JP2014513722A - メトトレキサートを用いる免疫寛容の誘導 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年5月16日出願、米国仮特許出願第61/486,697号の優先権を主張し、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本発明の方法は、種々の生物学的治療(例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質および代謝物などの生物製剤を用いる治療)における望ましくない免疫学的応答(例えばADA応答ならびに他の望ましくないTおよび/またはB細胞性免疫応答)を制御できる。タンパク質治療は、治療剤がペプチドおよびタンパク質を含むタンパク質性物質である治療を意味する。タンパク質治療薬は、例えば酵素、サイトカイン、増殖因子、免疫調節物質、血栓溶解剤、抗体(ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む)、抗体断片または改変抗体(例えばFab、F(ab’)2、Fv、Fd、scFvおよびdAb)である場合がある。例えばファブリ病のためのFabrazyme(登録商標)(組換えヒトアルファ−ガラクトシダーゼ)、ゴーシェ病のためのCerezyme(登録商標)(イミグルセラーゼ)、ムコ多糖症I(MPS I)のためのAldurazyme(登録商標)(ラロニダーゼ)ならびにポンペ病のためのMyozyme(登録商標)およびLumizyme(登録商標)(アルグルコシダーゼアルファ)を含む多数の酵素補充治療がある種の遺伝子疾患を有する患者のために開発されている。抗体治療薬の例は、Campath(登録商標)(アレムツズマブ)、Thymoglobulin(登録商標)、Avastin(登録商標)(ベバシズマブ)、Lucentis(登録商標)(ラニビズマブ)、Remicade(登録商標)(インフリキシマブ)、Humira(登録商標)(アダリムマブ)、Rituxan(登録商標)(リツキシマブ)、Tysabri(登録商標)(ナタリズマブ)、Simulect(登録商標)(バシリキシマブ)、Zenapax(登録商標)(ダクリズマブ)、OKT3(登録商標)(ムロモナブ−CD3)、Erbitux(登録商標)(セツキシマブ)、Mylotarg(登録商標)(ゲムツズマブ)、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)、およびBenlysta(登録商標)(ベリムマブ)を含む。他のタンパク質治療薬の例は、Enbrel(登録商標)(エタネルセプト)および他の融合タンパク質を含む。
本発明の方法は、腎移植、肝臓移植、心臓移植および幹細胞移植などの組織移植を受けている患者において免疫寛容を誘導するためにも用いられうる。宿主対移植片および移植片対宿主拒絶は、組織移植、特に同種移植片および異種移植片移植においてしばしば生じる。メトトレキサート単一サイクルは、抗移植片抗体応答を管理するために単独でまたは別の免疫調節剤(例えばThymoglobulin(登録商標)などの免疫抑制剤)と共に用いられうる。追加的に移植でのThymoglobulin(登録商標)とメトトレキサートとの組合せは、移植片生着を延長するように作用できる。最終的に、Thymoglobulin(登録商標)が関節リウマチおよび多発性硬化症などの慢性自己免疫疾患の設定で調査される場合、メトトレキサートはThymoglobulin(登録商標)のより安全な再処置を可能にでき、患者を顕著な抗ウサギ抗体(IgGおよび/もしくはIgMなど)ならびに/または注入関連反応の発症から保護する。
本発明者らは、メトトレキサートの1回の短いサイクルが、生物学的治療薬(例えばタンパク質治療薬)を受けている対象におけるADAなどの望ましくない免疫学的応答および組織移植を受けている患者における抗同種移植片応答を有意に低減できることを見出した。望ましくないADAを低減することは、患者の安全性を改善できるだけでなく、タンパク質治療薬の薬力学および/または薬物動態を改善することを通じてタンパク質治療薬の有効性も改善できる。
本発明の例示的適用は、多発性硬化症(MS)(再発寛解型MSなど)の処置におけるアレムツズマブ治療などのリンパ球除去治療を改善するためにメトトレキサートを使用することである。「リンパ球除去」は、循環リンパ球(例えばT細胞および/またはB細胞)の低減による免疫抑制の一種であり、リンパ球減少症をもたらす。治療では、リンパ球除去はThymoglobulin(登録商標)、ヒト化抗CD52モノクローナル抗体CAMPATH−1H(登録商標)(アレムツズマブ)およびリツキシマブなどのタンパク質治療薬によって達成されうる。リンパ球除去は、多発性硬化症(Colesら、Ann.Neurol.46、296〜304頁(1999);Colesら、2008)、関節リウマチ、脈管炎およびループスを含む多数の自己免疫状態の処置において望ましい。
正常メスC57BL/6マウス、6から12週齢をウサギ抗マウス胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体(mATG)のin vivo研究のために用い、Jackson Laboratories(Bar Harbor、ME)またはTaconic Laboratories(Hudson、NY)から得た。アレムツズマブ関連研究は、Charles River Laboratories/Genzyme Corp.から得たヒトCD52(huCD52)トランスジェニック(Tg)マウス、6〜12週齢を用いた。マウスを実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)に従い、American Association for Accreditation of Laboratory Animals Care I認証評価の下で収容および保持し、これらの研究で用いたすべての動物プロトコールは、Institutional Animals Care and Use Committeeによって認可された。
ポリクローナル抗体mATGおよびrbIgGをRuzekら、Transplantation、88(2):170〜9頁(2009)に記載のとおり調製し、実験に応じた種々のレジメンで腹腔内注射によって投与した。モノクローナル抗体アレムツズマブは、0.5mg/kgの1回注射または0.5mg/kg/日の3日もしくは5日のいずれかのサイクルのいずれかで静脈内に投与した。
組換えヒトアルグルコシダーゼアルファ(rhGAA、Genzyme Corp.によってMyozyme(登録商標)として販売)を製剤された薬物製品として用いた。異なる記載がなければ、マウスはrhGAA 20mg/kgで急速投与尾静脈注射によって毎週処置した。すべてのマウスは、rhGAA投与の前に腹腔内へのジフェンヒドラミン(Baxter Healthcare Corporation、Deerfield、IL)5から30mg/kgで予防的に処置された。対照動物は、滅菌0.9%生理食塩水またはrhGAA製剤用緩衝液のいずれかで静脈内処置された。
メトトレキサート(Calbiochem カタログ#454125)は、0.5、1.0、2.0または5mg/kgで腹腔内注射によって1〜3サイクル(各サイクルは実験に応じた3日、6日または7日連続の注射に相当する)投与した。毎月のmATG処置を含む研究では、メトトレキサートは、最初のmATG処置または最初の3回のmATG処置のいずれかの0、24および48時間後に5mg/kgで腹腔内へ投与した。mATGを0および4日目に投与する移植研究では、メトトレキサートを2mg/kgで0から6日目まで毎日、0.5mg/kgで0から6日目まで毎日、または0.5mg/kgで0から11日目まで毎日与えた。
ポリクローナル抗体mATGを腹腔内注射として5mg/kgを4週間ごとまたは移植設定の際は初回投与が移植の日(0日目)に与えられ、4日間隔で与えられる2回の20mg/kg投与として投与した。
脾細胞およびリンパ節細胞調製物に関して単一細胞懸濁物を採取したマウス脾臓または鼠径部および腸間膜のリンパ節からフロストスライドガラス間での均質化によって2%FCSを含有するPBS中に作製した。脾細胞調製のために赤血球を赤血球溶解溶液(BD Biosciences、San Diego、CA)での1〜2分間のインキュベーションによって溶解した。血液を後眼窩採血によって単離し、細胞調製を赤血球溶解溶液(BD Biosciences)で赤血球を20〜30分間溶解することによって実施した。すべての組織調製物について、生存細胞をViCell automated counter(Beckman Coulter、Fullerton、CA)を用いて数えた。単離後にすべての細胞調製物を下に記載するアッセイで用いる前にPBS/2%FCSで洗浄した。
異なる組織中の細胞集団の評価のために組織の単一細胞懸濁物を、抗マウスCD4、CD8、CD25、CD44、CD62L(すべての抗体はBD BiosciencesまたはeBioscience、San Diego、CA由来)を含んだ蛍光色素コンジュゲート抗体とインキュベートした。細胞内Foxp3発現分析を抗Foxp3製造者のプロトコール(eBiosciences、San Diego、CA)に従って実施した。抗体とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー(FACSCanto、BD BiosciencesおよびFCS Express software、De Novo Software、Los Angeles、CA)によって分析した。
総CD4 T細胞:CD4+CD8-、
総CD8 T細胞:CD8+CD4-、
CD4未処理細胞:CD4+CD25-CD62L+CD44-、
CD4メモリー細胞:CD4+CD25-CD62L-CD44+、
未処理CD8 T細胞:CD8+CD44-CD62L+、
CD8メモリー細胞:CD8+CD44+CD62L-、
制御性T細胞:CD4+CD25+Foxp3+、
総B細胞:CD19+、
B2/濾胞性B細胞:CD19+CD21intCD23hi、
B1B細胞:CD19+CD43+CD11b+、
移行性1B細胞:CD19+CD93+CD23-IgMhi、
移行性2B細胞:CD19+CD93+CD23+IgMhi、
移行性3B細胞:CD19+CD93+CD23+IgMlo、
辺縁帯B細胞:CD19+CD21hiCD23lo、および
B10B細胞:CD19+CD5+CD1d+。
マウス血清中の抗mATG IgGのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって分析した。簡潔には96ウエルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)を一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のウサギIgG 1μg/mlでコートした。Super Block Blocking Buffer(Thermo Scientific、Rockford、IL、USA)でのブロッキング後、血清の段階希釈物をウサギIgGコートプレートに2連で添加し、1時間、37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG二次抗体(Southern Biotechnology Associates、Birmingham、AL、USA)を添加し、1時間、37℃でインキュベートした。最終洗浄後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(BioFx、Owings Mills、MD、USA)を添加し、15分間、室温で発色させた。反応を1N HClの添加によって停止させ、吸光度値を450/650nmでELISAプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)で読み取った。エンドポイント力価は、平均が吸光度0.100(Softmax software(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を用いる)を超えた最低希釈と定義された。
マウス血清をELISAで決定した。簡潔には96ウエルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)を一晩、ヤギ抗ウサギIgG−Fc断片抗体(Bethyl Laboratories、TX、USA)1μg/mlでコートした。0.5%BSA(高純度)でのブロッキング後、標準対照および血清試料を必要に応じて希釈し、コートプレートのウエルに2連で添加し、1時間、36〜38℃で穏やかに振盪させてインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG−Fc断片抗体(Bethyl Laboratories、TX、USA)を適切に添加し、1時間、36〜38℃で穏やかに振盪させてインキュベートした。最終洗浄後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(BioFx、Owings Mills、MD、USA)を添加し、15分間、23〜25℃で発色させた。反応を1N HCLの添加によって停止させ、吸光度値を450/650nmでELISAプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)で読み取った。最終濃度は標準曲線を内挿された。本方法によるmATG特異的IgGの測定値は218,000を超える抗mATG IgGの力価によってわずかにだけ影響を受けることは予定された。
マウスは、アレムツズマブ処置の4〜6日後に採血し、特異的抗アレムツズマブIgGをELISAによって測定した。簡潔には96ウエルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)を一晩、PBS(pH7.2)中のアレムツズマブ3μg/mlでコートした。PBS中の0.1%BSAでのブロッキング後、血清の段階希釈物を、アレムツズマブコートプレートに2連で添加し、1時間、37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG二次抗体(Southern Biotechnology Associates、Birmingham、AL、USA)を添加し、1時間、37℃でインキュベートした。最終洗浄後、TMB基質(BioFx、Owings Mills、MD、USA)を添加し、15分間、室温で発色させた。反応を1N HClの添加によって停止させ、吸光度値を450/650nmでELISAプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)で読み取った。エンドポイント力価は、Excel software(Microsoft、Redmond、WA、USA)を用いて0.2の吸光度値で内挿された対数的に変換した試料希釈の真数と定義された。
マウスは、rhGAA処置の4〜6日後に採血し、特異的IgGをELISAによって測定した。簡潔には96ウエルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)を一晩、酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中のrhGAA 5μg/mlでコートした。PBS中の0.1%BSAでのブロッキング後、血清の段階希釈物を、rhGAAコートプレートに2連で添加し、1時間、37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG二次抗体(Southern Biotechnology Associates、Birmingham、AL)を添加し、1時間、37℃でインキュベートした。最終洗浄後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(TMB、KPL、Gaithersburg、MD)を添加し、15分間、室温で発色させた。反応を1N HClの添加によって停止させ、吸光度値を450/650nmでELISAプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)で読み取った。エンドポイント力価は、Softmax software(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いて0.2の吸光度値をもたらした試料希釈の逆数と定義された。
C57BL/6(Jackson Laboratories)またはE4GAAKO(Charles River)マウス、8〜12週齢にメトトレキサート(Calbiochem カタログ#454125)5mg/kgを腹腔内注射で1〜3サイクル(単一サイクルは3日連続注射に相当する)与えた。Myozyme(登録商標)(Genzyme Corporation)20mg/kgを尾静脈注射で1回または毎週投与2〜6回で最初のメトトレキサート投与と共に開始して与えた。動物は処置開始後毎週または毎日屠殺した。脾臓、腸間膜および鼠径リンパ節をTおよびB細胞サブセットのフローサイトメトリー分析のために収集し、血清をELISAアッセイのために収集した。脾臓をスライドガラスの間で処理し、赤血球(RBC)を溶解緩衝液(BD Biosciences(カタログ#555899)から購入)で製造者の説明書に従って溶解した。リンパ節をスライドガラスの間で処理し、2%ウシ胎児血清(FCS)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。細胞を4%ウシ胎児血清および総マウスIgG 25μg/mLを含有するPBS 200μLに再懸濁し、30分間、4℃でブロッキングした。脾臓細胞およそ300万個およびリンパ節細胞100万個をさまざまな抗体カクテルで染色し、Becton Dickinson CANTOIIフローサイトメーターのハイスループットサンプラー(HTS)で分析した。細胞事象少なくとも100,000個をリンパ球ゲート内で取得した。抗マウス抗体カクテルは、PE−CD21/35 カタログ#552957、FITC− カタログ#553138、PE−CD138 カタログ#553714、PE−CD127 カタログ#552543、APC−Cy7−CD19 カタログ#557655、FITC−CD43 カタログ#553270、PE−Cy7−CD4 カタログ#552775、FITC−CD3e カタログ#553062、APC−CD11b カタログ#553312、PE−Cy7−IgM カタログ#552867、APC−Cy7−CD8 カタログ#557654、PE−CD273(PD−L2) カタログ#557796、APC−CD138 カタログ#558626、PE−Cy7−CD11b カタログ#552850、PE−CD93(初期B系列)カタログ#558039、APC−CD69 カタログ#560689、Pe−Cy7−CD24 カタログ#560536、FITC−CD1d カタログ#553845、APC−CD5 カタログ#550035およびPercp−Cy5−7AAD カタログ#559925からなり、すべてBD Pharmingenから購入した。FITC−FoxP3 intracellular staining kitはeBioscienceから購入した。Pacific Blue(PB)−CD25 カタログ#102022、PB−CD23 カタログ#101616およびPB−CD86 カタログ#105022はBioLegendから購入した。リンパ球サブセットの分析は、De Novo Softwareから供給されるFCS express version 3 softwareで実施した。割合はバッチ処理オプションで作成し、絶対数は得られた細胞計数により算出した。脾臓およびリンパ節細胞計数はBeckman Coulter Vi−cell XR cell viability analyzerで製造者の説明書に従って得た。
C57BL/6(Jackson Laboratories)またはE4GAAKO(Charles River)マウス、8〜12週齢にメトトレキサート(Calbiochem カタログ#454125)5mg/kgを腹腔内注射、単一サイクル(3日連続投与)でrhGAA 20mg/kgでの処置と共に開始して与えた。1D11研究用に動物を1D11または13C4(Genzyme Corporation)のいずれかの5mg/kgの腹腔内注射で1週間に3回、隔日でrhGAAおよびメトトレキサート処置と共に開始して処置した。動物はrhGAA開始後マウス株に応じて6または7日目に屠殺した。脾臓を単一細胞懸濁物に調製し、製造者の説明書に従ってRoboSep(STEMCELL technologies)装置に装填し、B細胞ネガティブ選択に供した。精製B細胞を96ウエル丸底プレート(Costar カタログ#3799)に1ウエルあたり細胞500,000個で播種し、無刺激でまたはLPS(Sigma カタログ#L5014)10μg/mLと共に48時間、37℃でインキュベートした。製造者の説明書に従ってすべてのウエルにMonensin(BD Bioscience カタログ#554724)を供与した。細胞を少なくとも4時間、37℃でインキュベートした。試料をV底ウエル(USA Scientific カタログ#651201)に移し、1200rpmで、5分間、4℃で回転させた。細胞を4%ウシ胎児血清および総マウスIgG 25μg/mlを含有するPBS 200μLに再懸濁し、30分間、4℃でブロッキングした。プレートを再度回転させ、上に記載の抗体カクテル10μlを添加したPBS/2%FCS 90μLに再懸濁し、20分間(染色手順の最後の10分間に7AAD 5μLを添加して)、4℃でインキュベートした。試料への緩衝液100μLの添加とその後の回転は、洗浄として用いた。試料はタンパク質の表面分析および即時取得のために緩衝液に再懸濁する、またはIL−10(BioLegend カタログ#505008)、TGF−ベータ(BioLegend カタログ#141404)およびFoxP3(eBioscience カタログ#11−5773−82)の細胞内染色のために、製造者の説明書に従ってFix/Perm(eBioscience カタログ#11−5773)に再懸濁することができた。追加的表面染色は、TGF−ベータおよびTim−1(BioLegend カタログ#119506)抗体を含んだ。すべての試料は上に記載のとおり取得し、分析した。
C57BL/6およびBALB/cマウスはCharles River(Kingston、NYまたはRaleigh、NC)から得て、これらの実験に8から13週齢の間で用いた。ドナー同種C57BL/6マウスをKetamine(Fort Dodge Animal Health/Pfizer、Fort Dodge、IA)およびXylazine(Lloyd、Shenandoah、IA)の腹腔内注射で最初に麻酔し、胸骨正中切開を実施した。ドナー心臓を、上大静脈および肺静脈を結紮および分割する前に、in situで下大静脈および大動脈を通じて冷却ヘパリン処置乳酸リンゲル溶液(Baxter Healthcare、Deerfield、IL)1mlでゆっくり灌流した。次いで上行大動脈および肺動脈を切除し、移植片をドナーから取り出し、心臓を移植まで氷冷生理食塩水中で保存した。レシピエントマウス(Balb/c)を同様に麻酔し、ドナーマウスについて(腹腔を開いたこと以外は)上に記載したとおり準備した。開いた腹腔を見るために外科用顕微鏡を用い、腹部大動脈(AA)および下大静脈(IVC)を単離した。ドナー心臓をレシピエント腹部に(逆さまに)置き、移植片を、ドナー肺動脈とレシピエント下大静脈の間、同様にドナーの大動脈とレシピエントの腹部大動脈の間を端側吻合で血行再建した。止血を確認後、腹筋をrunning 5−O Vicryl suture(Ethicon、Johnson & Johnson、Somerville、NJ)で閉じ、皮膚をrunning 5−0 Ethilon suture(Ethicon)で閉じた。標準的な術後痛評価および管理を実施した。移植片は、触診によって最初の30日間、1週間に5〜7回、次いで研究の終了まで1週間に3〜4回評価した。
心臓移植片を10%中性緩衝ホルマリン中で固定し、右および左心室ならびに流出路を曝すために縦軸に沿って二分し、パラフィン包埋のためにルーチン的に処理した。切片を5ミクロンで切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)またはマッソントリクロームで染色した。連続切片も下に記載のとおり免疫染色した。各H&E染色切片を同種移植片拒絶病態(例えば脈管炎、心筋変性および壊死、心筋炎)の種々の特性について組織学的グレーディングスキームを用いて定性的に評価した。
血清同種抗体レベルを心臓移植または正常マウス由来の血清を1:50希釈でSV40形質転換C57BL/6線維芽細胞株(SVB6)とインキュベートし、続いてFITCウサギ抗マウスIgG(Dako、Carpinteria、CA)を用いて線維芽細胞結合抗体(同種抗体)を検出することによっておよびフローサイトメトリー分析によって決定した。実験間の同種抗体レベルを標準化するために血清染色線維芽細胞の幾何平均蛍光強度をアイソタイプ対照染色線維芽細胞で割った。血清抗体の同種線維芽細胞への結合は、同じ血清試料がSV40形質転換BALB/c線維芽細胞株(SVBalb)に結合しないこと(データ未記載)から明確に同種抗体であった。
C57BL/6マウスはJackson Laboratoriesから得て、特定病原体不在の条件下に収容した。対照マウスにはrhGAA 20mg/kg静脈内注射1回を与えた。寛容化マウスには、3日連続のメトトレキサート0.5mgの腹腔内注射に加えてrhGAA 20mg/kg静脈内注射1回を与えた。脾臓を最初のrhGAA注射の6日後に両ドナー群から採取し、プールされた単一細胞懸濁物中に処理した。細胞を洗浄し、0.22μMフィルターを通して濾過した。次いで細胞をStemCell Technologies RoboSep細胞分離システムを用いてB細胞を濃縮し、200μl静脈内注射を可能にするように再懸濁した。寛容化および非寛容化レシピエント群は、高細胞濃度10×106または低細胞濃度5×106のいずれかを静脈内注射を介して受けた。対照群にはrhGAAのみまたはrhGAAおよびメトトレキサート(3日連続MTX注射の単一サイクル)を与えた。すべての群は、毎週のrhGAA 20mg/kg静脈内注射を受け、16週間、隔週でBD Vacutainer血清分離チューブに後眼窩採血された。血清を取り出しELISAでの使用まで−20℃未満で保存した。抗rhGAA抗体力価をELISAを用いて決定し、SpectraMax M2で読み取り、力価値を外挿するためにSoftmaxを用いて算出した。対照および力価情報を含む生データSoftmaxファイルおよびEXCEL集計表をネットワークサーバーに保存した。すべてのグラフおよび統計はGraphPad Prism softwareを用いて作成した。
抗薬物抗体は抗体治療薬に応答して産生される
ポリクローナル抗体mATGは、抗原提示細胞を含む種々の免疫細胞型に結合した。本発明者らのデータは、mATGの1回コース(3日間隔で与える25mg/kgの2回投与、腹腔内投与)がマウスで100,000(図1A)もの高い抗mATG IgG力価を生じうることを示した。連続する毎月注射(5mg/kg、4週間ごと)として与えられる場合、抗mATG力価はさらに増大し、5回の毎月注射後に最大5×106の力価で
あった(図1B)。1回コースおよび毎月注射の両方についてウサギIgG(rbIgG)を対照として用いた。
メトトレキサートは単一サイクルの投与で抗mATG IgG応答を制御する
Thymoglobulin(登録商標)処置後に上昇した抗体力価が報告されており、血清病、急性腎不全および心臓血管反応の症例報告がThymoglobulin(登録商標)で処置した患者について記載された(Boothpurら、上記;Lundquistら、Liver Transpl、13(5):647〜50頁(2007);Busaniら、Minerva Anestesiol、72(4):243〜8頁(2006);Tanrioverら、Transplantation、80(2):279〜81頁(2005);Buchlerら、Clin Transplant、17(6):539〜45頁(2003))。メトトレキサートが抗mATG応答を低減できるか、したがってこれらの安全性の懸念を軽減できるかを決定するために、メトトレキサート単一サイクルとしてのみ与える3日間レジメンをマウスでの抗mATG IgG応答を制御する手段として評価した。これは、ERTのコンテクストにおいて与えられた少なくとも3サイクルと対立するものとして、メトトレキサート単一サイクルのみがmATGと共に投与された以前公表されたレジメンとは区別された。2回のmATG投与(25mg/kg、3日間隔)の最初に開始して5mg/kg、6日連続で腹腔内に投与されたメトトレキサート(Calbiochem カタログ#454125)は、抗mATG IgG応答を処置後少なくとも8週間にわたって95%(効果曲線下面積を比較して)抑制できた(図3)。
メトトレキサートは免疫寛容の活性機構を誘導する
上に示したとおり、メトトレキサートの非常に短期のコースは、複数ラウンドの抗原負荷にわたって抗体応答を有意に制御できた。このコンテクストにおいて短期のサイクルは、検査の数カ月間にわたって(抗体力価およびサイトカインレベルの両方に)持続的な効果を作り出したメトトレキサート単一サイクルであった。この長期間の抗体応答制御は、メトトレキサートが免疫寛容を誘導すること成功したことを示唆した。これまでのところ、メトトレキサートを、mATGの5カ月連続投与のコンテクストにおいて評価した。免疫寛容機構が活性化されたかどうかをさらに評価するために、5回の毎月mATG注射を当初に受けた動物の処置を8週間保留した。この休息期間後に動物にmATGの最終注射を与えた。免疫寛容の機構が用いられた場合、抗mATG IgG力価は6回目のmATG処置後に有意には増大しないはずであった。
メトトレキサート単一サイクルは、抗アレムツズマブ応答を有意に制御できる
再発寛解型多発性硬化症では、アレムツズマブが年サイクルで投与され、患者はADAを生じる場合があった(Colesら、N Engl J Med、359(17):1786〜801頁(2008))。免疫原性および薬物動態検査は複数の第III相研究で進行中であることから、抗アレムツズマブ抗体が患者のサブセットで曝露、有効性および/または安全性に強い影響を与えるかどうかは不明確であった。したがって本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルがアレムツズマブの5回の毎月1回注射サイクル後にADA力価を制御できるかどうかを評価した。HuCD52 Tgマウスにアレムツズマブ(0.5mg/kg)を静脈内へ毎月、5カ月連続で与えた。メトトレキサートを0.5、1または5mg/kgでアレムツズマブの毎月投与の最初の15分前ならびに投与の24および48時間後に与えた。メトトレキサート1mg/kgは、抗アレムツズマブ応答を88%低減したことから、いくらかの利益を提供した(図7A)。メトトレキサート5mg/kgは抗アレムツズマブIgG応答を99%低減するのに成功した(図7A)。メトトレキサートは、自然寛容には効果を有さないと考えられた。
メトトレキサートは、臨床的に関連するアレムツズマブ投与レジメンのコンテクストにおいて抗アレムツズマブ抗体応答を制御できる
アレムツズマブの臨床的に関連する投与スキームのコンテクストにおいてメトトレキサートがADAを制御するのに成功できるかどうかをhuCD52 Tgマウスで評価するために一連の実験を実施した。臨床では、アレムツズマブは12mg/日の毎日処置5回の初回サイクルとして投与された。患者での初回処置サイクルの12カ月後、アレムツズマブ12mg毎日投与3回の追加的サイクルを投与した。2回目処置サイクルの時点で、循環CD19+B細胞のレベルはベースライン値に回復した;しかし、循環CD4+ヘルパーT細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞のレベルは完全には復活しなかった(Colesら、N Engl J Med、359(17):1786〜801頁(2008))。
メトトレキサートはmATGの薬物動態および薬力学を改善できる
ADAは、タンパク質治療薬の薬物動態および薬力学を妨害する場合があった。本発明者らは、抗mATG IgG ADA応答がmATG薬物動態を妨害するかどうかを評価した。マウスをmATG単独またはメトトレキサート単一サイクルを伴うmATGのいずれかの5カ月間毎月注射で処置した。メトトレキサートは5mg/kgの毎日投与3回で投与した。循環mATGのレベルをアッセイするために1カ月目、3カ月目および5カ月目の後の種々の時期に血液をサンプリングした(図10)。
メトトレキサートは、アレムツズマブの薬力学を改善できる
メトトレキサートは、mATGの薬力学を増強するだけでなく、抗アレムツズマブ応答が除去活性の一部を中和すると考えられる場合に、循環TおよびB細胞のアレムツズマブ介在除去も復元させた。本実施例において記載される研究では、アレムツズマブの毎月静脈内注射5回をメトトレキサートを伴ってまたは伴わずにhuCD52 Tgマウスに与えた。メトトレキサート5mg/kgを6カ月研究の最初の3日間毎日投与した。両処置群の動物からアレムツズマブの5回目投与の2日前および5回目投与の1日後に血液を採取した。細胞集団をフローサイトメトリーで実施例6に記載のとおり評価した。
メトトレキサート単一サイクルは、抗rhGAA抗体応答を有意に制御できる
本発明者らは、rhGAA酵素補充治療におけるメトトレキサートの効果も研究した。この研究では、動物にrhGAAを12週間連続で毎週注射し、次いで4週間休息させ、次いで16週目にrhGAAで再負荷した。動物に1週目にメトトレキサート5mg/kgの3日連続投与の単一サイクルまたは1、2および3週目それぞれに単一サイクル(合計3サイクル)も与えた。rhGAA特異的IgG力価を0(すべての処置前)、6、8、12、16、18および20週目に動物で測定した。本発明者らのデータは、メトトレキサート単一サイクルが抗rhGAA応答を3サイクルレジメンと同様に少なくとも20週間にわたって制御したことを示した(図15)。
メトトレキサートは心臓同種移植のmATG介在生着を増強する
正常マウスにおいてメトトレキサートがmATGの有効性を増強できるかどうかを評価することに加えて、本発明者らは移植設定においてmATG機能がメトトレキサートによって増大されうるかどうかを調査した。Thymoglobulin(登録商標)が臨床的に移植生着を延長するための誘導治療として用いられることから、本発明者らはマウス同種心臓移植モデルにおいてメトトレキサートの追加がmATGの有効性を増大できるかどうかを評価した。mATG 20mg/kgを0および4日目に投与し、メトトレキサート2mg/kgを0〜6日目に処置の単一サイクルとして投与した。
メトトレキサート誘導寛容の機構はメトトレキサートの現在公知であり、認められた機能とは異なる
上の実施例で記載されたメトトレキサートの投与レジメンは、以前記載されたものとは異なる機構を引き起こすと考えられた。メトトレキサートは、増殖細胞の死を誘導することによってその抑制効果を介在すると考えられている葉酸アンタゴニストであった。上に提示したmATGデータは、メトトレキサート処置動物で抗体応答は誘導されるが、各連続するmATG処置では有意に低下したままであることを実証した。これらのデータは、B細胞応答が積極的に管理されたことを示唆した。理論に束縛されることを意図せず、本発明者らは、メトトレキサートがこれらの応答をそれらが生じた際に制御する制御性細胞集団(複数可)を誘導できるとの仮説を立てた。本発明者らは、Myozyme(登録商標)およびメトトレキサートで処置した動物での種々の脾臓BおよびT細胞サブセットへのメトトレキサート処置の効果をMyozyme(登録商標)単独で処置した動物と比較して調査した。本発明者らは、Myozyme(登録商標)処置7および8日後(メトトレキサート処置4および5日後;図19)にB10制御性B細胞集団における有意な増加を観察した。
メトトレキサートはmATGとの組合せで選択されたB細胞集団を増加させる
上の実施例では各mATG処置後に、mATG単独で処置したマウスならびにmATGおよびメトトレキサートで処置したマウスの両方においてADA力価は増大し、両セットの動物が抗体応答に寄与できるB細胞を含有したことを示唆した(図6)。それが真実であるとすると、少なくとも2つの仮説を描くことができた。最初の仮説は、メトトレキサートがMyozyme(登録商標)に応答できる大部分のB細胞を殺した可能性があり、残った少数がこのわずかな応答の原因であるとすることであった。これは可能ではあるが、複数の実験からのフローサイトメトリーデータは、Myozyme(登録商標)およびメトトレキサート処置後にB細胞集団の減少を示していなかった。第2の仮説は、Myozyme(登録商標)に応答できるB細胞集団がメトトレキサートのこの短期のコースでは殺されずに残り、Myozyme(登録商標)への各曝露後に制御性細胞によって制御されるとすることであった。これまでのところ、表現型データは、メトトレキサートおよびMyozyme(登録商標)での処置後のB細胞サブセットの増強を記載した。これらのB細胞の表現型は、動物研究においておよび寛容移植患者において記載された制御性B細胞サブセットに類似していると考えられた。したがって本発明者らは、この第2の仮説を異なる処置のコンテクストにおいて検討しようとした。
メトトレキサートは、アレムツズマブとの組合せで選択されたB細胞集団を増加させる 実施例4に記載のとおり、huCD52トランスジェニックマウスをアレムツズマブ0.5mg/kgの毎月投与で5カ月間を1回、アレムツズマブの初回投与に関連するメトトレキサート5mg/kg/日の毎日投与3回を伴ってまたは伴わずに処置した。細胞集団をアレムツズマブの5回目投与の2日前ならびに1、7および/または28日後のマウスの血液および脾臓においてフローサイトメトリーによって評価した。
サイトカインレベルへのメトトレキサートの効果
サイトカインは、B細胞応答において2つの役割を演じた。例えばB細胞活性化サイトカインIL−6およびBAFFは、B細胞分化のためにも必要であった。メトトレキサートが、B細胞集団を増加させると考えられることから、これらのサイトカインが増加することが予想できた。しかしIL−6は炎症促進性でもあり、したがって上昇したレベルはメトトレキサート誘導効果を妨害する可能性があった。IL−6と同様に、IL−10は、血漿細胞へのB細胞の分化および免疫抑制にも関与した。
アレムツズマブ関連二次自己免疫の処置におけるメトトレキサートの役割
アレムツズマブ処置多発性硬化症患者は、二次自己免疫を発症する場合があった。アレムツズマブ処置後に発症する最も一般的な自己免疫障害は、甲状腺自己免疫に関するものであった。追加的に免疫性血小板減少性紫斑病およびグッドパスチャー症候群もアレムツズマブで処置した多発性硬化症患者において観察された。3種すべての自己免疫は、B細胞応答および自己抗体が疾患発症および病態に直接結び付くことからB細胞性であった。アレムツズマブ処置とこれらの二次疾患の発症との関連は、十分に理解されていなかった。
メトトレキサートは、制御性B細胞集団の特異的誘導を通じて免疫寛容を誘導する
本発明者らのデータは、メトトレキサートが、他者らによって示唆された(Messingerら、Genetics in Medicine 14:135〜142頁(2012)およびLacanaら、Am J Med Genet Part C Semin Med Genet 160C:30〜39頁(2012))増殖細胞を殺す予想された手段によってではなく、TGF−ベータ、IL−10およびFoxP3を発現する制御性B細胞集団の特異的誘導を通じて免疫寛容を誘導することを驚くべきことに示した。メトトレキサート単一サイクルによってMyozyme(登録商標)に対して寛容化されたマウス由来のB細胞は免疫寛容を未処理動物に移入すると考えられた。さらに、IL−10およびTGF−ベータの両方がメトトレキサート誘導免疫寛容のために必要であると考えられた。いくつかの細胞サブセットでは、メトトレキサートがTGF−ベータを誘導し、これが次にIL−10およびFoxP3を誘導するとも考えられた。この機構は新規かつ予想外であり、メトトレキサート3サイクル、Rituximab(登録商標)(B細胞除去剤)および場合により静脈内免疫グロブリン(IVIG)での同時処置を含む現在の臨床免疫寛容プロトコールの価値を問題にした(Messingerら、上記)。この組合せ処置は十分であると考えられるが、本発明者らのデータは、1)メトトレキサート単一サイクルは、現在観察されたものよりもさらに低いADA力価を生じる可能性があること、および2)過剰量のメトトレキサートおよびリツキシマブが投与された場合、免疫寛容は保持されない可能性があることを示唆した。リツキシマブの初回用量は、リツキシマブ介在B細胞除去が血液および組織中のすべてのB細胞を包括的に除去するとは考えられていないことから過剰に有害ではない可能性があった。本明細書に記載の研究で見られたとおり、アレムツズマブはB10B細胞を積極的に除去するが、メトトレキサートでの処置はメトトレキサートの最初のサイクル後何カ月間もアレムツズマブ寛容の保持を補助すると考えられるこれらの細胞になお接触できる。さらにリツキシマブ処置には、(本明細書で示すとおり)免疫寛容を誘導および介在するようにメトトレキサートによって影響されると考えられる移行性B細胞提示の増加がすぐに続いた。これらの機構のデータが反直感的および予想外であったことから、低用量のメトトレキサート単一サイクルは(とりわけ)リンパ球除去タンパク質治療に対する免疫寛容を誘導する驚くべき有効な方法であった。
メトトレキサートは移植片病態を改善する
本発明者らは、メトトレキサートが正常動物(図52)および移植動物(図53)においてCD4+、CD8+、T制御性(CD4+CD25+FoxP3+)T細胞および総CD19+B細胞を除去しないことを実証する、マウス抗胸腺細胞グロブリンのコンテクストにおける追加的データも作成した。非特異的ウサギIgG単独またはメトトレキサートとの組合せで処置した正常動物を比較すると、血液および脾臓中の細胞集団に有意な変化はなかった(図52)。さらに、mATG単独で、またはmATGおよびメトトレキサートで処置した動物から単離したこれらの集団を比較しても増強された除去はなかった。むしろ本発明者らは、メトトレキサートによって増加したmATG曝露による可能性が最も高いmATG介在CD4+、CD8+および制御性T細胞効果の伸展だけを観察した(図52)。追加的に、同種移植を受けた動物でのメトトレキサート処置単独は、これらの特定の細胞サブセットを除去しなかった(図53)。mATG単独で処置された動物と比較したmATGおよびメトトレキサートで処置された動物におけるCD4+およびCD8+T細胞の数の低下は、メトトレキサート処置のコンテクストにおける場合mATGの延長された効果によって説明できた。重要なことに、メトトレキサートが正常または移植動物のいずれかにおける抗体応答を低減するように活性化B細胞を殺す場合予想されていたようには、メトトレキサートはB細胞の減少を誘導しなかった(図52および53)。これらのデータは、抗薬物抗体へのメトトレキサートの効果が活性化B細胞の抗葉酸誘導除去によって介在されない可能性があることを示唆した。予想されたとおり、この異所性心臓同種移植片モデルにおいてmATG処置も総B細胞数に強い影響を与えなかった。総合的に、mATGとメトトレキサートとの組合せ処置は、移植片拒絶病態の重症度を弱め、移植片へのT細胞浸潤の減少と関連したが、制御性T細胞表現型を有する細胞の増加には関連しなかった。これは、Myozyme(登録商標)およびアレムツズマブのコンテクストにおいて作成された結果と一致した。
Claims (53)
- 治療薬での処置の必要がある対象において免疫寛容を誘導する方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を単一サイクルで投与し、それにより対象において治療薬に対する免疫寛容を誘導することを含む上記方法。
- タンパク質治療薬での処置の必要がある対象においてその治療薬に対する抗体応答を阻害する方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を単一サイクルで投与し、それにより対象においてその治療薬に対する抗体応答を阻害することを含む上記方法。
- 治療薬での処置の必要がある対象において治療薬に対する輸注反応を軽減する方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象においてタンパク質治療薬に対する輸注反応を軽減することを含む上記方法。
- 治療薬での処置の必要がある自己免疫対象において二次自己免疫を低減する方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象において二次自己免疫を低減することを含む上記方法。
- 治療薬での処置の必要がある対象において治療薬の効能を増大させる方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象においてタンパク質治療薬の効能を増大させることを含む上記方法。
- 治療薬での処置の必要がある対象においてT細胞集団中の制御性T細胞の割合を増加させる方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより該対象において該割合を増加させることを含む上記方法。
- 治療薬はタンパク質治療薬である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体治療薬での処置の必要がある対象においてB細胞集団中の制御性B細胞の割合を増加させる方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより該対象において該割合を増加させることを含む上記方法。
- メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 対象において治療剤の薬物動態を延長する方法であって、治療剤の投与前または投与中または投与後に治療剤の薬物動態を延長する有効量でメトトレキサートを対象に投与することを含む上記方法。
- 対象はヒトである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 治療薬は抗体治療薬である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体治療薬はモノクローナル抗体治療薬である、請求項12に記載の方法。
- 抗体治療薬はリンパ球枯渇剤である、請求項12または13に記載の方法。
- 抗体治療薬はアレムツズマブである、請求項14に記載の方法。
- 対象は多発性硬化症患者である、請求項15に記載の方法。
- 抗体治療薬はポリクローナル抗体治療薬である、請求項12に記載の方法。
- 抗体治療薬はポリクローナルウサギ抗胸腺細胞グロブリン抗体である、請求項17に記載の方法。
- 対象は、臓器移植の必要があり、再生不良性貧血に罹患し、および/または移植片対宿主病に罹患している、もしくはそのリスクがあるヒト患者である、請求項18に記載の方法。
- 治療薬は酵素である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素はヒトアルファ−ガラクトシダーゼAである、請求項21に記載の方法
- 酵素はヒト酸性アルファ−グルコシダーゼである、請求項22に記載の方法。
- 有効量は0.1mg/kgから5mg/kgである、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- メトトレキサート単一サイクルは、1日のメトトレキサート投与または2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11日連続のメトトレキサート投与からなる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- メトトレキサート単一サイクルは治療薬処置開始の48時間前から48時間後の間に投与される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- その必要があるヒト患者においてリンパ球を枯渇させる方法であって、
患者をリンパ球枯渇剤で処置する工程、および
リンパ球枯渇剤での処置前または処置中または処置後にリンパ球枯渇剤に対する免疫寛容を患者において誘導する有効量でメトトレキサートを患者に投与する工程、
を含む上記方法。 - メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される、請求項26に記載の方法。
- リンパ球枯渇剤はモノクローナル抗体治療薬である、請求項26または27に記載の方法。
- リンパ球枯渇剤はポリクローナル抗体治療薬である、請求項26または27に記載の方法。
- モノクローナル抗体治療薬はアレムツズマブである、請求項28に記載の方法。
- モノクローナル抗体治療薬はリツキシマブである、請求項28に記載の方法。
- 患者は多発性硬化症患者である、請求項26〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 患者は再発寛解型多発性硬化症に罹患している、請求項32に記載の方法。
- ポリクローナル抗体治療薬は抗胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体である、請求項29に記載の方法。
- 組織移植の必要がある対象において免疫寛容を誘導する方法であって、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象において移植された組織に対する免疫寛容を誘導することを含む上記方法。
- メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される、請求項35に記載の方法。
- 移植された組織は腎臓組織または心臓組織である、請求項35または36に記載の方法。
- 対象は免疫調節のための別の薬剤の投与も受ける、請求項37に記載の方法。
- 免疫調節のための薬剤は免疫抑制剤である、請求項38に記載の方法。
- 免疫調節のための薬剤はポリクローナル抗胸腺細胞グロブリン抗体である、請求項38に記載の方法。
- 治療薬または組織移植の必要がある対象においてT細胞応答を阻害する方法であって、治療薬または組織移植で対象を処置する前、同時または後に対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象においてT細胞応答を阻害することを含む上記方法。
- メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される、請求項41に記載の方法。
- 治療薬はタンパク質治療薬である、請求項41または42に記載の方法。
- タンパク質治療薬は抗体治療薬である、請求項43に記載の方法。
- 抗体治療薬はモノクローナル抗体治療薬である、請求項44に記載の方法。
- 抗体治療薬はリンパ球枯渇剤である、請求項44または45に記載の方法。
- 抗体治療薬はアレムツズマブである、請求項46に記載の方法。
- 対象は多発性硬化症患者である、請求項47に記載の方法。
- 抗体治療薬はポリクローナル抗体治療薬である、請求項44に記載の方法。
- ポリクローナル抗体治療薬はポリクローナルウサギ抗胸腺細胞グロブリン抗体である、請求項49に記載の方法。
- 移植された組織は腎臓組織または心臓組織である、請求項43に記載の方法。
- 対象は免疫調節のための別の薬剤の投与も受ける、請求項51に記載の方法。
- 免疫調節のための薬剤は免疫抑制剤である、請求項52に記載の方法。
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