面都受到miRNA的调控。并且，miRNA参与了多种肝脏疾病的发生发展，而循环外泌体中miRNA的变化趋势与肝脏疾病的不同病理状态密切相关。因此，发现肝损伤适应反应中起关键作用的microRNA分子的变化，阐明其功能，将会对肝损伤的治疗带来新的靶标和干预策略。

然而，尽管越来越多的microRNA分子作为人类疾病的生物标志物、决定因素和治疗靶标被发现，但是在肝损伤适应性反应中起关键作用的microRNA仍没有确定，其所发挥的功能对该领域的科研人员来说仍是挑战。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，发现了在肝损伤适应性反应中起关键作用的microRNA分子，提供了microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的新用途。

具体如下：

本发明发现了microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物中的新用途。

进一步地，所述的microRNA-106b为microRNA-106b-5p。该microRNA-106b分为“-5p”和“-3p”两种，该microRNA-106b的前体长度约为70～80nt，可由两个臂分别产生microRNA，如两臂产生的microRNA表达没有明显差异，则以“-5p”和“-3p”分别命名。一般以microRNA-106b表示，如PUBMED的GENE数据库中microRNA 106b[Homo sapiens(human)]Gene ID:406900。

进一步地，所述的肝损伤为药物性肝损伤。

进一步地，所述的药物性肝损伤为川楝素造成的肝损伤。

上述肝损伤是指多种原因引起的肝脏生理功能障碍或病理改变，包括药物、病毒、酒精性或非酒精等原因引起的肝脏炎症、肝细胞凋亡或坏死、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等，可见血清/血浆肝损伤生化指标(如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、总胆固醇等变化)和肝组织病理学变化(如炎症、肝细胞凋亡或坏死、肝细胞水肿变性或空泡变性、结缔组织增生等)。

本发明以川楝素为例，通过实验发现，在药物性肝损伤适应性反应中血清外泌体microRNA-106b表达显著上调。

此外，采用经过化学修饰的miRNA-106b激动剂，构建高表达miRNA-106b的肝细胞或小鼠，结果发现，①高表达miRNA-106b的肝细胞，在暴露同样剂量的川楝素下，能抑制川楝素的毒性作用；②高表达miRNA-106b的小鼠，在暴露同样剂量的川楝素下，能耐受川楝素的肝毒性作用，降低肝损生化指标，促进损伤修复。而另一方面，采用经过化学修饰的miRNA-106b拮抗剂，构建拮抗miRNA-106b的肝细胞或小鼠，结果发现，①拮抗miRNA-106b的肝细胞，在暴露同样剂量的川楝素下，能增加川楝素的毒性作用；②拮抗miRNA-106b的小鼠，在暴露同样剂量的川楝素下，能增加川楝素的肝毒性作用，升高肝损生化指标，引起小鼠肝损伤加重，甚至死亡。

具体地，所述药物包含促进microRNA-106b表达或增强microRNA-106b功能的试剂。

该试剂可以是microRNA-106b的模拟物、microRNA-106b的前体、microRNA-106b的激动剂以及携带microRNA-106b的载体

进一步地，本发明采用的试剂为microRNA-106b的激动剂。

例如，所述microRNA-106b的agomir为mmu-miR-106b-5p(具体实施例3中采用的microRNA-106b的激动剂)；即：正义链为5’-UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU-3’，反义链则为5’-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3’。

该microRNA-106b的激动剂不仅限于上述mmu-miR-106b-5p。

本发明也发现了microRNA-106b在制备诊断肝损伤的产品中的应用。

进一步地，所述产品为肝损伤诊断标记物或者用于检测microRNA-106b表达水平的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒包括检测microRNA-106b的检测引物；

例如：所述检测引物的序列为microRNA 106b(human)PCR通用反向引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’，正向引物5’-TGCTGACAGTGCAGATA AGTCGT-3’，该microRNA-106b的检测引物不仅限于上述引物序列，针对microRNA-106b的引物都可以包括在试剂盒中。

进一步地，所述的microRNA-106b为microRNA-106b-5p。

进一步地，所述的肝损伤为药物性肝损伤。

进一步地，所述的药物性肝损伤为川楝素造成的肝损伤。

本发明还提供了一种防治肝损伤的药物，所述药物包含促进microRNA-106b表达或增强microRNA-106b功能的试剂。

上述药物可以由所述试剂和药物学上可接受的载体组成。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。

所述填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外，还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

上述药物的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。

上述药物还可以通过各种途径给予，包括：口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次通过实验发现microRNA-106b，尤其是microRNA-106b-5p，在肝损伤的适应性反应中起到关键性作用，既能作为诊断和预测肝损伤转归的诊断标志物，也能作为预防和治疗肝损伤的药物和新靶点。

附图说明

图1为实施例1在川楝素肝损伤适应性反应中，与各时间点对照组相比，川楝素作用下miR-106b-5p的表达水平；

其中，microarray为血清外泌体microRNA的芯片数据，RT-PCR为实时荧光定量PCR的验证结果；数据以均值±SD表示。

图2为实施例2中BNL CL.2细胞在不同给药条件作用48h后的细胞增殖率；

其中，川楝素(TSN)“+”表示各组均暴露0.1μM川楝素，以此建立肝损伤模型，“-”为仅暴露0.1μM川楝素组，agomir miR-106b-5p为microR-106b-5p激动剂组，即microR-106b-5p高表达组，agomir control为microR-106b-5p激动剂的对照，与其他microRNA基本无同源性，antagomir miR-106b-5p为microR-106b-5p拮抗剂组，即拮抗microR-106b-5p组，antagomir control为microR-106b-5p拮抗剂的对照，与其他microRNA基本无同源性；

数据以均值±SD表示，两两之间显著性分析采用one-way ANOVA及Bonferroni验后分析，^**p<0.01。

图3为实施例3中在microR-106b-5p激动剂作用下小鼠体重的变化情况；

其中，Control为生理盐水对照组，TSN为川楝素组，TSN+agomir control为microR-106b-5p激动剂对照和川楝素共同暴露组，TSN+agomir miR-106b-5p为microR-106b-5p激动剂和川楝素共同暴露组；

数据以均值±SD表示；control组、TSN组、TSN+agomir miR-106b-5p组，n＝6；TSN+agomir control组，n＝5；采用two-way ANOVA及Bonferroni验后检验进行显著性分析，与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与川楝素单独给药组相比，^#p<0.05，^##p<0.01；与川楝素+agomir control组相比，^αp<0.05，^ααp<0.01。

图4为实施例3中在microR-106b-5p激动剂作用下小鼠血清ALT值的变化情况；

数据以均值±SD表示；n＝5或6，采用two-way ANOVA及Bonferroni验后检验进行显著性分析；与对照组相比，^**p<0.01；与川楝素单独给药组相比，^##p<0.01；与川楝素+agomir control组相比，^##p<0.01。

图5为实施例3中在microR-106b-5p拮抗剂作用下小鼠体重的变化情况；

其中，Control为生理盐水对照组，TSN为川楝素组，TSN+antagomir control为microR-106b-5p拮抗剂对照和川楝素共同暴露组，TSN+antagomir miR-106b-5p为microR-106b-5p拮抗剂和川楝素共同暴露组；

数据以均值±SD表示；n＝6，但TSN+antagomir miR-106b-5p组中一只小鼠在第14天死亡，TSN+antagomir control组中一只小鼠在第13天死亡；采用two-way ANOVA及Bonferroni验后检验进行显著性分析，与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与川楝素单独给药组相比，^#p<0.05，^##p<0.01；与川楝素+antagomir control组相比，^αp<0.05，^ααp<0.01。

图6为实施例3中在microR-106b-5p拮抗剂作用下小鼠血清ALT值的变化情况；

数据以均值±SD表示；n＝6，但TSN+antagomir miR-106b-5p组中一只小鼠在第14天死亡，TSN+agomir control组中一只小鼠在第13天死亡；采用two-way ANOVA及Bonferroni验后检验进行显著性分析；与对照组相比，^**p<0.01；与川楝素单独给药组相比，^##p<0.01；与川楝素+antagomir control组相比，^##p<0.01。

图7为实施例4中microRNA-106b在临床其他肝损伤中的表达情况；

其中，数据以均值±SD表示；采用one-way ANOVA及Dunnett验后检验进行显著性分析，与正常人相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

具体实施方式

下面结合实例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1小鼠川楝素肝损伤反应模型血清外泌体microRNA表达谱分析

根据发明人前期文献(Lu X,Ji C,Tong W,Lian X,Wu Y,Fan X,GaoY.Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles highlights thecomplex and dynamic behavior of toosendanin-induced liver injury in mice.SciRep.2016；6:34225.doi:10.1038/srep34225)，构建小鼠川楝素肝损伤适应性反应模型；该文献研究发现小鼠对川楝素引起的肝损伤具有适应性现象，能够很好地模拟临床药物肝损伤适应性反应的发生与发展，即川楝素用药9天后出现肝损伤的生化学证据，且病理显示肝细胞坏死，不改变药物剂量，继续用药至21天，生化学指标恢复正常、肝组织病理好转的现象。

在此基础上，以川楝素肝损伤适应性反应为例，研究在恢复性组织修复事件中起关键作用的microRNA分子。

由于血清外泌体中的miRNA分子具有相对丰度高、不易被降解、能指示损伤发生发展机制等优势，本发明检测在川楝素肝损伤适应性反应中小鼠血清外泌体中差异表达的microRNA分子。

具体内容如下：

雄性BALB/c小鼠72只适应环境3天后，按体重随机分组，分为6组(n＝12)，分别是溶剂物质暴露3天、9天和21天的对照组，以及3天、9天和21天的川楝素80mg/kg给药组。溶剂对照组给予1％CMC-Na，川楝素均以1％CMC-Na配制成相应的悬浮液，小鼠按相应剂量灌胃给药，每天1次，给药体积0.2mL/10g，每天记录小鼠的体重数据，并观察小鼠精神状态，外观行为特征等变化。

各组末次给药24h后，收集小鼠血清。采用ExoQuick^TMExosome PrecipitationSolution(System Biosciences,USA)的标准步骤提取血清中的外泌体。采用mirVana^TMPARIS^TM Kit(Ambion,USA)中的标准步骤提取血清外泌体中的总RNA，包括microRNA，利用Agilent mouse miRNA(8*60K)V21.0array芯片及其标准杂交、扫描步骤获得芯片数据。采用Gene Spring GX 12(Agilent technologies,USA)软件对数据进行归一化等分析处理，获得与各时间点对照组相比，在川楝素组中差异表达的microRNA分子。

取芯片实验的RNA样本，采用实时荧光定量PCR实验对特定microRNA的表达进行验证。采用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。按照miScript RT II Kit逆转录试剂盒说明书将提取的RNA逆转录成cDNA，反转录条件为37℃60min，95℃5min。实时荧光定量PCR实验按照miScript SYBR Green PCR Kit说明书进行。实时荧光定量PCR反应总体积为25μL，体系主要包括2×SYBR Master Mix 12.5μL，Universal Primer 2.5μL，10μmol/L引物2.5μL，cDNA模板2μL，DEPC水5.5μL。

引物序列如表1所示。

表1实时荧光定量PCR实验所需的miRNA引物

实时荧光定量PCR反应在Bio-Rad CFX-Touch荧光定量PCR仪上进行，反应条件：95℃预变性15min后；以94℃15s、55℃30s、70℃30s进行40个循环。

miR-30e-5p在各组中表达值相近，因此，被选为本实验的内参基因。

按目的基因的fold change(变化倍数)＝2^-ΔΔCt，计算各组样本miRNA的表达强度，△Ct＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct＝试验组△Ct-对照组△Ct。当2^-ΔΔCt>1.5时，认为该microRNA上调，当2^-ΔΔCt<0.5时，认为该microRNA下调。每组实验重复3次。

结果如图1显示：与各时间点溶剂对照组相比，川楝素3、9、21天作用组都影响了miR-106b-5p(Gene ID:723925)，使其表达升高；且在川楝素各时间点作用下，miR-106b-5p的表达变化趋势与川楝素肝损伤适应性反应的发生发展过程相一致，表明miR-106b-5p可能是恢复性组织修复中的关键microRNA分子。此外，RT-PCR的验证结果显示，miR-106b-5p的表达趋势与芯片结果一致。

实施例2 miR-106b及anti-miR-106b对体外受损肝细胞增殖的影响

取对数生长期小鼠胚肝细胞(BNL CL.2)接种于96孔板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，吸去培养液并以PBS洗2遍，各孔分别加入含100nmol miR-106b-5p agomir(microR-106b-5p激动剂，即microR-106b-5p高表达组)、agomir control(microR-106b-5p激动剂对照，与其他microRNA基本无同源性)、miR-106b-5p antagomir(microR-106b-5p拮抗剂，即拮抗microR-106b-5p组)和antagomir control(microR-106b-5p拮抗剂对照，与其他microRNA基本无同源性)的川楝素培养液100μL(含10％FBSDMEM配制的0.1μM川楝素溶液)，以0.1μM川楝素溶液作为对照，建立体外肝损伤模型，置于培养箱中培养48h。按照Roche的Brdu Elisa试剂盒说明书步骤检测细胞的增殖情况。

结果如图2所示：与川楝素对照组或agomir control组相比，miR-106b-5p agomir(即miR-106b高表达)组能显著促进受损肝细胞的增值；而与川楝素对照组或antagomircontrol组相比，miR-106b-5p antagomir(即anti-miR-106b)组能显著抑制受损肝细胞的增值。

上述研究结果表明，miR-106b-5p具有促进受损肝细胞修复的作用，而拮抗miR-106b-5p则能抑制受损肝细胞的修复。

实施例3 miR-106b及anti-miR-106b对小鼠肝损伤模型的影响

雄性BALB/c小鼠按体重分6组：生理盐水对照组，川楝素组，miR-106b-5pantagomir组，antagomir control对照组，miR-106b-5p agomir组，agomir control对照组，n＝5或6(表示每组小鼠的只数)。antagomir组的小鼠尾静脉注射antagomir 100nmol/次，agomir组的小鼠尾静脉注射agomir 10nmol/次，生理盐水对照组和川楝素组分别尾静脉注射等体积生理盐水，每3天注射一次。生理盐水组灌胃给予CMC-Na，其余各组给予川楝素80mg/kg，期间观测小鼠体重变化并在第3天，第11天剪尾取血，测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的含量，第16天解剖小鼠，下腔静脉取血，分离血清，测定血清中的ALT活性。

结果显示：与川楝素作用组或agomir control组相比，miR-106b-5p agomir(即miR-106b高表达)组在10-12天时能显著升高小鼠的体重(图3)；且与生理盐水对照组相比，川楝素作用组或agomir control组在药物作用11天后，ALT的水平均显著上升，表明川楝素作用组及agomir control组小鼠出现肝损伤，而miR-106b-5p agomir(即miR-106b高表达)组ALT水平与生理盐水对照组相比无显著差异，但与川楝素作用组或agomir control组相比，差异显著(图4)，表明miR-106b能抑制川楝素引起的肝损伤，对小鼠肝脏产生保护作用。

另一方面，与川楝素作用组或antagomir control组相比，miR-106b-5pantagomir(即anti-miR-106b)组在9-16天时能显著降低小鼠体重(图5)；且与生理盐水对照组相比，川楝素作用组、antagomir control组或anti-miR-106b组在药物作用11天后，ALT的水平均显著上升，且与川楝素作用组或antagomir control组相比，anti-miR-106b组的ALT值升高更为显著(图6)；药物作用16天后，与对照组相比，仅anti-miR-106b组的ALT值有显著升高，表明miR-106b是适应性反应中的关键分子，拮抗miR-106b能加重川楝素引起的小鼠肝损伤，抑制肝损伤修复。

实施例4 miR-106b在临床其他肝损伤中的表达情况

检索GEO数据库中的涉及肝损伤及microRNA表达谱的数据，进一步分析miR-106b在临床其他肝损伤中的表达情况。根据GSE33857数据(Series Accession：GSE33857，miRNAanalysis is useful to diagnosis of liver disease,and evaluation of the gradeof liver disease.)中存储的外泌体microRNA表达谱数据，进一步分析外泌体miR-106b在正常人(n＝11)、临床慢性丙型肝炎(n＝8)、慢性乙型肝炎(n＝4)和非酒精性脂肪性肝炎(n＝5)的肝损伤病人中的表达情况。

结果如图7所示，与正常人相比，在慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎和非酒精性脂肪性肝炎造成的肝损伤病人中，外泌体miR-106b表达值均显著降低，表明其表达情况能作用诊断肝损伤的生物标志物。

序列表

<110> 浙江大学

<120> microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物以及诊断肝损伤的产品中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

taaagtgctg acagtgcaga t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tgtaaacatc cttgactgga ag 22

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

uaaagugcug acagugcaga u 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aucugcacug ucagcacuuu a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cagtgcaggg tccgaggtat 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tgctgacagt gcagataagt cgt 23

Claims

1.microRNA-106b在制备防治肝损伤的药物中的应用；

所述的肝损伤为药物性肝损伤；所述的防治肝损伤的药物包含促进microRNA -106b表达或增强microRNA-106b功能的试剂。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为microRNA-106b的激动剂。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-106b为microRNA-106b-5p。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物性肝损伤为川楝素造成的肝损伤。