JP6694020B2 - メトトレキサートを用いる免疫寛容の誘導 - Google Patents

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他の出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月１６日出願、米国仮特許出願第６１／４８６，６９７号の優先権を主張し、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる。

本発明は、一般に免疫学に、より具体的には患者における望ましくない免疫応答を低減するためのメトトレキサートの使用に関する。

現在米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、臨床使用のための１３０を超えるタンパク質治療薬を認可している（非特許文献１）。これらの治療薬は、ペプチド、組換えヒトタンパク質、タンパク質ワクチン、種々の動物種由来のポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体を含む。それらの配列および内在性自己抗原に対する立体構造相同性、グリコシル化状態、用量レベル、投与経路、局在性ならびに製造方法に関する特徴に応じて、治療用タンパク質は患者において抗体応答を誘発する場合がある（非特許文献２；３；４；５）。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答と称されるこれらの応答は、患者の安全性および薬物有効性に強い影響を与える場合がある。

リソソーム蓄積障害、ポンペ病の場合、ＡＤＡが組換えヒト酸性アルファ−グルコシダーゼに対する酵素補充治療（ＥＲＴ）で生じる場合がある。内在性酵素を測定可能な量で発現していない患者では、高い抗体力価レベルの維持は、患者の衰弱（ＣＲＩＭポンペ患者）と相関する（非特許文献６；７；８）。薬物安全性および有効性を損なう同様の影響が、第ＩＸ因子に対するＡＤＡを生じる血友病患者において観察されている（非特許文献４；９）。まれな事例では、ＡＤＡは組換えヒトエリスロポエチンの場合のように自己免疫疾患も誘導する場合がある（非特許文献１０；１１）。

ＡＤＡ応答は、治療薬が非ヒト由来、ヒト化またはさらに完全にヒトであるかにかかわらず抗体治療薬でも生じる場合がある。モノクローナルおよびポリクローナル抗体治療薬の両方の免疫原性は、患者の安全性および薬物有効性に影響する場合がある。インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブおよびナタリズマブなどの治療用モノクローナル抗体に対して生じる抗体は、治療用抗体の血清レベルおよび有効性の低下と関連している（非特許文献１２；１３；１４；１５；１６；１７）。アレルギー反応は、抗インフリキシマブ抗体と関連している（非特許文献１５）。輸注（infusion）関連過敏症反応は、ナタリズマブで処置された再発寛解型多発性硬化症患者の一部において観察されている（非特許文献１８）。

アレムツズマブは再発寛解型多発性硬化症患者においてＡＤＡを生じる場合がある別の抗体治療薬である（非特許文献１９）。アレムツズマブは、ＣＤ５２（免疫細胞で発現される細胞表面抗原）と相互作用するリンパ球除去モノクローナル抗体である。アレムツズマブは、再発寛解型多発性硬化症を処置するための後期臨床試験中であり、関節リウマチでも評価されている。研究者のグループは、抗アレムツズマブ抗体が単回用量漸増試験（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）で処置された関節リウマチ患者の６３％で生じたことを示した（非特許文献２０）。その研究ではアレムツズマブの有効性はＡＤＡの存在によって変化したと考えられた（Ｉｄ）。

ポリクローナル抗体治療薬Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）は、一部の患者で有害なＡＤＡとも関連している。血清病、急性腎不全および心臓血管反応がＴｈｙｍｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）処置移植レシピエントで観察されている（非特許文献２１；２２；２３；２４；２５）。

研究者らは、ＡＤＡの有害作用を最小化する様式を見出すことを試みた。タンパク質治療において免疫寛容を誘導し、ＡＤＡを低減する能力に関して検査された手法は、例えば非除去抗ＣＤ４抗体（非特許文献２６；２７）、アレムツズマブの非細胞結合最小変異体（ｍｉｎｉｍａｌ ｍｕｔａｎｔ）（非特許文献２８；２９）、免疫抑制治療（非特許文献３０；３１）、第ＶＩＩＩ因子に結合するホスファチジルイノシトール含有脂質粒子（非特許文献３２）、および組換え酸性アルファ−グルコシダーゼのアデノ随伴ウイルス感染を介した肝臓特異的投与（非特許文献３３；３４；３５）を含む。しかし、タンパク質治療および他の設定において望ましくない抗体応答を低減するための改善された方法を開発する必要性は依然としてある。

Ｌｅａｄｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、７（１）：２１〜３９頁（２００８） Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１（６）：４５７〜６２頁（２００２） Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２（３）：１６３〜７１頁（２０００）、ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２５７〜３４４頁 Ｔｈｏｒｌａｎｄら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、５（２）：１０１〜５頁（１９９９） Ｇｏｏｄｅｖｅ、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、１４ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１７〜２１頁（２００３） Ｋｉｓｈｎａｎｉら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．、９９（１）：２６〜３３頁（２０１０） Ｈｕｎｌｅｙら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１４（４）：ｅ５３２〜５頁（２００４） Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら、Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ、３（２）：１３２〜８頁（２００１） Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎら、Ｂｌｏｏｄ、８９（３）：１１１５〜６頁（１９９７） Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ、２４（１１）：１７２０〜４０頁（２００２）、ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １７１９頁 Ｌｏｃａｔｅｌｌｉら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ、２７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ３０３〜７頁（２００７） Ｂｅｎｄｔｚｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、５４（１２）：３７８２〜９頁（２００６） Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２（３）：３３４〜４１頁（２００９） Ｂａｒｔｅｌｄｓら、Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、６６（７）：９２１〜６頁（２００７） Ｂａｅｒｔら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４８（７）：６０１〜８頁（２００３） Ｔａｈｉｒら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）、４４（４）：５６１〜２頁（２００５） Ｍａｉｎｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、４１（９）：１５５２〜６３頁（１９９８） Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６７（９）：１７１７〜８頁（２００６） Ｃｏｌｅｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００８．３５９（１７）：１７８６〜８０１頁（２００８） Ｗｅｉｎｂｌａｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、１９９５．３８（１１）：１５８９〜９４頁（１９９５） Ｂｏｏｔｈｐｕｒら、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．、５５（１）：１４１〜３頁（２００９） Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ、１３（５）：６４７〜５０頁（２００７） Ｂｕｓａｎｉら、Ｍｉｎｅｒｖａ Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ、７２（４）：２４３〜８頁（２００６） Ｔａｎｒｉｏｖｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８０（２）：２７９〜８１頁（２００５） Ｂｕｃｈｌｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１７（６）：５３９〜４５頁（２００３） Ｃｏｂｂｏｌｄら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２（６）：３７７〜８７頁（１９９０） Ｗｉｎｓｏｒ−Ｈｉｎｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７３（７）：４７１５〜２３頁（２００４） Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２（６）：３６６３〜７１頁（１９９９） Ｓｏｍｅｒｆｉｅｌｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８５（１）：７６３〜８頁（２０１０） Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｂｌｏｏｄ、１０６（１０）：３３４３〜７頁（２００５） Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８（８）：２８６８〜７６頁（２００８） Ｐｅｎｇら、ＡＡＰＳ．Ｊ．、１２（３）：４７３〜８１頁（２０１０） Ｓｕｎら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ、８１（５）：１０４２〜９頁（２００７） Ｓｕｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（２）：３５３〜６０頁（２００９） Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１９（６）：６０９〜２１頁（２００８）

本発明は、治療薬での処置の必要がある対象において免疫寛容を誘導する方法を提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を単一サイクルで投与し、それにより対象において治療薬に対する免疫寛容を誘導する。

本発明は、治療薬での処置の必要がある対象において治療薬に対する抗体応答を阻害する方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を単一サイクルで投与し、それにより対象において治療薬に対する抗体応答を阻害する。

本発明は、治療薬での処置の必要がある対象において治療薬に対する輸注反応（ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を軽減する方法も提供する。本方法では、対象にメトト
レキサートの有効量を投与し、それにより対象においてタンパク質治療薬に対する輸注反応を軽減する。

本発明は、治療薬での処置の必要がある自己免疫対象において二次自己免疫（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）を低減する方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象において二次自己免疫を低減する。

本発明は、治療薬での処置の必要がある対象において治療薬の有効性を増大させる方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象においてタンパク質治療薬の効能を増大させる。

本発明は、リンパ球除去治療（例えばアレムツズマブ治療またはＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）治療）で処置される対象においてＴ細胞集団中の制御性Ｔ細胞の割合を増加させる方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより該対象において該割合を増加させる。

本発明は、抗体治療薬などのタンパク質治療薬での処置の必要がある対象においてＢ細胞集団中の制御性Ｂ細胞の割合を増加させる方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより該対象において該割合を増加させる。いくつかの実施形態では、メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される。関連する実施形態では、本発明は、タンパク質治療薬での処置の必要がある対象においてＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０、および／またはＦｏｘＰ３発現Ｂ細胞を増加させる方法であって、メトトレキサートの有効量を単一サイクルで投与することを含む上記方法を提供する。

本発明は、対象における治療剤の薬物動態を延長する方法も提供する。本方法では、治療剤の投与の前または途中または後に治療剤の薬物動態を延長するために有効な量でメトトレキサートを対象に投与する。

本発明は、その必要があるヒト患者においてリンパ球を枯渇させる（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）方法もさらに提供する。本方法では、患者をリンパ球枯渇剤（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ
ａｇｅｎｔ）で処置し、リンパ球枯渇剤での処置前または処置中または処置後にリンパ球枯渇剤に対する免疫寛容を患者において誘導するためまたは二次自己免疫を低減するために有効な量でメトトレキサートを患者に投与する。いくつかの実施形態では、メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤はモノクローナル抗体治療薬である場合がある（例えばアレムツズマブまたはリツキシマブ）。これらの実施形態のいくつかでは、患者は多発性硬化症患者である場合がある（例えば再発寛解型多発性硬化症患者）。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤はポリクローナル抗体治療薬である場合がある（例えば抗胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体）。

本発明は、組織移植の必要がある対象において免疫寛容を誘導する方法も提供する。本方法では、対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象において移植された組織に対する免疫寛容を誘導する。いくつかの実施形態では、メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与される。いくつかの実施形態では、移植された組織は腎臓組織または心臓組織である。いくつかの実施形態では、対象は、ポリクローナル抗胸腺細胞グロブリン抗体などの免疫調節のための薬剤（例えば免疫抑制剤）も受ける。

本発明は、治療薬または組織移植の必要がある対象においてＴ細胞応答を阻害する方法も提供する。本方法では、治療薬または組織移植で対象を処置する前、同時または後に対象にメトトレキサートの有効量を投与し、それにより対象においてＴ細胞応答を阻害する。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、治療薬はタンパク質治療薬である。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、治療薬は抗体治療薬である。例えば抗体治療薬はモノクローナル抗体治療薬および／またはリンパ球枯渇剤（例えばアレムツズマブ）またはポリクローナル抗体治療薬（例えばポリクローナルウサギ抗胸腺細胞グロブリン抗体）である場合がある。抗体治療薬がアレムツズマブであるさらなる実施形態では、対象は多発性硬化症患者である場合がある。抗体治療薬がポリクローナルウサギ抗胸腺細胞グロブリン抗体であるさらなる実施形態では、対象は、臓器移植の必要があり、再生不良性貧血であり、および／または移植片対宿主病であるもしくはそのリスクがあるヒト患者である場合がある。本発明の方法の他の実施形態では、治療薬は酵素である。例えば酵素はヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡまたはヒト酸性アルファ−グルコシダーゼである場合がある。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、メトトレキサートの有効量は０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇであってよい。いくつかの実施形態では、メトトレキサート単一サイクルは１日のメトトレキサート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキサート投与からなってよい。いくつかの実施形態では、メトトレキサート単一サイクルは治療薬処置開始の４８時間前から４８時間後の間に投与されてよい。

下に記載の各図では、アスタリスクまたは星印は統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ≦０．００１；^***、ｐ≦０．０００１）。

Ａ〜Ｂは、ｍＡＴＧ、ウサギ抗マウス胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体の１回および複数回コースに対する抗ウサギＩｇＧ応答を示すグラフである。平均抗ウサギＩｇＧ力価が測定され、ウサギＩｇＧ（ｒｂＩｇＧ）だけで処置したマウスが対象として用いられた。図１Ａは、８週間にわたるｍＡＴＧの１回コースに対する応答を示す。図１Ｂは、２０週間にわたるｍＡＴＧの複数回コースに対する応答を示す。矢印は、ｍＡＴＧまたはｒｂＩｇＧが投与された時点を示す。 アレムツズマブでの５回の毎月処置後の平均アレムツズマブ特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。矢印は、アレムツズマブが投与された時点を示す。 ｍＡＴＧの１回コース後の、メトトレキサート（ＭＴＸ）による抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答の抑制を示すグラフである。マウスはｍＡＴＧのみ、ｒｂＩｇＧのみ、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置された。 ｍＡＴＧでの５回の毎月処置コースを通じた抗ウサギＩｇＧ応答についてのメトトレキサートの効果を示すグラフである。矢印は、ｍＡＴＧまたはメトトレキサートが投与された時点を示す。図４Ａは、メトトレキサート３サイクルが平均抗ウサギＩｇＧ力価を有意に低減することを示す。図４Ｂは、メトトレキサート１回コースが平均抗ウサギＩｇＧ力価を有意に低減することを示す。図４Ｃは、ｍＡＴＧ単独、ｍＡＴＧおよびメトトレキサート単一サイクル、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサート３サイクルで処置したマウスの平均抗ウサギＩｇＧ力価を比較する。メトトレキサート単一サイクルは、メトトレキサート３サイクルよりもさらに有意に抗ウサギＩｇＧ力価を低減する。 図４−１の続き。 平均抗ウサギＩｇＧ力価が、ｍＡＴＧで処置したがメトトレキサートでしていないマウスと比較して、メトトレキサート処置マウス（メトトレキサート１および複数サイクル）においてｍＡＴＧ再負荷後に低減されることを示すグラフである。矢印は、ｍＡＴＧまたはメトトレキサートが投与された時点を示す。 ｍＡＴＧ単独で処置したマウスにおいてよりもｍＡＴＧおよびメトトレキサート単一サイクルで処置したマウスにおいて平均抗ウサギＩｇＧ力価が１００分の１であったことを示すグラフである。矢印は、ｍＡＴＧまたはメトトレキサートが投与された時点を示す。 ｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスでメトトレキサートが平均抗アレムツズマブＩｇＧ力価を低減できることを示す図である。図７Ａ：抗アレムツズマブ力価は、メトトレキサート０．５ｍｇ／ｋｇで処置したまたはメトトレキサートで処置しなかったマウスにおいてよりもメトトレキサート１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの単一サイクルで処置したマウスにおいて低い。マウスは、アレムツズマブ単独、またはアレムツズマブおよびメトトレキサート０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇの単一サイクルで処置された。 ｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスでメトトレキサートが平均抗アレムツズマブＩｇＧ力価を低減できることを示す図である。図７Ｂ：抗アレムツズマブ力価を検査するための研究設計。力価データは、星印で示されるとおりアレムツズマブの５回目投与の２４時間後に決定された。 ｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスでメトトレキサートが平均抗アレムツズマブＩｇＧ力価を低減できることを示す図である。図７Ｃ：アレムツズマブのみを受けたマウスと比較してアレムツズマブおよびメトトレキサートを受けたマウスにおいてメトトレキサートは、アレムツズマブの５回目投与の２４時間後での抗アレムツズマブ抗体力価を低減した。 Ａ〜Ｄは、アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の毎日投与５回で処置したマウスにおける全血での循環Ｔ細胞の絶対細胞数／μｌを示すグラフである。図８Ａは、総Ｔ細胞（ＣＤ３⁺）が処置の２、３および４週間後に低減されたことを示す。図８Ｂは、総Ｂ細胞（ＣＤ１９⁺）が処置の３週間後に低減されたことを示す。図８Ｃは、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４⁺）が処置の２、３および４週間後に低減されたことを示し、図８Ｄは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８⁺）が処置の２、３および４週間後に低減されたことを示す。 Ａ〜Ｂは、アレムツズマブ特異的ＩｇＧ応答を示す図である。図９Ａは、アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇでの３サイクル処置およびメトトレキサート０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇもしくは２ｍｇ／ｋｇでの単一サイクル処置後の応答を示す。アレムツズマブ処置の第単一サイクルは、５日連続投与からなり、第２および第３サイクルはそれぞれ３日連続投与からなった。図９Ｂは、１４週目の群ごとの各動物の抗アレムツズマブＩｇＧ力価を示す。 メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇの単一サイクルが、ｍＡＴＧの毎月投与５回で処置したマウスにおいて循環ｍＡＴＧレベルを復元させることを示すグラフである。 ｍＡＴＧの５回の毎月処置およびメトトレキサート単一サイクルで処置したマウスは、ｍＡＴＧの５回目投与後に血液中でｍＡＴＧ介在性のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞除去が増強されることを示す図である。これらのデータは、２回の実験からプールされる。 Ａ〜Ｂは、メトトレキサート単一サイクルで処置したマウスは、５回目の毎月ｍＡＴＧ処置後に制御性Ｔ（ＣＤ２５⁺Ｆｏｘｐ３⁺）細胞の割合増加を呈することを示すグラフである。マウスはｍＡＴＧ単独の５回の毎月処置、またはｍＡＴＧの５回の毎月処置およびメトトレキサート単一サイクル、またはｍＡＴＧの５回の毎月処置およびメトトレキサート３サイクルで処置された。図１２Ａは、脾臓中の制御性Ｔ細胞レベルを示す。図１２Ｂは、血液中の制御性Ｔ細胞レベルを示す。 Ａは、１０，０００を超える抗ウサギＩｇＧ力価がｍＡＴＧの薬物動態を妨害する場合があることを示す図である。Ｂは、１００，０００を超える抗ウサギ力価がＣＤ４およびＣＤ８細胞除去を妨害する場合があることを示す図である。処置前対照の％は、ＣＤ４およびＣＤ８の力価をｍＡＴＧ処置前のそれらそれぞれのレベルと比較したパーセントを意味する。 メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスがアレムツズマブの５回目の毎月投与後に循環ＣＤ３⁺Ｔ細胞およびＣＤ１９⁺Ｂ細胞の増強されたアレムツズマブ除去を呈することを示すグラフである。マウスは、アレムツズマブ単独、またはアレムツズマブおよび研究の最初の３日間のメトトレキサート単一サイクルで処置された。アスタリスクは、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^***、ｐ≦０．０００１）。 メトトレキサート単一サイクルが、１６週間の研究において処置の間を通じておよび最終ｒｈＧＡＡ処置の４週間後でさえ組換えヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）特異的ＩｇＧ力価を低減できることを示すグラフである。矢印は、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートが投与された時点を示す。マウスはｒｈＧＡＡ単独、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート単一サイクル、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート３サイクルで処置された。 ６週間の研究において、メトトレキサート単一サイクルがｒｈＧＡＡ特異的ＩｇＧ力価を低減することを示す図である。 １８週間の研究において、メトトレキサート単一サイクルがｒｈＧＡＡ特異的ＩｇＧ力価を低減することを示す図である。 Ａは、ｍＡＴＧ単独と比較して、メトトレキサートがｍＡＴＧと共に投与された場合に、マウス同種心臓移植モデルにおいて、抗ウサギＩｇＧ力価を低下させることを示すグラフである。Ｂは、マウス同種心臓移植モデルにおいてメトトレキサートがｍＡＴＧの循環レベルを増加させることを示すグラフである。マウスは、生理食塩水、ｍＡＴＧ単独、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサート単一サイクルで処置された。ｍＡＴＧは、２０ｍｇ／ｋｇで研究の０および４日目に投与され、一方メトトレキサート２ｍｇ／ｋｇは研究の０〜６日目に投与された。 ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置がレシピエントマウスに移植された同種心臓の生着を延長することを示すカプラン・マイヤープロットを示すグラフである。マウスは未処置のままとした、またはｍＡＴＧ ２０ｍｇ／ｋｇ単独で研究の０および４日目に、またはメトトレキサート２ｍｇ／ｋｇ単独で研究の０〜６日目に、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサート２ｍｇ／ｋｇの両方で０〜６日目に、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサート０．５ｍｇ／ｋｇの両方で０〜６日目もしくは０〜１１日目に処置した。 移植された同種心臓を有しメトトレキサート単独、またはｍＡＴＧと組み合わされたメトトレキサートのいずれかで処置したマウスが抗同種移植片抗体応答の低減を経験することを示す図である。図１８Ａは、２１日目の同種線維芽細胞へのレシピエントＩｇＧ結合を示す。図１８Ｂは、示した処置を与えられた、同系移植を受けた（Ｓｙｎ Ｔｘ）または同種移植を受けた（Ａｌｌｏ Ｔｘ）マウスにおける２１日目の同種抗体レベルを示す。示されるのは、個々のレシピエントマウス血清ＩｇＧの同種線維芽細胞への結合であり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の未染色線維芽細胞に対する比として表される。図１８Ｃは、処置を与えられなかった、ｍＡＴＧ、メトトレキサート、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートを与えられたマウスにおける２１日目の同種抗体レベルを示す。同種抗体レベルは、メトトレキサート、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置したマウスにおいて有意により低かった（それぞれｐ＝０．０００８およびｐ＜０．０００１）。 図１８−１の続き。 Ｂ１０制御性Ｂ細胞がメトトレキサート処置後に有意に増加することを示す図である。マウスは、ｒｈＧＡＡ単独、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート３日間サイクル１回、または生理食塩水で処置された。細胞数は研究の７日目および８日目に計数された。 活性化Ｂ細胞亜集団がｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート３日間サイクル１回での処置後６日目に、ｒｈＧＡＡ単独での処置と比較して有意に増加することを示すグラフである。ＣＤ８６＋移行性２Ｂ細胞、ＣＤ８６＋移行性３Ｂ細胞、ＣＤ８６＋濾胞性Ｂ細胞およびＣＤ８６＋辺縁帯Ｂ細胞の絶対細胞数は研究の６日目に計数された。アスタリスクは、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ≦０．００１）。 活性化辺縁帯Ｂ細胞、活性化濾胞性Ｂ細胞および活性化移行性３Ｂ細胞などの活性化脾臓Ｂ細胞亜集団について、細胞数がｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでの処置後でさえも、ｒｈＧＡＡ単独での処置と比較して増強されたままであることを示すグラフである。矢印は、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでの処置を表す。ｒｈＧＡＡは１日目および８日目に投与された。メトトレキサートは１、２および３日目にならびに８、９および１０日目に投与された。有意差は星印で表される（^*、ｐ＜０．０５）。８および９日目についてデータ未記載（垂直点線で示される）。 活性化ヘルパーＴ細胞、活性化細胞傷害性Ｔ細胞および活性化制御性Ｔ細胞などの活性化脾臓Ｔ細胞亜集団は、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでの処置後にｒｈＧＡＡ単独での処置と比較してほとんど未変化のままであることを示すグラフである。矢印は、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでの処置を表す。ｒｈＧＡＡは１日目および８日目に投与された。メトトレキサートは１、２および３日目にならびに８、９および１０日目に投与された。有意差は星印で表される（^*、ｐ＜０．０５）。８および９日目についてデータ未記載（垂直点線で示される）。 ｍＡＴＧとの組合せでのメトトレキサート処置を検討するための６カ月間研究設計を示す図である。実線矢印は、ｍＡＴＧ ５ｍｇ／ｋｇ注射を表し、破線矢印は、メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ注射を表し、点線矢印は、最終屠殺を表す。 Ａ〜Ｂは、ｍＡＴＧ単独またはメトトレキサート３サイクルと比較してメトトレキサート単一サイクルがｍＡＴＧと関連して脾臓Ｂ細胞を増やすことを示す図である。図２４Ａ：活性化濾胞性Ｂ細胞；図２４Ｂ：活性化移行性３Ｂ細胞。 Ａ〜Ｂは、アレムツズマブの血液中薬力学へのメトトレキサートの効果を示すグラフである。マウスは、アレムツズマブの初回投与に関連するメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日投与３回を伴ってまたは伴わずにアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇで５カ月間処置された。図２５Ａ：メトトレキサートは、アレムツズマブ（ＡＺＭ）による総Ｔ細胞（ＣＤ３⁺）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４⁺）および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｆｏｘｐ３⁺）の除去を増強する。黒色バーはアレムツズマブ単独で処置したマウスでの測定値を表し、白色バーはアレムツズマブおよびメトトレキサートで処置したマウスでの測定値を表す。図２５Ｂ：メトトレキサートはアレムツズマブによるＢ細胞の除去を増強する。星印は、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５）。 アレムツズマブの脾臓中薬力学へのメトトレキサートの効果を示すグラフである。マウスは、アレムツズマブの初回投与に関連するメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日投与３回を伴ってまたは伴わずにアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇで５カ月間処置された。Ｔ細胞はアレムツズマブでの５回目処置後に除去される。ＣＤ８ ＣＥＮ：ＣＤ８⁺セントラルメモリーＴ細胞；ＣＤ８ ＥＦＦ ＭＥＭ：ＣＤ８⁺エフェクターメモリーＴ細胞；ＣＤ４ ＣＥＮ ＭＥＭ：ＣＤ４⁺セントラルメモリーＴ細胞；ＣＤ４ ＥＦＦ ＭＥＭ：ＣＤ４⁺ エフェクターメモリーＴ細胞。星印は、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５）。 Ａ〜Ｂは、脾臓中Ｂ細胞数へのメトトレキサートの効果を示すグラフである。マウスは、アレムツズマブの初回投与に関連するメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日投与３回を伴ってまたは伴わずにアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇで５カ月間処置された。星印は、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５）。 Ａ〜Ｂは、アレムツズマブ単一用量３日後の脾臓リンパ球の除去を示すグラフである。図２８Ａ：Ｔ細胞およびＢ細胞は有意に除去される。小チェックはＰＢＳ処置対照マウスを表し、大チェックはアレムツズマブ処置マウスを表す。図２８Ｂ：Ｂ細胞（ＣＤ１９⁺）は、処置の２４時間後に９２％除去され、処置の３日後に３６％除去されたままである。３つのグラフは、異なる群の動物を表し、それぞれは異なる時点で採血した。星印は、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ≦０．００１；^***、ｐ≦０．０００１）。 Ａ〜Ｂは、サイトカインレベルへのメトトレキサートの効果を示す図である。図２９Ａは、脾臓およびリンパ節中のサイトカインレベルを評価するための６カ月研究の研究設計を示す。星印は、データがアレムツズマブでの５回目処置の２４時間後に収集されたことを示す。示すとおり矢印は、アレムツズマブもしくはメトトレキサートが投与されたまたは最終屠殺が実施された時点を示す。図２９Ｂは、アレムツズマブ単独で、またはアレムツズマブおよびメトトレキサートで処置したマウスにおけるＴＮＦファミリー（ＢＡＦＦ）に属するＢ細胞活性化因子のレベルを示す。 アレムツズマブおよびメトトレキサートでの処置後のサイトカインレベルを示す図である。図３０Ａは、４カ月研究の研究設計を示す。星印は、データがメトトレキサートの第２サイクルの１週間後に収集されたことを示す。示すとおり矢印は、アレムツズマブもしくはメトトレキサートが投与されたまたは最終屠殺が実施された時点を示す。 アレムツズマブおよびメトトレキサートでの処置後のサイトカインレベルを示す図である。図３０Ｂは、アレムツズマブ（ＡＺＭ）単独、またはメトトレキサート０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇもしくは２．０ｍｇ／ｋｇで処置したマウスにおける種々のサイトカインレベルを示す。 ＩＬ１０−／−（ノックアウト）およびＣ５７ＢＬ／６マウスでの抗ｒｈＧＡＡ力価へのメトトレキサートの効果を示す図である。ｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇはＩＬ１０−／−ノックアウトマウスおよびＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに、ｒｈＧＡＡの最初の３週間処置の０、２４および４８時間後にメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日を伴ってまたは伴わずに９週間毎週投与された。 アレムツズマブでの処置の１および／または２週間後にいくつかの（しかしすべてではない）脾臓Ｂ細胞集団が除去されることを示すグラフである。小斜線バーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）処置ｈｕＣＤ５２トランスジェニック対照マウスを表し；大斜線バーは、アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇで５日間連続処置したｈｕＣＤ５２トランスジェニックマウスを表す。アスタリスクは、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ≦０．００１；^***、ｐ≦０．０００１）。 アレムツズマブでの処置のコンテクストにおいてＢ細胞集団へのメトトレキサートの効果を検討するための研究設計を示す図である。甲状腺およびリンパ節（ＬＮ）を病理学的評価のために用いた。示すとおり矢印は、アレムツズマブおよびメトトレキサートが投与されたまたは最終屠殺の時点を示す。 メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日単独、アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇ単独、およびアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇとメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日との組合せの毎日投与３回のＢ細胞集団除去への効果を示すグラフである。アスタリスクは、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ≦０．００１；^***、ｐ≦０．０００１；ｎｓ、有意でない）。 アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇ単独での５サイクル処置、またはメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日単独の毎日投与３回、またはアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇとメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日との組合せ後のＢ細胞除去へのメトトレキサートの効果を示すグラフである。アスタリスクは、統計的有意差を有する測定値を示す（^*、ｐ＜０．０５）。 アレムツズマブ処置の初日に投与されたメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇの３日間単一サイクルで処置したマウスにおいてサイトカインＭＣＰ−１、ＩＬ−１３、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のレベルが低下していることを示すグラフである。データは、アレムツズマブの５回目投与の２４時間後、メトトレキサートでの処置の４カ月後に収集された。 Ａ〜Ｂは、ｎｕ／ｎｕヌードマウスでの２、６、１２週目のｒｈＧＡＡ力価を示す図である。図３７Ａは、２および６週目のｒｈＧＡＡ力価を示す。左から右へ生理食塩水で処置した対照マウス、ｒｈＧＡＡで処置したマウス、ならびにｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置したマウスでの２週目測定値に続いて、生理食塩水で処置された対照マウス、ｒｈＧＡＡで処置したマウス、ならびにｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置したマウスでの６週目測定値。図３７Ｂは、左から右へ、ｒｈＧＡＡ単独で処置されたｎｕ／ｎｕマウス（Ｍｙｏ）、メトトレキサートおよびｒｈＧＡＡで処置されたｎｕ／ｎｕマウス、ｒｈＧＡＡ単独で処置されたＢＬ６マウス、ならびにメトトレキサートおよびｒｈＧＡＡで処置されたＢＬ６での１２週目測定値を示す。 Ａ〜Ｂは、メトトレキサートでｒｈＧＡＡに対して寛容化されたマウスにおいてＩＬ−１０発現Ｂ１０Ｂ細胞の数および割合が増加することを示す図である。ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物から単離されたＢ１０Ｂ細胞をＩＬ−１０タンパク質発現についてフローサイトメトリーによって評価した。 図３８−１の続き。 Ａ〜Ｂは、活性化（ＣＤ８６＋）および非活性化（ＣＤ８６−）Ｂ１０Ｂ細胞の両方でＩＬ−１０が発現されていることを示す図である。図３９Ａは、ＣＤ８６で染色したＢ１０Ｂ細胞のＦＡＣＳプロットを示し、図３９Ｂは、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでの処置に応答したＣＤ８６⁺ＩＬ１０⁺Ｂ１０Ｂ細胞およびＣＤ８６^-ＩＬ１０⁺Ｂ１０Ｂ細胞の数を示す。 図３９−１の続き。 Ａ〜Ｂは、ｒｈＧＡＡを伴うメトトレキサート処置がＢ１０Ｂ細胞をそれらのＴＧＦ−ベータの発現を増大するように誘導することを示す図である。図４０Ａの第２および第３パネルは、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物由来で、ＴＧＦ−ベータおよびＣＤ８６で染色されたＢ１０Ｂ細胞を示すＦＡＣＳプロットである。図４０Ａの第１パネルは、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物におけるＴＧＦ−ベータ⁺Ｂ１０Ｂ細胞の数を示す。図４０Ｂは、ＣＤ８６⁺ＴＧＦ−ベータ⁺Ｂ１０Ｂ細胞およびＣＤ８６^-ＴＧＦ−ベータ⁺Ｂ１０Ｂ細胞計数を示す。 図４０−１の続き。 図４０−２の続き。 Ａは、ｒｈＧＡＡで処置された動物ではＢ１０Ｂ細胞がＦｏｘＰ３を発現すると考えられることを示す図である。 図４１−１の続き。 Ｂは、ＦｏｘＰ３＋Ｂ細胞の数がメトトレキサートおよびｒｈＧＡＡの両方での処置で増加することを示す図である。 図４１−３の続き。 Ｃは、活性化（ＣＤ８６＋）および非活性化（ＣＤ８６−）Ｂ１０Ｂ細胞の両方がＦｏｘＰ３を発現することを示す図である。 図４１−５の続き。 Ａ〜Ｃは、濾胞性、移行性２および移行性３Ｂ細胞（上から下）がＩＬ−１０を発現することならびにＩＬ−１０発現Ｂ細胞サブセットの細胞数がｒｈＧＡＡ単独で処置したマウスと比較してメトトレキサートで増加することを示す図である。 図４２−１の続き。 図４２−２の続き。 図４２−３の続き。 図４２−４の続き。 図４２−５の続き。 Ａ〜Ｃは、濾胞性、移行性２および移行性３Ｂ細胞（上から下）がＴＧＦ−ベータを発現することならびにＴＧＦ−ベータ発現Ｂ細胞サブセットの細胞数がｒｈＧＡＡ単独で処置したマウスと比較してメトトレキサートで増加することを示す図である。 図４３−１の続き。 図４３−２の続き。 図４３−３の続き。 図４３−４の続き。 図４３−５の続き。 Ａ〜Ｃは、濾胞性、移行性２および移行性３Ｂ細胞（上から下）がＦｏｘＰ３を発現することならびにＦｏｘＰ３発現Ｂ細胞サブセットの細胞数がｒｈＧＡＡ単独で処置したマウスと比較してメトトレキサートで増加することを示す図である。 図４４−１の続き。 図４４−２の続き。 図４４−３の続き。 図４４−４の続き。 図４４−５の続き。 抗ＴＧＦ−ベータ抗体（１Ｄ１１、Ｇｅｎｚｙｍｅ）またはアイソタイプ対照（１３Ｃ４）５ｍｇ／ｋｇの存在下または非存在下でｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置した動物の６週目での抗ｒｈＧＡＡ力価を示す図である。抗体力価は、動物の４つの異なる群において隔週で評価された。 Ａ〜Ｃは、１Ｄ１１処置がＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０またはＦｏｘＰ３を発現しているＢ１０Ｂ細胞のメトトレキサート誘導増殖を妨害したことを示す図である。脾臓はｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置され、ｒｈＧＡＡ１回処置またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート１回処置の７日後に１Ｄ１１または１３Ｃ４も同時投与された動物から単離された。次いで各群の細胞はプールされ、２日間培養され、次いでフローサイトメトリーを用いて計数された。 図４６−１の続き。 Ａ〜Ｃは、１Ｄ１１処置がＴＧＦ−ベータもしくはＩＬ−１０を発現している濾胞性Ｂ細胞のメトトレキサート誘導増殖を妨害したが、ＦｏｘＰ３＋濾胞性Ｂ細胞は、１Ｄ１１効果を経験したと考えられなかったことを示す図である。脾臓は、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置され、ｒｈＧＡＡ１回処置、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート１回処置の７日後に１Ｄ１１または１３Ｃ４も同時投与された動物から単離された。次いで各群の細胞はプールされ、２日間培養され、次いでフローサイトメトリーを用いて計数された。 図４７−１の続き。 Ａ〜Ｃは、移行性２Ｂ細胞では、１Ｄ１１処置がＴＧＦ−ベータ発現移行性２Ｂ細胞のメトトレキサート誘導増殖を妨害したが、ＩＬ−１０＋移行性２Ｂ細胞では効果は観察されなかったことを示す図である。脾臓は、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置され、ｒｈＧＡＡ１回処置またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート１回処置の７日後に１Ｄ１１または１３Ｃ４も同時投与された動物から単離された。次いで各群の細胞はプールされ、２日間培養され、次いでフローサイトメトリーを用いて計数された。 図４８−１の続き。 図４８−２の続き。 図４８−３の続き。 Ａ〜Ｃは、移行性３Ｂ細胞では、検出可能なＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３があるが、細胞に１Ｄ１１処置の明らかな効果はないことを示す図である。脾臓は、ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置され、ｒｈＧＡＡ１回処置またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート１回処置の７日後に１Ｄ１１または１３Ｃ４も同時投与された動物から単離され、細胞はフローサイトメトリーを用いて計数された。 図４９−１の続き。 図４９−２の続き。 図４９−３の続き。 図４８−４の続き。 Ａ〜Ｃは、濾胞性Ｂ細胞、移行性２Ｂ細胞および移行性３Ｂ細胞（上から下）では、１Ｄ１１処置がＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３の基礎レベルに影響を与えないことを示す図である。 図５０−１の続き。 図５０−２の続き。 図５０−３の続き。 図５０−４の続き。 Ａは、ｒｈＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）または「ＭＹＯ」）に対して寛容化されたマウス由来の総脾臓Ｂ細胞のｒｈＧＡＡ未処理レシピエントマウスへの移入を示す模式図である。移入後、レシピエントは（ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートのいずれかで処置された非移入対照動物と共に）、ｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇで毎週処置された。Ｂは、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート単一サイクルで処置された動物から単離された総脾臓Ｂ細胞がｒｈＧＡＡに対する免疫寛容を未処理宿主に移入できることを実証する力価分析を示すグラフである。 ウサギＩｇＧ（ｒｂＩｇＧ）、ｍＡＴＧ単独、ｒｂＩｇＧおよびメトトレキサート、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置された正常マウスの血液または脾臓由来の細胞計数を示すグラフである。メトトレキサートは、正常動物でＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔ制御性（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）Ｔ細胞または総ＣＤ１９＋Ｂ細胞を除去しない。 図５２−１の続き。 移植の１４日後にｒｂＩｇＧ、ｍＡＴＧ単独、ｒｂＩｇＧおよびメトトレキサート、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置された移植マウスの血液または脾臓由来の細胞計数を示すグラフである。メトトレキサートは、移植動物でＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔ制御性（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）Ｔ細胞および総ＣＤ１９＋Ｂ細胞を除去しない。 図５３−１の続き。 ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物でのＩＬ−１０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）におけるシフトによって見られるとおり、複数の細胞サブセットでメトトレキサート処置がＩＬ−１０の統計的に有意な増加を誘導することを示す図である。 ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物でのＴＧＦ−ベータの平均蛍光強度（ＭＦＩ）におけるシフトによって見られるとおり、複数の細胞サブセットでメトトレキサート処置がＴＧＦ−ベータの統計的に有意な増加を誘導することを示す図である。 図５５−１の続き。 ｒｈＧＡＡ、またはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置された動物におけるＦｏｘＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）におけるシフトによって見られるとおり、複数の細胞サブセットでメトトレキサート処置がＦｏｘＰ３の統計的に有意な増加を誘導することを示す図である。 図５６−１の続き。

本発明は、単一サイクルまたは短いコースのメトトレキサート投与が、補充酵素または治療用抗体などのタンパク質治療薬を受けている患者における望ましくない免疫応答（ＡＤＡ応答などならびに他の望ましくないＴおよび／またはＢ細胞性免疫応答）および組織移植における抗移植片抗体応答を低減するという本発明者らの驚くべき発見に基づく。この発見は、タンパク質治療および臓器移植の安全性および有効性の両方を増大させる新規方法を導く。

より具体的には本発明者らの研究は、メトトレキサート単一サイクルが抗体治療薬に対するＡＤＡを低減することを示した。下に詳述するとおり、研究の１セットは、ポリクローナル抗体治療薬、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）のマウスバージョンで行われた。Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）は、実質臓器移植の設定、再生不良性貧血、および移植片対宿主病の予防における免疫抑制のために用いられるウサギ抗ヒト胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体である。ウサギ抗マウス胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体（ｍＡＴＧ）は開発されている。それは、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）と類似する特徴を保持する（Ｒｕｚｅｋら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８８（２）：１７０〜９頁（２００９））。本発明者らは、メトトレキサート１回コースが抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価を＞９５％低減できることを実証した。実際に、本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルがメトトレキサート３サイクルよりＡＤＡを低減することにおいて良く働くことを驚くべきことに見出した。追加的にＡＤＡにおけるこの低減は、循環ｍＡＴＧのレベルを保持し、繰り返しｍＡＴＧ投与でｍＡＴＧ介在細胞除去および制御性Ｔ細胞割合を増強する。本発明者らの研究の別のセットは、モノクローナル抗体治療薬、アレムツズマブで行われた。本発明者らは、メトトレキサート１回コースが抗アレムツズマブ応答を同様に制御でき、アレムツズマブ介在リンパ球除去を増強することを見出した。

本発明者らは、このメトトレキサート単一サイクルレジメンが、タンパク質治療薬が酵素である場合にＡＤＡも低減することを発見した。本発明者らの２つの研究で本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルが、ＡＤＡを低減するために複数サイクルが必要であると当初は考えられた抗Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（組換えヒトアルグルコシダーゼアルファまたは「ｒｈＧＡＡ」）応答を効果的に制御できたことを実証した。

本発明者らは、メトトレキサートが臓器移植においても有用であることを発見した。本発明者らの研究で本発明者らは、心臓同種移植片移植でメトトレキサート単一サイクルが抗同種移植片抗体応答を制御できることを見出した。ｍＡＴＧと組み合わせた場合では心臓同種移植片の生着が有意により長かった。

本発明者らの研究は、タンパク質治療の最初の週に与えられたメトトレキサート単一サイクルが９５％を超えるＡＤＡの何カ月間もにわたる投与での長期低減を提供できることを示す。抗体力価でのこの低減は、ほとんどの研究の間を通じたメトトレキサートの不在にもかかわらず長期であった。さらに本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルが抗同種移植片応答（例えばマウス同種心臓移植モデルにおいて）を制御でき、複数抗原に同時に向けられた抗体応答についての制御を示すことを見出した。

メトトレキサートは古典的には、プリン代謝を阻害することおよびｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成を妨害することによって増殖細胞を殺すと考えられるジヒドロ葉酸還元酵素アンタゴニストとして公知である（Ｋｒｅｍｅｒ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、５０（５）：１３７０〜８２頁（２００４））。メトトレキサートがこの十分に記載された機構を通じて反応性細胞を単純に殺す可能性があることは容易に推測されうるが、これは本発明者らが発見した単一サイクルレジメンでは見込みがないと考えられる。メトトレキサートは、短い半減期を有し、処置の３から４カ月後細胞を積極的に殺すために十分長く細胞または循環内にありそうにはない（Ｗａｌｌｉｎｇ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、２４（１）：３７〜７７頁（２００６）；Ｓｌａｖｉｋｏｖａら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ、２５（２）：２１１〜６頁（１９７８））。さらに本発明者らは、メトトレキサート処置後にリンパ球除去の証拠を見出していない。むしろ本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルレジメンが無差別にリンパ球を除去するのではなく、免疫制御の活性機構を誘導することによって望ましくない抗体応答を低減することを驚くべきことに見出した。

本発明者らの研究は、メトトレキサート単一サイクルがＢ１０制御性Ｂ細胞ならびに活性化片縁帯Ｂ細胞、活性化濾胞性Ｂ細胞および活性化移行性３Ｂ細胞を増加させることを示す。本発明者らの研究は、メトトレキサート単一サイクルがＩＬ−１０発現、ＴＧＦ−ベータ発現およびＦｏｘＰ３発現Ｂ１０、濾胞性、移行性２および移行性Ｂ細胞の数を増加させること、ならびにこの増殖は、ＴＧＦ−ベータによって介在されることも示す。これらの研究は、メトトレキサートがＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３の発現レベルを増加させることも示す。脾臓Ｂ細胞集団の増殖は、メトトレキサートの作用の機序についての現在の理解を考慮すると驚くべきことであり、この投与パラダイムにおいてメトトレキサートが特有の、これまで知られていない様式で働くことを示唆する。メトトレキサートの低量、連続的な投与は、インフリキシマブ処置関節リウマチ患者で抗インフリキシマブ抗体応答を（曝露が継続していても）低減することが示され、このレジメンは寛容誘導よりも継続的な免疫抑制に関与するようである。メトトレキサート処置単独は、低用量で毎週与えられた場合に関節リウマチの疾患活性を低減することが示されている。近年の刊行物は、低用量メトトレキサートの連続的投与（隔日）で、関節リウマチにおけるメトトレキサート処置の有効性を補助できる自己抗原特異的制御性Ｔ細胞が出現することを示唆している（Ｘｉｎｑｉａｎｇら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、６４（７）：４６３〜４７１頁（２０１０））。対照的に、メトトレキサートについて本明細書で記載される投与パラダイムは、望ましくない免疫学的応答の長期間制御を提供できる短いコースのメトトレキサート処置に関与する点において真に特有のものである。

全体として本発明者らは、いくつかの異なる種類のＡＤＡ応答ならびに組織移植における抗同種移植片抗体応答ならびにＴ細胞およびＢ細胞応答について長期間制御をもたらしうるメトトレキサートの特有の投与レジメンを同定した。本発明者らは、メトトレキサートによって生じた免疫寛容が１匹の動物から別へ（例えば寛容化された動物由来のＢ細胞を非寛容化動物に移植することによって）移入されうることを見出した。本発明者らのデータは、免疫応答抑制において活性な制御性Ｂ細胞を表す場合がある活性化Ｂ細胞サブセットの増殖に関与する作用の特有の機構を通じてメトトレキサートが作用することを示唆する。さらにメトトレキサートは、制御性Ｔ細胞増殖の機構を通じても作用できる。

生物治療における望ましくない免疫応答
本発明の方法は、種々の生物学的治療（例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質および代謝物などの生物製剤を用いる治療）における望ましくない免疫学的応答（例えばＡＤＡ応答ならびに他の望ましくないＴおよび／またはＢ細胞性免疫応答）を制御できる。タンパク質治療は、治療剤がペプチドおよびタンパク質を含むタンパク質性物質である治療を意味する。タンパク質治療薬は、例えば酵素、サイトカイン、増殖因子、免疫調節物質、血栓溶解剤、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む）、抗体断片または改変抗体（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂ）であ
る場合がある。例えばファブリ病のためのＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（組換えヒトアルファ−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病のためのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（イミグルセラーゼ）、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ Ｉ）のためのＡｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）（ラロニダーゼ）ならびにポンペ病のためのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ）を含む多数の酵素補充治療がある種の遺伝子疾患を有する患者のために開発されている。抗体治療薬の例は、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ−ＣＤ３
）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、およびＢｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）（ベリムマブ）を含む。他のタンパク質治療薬の例は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）および他の融合タンパク質を含む。

多数の場合、望ましくない免疫応答は、患者においてタンパク質治療薬に対して生じる場合があり、患者の転帰に種々の作用をもたらす。ヒト患者に対して外来物である配列および立体構造を生物学的治療薬がしばしば含有することから、そのような応答が生じる。例えばＡＤＡは、治療の有効性を妨害するおよび／または安全性リスクを増加させる。ＡＤＡは、過敏症反応、アナフィラキシー、血清病、免疫複合体病、急性腎不全をもたらす場合がある。ＡＤＡは、タンパク質治療を受けている患者において、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学を含む十分に確立された方法を用いて臨床医によってモニターされうる。

いくつかの場合では、本明細書で用いられる「タンパク質治療」は、核酸治療薬を送達するためにウイルスベクターが用いられるウイルス治療を意味する。そのような治療で用いられる例示的ウイルスは、これだけに限らないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスを含む。抗体は、ウイルスのカプシドタンパク質に対して生じる場合があり、そのような治療の有効性を低減し安全性リスクを増加させる。本発明の方法は、同様にウイルス治療における望ましくない免疫学的応答（例えばＡＤＡ応答ならびに他の望ましくないＴおよび／またはＢ細胞性免疫応答）を制御するために有用である。

本発明の方法は、非タンパク質生物学的治療における望ましくない免疫学的応答も制御できる。例示的非タンパク質生物治療は、これだけに限らないが核酸治療（例えばアンチセンス治療、ｓｉＲＮＡ治療およびｍｉＲＮＡ治療）を含む。

移植における抗移植片応答
本発明の方法は、腎移植、肝臓移植、心臓移植および幹細胞移植などの組織移植を受けている患者において免疫寛容を誘導するためにも用いられうる。宿主対移植片および移植片対宿主拒絶は、組織移植、特に同種移植片および異種移植片移植においてしばしば生じる。メトトレキサート単一サイクルは、抗移植片抗体応答を管理するために単独でまたは別の免疫調節剤（例えばＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）などの免疫抑制剤）と共に用いられうる。追加的に移植でのＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）とメトトレキサートとの組合せは、移植片生着を延長するように作用できる。最終的に、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）が関節リウマチおよび多発性硬化症などの慢性自己免疫疾患の設定で調査される場合、メトトレキサートはＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）のより安全な再処置を可能にでき、患者を顕著な抗ウサギ抗体（ＩｇＧおよび／もしくはＩｇＭなど）ならびに／または注入関連反応の発症から保護する。

メトトレキサートでの望ましくない免疫学的応答の管理
本発明者らは、メトトレキサートの１回の短いサイクルが、生物学的治療薬（例えばタンパク質治療薬）を受けている対象におけるＡＤＡなどの望ましくない免疫学的応答および組織移植を受けている患者における抗同種移植片応答を有意に低減できることを見出した。望ましくないＡＤＡを低減することは、患者の安全性を改善できるだけでなく、タンパク質治療薬の薬力学および／または薬物動態を改善することを通じてタンパク質治療薬の有効性も改善できる。

メトトレキサート、小分子化合物は、重度の活性関節リウマチ、重度の乾癬ならびに子宮内で受精卵の周囲を形成する組織で始まるがん、乳がん、肺がん、ある種の頭頸部がん、ある種のリンパ腫および白血病（白血球で始まるがん）を含むある種のがんの患者を処置するために用いられてきた。メトトレキサートは、がん細胞の成長を遅らせることによ
ってがんを処置する。メトトレキサートは、皮膚細胞の成長を遅らせ、鱗屑の形成を停止させることによって乾癬を処置する。メトトレキサートは、免疫系の活性を低下させることによって関節リウマチを処置できる。

メトトレキサートは、α−ガラクトシダーゼＡおよびα−グルコシダーゼに対して誘発されたＡＤＡ応答を制御するコンテクストにおいて研究されている。しかしこれらの研究は、メトトレキサート単一サイクルよりもメトトレキサート複数サイクルの処置で行われた（Ｇａｒｍａｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７（３）：４９６〜５０２頁（２００４）；Ｊｏｓｅｐｈら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２（１）：１３８〜４６頁（２００８）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６０（２）：１９４〜５頁（２００９））。

本発明者らの研究は、メトトレキサート単一サイクルがＡＤＡおよび抗同種移植片抗体を有意に低減するために十分であることを驚くべきことに示す。実際に抗体治療薬（例えばｍＡＴＧ）に関与する研究で、本発明者らはメトトレキサート単一サイクル処置がＡＤＡを低減することにおいてメトトレキサート複数サイクル処置より有効であることを示す。メトトレキサートを用いる以前の研究は、メトトレキサート単一サイクルがＡＤＡを低減するために十分である指標を、まして複数サイクル処置よりも有効である指標を示さなかった。メトトレキサートは細胞傷害性であることが公知である。したがって、メトトレキサートによるＡＤＡの低減のための機構がこの特性に依存すると仮定した場合、処置サイクル数の低減は事実上メトトレキサートの有益な効果を低減すると予測されたであろう。さらにこれらの以前発表された研究は、メトトレキサート１回コースで本明細書において驚くべきことに実証された薬物動態、薬力学、有効性または安全性へのメトトレキサート処置の利益を実証していない。抗体治療においてメトトレキサートがＡＤＡを低減できることも彼らは開示していない。

本明細書で用いられる単一サイクルレジメンは、連続する日または連続しない日での処置レジメンまたは処置単位を意味し、主なタンパク質治療薬の投与または移植後の好ましくは５日以内（例えば３日以内）に開始される。主なタンパク質治療薬が複数期間で投与される場合、メトトレキサート単一サイクル処置は、好ましくはタンパク質治療薬投与の最初の期間を過ぎては延長されない。例として、毎週の、毎月のまたは毎年のタンパク質治療においてメトトレキサート単一サイクルはメトトレキサートの３日連続摂取（例えば経口）からなり、０日目（患者に初めて主なタンパク質治療薬が与えられる日または患者が組織移植を受ける日）に開始される。次いで患者は、メトトレキサートの単一用量を１日目（２４時間後）および２日目（４８時間後）に受ける。メトトレキサート単一サイクルも例えば０日目に開始されるメトトレキサートの２、３、４、５、６、７または８日連続投与からなりうる。メトトレキサートは、適切だと見なされた他の時期（例えば、二次自己免疫を例えばリンパ球除去治療において管理する場合）にも投与されうる。メトトレキサート単一サイクルは、好ましくは８日よりも長く継続しない。いくつかの実施形態では、メトトレキサート単一サイクルは、主な治療薬処置（すなわち生物学的治療薬での処置）開始の４８時間前から４８時間後の間に始まる。例えばメトトレキサート単一サイクルは、主な治療薬処置開始の４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、同時、１２時間後、２４時間後、３６時間後または４８時間後に始まりうる。

本発明者らの研究はメトトレキサートの低投与量が、タンパク質治療および移植における望ましくない免疫学的応答（例えばＡＤＡ応答ならびに他の望ましくないＴおよび／またはＢ細胞性免疫応答）を管理するために十分であることも驚くべきことに示す。したがって本発明の実施形態では、メトトレキサートは１回よりも多いサイクルで、しかし低い総投与量で投与されうる。例えばメトトレキサートは、２回以上（例えば３、４、５、６回など）のサイクルだが５ｍｇ／ｋｇを超えない総組合せ投与量で患者に投与されうる。

メトトレキサートの投与量は、単一サイクルで与えられる場合に抗体または細胞応答などの望ましくない免疫学的応答を低減するメトトレキサートの有効量である。ヒト患者におけるメトトレキサートの有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。いくつかの実施形態では、有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇから１．５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、０．１２ｍｇ／ｋｇから１．２８ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、有効量は、０．１２ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、有効量は、１．２８ｍｇ／ｋｇである。投与レジメンが低い新生物用量よりも関節リウマチに対する用量により類似している用量レベルでのメトトレキサートの短期のコースだけを含むことから、メトトレキサートの推奨投与量は最小の安全性リスクを生じる可能性がある。本発明者らの研究では、マウスでの各サイクルで検査されたメトトレキサートの総量は、１４または１５ｍｇ／ｋｇであった。マウスでのメトトレキサート１４ｍｇ／ｋｇは、体重６０ｋｇの平均成人でのおよそ６８ｍｇまたは５．９２ｍｇ／ｍ²に相当
する。関節リウマチ患者は、顕著な毒性を被ることなく１週間にメトトレキサート２５ｍｇまでを受ける場合がある。メトトレキサートの低い新生物用量は、３０ｍｇ／ｍ²であ
ると考えられ、５．９２ｍｇ／ｍ²よりも著しく高い。したがって（このメトトレキサー
トレジメンの一時的性質と合わせて）上に推奨する用量は、成人で十分許容されると考えられる。メトトレキサートの正確な投与量およびレジメンは、患者の健康状態、年齢、体重、性別、患者が受けている他の薬物療法およびそれらの公知の副作用、ならびに他のあらゆる関連する要因を考慮して当然臨床医によって確立されるべきである。患者での望ましくない抗体応答の管理におけるメトトレキサートの効果は、患者の臨床検査、症状、ＡＤＡまたは抗同種移植片抗体力価をアッセイする血液検査、免疫組織化学的アッセイ（例えばＣ４沈着アッセイならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびビーズベース蛍光アッセイなどの他の固相抗体検出法）を含む周知の方法によってモニターされうる。効果は、本発明者らがメトトレキサート処置によってレベルが低減されることを示したＭＣＰ−１、ＩＬ−１３、ＩＬ−６およびＩＬ−１２などのバイオマーカーならびに本発明者らがメトトレキサート処置によって数が増加することを示した移行性２Ｂ細胞、移行性３Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ１０Ｂ細胞およびＢ１Ｂ細胞のレベルを測定することによってもモニターされうる。追加的にＴＧＦ−ベータ、ＦｏｘＰ３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦも必要に応じて望ましくない免疫応答へのメトトレキサートの効果をモニターするためのバイオマーカーとして用いられうる。バイオマーカーのレベルは、治療薬（例えばタンパク質治療薬）に対するＴ細胞応答性へのメトトレキサートの効果をモニターするためにも用いられうる。ＩＬ−２、インターフェロン−γおよびＴＮＦ−αなどのＴ細胞活性化に関するバイオマーカーもＴ細胞応答へのメトトレキサートの効果についての読み取り値としてモニターされうる。

望ましくない免疫応答を制御するその能力によって、本発明のメトトレキサート単一サイクルレジメンは、所与の患者でのその繰り返し使用が安全性および有効性の懸念からこれまで限定されてきた多数のタンパク質治療薬の使用を拡大できる。例えばメトトレキサートとＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）との併用は、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）の利用を、これだけに限らないが糖尿病、ループス、強皮症、関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症を含むＴ細胞性自己免疫疾患などの再投与が望まれる他の疾患設定に拡大できる。追加的にメトトレキサートは、例えば多発性硬化症などの（アレムツズマブが通常年サイクルで繰り返し投与される）自己免疫疾患または（３ｍｇ／日で投与を開始し（輸注反応がグレード２またはそれ未満まで）、次いで１０ｍｇ／日まで増やされ（輸注反応がグレード２またはそれ未満まで）、最終的に３０ｍｇ／日まで増やされる（隔日で毎週３回）１２週間サイクルで、アレムツズマブが投与される）慢性Ｂ細胞リンパ性白血病におけるアレムツズマブの有効性および安全性を拡大できる。これらの種類の投与レジメンは、阻害性ＡＤＡ応答を強化できる。したがってメトトレキサートは、ＡＤＡおよび任意の他の望ましくない免疫応答を制御するために用いられうる。

メトトレキサートでのリンパ球除去治療の改善
本発明の例示的適用は、多発性硬化症（ＭＳ）（再発寛解型ＭＳなど）の処置におけるアレムツズマブ治療などのリンパ球除去治療を改善するためにメトトレキサートを使用することである。「リンパ球除去」は、循環リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＢ細胞）の低減による免疫抑制の一種であり、リンパ球減少症をもたらす。治療では、リンパ球除去はＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（登録商標）（アレムツズマブ）およびリツキシマブなどのタンパク質治療薬によって達成されうる。リンパ球除去は、多発性硬化症（Ｃｏｌｅｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、２９６〜３０４頁（１９９９）；Ｃｏｌｅｓら、２００８）、関節リウマチ、脈管炎およびループスを含む多数の自己免疫状態の処置において望ましい。

リンパ球除去治療は、二次自己免疫をもたらす場合がある。自己免疫は、最初の（「主な」）疾患、例えば「主な」自己免疫疾患、の発症に続いて生じる場合に本明細書において「二次自己免疫」と称される。二次自己免疫は、リンパ球減少症である、またはリンパ球減少症であったＭＳ患者で例えばリンパ球除去治療後に時に生じる。いくつかの個体では二次自己免疫は、リンパ球除去治療（例えばアレムツズマブでの処置）の直後に生じる。他の個体では二次自己免疫は、リンパ球除去治療の数カ月後または数年後まで生じない場合があり；それらの個体の一部では彼らが二次免疫を発症する時期までに実質的なリンパ球回復（総リンパ球計数）が生じる場合があり、それにより彼らはもはやリンパ球減少症ではない場合がある。リンパ球除去は、抗体治療薬または小分子治療薬での処置のコンテクストにおいて生じうる。

リンパ球減少性ＭＳ患者で生じる二次自己免疫は、これだけに限らないが甲状腺自己免疫（例えばグレーブス病）、血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、グッドパスチャー病、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、および自己免疫性リンパ球減少症を含む、ＭＳ以外の任意の種類の自己免疫状態である場合がある。いくつかの実施形態では、二次自己免疫は、Ｂ細胞性である、すなわちＢ細胞応答および自己抗体は、疾患発症および病態に直接結び付く。

これらの自己免疫疾患を診断するおよびモニターするための技術は、当業者に周知であり、症状の評価および血液分析などの診察を含む。本発明は、任意の公知の方法の使用を企図する。例えば患者の体液（例えば血液）中の自己抗体レベルは、自己免疫の徴候を検出する手段として決定されうる。具体的には抗核抗体、抗平滑筋抗体および抗ミトコンドリア抗体は、測定されうる。抗核抗体が検出された事象では、追加的なアッセイが抗二重鎖ＤＮＡ抗体、抗リボ核タンパク質抗体および抗Ｌａ抗体を測定するために実施されうる。抗甲状腺ペルオシキダーゼ（ＴＰＯ）および抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体抗体は、自己免疫性甲状腺疾患を検出するために測定される場合があり；抗ＴＰＯまたは抗ＴＳＨ受容体抗体が検出された場合、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４およびＴＳＨレベルを測定することによって甲状腺機能が影響を受けているかどうかを測定できる。抗血小板抗体は、自己免疫性血小板減少症を検出するために測定される場合があり、血小板レベルの測定は抗血小板抗体の存在が血小板数の低減をもたらしているかどうかを決定するために役立ちうる。ＷＯ２０１０／０４１１４９も参照されたい。

本発明のメトトレキサート単一サイクルレジメンは、ＡＤＡを低減し、二次自己免疫を最小化することによってリンパ球除去治療の安全性および有効性を改善するために用いられうる。理論に束縛されることを意図せず、本発明者らは、メトトレキサートが複数の自己抗原を同時に寛容化することによって二次自己免疫を低減できると考える。

他に定義する場合を除いて、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。例示的方法および材料が下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似のまたは等価の方法および材料も本発明の実施または検査において用いられうる。本明細書に記載のすべての刊行物および他の参考文献は、その全体を参照によって組み入れる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が支配する。本明細書に多数の文書が引用されるがこの引用は、任意のこれらの文書が当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成することの承認を構成しない。本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられた整数もしくは整数の群の包含を含意するが任意の他の整数もしくは整数の群の排除を含意しないことは理解される。材料、方法および例は、単なる例示であり限定することを意図しない。

本発明のさらなる詳細は、次の非限定的実施例において記載される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示として示されており、添付の実施形態を限定するとして解釈されるべきではないことは理解されるべきである。本開示およびこれらの実施例から、当業者は本発明のある種の特徴を確認でき、その精神および範囲を逸脱することなく、種々の用法および状態に適応させるために本発明の種々の変更および改変を加えられる。これらの実施例において用いられる材料および方法は次のとおり記載される。

マウス
正常メスＣ５７ＢＬ／６マウス、６から１２週齢をウサギ抗マウス胸腺細胞グロブリンポリクローナル抗体（ｍＡＴＧ）のｉｎ ｖｉｖｏ研究のために用い、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）またはＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）から得た。アレムツズマブ関連研究は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．から得たヒトＣＤ５２（ｈｕＣＤ５２）トランスジェニック（Ｔｇ）マウス、６〜１２週齢を用いた。マウスを実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ
ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃａｒｅ Ｉ認証評価の下で収容および保持し、これらの研究で用いたすべての動物プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。

非臨床薬理学研究のために用いたｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ（Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって作製された。マウスを作製するために、ヒト染色体１由来のゲノムＤＮＡおよそ１４５キロベースを含有するバクミド構築物をＣＤ−１胚性幹細胞のマウスゲノムに無作為に組み込んだ。このバクミドが含有したヒトゲノムＤＮＡの広がりのために、構築物はヒトＣＤ５２に加えて未知の機能の合計５個の部分的または全長遺伝子を含んだ。バクミドに含有された５個の部分的または全長遺伝子セグメントは、次のとおりであった：ヒトＣＤ５２遺伝子、新規遺伝子（ＤＫＦＺＰ４３４Ｌ０１１７）の３’末端、ＳＨ３ＢＧＲＬ３遺伝子（ＳＨ３ドメイン結合富グルタミン酸タンパク質様３）、ソキウス（ｓｏｃｉｕｓ）（ＳＯＣ）に関する遺伝子、ＡＩＭ１Ｌ（メラノーマ１様において欠如（ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ １−ｌｉｋｅ））遺伝子およびＺｎフィンガータンパク質６８３遺伝子。樹立系統３個は作製され、１０７系統はＧｅｎｚｙｍｅで確立された。

抗体投与
ポリクローナル抗体ｍＡＴＧおよびｒｂＩｇＧをＲｕｚｅｋら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８８（２）：１７０〜９頁（２００９）に記載のとおり調製し、実験に応じた種々のレジメンで腹腔内注射によって投与した。モノクローナル抗体アレムツズマブは、０．５ｍｇ／ｋｇの１回注射または０．５ｍｇ／ｋｇ／日の３日もしくは５日のいずれかのサイクルのいずれかで静脈内に投与した。

Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置
組換えヒトアルグルコシダーゼアルファ（ｒｈＧＡＡ、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．によってＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）として販売）を製剤された薬物製品として用いた。異なる記載がなければ、マウスはｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇで急速投与尾静脈注射によって毎週処置した。すべてのマウスは、ｒｈＧＡＡ投与の前に腹腔内へのジフェンヒドラミン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）５から３０ｍｇ／ｋｇで予防的に処置された。対照動物は、滅菌０．９％生理食塩水またはｒｈＧＡＡ製剤用緩衝液のいずれかで静脈内処置された。

メトトレキサート処置
メトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ＃４５４１２５）は、０．５、１．０、２．０または５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射によって１〜３サイクル（各サイクルは実験に応じた３日、６日または７日連続の注射に相当する）投与した。毎月のｍＡＴＧ処置を含む研究では、メトトレキサートは、最初のｍＡＴＧ処置または最初の３回のｍＡＴＧ処置のいずれかの０、２４および４８時間後に５ｍｇ／ｋｇで腹腔内へ投与した。ｍＡＴＧを０および４日目に投与する移植研究では、メトトレキサートを２ｍｇ／ｋｇで０から６日目まで毎日、０．５ｍｇ／ｋｇで０から６日目まで毎日、または０．５ｍｇ／ｋｇで０から１１日目まで毎日与えた。

ｍＡＴＧ処置
ポリクローナル抗体ｍＡＴＧを腹腔内注射として５ｍｇ／ｋｇを４週間ごとまたは移植設定の際は初回投与が移植の日（０日目）に与えられ、４日間隔で与えられる２回の２０ｍｇ／ｋｇ投与として投与した。

種々の組織由来の細胞調製物
脾細胞およびリンパ節細胞調製物に関して単一細胞懸濁物を採取したマウス脾臓または鼠径部および腸間膜のリンパ節からフロストスライドガラス間での均質化によって２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中に作製した。脾細胞調製のために赤血球を赤血球溶解溶液（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）での１〜２分間のインキュベーションによって溶解した。血液を後眼窩採血によって単離し、細胞調製を赤血球溶解溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で赤血球を２０〜３０分間溶解することによって実施した。すべての組織調製物について、生存細胞をＶｉＣｅｌｌ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて数えた。単離後にすべての細胞調製物を下に記載するアッセイで用いる前にＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄した。

フローサイトメトリー
異なる組織中の細胞集団の評価のために組織の単一細胞懸濁物を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ（すべての抗体はＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ由来）を含んだ蛍光色素コンジュゲート抗体とインキュベートした。細胞内Ｆｏｘｐ３発現分析を抗Ｆｏｘｐ３製造者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って実施した。抗体とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ、Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）によって分析した。

評価した細胞集団は次のとおり定義された：
総ＣＤ４ Ｔ細胞：ＣＤ４⁺ＣＤ８^-、
総ＣＤ８ Ｔ細胞：ＣＤ８⁺ＣＤ４^-、
ＣＤ４未処理細胞：ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ＣＤ４４^-、
ＣＤ４メモリー細胞：ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ^-ＣＤ４４⁺、
未処理ＣＤ８ Ｔ細胞：ＣＤ８⁺ＣＤ４４^-ＣＤ６２Ｌ⁺、
ＣＤ８メモリー細胞：ＣＤ８⁺ＣＤ４４⁺ＣＤ６２Ｌ^-、
制御性Ｔ細胞：ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｆｏｘｐ３⁺、
総Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺、
Ｂ２／濾胞性Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ２１^intＣＤ２３^hi、
Ｂ１Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ４３⁺ＣＤ１１ｂ⁺、
移行性１Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ９３⁺ＣＤ２３^-ＩｇＭ^hi、
移行性２Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ９３⁺ＣＤ２３⁺ＩｇＭ^hi、
移行性３Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ９３⁺ＣＤ２３⁺ＩｇＭ^lo、
辺縁帯Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ２１^hiＣＤ２３^lo、および
Ｂ１０Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ５⁺ＣＤ１ｄ⁺。

ｉｎ ｖｉｔｒｏブロッキング研究は、１００μｇ／ｍｌまでのｍＡＴＧはこれらの集団の検出を妨げないことを決定した。

抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
マウス血清中の抗ｍＡＴＧ ＩｇＧのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。簡潔には９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を一晩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のウサギＩｇＧ １μｇ／ｍｌでコートした。Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）でのブロッキング後、血清の段階希釈物をウサギＩｇＧコートプレートに２連で添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。最終洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＢｉｏＦｘ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を添加し、１５分間、室温で発色させた。反応を１Ｎ ＨＣｌの添加によって停止させ、吸光度値を４５０／６５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で読み取った。エンドポイント力価は、平均が吸光度０．１００（Ｓｏｆｔｍａｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いる）を超えた最低希釈と定義された。

ｍＡＴＧ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
マウス血清をＥＬＩＳＡで決定した。簡潔には９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を一晩、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃ断片抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）１μｇ／ｍｌでコートした。０．５％ＢＳＡ（高純度）でのブロッキング後、標準対照および血清試料を必要に応じて希釈し、コートプレートのウエルに２連で添加し、１時間、３６〜３８℃で穏やかに振盪させてインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃ断片抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を適切に添加し、１時間、３６〜３８℃で穏やかに振盪させてインキュベ
ートした。最終洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＢｉｏＦｘ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を添加し、１５分間、２３〜２５℃で発色させた。反応を１Ｎ ＨＣＬの添加によって停止させ、吸光度値を４５０／６５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で読み取った。最終濃度は標準曲線を内挿された。本方法によるｍＡＴＧ特異的ＩｇＧの測定値は２１８，０００を超える抗ｍＡＴＧ ＩｇＧの力価によってわずかにだけ影響を受けることは予定された。

抗アレムツズマブＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
マウスは、アレムツズマブ処置の４〜６日後に採血し、特異的抗アレムツズマブＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のアレムツズマブ３μｇ／ｍｌでコートした。ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡでのブロッキング後、血清の段階希釈物を、アレムツズマブコートプレートに２連で添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を添加し、１５分間、室温で発色させた。反応を１Ｎ ＨＣｌの添加によって停止させ、吸光度値を４５０／６５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で読み取った。エンドポイント力価は、Ｅｘｃｅｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて０．２の吸光度値で内挿された対数的に変換した試料希釈の真数と定義された。

抗ｒｈＧＡＡ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
マウスは、ｒｈＧＡＡ処置の４〜６日後に採血し、特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を一晩、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中のｒｈＧＡＡ ５μｇ／ｍｌでコートした。ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡでのブロッキング後、血清の段階希釈物を、ｒｈＧＡＡコートプレートに２連で添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。最終洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加し、１５分間、室温で発色させた。反応を１Ｎ ＨＣｌの添加によって停止させ、吸光度値を４５０／６５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で読み取った。エンドポイント力価は、Ｓｏｆｔｍａｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて０．２の吸光度値をもたらした試料希釈の逆数と定義された。

ｅｘ ｖｉｖｏ研究
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＥ４ＧＡＡＫＯ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）マウス、８〜１２週齢にメトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ＃４５４１２５）５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射で１〜３サイクル（単一サイクルは３日連続注射に相当する）与えた。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２０ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射で１回または毎週投与２〜６回で最初のメトトレキサート投与と共に開始して与えた。動物は処置開始後毎週または毎日屠殺した。脾臓、腸間膜および鼠径リンパ節をＴおよびＢ細胞サブセットのフローサイトメトリー分析のために収集し、血清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。脾臓
をスライドガラスの間で処理し、赤血球（ＲＢＣ）を溶解緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ＃５５５８９９）から購入）で製造者の説明書に従って溶解した。リンパ節をスライドガラスの間で処理し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を４％ウシ胎児血清および総マウスＩｇＧ ２５μｇ／ｍＬを含有するＰＢＳ ２００μＬに再懸濁し、３０分間、４℃でブロッキングした。脾臓細胞およそ３００万個およびリンパ節細胞１００万個をさまざまな抗体カクテルで染色し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣＡＮＴＯＩＩフローサイトメーターのハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）で分析した。細胞事象少なくとも１００，０００個をリンパ球ゲート内で取得した。抗マウス抗体カクテルは、ＰＥ−ＣＤ２１／３５ カタログ＃５５２９５７、ＦＩＴＣ− カタログ＃５５３１３８、ＰＥ−ＣＤ１３８ カタログ＃５５３７１４、ＰＥ−ＣＤ１２７ カタログ＃５５２５４３、ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ１９ カタログ＃５５７６５５、ＦＩＴＣ−ＣＤ４３ カタログ＃５５３２７０、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ４ カタログ＃５５２７７５、ＦＩＴＣ−ＣＤ３ｅ カタログ＃５５３０６２、ＡＰＣ−ＣＤ１１ｂ カタログ＃５５３３１２、ＰＥ−Ｃｙ７−ＩｇＭ カタログ＃５５２８６７、ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ８ カタログ＃５５７６５４、ＰＥ−ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２） カタログ＃５５７７９６、ＡＰＣ−ＣＤ１３８ カタログ＃５５８６２６、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ カタログ＃５５２８５０、ＰＥ−ＣＤ９３（初期Ｂ系列）カタログ＃５５８０３９、ＡＰＣ−ＣＤ６９ カタログ＃５６０６８９、Ｐｅ−Ｃｙ７−ＣＤ２４ カタログ＃５６０５３６、ＦＩＴＣ−ＣＤ１ｄ カタログ＃５５３８４５、ＡＰＣ−ＣＤ５ カタログ＃５５００３５およびＰｅｒｃｐ−Ｃｙ５−７ＡＡＤ カタログ＃５５９９２５からなり、すべてＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。ＦＩＴＣ−ＦｏｘＰ３ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＰＢ）−ＣＤ２５ カタログ＃１０２０２２、ＰＢ−ＣＤ２３ カタログ＃１０１６１６およびＰＢ−ＣＤ８６ カタログ＃１０５０２２はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。リンパ球サブセットの分析は、Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅから供給されるＦＣＳ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３ ｓｏｆｔｗａｒｅで実施した。割合はバッチ処理オプションで作成し、絶対数は得られた細胞計数により算出した。脾臓およびリンパ節細胞計数はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ｃｅｌｌ ＸＲ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒで製造者の説明書に従って得た。

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびサイトカイン分析
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＥ４ＧＡＡＫＯ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）マウス、８〜１２週齢にメトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ＃４５４１２５）５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射、単一サイクル（３日連続投与）でｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇでの処置と共に開始して与えた。１Ｄ１１研究用に動物を１Ｄ１１または１３Ｃ４（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のいずれかの５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で１週間に３回、隔日でｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート処置と共に開始して処置した。動物はｒｈＧＡＡ開始後マウス株に応じて６または７日目に屠殺した。脾臓を単一細胞懸濁物に調製し、製造者の説明書に従ってＲｏｂｏＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）装置に装填し、Ｂ細胞ネガティブ選択に供した。精製Ｂ細胞を９６ウエル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ カタログ＃３７９９）に１ウエルあたり細胞５００，０００個で播種し、無刺激でまたはＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ
カタログ＃Ｌ５０１４）１０μｇ／ｍＬと共に４８時間、３７℃でインキュベートした。製造者の説明書に従ってすべてのウエルにＭｏｎｅｎｓｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ＃５５４７２４）を供与した。細胞を少なくとも４時間、３７℃でインキュベートした。試料をＶ底ウエル（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ＃６５１２０１）に移し、１２００ｒｐｍで、５分間、４℃で回転させた。細胞を４％ウシ胎児血清および総マウスＩｇＧ ２５μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ ２００μＬに再懸濁し、３０分間、４℃でブロッキングした。プレートを再度回転させ、上に記載の抗体カクテル１０
μｌを添加したＰＢＳ／２％ＦＣＳ ９０μＬに再懸濁し、２０分間（染色手順の最後の１０分間に７ＡＡＤ ５μＬを添加して）、４℃でインキュベートした。試料への緩衝液１００μＬの添加とその後の回転は、洗浄として用いた。試料はタンパク質の表面分析および即時取得のために緩衝液に再懸濁する、またはＩＬ−１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ カタログ＃５０５００８）、ＴＧＦ−ベータ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ カタログ＃１４１４０４）およびＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ＃１１−５７７３−８２）の細胞内染色のために、製造者の説明書に従ってＦｉｘ／Ｐｅｒｍ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ＃１１−５７７３）に再懸濁することができた。追加的表面染色は、ＴＧＦ−ベータおよびＴｉｍ−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ カタログ＃１１９５０６）抗体を含んだ。すべての試料は上に記載のとおり取得し、分析した。

動物および心臓同種移植片モデル
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹまたはＲａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）から得て、これらの実験に８から１３週齢の間で用いた。ドナー同種Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＫｅｔａｍｉｎｅ（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）およびＸｙｌａｚｉｎｅ（Ｌｌｏｙｄ、Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ、ＩＡ）の腹腔内注射で最初に麻酔し、胸骨正中切開を実施した。ドナー心臓を、上大静脈および肺静脈を結紮および分割する前に、ｉｎ ｓｉｔｕで下大静脈および大動脈を通じて冷却ヘパリン処置乳酸リンゲル溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）１ｍｌでゆっくり灌流した。次いで上行大動脈および肺動脈を切除し、移植片をドナーから取り出し、心臓を移植まで氷冷生理食塩水中で保存した。レシピエントマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を同様に麻酔し、ドナーマウスについて（腹腔を開いたこと以外は）上に記載したとおり準備した。開いた腹腔を見るために外科用顕微鏡を用い、腹部大動脈（ＡＡ）および下大静脈（ＩＶＣ）を単離した。ドナー心臓をレシピエント腹部に（逆さまに）置き、移植片を、ドナー肺動脈とレシピエント下大静脈の間、同様にドナーの大動脈とレシピエントの腹部大動脈の間を端側吻合で血行再建した。止血を確認後、腹筋をｒｕｎｎｉｎｇ ５−Ｏ
Ｖｉｃｒｙｌ ｓｕｔｕｒｅ（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）で閉じ、皮膚をｒｕｎｎｉｎｇ ５−０ Ｅｔｈｉｌｏｎ ｓｕｔｕｒｅ（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じた。標準的な術後痛評価および管理を実施した。移植片は、触診によって最初の３０日間、１週間に５〜７回、次いで研究の終了まで１週間に３〜４回評価した。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをｒｈＧＡＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与１回、メトトレキサート（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ）５ｍｇ／ｋｇ ３回連続の腹腔内投与および１Ｄ１１または１３Ｃ４のいずれかの５ｍｇ／ｋｇ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）隔日３回投与で処置した。メトトレキサート、１Ｄ１１および１３Ｃ４処置はｒｈＧＡＡ注射と共に開始した。脾臓を処置開始７日後に収集し、Ｂ細胞、培養およびフロー分析のために上に記載のとおり処理した。追加的にｒｈＧＡＡ力価データを上に記載のとおり１２週間にわたるｒｈＧＡＡの毎週投与、メトトレキサート１または３サイクルのいずれかでの投与および１２週間の１Ｄ１１または１３Ｃ４の週３回隔日投与で動物を処置することによって得た。血清試料をＥＬＩＳＡ分析のために２週間ごとに収集した。

病理組織学および免疫組織化学
心臓移植片を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、右および左心室ならびに流出路を曝すために縦軸に沿って二分し、パラフィン包埋のためにルーチン的に処理した。切片を５ミクロンで切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはマッソントリクロームで染色した。連続切片も下に記載のとおり免疫染色した。各Ｈ＆Ｅ染色切片を同種移植片拒絶病態（例えば脈管炎、心筋変性および壊死、心筋炎）の種々の特性について組織
学的グレーディングスキームを用いて定性的に評価した。

免疫組織化学をＢｏｎｄ−Ｍａｘ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ
Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて実施した。ＣＤ３およびＦｏｘｐ３二重免疫陽性細胞を検出するために、移植片組織切片をＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔおよびＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ＡＰ Ｒｅｄ ｋｉｔ（Ｌｅｉｃａ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を製造者の指針に従って用いる抗ＣＤ３および抗Ｆｏｘｐ３抗体での二重免疫染色に供した。簡潔には、パラフィン包埋移植片の脱パラフィン切片を熱誘導エピトープ修復（９９℃で２５分間）に供し、無血清タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ、ＣＡ）、ウサギモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ／Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒ）、ペルオキシダーゼコンジュゲートポリマー、ペルオキシダーゼブロックおよびジアミノベンジジン検出試薬に続いて、ラット抗マウスＦｏｘｐ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、次いでウサギ抗ラット抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とインキュベートした。次いでスライドをＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ＡＰとインキュベートし、赤色検出試薬（ｒｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を混合し、最後にヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照スライドでは、一次抗ＣＤ３および抗Ｆｏｘｐ３抗体をＣｈｒｏｍｅｐｕｒｅ全ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）およびラットＩｇＧ２ａ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）でそれぞれ置き換えた。

血清同種抗体レベル
血清同種抗体レベルを心臓移植または正常マウス由来の血清を１：５０希釈でＳＶ４０形質転換Ｃ５７ＢＬ／６線維芽細胞株（ＳＶＢ６）とインキュベートし、続いてＦＩＴＣウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いて線維芽細胞結合抗体（同種抗体）を検出することによっておよびフローサイトメトリー分析によって決定した。実験間の同種抗体レベルを標準化するために血清染色線維芽細胞の幾何平均蛍光強度をアイソタイプ対照染色線維芽細胞で割った。血清抗体の同種線維芽細胞への結合は、同じ血清試料がＳＶ４０形質転換ＢＡＬＢ／ｃ線維芽細胞株（ＳＶＢａｌｂ）に結合しないこと（データ未記載）から明確に同種抗体であった。

養子移入マウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、特定病原体不在の条件下に収容した。対照マウスにはｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射１回を与えた。寛容化マウスには、３日連続のメトトレキサート０．５ｍｇの腹腔内注射に加えてｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射１回を与えた。脾臓を最初のｒｈＧＡＡ注射の６日後に両ドナー群から採取し、プールされた単一細胞懸濁物中に処理した。細胞を洗浄し、０．２２μＭフィルターを通して濾過した。次いで細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＲｏｂｏＳｅｐ細胞分離システムを用いてＢ細胞を濃縮し、２００μｌ静脈内注射を可能にするように再懸濁した。寛容化および非寛容化レシピエント群は、高細胞濃度１０×１０⁶または低細胞濃度５×１０⁶のいずれかを静脈内注射を介して受けた。対照群にはｒｈＧＡＡのみまたはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサート（３日連続ＭＴＸ注射の単一サイクル）を与えた。すべての群は、毎週のｒｈＧＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射を受け、１６週間、隔週でＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ血清分離チューブに後眼窩採血された。血清を取り出しＥＬＩＳＡでの使用まで−２０℃未満で保存した。抗ｒｈＧＡＡ抗体力価をＥＬＩＳＡを用いて決定し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２で読み取り、力価値を外挿するためにＳｏｆｔｍａｘを用いて算出した。対照および力価情報を含む生データＳｏｆｔｍａｘファイルおよびＥＸＣＥＬ集計表をネットワークサーバーに
保存した。すべてのグラフおよび統計はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて作成した。

〔実施例１〕
抗薬物抗体は抗体治療薬に応答して産生される
ポリクローナル抗体ｍＡＴＧは、抗原提示細胞を含む種々の免疫細胞型に結合した。本発明者らのデータは、ｍＡＴＧの１回コース（３日間隔で与える２５ｍｇ／ｋｇの２回投与、腹腔内投与）がマウスで１００，０００（図１Ａ）もの高い抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価を生じうることを示した。連続する毎月注射（５ｍｇ／ｋｇ、４週間ごと）として与えられる場合、抗ｍＡＴＧ力価はさらに増大し、５回の毎月注射後に最大５×１０⁶の力価で
あった（図１Ｂ）。１回コースおよび毎月注射の両方についてウサギＩｇＧ（ｒｂＩｇＧ）を対照として用いた。

アレムツズマブは、マウスＣＤ５２と交差反応しないことから、アレムツズマブでの前臨床研究は、導入遺伝子発現パターンがヒトにおけるＣＤ５２発現と類似しているｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスで行われなければならなかった。ｍＡＴＧと同様に、アレムツズマブの静脈内投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）は顕著なＡＤＡ応答をｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスで誘発した。これらの応答は、最初の４回処置を通じて増大し、次いでアレムツズマブの５回目投与後にｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスがもはや抗アレムツズマブ抗体を生成しないように下降した（図２）。この非応答性は自然寛容が生じたことを示唆した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ、９３（６）：２０８１〜８頁（１９９９））。

データは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのｍＡＴＧに対するＡＤＡ力価およびｈｕＣＤ５２
Ｔｇ ＣＤ１マウスでのアレムツズマブに対するＡＤＡ力価が高かったこと（＞１００，０００）を示した。この高レベルの免疫原性はｍＡＴＧおよびアレムツズマブが抗原提示細胞に結合する能力に起因する可能性があり、したがってそれらに対する免疫応答を誘導するための抗原処理および提示を増強していた。

〔実施例２〕
メトトレキサートは単一サイクルの投与で抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答を制御する
Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）処置後に上昇した抗体力価が報告されており、血清病、急性腎不全および心臓血管反応の症例報告がＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）で処置した患者について記載された（Ｂｏｏｔｈｐｕｒら、上記；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ、１３（５）：６４７〜５０頁（２００７）；Ｂｕｓａｎｉら、Ｍｉｎｅｒｖａ Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ、７２（４）：２４３〜８頁（２００６）；Ｔａｎｒｉｏｖｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８０（２）：２７９〜８１頁（２００５）；Ｂｕｃｈｌｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１７（６）：５３９〜４５頁（２００３））。メトトレキサートが抗ｍＡＴＧ応答を低減できるか、したがってこれらの安全性の懸念を軽減できるかを決定するために、メトトレキサート単一サイクルとしてのみ与える３日間レジメンをマウスでの抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答を制御する手段として評価した。これは、ＥＲＴのコンテクストにおいて与えられた少なくとも３サイクルと対立するものとして、メトトレキサート単一サイクルのみがｍＡＴＧと共に投与された以前公表されたレジメンとは区別された。２回のｍＡＴＧ投与（２５ｍｇ／ｋｇ、３日間隔）の最初に開始して５ｍｇ／ｋｇ、６日連続で腹腔内に投与されたメトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ＃４５４１２５）は、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答を処置後少なくとも８週間にわたって９５％（効果曲線下面積を比較して）抑制できた（図３）。

次にｍＡＴＧ ５ｍｇ／ｋｇ／注射での５回の毎月注射後のメトトレキサートの抗ｍＡＴＧ力価への効果を評価した。リンパ球復活がｍＡＴＧ処置の１カ月後にほぼ完全である
ことから（Ｒｕｚｅｋ、上記）、ｍＡＴＧ処置の毎月注射を実施した。次いで抗薬物抗体応答を毎月処置の２０週間にわたって毎週定量した。この期間中、ｍＡＴＧによるＣＤ４＋Ｔ細胞除去にもかかわらず、抗体力価は５００万にも達した（図１Ｂ）。興味深いことに、非特異的ウサギＩｇＧをｍＡＴＧと同じ用量レベルおよび計画で受けた動物は、低い抗ウサギＩｇＧ応答を示した（図１Ｂ）。ｍＡＴＧの増強された免疫原性に関する一つの可能性は、濾胞性樹状細胞（補体存在下でＢ細胞応答を有意に増強できる）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのｍＡＴＧの特異的結合である可能性があった。メトトレキサートの２つの処置レジメンも評価した。酵素補充治療（ＥＲＴ）での以前の研究では、酸性アルファ−グルコシダーゼの最初の３回投与中に与えられたメトトレキサート３サイクルが少なくとも８カ月間にわたる毎週のＥＲＴ投与の間、抗体力価の低減の維持を提供した（Ｊｏｓｅｐｈら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２（１）：１３８〜４６頁（２００８））。メトトレキサートの同様のコースをｍＡＴＧのコンテクスト（メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇがｍＡＴＧ投与の１５分間以内ならびに毎月のｍＡＴＧ処置の最初の３回それぞれの２４および４８時間後に与えられる）において評価した。このレジメンは、抗ｍＡＴＧ抗体応答を力価およそ４００万から力価８１６，０００に低下させ、効果曲線下面積を比較して７９％の低減を得るのに成功した（図４Ａ）。

追加的に、毎月ｍＡＴＧ処置の最初の５回だけ与えられたメトトレキサート１回コースの抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答への効果を評価し、３サイクルレジメンと直接比較した。驚くべきことに、この単一サイクルレジメンは、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価を３サイクルレジメンよりもさらに、力価およそ５０，０００まで低減した（図４Ｂ）。効果曲線下面積を比較して、単一サイクルレジメンは、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価を９８％低減した一方で、３サイクルレジメンは力価を６９％低減した（図４Ｃ）。３サイクルに対して単一サイクルレジメンでの増大した効果は、恐らく抗体力価制御を介在している細胞を殺すことにより、増加したメトトレキサート曝露がその寛容効果を事実上拮抗した可能性があることを示唆した。

〔実施例３〕
メトトレキサートは免疫寛容の活性機構を誘導する
上に示したとおり、メトトレキサートの非常に短期のコースは、複数ラウンドの抗原負荷にわたって抗体応答を有意に制御できた。このコンテクストにおいて短期のサイクルは、検査の数カ月間にわたって（抗体力価およびサイトカインレベルの両方に）持続的な効果を作り出したメトトレキサート単一サイクルであった。この長期間の抗体応答制御は、メトトレキサートが免疫寛容を誘導すること成功したことを示唆した。これまでのところ、メトトレキサートを、ｍＡＴＧの５カ月連続投与のコンテクストにおいて評価した。免疫寛容機構が活性化されたかどうかをさらに評価するために、５回の毎月ｍＡＴＧ注射を当初に受けた動物の処置を８週間保留した。この休息期間後に動物にｍＡＴＧの最終注射を与えた。免疫寛容の機構が用いられた場合、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価は６回目のｍＡＴＧ処置後に有意には増大しないはずであった。

本発明者らのデータは、予想されたとおり、メトトレキサートを投与されなかった動物は抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価の増大を経験したことを示した（図５）。対照的にｍＡＴＧの最初の注射と共にメトトレキサート単一サイクルだけを受けた動物は、有意により高い抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価を生じなかった（図５）。同様の傾向がメトトレキサート３サイクルで処置した動物において（効果はそれほど劇的ではなかったが）観察された（図５）。効果曲線下面積を比較した場合、メトトレキサート１回コースは力価を９９％低減した一方で３サイクルレジメンは力価を８５％低減した。これらのデータは、メトトレキサートが想起応答制御を保持できることを示し、マウスがこの抗原に対する寛容を生じたことを示唆した。

メトトレキサート処置動物は連続するｍＡＴＧ処置で増大した測定可能な力価を生じたが、全体としてメトトレキサート処置動物での力価レベルはｍＡＴＧ単独で処置した動物において観察されたものよりも一貫して１００分の１であった（図６）。抗体力価のより低いレベルは、安全性リスクおよび有効性効果に関する可能性を有意に低減するはずであった。理論に束縛されることを意図しないが、これらのデータは、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答を有意に低減できる制御の活性機構が誘導され、メトトレキサート処置後に長く保持されることを示唆した。

〔実施例４〕
メトトレキサート単一サイクルは、抗アレムツズマブ応答を有意に制御できる
再発寛解型多発性硬化症では、アレムツズマブが年サイクルで投与され、患者はＡＤＡを生じる場合があった（Ｃｏｌｅｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５９（１７）：１７８６〜８０１頁（２００８））。免疫原性および薬物動態検査は複数の第ＩＩＩ相研究で進行中であることから、抗アレムツズマブ抗体が患者のサブセットで曝露、有効性および／または安全性に強い影響を与えるかどうかは不明確であった。したがって本発明者らは、メトトレキサート単一サイクルがアレムツズマブの５回の毎月１回注射サイクル後にＡＤＡ力価を制御できるかどうかを評価した。ＨｕＣＤ５２ Ｔｇマウスにアレムツズマブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内へ毎月、５カ月連続で与えた。メトトレキサートを０．５、１または５ｍｇ／ｋｇでアレムツズマブの毎月投与の最初の１５分前ならびに投与の２４および４８時間後に与えた。メトトレキサート１ｍｇ／ｋｇは、抗アレムツズマブ応答を８８％低減したことから、いくらかの利益を提供した（図７Ａ）。メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇは抗アレムツズマブＩｇＧ応答を９９％低減するのに成功した（図７Ａ）。メトトレキサートは、自然寛容には効果を有さないと考えられた。

第２の研究は、上の発見を確認した。上記のとおり、ｈｕＣＤ５２トランスジェニックマウスをアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇの毎月投与５回で処置した。また、マウスを、アレムツズマブの最初の投与と関連してメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日投与３回で処置したまたはしなかった（図７Ｂ）。血清試料を抗アレムツズマブ力価を評価し、寛容を確認するために研究を通じて収集した。力価データは、５回目の毎月投与の２４時間後に得た。データはメトトレキサートが抗アレムツズマブ抗体力価を低減することを実証した（図７Ｃ）。

〔実施例５〕
メトトレキサートは、臨床的に関連するアレムツズマブ投与レジメンのコンテクストにおいて抗アレムツズマブ抗体応答を制御できる
アレムツズマブの臨床的に関連する投与スキームのコンテクストにおいてメトトレキサートがＡＤＡを制御するのに成功できるかどうかをｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスで評価するために一連の実験を実施した。臨床では、アレムツズマブは１２ｍｇ／日の毎日処置５回の初回サイクルとして投与された。患者での初回処置サイクルの１２カ月後、アレムツズマブ１２ｍｇ毎日投与３回の追加的サイクルを投与した。２回目処置サイクルの時点で、循環ＣＤ１９⁺Ｂ細胞のレベルはベースライン値に回復した；しかし、循環ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔ細胞のレベルは完全には復活しなかった（Ｃｏｌｅ
ｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５９（１７）：１７８６〜８０１頁（２００８））。

最初に、アレムツズマブ毎日処置５回後に循環ＴおよびＢ細胞サブセットの除去および復活の動態をｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスで調査した。アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇ（ヒト投与量１２ｍｇ／ｋｇに相当）、５日連続で静脈内注射を介して処置したｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスの末梢血では、総ＣＤ３⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔ細胞は、処置後４週で処置前のレベルには回復しなかったが、ＣＤ１９⁺Ｂ
細胞の数は対照レベルに戻った（図８Ａ〜Ｄ）。

再処置時に患者によって経験される細胞環境を刺激するために、アレムツズマブを第単一サイクルの４から５週間後にｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスに再投与した。アレムツズマブの初回コースが５日サイクルであることから、メトトレキサートは各日のアレムツズマブ処置の１５分前に、およびその後２日間投与した。このレジメンで与えられたメトトレキサートの最大累積サイクル用量は、１４ｍｇ／ｋｇ（２ｍｇ／ｋｇ／日）であり、これはメトトレキサートが５ｍｇ／ｋｇ／日の３日間コースとして与えられる場合の累積用量１５ｍｇ／ｋｇに非常に近かった。本発明者らは、メトトレキサートの２、１および０．５ｍｇ／ｋｇ／日投与の、アレムツズマブ処置３サイクルにわたる抗アレムツズマブ抗体への効果を評価した。１ｍｇ／ｋｇでは、メトトレキサートは検査したマウス８匹のうちの７匹で力価を制御すると考えられ、全体的として力価を７９％低減した（図９Ｂ）。２ｍｇ／ｋｇでは、メトトレキサートは効果曲線下面積を比較した場合にＡＤＡを９８％低減するのに成功した（図９Ａ）。

〔実施例６〕
メトトレキサートはｍＡＴＧの薬物動態および薬力学を改善できる
ＡＤＡは、タンパク質治療薬の薬物動態および薬力学を妨害する場合があった。本発明者らは、抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ ＡＤＡ応答がｍＡＴＧ薬物動態を妨害するかどうかを評価した。マウスをｍＡＴＧ単独またはメトトレキサート単一サイクルを伴うｍＡＴＧのいずれかの５カ月間毎月注射で処置した。メトトレキサートは５ｍｇ／ｋｇの毎日投与３回で投与した。循環ｍＡＴＧのレベルをアッセイするために１カ月目、３カ月目および５カ月目の後の種々の時期に血液をサンプリングした（図１０）。

１カ月目では、循環ｍＡＴＧのレベルは両処置群において同様であったが、３および５カ月目ではメトトレキサート処置群だけが測定可能な循環ｍＡＴＧのレベルを有した。メトトレキサート投与なしで、３回目および５回目のｍＡＴＧ投与後に測定したｍＡＴＧのレベルは、１回目投与後に測定したものよりも有意に低かった（図１０）。以前の研究は、メトトレキサートが抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ応答を有意に低減することを示した。したがってｍＡＴＧに対する抗体がｍＡＴＧ曝露および薬物動態を妨害すると考えられた。

ｍＡＴＧに対する抗体が繰り返し投与後に循環ｍＡＴＧのレベルを有意に低減すると考えられることから、再投与された場合、ｍＡＴＧの薬力学が同様に負の影響を受けることが予想できた。血液、脾臓およびリンパ節中のリンパ球除去を（力価が最高であった）５回目の毎月ｍＡＴＧ処置後に評価した。上に記載のとおりメトトレキサートで処置した動物には、処置の単一サイクルのみを与えた。

循環ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞のレベルは、ｍＡＴＧで処置したがメトトレキサートではしなかった動物では５回目のｍＡＴＧ処置後に未変化であった。しかしｍＡＴＧおよびメトトレキサート単一サイクルで処置した動物では、循環ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞は、有意に除去された（図１１）。この効果は、脾臓およびリンパ節においても同様に観察された。メトトレキサート処置は、脾臓および血液中の制御性Ｔ細胞の割合を増加させるｍＡＴＧの能力を増強した（図１２Ａ〜Ｂ）。同様の効果が血液およびリンパ節で観察された。ｍＡＴＧおよびＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）処置後に増強された制御性Ｔ細胞の存在は、この治療薬の有効性に寄与すると想定された（Ｒｕｚｅｋら、Ｂｌｏｏｄ、１１１（３）：１７２６〜３４頁（２００８））。ｍＡＴＧの連続するコース後のこの効果の保持を補助するメトトレキサートの能力は、抗体抗ウサギＩｇＧ力価を有意に低減するという潜在的に追加される利益であった。

これまでのところ、薬物動態および有効性の研究は、抗ｍＡＴＧ抗体がｍＡＴＧの曝露
および有効性を妨害することを示唆した。抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価とｍＡＴＧ曝露との直接比較は、エンドポイント力価が１０，０００を超える場合に循環ｍＡＴＧのレベルが有意に低減されたことを明らかにした（図１３ａ）。さらに抗ｍＡＴＧ ＩｇＧ力価が１００，０００を超える場合、ｍＡＴＧ介在細胞除去は阻害された（図１３ｂおよび１３ｃ）。力価と細胞除去の間のＲ²相関は、＞０．７であった。

〔実施例７〕
メトトレキサートは、アレムツズマブの薬力学を改善できる
メトトレキサートは、ｍＡＴＧの薬力学を増強するだけでなく、抗アレムツズマブ応答が除去活性の一部を中和すると考えられる場合に、循環ＴおよびＢ細胞のアレムツズマブ介在除去も復元させた。本実施例において記載される研究では、アレムツズマブの毎月静脈内注射５回をメトトレキサートを伴ってまたは伴わずにｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスに与えた。メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇを６カ月研究の最初の３日間毎日投与した。両処置群の動物からアレムツズマブの５回目投与の２日前および５回目投与の１日後に血液を採取した。細胞集団をフローサイトメトリーで実施例６に記載のとおり評価した。

本発明者らのデータは、循環Ｔ細胞の絶対数が処置の前後で同様であると考えられたことからアレムツズマブの５回目の毎月投与がもはやＴ細胞を除去しないと考えられることを示した（図１４（各時点は異なるセットの動物を表す））。対照的に、メトトレキサートは、Ｔ細胞を除去するアレムツズマブの能力を復元させたと考えられた（Ｐ＝０．０１２）。アレムツズマブ単独で処置した動物での循環Ｔ細胞の絶対数を、アレムツズマブと、アレムツズマブ投与の２日前または１日後のいずれかでのメトトレキサートとの両方で処置した動物と比較すると、循環Ｔ細胞の数はメトトレキサート処置動物において有意により低かった（Ｐ＝０．０３４および０．０２；図１４）。同様にメトトレキサート処置は、アレムツズマブによるＢ細胞の除去を増強すると考えられ（それぞれＰ＝１．２×１０^-5、Ｐ＝０．０２）、循環Ｂ細胞の数はメトトレキサート処置動物で処置１日後にさらに減少した（図１４）。

〔実施例８〕
メトトレキサート単一サイクルは、抗ｒｈＧＡＡ抗体応答を有意に制御できる
本発明者らは、ｒｈＧＡＡ酵素補充治療におけるメトトレキサートの効果も研究した。この研究では、動物にｒｈＧＡＡを１２週間連続で毎週注射し、次いで４週間休息させ、次いで１６週目にｒｈＧＡＡで再負荷した。動物に１週目にメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇの３日連続投与の単一サイクルまたは１、２および３週目それぞれに単一サイクル（合計３サイクル）も与えた。ｒｈＧＡＡ特異的ＩｇＧ力価を０（すべての処置前）、６、８、１２、１６、１８および２０週目に動物で測定した。本発明者らのデータは、メトトレキサート単一サイクルが抗ｒｈＧＡＡ応答を３サイクルレジメンと同様に少なくとも２０週間にわたって制御したことを示した（図１５）。

研究は、抗ｒｈＧＡＡ力価を生じることにおけるＴ細胞の役割を評価するためにＴ細胞欠損Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいても実施した。これらの実験で本発明者らはｒｈＧＡＡに対するＡＤＤがこれらのＴ細胞欠損マウスではほとんどから全く生じなかったことを繰り返し観察した（図３７Ａ〜Ｂ）。これらのデータは、Ｔ細胞が抗ｒｈＧＡＡ力価に寄与するという意見を裏付けた。これによりメトトレキサートがｒｈＧＡＡに対するＡＤＡを制御できることから、ｒｈＧＡＡへのＴ細胞応答にも影響を与えると考えられた。

〔実施例９〕
メトトレキサートは心臓同種移植のｍＡＴＧ介在生着を増強する
正常マウスにおいてメトトレキサートがｍＡＴＧの有効性を増強できるかどうかを評価することに加えて、本発明者らは移植設定においてｍＡＴＧ機能がメトトレキサートによ
って増大されうるかどうかを調査した。Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）が臨床的に移植生着を延長するための誘導治療として用いられることから、本発明者らはマウス同種心臓移植モデルにおいてメトトレキサートの追加がｍＡＴＧの有効性を増大できるかどうかを評価した。ｍＡＴＧ ２０ｍｇ／ｋｇを０および４日目に投与し、メトトレキサート２ｍｇ／ｋｇを０〜６日目に処置の単一サイクルとして投与した。

追加的に本発明者らは、同じレジメンでまたは１２日連続の延長したレジメンで与えられるメトトレキサートの４分の１の用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）を調査した。マウス群は、無処置（生理食塩水対照）、ｍＡＴＧ単独または、ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せレジメンのいずれかを受けた。正常マウスでの研究と同様に、ｍＡＴＧと同時投与されたメトトレキサートは、用いられたレジメンにかかわらずｍＡＴＧに対する抗薬物抗体力価を低減した（図１６Ａおよび表１）。さらに抗体力価の低減と同時に発生したのは、この移植設定におけるｍＡＴＧ曝露の観察された増大であった（図１６）。移植された組織に対する強く同時発生的な免疫応答の状態下に適したアジュバント効果を与えると、抗薬物抗体力価は、正常マウス設定においてよりもさらに速く増大し、最初のｍＡＴＧ投与の７日間以内に検出不能に近いｍＡＴＧレベルをもたらした（図１６Ｂ）。対照的に移植７日後までに抗ウサギＩｇＧ抗体力価はメトトレキサートで処置したマウスにおいて有意により低く、循環ｍＡＴＧレベルはこれらのマウスにおいて有意により高かった。これは、進行中の炎症応答状態下では、抗薬物抗体応答が加速される場合があり、薬力学および有効性に恐らくさらにより大きな影響を有することを強調した。重要なことに、これらの状態下でさえメトトレキサートは強い阻害効果をｍＡＴＧ抗薬物抗体に有し、ｍＡＴＧ曝露を増強した。しかし、ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置では２１日目まで循環ｍＡＴＧレベルがいまだ低く検出不能であることから、追加的寛容機構が＞１００日間の移植片生着をもたらしていると考えられた。これらの結果は、同種移植片の生着についてのｍＡＴＧとメトトレキサート処置との間の顕著な相乗作用を実証し、正常マウスにおいて観察されたのと同様のレベルのｍＡＴＧ抗薬物抗体の低減およびｍＡＴＧ曝露の増強を示した。

追加的データは、ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置が抗同種移植片応答を低減することに加えて心臓同種移植片の生着を有意に延長したことを確認した（図１７および１８）。実際に両方のｍＡＴＧまたはメトトレキサート処置単独はそれぞれ１５および２０日間の平均生着延長のわずかな利益を提供した一方で、ｍＡＴＧと評価されたいずれかのメトトレキサートレジメンとの同時投与は、ほとんどのマウスが最大１００日間を超
えてそれらの移植片を保有して心臓移植片生着における劇的な利益を実証した（図１７）。心臓移植片生着がｍＡＴＧおよびメトトレキサートでの初期の短期の誘導処置後に長く継続したことから、このレジメンは免疫抑制性よりはむしろ寛容原性であると考えられた。他の免疫抑制剤（例えばミコフェノール酸モフェチル、デキサメタゾン、ラパマイシンおよびシクロホスファミド）がｍＡＴＧと同時投与された場合に移植片生着を有意に延長できなかったことから、効果はｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せに特有であった。注目すべきことに、メトトレキサート処置単独も抗同種移植片抗体を有意に低減でき、抗体応答制御へのメトトレキサートの効果を一般にさらに立証した（図１８）。この筋書きではメトトレキサートは、心臓同種移植片の複数の抗原に対する抗体応答を同時に制御できると考えられた。さらなる低減がｍＡＴＧをメトトレキサート処置と組み合わせることによって誘導された（図１８Ｃ）。

〔実施例１０〕
メトトレキサート誘導寛容の機構はメトトレキサートの現在公知であり、認められた機能とは異なる
上の実施例で記載されたメトトレキサートの投与レジメンは、以前記載されたものとは異なる機構を引き起こすと考えられた。メトトレキサートは、増殖細胞の死を誘導することによってその抑制効果を介在すると考えられている葉酸アンタゴニストであった。上に提示したｍＡＴＧデータは、メトトレキサート処置動物で抗体応答は誘導されるが、各連続するｍＡＴＧ処置では有意に低下したままであることを実証した。これらのデータは、Ｂ細胞応答が積極的に管理されたことを示唆した。理論に束縛されることを意図せず、本発明者らは、メトトレキサートがこれらの応答をそれらが生じた際に制御する制御性細胞集団（複数可）を誘導できるとの仮説を立てた。本発明者らは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物での種々の脾臓ＢおよびＴ細胞サブセットへのメトトレキサート処置の効果をＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独で処置した動物と比較して調査した。本発明者らは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置７および８日後（メトトレキサート処置４および５日後；図１９）にＢ１０制御性Ｂ細胞集団における有意な増加を観察した。

追加的に、多数の活性化Ｂ細胞サブセットがメトトレキサート処置後に有意に増加した（図２０）。これらの集団は、活性化辺縁帯Ｂ細胞、活性化濾胞性Ｂ細胞ならびに活性化移行性２および３Ｂ細胞を含んだ。細胞集団は以下のとおり定義された：Ｂ２／濾胞性Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ２１^intＣＤ２３^hi；移行性２Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ９３⁺ＣＤ２３⁺ＩｇＭ^hi；および移行性３Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ９３⁺ＣＤ２３⁺ＩｇＭ^lo；辺縁帯Ｂ細胞：ＣＤ１９⁺ＣＤ２１^hiＣＤ２３^lo。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）２サイクルおよびメ
トトレキサートを与えられた（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は１および８日目に投与され、メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇは１〜３および８〜１０日目に与えられた）動物における脾臓細胞集団の毎日の評価は、これらの活性化Ｂ細胞集団が増加したままであることを実証した（図２１）。この結果は、メトトレキサート処置後に予想された応答が活性化、増殖細胞の死であったことから驚くべきことであった。対照的に、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞集団はほとんど未変化のままであった（図２２）。ヘルパーＴ細胞はＣＤ４＋と定義され、細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８＋と定義され、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＦｏｘＰ３＋と定義された。これらの発見は、増加したＢ細胞集団がメトトレキサート誘導免疫寛容の介在を補助できることを示唆した。

〔実施例１１〕
メトトレキサートはｍＡＴＧとの組合せで選択されたＢ細胞集団を増加させる
上の実施例では各ｍＡＴＧ処置後に、ｍＡＴＧ単独で処置したマウスならびにｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置したマウスの両方においてＡＤＡ力価は増大し、両セットの動物が抗体応答に寄与できるＢ細胞を含有したことを示唆した（図６）。それが真実で
あるとすると、少なくとも２つの仮説を描くことができた。最初の仮説は、メトトレキサートがＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）に応答できる大部分のＢ細胞を殺した可能性があり、残った少数がこのわずかな応答の原因であるとすることであった。これは可能ではあるが、複数の実験からのフローサイトメトリーデータは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサート処置後にＢ細胞集団の減少を示していなかった。第２の仮説は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）に応答できるＢ細胞集団がメトトレキサートのこの短期のコースでは殺されずに残り、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）への各曝露後に制御性細胞によって制御されるとすることであった。これまでのところ、表現型データは、メトトレキサートおよびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）での処置後のＢ細胞サブセットの増強を記載した。これらのＢ細胞の表現型は、動物研究においておよび寛容移植患者において記載された制御性Ｂ細胞サブセットに類似していると考えられた。したがって本発明者らは、この第２の仮説を異なる処置のコンテクストにおいて検討しようとした。

動物はｍＡＴＧで毎月、５カ月間処置され、メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇの単一サイクルを研究の最初の３日間、メトトレキサート５ｍｇ／ｋｇの３サイクルのいずれかを受けたまたはメトトレキサートを受けなかった（図２３）。３つの処置群での細胞集団における差異を次いで、５回目のｍＡＴＧ投与の１日前および５回目のｍＡＴＧ投与２日後での動物における集団を比較することによって評価した。

驚くべきことに、メトトレキサート単一サイクルでの処置の５カ月後、メトトレキサート単一サイクルおよびｍＡＴＧを受けたマウスとｍＡＴＧ単独またはメトトレキサート３サイクルを伴うｍＡＴＧのいずれかを受けたマウスとの間に差異を観察した。予想外に効果を実証した２つの細胞集団は、活性化濾胞性Ｂ細胞および活性化移行性３Ｂ細胞（それぞれ図２４Ａ〜Ｂ）であった。ｍＡＴＧ単独またはメトトレキサート３サイクルとの組合せのいずれかで処置したマウスでは、これらの細胞集団の絶対細胞数において減少が観察された。しかしメトトレキサート単一サイクルのみを受けたマウスでは、これらの集団において統計的に有意な減少は観察されず、メトトレキサートのこの投与レジメンがこれらの集団のいくらかの増殖を誘導したことを示唆した。興味深いことに、これら両方の細胞集団は、Ｍｙｏｚｙｍｅとの組合せでのメトトレキサート処置直後に増やされたことも示された（図２１）。同様のサブセットが寛容移植患者においても同定された。メトトレキサート単一サイクル処置が、抗原曝露で活性化および抑制性になるこれらのＢ細胞サブセットを誘導できる可能性があった。

〔実施例１２〕
メトトレキサートは、アレムツズマブとの組合せで選択されたＢ細胞集団を増加させる
実施例４に記載のとおり、ｈｕＣＤ５２トランスジェニックマウスをアレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇの毎月投与で５カ月間を１回、アレムツズマブの初回投与に関連するメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日投与３回を伴ってまたは伴わずに処置した。細胞集団をアレムツズマブの５回目投与の２日前ならびに１、７および／または２８日後のマウスの血液および脾臓においてフローサイトメトリーによって評価した。

血液ではアレムツズマブの薬力学的効果は、メトトレキサート処置動物においてアレムツズマブの５回目投与２４時間後に増強された。統計的に有意な細胞除去がＴ細胞およびＢ細胞サブセットの両方で５回目投与の１日後に観察され、抗アレムツズマブ力価がこれらの動物で低く、アレムツズマブ介在除去を妨害しないと考えられることを示す以前のデータと一致した。対照的にアレムツズマブ単独で処置したマウスは、アレムツズマブ薬力学を妨害するアレムツズマブ中和抗体をより多く有する可能性があった。図２５Ａに示すとおり、アレムツズマブ処置マウスではＴ細胞サブセットの有意な除去はなかったが、アレムツズマブおよびメトトレキサートで処置したマウスは、アレムツズマブ投与１日後に総Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および制御性Ｔ細胞における有意なアレムツズマブ介在除去を
示した。同様の発見が循環Ｂ細胞サブセットで観察されたが（図２５Ｂ）、細胞数減少に向かう傾向は、アレムツズマブ単独で処置した動物でも観察された。循環Ｔ細胞集団と同様に、脾臓Ｔ細胞集団はメトトレキサート処置動物において５回目のアレムツズマブ処置１日後に有意に除去された（図２６Ａ〜Ｂ）。

アレムツズマブおよびメトトレキサートで処置したマウスでのＴ細胞除去とは対照的に、濾胞性Ｂ細胞以外の分析された各脾臓Ｂ細胞集団は、有意に除去されなかった（図２７）。この評価は、制御性Ｂ細胞集団、Ｂ１０Ｂ細胞を含んだ。理論に束縛されることを意図せず、本発明者らはメトトレキサートがこれらのＢ細胞集団の一部またはすべてを（それらのアレムツズマブ介在除去とは反対に）増やすことができるとの仮説を立てた。免疫細胞が血液中では分化しないことから、この増殖は血液の高速の流動性環境では生じないと予想された。代わりに免疫応答は、（細胞／細胞相互作用およびサイトカイン／ケモカイン開始応答が組織の多様な微細環境において生じうる）脾臓および他の末梢リンパ組織において生じた。これらは、血液および脾臓において観察されたＢ細胞のアレムツズマブ介在除去の差次的効果を説明できた。これらのデータは、（脾臓Ｂ細胞がｍＡＴＧと組み合わされたメトトレキサート単一サイクルで処置したマウスで増やされると考えられた）ｍＡＴＧで作成されたデータに類似していた（図２４Ａ〜Ｂ）。実際に本明細書に記載のすべての研究では、メトトレキサート処置後の増殖が活性化細胞の特定の集団を評価した際に観察された。しかし、活性化および非活性化細胞の両方を含む細胞集団（総濾胞性Ｂ細胞など）の総数を評価する場合、メトトレキサート処置動物で有意な増殖は観察されなかった。

アレムツズマブ処置２４時間後の脾臓細胞集団とは対照的に、アレムツズマブの単一用量（メトトレキサートを伴わない）での処置３日後、脾臓細胞サブセットは有意に除去された（図２８Ａ）。Ｂ細胞復活が３日の印までに始まりうることから、アレムツズマブ処置動物においてＢ細胞除去がアレムツズマブ処置３日後においてよりも２４時間で、より大きい場合がある可能性があった。これは、末梢血中のこれらの集団を評価するいくつかの研究において実証された。除去は、末梢血において投与後３時間程度の早期で観察された。処置３日後までに、循環Ｂ細胞プールは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置した対照マウスにおいてよりもアレムツズマブ処置マウスにおいていまだに有意に低かったが、除去パーセントは２４時間のものほど高くなかった。２４時間での除去パーセントは９２％であり、３日での除去は３６％であった（図２８Ｂ）。Ｂ細胞再構成は１回投与後に急速に生じると考えられた。

結論として、動物がメトトレキサートを受けた５カ月後および抗原曝露の直後に、メトトレキサートが、寛容誘導の介在を補助する可能性があるＢ細胞集団を増やした可能性があると考えられた。増やされたと考えられる集団は、メトトレキサート処置の直後に増加したものに類似していた（図２１）。これらを基に、メトトレキサートが、免疫応答が抗原曝露時に（メトトレキサートでの処置のずっと後でさえも）積極的に制御されるようにする環境を誘導できることが示唆された。

〔実施例１３〕
サイトカインレベルへのメトトレキサートの効果
サイトカインは、Ｂ細胞応答において２つの役割を演じた。例えばＢ細胞活性化サイトカインＩＬ−６およびＢＡＦＦは、Ｂ細胞分化のためにも必要であった。メトトレキサートが、Ｂ細胞集団を増加させると考えられることから、これらのサイトカインが増加することが予想できた。しかしＩＬ−６は炎症促進性でもあり、したがって上昇したレベルはメトトレキサート誘導効果を妨害する可能性があった。ＩＬ−６と同様に、ＩＬ−１０は、血漿細胞へのＢ細胞の分化および免疫抑制にも関与した。

ＢＡＦＦデータは、アレムツズマブの５回目投与の２４時間後に採取した血清試料から作成した（図２９Ａ）。これは、上に提示したこの研究由来の細胞データの続きであった。この時点でＢＡＦＦレベルに差異は観察されなかった（図２９Ｂ）。

サイトカインレベルをアレムツズマブ第２サイクルの１週間後に評価した（図２９Ｂ）。一般にアレムツズマブ第２サイクルの１週間後、サイトカインレベルは低いと考えられた。この時点で統計的に有意な増加がメトトレキサート２ｍｇ／ｋｇで処置した動物のＴＮＦ−アルファレベルにおいて観察された。この増加は、メトトレキサート誘導寛容に関するまたは炎症応答の徴候である変化を反映する可能性があった。他のサイトカインにおいて観察された傾向（ＩＬ−６の明らかな増加およびＩＬ−７のわずかな減少可能性など）も注目された（図３０）。

制御性Ｂ細胞は、ＩＬ−１０分泌と関連していた。ＩＬ−１０分泌制御性Ｂ細胞がメトトレキサート誘導寛容において役割を演じるかどうかを評価する１つの様式は、メトトレキサートがＩＬ−１０欠損動物において抗体応答を制御できるかどうかを評価することであった。この種の評価は、上に述べたとおり、ＩＬ−１０が血漿細胞分化のために必要であり、したがって抗体応答はこれらの動物においてより低い可能性があることから困難である可能性があった。この注意を念頭に置いて本発明者らは、ＩＬ−１０がメトトレキサート誘導寛容において役割を演じる可能性があることを示唆する興味深い傾向を観察した。

この研究では、動物は静脈内Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）２０ｍｇ／ｋｇを９週間毎週受けた。メトトレキサート３サイクルを、５ｍｇ／ｋｇ／日でＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の最初の３回の毎週処置の０、２４および４８時間後に投与した。抗Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）力価を４、６および９週目に評価した（図３１）。ｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ／メトトレキサート処置ＩＬ−１０ノックアウトマウスでの平均力価値を比較すると、わずかな傾向は９週目に観察されたが、力価における有意な低下は観察されなかった。予想されたとおり、抗体力価は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物のようにはＩＬ−１０ノックアウト動物では高くなかった。ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置したＣ５７ＢＬ／６野生型動物における抗ｒｈＧＡＡ応答は、４、６および９週で低下していた。対照的に４および６週目での抗ｒｈＧＡＡ力価は、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートで処置したＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて低下していなかった。９週目で、ＩＬ−１０欠損
マウスにおける寛容の遅延性誘導を示す可能性があるわずかな低下があった。これは、ＩＬ−１０が制御性Ｂ細胞から分泌される唯一の抑制性サイトカインではないという報告と一致した（Ｓａｇｏｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；１２０（６）：１８４８〜１８６１頁（２０１０））。ＴＧＦ−ベータも制御性Ｂ細胞応答と関連していた。そのような遅延がある場合、ＴＧＦ−ベータなどの他のサイトカインもメトトレキサート寛容効果の介在を補助できる可能性があった。これまでのところ、これらのデータは、ＩＬ−１０がメトトレキサート誘導寛容において役割を演じる可能性があることを示唆した。

〔実施例１４〕
アレムツズマブ関連二次自己免疫の処置におけるメトトレキサートの役割
アレムツズマブ処置多発性硬化症患者は、二次自己免疫を発症する場合があった。アレムツズマブ処置後に発症する最も一般的な自己免疫障害は、甲状腺自己免疫に関するものであった。追加的に免疫性血小板減少性紫斑病およびグッドパスチャー症候群もアレムツズマブで処置した多発性硬化症患者において観察された。３種すべての自己免疫は、Ｂ細胞応答および自己抗体が疾患発症および病態に直接結び付くことからＢ細胞性であった。アレムツズマブ処置とこれらの二次疾患の発症との関連は、十分に理解されていなかった。

アレムツズマブ処置後、Ｔ細胞およびＢ細胞は除去された。これらの除去されたＴおよびＢ細胞の大部分は、中枢神経系で発現される抗原と相互作用する自己反応性細胞である可能性があった。結果として、アレムツズマブによるそれらのその後の除去は、このモノクローナル抗体治療の治療利益に寄与すると考えられた。自己免疫疾患に罹患している患者は、種々の自己免疫疾患に関連する複数の抗原に対する自己反応性（すなわち自己反応性Ｂ細胞および自己反応性抗体）を含むと記載されていた。環境的、生理学的および遺伝的要因はすべて、自己免疫疾患が続いて生じやすいかどうかの決定に寄与し、どの自己免疫疾患が患者に存在することになるかに影響する。自己免疫疾患の１種に罹患している患者が他も発症することは珍しくない。

アレムツズマブのコンテクストにおいて、１つの仮説は、多発性硬化症に関するものほど著明ではなかった固有の自己反応性が、アレムツズマブ処置後にリンパ球除去環境において拡大することが可能になることであった。自己免疫疾患を発症する人々は、多数の異なる抗原に対する自己反応性を、したがって他の自己免疫を発症する素因を典型的には有した（すなわち「固有の自己反応性」）。この考えを裏付けるのは、アレムツズマブがすべてのＢ細胞集団を等しくは除去しないことを示すｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスでのデータであった（図２７）。実際に、低親和性自己反応性Ｂ細胞、特に辺縁帯Ｂ細胞の構成を支持するＢ細胞レパートリーにおいて不均衡があると考えられた。重要なことに、辺縁帯Ｂ細胞が甲状腺自己免疫と関連していた（Ｓｅｇｕｎｄｏら、Ｔｈｙｒｏｉｄ、１１（６）：５２５〜５３０頁（２００１））。追加的に、多発性硬化症、ＥＡＥのマウスモデルにおいて自己免疫の抑制を補助することが示された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１８：３４２０〜３４３０頁（２００８））およびヒトにおいて存在することが示された（Ｉｗａｔａら、Ｂｌｏｏｄ、１１７：５３０〜５４１頁（２０１１））制御性Ｂ細胞サブセット、Ｂ１０Ｂ細胞は、辺縁帯Ｂ細胞よりも長期間除去された。アレムツズマブの第単一サイクル中のメトトレキサート処置の短いコースは、制御性Ｂ１０Ｂ細胞の提示の増加を補助し、アレムツズマブ処置後にＢ細胞レパートリーで辺縁帯Ｂ細胞がより均等に提示されるようにおよび／または辺縁帯Ｂ細胞を制御性辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ１ｄ＋辺縁帯細胞）に分化させるようにＢ細胞のバランス復元を補助できた。

脾臓Ｂ細胞集団をアレムツズマブのＢ細胞除去への効果を決定するために研究した（図
３２）。アレムツズマブ０．５ｍｇ／ｋｇをｈｕＣＤ５２ Ｔｇマウスに５日連続で静脈内投与した。具体的には、濾胞性Ｂ細胞集団（典型的には自己反応性ではない）、Ｂ１Ｂ細胞および辺縁帯Ｂ細胞（両方とも自己反応性である）、Ｂ１０Ｂ細胞（制御性である）ならびに移行性Ｂ細胞および辺縁帯Ｂ細胞（制御性Ｂ細胞に分化できると考えられている）を検討した。

濾胞性Ｂ１および制御性Ｂ細胞がアレムツズマブ処置後１および／または２週間で除去された一方で、辺縁帯Ｂ細胞および移行性１（Ｔ１）および移行性２（Ｔ２）Ｂ細胞はいずれの時点でも除去されなかった（図３２）。移行性３Ｂ細胞（Ｔ３）は、処置の１週間後に除去されただけであり、制御性Ｂ細胞の数は対照処置動物よりもアレムツズマブ処置マウスにおいて一般に低いと考えられたが、統計的差異は２および４週目では観察されなかった。

アレムツズマブでの処置のコンテクストにおけるメトトレキサートのＢ細胞集団への効果を検討するために、第２の研究を表３および図３３に示すとおり実施した。驚くべきことに、アレムツズマブを伴うメトトレキサートの同時処置は、アレムツズマブ単独で観察された除去よりもアレムツズマブ処置の直後での辺縁帯Ｂ細胞のより強い除去を可能にし（図３４）、それにより感染への適正な早期応答のために必要な、適切なレベルの自然発生低親和性自己反応性Ｂ細胞を有するバランスのとれた免疫環境を促進した。

アレムツズマブ単独で処置したマウス群は本研究に含まれ、メトトレキサートだけで処置したマウスがこの短いサイクルのレジメンで抗原刺激不在下での細胞効果（これは、メトトレキサート単独で処置した対照マウスにおいて観察された効果とは異なる可能性がある）を示すことを明らかにした（図３４）。本研究において作成されたデータ（脾臓Ｂ細胞集団がメトトレキサート処置の最終日の２日後に評価された）は、メトトレキサートが辺縁帯Ｂ細胞の除去を増強できることを示唆した。これは、アレムツズマブを伴って送達された場合にメトトレキサートが、自然発生Ｂ細胞サブセットが非自己反応性Ｂ細胞サブセットと適切なバランスにある細胞環境をもたらしうるとの仮説を裏付けた。

Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）を伴うメトトレキサート処置の直後での細胞集団の毎日の
評価に基づいて、本発明者らは、アレムツズマブのコンテクストにおいて、Ｂ１０Ｂ細胞集団および他の潜在的制御性Ｂ細胞集団がメトトレキサート処置の５〜６日後より早くではなくメトトレキサートによって増やされるとの仮説を立てた。本発明者らは、そのような集団がメトトレキサート処置後２日程度の早期では増やされたことを観察しておらず、このことはこの仮説と一致した。対照的にｍＡＴＧおよびアレムツズマブ処置のコンテクストにおいて見られるように、メトトレキサート処置後より長い期間において効果は異なると考えられた。それら両方の筋書きでメトトレキサート処置５カ月後、Ｂ細胞サブセットは、ｍＡＴＧおよびアレムツズマブ投与後１および２日でメトトレキサート処置マウスにおいて増やされたと考えられた（アレムツズマブデータに関して図３５を参照されたい）。興味深いことに、この時点で辺縁帯Ｂ細胞も増加していると考えられた（これは統計的に有意ではないが）。

メトトレキサートは、タンパク質治療および移植心臓組織抗原に対する寛容を誘導し、それによりＡＤＡおよび抗同種移植片抗体の産生および分泌に関するＢ細胞免疫応答を抑止した。したがって本発明者らは、メトトレキサートがアレムツズマブ処置後に細胞環境の制御を補助できるだけでなく、自己タンパク質への寛容を誘導でき、Ｂ細胞性自己免疫疾患の発症および病態に寄与する自己抗体の生成に関するＢ細胞免疫応答を軽減できるとの仮説を立てた。

この仮説を検討するために、動物に５カ月間毎月アレムツズマブを投与した。メトトレキサートを５ｍｇ／ｋｇで動物の一群に最初のアレムツズマブ処置後のみ３日連続で与えた。アレムツズマブ処置の５回目投与の２日前および１日後に動物を分析のために屠殺した。血清サイトカインレベルをアレムツズマブ処置の前後で評価した。驚くべきことに、これらの結果は、炎症促進性サイトカインＭＣＰ−１、ＩＬ−１３、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のレベルがメトトレキサートで処置した動物においてアレムツズマブの５回目投与の２４時間後、いずれかのメトトレキサートを投与された５カ月後に低下したことを示唆した（図３６）。これらのサイトカインは、Ｂ細胞応答および免疫細胞動員を促進するだけでなく、それらは、過敏症反応において役割を演じることもできた。これらのデータは、メトトレキサートが注入関連反応の阻止を補助できることを示唆した。

〔実施例１５〕
メトトレキサートは、制御性Ｂ細胞集団の特異的誘導を通じて免疫寛容を誘導する
本発明者らのデータは、メトトレキサートが、他者らによって示唆された（Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４：１３５〜１４２頁（２０１２）およびＬａｃａｎａら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｐａｒｔ Ｃ Ｓｅｍｉｎ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １６０Ｃ：３０〜３９頁（２０１２））増殖細胞を殺す予想された手段によってではなく、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３を発現する制御性Ｂ細胞集団の特異的誘導を通じて免疫寛容を誘導することを驚くべきことに示した。メトトレキサート単一サイクルによってＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）に対して寛容化されたマウス由来のＢ細胞は免疫寛容を未処理動物に移入すると考えられた。さらに、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの両方がメトトレキサート誘導免疫寛容のために必要であると考えられた。いくつかの細胞サブセットでは、メトトレキサートがＴＧＦ−ベータを誘導し、これが次にＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３を誘導するとも考えられた。この機構は新規かつ予想外であり、メトトレキサート３サイクル、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）（Ｂ細胞除去剤）および場合により静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）での同時処置を含む現在の臨床免疫寛容プロトコールの価値を問題にした（Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒら、上記）。この組合せ処置は十分であると考えられるが、本発明者らのデータは、１）メトトレキサート単一サイクルは、現在観察されたものよりもさらに低いＡＤＡ力価を生じる可能性があること、および２）過剰量のメトトレキサートおよびリツキシマブが投与された場合、免疫寛容は保持されない可能性があることを示唆した。リツキシマブの初回用量は、リツ
キシマブ介在Ｂ細胞除去が血液および組織中のすべてのＢ細胞を包括的に除去するとは考えられていないことから過剰に有害ではない可能性があった。本明細書に記載の研究で見られたとおり、アレムツズマブはＢ１０Ｂ細胞を積極的に除去するが、メトトレキサートでの処置はメトトレキサートの最初のサイクル後何カ月間もアレムツズマブ寛容の保持を補助すると考えられるこれらの細胞になお接触できる。さらにリツキシマブ処置には、（本明細書で示すとおり）免疫寛容を誘導および介在するようにメトトレキサートによって影響されると考えられる移行性Ｂ細胞提示の増加がすぐに続いた。これらの機構のデータが反直感的および予想外であったことから、低用量のメトトレキサート単一サイクルは（とりわけ）リンパ球除去タンパク質治療に対する免疫寛容を誘導する驚くべき有効な方法であった。

上に記載のとおり、いくつかのＢ細胞サブセットは、メトトレキサートとタンパク質治療薬との同時投与直後に細胞割合および／または細胞数において有意に増加した。さらにこれらのサブセットは、メトトレキサート寛容化マウスでメトトレキサート単一サイクル処置のずっと後に増加したと考えられた（例えば図２４、２７および３５を参照されたい）。併せてこれらのデータは、これらの細胞集団が免疫寛容誘導の誘導および保持の両方を積極的に介在できることを示唆した。この仮説をさらに立証するために本発明者らは、これらの細胞集団が免疫制御にしばしば関連するサイトカインおよび他のタンパク質を発現するかどうかを調査した。

免疫制御と関連する１つの細胞型はＢ１０Ｂ細胞であった。ヒトおよびマウスの両方においてＢ１０Ｂ細胞は、それらのＩＬ−１０発現によって特徴付けられ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：３４２０〜３４３０頁（２００８）、Ｉｗａｔａら、Ｂｌｏｏｄ、１１７：５３０〜５４１頁（２０１１））、ＩＬ−１０コンピテントマウスにおいて免疫応答だけを抑制できた。Ｂ１０Ｂ細胞は、メトトレキサート寛容化マウスにおいて増加しており（図１９）、ＩＬ−１０ノックアウト動物はメトトレキサート誘導免疫寛容に非応答性であった（図３１）。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物から単離したＢ１０Ｂ細胞をＩＬ−１０タンパク質発現についてフローサイトメトリーによって評価した。ＩＬ−１０は両処置群由来のＢ１０細胞において発現されていたが、ＩＬ−１０を発現しているＢ１０Ｂ細胞の数はＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物において増加していた（図３８）。ＩＬ−１０は、活性化ＣＤ８６＋および非活性化ＣＤ８６−Ｂ１０Ｂ細胞の両方において２日間の培養後に発現されていた（図３９）。以前の研究は、ＩＬ−１０発現がＰＭＡ／イオノマイシンまたはＬＰＳなどの刺激物質による細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後にのみ測定されたことを示すと考えられた（Ｃａｒｔｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８６：５５６９〜５５７９頁（２０１１）；Ｙａｎａｂａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２：７４５９〜７４７２頁（２００９））。驚くべきことに本発明者らの研究では、培養脾臓Ｂ細胞は、ＩＬ−１０の測定を可能にするためにいかなる刺激または操作も必要とせず、より直接的にこれらのＢ１０Ｂ細胞がＩＬ−１０をｉｎ ｖｉｖｏで発現することを示唆した。本明細書で提供するデータは、非刺激培養において作成された。追加的に本発明者らは、メトトレキサートがＩＬ−１０を発現する細胞集団を特異的に増殖できたことを本発明者らが初めて実証したと考えた。さらにこれらの細胞集団は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独で処置した動物からよりもＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物から単離した場合に、よりＩＬ−１０を発現すると考えられた（図５４）。

ＴＧＦ−ベータ発現は、制御性Ｔ細胞において免疫制御と関連し、しばしば制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−１０発現と結び付いた。さらにいくつかの報告は、制御性Ｂ細胞がＴＧＦ−ベータを発現できることを示していると考えられた。Ｂ１０Ｂ細胞がＴＧＦ−ベータを発現すると報告されたことはないが、本発明者らは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独
、またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置したマウスのＢ１０Ｂ細胞におけるＴＧＦ−ベータ発現をフローサイトメトリーを用いて評価することを決めた。予想外に本発明者らは、Ｂ１０Ｂ細胞がＴＧＦ−ベータを発現し、ＴＧＦ−ベータ発現細胞の数がメトトレキサート寛容化動物において増加したことを見出した（図４０Ａ）。さらにこれらの培養細胞では、ＴＧＦ−ベータは活性化（ＣＤ８６＋）および非活性化（ＣＤ８６−）Ｂ１０Ｂ細胞の両方で発現された（図４０Ｂ）。これは、メトトレキサート処置がＴＧＦ−ベータを発現する細胞の数を増加させるという追加的な新規観察であった。追加的にメトトレキサートは、ＴＧＦ−ベータの発現レベルを増加させた（図５５）。

ＦｏｘＰ３は、免疫制御と関連する別のタンパク質であった。ＦｏｘＰ３は制御性Ｔ細胞のマーカーであった。ＦｏｘＰ３は、マウスのＢ１０Ｂ細胞で発現されていると報告されていなかった。本発明者らは、メトトレキサート誘導免疫寛容の存在下および非存在下でＢ１０Ｂ細胞におけるＦｏｘＰ３発現をフローサイトメトリーを用いることによって調査した。Ｂ１０Ｂ細胞は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独で処置した動物において見られたとおりＦｏｘＰ３を発現すると考えられた（図４１Ａ）。ＦｏｘＰ３＋Ｂ細胞の数はメトトレキサートおよびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の両方での処置で増加したと考えられた（図４１Ｂ）。追加的に培養された活性化（ＣＤ８６＋）および非活性化（ＣＤ８６−）Ｂ１０Ｂ細胞の両方がＦｏｘＰ３を発現すると考えられた（図４１）。これはＢ１０Ｂ細胞がＦｏｘＰ３を発現することの最初の報告であった。本発明者らは、ＦｏｘＰ３が活性化（ＣＤ８６＋）および非活性化（ＣＤ８６−）Ｂ１０Ｂ細胞の両方で発現され、ＦｏｘＰ３の発現はメトトレキサート処置で増加することを見出した（図５６）。

追加的Ｂ細胞型が単一サイクルメトトレキサート誘導免疫寛容で有意に増加したことから、本発明者らはこれらの細胞型のいくつかがＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３を発現したかどうかを評価した。移行性２、移行性３および濾胞性Ｂ細胞は、ＩＬ−１０（図４２）、ＴＧＦ−ベータ（図４３）およびＦｏｘＰ３（図４４）を発現することが見出され、これはこれらの各Ｂ細胞サブセットに関して新規で予想外のことであった。Ｂ１０細胞で観察されたとおり、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３Ｂ細胞サブセットの絶対細胞数は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独で（図４２〜４４ＡおよびＣ）処置したマウスと比較してメトトレキサートで増加した（図４２〜４４ＢおよびＣ）。メトトレキサート処置は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独でまたはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物におけるこれらのタンパク質の平均蛍光強度でのシフトによって見られるとおり、複数の細胞サブセットにおけるＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３の統計的に有意な増加も誘導した（図５４〜５６）。

メトトレキサートおよびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）での処置によって増やされた複数のＴＧＦ−ベータ発現Ｂ細胞集団をさらに調査するために、次に本発明者らは、ＴＧＦ−ベータがメトトレキサート誘導免疫寛容のために必要であるかどうかを決定することを試みた。研究の間を通じて腹腔内注射で週３回与えられた抗ＴＧＦ−ベータ抗体（１Ｄ１１、Ｇｅｎｚｙｍｅ）５ｍｇ／ｋｇまたはアイソタイプ対照（１３Ｃ４）の存在下または非存在下でＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで動物を処置した。抗体力価を隔週で動物の４つの異なる群において評価した。ＴＧＦ−ベータがメトトレキサート誘導免疫寛容のために必要である場合、本発明者らは抗ＴＧＦ−ベータ抗体で処置した動物が低減した抗Ｍｙｏｚｙｍｅ力価を示すべきでないことを予想した。６週目力価を図４５に示し、ＴＧＦ−ベータがメトトレキサート誘導免疫寛容のために必要である場合があることを示唆した。これが早期の時点であることから、いくつかの動物だけが抗Ｍｙｏｚｙｍｅ応答を生じる時間を有していた。重要なことに、この時点の力価は、ｒｈＧＡＡ単独での２匹の動物ならびにｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートおよび１Ｄ１１で処置した動物が高力価を示した６週目で図１５Ｃに示したも
のと類似していたと考えられた。比較して、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートでまたはｒｈＧＡＡおよびメトトレキサートおよび１３Ｃ４で処置した動物で高力価を示したものはなかった。

追加的に、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）１回処置、またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサート１回処置の７日後に１Ｄ１１または１３Ｃ４も同時投与した）動物から脾臓を単離した。この時点でＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３を発現する移行性２、移行性３、Ｂ１０および濾胞性Ｂ細胞はＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物において増加していた。次いで各群の細胞をプールし、２日間培養し、次いで１Ｄ１１を伴う抗ＴＧＦ−ベータ処置がＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３を発現する細胞の増殖を妨害するかどうかをアイソタイプ対照抗体（１３Ｃ４）と比較して決定するためにフローサイトメトリーによって評価した。

全く予想外なことに１Ｄ１１処置は、ＴＧＦ−ベータを発現している細胞のメトトレキサート誘導増殖だけでなく、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３を発現しているいくつかのサブセットの増殖も妨害した。これはＢ１０Ｂ細胞（図４６）および濾胞性Ｂ細胞（図４７）について特に当てはまり、ＦｏｘＰ３＋濾胞性Ｂ細胞は１Ｄ１１効果を経験したと考えられなかった。１Ｄ１１処置がＴＧＦ−ベータ発現移行性２Ｂ細胞を妨害した移行性２Ｂ細胞では、ＩＬ−１０＋移行性２Ｂ細胞（活性化移行性２Ｂ細胞を含む；図４８）では効果は見られなかった。さらに１Ｄ１１によるＦｏｘＰ３＋移行性２Ｂ細胞での効果は、活性化ＣＤ８６＋移行性２Ｂ細胞を見る場合を除いて、この小さな処置群では明らかであるとは考えられなかった。重要なことに、これらのデータは、メトトレキサート誘導ＴＧＦ−ベータがＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３といくつかの細胞型においてだけ関連したことを示唆した。移行性３Ｂ細胞については、移行性３サブセットにおいて検出可能なＴＧＦ−ベータがあったが（図４９）、これらの細胞に１Ｄ１１処置の明らかな効果はなかった（Ｐ＜０．０５；図４９）。注目すべきことに、活性化ＣＤ８６＋移行性３Ｂ細胞では、１Ｄ１１処置マウスにおけるＩＬ−１０＋移行性３Ｂ細胞の数がより多いと考えられた。これは、この集団が１Ｄ１１処置による他の細胞型の数における喪失の補償を補助するように増殖した可能性があることを示唆した可能性がある。同様に注目されるのは、１Ｄ１１処置がこれらの細胞におけるＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘＰ３の基礎レベルに影響を与えなかったことであったが（それぞれ図５０Ａ〜Ｃ）、これらのサイトカインを発現する細胞へのメトトレキサートの効果に影響すると考えられた。

要約として、メトトレキサート誘導免疫寛容の際にＴＧＦ−ベータ抗体を注射することによってＴＧＦ−ベータを妨害することは、アイソタイプ対照で処置した動物と比較してＴＧＦ−ベータを発現している細胞の数を低減した。さらに、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３を発現しているＢ１０Ｂ細胞においてメトトレキサート誘導寛容について観察された典型的な増加は、１Ｄ１１処置によって阻害された。１Ｄ１１処置はある種のＢ細胞型（しかしすべてのＢ細胞型ではない）においてＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０および／またはＦｏｘＰ３へのメトトレキサートの効果に影響すると考えられた。これらの観察は、驚くべきことであり、メトトレキサートがＴＧＦ−ベータを誘導し、これが次にＢ１０Ｂ細胞などのある種の細胞でＩＬ−１０および潜在的にＦｏｘＰ３を誘導することを示唆した。ＴＧＦ−ベータとＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３との関連は以前報告されたと考えられるが、これらの細胞型では示されていなかった。さらにメトトレキサートは、この複合シグナル伝達カスケードと同時に関連していなかった。

これまでのところ、本発明者らは、ある種のＢ細胞がメトトレキサート誘導寛容で有意に増加したことおよびこれらのＢ細胞が免疫制御（抑制）と関連するタンパク質を発現し
たことを実証した。Ｂ細胞それ自体がメトトレキサート誘導寛容を介在しているかどうかをより直接的に評価するために、本発明者らはメトトレキサート寛容化マウス由来の総脾臓Ｂ細胞が免疫寛容を未処理宿主に移入できるかどうかを評価する養子移入実験を実施した。本発明者らはこの実験をＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサート処置単一サイクルを用いて実施した。本発明者らは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独または、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートで処置した動物からＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）または、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサート１回処置の７日後（上に記載のＢ細胞サブセットがメトトレキサートによって増加した時）に脾臓を単離し、次いですべての脾臓Ｂ細胞を精製した。次いでこれらの細胞をＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）未処理レシピエントマウスに移入した（図５１Ａ）。移入後、レシピエントを（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）または、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサートのいずれかで処置した非移入対照動物と共に）Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）２０ｍｇ／ｋｇで毎週処置した。抗Ｍｙｏｚｙｍｅ抗体力価を評価するために血液を隔週で収集した。脾臓を採取する時点で、各ドナー群由来のＢ細胞のサブセットをＴＧＦ−ベータ＋、ＩＬ−１０＋および／またはＦｏｘＰ３＋移行性２、移行性３、Ｂ１０ならびに濾胞性Ｂ細胞における予想された増加を確認するためにフローサイトメトリーによって評価した。ドナー群が予想された表現型を有することを確認した。力価分析は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびメトトレキサート単一サイクルで処置された動物から単離された総脾臓Ｂ細胞がＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）に対する免疫寛容を未処理宿主に移入できることを示唆した（図５１Ｂ）。これは、Ｂ細胞がメトトレキサート誘導免疫寛容を介在できることを裏付け、Ｂ細胞が抗炎症効果の介在を補助するようにメトトレキサートによって増やされる（殺されるのではなく）と記載されたのはこれが初めてであった。これらのデータは、免疫寛容を誘導するための（現在患者で実施されている）Ｂ細胞除去剤とメトトレキサートとの併用も直接問題にした（Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒら、上記およびＬａｃａｎａら、上記）。

〔実施例１６〕
メトトレキサートは移植片病態を改善する
本発明者らは、メトトレキサートが正常動物（図５２）および移植動物（図５３）においてＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔ制御性（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）Ｔ細胞および総ＣＤ１９＋Ｂ細胞を除去しないことを実証する、マウス抗胸腺細胞グロブリンのコンテクストにおける追加的データも作成した。非特異的ウサギＩｇＧ単独またはメトトレキサートとの組合せで処置した正常動物を比較すると、血液および脾臓中の細胞集団に有意な変化はなかった（図５２）。さらに、ｍＡＴＧ単独で、またはｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置した動物から単離したこれらの集団を比較しても増強された除去はなかった。むしろ本発明者らは、メトトレキサートによって増加したｍＡＴＧ曝露による可能性が最も高いｍＡＴＧ介在ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および制御性Ｔ細胞効果の伸展だけを観察した（図５２）。追加的に、同種移植を受けた動物でのメトトレキサート処置単独は、これらの特定の細胞サブセットを除去しなかった（図５３）。ｍＡＴＧ単独で処置された動物と比較したｍＡＴＧおよびメトトレキサートで処置された動物におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の低下は、メトトレキサート処置のコンテクストにおける場合ｍＡＴＧの延長された効果によって説明できた。重要なことに、メトトレキサートが正常または移植動物のいずれかにおける抗体応答を低減するように活性化Ｂ細胞を殺す場合予想されていたようには、メトトレキサートはＢ細胞の減少を誘導しなかった（図５２および５３）。これらのデータは、抗薬物抗体へのメトトレキサートの効果が活性化Ｂ細胞の抗葉酸誘導除去によって介在されない可能性があることを示唆した。予想されたとおり、この異所性心臓同種移植片モデルにおいてｍＡＴＧ処置も総Ｂ細胞数に強い影響を与えなかった。総合的に、ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置は、移植片拒絶病態の重症度を弱め、移植片へのＴ細胞浸潤の減少と関連したが、制御性Ｔ細胞表現型を有する細胞の増加には関連しなかった。これは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびアレムツズマブのコンテク
ストにおいて作成された結果と一致した。

長期生着移植片における組織学的変化を評価し、移植片生着でのｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せの機構を理解する両方のために、心臓移植片を収集し、病態および細胞組成に関して評価した。特に、制御性Ｔ細胞が移植では長期移植片生着に関連し、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）およびｍＡＴＧによって誘導され、ｍＡＴＧ処置後の遅延移植片拒絶の原因となることが実証されていることから、制御性Ｔ細胞と一致する表現型を有するＣＤ３＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を評価した。具体的には、心臓移植片をｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置群および未処置同系群から移植の少なくとも１００日後に収集した。未処置マウスおよびｍＡＴＧ単独またはメトトレキサート単独で処置したマウス由来の移植片を比較のために移植片拒絶後に採取した。Ｈ＆Ｅもしくはマッソントリクロームで染色した組織切片、または免疫染色した抗ＣＤ３および抗Ｆｏｘｐ３抗体を移植拒絶の指標である組織学的変化（例えば軽度から中程度の心筋炎、心筋変性および壊死、移植心冠動脈病変（ＣＡＶ）およびＴ細胞浸潤）について顕微鏡的に評価した。１００日目に、ｍＡＴＧおよびメトトレキサートで同時処置した動物由来の同種移植片は、最小から軽度のＣＡＶ病変および未検出から最小の心筋変性および心筋炎を示した。移植片拒絶を示唆する組織学的変化は、同系移植片においてこの後期時点で明らかでなかった（図５４）。組合せ処置群由来の同種移植片は、心筋血管に浸潤している数個の細胞を伴う心筋への軽度のＴ細胞浸潤を示した。同系移植片は、心筋内にわずかなＴ細胞を含有した。偶発的二重（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ ｄｕａｌ）ＣＤ３およびＦｏｘｐ３免疫陽性細胞を含むＴ細胞クラスターが同系移植片および組合せ処置同種移植片の両方の心外膜に存在した。したがって長期生着移植片は、低減した炎症と相関する移植片拒絶の最小の徴候を示した。

ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せ処置の効果は移植時に近いほどより活発に生じやすいことから、本発明者らは病態も評価し、移植心臓同種移植片の細胞浸潤を移植後７日（未処置マウスについて）または１４日（すべての処置群について）で特徴付けた。未処置同種移植片は、心筋炎、心筋変性ならびに冠動脈の心外膜および心筋内枝の両方における壊死を含む移植片拒絶病態を示した。対照的にｍＡＴＧおよびメトトレキサートの両方で処置した動物から単離された同種移植片は、それほど重度ではないＣＡＶを示した。これは、未処置動物由来およびｍＡＴＧまたはメトトレキサートのいずれかで処置された動物由来の同種移植片と比較されていた（図５８）。予想されたとおり、未処置マウス由来の同系移植片は、これらの時点で病態をほとんどまたは全く示さなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤が未処置マウスおよびｍＡＴＧまたはメトトレキサート単独で処置されたもの由来の同種移植片中の心筋および心外膜で観察された。数個のＣＤ３＋Ｔ細胞もこれらの移植片中のＣＡＶ病変に関連する炎症細胞浸潤に存在した。対照的に、ｍＡＴＧとメトトレキサートとの組合せで処置された動物由来の同種移植片は、実質的により低い心筋へのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤、およびごく最小の心外膜へのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示した。同系心臓移植片は、心外膜だけへの最小のＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示した。心外膜への炎症細胞浸潤中のわずかな割合のＴ細胞は、二重ＣＤ３およびＦｏｘｐ３免疫反応性によって示されるとおり制御性Ｔ細胞表現型を有すると考えられたが、この頻度は他の群においてより炎症浸潤において高くはないと考えられた。したがって低減した病態もｍＡＴＧおよびメトトレキサートでの処置後早期に観察され、低減したおよび心外膜限定の両方のＴ細胞浸潤と関連した。

Claims (12)

1. タンパク質治療薬での処置の必要がある対象において免疫寛容を誘導するための組成物であって、前記組成物は、メトトレキサートを活性成分として含み、メトトレキサートの有効量は単一サイクルで投与され、メトトレキサート単一サイクルは、１日のメトトレキサート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキサート投与からなり、そして、対象においてタンパク質治療薬の効能が増大する、上記組成物。
2. タンパク質治療薬は、抗体治療薬である、請求項１に記載の組成物。
3. 抗体治療薬は、アレムツズマブである、請求項２に記載の組成物。
4. 抗体治療薬は、リツキシマブである、請求項２に記載の組成物。
5. 組成物は、多発性硬化症患者に投与される、請求項３または４に記載の組成物。
6. 治療薬は、酵素である、請求項１に記載の組成物。
7. 酵素は、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡである、請求項６に記載の組成物。
8. 組成物は、ファブリ病患者に投与される、請求項７に記載の組成物。
9. 組成物は、ヒトに投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. メトトレキサート単一サイクルは、タンパク質治療薬による治療の前または途中または後に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 組成物は、治療薬の開始の４８時間前から４８時間後の間に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. メトトレキサートは、０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。

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