KR102316283B1 - 메토트렉세이트를 이용한 면역 관용의 유도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메토트렉세이트 처리를 이용하는 것에 의해 환자에서 항-약물 항체(ADA) 반응 및 다른 T- 및/또는 B-세포-중개의 면역 반응과 같은 원치 않는 면역 반응을 감소시키기 위한 방법을 제공한다.

Description

메토트렉세이트를 이용한 면역 관용의 유도{INDUCTION OF IMMUNE TOLERANCE BY USING METHOTREXATE}

본 출원은 그 개시가 전체로서 본원에 참고로 포함되는 2011. 5. 16.자 출원된 미국 가출원번호 61/486,697로부터 우선권을 주장한다.

본 발명은, 일반적으로 면역학에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 환자에서 원치 않는 면역 반응을 감소시키기 위한 메토트렉세이트의 용도에 관한 것이다.

최근, 미국 식품의약청(FDA)은 130 가지 이상의 단백질 치료제를 임상적 용도로서 승인하였다(Leader et al., Nat Rev Drug Discov, 7(1):21-39 (2008)). 이들 치료제에는 펩티드, 재조합 인간 단백질, 단백질 백신, 다양한 동물 종으로부터 유도된 다클론 항체 제제 및 단클론 항체가 포함된다. 내인성 자기-항원에 대한 이들의 서열 및 구조 상동성, 글리코실화 상태, 용량 수준, 투여 경로, 국재화, 그리고 제조 공정-관련 특성에 따라, 치료제 단백질은 환자에서 항체 반응을 이끌어낼 수 있다(Schellekens, Nat Rev Drug Discov, 1(6):457-62 (2002); Zinkernagel, Semin Immunol, 12(3):163-71 (2000), discussion 257-344; Thorland et al., Haemophilia, 5(2):101-5 (1999); Goodeve, Blood Coagul Fibrinolysis, 14 Suppl 1:S17-21 (2003)). 이들 반응은 항-약물 항체(ADA, anti-drug antibody) 반응이라고 불리우며, 때때로 환자의 안전성 및 약물 효능에 영향을 줄 수 있다.

리소좀 축적 장애인 폼페 병(Pompe disease)의 경우, ADA는 재조합 인간 산 알파-글루코시다제에 대한 효소-보충 요법(ERT, enzyme-replacement therapy)에서 생길 수 있다. 측정 가능한 양의 내인성 효소를 발현하지 않는 환자에서, 지속적 수준의 높은 항체 역가는 환자 거부와 관련된다(CRIM-폼페 환자)(Kishnani et al., Mol Genet Metab., 99(1):26-33 (2010); Hunley et al., Pediatrics, 114(4):e532-5 (2004); Amalfitano et al., Genet Med, 3(2): 132-8 (2001)). 약물 안전성과 효능에 있어서 유사한 타협이 인자 IX에 대한 ADA가 생긴 혈우병 환자에서 관찰되었다(Thorland et al., Haemophilia, 5(2):101-5 (1999); Ewenstein et al., Blood, 89(3):1115-6 (1997)). 희귀한 예로서, ADA는 재조합 인간 에리스로포이에틴의 경우에서와 같이 자가면역 질환을 유발할 수도 있다(Schellekens, Clin Ther, 24(11):1720-40 (2002), discussion 1719; Locatelli et al., Perit Dial Int, 27 Suppl 2:S303-7 (2007)).

ADA 반응은 또한 치료제가 비-인간 유래이거나, 인간화 또는 완전히 인간적인지 여부와 무관하게 항체 치료제에서 유발될 수도 있다. 단클론 및 다클론 항체 치료제 모두의 면역원성은 환자 안전성 및 약물 효능에 영향을 줄 수 있다. 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 리툭시맙(rituximab) 및 나탈리주맙(natalizumab)과 같은 치료제 단클론 항체에 대하여 생긴 항체는 치료제 항체의 감소된 혈청 농도 및 효능과 관련된다(Bendtzen et al., Arthritis Rheum, 54(12):3782-9 (2006); Schmidt et al., Clin Immunol, 132(3):334-41 (2009); Bartelds et al., Ann Rheum Dis, 66(7):921-6 (2007); Baert et al., N Engl J Med, 348(7):601-8 (2003); Tahir et al., Rheumatology (Oxford), 44(4):561-2 (2005); Maini et al., Arthritis Rheum, 41(9):1552-63 (1998)). 알러지 반응은 항-인플릭시맙 항체와 관련된다(Baert et al., N Engl J Med, 348(7):601-8 (2003)). 주입-관련된 과민성 반응은 나탈리주맙으로 치료 받은 재발-경감 다발성 경화증 환자에서 적은 비율로 관찰된다(Phillips et al., Neurology, 67(9):1717-8 (2006)).

알렘투주맙(alemtuzumab)은 재발-경감 다발성 경화증 환자에서 ADA를 생성시킬 수 있는 또 다른 항체 치료제이다(Coles et al., N Engl J Med, 2008. 359(17):1786-801 (2008)). 알렘투주맙은 면역 세포에서 발현되는 세포 표면 항원인 CD52와 상호작용하는 림프구-고갈성 단클론 항체이다. 알렘투주맙은 재발-경감 다발성 경화증을 치료하기 위한 말기 임상적 시도이고 류마티스성 관절염에서도 평가되었다. 일군의 연구자들은 항-알렘투주맙 항체가 단일 용량 단계적 증가 연구에서 치료 받은 류마티스성 관절염 환자의 63%에서 생긴 것을 보여주었다(Weinblatt et al., Arthritis Rheum, 1995. 38(11):1589-94 (1995)). 이 연구에서, 알렘투주맙의 효능은 ADA의 존재에 의해 변화되는 것으로 보였다(Id.).

다클론 항체 치료제인 Thymoglobulin®또한 소규모 환자 집단에서 유해한 ADA와 관련된다. 혈청병, 급성 신부전 및 심혈관계 반응이 Thymoglobulin® - 치료를 받은 이식 수용자에서 관찰되었다(Boothpur et al., Am J Kidney Dis., 55(1):141-3 (2009); Lundquist et al., Liver Transpl, 13(5):647-50 (2007); Busani et al., Minerva Anestesiol, 72(4):243-8 (2006); Tanriover et al., Transplantation, 80(2):279-81 (2005); Buchler et al., Clin Transplant, 17(6):539-45 (2003)).

연구자들은 ADA의 유해한 효과를 최소화하기 위한 방법을 발견하고자 시도하여왔다. 단백질 치료제에서 ADA를 감소시키고 면역 관용을 유도하기 위한 능력이 시험된 수단에는, 예를 들어 비-고갈성 항-CD4 항체(Cobbold et al., Semin Immunol, 2(6):377-87 (1990); Winsor-Hines et al., J Immunol, 173(7): 4715-23 (2004)), 알렘투주맙의 비-세포-결합성 최소 변이체(Gilliland et al., J Immunol, 162(6):3663-71 (1999); Somerfield et al., J Immunol., 185(1):763-8 (2010)), 면역억제 치료제(Bennett et al., Blood, 106(10):3343-7 (2005); Dickson et al., J Clin Invest, 118(8):2868-76 (2008)), 인자 VIII에 결합하는 포스파티딜이소시톨-함유 지질 입자(Peng et al., AAPS. J., 12(3):473-81 (2010)), 그리고 아데노-관련 바이러스 감염을 통한 재조합 산 알파-글루코시다제의 간-특이적 투여(Sun et al., Am J Human Genet, 81(5):1042-9 (2007); Sun et al., Mol Ther 18(2):353-60 (2009); Ziegler et al., Hum Gene Ther, 19(6):609-21 (2008))가 포함된다.

그러나, 단백질 치료제 및 다른 세팅에서 원치 않는 항체 반응을 감소시키기 위한 개선된 방법을 개발할 필요성이 남아있다.

본 발명은 치료제로 치료가 필요한 대상에서 면역 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 단일 사이클로 투여하고, 이에 의해 대상에서 치료제에 대한 면역 관용을 유도한다.

본 발명은 또한 치료제로 치료가 필요한 대상에서 치료제에 대한 항체 반응을 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 단일 사이클로 투여하고, 이에 의해 대상에서 치료제에 대한 항체 반응을 저해한다.

본 발명은 또한 치료제로 치료가 필요한 대상에서 치료제에 대한 주입 반응을 완화시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 대상에서 단백질 치료제에 대한 주입 반응을 완화시킨다.

본 발명은 또한 치료제로 치료가 필요한 자가면역 대상에서 2차 자가면역성을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 대상에서 2차 자가면역성을 감소시킨다.

본 발명은 또한 치료제로 치료가 필요한 대상에서 치료제의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 대상에서 단백질 치료제의 효능을 증가시킨다.

본 발명은 또한 림프구-고갈 요법, 예를 들어 알렘투주맙 요법 또는 Thymoglobulin®요법으로 치료 받는 대상에서 T 세포 집단의 T 조절 세포의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 상기 대상에서 상기 비율을 증가시킨다.

본 발명은 또한 항체 치료제와 같은 단백질 치료제의 치료가 필요한 대상에서 B 세포 집단의 B 조절 세포의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 상기 대상에서 상기 비율을 증가시킨다. 일부 실시예에서는, 유효량의 메토트렉세이트가 단일 사이클로 투여된다. 관련된 실시예에서, 본 발명은 유효량의 메토트렉세이트를 단일 사이클로 투여하는 것을 포함하는, 단백질 치료제의 치료가 필요한 대상에서 TGF-베타, IL-10- 및/또는 FoxP3-발현 B 세포를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 대상에서 치료제의 약물동력학을 연장시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 치료제의 투여 전 또는 도중 또는 후에 대상에게 메토트렉세이트를 유효량으로 투여하여 치료제의 약물동력학을 연장시킨다.

본 발명은 또한 필요로 하는 인간 대상에서 림프구를 고갈시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 환자를 림프구-고갈성 약제로 처리하고, 림프구-고갈성 약제의 처리 전 또는 도중 또는 후에, 환자에서 림프구-고갈성 약제에 대한 면역 관용을 유도하거나 2차 자가면역성을 감소시키기 위한 유효량으로 환자에게 메토트렉세이트를 투여한다. 일부 실시예에서는, 유효량의 메토트렉세이트가 단일 사이클로 투여된다. 일부 실시예에서, 림프구-고갈성 약제는 단클론 항체 치료제(예를 들어, 알렘투주맙 또는 리툭시맙)일 수 있다. 이들 일부 실시예에서, 환자는 다발성 경화증 환자(예를 들어, 재발-경감 다발성 경화증 환자)일 수 있다. 일부 실시예에서, 림프구-고갈성 약제는 다클론 항체 치료제(예를 들어, 항-흉선세포 글로불린 다클론 항체)일 수 있다.

본 발명은 또한 조직 이식이 필요한 대상에서 면역 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 대상에서 이식된 조직에 대한 면역 관용을 유도한다. 일부 실시예에서는, 유효량의 메토트렉세이트가 단일 사이클로 투여된다. 일부 실시예에서, 이식된 조직은 신장 조직 또는 심장 조직일 수 있다. 일부 실시예에서, 대상은 또한 다클론 항-흉선세포 글로불린 항체와 같은 면역-조절(예를 들어, 면역억제)를 위한 약제를 받는다.

본 발명은 또한 치료제 또는 조직 이식이 필요한 대상에서 T 세포 반응을 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 치료제 또는 조직 이식으로 환자를 처리하기 전, 동시 또는 후에 대상에게 유효량의 메토트렉세이트를 투여하고, 이에 의해 대상에서 T 세포 반응을 저해한다.

본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 치료제는 단백질 치료제이다.

본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 치료제는 항체 치료제이다. 예를 들어, 항체 치료제는 단클론 항체 치료제 및/또는 림프구-고갈성 약제(예를 들어, 알렘투주맙), 또는 다클론 항체 치료제(예를 들어, 다클론 토끼 항-흉선세포 글로불린 항체)일 수 있다. 항체 치료제가 알렘투주맙인 다른 실시예에서, 대상은 다발성 경화증 환자일 수 있다. 항체 치료제가 다클론 토끼 항-흉선세포 글로불린 항체인 다른 실시예에서, 대상은 기관 이식이 필요하고, 재생불량성 빈혈이고/이거나 이식편대숙주병을 갖거나 가질 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. 본 발명의 방법의 다른 실시예에서, 치료제는 효소이다. 예를 들어, 효소는 인간 알파-갈락토시다제 A 또는 인간 산 알파-글루코시다제일 수 있다.

본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 대상은 인간이다.

본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 메토트렉세이트의 유효량은 0.1 ㎎/㎏내지 5 ㎎/㎏일 수 있다. 일부 실시예에서, 메토트렉세이트의 단일 사이클은 1일의 메토트렉세이트 투여, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 연속일의 메토트렉세이트 투여로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 메토트렉세이트의 단일 사이클은 치료제 처리의 개시 48 시간 전 내지 48 시간 후 사이에 투여될 수 있다.

이하의 각 도면에서, 별표 또는 별은 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05; **, p ≤ 0.001; ***, p ≤ 0.0001).
도 1a 및 1B는 토끼 항-뮤린 흉선세포 글로불린 다클론 항체 mATG의 단일 또는 복수 코스에 대한 항-토끼 IgG 반응을 보여준다. 평균 항-토끼 IgG 역가를 측정하였고, 토끼 IgG(rbIgG) 단독으로 처리한 마우스가 대조군으로 사용되었다. 도 1a는 8 주 기간에 걸친 단일 코스의 mATG에 대한 반응을 보여준다. 도 1b는 20 주 기간에 걸친 복수 코스의 mATG에 대한 반응을 보여준다. 화살표는 mATG 또는 rbIgG가 투여된 시점을 나타낸다.
도 2는 알렘투주맙으로 5회의 매달 처리 후 평균 알렘투주맙-특이적 IgG 역가를 보여준다. 화살표는 알렘투주맙이 투여된 시점을 나타낸다.
도 3은 단일 코스의 mATG 이후 메토트렉세이트(MTX)에 의한 항-mATG IgG 반응의 억제를 보여준다. 마우스는 mATG 단독, rbIgG 단독, 또는 mATG와 메토트렉세이트로 처리되었다.
도 4a 내지 4C는 mATG로 5회의 매달 처리 코스 동안 항-토끼 IgG 반응에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 화살표는 mATG 또는 메토트렉세이트를 투여한 시점을 나타낸다. 도 4a는 3 사이클의 메토트렉세이트가 평균 항-토끼 IgG 역가를 유의성 있게 감소시키는 것을 보여준다. 도 4b는 3 사이클의 단일 코스의 메토트렉세이트가 평균 항-토끼 IgG 역가를 유의성 있게 감소시키는 것을 보여준다. 도 4c는 mATG 단독, mATG 및 단일 사이클의 메토트렉세이트, 또는 mATG 및 3 사이클의 메토트렉세이트로 처리한 마우스의 평균 항-토끼 IgG 역가를 비교한다. 단일 사이클의 메토트렉세이트는 3 사이클의 메토트렉세이트 보다 더욱 유의성 있게 항-토끼 IgG 역가를 감소시킨다.
도 5는 mATG 처리하였지만 메토트렉세이트는 처리하지 않는 마우스와 비교하여, 메토트렉세이트-처리한 마우스에서(단일 및 복수의 메토트렉세이트 사이클) mATG 재-시도 이후 평균 항-토끼 IgG 역가가 감소되는 것을 보여준다. 화살표는 mATG 또는 메토트렉세이트를 투여한 시점을 나타낸다.
도 6은 mATG 및 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리한 마우스에서 평균 항-토끼 IgG 역가가 mATG 단독 투여된 마우스의 경우 보다 100배 낮은 것을 보여준다. 화살표는 mATG 또는 메토트렉세이트가 투여된 시점을 나타낸다.
도 7a 내지 7C는 메토트렉세이트가 huCD52 Tg 마우스에서 평균 항-알렘투주맙 IgG 역가를 감소시킬 수 있는 것을 보여준다. 도 7a: 메토트렉세이트를 0.5 ㎎/㎏ 처리하거나 또는 메토트렉세이트 처리하지 않은 마우스 보다 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트를 단일 사이클로 처리한 마우스에서 항-알렘투주맙 역가가 더 낮다. 마우스는 알렘투주맙 단독, 또는 알렘투주맙 및 단일 사이클의 메토트렉세이트를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏으로 처리하였다. 도 7b: 항-알렘투주맙 역가를 시험하기 위한 연구 디자인. 역가 데이터는 별로 표시된 것과 같이 5 번째 알렘투주맙 투여 24 시간 후에 측정하였다. 도 7c: 메토트렉세이트는 5 번째 알렘투주맙 투여 24 시간 후 알렘투주맙 단독으로 처리된 마우스와 비교하여, 알렘투주맙과 메토트렉세이트로 처리한 마우스에서 항-알렘투주맙 항체 역가를 감소시켰다.
도 8a 내지 8D는 5 회의 1일 용량 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 처리한 마우스에서 순환하는 T 세포의 절대 세포수/전혈 ㎕를 보여준다. 도 8a는 총 T 세포(CD3⁺)가 2, 3 및 4 주 처리 후 감소된 것을 보여준다. 도 8b는 총 B 세포(CD19⁺)가 3 주 처리 후 감소된 것을 보여준다. 도 8c는 T 헬퍼 세포(CD4⁺)가 2, 3 및 4 주 처리 후 감소된 것을 보여주고, 도 8d는 세포독성 T 세포(CD8⁺)가 2, 3 및 4 주 처리 후 감소된 것을 보여준다.
도 9a 및 9B는 알렘투주맙-특이적 IgG 반응을 보여준다. 도 9a는 3 사이클의 알렘투주맙 0.5 ㎎/㎏ 처리, 그리고 1 사이클의 메토트렉세이트 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏ 처리 이후의 반응을 보여준다. 첫 번째 사이클의 알렘투주맙 처리는 5 연속일 투여로 구성되었고, 그리고 두 번째 및 세 번째 사이클은 각각 3 연속일 투여로 구성되었다. 도 9b는 14 주에서 각 동물 그룹 당 항-알렘투주맙 IgG 역가를 보여준다.
도 10은 단일 사이클의 메토트렉세이트 5 ㎎/㎏이 5 회의 매달 mATG 투여로 처리한 마우스에서 순환하는 mATG 농도를 회복시키는 것을 보여준다.
도 11은 5 회의 매달 처리 mATG 및 단일 사이클의 메토트렉세이트 처리한 마우스는 mATG의 5 번째 투여 이후 혈액 중 mATG-중개된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 고갈이 증진된 것을 보여준다. 이들 데이터는 2 개의 실험으로부터 모은 것이다.
도 12a 및 12B는 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리한 마우스가 5 번째 매달 mATG 처리 이후 T 조절(CD25⁺Foxp3⁺) 세포의 증가된 비율을 나타내는 것을 보여준다. 마우스는 mATG 단독 5 회의 매달 처리, 또는 mATG 및 단일 사이클의 메토트렉세이트 5 회의 매달 처리, 또는 mATG 및 3 사이클의 메토트렉세이트 5 회의 매달 처리로 처리되었다. 도 12a는 비장에서 T 조절 세포 농도를 보여준다. 도 12b는 혈액에서 T 조절 세포 농도를 보여준다.
도 13a는 10,000 보다 큰 항-토끼 IgG 역가는 mATG의 약물동력학에 간섭할 수 있음을 보여준다. 도 13b는 100,000 보다 큰 항-토끼 역가는 CD4 및 CD8 세포 고갈에 간섭할 수 있음을 보여준다. 전처리 대조군의 %는 mATG 처리 전 이들의 상응하는 농도와 비교한 CD4 및 CD8 역가의 백분율을 의미한다.
도 14는 메토트렉세이트 5 ㎎/㎏으로 처리한 마우스는 알렘투주맙 5 번째 매달 투여 이후 순환하는 CD3⁺ T 세포 및 CD19⁺ B 세포의 증진된 알렘투주맙 고갈을 나타내는 것을 보여준다. 마우스는 연구 첫 번째 3 일 동안 알렘투주맙 단독, 또는 알렘투주맙과 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리되었다. 별표는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05; ***, p ≤ 0.0001).
도 15a는 16-주 연구에서 단일 사이클의 메토트렉세이트가 처리 동안, 그리고 최종 rhGAA 처리 4 주 후에도 재조합 인간 알파-글루코시다제(rhGAA)-특이적 IgG 역가를 감소시킬 수 있음을 보여준다. 화살표는 rhGAA 및 메토트렉세이트가 투여된 시점을 나타낸다. 마우스는 rhGAA 단독, 또는 rhGAA 및 단일 사이클의 메토트렉세이트, 또는 rhGAA 및 3 사이클의 메토트렉세이트로 처리하였다. 도 15b는 6-주 연구에서 단일 사이클의 메토트렉세이트가 rhGAA-특이적 IgG 역가를 감소시키는 것을 보여준다. 도 15c는 18 주 연구에서 단일 사이클의 메토트렉세이트가 rhGAA-특이적 IgG 역가를 감소시키는 것을 보여준다.
도 16a는 뮤린 동종 심장 이식 모델에서 mATG와 함께 투여하였을 때, mATG 단독 투여와 비교하여 메토트렉세이트가 항-토끼 IgG 역가를 저하시키는 것을 보여준다. 도 16b는 뮤린 동종 심장 이식 모델에서 메토트렉세이트가 순환하는 mATG의 농도를 증가시키는 것을 보여준다. 마우스는 식염수, mATG 단독, 또는 mATG 및 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리하였다. mATG는 연구 0일 및 4일에 20 ㎎/㎏으로 투여하였고, 한편 2 ㎎/㎏의 메토트렉세이트는 연구 0 내지 6일에 투여하였다.
도 17은 mATG와 메토트렉세이트의 조합 처리가 수용자 마우스로 이식된 동종 심장의 생존을 연장시키는 것을 나타내는 카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meier plot)을 보여준다. 마우스는 비처리되거나, 또는 연구 0일 및 4일에 20 ㎎/㎏의 mATG 단독으로, 또는 연구 0 내지 6일에 2 ㎎/㎏의 메토트렉세이트 단독으로, 또는 연구 0 내지 6일에 mATG 및 2 ㎎/㎏의 메토트렉세이트 둘 다로, 또는 0 내지 6일 또는 0-11일에 mATG 및 0.5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트 둘 다로 처리되었다.
도 18은 메토트렉세이트 단독 또는 mATG와 조합된 메토트렉세이트로 처리한 동종 심장 이식된 마우스가 항-동종이식편 항체 반응의 감소를 경험한 것을 보여준다. 도 18a는 21일에 동종 섬유아세포에 대한 수용자 IgG 결합을 보여준다. 도 18b는 표시된 처리와 함께 공통 유전자 이식(Syn Tx) 또는 동종 이식(Allo Tx)을 받은 마우스에서 21일의 동종항체 농도를 보여준다. 동종 섬유아세포에 대한 각각의 수용자 마우스 혈청 IgG의 결합을 보여주고 미염색된 섬유아세포에 대한 평균 형광 강도(MFI)의 비율로서 표시된다. 도 18c는 비처리, mATG, 메토트렉세이트, 또는 mATG와 메토트렉세이트를 받은 마우스에서 21일의 동종항체 농도를 보여준다. 동종항체 농도는 메토트렉세이트 또는 mATG와 메토트렉세이트로 처리된 마우스에서 유의성 있게 낮았다(각각 p=0.0008 및 p<0.0001).
도 19는 B10 조절 B 세포가 메토트렉세이트 처리 후에 유의성 있게 증가된 것을 보여준다. 마우스는 rhGAA 단독 또는 rhGAA 및 단일 3-일 사이클의 메토트렉세이트 또는 식염수로 처리하였다. 세포수는 연구 7일 및 8일에 계수되었다.
도 20은 활성화된 B 세포 서브집단이 rhGAA 단독으로 처리된 것과 비교하여, rhGAA 및 단일 3-일 사이클의 메토트렉세이트로 처리된 후 6 일에 유의성 있게 증가된 것을 보여준다. CD86+ 전이성 2 B 세포, CD86+ 전이성 3 B 세포, CD86+ 난포성 B 세포, 및 CD86+ 변연대 B 세포의 절대 세포수는 연구 6 일에 계수하였다. 별표는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05; **, p ≤ 0.001).
도 21은 활성화된 변연대 B 세포, 활성화된 난포성 B 세포, 및 활성화된 전이성 3 B 세포와 같은 활성화된 비장 B 세포 서브집단에서 세포 수는, rhGAA 단독 처리와 비교하여 rhGAA 및 메토트렉세이트의 처리 이후에도 증진된 상태로 유지된 것을 보여준다. 화살표는 rhGAA 및 메토트렉세이트 처리를 나타낸다. rhGAA는 1 일 및 8 일에 투여하였다. 메토트렉세이트는 1, 2 및 3 일, 그리고 8, 9 및 10 일에 투여하였다. 유의성 있는 차이는 별로 표시되었다(*, p < 0.05). 8 및 9 일에는 데이터가 보이지 않는다(수직 점선으로 표시).
도 22는 활성화된 T 헬퍼 세포, 활성화된 T 세포독성 세포, 및 활성화된 T 조절 세포와 같은 활성화된 비장 T 세포 집단은, rhGAA 단독 처리와 비교하여 rhGAA 및 메토트렉세이트의 처리 이후에 크게 변화되지 않은 상태로 유지된 것을 보여준다. 화살표는 rhGAA 및 메토트렉세이트 처리를 나타낸다. rhGAA는 1 일 및 8 일에 투여되었다. 메토트렉세이트는 1, 2 및 3 일, 그리고 8, 9 및 10 일에 투여되었다. 유의성 있는 차이는 별로 표시되었다(*, p < 0.05). 8 및 9일에는 데이터가 보이지 않는다(수직 점선으로 표시).
도 23은 mATG와 조합된 메토트렉세이트 처리를 조사하기 위한 6 개월의 연구 디자인을 보여준다. 완전한 화살표는 5 ㎎/㎏ mATG 주사를 나타내고, 파선 화살표는 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트 주사를 나타내고, 그리고 점선 화살표는 말기 희생 처리를 나타낸다.
도 24a 및 24B는 mATG와 조합된 단일 사이클의 메토트렉세이트가, mATG 단독 또는 3 사이클의 메토트렉세이트와 비교하여 비장 B 세포를 강화시키는 것을 보여준다. 도 24a: 활성화된 난포성 B 세포; 도 24b: 활성화된 전이성 3 B 세포.
도 25a 및 25B는 혈액에서 알렘투주맙의 약력학에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 마우스는 알렘투주맙의 첫 번째 투여와 관련하여 3 회의 매일 용량 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이, 5 개월 동안 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙으로 처리되었다. 도 25a: 메토트렉세이트는 알렘투주맙(AZM)에 의한 총 T 세포(CD3⁺), T 헬퍼 세포(CD4⁺), 및 T 조절 세포(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)의 고갈을 증진시킨다. 흑색 막대는 알렘투주맙 단독 처리된 마우스에서의 측정을 나타내고, 백색 막대는 알렘투주맙과 메토트렉세이트로 처리된 마우스에서의 측정을 나타낸다. 도 25b: 메토트렉세이트는 알렘투주맙에 의한 B 세포의 고갈을 증진시킨다. 별은 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05).
도 26은 비장에서 알렘투주맙의 약력학에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 마우스는 알렘투주맙의 첫 번째 투여와 관련하여 3 회의 매일 용량 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이, 5 개월 동안 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙으로 처리되었다. T 세포는 5 번째 알렘투주맙의 처리 다음에 고갈된다. CD8 CEN: CD8⁺ 중심 기억 T 세포; CD8 EFF MEM: CD8⁺ 반응기 기억 T 세포; CD4 CEN MEM: CD4⁺ 중심 기억 T 세포; CD4 EFF MEM: CD4⁺ 반응기 기억 T 세포. 별은 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05).
도 27a 및 27B는 비장에서 B 세포수에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 마우스는 알렘투주맙의 첫 번째 투여와 관련하여 3 회의 매일 용량 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이, 5 개월 동안 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙으로 처리되었다. 별은 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05).
도 28a 및 28B는 알렘투주맙의 단일 투여 3 일 후 비장 림프구의 고갈을 보여준다. 도 28a: T 세포 및 B 세포는 유의성 있게 고갈되었다. 작은 체크무늬는 PBS-처리된 대조군 마우스를 나타내고, 큰 체크무늬는 알렘투주맙-처리된 마우스를 나타낸다. 도 28b: B 세포(CD 19⁺)는 처리 24 시간 후 92% 고갈되고, 처리 3일 후에는 36% 고갈된 상태로 유지되었다. 3 개 그래프는 다른 그룹의 동물을 나타내며, 각각 다른 시점에 채혈하였다. 별은 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05; **, p ≤ 0.001; ***, p ≤ 0.0001).
도 29a 및 29B는 사이토카인 농도에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 도 29a는 비장과 림프절에서 사이토카인 농도를 평가하기 위한 6개월 연구에 대한 연구 디자인을 보여준다. 별은 5 번째 알렘투주맙 처리 24 시간 후 데이터를 수집한 것을 나타낸다. 화살표는 나타낸 바와 같이, 알렘투주맙 또는 메토트렉세이트가 투여되거나, 말기 희생처리가 실시된 시점을 나타낸다. 도 29b는 알렘투주맙 단독으로, 또는 알렘투주맙과 메토트렉세이트를 함께 처리한 마우스에서 TNF 패밀리(BAFF)에 속하는 B 세포 활성화 인자의 농도를 보여준다.
도 30a 및 30B는 알렘투주맙 및 메토트렉세이트로 처리 후 사이토카인 농도를 보여준다. 도 30a는 4 개월 연구를 위한 연구 디자인을 보여준다. 별은 메토트렉세이트의 두 번째 사이클 일 주 후 데이터가 수집된 것을 나타낸다. 화살표는 나타낸 바와 같이, 알렘투주맙 또는 메토트렉세이트가 투여되거나, 말기 희생처리가 실시된 시점을 나타낸다. 도 30b는 알렘투주맙(AZM) 단독 또는 0.5 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 또는 2.0 ㎎/㎏의 메토트렉세이트와 함께 처리된 마우스에서 다양한 사이토카인의 농도를 보여준다.
도 31은 IL10 -/- (녹아웃) 및 C57BL/6 마우스에서 항-rhGAA 역가에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 20 ㎎/㎏의 rhGAA를 IL10 -/- 녹아웃 마우스 및 C57BL/6 야생형 마우스에서 rhGAA의 첫 번째 3 회의 매주 처리 0, 24 및 48 시간 후에 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이 9 주 동안 매주 투여하였다.
도 32는 알렘투주맙 처리 후 1 및/또는 2 주에 전부는 아니지만 일부 B 세포 집단이 고갈된 것을 보여준다. 작은 해치 막대는 인산염 완충 식염수(PBS) 처리된 huCD52 형질전환 대조군 마우스를 나타내고; 큰 해치 막대는 5 연속일 동안 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙 처리된 huCD52 형질전환 마우스를 나타낸다. 별표는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05; **, p ≤ 0.001; ***, p ≤ 0.0001).
도 33은 알렘투주맙 처리와 관련하여 B 세포 집단에 대한 메토트렉세이트의 효과를 조사하기 위한 연구 디자인을 보여준다. 갑상선 및 림프절(LN)이 병리학적 평가를 위해 사용되었다. 화살표는 알렘투주맙 및 메토트렉세이트가 투여되거나, 말기 희생처리가 실시된 시점을 나타낸다.
도 34는 B 세포 집단의 고갈에 대한 3 회의 1 일 용량 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트 단독, 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙 단독, 그리고 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙과 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트의 조합의 효과를 보여준다. 별표는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다 (*, p < 0.05; **, p ≤ 0.001; ***, p ≤ 0.0001; ns, 유의성 없음).
도 35는 5 사이클의 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙 단독 또는 3 회의 1 일 용량 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트 단독 또는 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙과 5 ㎎/㎏/일 메토트렉세이트의 조합으로 처리 후 B 세포 고갈에 대한 메토트렉세이트의 효과를 보여준다. 별표는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 측정치를 나타낸다(*, p < 0.05).
도 36은 사이토카인 MCP-1, IL-13, IL-6, 및 IL-12의 농도가 알렘투주맙 처리 첫날에 투여된 3 일 단일 사이클의 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트로 처리된 마우스에서 감소되는 것을 보여준다. 데이터는 5 번째 알렘투주맙 투여 24 시간 후, 메토트렉세이트 처리 4 개월 후 수집되었다.
도 37a 및 37B는 n/n 누드 마우스에서 2, 6 및 12 주의 rhGAA 역가를 보여준다. 도 37a는 2 및 6 주에서의 rhGAA 역가를 보여준다. 좌측에서 우측으로, 식염수 처리된 대조군 마우스, rhGAA 처리된 마우스, 그리고 rhGAA 및 메토트렉세이트로 처리된 마우스에서 2 주 측정, 이어서 식염수 처리된 대조군 마우스, rhGAA 처리된 마우스, 그리고 rhGAA 및 메토트렉세이트 처리된 마우스에서 6 주 측정. 도 37b는 좌측에서 우측으로 rhGAA 단독(Myo) 처리된 nu/nu 마우스, 메토트렉세이트와 rhGAA 처리된 nu/nu 마우스, rhGAA 단독 처리된 BL6 마우스, 그리고 메토트렉세이트와 rhGAA 처리된 BL6에서 12 주 측정을 보여준다.
도 38a 및 38B는 IL-10 발현 B10 B 세포의 수 및 비율이 메토트렉세이트로 rhGAA에 대해 관용된 마우스에서 증가하는 것을 보여준다. rhGAA 또는 rhGAA 및 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 분리된 B10 B 세포는 유동 세포분석법에 의해 IL-10 단백질 발현을 평가하였다.
도 39a 및 39B는 IL-10이 활성화된(CD86+) 및 비-활성화된(CD86-) B10 B 세포에서 발현되는 것을 보여준다. 도 39a는 CD86로 염색된 B10 B 세포의 FACS 플롯을 나타내고, 도 39b는 rhGAA 또는 rhGAA 및 메토트렉세이트 처리에 대한 반응에서 CD86⁺IL10⁺ B10 B 세포 및 CD86^-IL10⁺ B10 B 세포의 수를 나타낸다.
도 40a 및 40B는 rhGAA와 메토트렉세이트 처리가 B10 B 세포를 유도하여 이들의 TGF-베타의 발현을 증가시키는 것을 보여준다. 도 40a의 제 2 및 제 3 패널은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 TGF-베타 및 CD86으로 염색된 B10 B 세포를 보여주는 FACS 플롯이다. 도 40a의 제 1 패널은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 TGF-베타⁺ B10 B 세포의 수를 나타낸다. 도 40b는 CD86⁺TGF-베타⁺ B10 B 세포 및 CD86^-TGF-베타⁺ B10 B 세포 수를 나타낸다.
도 41a는 B10 B 세포가 rhGAA로 처리된 동물에서 FoxP3를 발현하는 것으로 보이는 것을 나타낸다(도 41a). 도 41b는 FoxP3+ B 세포의 수가 메토트렉세이트와 rhGAA 둘 다의 처리로 증가하는 것을 나타낸다. 도 41c는 활성화된(CD86+) 및 비-활성화된(CD86-) B10 B 세포가 FoxP3를 발현하는 것을 나타낸다.
도 42a 내지 42C는 난포성, 전이성 2, 및 전이성 3 B 세포(위에서 아래로)가 IL-10을 발현하는 것과 IL-10-발현 B 세포 서브셋의 세포수가 rhGAA 단독 처리된 마우스와 비교하여 메토트렉세이트 처리로 증가하는 것을 보여준다.
도 43a 내지 43C는 난포성, 전이성 2, 및 전이성 3 B 세포(위에서 아래로)가 TGF-베타를 발현하는 것과 TGF-베타-발현 B 세포 서브셋의 세포수가 rhGAA 단독 처리된 마우스와 비교하여 메토트렉세이트 처리로 증가하는 것을 보여준다.
도 44a 내지 44C는 난포성, 전이성 2, 및 전이성 3 B 세포(위에서 아래로)가 FoxP3를 발현하는 것과 FoxP3-발현 B 세포 서브셋의 세포수가 rhGAA 단독 처리된 마우스와 비교하여 메토트렉세이트 처리로 증가하는 것을 보여준다.
도 45는 5 ㎎/㎏의 항-TGF-베타 항체(1D11, Genzyme) 또는 동형 대조군(13C4)의 존재 또는 부재시, rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리한 동물에서 6 주의 항-rhGAA 역가를 보여준다. 항체 역가는 4 개의 다른 그룹의 동물에서 격주로 평가하였다.
도 46a 내지 46C는 1D11 처리가 TGF-베타, IL-10, 또는 FoxP3를 발현하는 B10 B 세포의 메토트렉세이트-유도된 확장을 방해하는 것을 보여준다. 비장은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리되고, 또한 단일 rhGAA 처리 또는 단일 rhGAA와 메토트렉세이트 처리 7 일 후 1D11 또는 13C4 공동-투여된 동물로부터 분리하였다. 각각의 그룹에서 세포를 모아서 2 일 동안 배양한 다음 유동 세포분석법을 사용하여 계수하였다.
도 47a 내지 47C는, 비록 FoxP3+ 난포성 B 세포는 ID11 효과를 경험하지 않지만, 1D11 처리가 TGF-베타 또는 IL-10을 발현하는 난포성 B 세포의 메토트렉세이트-유도된 확장을 방해하는 것을 보여준다. 비장은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리되고, 또한 단일 rhGAA 처리 또는 단일 rhGAA와 메토트렉세이트 처리 7 일 후 1D11 또는 13C4 공동-투여된 동물로부터 분리하였다. 각각의 그룹에서 세포를 모아서 2 일 동안 배양한 다음 유동 세포분석법을 사용하여 계수하였다.
도 48a 내지 48C는 전이성 2 B 세포에서, 1D11 처리가 TGF-베타-발현 전이성 2 B 세포의 메토트렉세이트-유도된 확장을 방해하는 한편, IL-10+ 전이성 2 B 세포에는 어떠한 효과도 보이지 않는 것을 보여준다. 비장은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리되고, 또한 단일 rhGAA 처리 또는 단일 rhGAA와 메토트렉세이트 처리 7 일 후 1D11 또는 13C4 공동-투여된 동물로부터 분리하였다. 각각의 그룹에서 세포를 모아서 2 일 동안 배양한 다음 유동 세포분석법을 사용하여 계수하였다.
도 49a 내지 49C는 전이성 3 B 세포에서, 검출 가능한 TGF-베타, IL-10 및 FoxP3가 존재하지만, 이 세포에서 ID11 처리의 명백한 효과는 없는 것을 보여준다. 비장은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트로 처리되고, 또한 단일 rhGAA 처리 또는 단일 rhGAA와 메토트렉세이트 처리 7 일 후 1D11 또는 13C4 공동-투여된 동물로부터 분리하였으며, 세포는 유동 세포분석법을 사용하여 계수하였다.
도 50a 내지 50C는 1D11 처리가 난포성 B 세포, 전이성 2 B 세포, 및 전이성 3 B 세포(위에서 아래로)에서 IL-10, TGF-베타, 및 FoxP3의 기준 농도를 변화시키지 않는 것을 보여준다.
도 51a는 rhGAA(Myozyme® 또는 "MYO")에 대하여 관용된 마우스로부터 rhGAA-나이브 수용체 마우스로의 총 비장 B 세포의 전달을 보여주는 모식도이다. 전달 후, 수용자(rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트 중 하나로 처리된 비-전달된 대조군 동물과 함께)는 20 ㎎/㎏의 rhGAA로 매주 처리되었다.
도 51b는 rhGAA 및 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 분리된 총 비장 B 세포가 나이브 숙주에서 rhGAA에 대한 면역 관용을 전이시킬 수 있는 것을 나타내는 역가 분석을 보여준다.
도 52는 토끼 IgG(rbIgG), mATG 단독, rbIgG 및 메토트렉세이트, 또는 mATG 및 메토트렉세이트로 처리된 정상 마우스의 혈액 또는 비장으로부터의 세포 수를 나타낸다. 메토트렉세이트는 정상 동물에서 CD4+, CD8+, T 조절(CD4+CD25+FoxP3+) T 세포, 또는 총 CD19+ B 세포를 고갈시키지 않는다.
도 53은 이식 14일 후 rbIgG, mATG 단독, rbIgG 및 메토트렉세이트, 또는 mATG 및 메토트렉세이트로 처리된 이식 마우스의 혈액 또는 비장으로부터의 세포 수를 나타낸다. 메토트렉세이트는 이식 동물에서 CD4+, CD8+, T 조절(CD4+CD25+FoxP3+) T 세포, 및 총 CD19+ B 세포를 고갈시키지 않는다.
도 54는 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트 처리된 동물에서 이들 단백질의 평균 형광 강도(MFI)의 이동에 의해 보여지듯이, 메토트렉세이트 처리가 복수의 세포 서브셋에서 IL-10의 통계적으로 유의성 있는 증가를 유도하는 것을 보여준다.
도 55는 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트 처리된 동물에서 이들 단백질의 평균 형광 강도(MFI)의 이동에 의해 보여지듯이, 메토트렉세이트 처리가 복수의 세포 서브셋에서 TGF-베타의 통계적으로 유의성 있는 증가를 유도하는 것을 보여준다.
도 56은 rhGAA 또는 rhGAA와 메토트렉세이트 처리된 동물에서 이들 단백질의 평균 형광 강도(MFI)의 이동에 의해 보여지듯이, 메토트렉세이트 처리가 복수의 세포 서브셋에서 FoxP3의 통계적으로 유의성 있는 증가를 유도하는 것을 보여준다.

본 발명은 단일 사이클 또는 단기 코스의 메토트렉세이트 투여가 대체 효소 또는 치료제 항체와 같은 단백질 치료제를 받는 환자에서 원치 않는 면역 반응(예를 들어, ADA 반응, 및 다른 원치 않는 T- 및/또는 B-세포 중개의 면역 반응), 그리고 조직 이식에서 항-이식 항체 반응을 감소시킨다는 본 발명자들의 놀라운 발견을 기초로 한다. 이러한 발견은 단백질 요법 및 기관 이식의 안전성과 효능 둘 다를 증가시키기 위한 신규의 방법을 유도한다.

보다 구체적으로, 본 발명자들의 연구는 단일 사이클의 메토트렉세이트가 항체 치료제에 대한 ADA를 감소시키는 것을 보여준다. 이하에서 상세히 설명하는 바와 같이, 일련의 연구가 다클론 항체 치료제인 Thymoglobulin®의 뮤린 버전으로 실시되었다. Thymoglobulin®은 고형 기관 이식의 세팅, 재생불량성 빈혈 및 이식편대숙주병의 예방에서 면역 억제를 위해 사용되는 토끼 항-인간 흉선세포 글로불린 다클론 항체이다. 토끼 항-뮤린 흉선세포 글로불린 다클론 항체(mATG)가 개발되었다. 이는 Thymoglobulin®과 유사한 특성을 유지한다(Ruzek, et al., Transplantation, 88(2):170-9 (2009)). 본 발명자들은 단일 코스의 메토트렉세이트가 항-mATG IgG 역가를 >95% 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 사실, 놀랍게도 본 발명자들은 단일 사이클의 메토트렉세이트가 3 사이클의 메토트렉세이트 보다 ADA를 감소시키는 데 보다 양호하게 작용한다는 것을 발견하였다. 추가로, 이러한 ADA에 있어서의 감소는 순환하는 mATG의 농도를 유지하고 mATG-중개의 세포 고갈 및 반복적인 mATG 투여에서 T 조절 세포 비율을 증진시킨다. 본 발명자들의 다른 세트의 연구는 단클론 항체 치료제인 알렘투주맙에 대하여 실시되었다. 본 발명자들은 단일 코스의 메토트렉세이트가 항-알렘투주맙 반응을 유사하게 제어하고 알렘투주맙-중개의 림프구 고갈을 증진시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명자들은 이러한 메토트렉세이트의 단일 사이클 요법이 단백질 치료제가 효소인 ADA도 감소시키는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 두 가지 연구에서, 본 발명자들은 원래 복수의 사이클이 ADA를 감소시키기 위해 요구되는 것으로 생각되었던 항-Myozyme® (재조합 인간 알글루코시다제 알파 또는 "rhGAA") 반응을 단일 사이클의 메토트렉세이트가 효과적으로 제어할 수 있다는 것을 보여주었다.

본 발명자들은 메토트렉세이트가 기관 이식에도 유용하다는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 단일 사이클의 메토트렉세이트가 심장 동종 이식에서 항-동종이식 항체 반응을 제어할 수 있다는 것을 발견하였다. mATG와 조합될 때, 심장 동종이식의 생존은 유의성 있게 더욱 연장되었다.

본 발명자들의 연구는 단백질 요법의 첫 번째 주 이내에 주어진 단일 사이클의 메토트렉세이트가 수 개월의 투여에 걸쳐 ADA에서 95% 보다 큰 장수명 감소를 제공할 수 있다는 것을 보여준다. 항체 역가에 있어서 이러한 감소는 대부분의 연구 동안 메토트렉세이트의 부재에도 불구하고 장수명이었다. 또한, 본 발명자들은 단일 사이클의 메토트렉세이트가 복수 항원에 대한 항체 반응을 동시에 제어하는 것을 보여주어, 항-동종이식 반응(예를 들어, 뮤린 동종 심장 이식 모델에서)을 제어할 수 있다는 것을 발견하였다.

메토트렉세이트는 퓨린 대사를 저해하고 새로운 DNA 합성을 방해하는 것에 의해 증식하는 세포를 사멸시키는 것으로 생각되는 디하이드로폴레이트 리덕타제 길항제로서 전통적으로 알려져 있다(Kremer, Arthritis Rheum, 50(5):1370-82 (2004)). 메토트렉세이트가 이러한 잘-기술된 메커니즘을 통해 반응성 세포를 간단히 사멸시킬 수 있는 것으로 쉽게 예상할 수 있지만, 이는 본 발명자들이 발견한 단일 사이클 요법과는 대조적인 것으로 보인다. 메토트렉세이트는 짧은 반감기를 갖고, 처리 3 내지 4 개월 후 세포들을 능동적으로 사멸시키기에 충분히 오래 세포 또는 순환 중에 존재할 것 같지는 않다(Walling, Invest New Drugs, 24(1):37-77 (2006); Slavikova et al., Neoplasma, 25(2):211-6 (1978)). 더욱이, 본 발명자들은 메토트렉세이트 처리 후 림프구 고갈의 증거를 발견하지 못하였다. 그 보다, 본 발명자들은 놀랍게도 단일 사이클 요법의 메토트렉세이트가 무차별하게 림프구를 고갈시키는 것에 의해서가 아니라 면역 제어의 활성 기전을 유도하는 것에 의해 원치 않는 항체 반응을 감소시키는 것을 발견하였다.

본 발명자들의 연구는 단일 사이클의 메토트렉세이트가 활성화된 변연대 B 세포, 활성화된 난포성 B 세포 및 활성화된 전이성 3 B 세포뿐 아니라 B10 조절 B 세포를 증가시키는 것을 보여준다. 본 발명자들의 연구는 또한 단일 사이클의 메토트렉세이트가 IL-10-발현, TGF-베타-발현, 그리고 FoxP3-발현 B10, 난포성, 전이성 2 및 전이성 B 세포의 수를 증가시키는 것과, 이러한 확장은 TGF-베타에 의해 중개되는 것을 보여준다. 이들 연구는 또한 메토트렉세이트가 IL-10, TGF-베타, 및 FoxP3의 발현 농도를 증가시키는 것을 보여준다. 비장 B 세포 집단의 확장은 메토트렉세이트의 작용 기전에 대한 현재의 이해를 보면 놀라운 것이고, 이러한 투여 패러다임에서 메토트렉세이트가 이전에 알려져 있지 않은 방식으로 독특하게 작용하는 것을 시사한다. 인플릭시맙-투여된 류마티스성 관절염 환자에서 낮고 지속적인 용량의 메토트렉세이트는 항-인플릭시맙 항체 반응을 감소시키는 것으로 보이며; 노출이 지속적이므로 이러한 요법은 관용 유도라기 보다는 일정한 면역억제를 포함하는 것으로 보인다. 메토트렉세이트 단독 처리는 낮은 용량으로 매주 주어질 때 류마티스성 관절염에서 질병 활성을 감소시키는 것으로 보인다. 최근의 문헌은 저용량 메토트렉세이트의 계속적인 투여시 자가항원-특이적 T 조절 세포가 나타나는데, 이는 류마티스성 관절염에서 메토트렉세이트 치료의 효능을 설명하는 데 도움을 줄 수 있다(Xinqiang et al., Biomed Pharmacother, 64(7):463-471 (2010)). 반면, 본원에서 기술되는 메토트렉세이트에 대한 투여 패러다임은 원치 않는 면역학적 반응의 오래-지속되는 제어를 제공할 수 있는 단기 코스의 메토트렉세이트 치료를 포함한다는 점에서 정말로 독특하다.

전적으로, 본 발명자들은 T 세포 및 B 세포 반응뿐 아니라, 조직 이식에서 항-동종이식 항체 반응 및 ADA 반응의 몇 가지 다른 타입에 걸쳐 오래-지속되는 제어를 얻을 수 있는 메토트렉세이트의 독특한 투여 요법을 확인하였다. 본 발명자들은 메토트렉세이트에 의해 개발된 면역 관용이, 예를 들어 관용된 동물로부터 비-관용된 동물로 B 세포를 이식하는 것에 의해 한 동물에서 다른 동물로 전달될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 데이터는 메토트렉세이트가 면역 반응을 억제하는 활성이 있는 조절 B 세포를 대표할 수 있는 활성화된 B 세포 서브셋의 확장을 포함하는 독특한 작용 기전을 통해 작용하는 것을 시사한다. 또한, 메토트렉세이트는 T 조절 세포 확장의 기전을 통해 작용할 수도 있다.

생물-요법에서 원치 않는 면역 반응

본 발명의 방법은 다양한 생물학적 요법(예를 들어, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 대사물과 같은 생물제제를 사용하는 요법)에서 원치 않는 면역학적 반응(예를 들어, ADA 반응, 및 다른 원치 않는 T- 및/또는 B-세포 중개의 면역 반응)을 제어할 수 있다. 단백질 요법은 치료제가 펩티드 및 단백질을 포함하는 단백질성 물질인 요법을 의미한다. 단백질 치료제는, 예를 들어 효소, 사이토카인, 성장인자, 면역조절제, 혈전용해제, 항체(다클론 및 단클론 항체를 포함), 항체 단편 또는 변형된 항체(예를 들어, Fab, F(ab)₂, Fv, Fd, scFv, 및 dAb)일 수 있다. 예를 들어, 많은 효소 대체 요법이 임의의 유전적 질병을 갖는 환자를 위해 개발되었으며, 파브리 병(Fabry disease)에 대한 Fabrazyme® (재조합 인간 알파-갈락토시다제), 고세 병(Gaucher disease)에 대한 Cerezyme® (이미글루세라제), 뮤코다당체 대사이상증 (Mucopolysaccharidosis I, MPS I)에 대한 Aldurazyme® (라로니다제), 그리고 폼페 병(Pompe disease)에 대한 Myozyme® 및 Lumizyme®(알글루코시다제 알파)가 포함된다. 항체 치료제의 예로는 Campath® (알렘투주맙), Thymoglobulin® Avastin® (베바시주맙), Lucentis® (라니비주맙), Remicade® (인플릭시맙), Humira® (아달리무맙), Rituxan® (리툭시맙), Tysabri® (나탈리주맙), Simulect® (바실릭시맙), Zenapax® (다클리주맙), OKT3® (무로모납-CD3), Erbitux® (세툭시맙), Mylotarg® (젬투주맙), Herceptin® (트라스투주맙), 및 Benlysta® (벨리무맙)이 포함된다. 다른 단백질 치료제의 예로는 Enbrel® (에타넬셉), 및 다른 융합 단백질이 포함된다.

많은 경우, 원치 않는 면역 반응이 단백질 치료제에 대하여 환자에서 발생할 수 있어, 환자 결과에 대한 가변적인 효과를 야기한다. 이러한 반응은 생물학적 치료제가 종종 인간 환자에게 외래적인 서열 및 구조를 포함하기 때문에 일어난다. 예를 들어, ADA는 치료적 효능을 방해하고/하거나 안전 위험성을 증가시킨다. ADA는 과민 반응, 아나필락시스, 혈청병, 면역 복합체 병, 급성 신부전을 야기할 수 있다. ADA는 임상의에 의해 단백질 요법을 받는 환자에서 ELISA 및 면역조직화학을 포함하는 잘 설정된 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다.

어떤 경우, 본원에서 사용되는 "단백질 요법(protein therapy)"은 바이러스 벡터가 핵산 치료제를 전달하기 위해 사용되는 바이러스 요법을 의미한다. 이러한 요법에 사용되는 예시적인 바이러스에는 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스, 및 레트로바이러스를 포함하지만 이로서 한정되지 않는다. 항체는 바이러스의 캡시드 단백질에 대하여 생길 수 있으며, 이러한 치료의 안전 위험성을 증가시키고 효능을 감소시킨다. 본 발명의 방법은 바이러스 요법에서 마찬가지로 원치 않는 면역학적 반응(예를 들어, ADA 반응, 및 다른 원치 않는 T- 및/또는 B-세포 중개된 면역 반응)을 제어하는 데 유용하다.

본 발명의 방법은 또한 비-단백질 생물학적 치료에서 원치 않는 면역학적 반응을 제어할 수 있다. 예시적인 비-단백질 생물-요법에는 핵산 요법(예를 들어, 안티센스 요법, siRNA 요법, 및 miRNA 요법)을 포함하지만, 이들만으로 한정되지는 않는다.

이식에 있어서 항-이식 반응

본 발명의 방법은 또한 신장 이식, 간 이식, 심장 이식, 및 줄기세포 이식과 같은 조직 이식을 받은 환자에서 면역 관용을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 대 이식 및 이식 대 숙주 거부는 조직 이식, 특히 동종이식 및 이종이식에서 종종 일어난다. 단일 사이클의 메토트렉세이트는 항-이식 항체 반응을 관리하기 위해 단독으로 또는 다른 면역-조절 약제(예를 들어, Thymoglobulin®과 같은 면역억제제)와 함께 사용될 수 있다. 또한, 이식에 있어서 Thymoglobulin®과 메토트렉세이트의 조합은 이식 생존을 연장시키기 위해 작용할 수 있다. 최종적으로, Thymoglobulin®이 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증과 같은 만성 자가면역 질환의 세팅에서 조사되는 경우, 메토트렉세이트는 더 안전한 Thymoglobulin®의 재-치료를 위해 허용되어, 중증의 항-토끼 항체(IgG 및/또는 IgM) 및/또는 주입-관련 반응의 발생으로부터 환자를 보호할 수 있다.

메토트렉세이트에 의한 원치 않는 면역학적 반응의 관리

본 발명자들은 단일의 단기 사이클의 메토트렉세이트가 생물 치료(예를 들어, 단백질 치료)를 받는 대상에서 ADA와 같은 원치 않는 면역 반응, 그리고 조직 이식을 받은 환자에서 항-동종이식 반응을 유의성 있게 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 원치 않는 ADA를 감소시키는 것은 단백질 치료제의 약력학 및/또는 약물동력학을 개선시키는 것을 통해, 환자 안전성을 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 단백질 치료제의 효능을 개선시킬 수도 있다.

작은 분자 화합물인 메토트렉세이트는 중증의 활성 류마티스성 관절염, 중증의 건선, 그리고 자궁에서 수정란 주위에 형성되는 조직에서 시작되는 암, 유방암, 폐암, 두부와 경부의 임의 암, 임의 종류의 림프종, 그리고 백혈병(백혈구에서 시작되는 암)을 포함하는 특정 종류의 암에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 메토트렉세이트는 암 세포의 성장을 지연시키는 것에 의해 암을 치료한다. 메토트렉세이트는 인편이 생기는 것을 중지시키도록 피부 세포의 성장을 지연시키는 것에 의해 건선을 치료한다. 메토트렉세이트는 면역 시스템의 활성을 감소시키는 것에 의해 류마티스성 관절염을 치료할 수 있다.

메토트렉세이트는 α-갈락토시다제 A 및 α-글루코시다제에 대하여 유도된 ADA 반응을 제어하는 것과 관련하여 연구되었다. 그러나, 이들 연구는 단일 사이클의 메토트렉세이트 보다는, 복수 사이클의 메토트렉세이트 치료로 행하여졌다(Garman et al. Clin Exp Immunol, 137(3):496-502 (2004); Joseph et al., Clin Exp Immunol, 152(1):138-46 (2008); Mendelsohn et al., N Engl J Med, 360(2):194-5 (2009)).

본 발명자들의 연구는 놀랍게도 단일 사이클의 메토트렉세이트가 ADA 및 항-동종이식 항체를 유의성 있게 감소시키기에 충분한 것을 보여준다. 사실, 항체 치료제(예를 들어, mATG)와 관련된 연구에서, 본 발명자들은 메토트렉세이트의 복수-사이클 치료 보다 메토트렉세이트의 단일-사이클 치료가 ADA를 감소시키는 데 더욱 유효한 것을 보여준다. 메토트렉세이트를 이용한 이전의 연구에서는 단일 사이클의 메토트렉세이트가 ADA를 감소시키기에 충분하다는 어떠한 시사도 없었으며, 복수-사이클 치료 보다 유효하다는 것은 더욱 없었다. 메토트렉세이트는 세포독성으로 알려져 있다. 따라서, 메토트렉세이트에 의한 ADA의 감소에 대한 기전이 이 특성에 의존하는 것으로 가정한다면, 치료 사이클 수를 감소시키는 것은 메토트렉세이트의 유익한 효과를 감소시킬 것으로 예상할 것이다. 더욱이, 이들 이전에 발표된 연구에서는, 놀랍게도 본원에서 단일 코스의 메토트렉세이트로 보여준 바와 같은 약물동력학, 약력학, 효능, 또는 안전성에 있어서 메토트렉세이트 치료의 유익함을 보여주지 못하였다. 그들은 메토트렉세이트가 항체 요법에서 ADA를 감소시킬 수 있다는 것을 개시하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단일 사이클 요법은 연속 또는 비-연속일 치료 요법, 또는 치료 유닛을 의미하고, 바람직하게는 주된 단백질 치료제의 투여 또는 이식 다음 5 일 이하(예를 들어, 3 일 이하)에 시작된다. 주된 단백질 치료제가 복수 시기로 투여되면, 메토트렉세이트의 단일 사이클 치료는 바람직하게는 단백질 치료제 투여의 제 1 시기를 지나 연장되지 않는다. 예를 들어, 매주, 매달, 또는 매년의 단백질 요법에서, 단일 사이클의 메토트렉세이트는 주된 단백질 치료제가 환자에게 처음으로 주어지거나, 또는 환자가 조직 이식을 받은 날인 0 일에 시작하여 연속 3 일의 메토트렉세이트 섭취(예를 들어, 경구)로 구성된다. 다음에 환자는 1 일(24 시간 후) 및 2 일(48 시간 후)에 단일 투여량의 메토트렉세이트를 받는다. 단일 사이클의 메토트렉세이트는 또한, 예를 들어 0 일에 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 연속 매일 투여의 메토트렉세이트로 구성될 수 있다. 메토트렉세이트는 또한 적절하다고 간주되는 다른 시기, 예를 들어 림프구-고갈 요법에서, 예를 들어 2차 자가면역을 관리할 때 투여될 수도 있다. 단일 사이클의 메토트렉세이트는 바람직하게는 8 일 보다 길게 지속하지 않는다. 일부 실시예에서, 단일 사이클의 메토트렉세이트는 주된 치료제 처리(즉, 생물 치료제 처리)의 개시 48 시간 전 내지 48 시간 후 사이에 개시된다. 예를 들어, 단일 사이클의 메토트렉세이트는 주된 치료제 처리의 개시 48 시간 전, 36 시간 전, 24 시간 전, 12 시간 전, 동시, 12 시간 후, 24 시간 후, 36 시간 후, 또는 48 시간 후에 개시될 수 있다.

본 발명자들의 연구는 또한 놀랍게도 낮은 용량의 메토트렉세이트가 단백질 요법 및 이식에서 원치 않는 면역학적 반응(예를 들어, ADA 반응, 그리고 다른 원치 않는 T- 및/또는 B-세포 중개 면역 반응)을 관리하기에 충분한 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 실시예에서, 메토트렉세이트는 1 사이클 보다 많지만, 낮은 총 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트는 환자에 2 또는 이보다 많은(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 등) 사이클로, 그러나 5 ㎎/㎏ 이하의 총 조합된 용량으로 투여될 수 있다.

메토트렉세이트의 용량은 단일 사이클로 주어질 때, 항체 또는 세포 반응과 같은 원치 않는 면역학적 반응을 감소시키는 유효량의 메토트렉세이트일 것이다. 인간 환자에서 메토트렉세이트의 유효량은 0.05 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 유효량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 1.5 ㎎/㎏이다. 일부 실시예에서, 유효량은 0.12 ㎎/㎏ 내지 1.28 ㎎/㎏이다. 일부 실시예에서, 유효량은 0.12 ㎎/㎏이다. 일부 실시예에서, 유효량은 1.28 ㎎/㎏이다. 메토트렉세이트의 권장되는 용량은 최소 안전성 위험을 제기할 수 있는데, 투여 요법이 단지 낮은 종양성 투여량 보다 류마티스성 관절염을 위한 투여량에 더 유사한 투여량 수준의 간단한 코스의 메토트렉세이트를 포함하기 때문이다. 본 발명자들의 연구에서는, 마우스에서 각 사이클에 시험된 메토트렉세이트의 총량은 14 내지 15 ㎎/㎏였다. 마우스에서 14 ㎎/㎏의 메토트렉세이트는 60 ㎏ 무게의 평균 성인에서 대략 68 ㎎ 또는 5.92 ㎎/㎡에 해당한다. 류마티스성 관절염 환자는 중증의 독성으로 고통 받지 않고 주당 25 ㎎까지의 메토트렉세이트를 받을 수 있다. 메토트렉세이트의 낮은 종양성 용량은 30 ㎎/㎡로 간주되며, 이는 5.92 ㎎/㎡ 보다 상당히 높다. 따라서, 위의 권장되는 용량은 이 메토트렉세이트 요법의 일시적 특성과 함께 성인에서 잘-용인될 것이다. 메토트렉세이트의 정확한 용량 및 요법은 물론 환자의 육체적 조건, 연령, 체중, 성, 환자가 복용하는 다른 의약 및 이들의 알려진 부작용, 그리고 다른 관련 인자들을 고려하여, 임상의에 의해 설정되어야 한다. 환자에서 원치 않는 항체 반응을 관리하는 데 있어서 메토트렉세이트의 효과는 환자의 임상 검사, 증상, ADA 또는 항-동종이식 항체 역가를 평가하는 혈액 검사. 면역조직화학적 측정법(예를 들어, C4 침착 평가 및 효소-결합된 면역흡수 측정법(ELISA) 및 비드-베이스의 형광 측정법)을 포함하는 공지의 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 효과는 또한, 본 발명자들이 메토트렉세이트 처리에 의해 농도가 감소되는 것을 보여준 MCP-1, IL-13, IL-6, 및 IL-12, 그리고 본 발명자들이 메토트렉세이트 처리에 의해 수가 증가되는 것을 보여준 전이성 2 B 세포, 전이성 3 B 세포, 난포성 B 세포, 변연대 B 세포, B10 B 세포, 및 B1 B 세포와 같은 생물표지의 농도를 측정하는 것에 의해 모니터링될 수 있다, 추가로, TGF-베타, FoxP3, IL-5, IL-10, IL-15, 및 GM-CSF는 필요에 따라 원치 않는 면역 반응에 대한 메토트렉세이트의 효과를 모니터링하기 위한 생물표지로서 사용될 수 있다. 생물표지의 농도는 또한 치료제(예를 들어, 단백질 치료제)에 대한 T 세포 반응성에 대한 메토트렉세이트의 효과를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. IL-2, 인터페론-γ, 및 TNF-α와 같은 T 세포 활성화에 대한 생물표지는 T 세포 반응에 대한 메토트렉세이트의 효과를 위해 해독된 정보로서 모니터링될 수도 있다.

원치 않는 면역 반응을 제어하는 능력으로 인해, 본 발명의 단일 사이클의 메토트렉세이트 요법은 과거에 안전성 및 효능 문제로 주어진 환자에서 반복된 사용이 제한된 많은 단백질 치료제의 용도를 확장시킬 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트의 Thymoglobulin®과 수반되는 사용은, 당뇨병, 낭창, 경피증, 류마티스성 관절염, 건선 및 다발성 경화증을 포함하지만 이들만으로 한정되지 않는 T 세포-중개의 자가면역 질환과 같은 재-투여가 요망되는 다른 질병 세팅으로 Thymoglobulin®의 유용성을 확장시킬 수 있다. 추가로, 메토트렉세이트는 예를 들어, 알렘투주맙이 보통 반복되는 매년의 사이클로 투여되는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환에서, 또는 알렘투주맙이 12-주 사이클로 3 ㎎/일의 시작 용량(주입 반응이 2 등급과 같거나 이보다 낮을 때까지), 다음에 10 ㎎/일로 증가(주입 반응이 2 등급과 같거나 이보다 낮을 때까지), 그리고 최종적으로 30 ㎎/일까지 바뀌어(격일로 매주 3 회) 투여되는 만성 B-세포 림프구성 백혈병에서, 알렘투주맙의 효능 및 안전성을 확장시킬 수 있다. 이러한 타입의 투여 요법은 저해성 ADA 반응을 강화시킬 수 있다. 따라서, 메토트렉세이트는 ADA 및 임의의 다른 원치 않는 면역 반응을 제어하는 데 사용될 수 있다.

메토트렉세이트에 의한 림프구-고갈 요법의 개선

본 발명의 예시적인 응용은 재발-경감 MS와 같은 다발성 경화증(MS)을 치료하는 알렘투주맙 요법과 같은 림프구-고갈 요법을 개선시키기 위해 메토트렉세이트를 사용하는 것이다. "림프구 고갈(lymphocyte depletion)"은 순환하는 림프구, 예를 들어 T 세포 및/또는 B 세포의 감소에 의한 면역억제 타입으로, 림프구 감소를 야기한다. 치료적으로, 림프구 고갈은 Thymoglobulin®, 인간화된 항-CD52 단클론 항체 CAMPATH-1H® (알렘투주맙), 및 리툭시맙과 같은 치료적 단백질에 의해 달성될 수 있다. 림프구 고갈은 다발성 경화증(Coles et al., Ann. Neurol. 46, 296- 304 (1999); Coles et al., 2008), 류마티스성 관절염, 맥관염, 및 낭창을 포함하는 많은 자가면역 증상의 치료에 요망된다.

림프구 고갈 요법은 2차 자가면역을 야기할 수 있다. 본원에서 자가면역은 제 1("1차") 질병, 예를 들어 "1차" 자가면역 질환의 개시에 수반하여 일어났을 때 "2차 자가면역(secondary autoimmunity)"으로 언급된다. 2차 자가면역은, 예를 들어 림프구 고갈 요법에 이어지는 림프구감소를 갖거나 가졌던 MS 환자에서 때때로 일어난다. 일부 개인에서, 2차 자가면역은 림프구 고갈 요법(예를 들어, 알렘투주맙 치료) 직후에 일어난다. 다른 개인에서, 2차 자가면역은 림프구 고갈 요법 이후 몇 개월 또는 몇 년까지도 일어나지 않을 수 있는데; 이러한 개인의 일부에서는 2차 면역이 생길 때까지 실질적인 림프구 회복(총 림프구 수)이 일어나 더 이상 림프구감소가 아닐 수 있다. 림프구 고갈은 항체 치료제 또는 작은 분자 치료제의 치료와 관련하여 일어날 수 있다.

림프구감소 MS 환자에서 일어나는 2차 자가면역은, 갑상선 자가면역(예를 들어, 그레이브스병), 혈소판감소성 자반, 면역성 혈소판감소증(ITP), 굿패스쳐병(Goodpasture's disease), 자가면역 호중구감소, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 자가면역 림프구감소를 포함하지만 이들만으로 한정되지 않는, MS 이외의 임의 타입의 자가면역 증상일 수 있다. 일부 실시예에서, 2차 자가면역은 B 세포 중개의, 즉 B 세포 반응 및 자기-항체가 질병 형성과 병리에 직접적으로 연결된다.

이들 자가면역 질병을 진단 및 모니터링하는 기술은, 혈액 분석과 같은 의학적 검사 및 증상의 평가를 포함하여, 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은 임의의 알려진 방법의 사용을 고려한다. 예를 들어, 환자의 체액(예를 들어, 혈액)에서 자기항체 농도는 자가면역의 징후를 검출하는 수단으로서 측정될 수 있다. 특히, 항-핵 항체, 항-평활근 항체, 그리고 항-미토콘드리아 항체를 측정할 수 있다. 항-핵 항체가 검출되는 경우, 항-이중-나선 DNA 항체, 항-리보핵산단백질 항체, 및 항-La 항체를 측정하기 위해 추가적 분석이 수행될 수 있다. 항-갑상선 퍼옥시다제(TPO) 및 항-갑상선 자극 호르몬(TSH) 수용체 항체는 자가면역 갑상선 질환을 검출하기 위해 측정될 수 있으며; 항-TPO 또는 항-TSH 수용체 항체가 검출되면, 유리 T3, 유리 T4 및 TSH 농도를 측정하는 것에 의해 갑상선 기능이 영향을 받는지 여부를 측정할 수 있다. 항-혈소판 항체는 자가면역 혈소판감소를 검출하기 위해 측정될 수 있고, 혈액 혈소판 농도의 측정은 항-혈소판 항체의 존재가 혈소판 수의 감소를 야기하는 것인지를 결정하는 데 제공될 수 있다. 또한 WO 2010/041149 참조.

본 발명의 단일 사이클 메토트렉세이트 요법은 2차 자가면역의 최소화뿐 아니라 ADA의 감소에 의해 림프구-고갈 요법의 안전성 및 효능을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 구애되지 않고, 본 발명자들은 메토트렉세이트가 복수의 자기항원을 동시에 관용하는 것에 의해 2차 자가면역을 감소시킬 수 있는 것으로 생각한다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료 역시 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있다 하더라도, 예시적인 방법과 재료가 이하에서 기술된다. 본원에 언급된 모든 출판물 및 다른 참고문헌은 본원에 전체로서 참고로 도입된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 비록 많은 문헌이 본원에 인용되지만, 이 인용은 허가를 구성하지 않고, 임의의 이들 문헌은 본 분야에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다. 본 명세서 및 청구범위에서, "포함한다(comprise)"는 용어 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변경은 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예

본 발명의 추가적인 상세가 다음 비-한정적인 실시예에서 기술될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내면서, 단지 예시로서만 주어지고 첨부된 실시예를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 개시 및 이들 실시예로부터, 본 분야의 숙련자들은 본 발명의 임의의 특성을 확인할 수 있으며, 이의 정수 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 증상에 적합화하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 이들 실시예에서 사용된 재료 및 방법은 다음과 같이 기술된다.

마우스

6 내지 12 주령 사이의 정상 암컷 C57BL/6 마우스가 토끼 항-뮤린 흉선세포 글로불린 다클론 항체(mATG)의 in vivo 연구에 사용되고 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME) 또는 Taconic Laboratories(Hudson, NY)로부터 입수되었다. 알렘투주맙-관련 연구는 Charles River Laboratories/Genzyme Corp.로부터 입수된 6-12 주령의 인간 CD52(huCD52) 형질전환된(Tg) 마우스를 채용하였다. 마우스는 실험동물 케어 I의 승인을 위한 미국 협회 승인 하에서 실험동물 케어 및 사용 가이드에 따라 수용 및 유지되고 이들 연구에 사용된 모든 동물 프로토콜은 동물 케어 및 사용 위원회에 의해 허가되었다.

비임상 약물학 연구에 사용된 huCD52 Tg 마우스는 Xenogen(Cranbury, NJ, USA)에 의해 생산되었다. 이 마우스를 생산하기 위해, 인간 염색체 1으로부터 약 145 kilobases의 게놈 DNA를 포함하는 박미드(bacmid) 구조를 임의로 마우스 CD-1 배아 줄기세포의 게놈으로 통합시켰다. 이 박미드에 포함되는 인간 게놈 DNA의 범위로 인해, 이 구조는 인간 CD52에 더하여 미지 기능의 총 5 개 부분적 또는 전체 유전자를 포함하였다. 이 박미드에 포함된 5 개 부분적 또는 전체 유전자 단편은 다음과 같다: 인간 CD52 유전자, 신규 유전자의 3' 말단(DKFZP434L0117), SH3BGRL3 유전자(SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3), 소시우스 유전자(SOC), AIM1L(absent in melanoma 1-like) 유전자, 및 징크 핑거 단백질 683 유전자. 3 개의 파운더 라인이 생산되었고 라인 107은 Genzyme에서 인정되었다.

항체 투여

다클론 항체 mATG 및 rbIgG를 Ruzek et al., Transplantation, 88(2):170-9 (2009)에 기술된 것과 같이 제조하고, 실험에 따라 다양한 요법으로 복막내 주사로 투여하였다. 단클론 항체 알렘투주맙은 0.5 ㎎/㎏의 단일 주사로, 또는 0.5 ㎎/㎏/일의 3 일 또는 5 일 사이클로 정맥내 투여하였다.

Myozyme® 처리

재조합 인간 알글루코시다제 알파(rhGAA, Genzyme Corp.에 의해 Myozyme® d으로 시판)를 제형화된 의약 제품으로서 사용하였다. 달리 언급하지 않는다면, 마우스는 볼루스 꼬리 정맥 주사로 매주 20 ㎎/㎏의 rhGAA를 처리하였다. 모든 마우스는 rhGAA 투여 전에 예방으로서 5 내지 30 ㎎/㎏ 디펜히드라민(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)을 복막내 투여하였다. 대조 동물은 멸균 0.9% 식염수 또는 rhGAA-제형 완충액을 정맥내 투여하였다.

메토트렉세이트 처리

메토트렉세이트(Calbiochem catalog #454125)는 0.5, 1.0, 2.0 또는 5 ㎎/㎏을 1-3 사이클 동안 복막내 주사로 투여하였는데, 각 사이클은 실험에 따라 3, 6 또는 7 연속일 주사로 동일하다. 매달 mATG 처리를 포함하는 연구에서, 메토트렉세이트는 개시 mATG 처리 또는 최초 3 mATG 처리 0, 24 및 48 시간 후에 5 ㎎/㎏으로 복막내 투여하였다. mATG가 0 및 4 일에 투여되는 이식 연구에서, 메토트렉세이트는 0 내지 6 일까지 매일 2 ㎎/㎏, 0 내지 6 일까지 매일 0.5 ㎎/㎏, 또는 0 내지 11 일까지 매일 0.5 ㎎/㎏을 주었다.

mATG 처리

다클론 항체 mATG는 매 4 주마다 5 ㎎/㎏의 복막내 주사로, 또는 이식 세팅에서 이식 날(0 일) 주어지는 최초 투여와 4 일에 주어지는 2 회의 20 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였다.

다양한 조직으로부터 세포 조제

비장세포 및 림프절 세포 조제를 위해, 불투명 유리 슬라이드 사이에서 2% FCS를 포함하는 PBS로의 균질화에 의해 수확된 마우스 비장 또는 서혜부 및 장간막 림프절로부터 단일-세포 현탁액을 생성하였다. 비장세포 조제를 위해, 적혈구를 적혈구 용해 용액(BD Biosciences, San Diego, CA)과 함께 1 내지 2 분 인큐베이션으로 용해시켰다. 레트로-오비탈 블리딩(retro-orbital bleeding)으로 혈액을 분리하고 적혈구 용해 용액(BD Biosciences)으로 20 내지 30 분 동안 적혈구를 용해시켜 세포 조제를 실시하였다. 모든 조직 조제를 위해, ViCell 자동세포 카운터(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여 생존 세포를 열거하였다. 분리 다음에, 모든 세포 조제를 아래에 기술되는 분석에 사용하기 전 PBS/2% FCS로 세척하였다.

유동 세포분석

다른 조직 내의 세포 집단의 평가를 위해, 조직의 단일 세포 현탁액을 항-마우스 CD4, CD8, CD25, CD44, CD62L(모든 항체 입수처는 BD Biosciences 또는 eBioscience, San Diego, CA)를 포함하는 형광색소-결합된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포내 Foxp3 발현 분석은 항-Foxp3 제조자의 프로토콜 (eBiosciences, San Diego, CA)에 따라 실시하였다. 항체와 인큐베이션한 다음, 세포를 세척하고 유동 세포분석에 의해 분석하였다(FACSCanto, BD Biosciences 및 FCS Express software, De Novo Software, Los Angeles, CA).

평가된 세포 집단은 다음과 같이 정의되었다:

총 CD4 T 세포: CD4⁺CD8^-,

총 CD8 T 세포: CD8⁺CD4^-,

CD4 나이브 세포: CD4⁺CD25^-CD62L⁺CD44^-,

CD4 기억 세포: CD4⁺CD25^-CD62L^-CD44⁺,

나이브 CD8 T 세포: CD8⁺CD44^-CD62L⁺,

CD8 기억 세포: CD8⁺CD44⁺CD62L^-,

조절 T 세포: CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺,

총 B 세포: CD19⁺,

B2/난포성 B 세포: CD19⁺CD21^intCD23^hi,

B1 B 세포: CD19⁺CD43⁺CD11b⁺,

전이성 1 B 세포: CD19⁺CD93⁺CD23^-IgM^hi,

전이성 2 B 세포: CD19⁺CD93⁺CD23⁺IgM^hi,

전이성 3 B 세포: CD19⁺CD93⁺CD23⁺IgM^lo,

변연대 B 세포: CD19⁺CD21^hiCD23^lo, 및

B10 B 세포: CD19⁺CD5⁺CD1d⁺.

In vitro 블로킹 연구에서 100 ㎍/㎖까지 mATG는 이들 집단의 검출을 방해하지 않는 것으로 측정되었다.

항-mATG IgG ELISA

마우스 혈청에서 항-mATG IgG 농도는 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 분석하였다. 간단하게는, 96-웰 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 1 ㎍/㎖의 인산 완충된 식염수(PBS) 중 토끼 IgG로 밤새 코팅하였다. Super Block 블로킹 완충액(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)으로 블로킹한 다음, 일련의 혈청 희석액을 토끼 IgG-코팅된 플레이트에 이중으로 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA)를 가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척한 다음, 3,3' 5,5'테트라메틸벤지딘 기질 (BioFx, Owings Mills, MD, USA)을 가하고 실온에서 15 분 동안 전개되도록 하였다. 1 N HCl의 첨가로 반응을 중단시키고 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450/650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Softmax 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 0.100의 흡광도 위의 평균을 갖는 최저 희석액으로서 종말점 역가를 정의하였다.

mATG-특이적 IgG ELISA

마우스 혈청을 ELISA로 측정하였다. 간단하게는, 96-웰 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 1 ㎍/㎖의 염소 항-토끼 IgG-Fc 단편 항체(Bethyl Laboratories, TX, USA 로 밤새 코팅하였다. 0.5% BSA(고순도)로 블로킹한 다음, 표준 대조 및 혈청 샘플을 필요에 따라 희석하고 코팅된 플레이트의 웰에 이중으로 첨가하고 36 내지 38℃에서 1 시간 동안 온화하게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 염소 항-토끼 IgG-Fc 단편 항체(Bethyl Laboratories, TX, USA)를 적절히 가하고 36 내지 38℃에서 온화하게 진탕하면서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척한 다음, 3,3' 5,5' 테트라메틸벤지딘 기질(BioFx, Owings Mills, MD, USA)을 가하고 23 내지 25℃에서 15 분 동안 전개되도록 하였다. 1 N HCl을 가하여 반응을 중단시키고 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450/650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 최종 농도를 표준 곡선 밖으로 내삽하였다. 이 방법에 의한 mATG-특이적 IgG의 측정은 218,000 보다 큰 항-mATG IgG의 역가에 의해 단지 보통으로 영향을 받는 것으로 예정되어졌다.

항-알렘투주맙 IgG ELISA

마우스를 알렘투주맙 처리 4 내지 6 일 후에 채혈하고 특이적 항-알렘투주맙 IgG를 ELISA에 의해 측정하였다. 간단하게는, 96-웰 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 3 ㎍/㎖의 PBS(pH 7.2) 중 알렘투주맙으로 밤새 코팅하였다. 0.1% PBS 중 BSA로 블로킹한 다음, 일련의 혈청 희석액을 알렘투주맙-코팅된 플레이트에 이중으로 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA)를 가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 되도록 하였다. 최종 세척한 다음, TMB 기질(BioFx, Owings Mills, MD, USA)을 가하고 실온에서 15 분 동안 전개되도록 하였다. 1 N HCl의 첨가로 반응을 중단시키고 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450/650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Excel 소프트웨어(Microsoft, Redmond, WA, USA)를 사용하여 0.2의 흡광도 값으로 내삽된 대수적으로 전환된 샘플 희석액의 역대수로서 종결점 역가를 정의하였다.

항-rhGAA IgG ELISA

마우스를 rhGAA 처리 4 내지 6 일 후에 채혈하고 특이적 IgG를 ELISA에 의해 측정하였다. 간단하게는, 96-웰 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 5 ㎍/㎖의 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 중 rhGAA로 밤새 코팅하였다. 0.1% PBS 중 BSA로 블로킹한 다음, 일련의 혈청 희석액을 rhGAA-코팅된 플레이트에 이중으로 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA)를 가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 최종 세척한 다음, 3,3' 5,5' 테트라메틸벤지딘 기질((TMB, KPL, Gaithersburg, MD)을 가하고 실온에서 15 분 동안 전개되도록 하였다. 1 N HCl의 첨가로 반응을 중단시키고 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450/650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Softmax 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 0.2의 흡광도 값의 결과를 내는 샘플 희석액의 역수로서 종말점 역가를 정의하였다.

Ex vivo 연구

8-12 주령의 C57BL/6(Jackson Laboratories) 또는 E4GAAKO(Charles River) 마우스에 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트(Calbiochem catalog #454125)를 1 내지 3 사이클 동안 복막내 주사로 투여하였으며, 여기에서 1 사이클은 3 연속 주사일과 동일하다. 20 ㎎/㎏의 Myozyme® (Genzyme Corporation)을 최초 메토트렉세이트 투여와 함께 시작하여 1 회 또는 2 내지 6 매주 용량으로 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 동물을 투여 개시 후 매주 또는 매일 희생시켰다. T 및 B 세포 서브셋의 유동 세포분석을 위해 비장, 장간막 및 서혜부 림프절을 수집하고, ELISA 분석을 위해 혈청을 수집하였다. 비장을 글라스 슬라이드 사이에서 처리하고 적혈구(RBC)를 BD Biosciences(catalog#555899)로부터 구입한 용해 완충액으로 제조자의 지시에 따라 용해시켰다. 림프절을 글라스 슬라이드 사이에서 처리하고 2% 우태혈청(FCS)을 포함하는 인산염 완충된 식염수(PBS)로 세척하였다. 세포를 4% 우태혈청 및 25 ㎍/mL의 총 마우스 IgG를 포함하는 200 ㎕의 PBS로 재현탁하고 4℃에서 30 분 동안 차단시켰다. 약 3백만 비장 세포 및 1백만 림프절 세포를 다른 항체 칵테일로 염색하고 Becton Dickinson CANTOII 유동 세포분석기에서 HTS(high through put sampler)로 분석하였다. 적어도 100,000 세포 이벤트를 림프구 게이트 내에서 획득하였다. 항-마우스 항체 칵테일은, 모두 BD Pharmingen으로부터 구입한 PE-CD21/35 catalog #552957, FITC- catalog #553138, PE- CD138 catalog #553714, PE- CD127 catalog #552543, APC-Cy7-CD19 catalog #557655, FITC-CD43 catalog #553270, PE-Cy7-CD4 catalog #552775, FITC-CD3e catalog #553062, APC-CD11b catalog #553312, PE-Cy7-IgM catalog #552867, APC-Cy7-CD8 catalog #557654, PE-CD273(PD-L2) catalog #557796, APC-CD138 catalog #558626, PE-Cy7-CD11b catalog #552850, PE-CD93(초기 B 혈통) catalog #558039, APC-CD69 catalog #560689, Pe-Cy7-CD24 catalog #560536, FITC-CD1d catalog #553845, APC-CD5 catalog #550035 및 Percp-Cy5-7AAD catalog #559925로 구성되었다. FITC-FoxP3 세포내 염색 키트는 eBioscience로부터 구입하였다. Pacific Blue(PB)- CD25 catalog #102022, PB-CD23 catalog #101616 및 PB-CD86 catalog #105022는 BioLegend로부터 구입하였다. 림프구 서브셋의 분석은 De Novo Software에 의해 제공된 FCS 익스프레스 버전 3 소프트웨어로 수행되었다. 백분율은 배치 처리 옵션으로 생성되었고 절대수는 얻어진 세포 카운트에 따라 계산하였다. 비장 및 림프절 세포 계수는 제조자의 지시에 따라 Beckman Coulter Vi-cell XR 세포 생존력 분석기로 얻었다.

In vitro 및 사이토카인 분석

8 내지 12 주령의 C57BL/6(Jackson Laboratories) 또는 E4GAAKO(Charles River) 마우스에 20 ㎎/㎏의 rhGAA 처리와 함께 시작하여 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트 (Calbiochem catalog #454125)를 1 사이클(3 연속 매일 투여) 동안 복막내 주사로 투여하였다. 1D11 연구를 위해, 동물들에게 rhGAA 및 메토트렉세이트 처리와 함께 시작하여 매주 3 회, 격일로, 5 ㎎/㎏의 1D11 또는 13C4(Genzyme Corporation)의 복막내 주사 처리하였다. 마우스 종에 따라 rhGAA 개시 후 6 또는 7 일에 동물들을 희생시켰다. 비장은 단일 세포 현탁액으로 제조하고 제조자의 지시에 따라 RoboSep(STEMCELL technologies) 기기에 로딩하고 B 세포 네가티브 선택 처리하였다. 정제된 B 세포를 96 웰 둥근 바닥 플레이트(Costar catalog #3799)에서 웰 당 500,000 세포로 접종하고 10 ㎍/mL의 LPS(Sigma catalog #L5014)와 함께 또는 자극 없이 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션 하였다. 모든 웰은 제조자의 지시에 따라 Monensin(BD Bioscience catalog #554724)을 수용하였다. 세포들을 37℃에서 적어도 4 시간 동안 인큐베이션 되도록 하였다. 샘플을 V 바닥 웰(USA Scientific catalog #651201)로 옮기고 4℃에서 5 분 동안 1200 rpm으로 회전시켰다. 세포를 4% 우태혈청 및 25 ㎍/㎖의 총 마우스 IgG를 포함하는 200 ㎕의 PBS에 재현탁시키고 4℃에서 30 분 동안 블로킹시켰다. 플레이트를 다시 회전시키고 위에 기술한 것과 같은 항체 칵테일 10 ㎕을 가하고 90 ㎕의 PBS/2% FCS에 재현탁시키고, 염색 과정 최종 10 분 동안 5 ㎕ 7AAD를 가하여 4℃에서 20 분 동안 인큐베이션 하였다. 샘플에 100 ㎕의 완충액을 가하고 이어지는 회전을 세척으로 사용하였다. 샘플들은 단백질의 표면 분석 및 즉시 획득을 위해 완충액에 재현탁시키거나, 제조자의 지시에 따라 IL-10(BioLegend catalog #505008), TGF-beta(BioLegend catalog #141404) 및 FoxP3(eBioscience catalog #11-5773-82)의 세포내 염색을 위해 Fix/Perm(eBioscience catalog #11-5773)에 재현탁시킬 수 있을 것이다. 추가적인 표면 염색은 TGF-베타 및 Tim-1(BioLegend catalog #119506) 항체를 포함하였다. 모든 샘플은 위에 기술한 바와 같이 획득하고 분석하였다.

동물 및 심장 동종이식 모델

C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 Charles River(Kingston, NY or Raleigh, NC)로부터 입수하고 8 내지 13 주령을 이들 실험에 사용하였다. 제공자 동종 C57BL/6 마우스를 먼저 케타민(Fort Dodge Animal Health/Pfizer, Fort Dodge, IA) 및 자일라진(Lloyd, Shenandoah, IA)의 복막내 주사로 마취시키고 정중 흉골절개술을 시행하였다. 제공자 심장을 상대정맥과 폐정맥 결찰 및 분리 전에 하대정맥과 대동맥을 통해 1 ㎖의 냉 헤파린 처리된 링거 락테이트 용액(Baxter Healthcare, Deerfield, IL)으로 서서히 in situ 관류시켰다. 다음에 상향 대동맥과 폐동맥을 절개하고 제공자로부터 분리된 이식물 및 심장을 이식할 때까지 빙-냉 식염수에 저장하였다. 복강을 개방시키는 것을 제외하고, 수용자 마우스(Balb/c)를 제공자 마우스에 대하여 위에 기술한 것과 유사하게 마취 및 준비하였다. 개방된 복강을 보기 위한 수술용 현미경을 사용하여, 복부 대동맥(AA) 및 하대정맥(IVC)을 분리하였다. 제공자 심장을 수용자 복부에 놓고(거꾸로), 제공자의 대동맥과 수용자 복부 대동맥과 함께, 제공자 폐동맥과 수용자 하대정맥 사이에서 단부-대-측부 문합으로 혈관을 이식하였다. 지혈이 확인된 후, 복부 근육을 러닝 5-O Vicryl 봉합(Ethicon, Johnson & Johnson, Somerville, NJ)으로 봉합하고, 피부는 러닝 5-0 Ethilon 봉합(Ethicon)으로 봉합하였다. 표준적인 수술후 통증 평가 및 관리를 실시하였다. 이식은 최초 30 일 동안은 주 당 5 내지 7 회 촉진으로, 연구 종결까지는 주 당 3 내지 4 회 촉진으로 평가하였다.

C57Bl/6 마우스는 rhGAA(Genzyme Corporation)의 1회 20 ㎎/㎏ 정맥내 투여, 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트(APP Pharmaceuticals, LLC)의 3 연속 복막내 투여, 그리고 5 ㎎/㎏ 1D11 또는 13C4 (Genzyme Corporation)의 하루 걸러 3 투여로 처리하였다. 메토트렉세이트, 1D11, 및 13C4 처리는 rhGAA 주사와 함께 시작하였다. 비장은 처리 개시 7일 후 수집하고 B 세포에 대하여 위에 기술한 바와 같이 처리하고, 배양 및 유동 분석하였다. 추가로, rhGAA 역가 데이터는 위에 기술한 바와 같이 동물을 12 주 동안 매주 rhGAA 투여, 1 또는 3 사이클로 메토트렉세이트 투여, 그리고 12 주 동안 하루 걸러 주 3 회 1D11 또는 13C4 투여하여 얻었다. 혈청 샘플은 ELISA 분석으로 매 2 주마다 수집하였다.

조직병리학 및 면역조직화학

심장 이식물은 10% 중성 완충된 포르말린으로 고정시키고, 종축으로 이등분하여 우측 및 좌측 심실과 유출 트랙을 노출시키고, 파라핀 포매를 통상적으로 실시하였다. 5 마이크론으로 섹션을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 메슨 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색하였다. 일련의 섹션은 이하에 기술되는 바와 같이 면역염색하였다. 각각의 H&E-염색된 섹션은 조직학적 등급 계획을 이용하여 다양한 특성의 이종이식 거부 병리(예를 들어, 맥관염, 심근 변성 및 괴사, 심근염)를 질적으로 평가하였다.

면역조직화학은 Bond-Max 자동화된 면역염색 시스템(Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL)을 사용하여 수행되었다. CD3 및 Foxp3 이중 면역학적양성 세포를 검출하기 위해, 이식 세포 섹션을 제조자의 가이드라인에 따라 Bond 폴리머 정제 검출 키트 및 Bond 폴리머 AP 레드 키트(Leica, Buffalo Grove, IL)를 사용하여 항-CD3 및 항-Foxp3 항체로 이중 면역염색 처리하였다. 간단히, 파라핀-포매된 이식물의 탈파라핀화된 섹션을 열-유도된 에피토프 회수 처리하고(99℃에서 25 분), 무혈청 단백질 블록(Dako, Carpentaria, CA), 토끼 단클론 항-CD3 항체(Lab Vision/Neo Marker), 퍼옥시다제-결합된 폴리머, 퍼옥시다제 블록, 및 디아미노 벤지딘 검출 시약과 함께, 이어서 래트 항-마우스 Foxp3 항체(eBioscience Inc., San Diego, CA), 다음에 토끼 항-래트 항체 (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)와 함께 인큐베이션 하였다. 다음에 슬라이드를 Bond 폴리머 AP와 함께 인큐베이션 하고 레드 검출 시약과 혼합하고, 최종적으로 헤마톡실린으로 카운터염색 하였다. 음성 대조 슬라이드에서, 1차 항-CD3 및 항-Foxp3 항체를 각각 크롬퓨어(Chromepure) 전 토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) 및 래트 IgG2a(AbD Serotec, Raleigh, NC)로 교체하였다.

혈청 동종항체 농도

혈청 동종항체 농도는 심장 이식되거나 정상 마우스로부터의 혈청을 1:50 희석에서 SV40 변형된 C57BL/6 섬유아세포 라인(SVB6)과 함께 인큐베이션한 다음 FITC 토끼 항-마우스 IgG(Dako, Carpinteria, CA)를 사용하여 섬유아세포 결합된 항체(동종항체)를 검출하고 유동 세포분석 하는 것에 의해 측정하였다. 혈청 염색된 섬유아세포의 기하학적 평균 형광 강도를 동위원소 대조 염색된 섬유아세포로 나누어 실험 간의 동종항체 농도를 정상화하였다. 동일 혈청 샘플은 SV40 변형된 BALB/c 섬유아세포 라인(SVBalb)에 결합하지 않기 때문에 동종 섬유아세포에 대한 혈청 항체의 결합은 동종항체 특이적이다(데이터 없음).

양자 전달 마우스 모델

C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratories로부터 입수하였고 특이적 무병원균 조건 하에서 수용하였다. 대조 마우스는 rhGAA의 단일 정맥주사를 20 ㎎/㎏ 투여하였다. 관용된 마우스에 3 회의 연속적인 매일의 메토트렉세이트 0.5 ㎎의 복막내 주사에 추가하여 20 ㎎/㎏의 rhGAA로 단회 정맥주사하였다. 초기 rhGAA 주사 6 일 후 두 제공자 그룹으로부터 비장을 수확하여 모아진 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 세포를 세척하고 0.22 μM 필터를 통해 여과하였다. 다음에 세포는 StemCell Technologies RoboSep 세포 분리 시스템을 사용하여 B 세포를 강화하고 200 ㎕ 정맥내 주사가 허용되도록 재현탁 하였다. 관용된 수용자 그룹 및 비-관용된 수용자 그룹은 정맥내 주사를 통해 하이 셀 10 x 10⁶ 또는 로우 셀 5 x 10⁶ 농도를 받았다. 대조군에는 rhGAA만, 또는 rhGAA 및 메토트렉세이트(단일 사이클의 3 회 연속 매일 MTX 주사)를 주었다. 모든 그룹은 매주 정맥내 rhGAA 20 ㎎/㎏ 주사를 받고, BD Vacutainer 혈청 분리 튜브로 16 주 동안 격주로 안와후방에서 채혈하였다. 혈청을 분리하고 ELISA 사용시까지 -20℃에서 저장하였다. 항-rhGAA 항체 역가는 ELISA를 이용하여 측정하고 SpectraMax M2에서 판독하고 Softmax를 이용하여 계산하여 역가 값을 외삽하였다. 대조 및 역가 정보를 포함하는 미가공 데이터 Softmax 파일과 EXCEL 스르레드시트를 네트워크 서버에 저장하였다. 모든 그래프와 통계처리는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 얻었다.

실시예 1: 항-약물 항체는 항체 치료제에 반응하여 생산된다

다클론 항체 mATG는 항원-제시 세포를 포함하는 다양한 면역 세포 타입에 결합한다. 본 발명자들의 데이터는 단일 코스의 mATG(복막내로 투여되는, 3일 간격으로 주어지는 25 ㎎/㎏의 2회의 투여량)가 마우스에서 100,000만큼 높은 항-mATG IgG 역가를 생성할 수 있다는 것을 보여준다(도 1a). 연속적 매달 주사(5 ㎎/㎏, 매 4 주마다)로서 주어질 때, 항-mATG 역가는 5 회의 매달 주사 이후 역가 5X10⁶까지 더욱 증가하였다(도 1b). 단일 코스와 매달 주사 양쪽에서 토끼 IgG(rbIgG)는 대조로서 사용되었다.

알렘투주맙은 뮤린 CD52와 교차-반응하지 않으므로, 알렘투주맙을 사용한 전임상은 huCD52 Tg 마우스에서 실시되어야 하며, 여기에서 이식유전자 발현 패턴은 인간에서 CD52 발현과 유사하다. mATG와 유사하게, 알렘투주맙(0.5 ㎎/㎏)의 정맥내 투여는 huCD52 Tg 마우스에서 유의성 있는 ADA 반응을 유발하였다. 이들 반응은 최초 4 처리를 통해 증가하였고, 다음에 감소하여 알렘투주맙의 5 번째 투여 이후, huCD52 Tg 마우스는 더 이상 항-알렘투주맙 항체를 생성하지 않았다(도 2). 이러한 비-반응성은 천연 관용이 일어난 것을 시사한다(Rosenberg et al., Blood, 93(6):2081-8 (1999)).

이 데이터는 C57BL/6 마우스에서 mATG에 대한 ADA 역가 및 huCD52 Tg CD1 마우스에서 알렘투주맙에 대한 ADA 역가가 높은(>100,000) 것을 보여준다. 이러한 높은 수준의 면역성은 mATG 및 알렘투주맙의 항원-제시 세포에 결합하는 능력에 기인할 수 있으며, 이에 의해 이들에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 항원 처리 및 제시를 증가시킨다.

실시예 2: 메토트렉세이트는 단일 사이클의 투여로 항-mATG IgG 반응을 제어한다

Thymoglobulin® 처리 이후 증가된 항체 역가가 보고되었으며, Thymoglobulin®으로 치료한 환자에서 혈청병, 급성 신부전 및 심장혈관 반응의 사례 보고가 기술되었다(Boothpur et al., supra; Lundquist et al., Liver Transpl, 13(5):647-50 (2007); Busani et al., Minerva Anestesiol, 72(4):243-8 (2006); Tanriover et al., Transplantation, 80(2):279-81 (2005); Buchler et al., Clin Transplant, 17(6):539-45 (2003)). 메토트렉세이트가 항-ATG 반응을 감소시키고, 이에 따라 이들 안전성 우려를 완화시킬 수 있는지 결정하기 위해, 단일 사이클만으로 주어지는 메토트렉세이트 3-일 요법이 마우스에서 항-mATG IgG 반응을 제어하는 수단으로서 평가되었다. 이것은 ERT와 관련하여 주어진 적어도 3 사이클과는 대조적으로 단지 단일 사이클의 메토트렉세이트가 mATG와 함께 투여된 점에서 앞서 발표된 요법과는 구분된다. 2 회의 mATG 투여(25 ㎎/㎏, 3일 간격)의 첫 번째에 개시되어 6 연속일 동안 5 ㎎/㎏으로 복막내 투여된 메토트렉세이트(Calbiochem catalog #454125)는, 효과 곡선 아래 면적 비교에서 처리 다음 적어도 8 주 동안 항-mATG IgG 반응을 95% 억제할 수 있었다(도 3).

다음에, 5 ㎎/㎏/주사로 mATG의 5 회 매달 주사 다음 항-mATG 역가에 대한 메토트렉세이트의 효과를 평가하였다. mATG의 매달 주사 처리는, 림프구 재증식이 mATG 처리 다음 1 개월에 거의 완료되기 때문에 시행되었다(Ruzek, supra). 다음에 항-약물 항체 반응을 20 주의 매달 처리 동안 매주 정량하였다. 이 시기 동안, mATG에 의한 CD4+ T 세포 고갈에도 불구하고, 항체 역가는 5백만까지 도달하였다(도 1b). 흥미롭게도, mATG와 동일 계획 및 투여량 수준으로 mATG 비-특이적 토끼 IgG를 받은 동물들은 낮은 항-토끼 IgG 반응을 보였다(도 1b). mATG의 증진된 면역성에 대한 하나의 가능성은 난포성 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포(APCs, antigen presenting cells)에 대한 mATG의 특이적 결합일 수 있으며, 이는 보체 존재시 B 세포 반응을 유의성 있게 증진시킬 수 있다. 두 가지 메토트렉세이트의 치료 요법도 평가하였다. 이전의 효소-대체 요법(ERT, enzyme-replacement therapy) 연구에서, 산 알파-글루코시다제의 첫 번째 3 투여 중에 주어지는 3 사이클의 메토트렉세이트는 매주 ERT 투여의 적어도 8 개월 동안 항체 역가에 있어서 지속되는 감소를 제공하였다((Joseph et al., Clin Exp Immunol, 152(1):138-46 (2008)). 유사한 코스의 메토트렉세이트를 mATG와 관련하여 평가하였는데, 여기에서는 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트가 mATG 투여 15 분 이내, 그리고 3 회의 매달 mATG 처리 각각의 첫 번째 24 및 48 시간 후에 주어졌다. 이 요법은 항-mATG 항체 반응을 약 4백만의 역가로부터 816,000의 역가까지 성공적으로 감소시켜, 효과 곡선 아래 면적 비교시 79%의 감소를 산출하였다(도 4a).

추가로, 5 회의 매달 mATG 처리의 첫 번째에만 주어지는 단일 코스 메토트렉세이트의 항-mATG IgG 반응에 대한 효과를 평가하고 3-사이클 요법과 직접적으로 비교하였다. 놀랍게도, 이러한 단일 사이클 요법은 항-mATG IgG 역가를 3-사이클 요법 보다 훨씬 더, 대략 50,000의 역가까지 감소시켰다(도 4b). 효과 곡선 아래 면적 비교시, 3 사이클 요법은 역가를 69% 감소시킨 반면, 단일 사이클 요법은 항-mATG IgG 역가를 98% 감소시켰다(도 4c). 3-사이클 요법에 대한 단일-사이클 요법의 증가된 효과는, 메토트렉세이트 노출을 증가시키는 것이, 아마도 항체 역가에 대한 제어를 중개하는 세포를 사멸시키는 것에 의해, 실제로 그 관용 효과에 반대하는 것을 제시한다.

실시예 3: 메토트렉세이트는 면역 관용의 능동적 기전을 유도한다

위에 나타낸 바와 같이, 매우 간단한 코스의 메토트렉세이트는 복수 라운드의 항원 시도를 통해 항체 반응을 유의성 있게 제어할 수 있다. 이러한 맥락에서, 간단한 사이클은 시험 개월 동안에 걸쳐 지속적인 효과(항체 역가 및 사이토카인 농도 양쪽에서)를 생성하는 단일 사이클의 메토트렉세이트이다. 이처럼 오래-지속되는 항체 반응의 제어는 메토트렉세이트가 면역 관용을 성공적으로 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 메토트렉세이트는 mATG의 5 연속 매달 투여의 맥락에서 평가되었다. 면역 관용 기전이 활성화되는지 여부를 추가로 평가하기 위해, 원래 5 회의 매달 mATG 주사를 받은 동물들을 처리로부터 8 주 동안 수용하였다. 이러한 휴식 기간에 이어서, 동물들에게 마지막 mATG 주사를 주었다. 면역 관용의 기전이 채용된다면, 항-mATG IgG 역가는 6 번째 mATG 처리 이후 유의성 있게 증가하지 않아야 한다.

본 발명자들의 데이터는 메토트렉세이트를 투여하지 않은 동물들이, 예상한 바와 같이 항-mATG IgG 역가의 증가를 경험한 것을 보여준다(도 5). 대조적으로, mATG의 첫 번째 주사와 함께 단일 사이클의 메토트렉세이트를 받은 동물들은 유의성 있게 큰 항-ATG IgG 역가를 생성하지 않았다(도 5). 3 사이클의 메토트렉세이트로 처리된 동물들에서도, 비록 효과가 극적이지는 않았지만, 유사한 경향이 관찰되었다(도 5). 효과 곡선 아래 면적을 비교할 때, 3 사이클 요법은 역가가 85% 감소한 반면, 단일 코스의 메토트렉세이트는 역가가 99% 감소하였다. 이들 데이터는 메토트렉세이트가 리콜 반응 동안 제어를 유지할 수 있는 것을 나타내어, 마우스는 이 항원에 대하여 관용을 형성시킨 것을 시사한다.

비록 메토트렉세이트-처리된 동물들이 연속적인 mATG 처리로 증가된 측정 가능한 역가를 생성하였지만, 메토트렉세이트-처리된 동물에서 전체 역가 수준은 mATG 단독 처리된 동물에서 관찰된 것보다 지속적으로 100-배 더 낮았다(도 6). 더 낮은 수준의 항체 역가는 안전성 위험 및 효능 효과의 가능성을 유의성 있게 감소시켜야 한다. 비록 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 이들 데이터는 항-mATG IgG 반응을 유의성 있게 감소시킬 수 있는 능동적 기전의 제어가 유도되고 메토트렉세이트 처리 후 오래 유지되는 것을 시사한다.

실시예 4: 단일 사이클의 메토트렉세이트는 항-알렘투주맙 반응을 유의성 있게 제어할 수 있다

재발-경감 다발성 경화증에서, 알렘투주맙은 매년 사이클로 투여되고 환자는 ADA를 발생시킬 수 있다(Coles et al., N Engl J Med, 359(17):1786-801 (2008)). 면역성 및 약효학적 시험이 복수의 III상 연구에서 실시 중으로, 항-알렘투주맙 항체가 환자들 서브셋에서 노출, 효능 및/또는 안전성에 영향을 줄 것인지 여부는 불명확하다. 따라서, 본 발명자들은 단일 사이클의 메토트렉세이트가 5 회의 매달 단일 알렘투주맙 주사 사이클 이후 ADA 역가를 제어할 수 있는지 여부를 평가하였다. HuCD52 Tg 마우스에 5 연속 개월 동안 매달 정맥내로 알렘투주맙(0.5 ㎎/㎏)을 주었다. 메토트렉세이트는 첫 번째 매달 알렘투주맙 투여 15분 전과 투여 24 및 48 시간 후에 0.5, 1 또는 5 ㎎/㎏으로 주었다. 1 ㎎/㎏의 메토트렉세이트는 항-알렘투주맙 반응을 88% 감소시켜 약간의 이점을 제공하였다(도 7a). 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트는 성공적으로 항-알렘투주맙 IgG 반응을 99% 감소시켰다(도 7a). 메토트렉세이트는 자연적인 관용에는 아무 효과도 없는 것으로 보였다.

두 번째 연구는 위의 발견을 확인하였다. 위와 같이, huCD52 형질전환 마우스를 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙의 5 회 매달 투여로 처리하였다. 마우스는 또한 알렘투주맙의 첫 번째 투여와 관련하여 5 ㎎/㎏/일 메토트렉세이트의 3 회 매일 투여와 함께 또는 없이 처리하였다(도 7b). 항-알렘투주맙 역가를 평가하고 관용을 확인하기 위해 혈청 샘플을 연구 동안 수집하였다. 역가 데이터는 5 번째 매달 투여 24 시간 후에 얻었다. 이 데이터는 메토트렉세이트가 항-알렘투주맙 항체 역가를 감소시킨 것을 보여준다(도 7c).

실시예 5: 메토트렉세이트는 임상적으로 관련된 알렘투주맙 투여 요법의 맥락에서 항-알렘투주맙 항체 반응을 제어할 수 있다

메토트렉세이트가 huCD52 Tg 마우스에서 알렘투주맙의 임상적으로-관련된 투여 계획 맥락에서 ADA를 성공적으로 제어할 수 있는지를 평가하기 위해 일련의 실험이 수행되었다. 임상에서, 알렘투주맙은 12 ㎎/일의 5회 매일 처리의 개시 사이클로서 투여된다. 환자에서 개시 처리 사이클 12 개월 후, 3 회의 매일 12 ㎎ 투여량의 알렘투주맙이 추가 사이클로 투여된다. 두 번째 처리 사이클 시기에, 순환하는 CD19⁺ B 세포의 농도가 기저값으로 회복되지만, 순환하는 CD4⁺ T 헬퍼 세포 및 CD8⁺ T 세포독성 세포의 농도는 완전히 재증식되지는 않았다(Coles et al., N Engl J Med, 359(17):1786-801 (2008)).

처음에, 알렘투주맙 5회 매일 투여 이후 순환하는 T 및 B 세포 서브셋의 고갈 및 재증식 동력학을 huCD52 Tg 마우스에서 검사하였다. 정맥내 주사를 통해 5 연속일 동안 0.5 ㎎/㎏(12 ㎎/㎏ 인간 용량과 동등) 알렘투주맙으로 처리된 huCD52 Tg 마우스의 말초 혈액에서, 총 CD3⁺ T 세포, CD4⁺ T 헬퍼 세포, 및 CD8⁺ T 세포독성 세포는 처리 4 주 후에 처리 전 수준으로 회복되지 않은 반면, CD19⁺ B 세포의 수는 대조군 수준으로 회복되었다(도 8a 내지 8D).

재치료 시기에 환자에서 경험되는 세포 환경을 모방하기 위해, huCD52 Tg 마우스에서 첫 번째 사이클 이후 4 내지 5 주 사이에 알렘투주맙을 재-투여하였다. 알렘투주맙의 개시 코스는 5-일 사이클이었으므로, 메토트렉세이트는 각각의 매일 알렘투주맙 처리 15 분 전 및 이후 2일 동안 투여하였다. 이 요법에서 주어지는 메토트렉세이트의 누적 사이클 투여량은 14 ㎎/㎏(2 ㎎/㎏/일)으로, 이는 메토트렉세이트가 5 ㎎/㎏/일의 3-일 코스로 주어질 때 누적 투여량 15 ㎎/㎏과 매우 유사하다. 본 발명자들은 3회의 알렘투주맙 처리 사이클 동안 항-알렘투주맙 항체에 대한 메토트렉세이트 2, 1 및 0.5 ㎎/㎏/일 투여의 효과를 평가하였다. 1 ㎎/㎏에서 메토트렉세이트는 시험을 받은 8 마리 마우스 중 7 마리 마우스에서 역가를 제어하는 것으로 보이며 모두 역가가 79% 감소되었다(도 9b). 2 ㎎/㎏에서 메토트렉세이트는 효과 곡선 아래 면적 비교시 성공적으로 ADA를 98% 감소시켰다(도 9a).

실시예 6: 메토트렉세이트는 mATG의 약물동력학 및 약력학을 개선시킬 수 있다

ADA는 단백질 치료제의 약물동력학 및 약력학을 방해할 수 있다. 본 발명자들은 항-mATG IgG ADA 반응이 mATG 약물동력학을 방해하는지 여부를 평가하였다. 마우스들은 5 개월 동안 매달 mATG 단독 또는 단일 사이클의 메토트렉세이트와 함께 mATG의 주사로 처리하였다. 메토트렉세이트는 매일 5 ㎎/㎏ 3회 투여량으로 투여하였다. 혈액은 순환하는 mATG의 농도를 평가하기 위해 1 개월, 3 개월, 및 5 개월 후 다양한 시기에 채취하였다(도 10).

1 개월에, 순환하는 mATG의 농도는 양쪽 처리 그룹 사이에 유사하였지만, 3 개월 및 5 개월에는 메토트렉세이트-처리된 그룹에서만 측정 가능한 농도의 순환하는 mATG를 가졌다. 메토트렉세이트 투여 없이, 세 번째 및 다섯 번째 mATG 투여 이후 측정된 mATG의 농도는 첫 번째 투여 후 측정된 것보다 유의성 있게 낮았다(도 10). 이전의 연구에서는 메토트렉세이트가 항-mATG IgG 반응을 유의성 있게 감소시키는 것을 보여주었다. 따라서, mATG에 대한 항체는 mATG 노출 및 약물동력학을 방해하는 것으로 보인다.

mATG에 대한 항체는 반복 투여 이후 순환하는 mATG의 농도를 유의성 있게 감소시키는 것으로 보이므로, 재투여시 mATG의 약물동력학은 마찬가지로 부정적 영향을 받을 것으로 예상할 수 있다. 혈액, 비장 및 림프절에서 림프구 고갈은 5 번째 매달 mATG 투여 후, 역가가 최고일 때 평가하였다. 위에 기술한 바와 같이, 메토트렉세이트 처리된 동물들은 단일 사이클의 처리만을 받았다.

순환하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 농도는 mATG 처리되고 메토트렉세이트 처리되지 않은 동물들에서 5 번째 mATG 처리 후 변화되지 않았다. 그러나, mATG와 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리된 동물들에서, 순환하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 유의성 있게 고갈되었다(도 11). 이러한 효과는 비장과 림프절에서도 마찬가지로 유사하게 관찰되었다. 메토트렉세이트 처리는 비장 및 혈액에서 T 조절 세포의 비율을 증가시키는 mATG의 능력을 증진시켰다(도 12a 및 12B). 유사한 효과가 혈액과 림프절에서 관찰되었다. mATG 및 Thymoglobulin® 처리 이후 T 조절 세포의 증진은 이 치료제의 효능을 기고하기 위해 상정되었다(Ruzek et al., Blood, 111(3):1726-34 (2008)). 연속된 코스의 mATG 이후 이러한 효과를 유지하는 것을 돕는 메토트렉세이트의 능력은 항체 항-토끼 IgG 역가를 유의성 있게 감소시키는 잠재적인 추가된 혜택이다.

지금까지, 약물동력학 및 효능 연구는 항-mATG 항체가 mATG의 노출 및 효능을 방해하는 것을 시사한다. 항-mATG IgG 역가와 mATG 노출 사이의 직접적인 비교는 종말점 역가가 10,000보다 클 때 순환하는 mATG의 농도가 유의성 있게 감소되는 것을 밝힌다(도 13a). 더욱이, 항-mATG IgG 역가가 100,000보다 클 때, mATG-중개된 세포 고갈은 저해된다(도 13b 및 13c). 역가와 세포 고갈 사이의 R² 상관관계는 > 0.7이다.

실시예 7: 메토트렉세이트는 알렘투주맙의 약력학을 개선시킬 수 있다

메토트렉세이트는 mATG의 약력학을 증진시킬 뿐 아니라, 항-알렘투주맙 반응이 고갈 활성의 일부를 중화하는 것으로 나타날 때 순환하는 T 및 B 세포의 알레투주맙-중개된 고갈을 회복시킨다. 이 실시예에 기술된 연구에서는, huCD52 Tg 마우스에 5 회의 매달 정맥내 알렘투주맙 주사를 메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이 주었다. 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트를 6 개월 연구의 첫 번째 3 일 동안 매일 투여하였다. 알렘투주맙 5 번째 투여 2 일 전 및 5 번째 투여 1 일 후에 양쪽 처리 그룹의 동물들로부터 혈액을 수확하였다. 세포 집단은 실시예 6에서 기술한 바와 같이 유동 세포분석에 의해 평가하였다.

본 발명자들의 데이터는, 알렘투주맙의 5 번째 매달 투여는 더 이상 T 세포를 고갈시키지 않는 것으로 나타난 것을 보여주는데, 순환하는 T 세포의 절대수가 처리 전 및 후에 유사한 것으로 보이기 때문이다(도 14(각각의 시점은 다른 세트의 동물을 나타낸다)). 대조적으로, 메토트렉세이트는 T 세포를 고갈시키는 알렘투주맙의 능력을 회복시키는 것으로 보였다(P=0.012). 알렘투주맙 단독 처리된 동물 및 알렘투주맙 투여 2 일 전 또는 1 일 후에 알렘투주맙과 메토트렉세이트 둘 다로 처리된 동물에서 순환하는 T 세포의 절대수를 비교할 때, 순환하는 T 세포의 수는 메토트렉세이트-처리된 동물에서 유의성 있게 저하되었다(P=0.034 및 0.02; 도 14). 유사하게, 메토트렉세이트 처리는 알렘투주맙에 의한 B 세포의 고갈을 증진시키는 것으로 보였으며(각각 P=1.2x10^-5, P=0.02), 순환하는 B 세포의 수는 처리 1 일 후 메토트렉세이트-처리된 동물에서 더욱 감소하였다(도 14).

실시예 8: 단일 사이클의 메토트렉세이트는 항-rhGAA 항체 반응을 유의성 있게 제어할 수 있다

본 발명자들은 또한 rhGAA 효소 대체 요법에서 메토트렉세이트의 효과를 연구하였다. 이 연구에서, 동물들에게 연속 12 주 동안 rhGAA를 매주 주사하고, 다음에 4 주 동안 휴식하고 16 주에 rhGAA를 재-시도하였다. 동물들은 1 주 째에 단일 사이클의 3일간 연속으로 매일 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트 투여를 받거나, 또는 1, 2 및 3 주 째에 각각 단일 사이클을 받았다(총 3 사이클). 0(처리 전), 6, 8, 12, 16, 18 및 20 주에 동물들에서 rhGAA-특이적 IgG 역가를 측정하였다. 본 발명자들의 데이터는 단일 사이클의 메토트렉세이트가 적어도 20 주 동안 3 사이클 요법과 마찬가지로 항-rhGAA 반응을 제어하는 것을 보여준다(도 15).

또한, 항-rhGAA 역가 생성에 있어서 T 세포의 역할을 평가하기 위해 T 세포 결핍 Nu/Nu 마우스에서 연구를 수행하였다. 이들 실험에서, 본 발명자들은 이들 T 세포 결핍 마우스에서 rhGAA에 대하여 ADA가 거의 또는 전혀 형성되지 않은 것을 반복적으로 관찰하였다(도 37a 및 37B). 이들 데이터는 T 세포가 항-rhGAA 역가에 기여한다는 개념을 지지한다. 따라서, 메토트렉세이트가 rhGAA에 대한 ADA를 제어할 수 있으므로, rhGAA에 대한 T 세포 반응에도 영향을 미치는 것으로 보인다.

실시예 9: 메토트렉세이트는 심장 동종이식의 mATG-중개된 생존을 증진시킨다

메토트렉세이트가 정상 마우스에서 mATG의 효능을 증진시킬 수 있는지 여부를 평가하는 것에 추가하여, 본 발명자들은 mATG 기능이 이식 세팅에서 메토트렉세이트에 의해 증가될 수 있는지 여부를 조사하였다. Thymoglobulin®이 이식 생존을 연장시키기 위한 유도 요법으로서 임상적으로 사용되기 때문에, 본 발명자들은 메토트렉세이트의 부가가 뮤린 동종 심장 이식 모델에서 mATG의 효능을 증가시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 20 ㎎/㎏의 mATG를 1 및 4 일에 투여하고 2 ㎎/㎏ 메토트렉세이트는 0 내지 6 일에 단일 사이클 처리로 투여하였다.

또한, 본 발명자들은 동일한 요법 하 또는 12 연속일의 확장된 요법으로 4배 낮은 투여량의 메토트렉세이트(0.5 ㎎/㎏)를 조사하였다. 마우스 그룹들은 비처리(식염수 대조군), mATG 단독, 또는 mATG와 메토트렉세이트의 조합 요법을 받았다. 정상 마우스에서의 연구와 유사하게, mATG와 함께 공동투여된 메토트렉세이트는 사용된 요법과 무관하게 mATG에 대한 항-약물 항체 역가를 감소시켰다(도 16a 및 표 1). 더욱이, 항체 역가에 있어서의 감소와 동시에 일어난 것은 이 이식 세팅에서 mATG 노출의 관찰된 증가였다(도 16). 이식된 조직에 대한 강력하고 동시에 일어나는 면역 반응의 조건 하에 예상되는 보조 효과를 고려할 때, 항-약물 항체 역가는 정상 마우스 세팅에서 보다 훨씬 신속하게 증가하고 mATG 농도는 첫 번째 mATG 투여 7 일 이내에 거의 검출 불가능에 가까운 결과를 낳았다(도 16b). 대조적으로, 이식 7 일 후까지 항-토끼 IgG 항체 역가는 메토트렉세이트 처리된 마우스에서 유의성 있게 더 낮았으며, 순환하는 mATG 농도는 이들 마우스에서 유의성 있게 더 높았다. 이는 진행중인 염증 반응 조건 하에서 항-약물 항체 반응은 가속화될 수 있고 약물동력학 및 효능에서 한층 더 큰 영향을 줄 수 있을 것임을 강조한다. 중요하게도, 이들 조건 하에서도 메토트렉세이트는 mATG 항-약물 항체에 대한 상당한 저해 효과를 갖고 mATG 노출을 증진시켰다. 그러나, 순환하는 mATG 농도는 mATG와 메토트렉세이트의 조합 처리에서 21 일까지 검출 불가능하게 낮았기 때문에, 추가의 관용 기전이 >100일 이식 생존에서도 작용할 것으로 보인다. 이들 결과는 동종 이식의 생존에 대한 mATG와 메토트렉세이트 처리 사이에 현저한 상승작용을 나타내고 정상 마우스에서 관찰된 것과 유사한 수준의 mATG 항-약물 항체의 감소 및 mATG 노출의 증진을 보여준다.

표 1: 메토트렉세이트 요법은 심장 동종이식 마우스에서 항-mATG 항체 역가를 감소시킨다

n/a=불가능

추가 데이터는 mATG와 메토트렉세이트의 조합 처리는 항-동종이식 반응을 감소시키는 데 더하여 심장 동종이식의 생존을 유의성 있게 연장시킨 것을 확인하였다(도 17 및 18). 정말로, mATG 또는 메토트렉세이트 단독 처리 둘 다에서는 각각 15 및 20 일의 평균 연장된 생존이라는 보통의 혜택을 제공한 반면, mATG와 평가된 임의의 메토트렉세이트 요법의 공동-투여는 이식을 유지한 대부분의 마우스에서 100 일이 넘는 심장 이식 생존의 극적인 혜택을 보여주었다(도 17). 심장 이식 생존은 mATG와 메토트렉세이트의 초기의 간단한 유도 이후 장기간 지속되므로, 이 요법은 면역억제보다는 면역관용성으로 보인다. 다른 면역억제제(예를 들어, 마이코페놀레이트 모페틸, 덱사메타손, 라파마이신 및 사이클로포스파미드)는 mATG와 공동-투여시 이식 생존을 유의성 있게 연장시키지 못했으므로, 이 효과는 mATG와 메토트렉세이트의 조합에 특이적이다. 놀랍게도, 메토트렉세이트 단독 처리는 항-동종이식 항체를 유의성 있게 감소시킬 수 있어, 일반적인 항체 반응을 제어하는 메토트렉세이트의 효과를 추가로 입증하였다(도 18). 이 시나리오에서, 메토트렉세이트는 심장 동종이식의 복수의 항원에 대한 항체 반응을 동시적으로 제어할 수 있는 것으로 보인다. 추가의 감소는 mATG와 메토트렉세이트의 조합 처리에 의해 유도되었다(도 18c).

실시예 10: 메토트렉세이트-유도된 관용의 기전은 현재 알려지고 수용된 메토트렉세이트의 기능과는 다른 독특한 것이다

*위의 실시예에 기술된 메토트렉세이트의 투여 요법은 이전에 기술된 것과는 다른 독특한 기전을 적용하는 것으로 보인다. 메토트렉세이트는 증식하는 세포의 사멸을 유도하는 것에 의해 억제 효과를 중개하는 것으로 생각되는 폴레이트 길항제이다. 위에 제시된 mATG 데이터는 메토트렉세이트-처리된 동물에서 각각의 연속적인 mATG 처리로 항체 반응이 유도되지만 유의성 있게 감소되어 유지되는 것을 보여준다. 이들 데이터는 B 세포 반응이 능동적으로 관리되는 것을 시사한다. 이론에 구애되지 않고, 본 발명자들은 메토트렉세이트가 이들 반응을 반응이 일어남에 따라 제어하는 조절 세포 집단(들)을 유도할 수 있다는 가설을 세운다. 본 발명자들은 Myozyme®과 메토트렉세이트 처리된 동물에서 다양한 비장 B 및 T 세포 서브셋에 대한 메토트렉세이트 처리의 효과를 Myozyme® 단독 처리된 동물과 비교하여 조사하였다. 본 발명자들은 Myozyme® 처리 7 및 8 일 후에 B10 조절 B 세포 집단에서 유의성 있는 증가를 관찰하였다(메토트렉세이트 처리 4 및 5 일 후; 도 19).

추가로, 많은 활성화된 B 세포 서브셋이 메토트렉세이트 처리 후 유의성 있게 증가되었다(도 20). 이들 집단은 활성화된 변연대 B 세포, 활성화된 난포성 B 세포 및 활성화된 전이성 2 및 3 B 세포를 포함하였다. 세포 집단은 다음과 같이 정의되었다: B2/난포성 B 세포: CD19⁺CD21^intCD23^hi; 전이성 2 B 세포: CD19⁺CD93⁺CD23⁺IgM^hi; 및 전이성 3 B 세포: CD19⁺CD93⁺CD23⁺IgM^lo; 변연대 B 세포: CD19⁺CD21^hiCD23^lo. Myozyme®이 1 일 및 8 일에 투여되고 5 ㎎/㎏의 메토트렉세이트가 1 내지 3 일 및 8 내지 10 일에 주어지는, 2 사이클의 Myozyme® 및 메토트렉세이트가 주어진 동물에서 비장 세포 집단의 매일 평가는 이들 활성화된 B 세포 집단이 증가된 상태로 유지되는 것을 보여주었다(도 21). 메토트렉세이트 처리 후 예상된 반응이 활성화된 증식하는 세포의 사멸일 것이기 때문에, 이러한 결과는 놀라운 것이다. 대조적으로, 활성화된 T 헬퍼, T 세포독성 및 T 조절 세포 집단은 크게 변화하지 않고 남아있었다(도 22). T 헬퍼 세포는 CD4+로 정의되고, T 세포독성은 CD8+로 정의되고, 그리고 T 조절 세포는 CD4+CD25+ 및 FoxP3+로 정의되었다. 이들 발견은 증가된 B 세포 집단이 메토트렉세이트-유도된 면역 내성을 중개하는 것을 도울 수 있음을 시사한다.

실시예 11: 메토트렉세이트는 mATG와 조합하여 선택된 B 세포 집단을 증가시킨다

위의 실시예에서, 각각의 mATG 처리 후, ADA 역가는 mATG 단독 처리된 마우스와 mATG 및 메토트렉세이트 처리된 마우스 양쪽에서 증가하여, 양쪽 세트의 동물들이 항체 반응에 기여할 수 있는 B 세포를 포함하는 것을 시사한다(도 6). 이 경우라면, 적어도 2 가지 가설을 세울 수 있다. 첫 번째 가설은 메토트렉세이트가 Myozyme®에 대하여 반응할 수 있는 대다수의 B 세포를 사멸시킬 수 있고 남아있는 소수가 이러한 약간의 반응에 책임이 있다는 것이다. 비록 이것이 가능하더라도, 복수의 실험으로부터의 유동 세포분석 데이터는 Myozyme® 및 메토트렉세이트 처리에 따른 B 세포 집단의 감소를 나타내지 않는다. 두 번째 가설은 Myozyme®에 대하여 반응할 수 있는 B 세포 집단은 이러한 간단한 코스의 메토트렉세이트에 의해 사멸되지 않고, 남아서 Myozyme®에 대한 각각의 노출에 따른 조절 세포에 의해 제어된다는 것이다. 지금까지, 표현형 데이터는 메토트렉세이트와 Myozyme® 처리에 따른 B 세포 서브셋의 증진을 기술한다. 이들 B 세포의 표현형은 동물 연구 및 관용된 이식 환자에서 기술된 조절 B 세포 서브셋과 유사한 것으로 보인다. 따라서 본 발명자들은 다른 처리의 맥락에서 이 두 번째 가설을 시험하고자 하였다.

동물들은 5 개월 동안 매달 mATG 처리되고 연구의 첫 번째 3일에 단일 사이클의 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트, 또는 3회의 사이클의 5 ㎎/㎏ 메토트렉세이트를 받거나, 또는 메토트렉세이트를 받지 않았다(도 23). 3 개의 처리 그룹 사이에서 세포 집단의 차이는 5 번째 mATG 투여 하루 전 및 5 번째 mATG 투여 2일 후 동물들에서 집단을 비교하는 것에 의해 평가하였다.

놀랍게도, 단일 사이클의 메토트렉세이트 처리 5 개월 후, 단일 사이클의 메토트렉세이트와 mATG를 받은 마우스과 mATG 단독 또는 mATG와 3회의 사이클의 메토트렉세이트를 받은 마우스 사이에서 차이가 관찰되었다. 예상치 않게 효과를 나타낸 두 세포 집단은 활성화된 난포성 B 세포 및 활성화된 전이성 3 B 세포였다(각각 도 24a 및 24B). mATG 단독 또는 3회의 사이클의 메토트렉세이트와 조합으로 투여된 마우스에서, 이들 세포 집단의 절대 세포수에서 감소가 관찰되었다. 그러나, 단일 사이클의 메토트렉세이트를 받은 마우스에서는 이들 집단에서 통계적으로 유의성 있는 감소가 관찰되지 않아, 이러한 메토트렉세이트의 투여 요법이 이들 집단의 어느 정도의 강화를 유도하는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 이들 세포 집단 양쪽이 Myozyme과 조합된 메토트렉세이트 처리에 따라 바로 강화된 것으로 보였다(도 21). 유사한 서브셋은 관용된 이식 환자에서도 확인되었다. 단일 사이클의 메토트렉세이트 처리가 항원 노출로 활성화되고 억제된 이들 B 세포 서브셋을 유도할 수 있는 것이 가능하다.

실시예 12: 메토트렉세이트는 알렘투주맙과 조합하여 선택된 B 세포 집단을 증가시킨다

실시예 4에서 기술한 바와 같이, huCD52 형질전환 마우스를 알렘투주맙의 첫 번째 투여와 관련하여, 5 ㎎/㎏/일의 메토트렉세이트의 3 회 매일 투여와 함께 또는 메토트렉세이트 없이, 5 개월 동안 0.5 ㎎/㎏ 알렘투주맙의 단일 매달 투여로 처리하였다. 세포 집단은 알렘투주맙 5 번째 투여 2 일 전, 그리고 1, 7 및/또는 28 일 후 유동 세포분석에 의해 마우스의 혈액 및 비장에서 평가하였다.

혈액에서, 알렘투주맙의 약력학적 효과는 알렘투주맙 5 번째 투여 24 시간 후 메토트렉세이트-처리된 동물에서 증진되었다. 통계적으로 유의성 있는 세포 고갈은 5 번째 투여 1 일 후 T 세포 및 B 세포 서브셋 둘 다에서 관찰되어, 항-알렘투주맙 역가가 이들 동물에서 낮고 알렘투주맙-중개된 고갈을 방해하지 않는 것으로 나타난 이전의 데이터와 일치하였다. 대조적으로, 알렘투주맙 단독 처리된 마우스는 알렘투주맙 약력학을 방해하는 더 많은 알렘투주맙-중화 항체를 가질 수 있다. 도 25a에서 보듯이, 알렘투주맙 투여 1 일 후에 알렘투주맙-처리된 마우스에서는 유의성 있는 T 세포 서브셋의 고갈이 없지만, 알렘투주맙과 메토트렉세이트로 처리된 마우스는 총 T 세포, T 헬퍼 세포 및 T 조절 세포에서 유의성 있는 알렘투주맙-중개된 고갈을 나타낸다. 비록 알렘투주맙 단독 처리된 동물에서도 세포수 감소를 향한 경향이 관찰되었지만, 유사한 발견이 순환하는 B 세포 서브셋에서 관찰되었다(도 25b). 순환하는 T 세포 집단과 함께, 비장 T 세포 집단은 5 번째 알렘투주맙 처리 1 일 후 메토트렉세이트-처리된 동물에서 유의성 있게 고갈되었다(도 26A-B).

알렘투주맙과 메토트렉세이트로 처리된 마우스에서의 T 세포 고갈과 대조적으로, 분석된 각각의 비장 B 세포 집단은 난포성 B 세포를 제외하고 유의성 있게 고갈되지 않았다(도 27). 본 평가에는 조절 B 세포 집단인 B10 B세포가 포함된다. 이론에 구애되지 않고, 본 발명자들은 메토트렉세이트가 알렘투주맙-중개된 고갈에 대항하는 이들 B 세포 집단의 일부 또는 전부를 강화할 수 있다는 가설을 세운다. 면역 세포는 혈액 내에서 분화하지 않기 때문에, 이러한 강화는 혈액의 빠른 유동 환경에서 일어날 것으로 예상치 못한 것이다. 대신에, 면역 반응은 비장 및 다른 말초 림프 조직에서 일어나는데, 여기에서 세포/세포 상호작용과 사이토카인/케모카인-개시된 반응이 조직의 다양한 틈새에서 일어날 수 있다. 이것은 혈액과 비장에서 관찰되는 알렘투주맙-중개된 B 세포 고갈의 차별적 효과를 설명할 수 있다. 이들 데이터는 비장 B 세포가 mATG와 조합된 메토트렉세이트의 단일 사이클로 처리된 마우스에서 강화되는 것으로 보이는, mATG로 생성된 데이터와 유사하다(도 24a 및 24B). 실제로, 본원에서 기술된 모든 연구에서, 메토트렉세이트 처리에 따른 강화는 활성화된 세포의 특이적 집단을 평가할 때 관찰되었다. 그러나, 총 난포성 B 세포와 같이, 활성화된 및 비활성화된 세포 둘 다를 포함하는 세포 집단의 총 수를 평가할 때, 메토트렉세이트-처리된 동물에서 유의성 있는 강화는 관찰되지 않았다.

알렘투주맙 처리 24 시간 후 비장 세포 집단과 대조적으로, 알렘투주맙의 단일 투여(메토트렉세이트 없이) 처리 3 일 후 비장 세포 서브셋은 유의성 있게 고갈되었다(도 28a). 24 시간에서, B 세포 고갈은 알렘투주맙-처리된 동물에서 알렘투주맙 처리 3 일 후 보다 클 수 있는데, B 세포 재증식은 3-일 기준으로 시작될 수 있기 때문이다. 이것은 말초 혈액에서 이들 집단을 평가하는 몇몇 연구에서 보여주었다. 고갈은 말초 혈액에서 빠르게는 투여 3 시간 후에 관찰되었다. 투여 3 일 후까지, 비록 고갈 비율은 24 시간에서만큼 크지는 않았지만, 순환하는 B 세포 집단은 인산염 완충된 식염수(PBS)로 처리된 대조군 마우스보다 알렘투주맙-처리된 마우스에서 여전히 유의성 있게 더 낮았다. 24 시간에서의 고갈 백분율은 92%인 반면, 3일에서의 고갈은 36%였다(도 28b). B 세포 재구성은 단일 투여에 따라 신속하게 일어나는 것으로 보인다.

결론적으로, 동물들이 메토트렉세이트를 받고 5 개월 후 및 항원 노출 직후, 메토트렉세이트는 관용 유도 중개를 잠재적으로 돕는 B 세포 집단을 강화시킬 수 있는 것으로 보인다. 강화된 것으로 보이는 집단들은 메토트렉세이트 처리 직후 증가된 것들과 유사하다(도 21). 함께 고려하면, 이는 메토트렉세이트가 면역 반응이 항원 노출 시기에 능동적으로 제어되도록 허용하는 환경을, 메토트렉세이트 처리 오랜 후라도 유도할 수 있는 것을 시사한다.

실시예 13: 사이토카인 농도에 대한 메토트렉세이트의 효과

사이토카인은 B 세포 반응에서 이중적인 역할을 한다. 예를 들어, B-세포 활성화 사이토카인 IL-6 및 BAFF는 B 세포 분화에도 요구된다. 메토트렉세이트는 B 세포 집단을 증가시키는 것으로 생각되기 때문에, 이들 사이토카인이 증가될 것으로 예상할 수 있다. 그러나, IL-6는 또한 전-염증성(pro-inflammatory)이고, 따라서 증가된 농도는 메토트렉세이트-유도된 효과를 방해할 수 있다. IL-6와 마찬가지로, IL-10은 B 세포의 혈장 세포로의 분화 및 면역억제에도 관여한다.

BAFF 데이터는 알렘투주맙의 5 번째 투여 24 시간 후 채취된 혈청 샘플로부터 생성되었다(도 29a). 이것은 위에 제시된 이 연구로부터의 세포 데이터의 연속이다. 이 시점에서는 BAFF 농도에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 29b).

표 2: 알렘투주맙 및/또는 메토트렉세이트 처리 마우스에서의 연구 디자인

사이토카인 농도는 알렘투주맙의 2 번째 사이클 1 주일 후에 평가하였다(도 29b). 일반적으로, 알렘투주맙의 2 번째 사이클 1 주일 후 사이토카인 농도는 낮은 것으로 보였다. 이 시점에서, 통계적으로 유의성 있는 증가는 2 ㎎/㎏의 메토트렉세이트로 처리된 동물의 TNF-알파 농도에서 관찰되었다. 이러한 증가는 메토트렉세이트-유도된 관용과 관련되거나 염증 반응의 신호인 변화를 반영할 수 있다. IL-6에서의 명백한 증가 및 IL-7에서 잠재적으로 약간의 감소와 같은 다른 사이토카인에서 관찰된 경향이 역시 주목되었다(도 30).

조절 B 세포는 IL-10 분비와 관련되었다. IL-10-분비 조절 B 세포가 메토트렉세이트-유도된 관용에 역할을 하는지 여부를 평가하기 위한 한 가지 방법은 메토트렉세이트가 IL-10 결핍 동물에서 항체 반응을 제어할 수 있는지 여부를 평가하는 것이다. 이러한 타입의 평가는 위에 언급한 바와 같이, IL-10이 혈장 세포 분화에 필요하고 따라서 항체 반응이 이들 동물에서 더 낮을 수 있다는 점에서 도전적일 수 있다. 이러한 경고를 염두에 두고, 본 발명자들은 IL-10이 메토트렉세이트-유도된 관용에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사하는 흥미로운 경향을 관찰하였다.

이 연구에서, 동물들은 9 주 동안 매주 20 ㎎/㎏의 정맥내 Myozyme®을 받았다. 3 사이클의 메토트렉세이트를 Myozyme® 첫 번째 3 회 매주 투여 0, 24 및 48 시간 후 5 ㎎/㎏/일로 투여하였다. 항-Myozyme® 역가는 4, 6 및 9 주에 평가하였다(도 31). rhGAA- 및 rhGAA/메토트렉세이트-처리된 IL-10 녹아웃 마우스에서의 평균 역가 값을 비교하여, 비록 약간의 경향은 9주에 관찰되었지만, 역가의 유의성 있는 감소는 관찰되지 않았다. 예상한 바와 같이, 항체 역가는 IL-10 녹아웃 동물에서 C57BL/6 야생형 동물에서처럼 높지 않았다. rhGAA 및 메토트렉세이트로 처리된 C57BL/6 야생형 동물에서 항-rhGAA 반응은 4, 6 및 9 주에 감소하였다. 대조적으로, 4 및 6 주에서의 항-rhGAA 역가는 rhGAA 및 메토트렉세이트로 처리된 IL-10 녹아웃 동물에서 감소되지 않았다. 9 주에서는 약간의 감소가 있었는데, 이는 IL-10 결핍 마우스에서 관용의 지연된 유도를 나타낼 수 있다. 이것은 IL-10이 조절 B 세포에 의해 분비되는 유일한 억제성 사이토카인이 아니라는 보고와 일치할 것이다(Sagoo et al., J. Clin. Investigation; 120(6):1848-1861 (2010)). TGF-베타 역시 조절 B 세포 반응과 관련되었다. 이러한 지연이 있다면, TGF-베타와 같은 다른 사이토카인은 메토트렉세이트-관용 효과를 중개하는 것을 도울 수 있을 것이다. 따라서, 이들 데이터는 IL-10이 메토트렉세이트-유도된 관용에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 14: 알렘투주맙-관련된 2차 자가면역의 치료에서 메토트렉세이트의 역할

알렘투주맙-처리된 다발성 경화증 환자는 2차 자가면역을 형성시킬 수 있다. 알렘투주맙 처리에 따라 형성되는 가장 흔한 자가면역 질환은 갑상선 자가면역과 관련된 것들이다. 추가로, 면역 혈소판감소성 자반 및 굿패스처 증후군(Good Pasture's syndrome) 역시 알렘투주맙으로 처리된 다발성 경화증 환자에서 관찰되었다. 3 가지 타입의 자가면역 모두 B 세포 반응 및 자기-항체가 질병 형성과 병리에 직접적으로 연결된다는 점에서 B 세포 중개된다. 이들 2차 질병의 형성과 알렘투주맙 처리의 관련은 잘 이해되지 않는다.

알렘투주맙 처리에 따라, T 세포 및 B 세포가 고갈된다. 이들 고갈된 T 및B 세포의 큰 비율이 중추신경계에서 발현된 항원과 상호작용하는 자기-반응성 세포일 것이다. 결과적으로, 이들의 알렘투주맙에 의해 후속되는 고갈이 이 단클론 항체 요법의 치료적 이득에 기여하는 것으로 생각된다. 자가면역 질환으로 고통 받는 환자들은 다양한 자가면역 질환과 관련되는 복수의 항원에 대하여 자가반응성(즉, 자가반응성 B 세포 및 자가반응성 항체)을 포함하는 것으로 기술된다. 환경적, 생리적, 및 유전적 인자가 모두, 자가면역 질환이 환자에 존재할 어느 자가면역 질환에 뒤따르고 영향을 미칠 것인지 여부의 결정에 기여한다. 한 가지 타입의 자가면역 질환으로 고통 받는 환자가 또한 다른 것을 형성시키는 것은 드물지 않다.

알렘투주맙의 맥락에서, 하나의 가설은 다발성 경화증과 관련된 것만큼 현저하지 않는 내재적 자가반응성이 알렘투주맙 치료에 따른 림프구-고갈된 환경에서 확장되도록 허용된다는 것이다. 하나의 자가면역 질환을 형성시킨 사람은 통상적으로 많은 다른 항원에 대하여 자가반응성을 갖고, 따라서 다른 자가면역을 형성시키는 소인을 갖는다(즉, "내재적 자가반응성(inherent autoreactivity)"). 이러한 생각을 뒷받침하는 것은 알렘투주맙이 모든 B 세포 집단을 동등하게 고갈시키지 않는 것을 보여주는 huCD52 Tg 마우스에서의 데이터이다(도 27). 사실, 낮은 친화성의 자가반응성 B 세포, 특히 변연대 B 세포의 구성 성분을 선호하는 B 세포 목록에는 불균형이 있는 것으로 보인다. 중요하게는, 변연대 B 세포는 갑상선 자가면역과 관련된다(Segundo et al., Thyroid, 11(6):525-530 (2001). 추가적으로, 조절 B 세포 서브셋, B10 B 세포는 다발성 경화증, EAE의 뮤린 모델에서 자가면역성 억제를 돕는 것을 보여주고(Matsushita et al., J. Clin. Investigation, 118:3420-3430 (2008)), 또한 인간에서 존재하는 것을 보여주는데((Iwata et al., Blood, 117:530-541 (2011)), 변연대 B 세포보다 더 긴 시기 동안 고갈된다. 첫 번째 사이클의 알렘투주맙 동안 단기 코스의 메토트렉세이트 치료는 조절 B10 B 세포의 재현을 증가시키는 것을 도울 수 있고, 그리고 변연대 B 세포가 알렘투주맙 처리에 따라 B 세포 목록에서 동등 이상으로 재현되도록 B 세포 균형을 회복시키고, 그리고/또는 변연대 B 세포를 조절 변연대 B 세포(CD1d+변연대 세포)로 분화시킨다.

비장 B 세포 집단은 B 세포 고갈에 대한 알렘투주맙의 효과를 결정하기 위해 연구되었다(도 32). 0.5 ㎎/㎏의 알렘투주맙을 huCD52 Tg 마우스에 5일 연속으로 정맥내 투여하였다. 특히, 난포성 B 세포(통상적으로 자가반응성이 아닌), B1 B 세포 및 변연대 B 세포(둘 다 자가반응성인), B10 B 세포(조절성인), 그리고 전이성 B 세포와 변연대 B 세포(B 조절 세포로 분화될 수 있는 것으로 생각되는)의 집단을 조사하였다.

난포성, B1 및 조절 B 세포는 알렘투주맙 처리 1 및/또는 2 주 후에 고갈된 반면, 변연대 B 세포 및 전이성 1(T1) 및 전이성 2(T2) B 세포는 어느 시점에서도 고갈되지 않았다(도 32). 비록 2 및 4 주에 통계적 유의성은 관찰되지 않았지만, 전이성 3 B 세포(T3)는 단지 처리 1 주일 후에 고갈되었고, 조절 B 세포의 수는 일반적으로 대조-처리된 동물에서보다 알렘투주맙-처리된 마우스에서 더 낮은 것으로 보인다.

알렘투주맙 처리의 맥락에서 B 세포 집단에 대한 메토트렉세이트의 효과를 검사하기 위해, 표 3 및 도 33에 나타낸 바와 같이 2 번째 연구가 수행되었다. 놀랍게도, 메토트렉세이트와 알렘투주맙의 공동-처리는 알렘투주맙 단독에서 관찰된 고갈보다 알렘투주맙 처리 직후 변연대 B 세포의 다 강력한 고갈을 허용할 수 있어(도 34), 이에 의해 감염에 대한 적절한 초기 반응에 필요한 자연적으로 발생한 저-친화성 자기-반응성 B 세포의 적정 농도를 갖는 균형 잡힌 면역 환경을 촉진한다.

알렘투주맙 단독 처리된 마우스 그룹이 이 연구에 포함되었고, 이러한 단기 사이클 요법으로 메토트렉세이트만 처리된 마우스가 항원 자극 없이 세포성 효과를 나타내는 것을 밝혔으며, 이는 메토트렉세이트 단독 처리된 대조군 마우스에서 관찰된 효과와는 다를 수 있다(도 34). 비장 B 세포 집단이 메토트렉세이트 처리 마지막 날 2 일 후 평가된 이 연구에서 생성된 데이터는 메토트렉세이트가 변연대 B 세포의 고갈을 증진시킬 수 있다는 것을 시사한다. 이는 알렘투주맙과 함께 전달될 때, 메토트렉세이트가 자연적으로 발생한 B 세포 서브셋이 비-자가반응성 B 세포 서브셋과 적절히 균형을 이루는 세포 환경을 야기할 수 있다는 가설을 지지한다.

표 3: 알렘투주맙 및/또는 메토트렉세이트 처리된 마우스에서의 연구 디자인

Myozyme®과 함께 메토트렉세이트 처리 직후에 뒤따르는 세포 집단의 매일 평가에 근거하여, 본 발명자들은 알렘투주맙의 맥락에서 B10 B 세포 집단 및 다른 잠재적 조절 B 세포 집단이 메토트렉세이트 처리 5 내지 6 일 후보다 이르지 않게 메토트렉세이트에 의해 강화될 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 이러한 집단이 메토트렉세이트 처리 2 일 후처럼 일찍 강화되는 것을 관찰하지 못하였는데, 이는 이러한 가설과 일치한다. 대조적으로, mATG와 알렘투주맙 처리의 맥락에서 보여진 바와 같이, 이 효과는 메토트렉세이트 처리 후 더 긴 시기에서는 다른 것으로 보인다. 이들 두 시나리오에서, 메토트렉세이트 처리 5 개월 후 B 세포 서브셋이 메토트렉세이트-처리된 마우스에서 mATG 및 알렘투주맙 투여 1 및 2 일 후 강화되는 것으로 보였다(도 35 알렘투주맙 데이터 참조). 흥미롭게도, 이 시점에서 변연대 B 세포 역시 증가된 것으로 보였다(비록 이것이 통계적으로 유의성 있지는 않지만).

메토트렉세이트는 단백질 치료 및 이식된 심장 조직 항원에 대한 관용을 유도하고, 이에 의해 ADA 및 항-동종이식 항체의 생산 및 분비와 관련된 B 세포 면역 반응을 제거한다. 본 발명자들은 이에 따라 메토트렉세이트가 알렘투주맙 처리에 따른 세포 환경 제어를 도울 수 있을 뿐 아니라, 자기-단백질에 대한 관용을 유도하고 B 세포-중개된 자가면역 질환의 생성 및 병리에 기여하는 자가-항체의 발생과 관련된 B 세포 면역 반응을 경감시킬 수 있다는 가설을 세웠다.

이 가설을 시험하기 위해, 동물들에게 5 개월 동안 매달 알렘투주맙을 투여하였다. 메토트렉세이트는 첫 번째 알렘투주맙 처리 다음에만 연속 3 일 동안 5 ㎎/㎏으로 한 그룹의 동물들에게 주어졌다. 알렘투주맙 처리의 5 번째 투여 2 일 전 및 1 일 후, 동물들을 분석을 위해 희생시켰다. 알렘투주맙 처리 전 및 후 혈청 사이토카인 농도를 평가하였다. 놀랍게도, 이들 결과는 전염증성 사이토카인 MCP-1, IL-13, IL-6및 IL-12의 농도가 알렘투주맙의 5 번째 투여 24 시간 후, 임의의 메토트렉세이트 투여 5 개월 후, 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 감소된 것을 시사한다(도 36). 이들 사이토카인은 B 세포 반응 및 면역 세포 보충을 촉진할 뿐 아니라, 또한 과민성 반응에도 역할을 할 수 있다. 이들 데이터는 메토트렉세이트가 주입 관련된 반응 억제를 도울 수 있음을 시사한다.

실시예 15: 메토트렉세이트는 조절 B 세포 집단의 특이적 유도를 통해 면역 관용을 유도한다

본 발명자들의 데이터는 놀랍게도 메토트렉세이트가 다른 사람들(Messinger et al., Genetics in Medicine 14:135-142 (2012) and Lacana et al., Am J Med Genet Part C Semin Med Genet 160C:30-39 (2012))에 의해 시사된 것과 같이 증식하는 세포를 사멸시키는 예상된 수단에 의해서가 아니라, TGF-베타, IL-10 및 FoxP3를 발현하는 조절 B 세포 집단의 특이적 유도를 통해 면역 관용을 유도한다는 것을 보여준다. 단일 사이클의 메토트렉세이트에 의해 Myozyme®에 대하여 관용된 마우스로부터의 B 세포는 면역 관용을 나이브 동물에게 전달하는 것으로 보였다. 더욱이, IL-10 및 TGF-베타는 메토트렉세이트-유도된 면역 관용에 필수적으로 보였다. 일부 세포 서브셋에서는 또한 메토트렉세이트가 TGF-베타를 유도하고, 이는 차례로 IL-10 및 FoxP3를 유도하는 것으로 보였다. 이러한 기전은 새롭고 예상치 못했던 것이고, 3 사이클의 메토트렉세이트, Rituximab® (B 세포-고갈성 약제), 및 임의로 정맥내 면역글로불린(IVIG)의 공동-처리를 포함하는 현재의 임상적 면역 관용 프로토콜의 가치에 의문을 제기한다(Messinger et al., supra). 비록 이 조합 치료는 성공적인 것으로 보이지만, 본 발명자들의 데이터는 1) 단일 사이클의 메토트렉세이트는 잠재적으로 현재 관찰된 것보다 훨씬 낮은 ADA 역가를 생성시킬 수 있다는 것, 그리고 2) 너무 많은 메토트렉세이트 및 리툭시맙이 투여되면, 면역 관용이 유지되지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 리툭시맙-중개의 B 세포 고갈은 혈액 및 조직에서 모든 B 세포를 완전히 고갈시키는 것으로는 생각되지 않기 때문에 리툭시맙의 개시 투여량은 그렇게 해롭지 않을 수 있다. 본원에 기술된 연구에서 보듯이, 비록 알렘투주맙은 능동적으로 B10 B 세포를 고갈시키지만, 메토트렉세이트 처리는 여전히 메토트렉세이트의 개시 사이클에 이어지는 수 개월 동안 알렘투주맙 관용의 유지를 돕는 것으로 보이는 이들 세포에 접근할 수 있다. 더욱이, 리툭시맙 처리는 전이성 B 세포의 증가된 재현이 신속하게 뒤따르며, 이는 본원에서 보여준 바와 같이 면역 관용을 유도하고 중개하기 위한 메토트렉세이트에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 이들 기전 데이터는 반직관적이고 예상치 못한 것으로, 단일 사이클의 낮은 투여량의 메토트렉세이트가 그 중에서도 특히 림프구-고갈 단백질 치료제에 대한 면역 관용을 유도하는 놀랍고도 효과적인 방법이다.

위에 기술한 바와 같이, 몇 가지 B 세포 서브셋은 단백질 치료제와 함께 메토트렉세이트의 공동-투여 직후 세포 비율 및/또는 세포수에서 유의성 있게 증가된다. 더욱이, 이들 서브셋은 메토트렉세이트의 단일 사이클 처리 오랜 후 메토트렉세이트-관용된 마우스에서 증가된 것으로 보인다(예를 들어 도 24, 27 및 35 참조). 함께, 이들 데이터는 이들 세포 집단이 면역 관용 유도의 유도와 유지 둘 다를 능동적으로 중개할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 가설을 더욱 입증하기 위해, 본 발명자들은 이들 세포 집단이 사이토카인 및 면역 조절에 종종 관련되는 다른 단백질을 발현하는지 여부를 조사하였다.

면역 조절에 관련되는 하나의 세포 타입은 B10 B 세포이다. 인간 및 마우스 둘 다에서 B10 B 세포는 그의 IL-10 발현을 특징으로 하고((Matsushita et al., J. Clin. Invest. 118:3420-3430 (2008), Iwata et al., Blood 117:530-541 (2011)), IL-10 컴피턴트(competent) 마우스에서 면역 반응을 단지 억제할 수 있다. B10 B 세포는 메토트렉세이트-관용된 마우스에서 증가되었고(도 19), IL-10 녹아웃 동물들은 메토트렉세이트-유도된 면역 관용에 비반응성이었다(도 31). Myozyme® 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물들로부터 분리된 B10 B 세포는 유동 세포분석에 의해 IL-10 단백질 발현을 평가하였다. 비록 IL-10은 처리 그룹 둘 다로부터 B10 세포에서 발현되었지만, IL-10을 발현하는 B10 B 세포의 수는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 증가되었다(도 38). IL-10은 배양 2 일 후 활성화된 CD86+ 및 비-활성화된 CD86- B10 B 세포 둘 다에서 발현되었다(도 39). 이전의 연구는 IL-10 발현이 PMA/이오노마이신 또는 LPS와 같은 자극에 의한 세포의 in vitro 자극에 따라서만 측정되는 것을 보여준 것으로 보인다(Carter et al., J Immunol 186:5569-5579 (2011); Yanaba et al., J Immunol 182:7459-7472 (2009)). 놀랍게도, 본 발명자들의 연구에서는, 배양된 비장 B 세포는 IL-10의 측정이 허용되기 위한 어떠한 자극 또는 처리도 필요하지 않았으며, 이들 B10 B 세포가 IL-10을 in vivo 발현하는 것을 보다 직접적으로 시사한다. 본원에 제시된 데이터는 비-자극 배양으로 얻어졌다. 추가로, 본 발명자들은 메토트렉세이트가 IL-10을 발현하는 세포 집단을 특이적으로 확장시킬 수 있다는 것을 본 발명자들이 최초로 보여주었다고 믿는다. 더욱이, 이들 세포 집단은 Myozyme® 단독으로 처리된 동물보다 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 분리될 때 더 많은 IL-10을 발현하는 것으로 보인다(도 54).

TGF-베타 발현은 T 조절 세포에서 면역 조절에 관여하고 T 조절 세포에서 IL-10 발현에 종종 연계된다. 더욱이, 일부 보고서에서는 조절 B 세포가 TGF-베타를 발현할 수 있는 것을 나타낸 것으로 보인다. 비록 B10 B 세포는 TGF-베타를 발현하는 것으로 보고된 적이 없지만. 본 발명자들은 Myozyme® 단독 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 마우스의 B10 B 세포에서 TGF-베타 발현을 유동 세포분석으로 평가할 것을 결정하였다. 예상치 못하게, 본 발명자들은 B10 B 세포가 TGF-베타를 발현하는 것, 그리고 TGF-베타-발현 세포의 수는 메토트렉세이트-관용된 동물에서 증가하는 것을 발견하였다(도 40a). 더욱이, 이들 배양된 세포에서 TGF-베타는 활성화된(CD86+) 및 비-활성화된(CD86-) B10 B 세포 둘 다에서 발현된다(도 40b). 이것은 메토트렉세이트 처리가 TGF-베타를 발현하는 세포의 수를 증가시킨다는 추가의 새로운 관찰이다. 추가적으로, 메토트렉세이트는 TGF-베타의 발현 수준을 증가시킨다(도 55).

FoxP3는 면역 조절과 관련된 또 다른 단백질이다. FoxP3는 T 조절 세포의 표지이다. FoxP3는 마우스에서 B10 B 세포에서 발현되는 것으로 보고된 적이 없다. 본 발명자들은 유동 세포분석을 사용하여 메토트렉세이트-유도된 면역 관용의 존재 및 부재시 B10 B 세포에서 FoxP3 발현을 조사하였다. B10 B 세포는 Myozyme® 단독으로 처리된 동물에서 보여진 바와 같이 PoxP3를 발현하는 것으로 보인다(도 41a). FoxP3+ B 세포의 수는 메토트렉세이트와 Myozyme® 둘 다의 처리로 증가하는 것으로 보인다(도 41b). 추가적으로, 배양된 활성화된(CD86+) 및 비-활성화된(CD86-) B10 B 세포 둘 다 FoxP3를 발현하는 것으로 보인다(도 41). 이것은 B10 B 세포가 FoxP3를 발현한다는 최초의 보고였다. 본 발명자들은 FoxP3가 활성화된(CD86+) 및 비-활성화된(CD86-) B10 B 세포 양쪽에서 발현되고 FoxP3의 발현은 메토트렉세이트 처리로 증가하는 것을 발견하였다(도 56).

추가의 B 세포-타입은 단일 사이클 메토트렉세이트-유도된 면역 관용으로 유의성 있게 증가하기 때문에, 본 발명자들은 이들 세포 타입의 일부가 IL-10, TGF-베타 및 FoxP3를 발현하는지 여부를 평가하였다. 전이성 2, 전이성 3 및 난포성 B 세포는 IL-10(도 42), TGF-베타(도 43) 및 FoxP3(도 44)를 발현하는 것이 발견되었으며, 이것은 이들 B 세포 서브셋 각각에서 예상치 못한 새로운 것이었다. B10 세포에서 관찰된 바와 같이, IL-10, TGF-베타 및 FoxP3 B 세포 서브셋의 절대 세포수는 Myozyme® 단독(도 42 내지 44A 및 44C) 처리된 마우스와 비교하여 메토트렉세이트(도 42 내지 44B 및 44C) 처리로 증가하였다. 메토트렉세이트 처리는 또한 Myozyme® 단독 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 이들 단백질의 평균 형광 강도에서의 이동에 의해 보여지듯이 복수의 세포 서브셋 내 IL-10, TGF-베타 및 FoxP3에서 통계적으로 유의성 있는 증가를 유도한다(도 54 내지 56).

메토트렉세이트와 Myozyme® 처리에 의해 강화된 복수의 TGF-베타 발현 B 세포 집단을 더욱 조사하기 위해, 본 발명자들은 다음에 TGF-베타가 메토트렉세이트-유도된 관용에 요구되는지 여부를 결정할 것을 고려하였다. 동물들은 연구 동안 복막내 주사를 통해 주 당 3 회 주어지는 5 ㎎/㎏의 항-TGF-베타 항체(1D11, Genzyme) 또는 동형(isotype) 대조군(13C4)의 존재와 함께 또는 없이 Myozyme® 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리되었다. 항체 역가는 4 개의 다른 동물 그룹에서 격주로 평가하였다. TGF-베타가 메토트렉세이트-유도된 면역 관용에 요구된다면, 본 발명자들은 항-TGF-베타 항체로 처리된 동물들이 감소된 항-Myozyme 역가를 나타내지 않아야 한다고 예상하였다. 6 주 역가는 도 45에 나타내고, TGF-베타가 메토트렉세이트-유도된 면역 관용에 필요할 수 있다고 시사한다. 이는 초기 시간 지점이기 때문에, 단지 일부 동물만 항-Myozyme 반응을 일으키는 시간을 가진다. 중요하게는, 이 시점에서 역가는 도 15c에서 6 주에 나타낸 것과 유사한 것으로 보이며, 여기에서는 rhGAA 단독 및 rhGAA- 및 메토트렉세이트- 및 1D11-처리된 동물 중 두 동물이 높은 역가를 나타내었다. 비교하면, rhGAA 및 메토트렉세이트 또는 rhGAA 및 메토트렉세이트 및 13C4 처리된 동물들은 어느 것도 높은 역가를 나타내지 않았다.

추가적으로, 단일 Myozyme® 처리 또는 단일 Myozyme®과 메토트렉세이트처리 7 일 후 1D11 또는 13C4 공동-투여된, Myozyme® 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물들로부터 비장을 분리하였다. 이 시점에서, IL-10, TGF-베타 및 FoxP3를 발현하는 전이성 2, 전이성 3, B10 및 난포성 B 세포는 Myozyme® 및 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 증가하였다. 각각의 그룹에서 세포를 모아서 2 일 동안 배양한 다음 1D11과 함께 항-TGF-베타 처리가 TGF-베타, IL-10 및 FoxP3를 발현하는 세포의 확장을 방해하는지 여부를 동형 대조군 항체(13C4)와 비교하여 결정하기 위해 유동 세포분석에 의해 평가하였다.

정말로 예상치 못하게, 1D11 처리는 TGF-베타를 발현하는 세포의 메토트렉세이트-유도된 확장뿐 아니라 IL-10 및 FoxP3를 발현하는 일부 서브셋의 확장도 방해하였다. 비록 FoxP3+ 난포성 B 세포는 1D11 효과를 경험하지 않는 것으로 보였지만, 이것은 특히 B10 B 세포(도 46) 및 난포성 B 세포(도 47)에서는 사실이었다. 1D11 처리가 TGF-베타-발현 전이성 2 B 세포를 방해하는 전이성 2 B 세포에서는, IL-10+ 전이성 2 B 세포(활성화된 전이성 2 B 세포를 포함하여; 도 48)에는 아무 효과도 보이지 않았다. 더욱이, 활성화된 CD86+ 전이성 2 B 세포를 보지 않는다면, 1D11에 의한 FoxP3+ 전이성 2 B 세포에서의 효과는 이러한 작은 처리 그룹에서는 명백해 보이지 않았다. 중요하게는, 이들 데이터가 단지 일부 세포 타입에서 메토트렉세이트-유도된 TGF-베타가 IL-10 및 FoxP3와 관련된 것을 시사한다. 전이성 3 B 세포에서는, 비록 전이성 3 서브셋에서 검출 가능한 TGF-베타가 있지만(도 49), 이들 세포에서 1D11 처리의 명백한 효과는 없다(P<0.05; 도 49). 특히, 활성화된 CD86+ 전이성 3 B 세포에서는, 1D11-처리된 마우스에서 더 높은 수의 IL-10+ 전이성 3 B 세포가 있는 것으로 보인다. 이는 이 집단이 1D11 처리에 기인한 다른 세포-타입의 수에서의 감소를 보상하는 것을 돕기 위해 확장되는 것을 시사할 수 있다. 또한 중요한 것은, 1D11 처리가 이들 세포에서 IL-10, TGF-베타 및 FoxP3의 기준 농도에는 영향을 미치지 않았지만(각각 도 50a 내지 50C), 이들 사이토카인을 발현하는 세포에서의 메토트렉세이트 효과에 영향을 미치는 것으로 보인다.

요약하면, 메토트렉세이트-유도된 면역 관용 동안 TGF-베타 항체를 주사하는 것에 의해 TGF-베타를 방해하는 것은, 동형 대조군으로 처리된 동물과 비교하여 TGF-베타를 발현하는 세포의 수를 감소시킨다. 더욱이, 메토트렉세이트-유도된 관용에서 관찰되는 IL-10 및 FoxP3 발현 B10 B 세포의 전형적인 증가는 1D11 처리에 의해 저해된다. 1D11 처리는 어떤 B 세포 타입에서 TGF-베타, IL-10 및/또는 FoxP3에 대한 메토트렉세이트 효과에 영향을 미치는 것으로 보이지만, 모든 B 세포 타입은 아니다. 이들 관찰은 놀라운 것으로, 메토트렉세이트가 TGF-베타를 유도하고, 이것은 B10 B 세포와 같은 임의의 세포에서 차례로 IL-10 및 잠재적으로 FoxP3를 유도한다. 비록 TGF-베타와 IL-10 및 FoxP3의 관련은 앞서 보고된 것으로 보이지만, 이들 세포 타입에서는 보이지 않는다. 더욱이, 메토트렉세이트는 이러한 복합적인 신호 캐스케이드와는 동시에 관련되지 않는다.

지금까지, 본 발명자들은 임의의 B 세포가 메토트렉세이트-유도된 관용에서 유의성 있게 증가하는 것, 그리고 이들 B 세포는 면역-조절(억제) 관련된 단백질을 발현하는 것을 보여주었다. B 세포 자신이 메토트렉세이트-유도된 관용을 중개하는지를 더욱 직접적으로 평가하기 위해, 본 발명자들은 메토트렉세이트-관용된 마우스로부터의 총 비장 B 세포가 면역 관용을 나이브 숙주로 전달할 수 있는지 여부를 평가하는 양자 전달 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 Myozyme®과 단일 사이클의 메토트렉세이트 처리를 사용하여 이 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 Myozyme®또는 Myozyme®과 메토트렉세이트의 단일 처리 7 일 후(위에 언급된 B 세포 서브셋이 메토트렉세이트에 의해 증가되었을 때) Myozyme® 단독 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 동물들로부터 비장을 분리한 다음, 모든 비장 B 세포를 정제하였다. 이들 세포는 다음에 Myozyme® - 나이브 수용자 마우스로 전달하였다(도 51a). 전달 후, 수용자들(Myozyme® 또는 Myozyme®과 메토트렉세이트로 처리된 비-전달된 대조군 동물들과 함께)은 20 ㎎/㎏의 Myozyme®으로 매주 처리하였다. 항-Myozyme 항체 역가를 평가하기 위해 격주로 혈액을 수집하였다. 비장 수확 시기에, 각각의 제공자 그룹으로부터 B 세포의 서브셋을 유동 세포분석으로 평가하여 TGF-베타+, IL-10+ 및/또는 FoxP3+ 전이성 2, 전이성 3, B10 및 난포성 B 세포에서의 예상된 증가를 확인하였다. 제공자 그룹은 예상된 표현형을 갖는 것이 확인되었다. 역가 분석은 Myozyme® 및 단일 사이클의 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 분리된 총 비장 B 세포가 Myozyme®에 대한 면역 관용을 나이브 숙주로 전달할 수 있었음을 시사하였다(도 51b). 이는 B 세포가 메토트렉세이트-유도된 면역 관용을 중개할 수 있음을 지지하고, B 세포가 항염증 효과 중개를 돕기 위해 메토트렉세이트에 의해 강화된(사멸되지 않고) 것으로 기술된 최초였다. 이들 데이터는 또한 현재 환자들에게 시행되고 있는 면역 관용을 유도하기 위해 메토트렉세이트를 B 세포 고갈성 약제와 함께 사용하는 것에 직접적으로 의문을 제기한다(Messinger et al., supra and Lacana′et al., supra).

실시예 16: 메토트렉세이트는 이식 병리학을 개선한다

본 발명자들은 또한 뮤린 항-흉선세포 글로불린의 맥락에서 메토트렉세이트가 정상 동물(도 52) 및 이식 동물(도 53)에서 CD4+, CD8+, T 조절(CD4+CD25+FoxP3+) T 세포 및 총 CD19+ B 세포를 고갈시키지 않는 것을 나타내는 추가적인 데이터를 만들었다. 비-특이적 토끼 IgG 단독 또는 메토트렉세이트와 조합하여 투여된 정상 동물과 비교할 때, 혈액 및 비장에서 세포 집단에는 유의성 있는 변화가 없었다(도 52). 더욱이, mATG 단독 또는 mATG와 메토트렉세이트로 처리된 동물로부터 분리된 이들 집단과 비교할 때, 증진된 고갈이 없었다. 그보다, 본 발명자들은 단지 mATG-중개된 CD4+, CD8+ 및 T 조절 세포 효과의 연장을 관찰하였는데, 이는 메토트렉세이트에 의한 증가된 mATG 노출에 기인하는 것으로 보인다(도 52). 추가로, 동종 이식을 받은 동물에서 메토트렉세이트 단독 처리는 이들 특정 세포 서브셋을 고갈시키지 않았다(도 53). mATG 단독 처리된 동물과 비교하여 mATG 및 메토트렉세이트로 처리된 동물에서 더 낮은 수의 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 메토트렉세이트 처리의 맥락에서 mATG의 연장된 효과에 의해 설명될 수 있다. 중요하게는, 메토트렉세이트가 정상 또는 이식된 동물에서 항체 반응을 감소시키기 위해 활성화된 B 세포를 사멸시킬 경우 예상되는 B 세포에서의 감소를 메토트렉세이트는 유도하지 않았다(도 52 및 53). 이들 데이터는 항-약물 항체에 대한 메토트렉세이트 효과가 활성화된 B 세포의 항-폴레이트 유도된 고갈에 의해 중개되지 않을 수 있음을 시사한다. 예상한 바와 같이, mATG 처리는 또한 이러한 이소성(heterotopic) 심장 동종이식 모델에서 총 B 세포 수에 영향을 주지 않았다. 전반적으로, mATG와 메토트렉세이트의 조합 처리는 중증도의 이식 거부 병리를 약화시키고, 이식에서 감소된 T 세포 침투와 관련되지만, 세포에서 조절 T 세포 표현형의 증가와는 관련되지 않았다. 이는 Myozyme® 및 알렘투주맙의 맥락에서 생성된 결과와 일치한다.

장기-생존 이식에서의 조직학적 변화를 평가하고 이식 생존에 대한 mATG와 메토트렉세이트 조합의 기전을 이해하기 위해, 세포 조성물과 함께 심장 이식편을 수집하여 병리를 평가하였다. 특히, 조절 T 세포는 이식에서 장기간 이식 생존에 관련되고 Thymoglobulin® 및 mATG에 의해 유도되고, 또한 mATG 처리에 따른 지연된 이식 거부에 책임이 있는 것으로 나타났기 때문에, T 조절 세포와 일치하는 표현형을 갖는 CD3+Foxp3+ 세포를 평가하였다. 특히, 심장 이식편은 mATG와 메토트렉세이트 조합-처리된 그룹 및 비처리된 공통 유전자 그룹으로부터 적어도 이식 100 일 후에 수집하였다. 비처리 마우스 및 mATG 단독 또는 메토트렉세이트 단독 처리된 마우스로부터의 이식편을 비교를 위해 이식 거부 이후 채취하였다. H&E 또는 메슨 트리크롬 또는 면역염색된 항-CD3 및 항-FoxP3 항체로 염색된 조직 섹션에서 이식 거부의 지표가 되는 조직학적 변화, 예를 들어 경도 내지 중등도의 심근염, 심근 변성 및 괴사, 심장 동종이식 맥관장애(CAV, cardiac allograft vasculopathy), 및 T 세포 침투를 현미경으로 평가하였다. 100 일에, mATG와 메토트렉세이트로 공동-처리된 동물로부터의 동종이식편은 최소 내지 경도의 CAV 병변을 나타내고 최소 심근 변성 및 심근염은 나타내지 않았다. 이 후기 시점에서 이식 거부를 시사하는 조직학적 변화는 공통 유전자 이식편에서는 분명하지 않았다(도 54). 조합 처리된 그룹으로부터의 동종이식편은 심근 혈관을 침투하는 약간의 세포와 함께 심근에서 경도의 T 세포 침투를 나타내었다. 공통 유전자 이식편은 심근 내에 드문 T 세포를 포함하였다. 가끔 이중 CD3 및 FoxP3 면역양성 세포를 갖는 T 세포의 클러스터가 공통 유전자 이식편 및 조합-처리된 동종이식편 양쪽의 심외막에 존재하였다. 따라서, 장기-생존 이식편은 이식 거부의 최소 신호를 보여주었으며, 이는 감소된 염증과 관련된다.

mATG와 메토트렉세이트 조합 처리의 효과가 이식 시기에 가까울수록 더 능동적으로 일어나는 것으로 보이므로, 본 발명자들은 또한 이식 7 일 후(비처리된 마우스에서) 또는 14 일 후(모든 처리 그룹에서) 이식된 심장 동종이식편의 세포 침투를 특성화하고 병리를 평가하였다. 비처리된 동종이식편은 관상 동맥의 심외막 및 심근내 가지 양쪽에서 심근염, 심근 변성 및 괴사를 포함하는 이식 거부 병리를 나타내었다. 대조적으로, mATG와 메토트렉세이트 둘 다로 처리된 동물로부터 분리된 동종이식편은 덜 심한 CAV를 나타내었다. 이는 mATG 또는 메토트렉세이트로 처리된 동물 및 비처리된 동물로부터의 동종이식편을 비교한 것이다(도 58). 예상한 바와 같이, 비처리된 마우스로부터의 공통 유전자 이식편은 이 시점에서는 거의 또는 전혀 병리를 나타내지 않았다. CD3+ T 세포 침투는 비처리된 마우스로부터의 동종이식편 및 mATG 또는 메토트렉세이트 단독으로 처리된 것에서 심근 및 심외막에서 관찰되었다. 이들 이식편에서는 CAV 병변과 관련된 염증 세포 침투물에서 약간의 CD3+ T 세포도 존재하였다. 대조적으로, mATG와 메토트렉세이트의 조합으로 처리된 동물로부터의 동종이식편은 심근에서 실질적으로 더 낮은 CD3+ T 세포 침투와 심외막에서 단지 최소의 CD3+ T 세포 침투를 나타내었다. 공통 유전자 심장 이식편은 단지 심외막에서 최소의 CD3+ T 세포 침투를 보여주었다. 심외막 내의 염증 세포 침투물 내에서 작은 비율의 T 세포는 이중 CD3 및 FoxP3 면역반응성에 의해 나타난 바와 같이 T 조절 세포 표현형을 갖는 것으로 보였지만, 이 빈도는 다른 그룹에서 보다 염증성 침투물 내에서 크지 않은 것으로 보였다. 따라서, 감소된 병리가 또한 mATG와 메토트렉세이트 처리 후 일찍 관찰되었고, 감소되고 심외막-제한된 T 세포 침투 양쪽에 관련되었다.

Claims (11)

1. 유효량의 메토트렉세이트를 포함하고, 치료제로 치료가 필요한 대상에서 B 세포 집단의 B 조절 세포의 비율을 증가시킴으로써, 상기 대상에서 질병 또는 증상의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물이며, 대상에게 1일의 메토트렉세이트 투여, 또는 연속 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11일의 메토트렉세이트 투여로 구성되는 단일 사이클로 투여되고, 여기서 추가 사이클의 메토트렉세이트가 상기 치료제의 후속하는 정기적 투여 시기에 맞추어 대상에게 정기적으로 투여되지는 않으며, 여기서
   a) 질병 또는 증상이 다발성 경화증이고, 치료제가 알렘투주맙이거나;
   b) 질병 또는 증상이 자가면역 질환이고, 치료제가 리툭시맙이거나;
   c) 질병 또는 증상이 조직 이식 또는 기관 이식, 재생불량성 빈혈, 또는 이식편대숙주병이고, 치료제가 다클론 토끼 항-흉선세포 글로불린 항체이거나;
   d) 질병 또는 증상이 파브리 병이고, 치료제가 인간 알파-갈락토시다제 A이거나; 또는
   e) 질병 또는 증상이 폼페 병이고, 치료제가 인간 산 알파-글루코시다제인, 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 B 조절 세포가 B10 조절 B 세포인 제약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 B 세포 집단이 비장 B 세포 집단인 제약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 B 조절 세포가 IL-10, TGF-베타, 및 FoxP3를 발현하는 제약 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 단일 사이클의 메트트렉세이트가 치료제 처리의 개시 48시간 전 내지 48시간 후 사이에 투여되는 제약 조성물.
8. 제1항에 있어서, 메토트렉세이트가 0.1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏의 유효량으로 투여되는 제약 조성물.
9. 유효량의 메토트렉세이트를 포함하고, 치료제로 치료가 필요한 질병 또는 증상을 갖는 대상에서 치료제의 효능을 증가시키는 것에 사용하기 위한 제약 조성물이며, 대상에게 1일의 메토트렉세이트 투여, 또는 연속 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11일의 메토트렉세이트 투여로 구성되는 단일 사이클로 투여되고, 이에 의해 대상에서 치료제의 효능을 증가시키며, 여기서 추가 사이클의 메토트렉세이트가 상기 치료제의 후속하는 정기적 투여 시기에 맞추어 대상에게 정기적으로 투여되지는 않으며, 여기서
   a) 질병 또는 증상이 파브리 병이고, 치료제가 인간 알파-갈락토시다제 A이거나;
   b) 질병 또는 증상이 폼페 병이고, 치료제가 인간 산 알파-글루코시다제이거나;
   c) 질병 또는 증상이 다발성 경화증이고, 치료제가 알렘투주맙이거나;
   d) 질병 또는 증상이 자가면역 질환이고, 항체 치료제가 리툭시맙이거나; 또는
   e) 질병 또는 증상이 조직 이식 또는 기관 이식, 재생불량성 빈혈, 또는 이식편대숙주병이고, 치료제가 다클론 토끼 항-흉선세포 글로불린 항체인, 제약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 메토트렉세이트가
    a. 대상에서 치료제에 대한 면역 관용을 유도하거나;
    b. 대상에서 치료제에 대한 항체 반응을 저해하거나;
    c. 대상에서 치료제에 대한 주입 반응을 완화시키거나;
    d. 대상에서 2차 자가면역성을 감소시키거나;
    e. 대상에서 T 세포 집단의 T 조절 세포의 비율을 증가시키거나;
    f. 대상에서 B 세포 집단의 B 조절 세포의 비율을 증가시키거나;
    g. 대상에서 T 세포 반응을 저해하거나;
    h. 치료제의 약물동력학을 연장시키거나; 또는
    i. 림프구를 고갈시킴으로써,
    치료제의 효능을 증가시키는 제약 조성물.
11. 제1항에 있어서, B 세포 고갈성 약제와 조합하여 대상에게 투여되지 않는 제약 조성물.

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