ES2836823T3 - Inducción de inmunotolerancia mediante el uso de metotrexato - Google Patents

Abstract

Metotrexato para usar en la inducción de inmunotolerancia en un sujeto que tiene una enfermedad o afección o que necesita trasplante de tejido, en donde el metotrexato se administra en un ciclo único que consiste en 1 día de administración de metotrexato o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 días consecutivos de administración de metotrexato; en donde el ciclo único de metotrexato se administra entre 48 horas antes y 48 horas después del inicio de un tratamiento con un agente terapéutico de proteína; y en donde a) la enfermedad o afección es la esclerosis múltiple y el agente terapéutico es alemtuzumab; b) la enfermedad o afección es una afección autoinmunitaria y el agente terapéutico es rituximab; c) la enfermedad o afección es un trasplante de tejido u órgano, anemia aplásica o enfermedad de injerto contra huésped, y el agente terapéutico es un anticuerpo de conejo de globulina antitimocítica; d) la enfermedad o afección es la enfermedad de Pompe y el agente terapéutico es alfa-glucosidasa humana recombinante; o e) la enfermedad es la enfermedad de Fabry y el agente terapéutico es la alfa-galactosidasa A humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Inducción de inmunotolerancia mediante el uso de metotrexato

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a la inmunología y, más específicamente, al uso de metotrexato para reducir las respuestas inmunitarias no deseadas en los pacientes.

Antecedentes de la invención

Actualmente, la Administración de Medicamentos y Alimentos de EE.UU. (FDA) ha aprobado más de 130 agentes terapéuticos proteínas para uso clínico (Leader et al., Nat Rev Drug Discov, 7 (1): 21-39 (2008)). Estos agentes terapéuticos incluyen péptidos, proteínas humanas recombinantes, vacunas de proteínas, preparaciones de anticuerpos policlonales derivados de una variedad de especies animales y anticuerpos monoclonales. Dependiendo de su secuencia y homología conformacional con autoantígenos endógenos, estado de glicosilación, nivel de dosis, vía de administración, localización y características relacionadas con el procedimiento de fabricación, los agentes terapéuticos proteínas pueden producir respuestas de anticuerpos en el paciente (Schellekens, Nat Rev Drug Discov, 1 (6): 457-62 (2002); Zinkernagel, Semin Immunol, 12 (3): 163-71 (2000), discusión 257-344; Thorland et al., Haemophilia, 5(2):101-5 (1999); Goodeve, Blood Coagul Fibrinolysis, 14 Suppl 1:S 17-21 (2003)). Estas respuestas, denominadas respuestas de anticuerpos antifármaco (ADA, por sus siglas en inglés anti-drug antibody), pueden afectar a veces a la seguridad del paciente y la eficacia del fármaco.

En el caso del trastorno de almacenamiento lisosómico, enfermedad de Pompe, se pueden desarrollar ADA en la terapia de reemplazo enzimático (ERT) contra la alfa-glucosidasa ácida humana recombinante. En pacientes que no expresan cantidades medibles de la enzima endógena, los niveles sostenidos de títulos altos de anticuerpos se correlacionan con la disminución en el paciente (pacientes CRIM-Pompe) (Kishnani et al., MolGenetMetab., 99 (1):26-33 (2010)); Hunley et al., Pediatrics, 114 (4): e532-5 (2004); Amalfitano et al., GenetMed, 3 (2): 132-8 (2001)). Se ha observado un compromiso similar en la seguridad y eficacia de los fármacos en pacientes con hemofilia que desarrollan ADA contra el factor IX (Thorland et al., Haemophilia, 5 (2): 101-5 (1999); Ewenstein et al., Blood, 89 (3):1115-6 (1997)). En raras ocasiones, los ADA también pueden inducir una enfermedad autoinmunitaria como en el caso de la eritropoyetina humana recombinante (Schellekens, Clin Ther, 24 (11): 1720-40 (2002), discusión 1719; Locatelli et al., Perit Dial Int, 27 Suppl 2: S303-7 (2007)).

Las respuestas de ADA también pueden ocurrir con agentes terapéuticos anticuerpos independientemente de si los tratamientos son de origen no humano, humanizados o incluso completamente humanos. La inmunogenicidad de los tratamientos de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales puede influir en la seguridad del paciente y la eficacia del fármaco. Los anticuerpos que se desarrollan contra anticuerpos monoclonales terapéuticos tales como infliximab, adalimumab, rituximab y natalizumab se han asociado con menores niveles séricos y eficacia de los anticuerpos terapéuticos (Bendtzen et al., Arthritis Rheum, 54 (12):3782-9 (2006); Schmidt et al., Clin Immunol, 132 (3):334-41 (2009); Bartelds et al., Ann Rheum Dis, 66 (7):921 -6 (2007); Baert et al., NEngl JM ed , 348 (7):601 -8 (2003); Tahir et al., Rheumatology (Oxford), 44(4):561-2 (2005); Maini et al., Arthritis Rheum, 41(9):1552-63 (1998)). Se han asociado reacciones alérgicas con anticuerpos anti-infliximab (Baert et al., N Engl J Med, 348(7):601-8 (2003)). Se han observado reacciones de hipersensibilidad relacionadas con la infusión en un pequeño porcentaje de pacientes con esclerosis múltiple remitente-recurrente tratados con natalizumab (Phillips et al., Neurology, 67(9):1717-8 (2006)).

El alemtuzumab es otro anticuerpo terapéutico que puede generar ADA en pacientes con esclerosis múltiple remitenterecurrente (Coles et al., N Engl J Med, 2008. 359(17):1786-801 (2008)). Alemtuzumab es un anticuerpo monoclonal que agota los linfocitos que interactúa con CD52, un antígeno de la superficie celular expresado en células inmunitarias. Alemtuzumab se encuentra en ensayos clínicos en etapa tardía para el tratamiento de la esclerosis múltiple remitente-recurrente y también se ha evaluado en la artritis reumatoide. Un grupo de investigadores ha demostrado que se desarrollaron anticuerpos anti-alemtuzumab en el 63% de los pacientes con artritis reumatoide tratados en un estudio de escalamiento de dosis única (Weinblatt et al., Arthritis Rheum, 1995. 38 (11): 1589-94 (1995)). En ese estudio, la eficacia de alemtuzumab parecía que era alterada por la presencia de ADA (ibidem).

El anticuerpo policlonal terapéutico Timoglobulina® también se asocia con ADA perjudiciales en un pequeño subconjunto de pacientes. Se han observado enfermedad del suero, insuficiencia renal aguda y reacciones cardiovasculares en receptores de trasplantes tratados con Timoglobulina® (Boothpur et al., Am J Kidney Dis., 55(1):141 -3 (2009); Lundquist et al., Liver Transpl., 13(5):647-50 (2007); Busani et al., Minerva Anestesiol, 72(4):243-8 (2006); Tanriover et al., Transplantation, 80(2):279-81 (2005); Buchler et al., Clin Transplant, 17(6):539-45 (2003)).

Las investigaciones han tratado de encontrar formas de minimizar los efectos perjudiciales de los ADA. Las herramientas que se han ensayado para determinar su capacidad para inducir inmunotolerancia y reducir los ADA en terapias con proteínas incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 no agotadores (Cobbold et al., Semin Immunol, 2 (6):377-87 (1990); Winsor-Hines et al., J Immunol, 173(7):4715-23 (2004)), mutantes mínimos de alemtuzumab que no se unen a células (Gilliland et al., J Immunol, 162(6):3663-71 (1999); Somerfield et al., J Immunol., 185(1 ):763-8 (2010)), terapias inmunosupresoras (Bennett et al., Blood, 106(10):3343-7 (2005); Dickson et al., J Clin Invest, 118(8):2868-76 (2008)), partículas lipídicas que contienen fosfatidilinositol que se unen al factor VIII (Peng et al., AAPS.

J., 12(3) :473-81 (2010)), y la administración específica al hígado de alfa-glucosidasa ácida recombinante a través de infección por virus adenoasociados (Sun et al., Am J Human Genet, 81(5):1042-9 (2007); Sun et al., Mol Ther 18(2):353-60 (2009); Ziegler et al., Hum Gene Ther, 19(6):609-21 (2008)). Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de desarrollar métodos mejorados para reducir las respuestas de anticuerpos no deseadas en terapias con proteínas y otros marcos.

Resumen de la invención

La invención se refiere al metotrexato para usar en la inducción de inmunotolerancia en un sujeto que tiene una enfermedad o afección o que necesita un trasplante de tejido, en donde el metotrexato se administra en un solo ciclo que consiste en 1 día de administración de metotrexato o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 días consecutivos de administración de metotrexato; en donde el ciclo único de metotrexato se administra entre 48 horas antes y 48 horas después del inicio de un tratamiento con un agente terapéutico de proteína; y en donde

a) la enfermedad o afección es esclerosis múltiple y el agente terapéutico es alemtuxumab;

b) la enfermedad o afección es una afección autoinmunitaria y el agente terapéutico es rituximab;

c) la enfermedad o afección es un trasplante de tejido u órgano, anemia aplásica o enfermedad de injerto contra huésped, y el tratamiento es un anticuerpo de conejo de globulina antitimocítica;

d) la enfermedad o afección es la enfermedad de Pompe y el tratamiento es la alfa-glucosidasa humana recombinante; o

e) la enfermedad es la enfermedad de Fabry y el tratamiento es la alfa-galactosidasa A humana.

También se describe un método para inhibir respuestas de anticuerpos a un agente terapéutico en un sujeto que necesita tratamiento con el agente terapéutico. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato en un solo ciclo, inhibiendo así las respuestas de anticuerpos contra el agente terapéutico en el sujeto.

También se describe un método para aliviar una reacción de infusión a un agente terapéutico en un sujeto que necesita tratamiento con el agente terapéutico. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, aliviando así una reacción de infusión al agente terapéutico de proteína en el sujeto.

También se describe un método para reducir la autoinmunidad secundaria en un sujeto autoinmune que necesita tratamiento con un agente terapéutico. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, reduciendo así la autoinmunidad secundaria en el sujeto.

También se describe un método para aumentar la eficacia de un agente terapéutico en un sujeto que necesita tratamiento con el agente terapéutico. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, aumentando así la eficacia del agente terapéutico de proteína en el sujeto.

También se describe un método para aumentar el porcentaje de células T reguladoras en la población de células T en un sujeto tratado con una terapia de agotamiento de linfocitos, p. ej., una terapia con alemtuzumab o una terapia con Timoglobulina®. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, aumentando así dicho porcentaje en dicho sujeto.

También se describe un método para aumentar el porcentaje de células B reguladoras en la población de células B en un sujeto que necesita tratamiento con un agente terapéutico de proteína tal como un agente terapéutico de anticuerpo. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, aumentando así dicho porcentaje en dicho sujeto. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de metotrexato se administra en un solo ciclo. En realizaciones relacionadas, se describe un método para aumentar las células B que expresan TGF-beta, IL-10 y/o FoxP3 en un sujeto que necesita tratamiento con un agente terapéutico de proteína, que comprende administrar una cantidad eficaz de metotrexato en un solo ciclo.

También se describe un método para prolongar la farmacocinética de un agente terapéutico en un sujeto. En este método, se administra metotrexato al sujeto, antes o durante o después de la administración del agente terapéutico, en una cantidad eficaz para prolongar la farmacocinética del agente terapéutico.

También se describe un método para agotar los linfocitos en un paciente humano que lo necesite. En este método, se trata al paciente con un agente de agotamiento de linfocitos y se administra metotrexato al paciente, antes o durante o después del tratamiento con el agente de agotamiento de linfocitos, en una cantidad eficaz para inducir inmunotolerancia en el paciente hacia el agente de agotamiento de linfocitos o para reducir la autoinmunidad secundaria. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de metotrexato se administra en un solo ciclo. En algunas realizaciones, el agente de agotamiento de linfocitos puede ser un agente terapéutico de anticuerpo monoclonal (p. ej., alemtuzumab o rituximab). En algunas de estas realizaciones, el paciente puede ser un paciente con esclerosis múltiple (p. ej., un paciente con esclerosis múltiple remitente-recurrente). En algunas realizaciones, el agente de agotamiento de linfocitos puede ser un agente terapéutico de anticuerpo policlonal (p. ej., anticuerpo policlonal globulina antitimocítica).

También se describe un método para inducir inmunotolerancia en un sujeto que necesita un trasplante de tejido. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato, induciendo así inmunotolerancia hacia el tejido trasplantado en el sujeto. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de metotrexato se administra en un solo ciclo. En algunas realizaciones, el tejido trasplantado es tejido renal o tejido cardiaco. En algunas realizaciones, el sujeto también recibe un agente para la inmunomodulación (p. ej., un inmunosupresor), tal como un anticuerpo policlonal globulina antitimocítica).

También se describe un método para inhibir las respuestas de células T en un sujeto que necesita un agente terapéutico o trasplante de tejido. En este método, se administra al sujeto una cantidad eficaz de metotrexato antes, al mismo tiempo o después de tratar al sujeto con el agente terapéutico o trasplante de tejido, inhibiendo así las respuestas de las células T en el sujeto.

En la invención, el agente terapéutico es un agente terapéutico de proteína.

En algunas realizaciones de la invención, el agente terapéutico es un anticuerpo terapéutico. Por ejemplo, el agente terapéutico de anticuerpo puede ser un agente terapéutico de anticuerpo monoclonal y/o un agente de agotamiento de linfocitos (p. ej., alemtuzumab), o un agente terapéutico de anticuerpo policlonal (p. ej., anticuerpo policlonal de conejo globulina antitimocítica). En realizaciones en donde el agente terapéutico de anticuerpo es alemtuzumab, el sujeto es un paciente con esclerosis múltiple. En realizaciones en donde el agente terapéutico de anticuerpo es un anticuerpo policlonal de conejo de globulina antitimocito, el sujeto es un paciente humano que necesita un trasplante de órgano, tiene anemia aplásica y/o tiene o está en riesgo de tener una enfermedad de injerto contra huésped. En otras realizaciones de los métodos de la invención, el agente terapéutico es una enzima. Por ejemplo, la enzima puede ser alfa-galactosidasa A humana o alfa-glucosidasa ácida humana.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el sujeto es un ser humano.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, la cantidad eficaz de metotrexato puede ser de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg. En la invención, el ciclo único de metotrexato consiste en 1 día de administración de metotrexato o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 días consecutivos de administración de metotrexato. En la invención, el ciclo único de metotrexato se puede administrar entre 48 horas antes y 48 horas después del inicio del tratamiento terapéutico.

Breve descripción de las figuras

En cada una de las figuras descritas a continuación, los asteriscos o estrellas indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; **, p < 0,001; ***, p < 0,0001).

Las figs. 1A-B muestran respuestas de anti-IgG de conejo a series únicas y múltiples de mATG, un anticuerpo policlonal de conejo de globulina antitimocítica murina. Se midieron los títulos medios de anti-IgG de conejo y se usaron como control ratones tratados solo con IgG de conejo (rbIgG). La fig. 1A muestra las respuestas a una sola serie de mATG a lo largo de un período de 8 semanas. La fig. 1B muestra las respuestas a varias series de mATG a lo largo de un período de 20 semanas. Las flechas indican puntos de tiempo en los que se administraron mATG o rbIgG.

La fig. 2 muestra títulos medios de IgG específica de alemtuzumab después de cinco tratamientos mensuales con alemtuzumab. Las flechas indican los tiempos en los que se administró alemtuzumab.

La fig. 3 muestra la supresión de las respuestas de IgG anti-mATG por el metotrexato (MTX) después de una serie única de mATG. Los ratones se trataron con mATG sola, rbIgG solo o mATG y metotrexato.

Las figs. 4A-C muestran los efectos del metotrexato sobre las respuestas de anti-IgG de conejo a lo largo de una serie de cinco tratamientos mensuales con mATG. Las flechas indican los tiempos en los que se administró mATG o metotrexato. La fig. 4A muestra que tres ciclos de metotrexato reducen significativamente los títulos medios de anti-IgG de conejo. La fig. 4B muestra que una sola serie de metotrexato reduce significativamente los títulos medios de anti-IgG de conejo. La fig. 4 C compara los títulos medios de anti-IgG de conejo de ratones tratados con mATG sola, mATG y un solo ciclo de metotrexato, o mATG y tres ciclos de metotrexato. Un solo ciclo de metotrexato reduce los títulos de anti-IgG de conejo de manera más significativa que tres ciclos de metotrexato.

La fig. 5 muestra que los títulos medios de anti-IgG de conejo se reducen después de la reexposición a mATG en ratones tratados con metotrexato (ciclos de metotrexato únicos y múltiples), en comparación con los ratones tratados con mATG pero no con metotrexato. Las flechas indican los tiempos en los que se administró mATG o metotrexato.

La fig. 6 muestra que el título medio de anti-IgG de conejo en ratones tratados con mATG y un solo ciclo de metotrexato es 100 veces menor que en ratones tratados con mATG sola. Las flechas indican los tiempos en los que se administró mATG o metotrexato.

Las figs. 7A-C muestran que el metotrexato puede reducir los títulos medios de IgG anti-alemtuzumab en ratones Tg huCD52. Fig. 7A: Los títulos de anti-alemtuzumab son más bajos en ratones tratados con un solo ciclo de 1 mg/kg o 5 mg/kg de metotrexato que en ratones tratados con 0,5 mg/kg o sin metotrexato. Los ratones se trataron con alemtuzumab solo o alemtuzumab y un solo ciclo de metotrexato de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg. Fig. 7B: Diseño de estudio para ensayar los títulos de anti-alemtuzumab. Los datos de títulos se determinaron a las 24 horas después de la quinta dosis de alemtuzumab, según lo indicado por la estrella. Fig. 7C: El metotrexato redujo los títulos de anticuerpos anti-alemtuzumab en ratones que recibían alemtuzumab y metotrexato, en comparación con ratones que recibían solo alemtuzumab, 24 horas después de la quinta dosis de alemtuzumab.

Las figs. 8A-D muestran el número absoluto de células/pl de sangre entera de células T en la circulación en ratones tratados con cinco dosis diarias de 0,5 mg/kg de alemtuzumab o solución salina tamponada con fosfato (PBS). La fig.

8A muestra que las células T totales (CD3+) se redujeron dos, tres y cuatro semanas después del tratamiento. La fig.

8B muestra que las células B totales (CD19+) se redujeron tres semanas después del tratamiento. La fig. 8C muestra que las células T cooperadoras (CD4+) se redujeron a las dos, tres y cuatro semanas después del tratamiento, y la fig.

8D muestra que las células T citotóxicas (CD8+) se redujeron a las dos, tres y cuatro semanas después del tratamiento.

Las figs. 9A-B muestran respuestas de IgG específicas de alemtuzumab. La fig. 9A muestra respuestas después de tres ciclos de tratamiento con alemtuzumab de 0,5 mg/kg y un ciclo de tratamiento con metotrexato de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg. El primer ciclo de tratamiento con alemtuzumab consistía en cinco días consecutivos de administración, y el segundo y tercer ciclos consistía cada uno en tres días consecutivos de administración. La fig. 9B muestra títulos de IgG anti-alemtuzumab de cada animal por grupo la semana 14.

La fig. 10 muestra que un solo ciclo de 5 mg/kg de metotrexato restablece los niveles de mATG en la circulación en ratones tratados con cinco dosis mensuales de mATG.

La fig. 11 muestra que los ratones tratados con cinco tratamientos mensuales de mATG y un solo ciclo de metotrexato tienen un mayor agotamiento de células T CD4+ y CD8+ mediado por mATG en sangre después de la quinta dosis de mATG. Estos datos son combinados de dos experimentos.

Las figs. 12A-B muestran que los ratones tratados con un solo ciclo de metotrexato presentan porcentajes mayores de células T reguladoras (CD25+Foxp3+) después de un quinto tratamiento mensual con mATG. Los ratones se trataron con cinco tratamientos mensuales de mATG sola, o cinco tratamientos mensuales de mATG y un ciclo único de metotrexato, o cinco tratamientos mensuales de mATG y tres ciclos de metotrexato. La fig. 12A muestra niveles de células T reguladoras en el bazo. La fig. 12B muestra los niveles de células T reguladoras en la sangre.

La fig. 13A muestra que un título de anti-IgG de conejo superior a 10.000 puede interferir con la farmacocinética de mATG. La fig. 13B muestra que un título anti-conejo superior a 100.000 puede interferir con el agotamiento de células CD4 y CD8. El % de control pretratamiento se refiere al porcentaje de títulos de CD4 y CD8 en relación con sus niveles respectivos antes del tratamiento con mATG.

La fig. 14 muestra que los ratones tratados con 5 mg/kg de metotrexato presentan mayor agotamiento por alemtuzumab de células T CD3+ y células B CD19+ en la circulación después de una quinta dosis mensual de alemtuzumab. Los ratones se trataron con alemtuzumab solo o alemtuzumab y un solo ciclo de metotrexato durante los primeros tres días del estudio. Los asteriscos indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; ***, p < 0,0001).

La fig. 15A muestra que un solo ciclo de metotrexato puede reducir los títulos de IgG específicos de la alfa-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA) durante todo el tratamiento, e incluso cuatro semanas después del último tratamiento con rhGAA, en un estudio de 16 semanas. Las flechas indican los tiempos en los que se administraron rhGAA y metotrexato. Los ratones se trataron con rhGAA sola o rhGAA y un solo ciclo de metotrexato, o rhGAA y tres ciclos de metotrexato. La fig. 15B muestra que, en un estudio de seis semanas, un solo ciclo de metotrexato reduce los títulos de IgG específicos de rhGAA. La fig. 15C muestra que un solo ciclo de metotrexato reduce los títulos de IgG específicos de rhGAA en un estudio de 18 semanas.

La fig. 16A muestra que el metotrexato disminuye los títulos de anti-IgG de conejo en un modelo de trasplante de corazón alogénico murino cuando se administra con mATG, en comparación con mATG sola. La fig. 16B muestra que el metotrexato aumenta los niveles en la circulación de mATG en un modelo de trasplante de corazón alogénico murino. Los ratones se trataron con solución salina, mATG sola o mATG y un solo ciclo de metotrexato. Se administró mATG en 20 mg/kg los días 0 y 4 del estudio, mientras que se administraron 2 mg/kg de metotrexato los días 0-6 del estudio.

La fig. 17 muestra un diagrama de Kaplan-Meier que indica que un tratamiento combinado de mATG y metotrexato prolonga la supervivencia de corazones alogénicos trasplantados en ratones receptores. Los ratones no se trataron o se trataron con 20 mg/kg de mATG sola los días 0 y 4 del estudio, o con 2 mg/kg de metotrexato solo los días 0-6 del estudio, o tanto con mATG como con 2 mg/kg de metotrexato los días 0-6, o tanto con mATG como con 0,5 mg/kg de metotrexato los días 0-6 o los días 0-11.

La fig. 18 muestra que los ratones con un trasplante de corazón alogénico tratados con metotrexato solo o metotrexato en combinación con mATG experimentan una reducción en las respuestas de anticuerpos anti-aloinjerto. La fig. 18A muestra la unión de la IgG del receptor a los fibroblastos alogénicos el día 21. La fig. 18B muestra niveles de aloanticuerpos el día 21 en ratones que recibieron trasplantes singénicos (Tx sing.) o un trasplante alogénico (Tx alo.) con los tratamientos indicados. Se muestra la unión de la IgG de suero de ratón receptor individual a fibroblastos alogénicos y se expresa como una relación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) respecto a fibroblastos no teñidos. La fig. 18C muestra niveles de aloanticuerpos el día 21 en ratones que no recibieron tratamiento, recibieron mATG, metotrexato o mATG y metotrexato. Los niveles de aloanticuerpos eran significativamente más bajos en ratones tratados con metotrexato o mATG y metotrexato (p = 0,0008 y p <0,0001, respectivamente).

La fig. 19 muestra que las células B reguladoras B10 aumentan significativamente después del tratamiento con metotrexato. Los ratones se trataron con rhGAA sola o rhGAA y un solo ciclo de tres días de metotrexato o solución salina. Se contaron los números de células el día 7 y el día 8 del estudio.

La fig. 20 muestra que las subpoblaciones de células B activadas son significativamente mayores el día 6 después del tratamiento con rhGAA y un solo ciclo de tres días de metotrexato, en comparación con el tratamiento con rhGAA sola. El número absoluto de células de las células B transicionales 2 CD86+, células B transicionales 3 CD86+, células B foliculares CD86+ y células B de la zona marginal CD86+ se contaron el día 6 del estudio. Los asteriscos indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; **, p < 0,001).

La fig. 21 muestra que para las subpoblaciones de células B esplénicas activadas, tales como las células B de la zona marginal activadas, las células B foliculares activadas y las células B transicionales 3 activadas, el número de células permanece mayor incluso después del tratamiento con rhGAA y metotrexato, en comparación con el tratamiento con rhGAA sola. Las flechas representan el tratamiento con rhGAA y metotrexato. Se administró rhGAA el día 1 y el día 8. Se administró metotrexato los días 1, 2 y 3, y los días 8, 9 y 10. Las diferencias significativas están representadas por estrellas (*, p <0,05). Los datos no se muestran para los días 8 y 9 (indicados por líneas de puntos verticales).

La fig. 22 muestra que las poblaciones de células T esplénicas activadas, tales como las células T cooperadoras activadas, células T citotóxicas activadas y células T reguladoras activadas, permanecen prácticamente sin cambios después del tratamiento con rhGAA y metotrexato, en comparación con el tratamiento con rhGAA sola. Las flechas representan el tratamiento con rhGAA y metotrexato. Se administró rhGAA el día 1 y el día 8. Se administró metotrexato los días 1,2 y 3, y los días 8, 9 y 10. Las diferencias significativas están representadas por estrellas (*, p <0,05). Los datos no se muestran para los días 8 y 9 (indicados por líneas de puntos verticales).

La fig. 23 muestra un diseño de estudio de seis meses de duración para examinar el tratamiento con metotrexato en combinación con mATG. Las flechas continuas representan inyecciones de mATG de 5 mg/kg, las flechas de trazos representan inyecciones de metotrexato de 5 mg/kg y las flechas de puntos representan sacrificios terminales.

Las figs. 24A-B muestran que un solo ciclo de metotrexato en conexión con mATG enriquece las células B esplénicas, en comparación con mATG sola o tres ciclos de metotrexato. Fig. 24A: células B foliculares activadas; Fig. 24B: células B de transición 3 activadas.

Las figs. 25A-B muestran los efectos del metotrexato sobre la farmacodinámica de alemtuzumab en la sangre. Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco meses, con o sin tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato en relación con la primera administración de alemtuzumab. Fig. 25A: El metotrexato mejora el agotamiento por alemtuzumab (AZM) de las células T totales (CD3+), células T cooperadoras (CD4+) y células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+). Las barras negras representan mediciones en ratones tratados con alemtuzumab solo, mientras que las barras blancas representan mediciones en ratones tratados con alemtuzumab y metotrexato. Fig. 25B: El metotrexato mejora el agotamiento de las células B por alemtuzumab. Las estrellas indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05).

La fig. 26 muestra los efectos del metotrexato sobre la farmacodinámica de alemtuzumab en el bazo. Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco meses, con o sin tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato en relación con la primera administración de alemtuzumab. Las células T están agotadas después del quinto tratamiento con alemtuzumab. CD8 CEN: células T de memoria centrales CD8+; CD8 EFF MEM: células T de memoria efectoras CD8+; CD4 CEN MEM: células T de memoria centrales CD4+; CD4 EFF MEM: células T de memoria efectoras CD4+. Las estrellas indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05).

Las figs. 27A-B muestran los efectos del metotrexato sobre el número de células B en el bazo. Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco meses, con o sin tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato en relación con la primera administración de alemtuzumab. Las estrellas indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05).

Las figs. 28A-B muestran agotamiento de los linfocitos esplénicos tres días después de una sola dosis de alemtuzumab. Fig. 28A: Las células T y las células B se agotan significativamente. Las marcas pequeñas representan ratones de control tratados con PBS y las marcas grandes representan ratones tratados con alemtuzumab. Fig. 28B: Las células B (CD 19+) están agotadas en un 92% 24 horas después del tratamiento y permanecen agotadas en un 36% tres días después del tratamiento. Los tres gráficos representan diferentes grupos de animales, a cada uno de los cuales se extrajo sangre en diferentes tiempos de medición. Las estrellas indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; **, p < 0,001; ***, p < 0,0001).

Las figs. 29A-B muestran los efectos del metotrexato en los niveles de citoquinas. La fig. 29A muestra un diseño de estudio para un estudio de seis meses para evaluar los niveles de citoquinas en el bazo y los ganglios linfáticos. La estrella indica que los datos se recogieron 24 horas después del quinto tratamiento con alemtuzumab. Las flechas indican los tiempos en los que se administró alemtuzumab o metotrexato, o se realizaron sacrificios terminales, según se indica. La fig. 29B muestra niveles de factor de activación de células B perteneciente a la familia de TNF (BAFF) en ratones tratados con alemtuzumab solo o con alemtuzumab y metotrexato.

Las figs. 30A-B muestran los niveles de citoquinas después del tratamiento con alemtuzumab y metotrexato. La fig.

30A muestra un diseño de estudio para un estudio de cuatro meses. La estrella indica que los datos se recogieron una semana después del segundo ciclo de metotrexato. Las flechas indican puntos de tiempo en los que se administró alemtuzumab o metotrexato, o se realizaron sacrificios terminales, según se indica. La fig. 30B muestra los niveles de diversas citoquinas en ratones tratados con alemtuzumab (AZM) solo o con 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg o 2,0 mg/kg de metotrexato.

La fig. 31 muestra los efectos del metotrexato en los títulos de anti-rhGAA en ratones IL10 -/- (inactivación génica) y C57BL/6. Se administraron semanalmente 20 mg/kg de rhGAA durante nueve semanas a ratones con inactivación génica IL10 -/- y ratones de tipo natural C57BL/6, con o sin 5 mg/kg/día de metotrexato a las 0, 24 y 48 horas después del primero de tres tratamientos semanales de rhGAA.

La fig. 32 muestra que algunas, pero no todas, las poblaciones de células B esplénicas están agotadas una y/o dos semanas después del tratamiento con alemtuzumab. Las barras sombreadas pequeñas representan ratones de control transgénicos huCD52 tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS); las barras grandes sombreadas representan ratones transgénicos huCD52 tratados con 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco días consecutivos. Los asteriscos indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; **, p < 0,001; ***, p < 0,0001).

La fig. 33 muestra un diseño de estudio para examinar los efectos del metotrexato en las poblaciones de células B en el contexto del tratamiento con alemtuzumab. Se usaron tiroides y ganglios linfáticos (GL) para la evaluación patológica. Las flechas indican los tiempos en los que se administraron alemtuzumab y metotrexato, o sacrificios terminales, según se indica.

La fig. 34 muestra los efectos de tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato solo, 0,5 mg/kg de alemtuzumab solo y 0,5 mg/kg de alemtuzumab y 5 mg/kg/día de metotrexato en combinación en el agotamiento de las poblaciones de células B. Los asteriscos indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05; **, p < 0,001; ***, p < 0,0001); ns, no significativo).

La fig. 35 muestra los efectos del metotrexato sobre el agotamiento de células B después de cinco ciclos de tratamiento con 0,5 mg/kg de alemtuzumab solo o tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato solo o 0,5 mg/kg de alemtuzumab y 5 mg/kg/día de metotrexato en combinación. Los asteriscos indican mediciones con diferencias estadísticamente significativas (*, p <0,05).

La fig. 36 muestra que los niveles de las citoquinas MCP-1, IL-13, IL-6 e IL-12 son menores en ratones tratados con un solo ciclo de tres días de 5 mg/kg de metotrexato administrado el primer día de tratamiento con alemtuzumab. Los datos se recogieron 24 horas después de una quinta dosis de alemtuzumab, cuatro meses después del tratamiento con metotrexato.

Las figs. 37A-B muestran títulos de rhGAA las semanas 2, 6 y 12 en ratones atímicos nu/nu. La fig. 37A muestra títulos de rhGAA las semanas 2 y 6. De izquierda a derecha, mediciones de la semana 2 en ratones de control tratados con solución salina, ratones tratados con rhGAA y ratones tratados con rhGAA y metotrexato, seguido de mediciones de la semana 6 en ratones de control tratados con solución salina, ratones tratados con rhGAA y ratones tratados con rhGAA y metotrexato. La fig. 37B muestra las mediciones de la semana 12 en, de izquierda a derecha, ratones nu/nu tratados con rhGAA sola (Myo), ratones nu/nu tratados con metotrexato y rhGAA, ratones BL6 tratados con rhGAA sola y BL6 tratados con metotrexato y rhGAA.

Las figs. 38A-B muestran que el número y porcentajes de células B B10 que expresan IL-10 es mayor en ratones hechos tolerantes a rhGAA con metotrexato. Se evaluó la expresión de la proteína IL-10 de las células B B10 aisladas de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato por citometría de flujo.

Las figs. 39A-B muestran que la IL-10 se expresa tanto en células B B10 activadas (CD86+) como no activadas (CD86-). La fig. 39A representa un gráfico de FACS de células B B10 teñidas con CD86, mientras que la fig. 39B representa el número de células B B10 CD86+IL10+ y células B B10 CD86-IL10+ en respuesta al tratamiento con rhGAA o rhGAA y metotrexato.

Las figs. 40A-B muestran que el tratamiento de metotrexato con rhGAA induce a las células B B10 a aumentar su expresión de TGF-beta. El segundo y tercer paneles de la fig. 40A son gráficas de FACS que muestran células B B10 teñidas con TGF-beta y CD86 de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato. El primer panel de la fig. 40A representa el número de células B B10 TGF-beta+ en animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato. La fig.

40B representa recuentos de células B B10 CD86+TGF-beta+ y células B B10CD86-TGF-beta+.

La fig. 41A representa que las células B B10 parecen expresar FoxP3 en animales tratados con rhGAA (Fig. 41A). La fig. 41B describe que el número de células B FoxP3+ aumenta con el tratamiento con metotrexato y rhGAA. La fig.

41C representa que tanto las células B B10 activadas (CD86+) como las no activadas (CD86-) expresan FoxP3.

Las figs. 42A-C muestran que las células B foliculares, transicionales 2 y transicionales 3 (de arriba a abajo) expresan IL-10 y que el número de células de los subconjuntos de células B que expresan IL-10 aumenta con metotrexato en comparación con los ratones tratados con rhGAA sola.

Las figs. 43A-C muestran que las células B foliculares, transicionales 2 y transicionales 3 (de arriba a abajo) expresan TGF-beta y que el número de células de los subconjuntos de células B que expresan TGF-beta aumenta con metotrexato en comparación con los ratones tratados con rhGAA sola.

Las figs. 44A-C muestran que las células B foliculares, transicionales 2 y transicionales 3 (de arriba a abajo) expresan FoxP3 y que el número de células de los subconjuntos de células B que expresan FoxP3 aumenta con metotrexato en comparación con los ratones tratados con rhGAA sola.

La fig. 45 muestra títulos anti-rhGAA la semana 6 en animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato, en presencia o ausencia de 5 mg/kg de anticuerpo anti-TGF-beta (1D11, Genzyme) o el control de isotipo (13C4). Los títulos de anticuerpos se evaluaron cada dos semanas en los cuatro grupos diferentes de animales.

Las figs. 46A-C muestran que el tratamiento con 1D11 interfería con la expansión inducida por metotrexato de las células B B10 que expresan TGF-beta, IL-10 o FoxP3. Se aislaron bazos de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato a los que también se coadministró 1D11 o 13C4 siete días después de un solo tratamiento con rhGAA o un solo tratamiento con rhGAA y metotrexato. Las células de cada grupo después se combinaron y cultivaron durante dos días y después se contaron usando citometría de flujo.

Las figs. 47A-C muestran que el tratamiento con 1D11 interfería con la expansión inducida por metotrexato de las células B foliculares que expresaban TGF-beta o IL-10, aunque las células B foliculares FoxP3+ no parecían experimentar los efectos de 1D11. Se aislaron bazos de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato a los que también se coadministró 1D11 o 13C4 siete días después de un solo tratamiento con rhGAA o un solo tratamiento con rhGAA y metotrexato. Las células de cada grupo se combinaron y cultivaron durante dos días y luego se contaron usando citometría de flujo.

Las figs. 48A-C muestran que en las células B transicionales 2 mientras que el tratamiento con 1D11 interfería con la expansión inducida por metotrexato de las células B transicionales 2 que expresan TGF-beta, no se observaron efectos en las células B transicionales 2 IL-10+. Se aislaron bazos de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato a los que también se coadministró 1D11 o 13C4 siete días después de un solo tratamiento con rhGAA o un solo tratamiento con rhGAA y metotrexato. Las células de cada grupo se combinaron y cultivaron durante dos días y después se contaron usando citometría de flujo.

Las figs. 49A-C muestran que en las células B transicionales 3 hay TGF-beta, IL-10 y FoxP3 detectables, pero ningún efecto aparente del tratamiento con 1D11 en las células. Se aislaron bazos de animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato a los que también se coadministró 1D11 o 13C4 siete días después de un solo tratamiento con rhGAA o un solo tratamiento con rhGAA y metotrexato, y las células se contaron usando citometría de flujo.

Las figs. 50A-C muestran que el tratamiento con 1D11 no afecta los niveles basales de IL-10, TGF-beta y FoxP3 en las células B foliculares, células B transicionales 2 y células B transicionales 3 (de arriba a abajo).

La fig. 51A es un esquema que muestra la transferencia de las células B esplénicas totales de un ratón hecho tolerante a rhGAA (Myozyme® o "MYO") a un ratón receptor sin tratamiento previo con rhGAA. Después de la transferencia, los receptores (junto con los animales de control que no recibieron transferencia tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato) se trataron semanalmente con 20 mg/kg de rhGAA.

La fig. 51B muestra un análisis de títulos que demuestra que las células B esplénicas totales aisladas de animales tratados con rhGAA y un solo ciclo de metotrexato pueden transferir inmunotolerancia a rhGAA a hospedantes que no han recibido tratamiento previo.

La fig. 52 representa recuentos de células de la sangre o el bazo de ratones normales tratados con IgG de conejo (rbIgG), mATG sola, rbIgG y metotrexato, o mATG y metotrexato. El metotrexato no agota las células T CD4+, CD8+, T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) ni las células B CD19+ totales en animales normales.

La fig. 53 representa recuentos de células de la sangre o el bazo de ratones trasplantados tratados con rbIgG, mATG sola, rbIgG y metotrexato, o mATG y metotrexato 14 días después del trasplante. El metotrexato no agota las células T CD4+, CD8+, T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) ni las células B CD19+ totales en los animales trasplantados.

La fig. 54 muestra que el tratamiento con metotrexato induce aumentos estadísticamente significativos en IL-10 en múltiples subconjuntos de células como se ve por un cambio en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de estas proteínas en animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato.

La fig. 55 muestra que el tratamiento con metotrexato induce aumentos estadísticamente significativos de TGF-beta en múltiples subconjuntos de células como se ve por un cambio en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de estas proteínas en animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato.

La fig. 56 muestra que el tratamiento con metotrexato induce aumentos estadísticamente significativos de FoxP3 en múltiples subconjuntos de células como se ve por un cambio en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de estas proteínas en animales tratados con rhGAA o rhGAA y metotrexato.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de los autores de la invención de que un solo ciclo o una serie corta de administración de metotrexato reduce las respuestas inmunitarias no deseadas (tales como las respuestas de ADA y otras respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o B no deseadas) en pacientes que reciben agentes terapéuticos de proteínas tales como enzimas de reemplazo o agentes terapéuticos de anticuerpos, y respuestas de anticuerpos anti-injerto en el trasplante de tejidos. Este descubrimiento conduce a nuevos métodos para aumentar tanto la seguridad como la eficacia de las terapias con proteínas y el trasplante de órganos.

Más específicamente, los estudios de los autores de la invención han demostrado que un solo ciclo de metotrexato reduce los ADA contra los agentes terapéuticos de anticuerpos. Como se detalla a continuación, se hizo un conjunto de estudios con una versión murina de un anticuerpo policlonal terapéutico, Timoglobulina®. La Timoglobulina® es un anticuerpo policlonal de conejo de globulina antitimocítica humana usado para la inmunosupresión en el contexto del trasplante de órganos sólidos, anemia aplásica y en la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped. Se ha desarrollado un anticuerpo policlonal de conejo de globulina antitimocítica murina (mATG). Mantiene características similares a la Timoglobulina® (Ruzek, et al., Transplantation, 88 (2): 170-9 (2009)). Los autores de la invención han demostrado que una sola serie de metotrexato puede reducir los títulos de IgG anti-mATG en >95%. De hecho, sorprendentemente han descubierto que un solo ciclo de metotrexato funciona mejor para reducir los ADA que tres ciclos de metotrexato. Además, esta reducción de ADA mantiene los niveles de mATG en la circulación y mejora el agotamiento de células mediado por mATG y los porcentajes de células T reguladoras tras la administración repetida de mATG. Otro conjunto de estudios de los autores de la invención se hizo con un agente terapéutico de anticuerpo monoclonal, alemtuzumab. Encontraron que una sola serie de metotrexato puede controlar de manera similar las respuestas anti-alemtuzumab y mejorar el agotamiento de linfocitos mediado por alemtuzumab.

Los autores de la invención han descubierto que este régimen de un solo ciclo de metotrexato también reduce los ADA cuando agente terapéutico de proteína es una enzima. En dos de sus estudios, demostraron que un solo ciclo de metotrexato podría controlar eficazmente las respuestas anti-Myozyme® (alglucosidasa alfa humana recombinante o "rhGAA") donde originalmente se pensaba que se requerían múltiples ciclos para reducir los ADA.

Los autores de la invención han descubierto que el metotrexato también es útil en el trasplante de órganos. En sus estudios, encontraron que un solo ciclo de metotrexato podría controlar las respuestas de anticuerpos anti-aloinjerto en el trasplante de aloinjerto de corazón. Cuando se combinaba con mATG, la supervivencia de un aloinjerto de corazón era significativamente más larga.

Los estudios de los autores de la invención muestran que un solo ciclo de metotrexato administrado dentro de la primera semana de una terapia de proteínas puede proporcionar una reducción de larga duración de más de 95% de los ADA a lo largo de muchos meses de dosificación. Esta reducción en los títulos de anticuerpos era de larga duración a pesar de la ausencia de metotrexato en la mayoría de los estudios. Además, han descubierto que un solo ciclo de metotrexato puede controlar las respuestas anti-aloinjerto (p. ej., en un modelo de trasplante de corazón alogénico murino), mostrando control sobre las respuestas de anticuerpos dirigidos hacia múltiples antígenos simultáneamente.

El metotrexato se conoce clásicamente como un antagonista de la dihidrofolato reductasa que se cree que mata las células en proliferación inhibiendo el metabolismo de las purinas e interfiriendo con la síntesis nueva de ADN (Kremer, Arthritis Rheum, 50 (5):1370-82 (2004)). Se podría suponer fácilmente que el metotrexato puede simplemente matar las células reactivas a través de este mecanismo bien descrito, pero esto parece poco probable con el régimen de un ciclo único que los autores de la invención han descubierto. El metotrexato tiene una semivida corta y no es probable que esté en las células o en la circulación el tiempo suficiente para matar las células de forma activa tres o cuatro meses después del tratamiento (Walling, Invest New Drugs, 24 (1):37-77 (2006); Slavikova et al., Neoplasma, 25 (2):211-6 (1978)). Además, no encontraron evidencia de agotamiento de linfocitos después del tratamiento con metotrexato. Más bien, descubrieron sorprendentemente que un régimen de un solo ciclo de metotrexato reduce las respuestas de anticuerpos no deseadas al inducir un mecanismo activo de control inmunitario, no agotando indiscriminadamente los linfocitos.

Los estudios de los autores de la invención muestran que un solo ciclo de metotrexato aumenta las células B reguladoras B10, así como las células B de la zona marginal activadas, células B foliculares activadas y células B transicionales 3 activadas. Sus estudios también muestran que un solo ciclo de metotrexato aumenta el número de células B B10, foliculares, transicionales y transicionales 2 que expresan IL-10, que expresan TGF-beta y que expresan FoxP3, y que esta expansión es mediada por TGF-beta. Estos estudios también muestran que el metotrexato aumenta los niveles de expresión de IL-10, TGF-beta y FoxP3. La expansión de las poblaciones de células B esplénicas es sorprendente dada la comprensión actual del mecanismo de acción del metotrexato y sugiere que en este paradigma de administración, el metotrexato está funcionando de una manera única y previamente desconocida. Se ha mostrado que las dosis continuas, bajas, de metotrexato en pacientes con artritis reumatoide tratados con infliximab reducen las respuestas de anticuerpos anti-infliximab; sin embargo, dado que la exposición es continua, es más probable que este régimen implique inmunosupresión constante, en lugar de inducción de tolerancia. Se ha mostrado que el tratamiento con metotrexato solo reduce la actividad de la enfermedad en la artritis reumatoide cuando se administra semanalmente en dosis bajas. Una publicación reciente sugiere que tras la administración continua de metotrexato en dosis bajas (cada dos días), aparecen células reguladoras T específicas de autoantígeno, que pueden ayudar a explicar la eficacia del tratamiento con metotrexato en la artritis reumatoide (Xinqiang et al., Biomed Pharmacother, 64 (7):463-471 (2010)). Por el contrario, el paradigma de dosificación descrito en el presente documento para el metotrexato es verdaderamente único en cuanto que implica una serie corta de tratamiento con metotrexato que puede proporcionar un control de larga duración de respuestas inmunológicas no deseadas.

En conjunto, los autores de la invención han identificado una pauta posológica única de metotrexato que puede producir un control de larga duración sobre varios tipos diferentes de respuestas de ADA y respuestas de anticuerpos anti-aloinjerto en el trasplante de tejido, así como las respuestas de células T y células B. Han descubierto que la inmunotolerancia desarrollada por el metotrexato puede ser transferida de un animal a otro, por ejemplo, trasplantando células B de un animal con tolerancia a un animal sin tolerancia. Sus datos sugieren que el metotrexato actúa a través de un mecanismo de acción único que implica la expansión de subconjuntos de células B activadas que pueden representar células B reguladoras activas en la supresión de respuestas inmunitarias. Además, el metotrexato también puede actuar a través de un mecanismo de expansión de células T reguladoras.

Respuestas inmunitarias no deseadas en bioterapia

Los métodos de esta invención pueden controlar respuestas inmunológicas no deseadas (p. ej., respuestas de ADA y otras respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o B no deseadas) en una variedad de terapias biológicas (p. ej., terapia que usa un producto biológico tal como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y metabolitos). La terapia con proteínas se refiere a una terapia en la que el agente terapéutico es una sustancia proteínica, incluyendo péptidos y proteínas. Las proteínas terapéuticas pueden ser, por ejemplo, enzimas, citoquinas, factores de crecimiento, inmunomoduladores, trombolíticos, anticuerpos (incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales), fragmentos de anticuerpos o anticuerpos modificados (p. ej., Fab, F(ab')², Fv, Fd, scFv y dAb). Por ejemplo, se han desarrollado muchas terapias de reemplazo de enzimas para pacientes con ciertas enfermedades genéticas, que incluyen Fabrazyme® (alfa-galactosidasa humana recombinante) para la enfermedad de Fabry, Cerezyme® (imiglucerasa) para la enfermedad de Gaucher, Aldurazyme® (laronidasa) para la mucopolisacaridosis I (MPS I) y Myozyme® y Lumizyme® (alglucosidasa alfa) para la enfermedad de Pompe. Ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen Campath® (alemtuzumab), Timoglobulina®, Avastin® (bevacizumab), Lucentis® (ranibizumab), Remicade® (infliximab), Humira® (adalimumab), Rituxan® (rituximab), Tysabri® (natalizumab), Simulect® (basiliximab), Zenapax® (daclizumab), OKT3® (muromonab-CD3), Erbitux® (Cetuximab), Mylotarg® (gemtuzumab), Herceptin® (trastuzumab), y Benlysta® (belimumab). Ejemplos de otras proteínas terapéuticas incluyen Enbrel® (etanercep),

En muchos casos, se pueden generar respuestas inmunitarias no deseadas en un paciente contra el agente terapéutico de proteína, causando efectos variables sobre el resultado del paciente. Dichas respuestas se producen porque los agentes terapéuticos biológicos a menudo contienen secuencias y conformaciones que son extrañas para un paciente humano. Por ejemplo, los ADA interfieren con la eficacia terapéutica y/o aumenta los riesgos de seguridad. Los ADA pueden causar reacciones de hipersensibilidad, anafilaxia, enfermedad del suero, enfermedad por inmunocomplejos, insuficiencia renal aguda. Un médico puede controlar los ADA en pacientes que reciben terapia de proteínas usando métodos bien establecidos, que incluyen ELISA e inmunohistoquímica.

En algunos casos, una "terapia de proteínas" como se usa en el presente documento se refiere a una terapia viral donde se usa un vector viral para suministrar un agente terapéutico de ácido nucleico. Los virus de ejemplo usados en dichas terapias incluyen, pero no se limitan a adenovirus, virus adenoasociados y retrovirus. Se pueden desarrollar anticuerpos contra las proteínas de la cápside del virus, reduciendo la eficacia y aumentando los riesgos de seguridad de dichas terapias. Los métodos de esta invención son útiles para controlar respuestas inmunológicas no deseadas (p. ej., respuestas de ADA y otras respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o B no deseadas) también en terapias virales.

Los métodos de esta invención también pueden controlar respuestas inmunológicas no deseadas en terapias biológicas no proteicas. Las bioterapias no proteicas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a terapias de ácidos nucleicos (p. ej., terapias antisentido, terapias de ARNip y terapias de miARN).

Respuesta anti-injerto en trasplante

Los métodos de esta invención también se pueden usar para inducir inmunotolerancia en un paciente que recibe un trasplante de tejido, tal como trasplante renal, trasplante de hígado, trasplante de corazón y trasplante de células madre. Los rechazos de huésped contra injerto e injerto contra huésped ocurren a menudo en el trasplante de tejido, especialmente el trasplante de aloinjerto y xenoinjerto. Se puede usar un ciclo único de metotrexato solo o junto con otro agente inmunomodulador (p.ej., un inmunosupresor tal como Timoglobulina®) para controlar la respuesta de anticuerpos anti-injerto. Además, la combinación de Timoglobulina® y metotrexato en el trasplante puede actuar para prolongar la supervivencia del injerto. Finalmente, en un caso en el que la Timoglobulina® se investigue en el contexto de una enfermedad autoinmunitaria crónica tal como la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple, el metotrexato puede permitir el tratamiento de nuevo más seguro de Timoglobulina®, protegiendo al paciente del desarrollo de anticuerpos anti-conejo significativos (tales como como IgG y/o IgM) y/o reacciones relacionadas con la infusión.

Gestión de respuestas inmunológicas no deseadas con metotrexato

Los autores de la invención han descubierto que un solo ciclo corto de metotrexato puede reducir significativamente las respuestas inmunológicas no deseadas tales como ADA en sujetos que reciben agentes terapéuticos biológicos (p. ej., agentes terapéuticos de proteínas) y respuestas anti-aloinjerto en pacientes que reciben trasplante de tejido. La reducción de ADA no deseados no solo puede mejorar la seguridad del paciente, sino que también puede mejorar la eficacia de un agente terapéutico de proteína mejorando la farmacodinamia y/o farmacocinética del agente terapéutico de proteína.

El metotrexato, un compuesto de molécula pequeña, se ha usado para tratar pacientes con artritis reumatoide activa grave, psoriasis grave y ciertos tipos de cáncer, que incluyen cánceres que comienzan en los tejidos que se forman alrededor de un óvulo fertilizado en el útero, cáncer de mama, cáncer de pulmón, ciertos cánceres de cabeza y cuello, ciertos tipos de linfoma y leucemia (cáncer que comienza en los glóbulos blancos). El metotrexato trata el cáncer ralentizando el crecimiento de las células cancerosas. El metotrexato trata la psoriasis ralentizando el crecimiento de células de la piel para detener la formación de escamas. El metotrexato puede tratar la artritis reumatoide disminuyendo la actividad del sistema inmunitario.

El metotrexato se ha estudiado en el contexto del control de las respuestas de ADA producidas contra la agalactosidasa A y la a-glucosidasa. Sin embargo, esos estudios se hicieron con múltiples ciclos de tratamiento con metotrexato (Garman et al. Clin Exp Immunol, 137 (3): 496-502 (2004); Joseph et al., Clin Exp Immunol, 152 (1): 138­ 46 (2008); Mendelsohn et al., N Engl J Med, 360 (2): 194-5 (2009)), en lugar de un solo ciclo de metotrexato.

Los estudios de los autores de la invención muestran sorprendentemente que un solo ciclo de metotrexato es suficiente para reducir significativamente los ADA y los anticuerpos anti-aloinjerto. De hecho, en estudios que implican agentes terapéuticos de anticuerpos (p. ej., mATG), mostraron que el tratamiento de un solo ciclo de metotrexato es más eficaz para reducir los ADA que el tratamiento de múltiples ciclos de metotrexato. Los estudios previos que usaron metotrexato no dieron ninguna indicación de que un solo ciclo de metotrexato sería suficiente para reducir los ADA, y mucho menos que sería más efectivo que el tratamiento de ciclos múltiples. Se sabe que el metotrexato es citotóxico. Por lo tanto, si se hubiera planteado la hipótesis de que un mecanismo para la reducción de ADA por el metotrexato dependía de esta propiedad, entonces se habría predicho que la reducción del número de ciclos de tratamiento reduciría los efectos beneficiosos del metotrexato. Además, los estudios publicados previamente no demuestran los beneficios del tratamiento con metotrexato sobre la farmacocinética, farmacodinamia, eficacia o seguridad, como se ha demostrado sorprendentemente en el presente documento con una sola serie de metotrexato. Tampoco describen que el metotrexato pueda reducir los ADA en la terapia con anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, un régimen de un solo ciclo se refiere a un régimen de tratamiento, o una unidad de tratamiento, de días consecutivos o no consecutivos y se inicia preferiblemente no más de cinco (p. ej., no más de tres) días después de la administración del agente terapéutico de proteína terapéutica o el trasplante. Si el agente terapéutico de proteína principal se administra en múltiples períodos, un solo ciclo de tratamiento de metotrexato preferiblemente no se extiende más allá del primer período de administración del agente terapéutico de proteína. A modo de ejemplo, en una terapia de proteína semanal, mensual o anual, un solo ciclo de metotrexato consiste en tres días consecutivos de ingesta de metotrexato (p. ej., vía oral), comenzando el día 0, el día en que se administra el agente terapéutico de proteína principal al paciente por primera vez, o cuando el paciente recibe un trasplante de tejido. Después el paciente recibe una sola dosis de metotrexato el día 1 (24 horas después) y el día 2 (48 horas después). Un solo ciclo de metotrexato también puede consistir en, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dosis diarias consecutivas de metotrexato, comenzando el día 0. El metotrexato también puede administrarse en otros momentos según se considere adecuado, p. ej., cuando se gestiona la autoinmunidad secundaria en, p. ej., una terapia de agotamiento de linfocitos. Un solo ciclo de metotrexato preferiblemente no dura más de 8 días. En la invención, un solo ciclo de metotrexato comienza entre 48 horas antes y 48 horas después del inicio del tratamiento terapéutico principal (es decir, el tratamiento con el agente terapéutico biológico). Por ejemplo, un solo ciclo de metotrexato puede comenzar 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, simultáneamente con, 12 horas después, 24 horas después, 36 horas después o 48 horas después, del inicio del tratamiento terapéutico principal.

Los estudios de los autores de la invención también muestran sorprendentemente que una dosis baja de metotrexato es suficiente para gestionar respuestas inmunológicas no deseadas (p. ej., respuestas de ADA y otras respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o B no deseadas) en terapias de proteínas y trasplantes. Por consiguiente, se describe que el metotrexato se puede administrar en más de un ciclo, pero a una dosis total baja. Por ejemplo, el metotrexato se puede administrar en dos o más (p. ej., 3, 4, 5, 6, etc.) ciclos, pero con una dosis combinada total de no más de 5 mg/kg en un paciente.

La dosis de metotrexato será una cantidad eficaz de metotrexato para reducir las respuestas inmunológicas no deseadas, tales como respuestas de anticuerpos o celulares, cuando se administra en un solo ciclo. Una cantidad eficaz de metotrexato en pacientes humanos puede estar en el intervalo de 0,05 mg/kg a 5 mg/kg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es de 0,1 mg/kg a 1,5 mg/kg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es de 0,12 mg/kg a 1,28 mg/kg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es 0,12 mg/kg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es 1,28 mg/kg. La dosis recomendada de metotrexato puede presentar riesgos de seguridad mínimos porque la pauta posológica implica solo una serie breve de metotrexato con niveles de dosis que son más similares a las dosis para la artritis reumatoide que a las dosis neoplásicas bajas. En los estudios de los autores de la invención, la cantidad total de metotrexato ensayada en cada ciclo en ratones era de 14 o 15 mg/kg. 14 mg/kg de metotrexato en ratones equivalen aproximadamente a 68 mg o 5,92 mg/m2 en un adulto medio que pesa 60 kg. Los pacientes con artritis reumatoide pueden recibir hasta 25 mg de metotrexato por semana sin sufrir toxicidades importantes. Se considera que la dosis neoplásica baja de metotrexato es de 30 mg/m2, significativamente mayor que 5,92 mg/m2. Por lo tanto, es probable que las dosis recomendadas antes, combinadas con la naturaleza transitoria de este régimen de metotrexato, sean bien toleradas en adultos. Por supuesto, un médico debe establecer la dosis y régimen exactos de metotrexato, teniendo en cuenta el estado físico, edad, peso, sexo del paciente, otros medicamentos que esté tomando y sus efectos secundarios conocidos, y cualquier otro factor relevante. El efecto del metotrexato en la gestión de respuestas de anticuerpos no deseadas en el paciente se puede controlar por métodos bien conocidos, que incluyen el examen clínico del paciente, síntomas, análisis de sangre que analizan títulos de ADA o anticuerpos anti-aloinjerto, ensayos inmunohistoquímicos (p. ej., ensayos de deposición de C4 y otros métodos de detección de anticuerpos en fase sólida, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y ensayos fluorométricos basados en perlas). El efecto también se puede controlar midiendo los niveles de biomarcadores tales como MCP-1, IL-13, IL-6 e IL-12, cuyo nivel se ha mostrado que se reduce con el tratamiento de metotrexato, y células B transicionales 2, células B transicionales 3, células B foliculares, células B de la zona marginal, células B B10 y células B B1, que se ha mostrado que aumentan en número por el tratamiento de metotrexato. Además, se pueden usar TGF-beta, FoxP3, IL-5, IL-10, IL-15 y GM-CSF como biomarcadores para controlar los efectos del metotrexato en las respuestas inmunitarias no deseadas según sea necesario. Los niveles de biomarcadores también se pueden usar para controlar los efectos del metotrexato en la respuesta de las células T para un agente terapéutico (p. ej., un agente terapéutico de proteína). Los biomarcadores para la activación de las células T, tal como IL-2, interferón-g y TNF-a, también se pueden controlar como lecturas del efecto del metotrexato en las respuestas de células T.

Debido a su capacidad para controlar respuestas inmunitarias no deseadas, el régimen de metotrexato de un solo ciclo de esta invención puede expandir el uso de muchos agente terapéutico de proteínas cuyos usos repetidos en un paciente dado se han limitado en el pasado debido a problemas de seguridad y eficacia. Por ejemplo, el uso concomitante de metotrexato con Timoglobulina® puede ampliar la utilidad de la Timoglobulina® a otros entornos de enfermedad donde se desea la dosificación de nuevo, tales como enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T que incluyen, pero no se limitan a diabetes, lupus, esclerodermia, artritis reumatoide, psoriasis y esclerosis múltiple. Además, el metotrexato puede ampliar la eficacia y seguridad de alemtuzumab, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple, en donde el alemtuzumab se administra habitualmente en ciclos anuales repetidos, o en la leucemia linfocítica crónica de células B, en donde el alemtuzumab se administra en un ciclo de 12 semanas, empezando la administración con 3 mg/día (hasta que las reacciones a la infusión son iguales o menores que el grado 2), después escalando hasta 10 mg/día (hasta que las reacciones a la infusión son iguales o menores que el grado 2), y finalmente moviéndose hasta 30 mg/día (en días alternos, 3 veces por semana). Estos tipos de pautas posológicas pueden potenciar las respuestas inhibidoras de ADA. Por tanto, el metotrexato se puede usar para controlar los ADA y cualquier otra respuesta inmunitaria no deseada.

Mejora de la terapia de agotamiento de linfocitos con metotrexato

Una aplicación de ejemplo de esta invención es usar metotrexato para mejorar la terapia de agotamiento de linfocitos tal como la terapia con alemtuzumab en el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM), tal como la EM remitenterecurrente. El "agotamiento de linfocitos" es un tipo de inmunosupresión por reducción de linfocitos en la circulación, p. ej., células T y/o células B, dando como resultado linfopenia. Terapéuticamente, el agotamiento de linfocitos se puede lograr mediante una proteína terapéutica tal como Timoglobulina®, anticuerpo monoclonal anti-CD52 humanizado CAMPATH-1H® (alemtuzumab) y rituximab. Se desea el agotamiento de linfocitos en el tratamiento de una serie de afecciones autoinmunitarias, que incluyen la esclerosis múltiple (Coles et al., Ann. Neurol. 46, 296-304 (1999); Coles et al., 2008), artritis reumatoide, vasculitis y lupus.

La terapia de agotamiento de linfocitos puede causar autoinmunidad secundaria. La autoinmunidad se denomina en el presente documento "autoinmunidad secundaria" cuando surge después del inicio de una primera enfermedad ("primaria"), por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria "primaria". La autoinmunidad secundaria a veces surge en pacientes con EM que tienen o han tenido linfopenia después, p. ej., de una terapia de agotamiento de linfocitos. En algunas personas, la autoinmunidad secundaria surge poco después de la terapia de agotamiento de linfocitos (p. ej., tratamiento con alemtuzumab). En otros individuos, la autoinmunidad secundaria puede no surgir hasta meses o años después de la terapia de agotamiento de linfocitos; en algunos de esos individuos, para cuando desarrollan inmunidad secundaria, se puede haber producido una recuperación sustancial de linfocitos (recuento total de linfocitos) de modo que es posible que ya no sean linfopénicos. El agotamiento de linfocitos puede ocurrir en el contexto del tratamiento con agentes terapéuticos de anticuerpos o agente terapéutico de moléculas pequeñas.

La autoinmunidad secundaria que surge en pacientes con EM linfopénica puede ser cualquier tipo de enfermedad autoinmunitaria distinta de la EM, que incluye, pero no se limita a autoinmunidad tiroidea (p. ej., enfermedad de Graves), púrpura trombocitopénica, trombocitopenia inmune (ITP), enfermedad de Goodpasture, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune y linfopenia autoinmune. En algunas realizaciones, la autoinmunidad secundaria es mediada por células B, es decir, las respuestas de las células B y autoanticuerpos están directamente relacionados con el desarrollo de la enfermedad y la patología.

Las técnicas para diagnosticar y vigilar estas enfermedades autoinmunitarias son bien conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo la evaluación de los síntomas y examen médico tal como el análisis de sangre. La invención contempla el uso de cualquier método conocido. Por ejemplo, se pueden determinar los niveles de autoanticuerpos en un líquido corporal de un paciente (p. ej., sangre) como un medio para detectar signos de autoinmunidad. Específicamente, se pueden medir anticuerpos antinucleares, anticuerpos antimúsculo liso y anticuerpos antimitocondriales. En el caso de que se detecten anticuerpos antinucleares, se pueden realizar ensayos adicionales para medir anticuerpos anti-ADN bicatenario, anticuerpos anti-ribonucleoproteína y anticuerpos anti-La. Se pueden medir los anticuerpos antiperoxidasa tiroidea (TPO) y anti-receptor de hormona estimulante de tiroides (TSH) para detectar enfermedades tiroideas autoinmunitarias; si se detectan anticuerpos anti-TPO o anti-receptor de TSH, se puede medir si la función tiroidea está afectada midiendo los niveles de T3 libre, T4 libre y TSH. Se pueden medir los anticuerpos antiplaquetarios para detectar trombocitopenia autoinmune, y una medición de los niveles de plaquetas en sangre puede servir para determinar si la presencia de anticuerpos antiplaquetarios está provocando una reducción en el número de plaquetas. Véase también el documento WO 2010/041149.

El régimen de metotrexato de un solo ciclo de esta invención se puede usar para mejorar la seguridad y eficacia de la terapia de agotamiento de linfocitos reduciendo los ADA así como minimizando la autoinmunidad secundaria. Sin desear estar ligado a la teoría, se cree que el metotrexato puede reducir la autoinmunidad secundaria haciendo que se toleren múltiples autoantígenos simultáneamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. A continuación se describen métodos y materiales de ejemplo, aunque también se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan en su totalidad por referencia. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Aunque en el presente documento se citan una serie de documentos, esta cita no constituye una admisión de que alguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica. A lo largo de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, la palabra "comprender" o variaciones como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros expuestos pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos

Se describirán más detalles de la invención en los siguientes ejemplos no limitantes. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración, y no deben interpretarse como limitantes de las realizaciones adjuntas. A partir de la presente descripción y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar ciertas características de esta invención, y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Los materiales y métodos usados en estos ejemplos de trabajo se describen a continuación.

Ratones

Se usaron ratones C57BL/6 hembra normales de entre 6 y 12 semanas de edad para los estudios in vivo del anticuerpo policlonal de conejo de globulina antitimocítica murina (mATG) y se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) o Taconic Laboratories (Hudson, NY). Los estudios relacionados con alemtuzumab emplearon ratones transgénicos (Tg) con CD52 humano (huCD52) de entre 6 y 12 semanas de edad que se obtuvieron de Charles River Laboratories/Genzyme Corp. Los ratones se alojaron y mantuvieron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y bajo la acreditación de la Asociación norteamericana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio I y todos los protocolos de animales usados en estos estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

El ratón Tg huCD52 usado para estudios de farmacología no clínica fue generado por Xenogen (Cranbury, NJ, EE.UU.). Para generar el ratón, se integró aleatoriamente una construcción de bácmido que contenía aproximadamente 145 kilobases de ADN genómico del cromosoma 1 humano en el genoma de ratón de células madre embrionarias CD-1. Debido a la extensión de ADN genómico humano que contenía este bácmido, la construcción incluía un total de 5 genes parciales o completos de función desconocida además del de CD52 humano. Los 5 segmentos de genes parciales o completos contenidos en el bácmido eran los siguientes: el gen de CD52 humano, el extremo 3' de un gen nuevo (DKFZP434L0117), el gen SH3BGRL3 (dominio SH3 que une la proteína rica en ácido glutámico de tipo 3), el gen para socius (SOC), el gen AIM1L (ausente en el melanoma tipo 1) y el gen 683 de la proteína de dedos de zinc. Se generaron tres líneas fundadoras y la línea 107 se estableció en Genzyme.

Administración de anticuerpos

Los anticuerpos policlonales mATG y rbIgG se prepararon como se describe en Ruzek et al., Transplantation, 88 (2):170-9 (2009), y se administraron por inyección intraperitoneal en varios regímenes dependiendo del experimento. El anticuerpo monoclonal alemtuzumab se administró por vía intravenosa como una sola inyección de 0,5 mg/kg o en un ciclo de tres o cinco días de 0,5 mg/kg/día.

Tratamiento de Myozyme®

Se usó alglucosidasa alfa humana recombinante (rhGAA, comercializada por Genzyme Corp. como Myozyme®) como producto farmacéutico formulado. Los ratones se trataron semanalmente con 20 mg/kg de rhGAA por inyección de bolo en la vena de la cola, a menos que se indique lo contrario. Todos los ratones se trataron profilácticamente con 5 a 30 mg/kg de difenhidramina (Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) por vía intraperitoneal antes de la administración de rhGAA. Los animales de control se trataron por vía intravenosa con solución salina al 0,9% estéril o tampón de formulación rhGAA.

Tratamiento de metotrexato

Se administró metotrexato (Calbiochem n° de catálogo 454125) en 0,5, 1,0, 2,0 o 5 mg/kg por inyección intraperitoneal durante 1-3 ciclos, donde cada ciclo equivale a tres, seis o siete días consecutivos de inyección, dependiendo del experimento. En los estudios que incluían un tratamiento mensual con mATG, se administró metotrexato por vía intraperitoneal en 5 mg/kg a las 0, 24 y 48 horas después del tratamiento inicial de mATG o de los tres primeros tratamientos de mATG. En estudios de trasplante donde se administró mATG los días 0 y 4, el metotrexato se administró diariamente con 2 mg/kg desde los días 0 a 6, diariamente con 0,5 mg/kg desde los días 0 a 6, o diariamente con 0,5 mg/kg desde los días 0 a 11.

Tratamiento de mATG

El anticuerpo policlonal mATG se administró como una inyección intraperitoneal de 5 mg/kg cada cuatro semanas o como dos dosis de 20 mg/kg administradas con cuatro días de diferencia en el contexto del trasplante con la primera dosis administrada el día del trasplante (día 0).

Preparaciones celulares de diversos tejidos.

Para preparaciones de células de esplenocitos y ganglios linfáticos, se generaron suspensiones de células individuales a partir de bazos o ganglios linfáticos inguinales y mesentéricos de ratón recogidos, por homogeneización entre portaobjetos de vidrio esmerilado en PBS que contenía FCS al 2%. Para las preparaciones de esplenocitos, los glóbulos rojos se lisaron por incubación de 1-2 minutos con una solución de lisis de glóbulos rojos (BD Biosciences, San Diego, CA). La sangre se aisló por extracción de sangre retroorbital y las preparaciones celulares se realizaron por lisis de los glóbulos rojos con solución de lisis de glóbulos rojos (BD Biosciences) durante 20-30 minutos. Para todas las preparaciones de tejido, las células vivas se contaron usando el contador automático ViCell (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Después del aislamiento, todas las preparaciones de células se lavaron con PBS/FCS al 2% antes de su uso en los ensayos descritos a continuación.

Citometría de flujo

Para la evaluación de poblaciones celulares dentro de diferentes tejidos, se incubaron suspensiones de células individuales de los tejidos con anticuerpos conjugados con fluorocromo que incluían anti-CD4, CD8, CD25, CD44, CD62L de ratón (todos los anticuerpos de BD Biosciences o eBioscience, San Diego, CA). El análisis de expresión de Foxp3 intracelular se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante para anti-Foxp3 (eBiosciences, San Diego, CA). Después de la incubación con los anticuerpos, las células se lavaron y analizaron por citometría de flujo (FACSCanto, b D Biosciences y FCS Express, Software De Novo, Los Ángeles, CA).

Las poblaciones de células evaluadas se definieron como sigue:

CD4 totales T : CD4+CD8-,

células T CD8 totales: CD8+CD4-,

células CD4 naive: CD4+CD25-CD62L+CD44-,

células de memoria CD4: CD4+CD25-CD62L-CD44+,

células T CD8 naive: CD8+CD44-CD62L+,

células de memoria CD8: CD8+CD44+CD62L-,

células T reguladoras: CD4+CD25+Foxp3+,

células B totales: CD19+,

células B B2/foliculares: CD19+CD21intCD23hi,

células B B1: CD19+CD43+CD11 b+,

células B transicionales 1: CD19+CD93+CD23-IgMhi,

células B transicionales 2: CD19+CD93+CD23+IgMhi,

células B transicionales 3: CD19+CD93+CD23+IgMto

células B de la zona marginal: CD19+CD21hiCD23lC), y

células B B10: CD19+CD5+CD1d+.

Los estudios de bloqueo in vitro determinaron que hasta 100 qg/ml de mATG no impedían la detección de estas poblaciones.

ELISA de IgG anti-mATG

Los niveles de IgG anti-mATG en suero de ratón se analizaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) durante la noche con 1 qg/ml de IgG de conejo en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después del bloqueo con tampón de bloqueo Super Block (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), se añadieron diluciones seriadas de suero por duplicado a placas recubiertas con IgG de conejo y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las placas se lavaron y se añadió anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EE.UU.) y se dejó incubar durante 1 h a 37°C. Después de un lavado final, se añadió el sustrato 3,3' 5,5'-tetrametilbencidina (BioFx, Owings Mills, MD, EE.UU.) y se dejó desarrollar durante 15 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por la adición de HCl 1 N y los valores de absorbancia se leyeron a 450/650 nm en un lector de placas de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los títulos de punto final se definieron como la dilución más baja que promedia por encima de una absorbancia de 0,100 usando el software ^{Softmax (Molecular Devices, Sunnyvale,} Ca, ^EE.UU.).

ELISA de IgG específica de mATG

El suero de ratón se determinó por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) durante la noche con 1 qg/ml de anticuerpo de cabra anti-fragmento Fc-IgG de conejo (Bethyl Laboratories, TX, EE.UU.). Después del bloqueo con BSA al 0,5% (alta pureza), los controles de referencia y las muestras de suero se diluyeron según fuera necesario y se añadieron por duplicado a los pocillos de las placas recubiertas y se incubaron a 36-38°C durante 1 hora con agitación suave. Las placas se lavaron y se añadió anticuerpo de cabra anti-fragmento Fc-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, TX, EE.UU.) según fuera adecuado y se incubó durante 1 hora a 36-38°C con agitación suave. Después de un lavado final, se añadió el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFx, Owings Mills, MD, EE.UU.) y se dejó que se desarrollara durante 15 min a 23-25°C. La reacción se detuvo añadiendo HCl 1 N y se leyeron los valores de absorbancia a 450/650 nm en un lector de placas ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Las concentraciones finales se interpolaron de la curva de referencia. Se predeterminó que a la medición de IgG específica de mATG por este método le afectaban solo modestamente los títulos de IgG anti-mATG que eran mayores que 218.000.

ELISA de IgG anti-alemtuzumab

Se extrajo sangre de los ratones 4-6 días después del tratamiento con alemtuzumab y se midió la IgG antialemtuzumab específica por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) durante la noche con 3 qg/ml de alemtuzumab en PBS (pH 7,2). Después del bloqueo con BSA al 0,1% en PBS, se añadieron diluciones seriadas de suero por duplicado a placas recubiertas con alemtuzumab y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las placas se lavaron y se añadió anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EE.UU.) y se dejó incubar ^{durante 1 h a 37°C. Después de un lavado final, se añadió el sustrato TMB (BioFx, Owings Mills,} Md, ^{EE.UU.) y se} dejó que se desarrollara durante 15 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de HCl 1 N y los valores de absorbancia se leyeron a 450/650 nm en un lector de placas ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los títulos de punto final se definieron como el antilogaritmo de la dilución de muestra transformada logarítmicamente interpolada a un valor de absorbancia de 0,2 usando el software Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.).

ELISA de IgG anti-rhGAA

Se extrajo sangre de los ratones 4-6 días después del tratamiento con rhGAA y se midió la IgG específica por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocilios (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) durante la noche con 5 gg/ml de rhGAA en tampón de acetato de sodio (pH 5,0). Después de bloqueo con BSA al 0,1% en PBS, se añadieron diluciones seriadas de suero por duplicado a placas recubiertas con rhGAA y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Las placas se lavaron y se añadió anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) y se dejó incubar durante 1 hora a 37°C. Después de un lavado final, se añadió el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB, KPL, Gaithersburg, MD) y se dejó que se desarrollara durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de HCl 1 N y se leyeron los valores de absorbancia a 450/650 nm en un lector de placas de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los títulos de punto final se definieron como el recíproco de la dilución de muestra que da como resultado un valor de absorbancia de 0,2 usando el software Softmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Estudios ex vivo

Ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories) o E4GAAKO (Charles River) de 8-12 semanas de edad recibieron 5 mg/kg de metotrexato (Calbiochem n° de catálogo 454125) por inyección intraperitoneal durante 1-3 ciclos, donde 1 ciclo equivale a 3 días consecutivos de inyección. Se administraron 20 mg/kg de Myozyme® (Genzyme Corporation) por inyección en la vena de la cola una vez o 2-6 dosis semanales, comenzando con la primera dosis de metotrexato. Los animales se sacrificaron semanalmente o diariamente después del inicio del tratamiento. Se recogieron los bazos, ganglios linfáticos mesentéricos e inguinales para análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células T y B y se recogieron sueros para ensayos de ELISA. Los bazos se procesaron entre portaobjetos de vidrio y los glóbulos rojos (RBC) se lisaron con tampón de lisis comprado en BD Biosciences (n° de catálogo 555899) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ganglios linfáticos se procesaron entre portaobjetos de vidrio y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía suero de ternero fetal (FCS) al 2%. Las células se volvieron a suspender en 200 gl de PBS que contenía suero bovino fetal al 4% y 25 gg/ml de IgG de ratón total y se bloquearon durante 30 minutos a 4°C. Aproximadamente 3 millones de células de bazo y 1 millón de células de ganglios linfáticos se tiñeron con diferentes cócteles de anticuerpos y se analizaron con un muestreador de alto rendimiento (HTS) en un citómetro de flujo Becton Dickinson CANTOII. Se adquirieron al menos 100.000 eventos celulares dentro de la ventana (gate) de linfocitos. Los cócteles de anticuerpos anti-ratón consistían en PE-CD21/35 n° de catálogo 552957, FITC- n° de catálogo 553138, PE- CD138 n° de catálogo 553714, PE- CD127 n° de catálogo 552543, APC-Cy7-CD19 n° de catálogo 557655, FITC-CD43 n° de catálogo 553270, PE-Cy7-CD4 n° de catálogo 552775, FITC-CD3e n° de catálogo 553062, APC-CD11b n° de catálogo 553312, PE-Cy7-IgM n° de catálogo 552867, APC-Cy7-CD8 n° de catálogo 557654, PE-CD273 (PD-L2) n2 de catálogo 557796, APC-CD138 n2 de catálogo 558626, PE-Cy7-CD11b n2 de catálogo 552850, PE-CD93 (linaje B temprano) n° de catálogo 558039, APC-CD69 n° de catálogo 560689, Pe-Cy7-CD24 n° de catálogo 560536, FITC-CD1d n° de catálogo 553845, APC-CD5 n° de catálogo 550035, y Percp-Cy5-7AAD n° de catálogo 559925, todos adquiridos de BD Pharmingen. El kit de tinción intracelular FITC-FoxP3 se adquirió de eBioscience. Pacific Blue (PB) - CD25 n° de catálogo 102022, PB-CD23 n° de catálogo 101616 y PB-CD86 n° de catálogo 105022 se adquirieron de BioLegend. El análisis de los subconjuntos de linfocitos se realizó con el software FCS express versión 3 proporcionado por De Novo Software. Los porcentajes se generaron con la opción de procesamiento por lotes y los números absolutos se calcularon de acuerdo con los recuentos de células obtenidos. Los recuentos de células del bazo y ganglios linfáticos se obtuvieron con el analizador de viabilidad celular Beckman Coulter Vi-cell XR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis in vitro y de citoquinas

Se administró a ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories) o E4GAAKO (Charles River) de 8 a 12 semanas de edad 5 mg/kg de metotrexato (Calbiochem n° de catálogo 454125) por inyección intraperitoneal durante 1 ciclo (3 dosis diarias consecutivas) comenzando con el tratamiento con 20 mg/kg de rhGAA. Para los estudios 1D11, los animales se trataron con inyecciones intraperitoneales de 5 mg/kg de 1D11 o 13C4 (Genzyme Corporation) 3 veces por semana, cada dos días, comenzando con el tratamiento de rhGAA y metotrexato. Los animales se sacrificaron el día 6 o 7 después de iniciar rhGAA dependiendo de la cepa de ratón. Los bazos se prepararon en suspensión de células individuales y se cargaron en el instrumento RoboSep (STEMCELL Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se sometieron a selección negativa de células B. Las células B purificadas se sembraron con 500.000 células por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Costar n° de catálogo 3799) y se incubaron sin estimulación o con 10 gg/ml de LPS (Sigma n° de catálogo L5014) durante 48 horas a 37°C. Todos los pocillos recibieron monensina (BD Bioscience n° de catálogo 554724) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se dejó incubar las células durante al menos 4 horas a 37°C. Las muestras se transfirieron a pocillos con fondo en V (USA Scientific n° de catálogo 651201) y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las células se volvieron a suspender en 200 gl de PBS que contenía suero bovino fetal al 4% y 25 gg/ml de IgG de ratón total y se bloquearon durante 30 minutos a 4°C. Las placas se centrifugaron de nuevo y se volvieron a suspender en 90 gl de PBS/FCS al 2% con la adición de 10 gl de cóctel de anticuerpos como se ha descrito antes y se incubaron durante 20 minutos a 4°C con la adición de 5 gl de 7AAD durante los últimos 10 minutos del procedimiento de tinción. La adición de 100 gl de tampón a las muestras con centrifugado posterior se usó como lavado. Las muestras se pueden volver a suspender en tampón para análisis de superficie de proteína y adquisición inmediata o volver a suspender en Fix/Perm (eBioscience n° de catálogo 11-5773) para la tinción intracelular de IL-10 (BioLegend n° de catálogo 505008), TGF beta (BioLegend n° de catálogo 141404) y FoxP3 (eBioscience n° de catálogo 11-5773-82) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tinción de superficie adicional incluía anticuerpos para TGF-beta y Tim-1 (BioLegend n° de catálogo 119506). Todas las muestras se adquirieron y analizaron como se ha descrito antes.

Animales y modelo de aloinjerto cardiaco

Se obtuvieron ratones C57BL/6 y BALB/c de Charles River (Kingston, NY o Raleigh, NC) y se usaron en estos experimentos entre las 8 y 13 semanas de edad. Los ratones C57BL/6 alogénicos donantes se anestesiaron primero con una inyección intraperitoneal de ketamina (Fort Dodge Animal Health/Pfizer, Fort Dodge, IA) y xilazina (Lloyd, Shenandoah, IA) y se realizó una esternotomía mediana. El corazón del donante se perfundió lentamente en el sitio con 1 ml de solución de lactato de Ringer heparinizada fría (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) a través de la vena cava inferior y la aorta antes de ligar y dividir la vena cava superior y venas pulmonares. Luego se cortaron transversalmente la aorta ascendente y la arteria pulmonar, se extrajo el injerto del donante y el corazón se almacenó en solución salina helada hasta el injerto. Un ratón receptor (Balb/c) se anestesió y preparó de forma similar como se ha descrito antes para los ratones donantes, excepto que se abrió la cavidad abdominal. Usando un microscopio quirúrgico para ver la cavidad abdominal abierta, se aisló la aorta abdominal (AA) y la vena cava inferior (VCI). El corazón del donante se colocó en el abdomen del receptor (boca abajo) y los injertos se revascularizaron con anastomosis termino-laterales entre la arteria pulmonar del donante y la vena cava inferior del receptor, así como la aorta del donante y la aorta abdominal del receptor. Después de que se confirmó la hemostasia, el músculo abdominal se cerró con una sutura continua de Vicryl 5-O (Ethicon, Johnson & Johnson, Somerville, NJ) y la piel se cerró con una sutura continua de Ethilon 5-0 (Ethicon). Se realizó una evaluación y gestión convencionales del dolor postoperatorio. Los injertos se evaluaron mediante palpación 5-7 veces por semana durante los primeros 30 días, y luego 3-4 veces por semana hasta el final del estudio.

Los ratones C57B1/6 se trataron con una dosis intravenosa de 20 mg/kg de rhGAA (Genzyme Corporation), 3 dosis intraperitoneales consecutivas de 5 mg/kg de metotrexato (APP Pharmaceuticals, LLC) y 5 mg/kg de 1D11 o 13C4 (Genzyme Corporation) para 3 dosis cada dos días. El tratamiento con metotrexato, 1D11 y 13C4 comenzó con las inyecciones de rhGAA. Los bazos se recogieron 7 días después del inicio del tratamiento y se procesaron como se ha descrito antes para células B, cultivo y análisis de flujo. Además, los datos de los títulos de rhGAA se obtuvieron tratando animales como se ha descrito antes, con rhGAA administrado semanalmente durante 12 semanas, metotrexato administrado durante 1 o 3 ciclos, y 1D11 o 13C4 administrado 3 veces a la semana cada dos días durante 12 semanas. Se recolectaron muestras de suero cada 2 semanas para análisis ELISA.

Histopatología e inmunohistoquímica

Los injertos cardiacos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se dividieron en dos a lo largo del eje longitudinal para exponer los ventrículos derecho e izquierdo y el tracto de salida, y se procesaron de forma rutinaria para la inclusión en parafina. Se cortaron secciones de 5 micrómetros y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) o tricrómico de Masson. Las secciones seriadas también se inmunotiñeron como se describe a continuación. Cada sección teñida con H&E se evaluó cualitativamente para determinar varias características de la patología de rechazo del aloinjerto (p. ej., vasculitis, degeneración y necrosis miocárdica, miocarditis) usando un esquema de clasificación histológica.

La inmunohistoquímica se realizó usando un sistema de inmunotinción automático Bond-Max (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Para detectar células inmunopositivas dobles CD3 y Foxp3, las secciones de tejido del injerto se sometieron a doble inmunotinción con anticuerpos anti-CD3 y anti-Foxp3 usando el kit Bond Polymer Refine Detection y el kit Bond Polymer AP Red (Leica, Buffalo Grove, IL) siguiendo las pautas del fabricante. Brevemente, las secciones desparafinizadas de injertos insertados en parafina se sometieron a recuperación de epítopo inducida por calor (25 min a 99°C), se incubaron con bloque de proteína exenta de suero (Dako, Carpentaria, CA), anticuerpo monoclonal de conejo anti-CD3 (Lab Vision/Neo Marker), polímero conjugado con peroxidasa, bloque de peroxidasa y reactivo de detección de diamino-bencideno seguido de anticuerpo de rata anti-Foxp3 de ratón (eBioscience Inc., San Diego, CA) y después un anticuerpo de conejo anti-rata (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Después, los portaobjetos se incubaron con Bond Polymer AP y reactivo de detección rojo mezclado y finalmente se contratiñeron con hematoxilina. En los portaobjetos de control negativo, los anticuerpos primarios anti-CD3 y anti-Foxp3 se reemplazaron con IgG de conejo completa Chromepure (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) e IgG2a de rata (AbD Serotec, Raleigh, NC), respectivamente.

Niveles de aloanticuerpos séricos

Los niveles de aloanticuerpos en suero se determinaron incubando suero de ratones con trasplante cardiaco o normales en diluciones 1:50 con una línea de fibroblastos C57BL/6 transformada en SV40 (SVB6) seguido de la detección de anticuerpos unidos a fibroblastos (aloanticuerpos) usando IgG de conejo anti-ratón FITC (Dako, Carpinteria, CA) y por análisis de citometría de flujo. Las intensidades fluorescentes medias geométricas de los fibroblastos teñidos en suero se dividieron entre los fibroblastos teñidos de control de isotipo para normalizar los niveles de aloanticuerpos entre experimentos. La unión de los anticuerpos del suero a los fibroblastos alogénicos eran específicamente aloanticuerpos porque las mismas muestras de suero no se unieron a una línea de fibroblastos BALB/c transformada con SV40 (SVBalb) (datos no mostrados).

Modelo de ratón de transferencia adoptiva

Los ratones C57BL/6 se obtuvieron de Jackson Laboratories y se alojaron en condiciones específicas exentas de patógenos. A los ratones de control se les administró una única inyección intravenosa de rhGAA de 20 mg/kg. Se administró a los ratones hechos tolerantes una única inyección intravenosa de rhGAA de 20 mg/kg, además de tres inyecciones intraperitoneales de metotrexato diarias consecutivas de 0,5 mg. Los bazos se recogieron el día seis después de la inyección inicial de rhGAA, de ambos grupos de donantes, y se procesaron en suspensiones de células individuales agrupadas. Las células se lavaron y filtraron a través de un filtro de 0,22 pM. Después, las células se enriquecieron en células B usando un sistema de separación de células StemCell Technologies RoboSep y se volvieron a suspender para permitir una inyección intravenosa de 200 pl. Los grupos de receptores hechos tolerantes y no tolerantes recibieron una concentración de células alta de 10 x 106 o de células baja de 5 x 106 mediante inyecciones intravenosas. A los grupos de control se les administró rhGAA solamente, o rhGAA y metotrexato (un solo ciclo de tres inyecciones diarias consecutivas de MTX). Todos los grupos recibieron inyecciones intravenosas de 20 mg/kg de rhGAA semanalmente y se les extrajo sangre de forma retroorbital cada dos semanas durante 16 semanas en tubos separadores de suero Bd Vacutainer. El suero se separó y se almacenó por debajo de -20°C hasta que se usó para ELISA. Los títulos de anticuerpos anti-rhGAA se determinaron usando ELISA, se leyeron en un SpectraMax M2 y se calcularon usando Softmax para extrapolar el valor del título. Los archivos Softmax de datos brutos y las hojas de cálculo EXCEL que contienen información de control y títulos se almacenaron en servidores de red. Todos los gráficos y estadísticas se generaron usando el software GraphPad Prism.

Ejemplo 1: Los anticuerpos antifármaco se producen en respuesta a agentes terapéuticos de anticuerpos

El anticuerpo policlonal mATG se une a una variedad de tipos de células inmunitarias, incluyendo las células presentadoras de antígenos. Los datos de los autores de la invención muestran que una sola serie de mATG (dos dosis de 25 mg/kg dadas con tres días de separación, administradas por vía intraperitoneal) podría generar títulos de IgG anti-mATG tan altos como 100.000 (Fig. 1A) en ratones. Cuando se dieron como inyecciones mensuales sucesivas (5 mg/kg, cada 4 semanas), los títulos de anti-mATG aumentaron aún más con títulos de hasta 5X106 después de cinco inyecciones mensuales (Fig. 1B). Tanto para la serie única como para las inyecciones mensuales, se usó IgG de conejo (rbIgG) como control.

Como alemtuzumab no reacciona de forma cruzada con CD52 murino, los estudios preclínicos con alemtuzumab se deben hacer en ratones Tg huCD52 donde el patrón de expresión transgénica es similar a la expresión de CD52 en seres humanos. De manera similar a mATG, la administración intravenosa de alemtuzumab (0,5 mg/kg) provocó respuestas de ADA significativas en ratones Tg huCD52. Estas respuestas aumentaron a lo largo de los primeros cuatro tratamientos y después disminuyeron de manera que después de la quinta dosis de alemtuzumab, los ratones Tg huCD52 ya no generaban anticuerpos anti-alemtuzumab (Fig. 2). Esta falta de respuesta sugiere que se ha producido una tolerancia natural (Rosenberg et al., Blood, 93 (6): 2081-8 (1999)).

Los datos muestran que los títulos de ADA contra mATG en los ratones C57BL/6 y los títulos de ADA contra alemtuzumab en los ratones Tg huCD52 CD1 eran altos (> 100.000). Este nivel alto de inmunogenicidad puede atribuirse a la capacidad de la mATG y alemtuzumab para unirse a células presentadoras de antígeno, mejorando así el procesamiento y la presentación de antígenos para inducir respuestas inmunitarias contra ellos.

Ejemplo 2: El metotrexato controla las respuestas de IgG anti-mATG con un solo ciclo de administración

Se han descrito títulos de anticuerpos elevados después del tratamiento con Timoglobulina®, y se han descrito notificaciones de casos de enfermedad del suero, insuficiencia renal aguda y reacciones cardiovasculares en pacientes tratados con Timoglobulina® (Boothpur et al., véase antes; Lundquist et al., Liver Transpl, 13). (5):647-50 (2007); Busani et al., Minerva Anestesiol, 72 (4):243-8 (2006); Tanriover et al., Transplantation, 80 (2):279-81 (2005); Buchler et al., Clin Transplant, 17 (6):539-45 (2003)). Para determinar si el metotrexato podría reducir las respuestas anti-ATG y, por lo tanto, mitigar estos problemas de seguridad, se evaluó un régimen de tres días de metotrexato, administrado solamente como un ciclo único, como un medio para controlar las respuestas de IgG anti-mATG en ratones. Esto es distinto del régimen que se publicó previamente en el que solo se administraba un ciclo único de metotrexato con mATG en lugar de al menos tres ciclos que se administraron en el contexto de ERT. El metotrexato (Calbiochem n° de catálogo 454125) administrado por vía intraperitoneal en 5 mg/kg durante seis días consecutivos empezando en la primera de dos administraciones de mATG (25 mg/kg, con 3 días de separación) podría suprimir las respuestas de IgG anti-mATG durante al menos ocho semanas después del tratamiento en 95% cuando se comparan las áreas bajo las curvas de efecto (Fig. 3).

A continuación, se evaluó el efecto del metotrexato en los títulos anti-mATG después de cinco inyecciones mensuales de mATG de 5 mg/kg/inyección. Se realizaron inyecciones mensuales de tratamiento con mATG porque la repoblación de linfocitos está casi completa un mes después del tratamiento con mATG (Ruzek, véase antes). Las respuestas de anticuerpos antifármaco después se cuantificaron semanalmente durante 20 semanas de tratamientos mensuales. Durante este período, a pesar del agotamiento de células T CD4+ por la mATG, los títulos de anticuerpos alcanzaron hasta 5 millones (Fig. 1B). Es interesante que los animales que recibieron IgG de conejo no específica con el mismo nivel de dosis y pauta que mATG mostraron respuestas bajas de anti-IgG de conejo (Fig. 1B). Una posibilidad para la inmunogenicidad mejorada de la mATG puede ser la unión específica de mATG a células presentadoras de antígeno (APC) tales como células dendríticas foliculares, que cuando están en presencia de complemento pueden mejorar significativamente las respuestas de células B. También se evaluaron dos regímenes de tratamiento con metotrexato. En un trabajo previo con terapia de reemplazo enzimático (ERT), tres ciclos de metotrexato administrados durante las primeras tres dosis de alfa-glucosidasa ácida proporcionaron una reducción sostenida en el título de anticuerpos hasta al menos ocho meses de dosificación semanal de ERT (Joseph et al., Clin Exp Immunol, 152 (1):138-46 (2008)). Se evaluó una serie similar de metotrexato en el contexto de mATG donde se administraron 5 mg/kg de metotrexato en el espacio de 15 minutos de la administración de mATG, así como 24 y 48 horas después de cada uno de los primeros tres tratamientos mensuales de mATG. Este régimen disminuyó con éxito las respuestas de anticuerpos anti-mATG desde títulos de aproximadamente 4 millones a títulos de 816.000, dando una reducción de 79% comparando el área bajo las curvas de efecto (Fig. 4A).

Además, se evaluó el efecto de una sola serie de metotrexato administrada solo alrededor del primero de cinco tratamientos mensuales de mATG, en las respuestas de IgG anti-mATG y se comparó directamente con un régimen de tres ciclos. Sorprendentemente, este régimen de un solo ciclo redujo los títulos de IgG anti-mATG incluso más que el régimen de tres ciclos, a un título de aproximadamente 50.000 (Fig. 4B). Al comparar el área bajo las curvas de efecto, el régimen de un solo ciclo redujo los títulos de IgG anti-mATG en 98%, mientras que el régimen de tres ciclos redujo los títulos en 69% (Fig. 4C). Los efectos mayores del régimen de un solo ciclo frente al régimen de tres ciclos sugieren que el aumento de la exposición al metotrexato puede en realidad antagonizar sus efectos de tolerancia, quizás al matar las células que median el control sobre el título de anticuerpos.

Ejemplo 3: El metotrexato induce un mecanismo activo de inmunotolerancia

Como se ha mostrado antes, una serie muy breve de metotrexato puede controlar significativamente las respuestas de anticuerpos a través de múltiples rondas de exposición al antígeno. En este contexto, el ciclo breve era un solo ciclo de metotrexato que producía efectos duraderos (tanto en los títulos de anticuerpos como en los niveles de citoquinas) a lo largo de los meses de ensayo. Este control de larga duración de la respuesta de anticuerpos sugiere que el metotrexato puede inducir con éxito la inmunotolerancia. El metotrexato se había evaluado hasta ahora en el contexto de cinco dosis mensuales consecutivas de mATG. Para evaluar más si se había activado un mecanismo de inmunotolerancia, los animales que originalmente recibieron cinco inyecciones mensuales de mATG no recibieron tratamiento durante ocho semanas. Después de este periodo de descanso, los animales recibieron una inyección final de mATG. Si se usara un mecanismo de inmunotolerancia, los títulos de IgG anti-mATG no aumentarían significativamente después del sexto tratamiento con mATG.

Los datos de los autores de la invención muestran que los animales a los que no se administró metotrexato experimentaron un aumento en los títulos de IgG anti-mATG, como se esperaba (Fig. 5). Por el contrario, los animales que recibieron solo un ciclo de metotrexato con la primera inyección de mATG no generaron títulos de IgG anti-mATG significativamente mayores (Fig. 5). Se observó una tendencia similar en animales tratados con tres ciclos de metotrexato, aunque el efecto no era tan espectacular (Fig. 5). Cuando se compara el área bajo las curvas de efecto, el ciclo único de metotrexato reducía los títulos en 99%, mientras que el régimen de tres ciclos reducía los títulos en 85%. Estos datos indican que el metotrexato puede mantener el control sobre las respuestas de recuerdo, lo que sugiere que los ratones han desarrollado tolerancia contra este antígeno.

Aunque los animales tratados con metotrexato generaron títulos medibles que aumentan con los tratamientos sucesivos de mATG, en general, los niveles de títulos en los animales tratados con metotrexato eran consistentemente 100 veces más bajos que los observados en animales tratados con mATG sola (Fig. 6). El nivel más bajo de títulos de anticuerpos debería reducir significativamente el potencial de riesgos de seguridad y efectos de eficacia. Sin querer estar limitados por la teoría, estos datos sugieren que se ha inducido un mecanismo activo de control que puede reducir significativamente las respuestas de IgG anti-mATG y se mantiene mucho después del tratamiento con metotrexato.

Ejemplo 4: Un solo ciclo de metotrexato puede controlar significativamente las respuestas anti-alemtuzumab

En la esclerosis múltiple remitente-recurrente, el alemtuzumab se administra en ciclos anuales y los pacientes pueden generar ADA (Coles et al., N Engl J Med, 359 (17): 1786-801 (2008)). Puesto que el ensayo de inmunogenicidad y farmacocinética están en curso en múltiples estudios de fase III, no está claro si los anticuerpos anti-alemtuzumab afectarán a la exposición, eficacia y/o seguridad en un subconjunto de pacientes. Por lo tanto, se evaluó si un solo ciclo de metotrexato podría controlar los títulos de ADA después de cinco ciclos mensuales de una sola inyección de alemtuzumab. A los ratones Tg HuCD52 se les administró alemtuzumab (0,5 mg/kg) por vía intravenosa mensualmente durante cinco meses consecutivos. Se administró 0,5, 1 o 5 mg/kg de metotrexato 15 minutos antes de la primera dosis mensual de alemtzumab, así como 24 y 48 horas después de la dosis. 1 mg/kg de metotrexato proporcionaba algún beneficio, ya que reducía las respuestas anti-alemtuzumab en 88% (Fig. 7A). 5 mg/kg de metotrexato reducían con éxito las respuestas de IgG anti-alemtuzumab en 99% (Fig. 7A). El metotrexato parecía no tener ningún efecto en la tolerancia natural.

Un segundo estudio confirmó los hallazgos anteriores. Como antes, se trataron ratones transgénicos huCD52 con cinco dosis mensuales de 0,5 mg/kg de alemtuzumab. Los ratones también se trataron con o sin tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato en conexión con la primera administración de alemtuzumab (Fig. 7B). Se recogieron muestras de suero durante todo el estudio para evaluar los títulos de anti-alemtuzumab y confirmar la tolerancia. Los datos de títulos se obtuvieron 24 horas después de la quinta dosis mensual. Los datos demostraban que el metotrexato reducía los títulos de anticuerpos anti-alemtuzumab (Fig. 7C).

Ejemplo 5: El metotrexato puede controlar las respuestas de anticuerpos anti-alemtuzumab en el contexto de un régimen de dosificación de alemtuzmab clínicamente relevante

Se llevó a cabo una serie de experimentos para evaluar si el metotrexato podía controlar con éxito los ADA en el contexto de un esquema de dosificación clínicamente relevante de alemtuzumab en ratones Tg huCD52. En la clínica, el alemtuzumab se administra como un ciclo inicial de cinco tratamientos diarios de 12 mg/día. Doce meses después del ciclo de tratamiento inicial en pacientes, se administra un ciclo adicional de tres dosis diarias de 12 mg de alemtuzumab. En el momento del segundo ciclo de tratamiento, los niveles de células B CD19+ en la circulación se han recuperado a los valores iniciales; sin embargo, los niveles de células T cooperadoras CD4+ y células citotóxicas T CD8+ en la circulación no se han repoblado completamente (Coles et al., N Engl J Med, 359 (17): 1786-801 (2008)).

Inicialmente, se investigó la cinética de agotamiento y repoblación de los subconjuntos de células T y B en la circulación después de cinco tratamientos diarios de alemtuzumab en ratones Tg huCD52. En la sangre periférica de ratones Tg huCD52 tratados con alemtuzumab durante cinco días consecutivos con 0,5 mg/kg (equivalente a la dosis humana de 12 mg/kg) por inyección intravenosa, las células T CD3+, células T cooperadoras CD4+ y células T citotóxicas CD8+ totales no se recuperaron a los niveles previos al tratamiento cuatro semanas después del tratamiento, mientras que el número de células B CD19+ volvió a los niveles de control (Figs. 8A-D).

Con el fin de simular el entorno celular experimentado por los pacientes en el momento del retratamiento, se volvió a administrar alemtuzumab a los ratones Tg huCD52 entre 4 y 5 semanas después del primer ciclo. Dado que la serie inicial de alemtuzumab era un ciclo de cinco días, se administró metotrexato 15 minutos antes de cada tratamiento diario con alemtuzumab y durante dos días después. La dosis máxima acumulada del ciclo de metotrexato administrado en este régimen es de 14 mg/kg (2 mg/kg/día), que es muy similar a la dosis acumulada de 15 mg/kg cuando el metotrexato se administra como una serie de tres días de 5 mg/kg/día. Se evaluaron los efectos de la administración de 2, 1 y 0,5 mg/kg/día de metotrexato en los anticuerpos anti-alemtuzumab durante tres ciclos de tratamiento con alemtuzumab. Con 1 mg/kg, el metotrexato parecía controlar los títulos en 7 de los 8 ratones evaluados y los títulos en general redujeron en 79% (Fig. 9B). Con 2 mg/kg, el metotrexato reducía con éxito los ADA en 98% cuando se compara el área bajo las curvas de efecto (Fig. 9A).

Ejemplo 6: El metotrexato puede mejorar la farmacocinética y la farmacodinámica de la mATG

Los ADA pueden interferir con la farmacocinética y la farmacodinámica de los agentes terapéuticos de proteína. Los autores de la invención evaluaron si las respuestas de ADA IgG anti-mATG interferían con la farmacocinética de mATG. Los ratones se trataron durante cinco meses con inyecciones mensuales de mATG sola o mATG con un solo ciclo de metotrexato. Se administraron 5 mg/kg al día de metotrexato durante tres dosis. Se tomaron muestras de sangre en varios momentos después del mes 1, mes 3 y mes 5 para analizar el nivel de mATG en la circulación (Fig. 10).

El mes 1, los niveles de mATG en la circulación eran similares entre ambos grupos de tratamiento, pero los meses 3 y 5 solo el grupo tratado con metotrexato tenía niveles medibles de mATG en la circulación. Sin la administración de metotrexato, los niveles de mATG medidos después de la tercera y quinta dosis de mATG eran significativamente más bajos que los medidos después de la primera dosis (Fig. 10). Estudios previos han mostrado que el metotrexato reduce significativamente las respuestas de IgG anti-mATG. Por tanto, parece que los anticuerpos contra mATG interfieren con la exposición y la farmacocinética de mATG.

Dado que los anticuerpos contra mATG parecen reducir significativamente los niveles de mATG en la circulación después de la administración repetida, se puede esperar que la farmacodinámica de la mATG cuando se administra de nuevo también se vea afectada negativamente. Se evaluó el agotamiento de linfocitos en la sangre, bazo y ganglios linfáticos después del quinto tratamiento mensual de mATG, cuando los títulos estaban en su nivel más alto. Como se ha descrito antes, los animales tratados con metotrexato solo recibieron un ciclo único de tratamiento.

Los niveles de linfocitos T CD4+ y CD8+ en la circulación no cambiaron después del quinto tratamiento con mATG en animales tratados con mATG pero no con metotrexato. Sin embargo, en animales tratados con mATG y un ciclo de metotrexato, las células T CD4+ y CD8+ en la circulación se agotaron significativamente (Fig. 11). Este efecto se observó de manera similar en el bazo y los ganglios linfáticos. El tratamiento con metotrexato mejoró la capacidad de la mATG para aumentar el porcentaje de células T reguladoras en el bazo y la sangre (Figs. 12A-B). Se observó un efecto similar en la sangre y ganglios linfáticos. Se ha postulado que la presencia mejorada de células T reguladoras después del tratamiento con mATG y Timoglobulina® contribuye a la eficacia de este tratamiento (Ruzek et al., Blood, 111 (3):1726-34 (2008)). La capacidad del metotrexato para ayudar a mantener este efecto después de series sucesivas de mATG es un potencial beneficio añadido de reducir significativamente los títulos de anticuerpos anti-IgG de conejo.

Hasta el momento, los estudios farmacocinéticos y de eficacia sugieren que los anticuerpos anti-mATG interfieren con la exposición y la eficacia de la mATG. Una comparación directa entre el título de IgG anti-mATG y la exposición a mATG pone de manifiesto que cuando los títulos de punto final son superiores a 10.000, el nivel de mATG en la circulación se reduce significativamente (Fig. 13a). Además, cuando los títulos de IgG anti-mATG son superiores a 100.000, se inhibe la agotamiento de células mediado por mATG (Figs. 13b y 13c). La correlación R2 entre el título y el agotamiento de células es > 0,7.

Ejemplo 7: El metotrexato puede mejorar la farmacodinámica de alemtuzumab

El metotrexato no solo mejora la farmacodinámica de la mATG, sino que también restablece el agotamiento de las células T y B en la circulación mediado por alemtuzumab cuando parece que las respuestas anti-alemtuzumab neutralizan parte de la actividad de agotamiento. En los estudios descritos en este ejemplo, se administraron cinco inyecciones intravenosas mensuales de alemtuzumab a ratones Tg huCD52 con y sin metotrexato. Se administraron diariamente 5 mg/kg de metotrexato durante los primeros tres días del estudio de 6 meses. Se recogió sangre de los animales de ambos grupos de tratamiento dos días antes de la quinta dosis y un día después de la quinta dosis de alemtuzumab. Las poblaciones de células se evaluaron mediante citometría de flujo como se describe en el ejemplo 6.

Los datos de los autores de la invención muestran que la quinta dosis mensual de alemtuzumab parecía que ya no agotaba las células T, ya que el número absoluto de células T en la circulación parecía similar antes y después del tratamiento (Fig. 14 (cada punto de tiempo representa un conjunto diferente de animales)). Por el contrario, parecía que metotrexato restablecía la capacidad de alemtuzumab para agotar las células T (P = 0,012). Cuando se compara el número absoluto de células T en la circulación en animales tratados con alemtuzumab solo y animales tratados con alemtuzumab y metotrexato, ya sea dos días antes o un día después de la administración de alemtuzumab, el número de células T en la circulación era significativamente menor en los animales tratados con metotrexato. (P = 0,034 y 0,02; Fig. 14). De manera similar, el tratamiento con metotrexato parecía mejorar el agotamiento de las células B por alemtuzumab (P = 1,2x10-5, P = 0,02 respectivamente), y el número de células B en la circulación disminuía más en los animales tratados con metotrexato un día después del tratamiento (Fig. 14).

Ejemplo 8: Un solo ciclo de metotrexato puede controlar significativamente las respuestas de anticuerpos anti-rhGAA

Los autores de la invención también estudiaron el efecto del metotrexato en la terapia de reemplazo de la enzima rhGAA. En este estudio, se inyectó a los animales semanalmente rhGAA durante doce semanas consecutivas, después descansaron durante cuatro semanas y después se volvieron a exponer a rhGAA la semana 16. Los animales también recibieron un solo ciclo de tres dosis diarias consecutivas de 5 mg/kg de metotrexato la semana 1, o recibieron un ciclo en cada una de las semanas 1, 2 y 3 (con un total de tres ciclos). Los títulos de IgG específica de rhGAA se midieron en los animales las semanas 0 (antes de cualquier tratamiento), 6, 8, 12, 16, 18 y 20. Los datos de los autores de la invención muestran que un solo ciclo de metotrexato controlaba las respuestas anti-rhGAA hasta al menos 20 semanas, así como el régimen de tres ciclos (Fig. 15).

También se han llevado a cabo estudios en ratones Nu/Nu deficientes en células T para evaluar la función de las células T en la generación de títulos anti-rhGAA. En estos experimentos, se ha observado repetidamente que se desarrollan pocos o ningún ADA contra rhGAA en estos ratones deficientes en células T (Figs. 37A-B). Estos datos apoyan la idea de que las células T contribuyen a los títulos anti-rhGAA. Por lo tanto, como el metotrexato puede controlar los ADA contra rhGAA, es probable que también afecte a las respuestas de las células T a la rhGAA.

Ejemplo 9: El metotrexato mejora la supervivencia mediada por mATG de trasplantes alogénicos de corazón

Además de evaluar si el metotrexato podría mejorar la eficacia de la mATG en ratones normales, se investigó si se podría aumentar la función de mATG mediante el metotrexato en un contexto de trasplante. Dado que se usa clínicamente Timoglobulina® como terapia de inducción para prolongar la supervivencia del trasplante, se evaluó si la adición de metotrexato podría aumentar la eficacia de la mATG en un modelo de trasplante de corazón alogénico murino. Se administraron 20 mg/kg de mATG los días 0 y 4, mientras que se administraron 2 mg/kg de metotrexato como un ciclo único de tratamiento los días 0-6.

Además, se investigaron dosis cuatro veces más bajas de metotrexato (0,5 mg/kg) administradas con el mismo régimen o con un régimen prolongado de 12 días consecutivos. Los grupos de ratones bien no recibieron tratamiento (control de solución salina), recibieron mATG sola o una combinación de los regímenes de mATG y metotrexato. De manera similar a los estudios en ratones normales, el metotrexato coadministrado con mATG redujo los títulos de anticuerpos antifármacos contra la mATG independientemente del régimen usado (Fig. 16A y Tabla 1). Además, coincidiendo con la reducción en los títulos de anticuerpos se observó un aumento en la exposición a la mATG en este contexto de trasplante (Fig. 16). Dado el probable efecto adyuvante en las condiciones de una potente respuesta inmunitaria coincidente contra el tejido trasplantado, los títulos de anticuerpos antifármaco aumentaron incluso más rápido que en un contexto de ratón normal y dieron como resultado que los niveles de mATG eran casi indetectables dentro de los 7 días de la primera administración de mATG (Fig. 16B). Por el contrario, siete días después del trasplante, los títulos de anticuerpos anti-IgG de conejo eran significativamente más bajos en los ratones tratados con metotrexato, y los niveles de mATG en la circulación eran significativamente más altos en esos ratones. Esto destaca que, en condiciones de una respuesta inflamatoria en curso, las respuestas de anticuerpos antifármaco se pueden acelerar y quizás tener un impacto aún mayor en la farmacodinámica y la eficacia. Es importante destacar que, incluso en estas condiciones, el metotrexato tenía un profundo efecto inhibidor en los anticuerpos antifármaco mATG y aumentaba la exposición a la mATG. Sin embargo, debido a que los niveles de mATG en la circulación todavía eran bajos o indetectables a los 21 días con el tratamiento de combinación de mATG y metotrexato, es probable que estén en juego mecanismos de tolerancia adicionales dada la supervivencia >100 días del injerto. Estos resultados demuestran una sinergia notable entre la mATG y el tratamiento con metotrexato en la supervivencia de injertos alogénicos y muestra un nivel similar de reducción en anticuerpos antifármaco mATG y mejora de la exposición a la mATG como se observa en ratones normales.

Tabla 1: Los regímenes de metotrexato reducen los títulos de anticuerpos anti-mATG en ratones de trasplante de aloinjerto cardiaco

*n/d = no disponible

Datos adicionales confirmaron que el tratamiento combinado de mATG y metotrexato prolongaba significativamente la supervivencia de los aloinjertos de corazón además de reducir las respuestas anti-aloinjerto (Figs. 17 y 18). De hecho, mientras que tanto el tratamiento con mATG como con metotrexato solos proporcionaban un beneficio modesto de una supervivencia media prolongada a 15 y 20 días, respectivamente, la coadministración de mATG y cualquiera de los regímenes de metotrexato evaluados demostraba un beneficio notable en la supervivencia del injerto cardiaco reteniendo la mayoría de los ratones sus injertos hasta más de 100 días (Fig. 17). Puesto que la supervivencia del injerto cardiaco continúa mucho después de los tratamientos breves tempranos de inducción de mATG y metotrexato, este régimen parece ser tolerogénico en lugar de inmunosupresor. El efecto era exclusivo de la combinación de mATG y metotrexato, ya que otros agentes inmunosupresores (p. ej., micofenolato de mofetilo, dexametasona, rapamicina y ciclofosfamida) no lograban prolongar significativamente la supervivencia del injerto cuando se administraban conjuntamente con mATG. Sorprendentemente, el tratamiento con metotrexato solo era capaz de reducir significativamente los anticuerpos anti-aloinjerto, lo que confirma aún más los efectos del metotrexato en el control de las respuestas de anticuerpos en general (Fig. 18). En este escenario, el metotrexato parece ser capaz de controlar las respuestas de anticuerpos contra múltiples antígenos del aloinjerto de corazón simultáneamente. Se indujo una reducción adicional combinando mATG con el tratamiento con metotrexato (Fig. 18C).

Ejemplo 10: El mecanismo de tolerancia inducida por metotrexato es único de la función actualmente conocida y aceptada del metotrexato

La pauta posológica del metotrexato descrita en los ejemplos anteriores parece invocar un mecanismo que es único respecto del descrito anteriormente. El metotrexato es un antagonista del folato que se cree que media sus efectos supresores al inducir la muerte de las células en proliferación. Los datos de mATG presentados antes demuestran que se inducen respuestas de anticuerpos, pero permanecen significativamente disminuidas con cada tratamiento sucesivo de mATG en animales tratados con metotrexato. Estos datos sugieren que las respuestas de células B se gestionan de forma activa. Sin desear estar ligado a la teoría, se plantea la hipótesis de que el metotrexato puede inducir una población o poblaciones de células reguladoras que controlan estas respuestas a medida que ocurren. Se investigó el efecto del tratamiento con metotrexato en una variedad de subconjuntos de células B y T esplénicas en animales tratados con Myozyme® y metotrexato en comparación con animales tratados con Myozyme® solo. Se observaron aumentos significativos en la población de células B reguladoras B10 siete y ocho días después del tratamiento con Myozyme® (cuatro y cinco días después del tratamiento con metotrexato; Fig. 19).

Además, una serie de subconjuntos de células B activadas eran significativamente mayores después del tratamiento con metotrexato (Fig. 20). Estas poblaciones incluían células B de la zona marginal activadas, células B foliculares activadas y células B transicionales 2 y 3 activadas. Las poblaciones de células se definieron como sigue: células B B2/foliculares: CD19+CD21intCD23hi; células B transicionales 2: CD19+CD93+CD23+IgMhi; y células B transicionales 3: CD19+CD93+CD23+IgMto; células B de la zona marginal: CD19+CD21hiCD23o Una evaluación diaria de las poblaciones de células esplénicas en animales que recibieron dos ciclos de Myozyme® y metotrexato, donde Myozyme® se administró los días 1 y 8 y se administraron 5 mg/kg de metotrexato los días 1-3 y 8-10, demostró que estas poblaciones de células B activadas permanecían más altas (Fig. 21). Este resultado es sorprendente porque la respuesta esperada después del tratamiento con metotrexato sería la muerte de las células en proliferación, activadas. Por el contrario, las poblaciones de células T cooperadoras, T citotóxicas y T reguladoras activadas permanecían prácticamente sin cambios (Fig. 22). Las células T cooperadoras se definieron como CD4+, las T citotóxicas se definieron como CD8+ y las células T reguladoras se definieron como CD4+CD25+ y FoxP3+. Estos hallazgos sugieren que las mayores poblaciones de células B pueden ayudar a mediar la inmunotolerancia inducida por el metotrexato.

Ejemplo 11: El metotrexato aumenta las poblaciones de células B seleccionadas en combinación con mATG

En los ejemplos anteriores, después de cada tratamiento con mATG, aumentaban los títulos de ADA tanto en los ratones tratados con mATG sola como en los ratones tratados con mATG y metotrexato, lo que sugiere que ambos grupos de animales contienen células B que son capaces de contribuir a una respuesta de anticuerpos (Fig. 6). Si ese es el caso, se pueden establecer al menos dos hipótesis. Una primera hipótesis es que el metotrexato puede haber matado a la gran mayoría de células B capaces de responder a Myozyme®, y las pocas que quedan son responsables de esta leve respuesta. Aunque esto es posible, los datos de citometría de flujo de múltiples experimentos no han indicado una disminución en las poblaciones de células B después del tratamiento con Myozyme® y metotrexato. Una segunda hipótesis es que las poblaciones de células B que pueden responder a Myozyme® no mueren por esta breve serie de metotrexato, sino que permanecen y son controladas por células reguladoras después de cada exposición a Myozyme®. Hasta ahora, los datos fenotípicos describen una mejora de los subconjuntos de células B después del tratamiento con metotrexato y Myozyme®. El fenotipo de estas células B parece similar a los subconjuntos de células B reguladoras que se han descrito en estudios con animales y en pacientes tolerantes al trasplante. Por lo tanto, se buscaba probar esta segunda hipótesis en el contexto de diferentes tratamientos.

Los animales se trataron con mATG mensualmente durante cinco meses y recibieron un solo ciclo de 5 mg/kg de metotrexato los primeros tres días del estudio, tres ciclos de 5 mg/kg de metotrexato o nada de metotrexato (Fig. 23). A continuación, se evaluaron las diferencias en las poblaciones de células entre los tres grupos de tratamiento comparando las poblaciones de animales un día antes de la quinta dosis de mATG y dos días después de la quinta dosis de mATG.

Sorprendentemente, cinco meses después del tratamiento con un solo ciclo de metotrexato, se observaron diferencias entre los ratones que recibieron un solo ciclo de metotrexato y mATG y los ratones que recibieron mATG sola o mATG con tres ciclos de metotrexato. Dos poblaciones de células que inesperadamente demostraron efectos fueron las células B foliculares activadas y células B transicionales 3 activadas (Figs. 24A-B, respectivamente). En ratones tratados con mATG sola o en combinación con tres ciclos de metotrexato, se observaron disminuciones en el número absoluto de células de estas poblaciones de células. Sin embargo, en ratones que recibieron solo un ciclo de metotrexato, no se observaron disminuciones estadísticamente significativas en estas poblaciones, lo que sugiere que este régimen de dosificación de metotrexato inducía algún enriquecimiento de estas poblaciones. Es interesante que también se mostró que ambas poblaciones de células se enriquecían directamente después del tratamiento con metotrexato en combinación con Myozyme (Fig. 21). También se han identificado subconjuntos similares en pacientes tolerantes al trasplante. Es posible que un solo ciclo de tratamiento con metotrexato pueda inducir estos subconjuntos de células B que, tras la exposición al antígeno, se convierten en activados y supresores.

Ejemplo 12: El metotrexato aumenta las poblaciones de células B seleccionadas en combinación con alemtuzumab

Como se describe en el ejemplo 4, se trataron ratones transgénicos huCD52 con dosis únicas mensuales de 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco meses, con o sin tres dosis diarias de 5 mg/kg/día de metotrexato en conexión con la primera administración de alemtuzumab. Se evaluaron las poblaciones de células en la sangre y el bazo de los ratones 2 días antes y 1,7 y/o 28 días después de la quinta dosis de alemtuzumab por citometría de flujo.

En sangre, mejoró el efecto farmacodinámico de alemtuzumab en animales tratados con metotrexato 24 horas después de la quinta dosis de alemtuzumab. Se observó un agotamiento de células estadísticamente significativo en los subgrupos tanto de células T como de células B un día después de la quinta dosis, lo que está de acuerdo con los datos anteriores que indican que los títulos de anti-alemtuzumab son bajos en estos animales y no es probable que interfieran con el agotamiento mediado por alemtuzumab. Por el contrario, los ratones tratados con alemtuzumab solo pueden tener más anticuerpos neutralizantes de alemtuzumab que interfieren con la farmacodinamia de alemtuzumab. Como se muestra en Fig. 25A, no había agotamiento significativo de los subconjuntos de células T en los ratones tratados con alemtuzumab, pero los ratones tratados con alemtuzumab y metotrexato presentan agotamiento significativo mediado por alemtuzumab de las células T totales, células T cooperadoras y las células T reguladoras un día después de la administración de alemtuzumab. Se observaron hallazgos similares en subconjuntos de células B en la circulación (Fig. 25B), aunque también se observaron tendencias hacia la disminución del número de células en animales tratados con alemtuzumab solo Como con las poblaciones de células T en la circulación, las poblaciones de células T esplénicas se agotaron significativamente en animales tratados con metotrexato un día después del quinto tratamiento con alemtuzumab (Figs. 26A-B).

En contraste con la agotamiento de células T en ratones tratados con alemtuzumab y metotrexato, ninguna de las poblaciones de células B esplénicas que se analizaron, excepto las células B foliculares, se agotaron significativamente (Fig. 27). Esta evaluación incluye la población de células B reguladoras, células B B10. Sin desear estar limitados por la teoría, se plantea la hipótesis de que el metotrexato puede enriquecer algunas o todas estas poblaciones de células B, lo que contrarresta su agotamiento mediado por alemtuzumab. No se espera que este enriquecimiento ocurra en el entorno rápido, fluido de la sangre porque las células inmunitarias no se diferencian en la sangre. En cambio, las respuestas inmunitarias ocurren en el bazo y otros tejidos linfoides periféricos donde las interacciones célula/célula y las respuestas iniciadas por citoquina/quimiocina pueden ocurrir en los diversos nichos del tejido. Esto puede explicar los efectos diferenciales del agotamiento de las células B mediado por alemtuzumab observado en la sangre y el bazo. Estos datos son similares a los datos generados con mATG (Fig. 24A-B). De hecho, en todos los estudios descritos en el presente documento, se ha observado enriquecimiento después del tratamiento con metotrexato cuando se evalúan poblaciones específicas de células activadas. Sin embargo, cuando se evalúa el número total de una población celular que incluye tanto células activadas como no activadas, tales como células B foliculares totales, no se observaba enriquecimiento significativo en los animales tratados con metotrexato.

A diferencia de las poblaciones de células esplénicas 24 horas después del tratamiento con alemtuzumab, tres días después del tratamiento con una sola dosis de alemtuzumab (y no metotrexato), los subconjuntos de células esplénicas se agotaron significativamente (Fig. 28A). Es posible que a las 24 horas el agotamiento de células B sea mayor en animales tratados con alemtuzumab que a los tres días después del tratamiento con alemtuzumab, ya que la repoblación de células B puede haber empezado en la marca de los tres días. Esto se ha demostrado en varios estudios que evalúan estas poblaciones en sangre periférica. Se observó agotamiento tan pronto como tres horas después de la dosificación en la sangre periférica. Tres días después del tratamiento, los grupos de células B en la circulación seguían siendo significativamente menores en ratones tratados con alemtuzumab que en ratones de control tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS), aunque el porcentaje de reducción no era tan grande como el de las 24 horas. El porcentaje de agotamiento a las 24 horas era de 92%, mientras que el agotamiento a los tres días era de 36% (Fig. 28B). La reconstitución de células B parece ocurrir rápidamente después de una sola dosis.

En conclusión, cinco meses después de que los animales recibieran metotrexato y directamente después de la exposición al antígeno, parece que el metotrexato puede haber enriquecido las poblaciones de células B que potencialmente ayudan a mediar la inducción de tolerancia. Las poblaciones que parecen enriquecidas son similares a las que aumentan directamente después del tratamiento con metotrexato (Fig. 21). Considerado junto, esto sugiere que el metotrexato puede inducir un entorno que permite que las respuestas inmunitarias sean controladas activamente en el momento de la exposición al antígeno, incluso mucho después del tratamiento con metotrexato.

Ejemplo 13: Los efectos del metotrexato en los niveles de citoquinas

Las citoquinas tienen una función doble en las respuestas de células B. Por ejemplo, las citoquinas IL-6 y BAFF que activan las células B también son necesarias para la diferenciación de las células B. Puesto que el metotrexato parece que aumenta las poblaciones de células B, se puede esperar que aumenten estas citoquinas. Sin embargo, la IL-6 también es proinflamatoria y, por lo tanto, los niveles elevados pueden interferir con los efectos inducidos por metotrexato. Al igual que la IL-6, la IL-10 está implicada en la diferenciación de células B en células plasmáticas y también en la inmunosupresión.

Los datos de BAFF se generaron a partir de muestras de suero tomadas 24 horas después de la 5a dosis de alemtuzumab (Fig. 29A). Esto es una continuación de los datos celulares de este estudio presentado antes. En este punto de tiempo no se observaron diferencias en los niveles de BAFF (Fig. 29B).

Tabla 2: Diseño del estudio en ratones tratados con alemtuzumab y/o metotrexato

Los niveles de citoquinas se evaluaron una semana después del segundo ciclo de alemtuzumab (Fig. 29B). Generalmente, una semana después del segundo ciclo de alemtuzumab, los niveles de citoquinas aparecían bajos. En este punto de tiempo, se observó un aumento estadísticamente significativo en los niveles de TNF-alfa en animales tratados con 2 mg/kg de metotrexato. Este aumento puede reflejar un cambio que está relacionado con la tolerancia inducida por el metotrexato o que es un signo de una respuesta inflamatoria. También se observaron tendencias observadas en otras citoquinas, tales como aumentos aparentes de IL-6 y disminuciones potencialmente leves de IL-7 (Fig. 30).

Las células B reguladoras se han asociado con la secreción de IL-10. Una forma de evaluar si las células B reguladoras secretoras de IL-10 tienen una función en la tolerancia inducida por metotrexato es evaluar si el metotrexato puede controlar las respuestas de anticuerpos en animales deficientes en IL-10. Este tipo de evaluación puede ser un desafío en cuanto que, como se ha mencionado antes, la IL-10 es necesaria para la diferenciación de células plasmáticas y, por lo tanto, las respuestas de anticuerpos pueden ser menores en estos animales. Con esta advertencia en mente, se observan tendencias interesantes que sugieren que la IL-10 puede tener una función en la tolerancia inducida por metotrexato.

En este estudio, los animales recibieron 20 mg/kg de Myozyme® intravenoso semanalmente durante nueve semanas. Se administraron tres ciclos de metotrexato de 5 mg/kg/día 0, 24 y 48 horas después de los primeros tres tratamientos semanales de Myozyme®. Los títulos de anti-Myozyme® se evaluaron las semanas 4, 6 y 9 (Fig. 31). Al comparar los valores de los títulos medios en ratones con inactivación génica de IL-10 tratados con rhGAA y rhGAA/metotrexato, no se observó una disminución significativa del título, aunque se observaba una ligera tendencia la semana 9. Como se esperaba, los títulos de anticuerpos no eran tan altos en los animales con inactivación génica de IL-10 como en los animales de tipo natural C57BL/6. Las respuestas anti-rhGAA en animales de tipo natural C57BL/6 tratados con rhGAA y metotrexato disminuyeron a las 4, 6 y 9 semanas. Por el contrario, los títulos de anti-rhGAA las semanas 4 y 6 no disminuyeron en los animales con inactivación génica de IL-10 que se trataron con rhGAA y metotrexato. La semana 9, había una ligera disminución, lo que puede indicar una inducción retardada de tolerancia en ratones deficientes en IL-10. Esto estaría de acuerdo con los informes de que la IL-10 no es la única citoquina supresora secretada por las células B reguladoras (Sagoo et al., J. Clin. Investigation; 120 (6):1848-1861 (2010)). El TGF-beta también se ha asociado con la respuesta de células B reguladoras. Si existe dicho retraso, otras citoquinas tales como el TGF-beta pueden ayudar a mediar el efecto de tolerización del metotrexato. Estos datos hasta ahora sugieren que la IL-10 puede tener una función en la tolerancia inducida por metotrexato.

Ejemplo 14: Una función del metotrexato en el tratamiento de la autoinmunidad secundaria asociada con alemtumzab

Los pacientes con esclerosis múltiple tratados con alemtuzumab pueden desarrollar autoinmunidad secundaria. Los trastornos autoinmunitarios más comunes que se desarrollan después del tratamiento con alemtuzumb son los relacionados con la autoinmunidad tiroidea. Además, también se ha observado púrpura trombocitopénica inmunitaria y síndrome de Good Pasture en pacientes con esclerosis múltiple tratados con alemtuzumab. Los tres tipos de autoinmunidad son mediados por células B en cuanto que las respuestas de células B y los autoanticuerpos están directamente relacionados con el desarrollo de la enfermedad y la patología. No se comprende bien la asociación del tratamiento de alemtuzumab con el desarrollo de estas enfermedades secundarias.

Después del tratamiento de alemtuzumab, las células T y células B se agotan. Es probable que un gran porcentaje de estas células T y B agotadas sean células autorreactivas que interaccionan con antígenos expresados en el sistema nervioso central. Como resultado, se cree que su posterior agotamiento por alemtuzumab contribuye al beneficio terapéutico de esta terapia con anticuerpos monoclonales. Se ha descrito que los pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias contienen autorreactividades (es decir, células B autorreactivas y anticuerpos autorreactivos) contra múltiples antígenos que están asociados con una variedad de enfermedades autoinmunitarias. Los factores ambientales, fisiológicos y genéticos contribuyen todos a determinar si la enfermedad autoinmunitaria probablemente producirá e influirá en qué enfermedad autoinmunitaria estará presente en el paciente. No es raro que los pacientes que padecen un tipo de enfermedad autoinmunitaria también desarrollen otro.

En el contexto de alemtuzumab, una hipótesis es que las autorreactividades inherentes que no eran tan prominentes como las relacionadas con la esclerosis múltiple se pueden expandir en el entorno con agotamiento de linfocitos después del tratamiento con alemtuzumab. Las personas que desarrollan una enfermedad autoinmunitaria típicamente tienen autorreactividades contra una serie de antígenos diferentes y, por lo tanto, una predisposición a desarrollar otras autoinmunidades (es decir, "autorreactividad inherente"). En apoyo de esta idea hay datos en ratones Tg huCD52 que muestran que alemtuzumab no agota de manera equivalente todas las poblaciones de células B (Fig. 27). De hecho, parece haber un desequilibrio en el repertorio de células B que favorece una constitución de células B autorreactivas de baja afinidad, particularmente células B de la zona marginal. Es importante destacar que las células B de la zona marginal se han asociado con la autoinmunidad tiroidea (Segundo et al., Thyroid, 11 (6):525-530 (2001). Además, el subconjunto de células B reguladoras, células B B10, que se ha mostrado que ayudan a mitigar la autoinmunidad en el modelo murino de esclerosis múltiple, EAE (Matsushita et al., J. Clin. Investigation, 118: 3420­ 3430 (2008)), y se ha mostrado que existen en seres humanos (Iwata et al., Blood, 117: 530-541 (2011)) se agota durante periodos de tiempo más largos que las células B de la zona marginal. Una serie corta de tratamiento con metotrexato durante el primer ciclo de alemtuzumab puede ayudar a aumentar la representación de las células B reguladoras B10 y a restablecer el equilibrio de células B de manera que las células B de la zona marginal estén representadas de manera más equitativa en el repertorio de células B después del tratamiento con alemtuzumab y/o diferencien las células B de la zona marginal en células B de la zona marginal reguladoras (células de la zona marginal CD1d+).

Se estudiaron poblaciones de células B esplénicas para determinar los efectos de alemtuzumab en el agotamiento de las células B (Fig. 32). Se administraron por vía intravenosa 0,5 mg/kg de alemtuzumab durante cinco días consecutivos a ratones Tg huCD52. Específicamente, se examinaron poblaciones de células B foliculares (que típicamente no son autorreactivas), células B B1 y células B de la zona marginal (las cuales son ambas autorreactivas), células B B10 (que son reguladoras) y células B transicionales y células B de la zona marginal (que se cree que se pueden diferenciar en células B reguladoras).

Aunque las células B foliculares, B1 y reguladoras se agotaban una y/o dos semanas después del tratamiento con alemtuzumab, las células B de la zona marginal y las células B transicionales 1 (T1) y transicionales 2 (T2) no se agotaban en ningún punto de tiempo (Fig. 32). Las células B transicionales 3 (T3) solo se agotaban después de una semana de tratamiento, y el número de células B reguladoras generalmente aparecía inferior en ratones tratados con alemtuzumab que en animales tratados con control, aunque no se observó significación estadística las semanas 2 y 4.

Para examinar los efectos del metotrexato en las poblaciones de células B en el contexto del tratamiento con alemtuzumab, se llevó a cabo un segundo estudio como se indica en la tabla 3 y Fig. 33. Sorprendentemente, el tratamiento conjunto de metotrexato con alemtuzumab puede permitir un agotamiento más fuerte de las células B de la zona marginal poco después del tratamiento con alemtuzumab, que el agotamiento observado con alemtuzumab solo (Fig. 34), promoviendo así un entorno inmunológico equilibrado con el nivel adecuado de células B autorreactivas de baja afinidad de origen natural necesario para una respuesta temprana adecuada a la infección.

En este estudio se incluyó un grupo de ratones tratados con alemtuzumab solo, y se puso de manifiesto que los ratones tratados solo con metotrexato en este régimen de ciclo corto presentaban efectos celulares en ausencia de estimulación antigénica, que pueden ser diferentes de los efectos observados en los ratones de control tratados con metotrexato solo (Fig. 34). Los datos generados en este estudio, en donde se evaluaron las poblaciones de células B esplénicas dos días después del último día de tratamiento con metotrexato, sugieren que el metotrexato puede potenciar el agotamiento de células B de la zona marginal. Esto respalda la hipótesis de que el metotrexato, cuando se suministra con alemtuzumab, puede dar como resultado un entorno celular en donde los subconjuntos de células B de origen natural están adecuadamente en equilibrio con los subconjuntos de células B no autorreactivas.

Tabla 3: Diseño del estudio en ratones tratados con alemtuzumab y/o metotrexato

Basándose en la evaluación diaria de las poblaciones de células que siguió directamente después del tratamiento de metotrexato con Myozyme®, se planteó la hipótesis de que en el contexto de alemtuzumab, las poblaciones de células B B10 y otras poblaciones de células B potencialmente reguladoras serán enriquecidas por el metotrexato no antes de los 5-6 días después del tratamiento con metotrexato. No se ha observado que dichas poblaciones se enriquezcan tan pronto como dos días después del tratamiento con metotrexato, lo cual está de acuerdo con esta hipótesis. Por el contrario, los efectos parecen ser diferentes en periodos de tiempo más prolongados después del tratamiento con metotrexato, como se observa en el contexto del tratamiento con mATG y alemtuzumab. En ambos escenarios, cinco meses después del tratamiento con metotrexato, los subconjuntos de células B aparecían enriquecidos en ratones tratados con metotrexato uno y dos días después de la administración de mATG y alemtuzumab (véase la Fig. 35 para los datos de alemtuzumab). Es interesante que las células B de la zona marginal en este punto de tiempo también parecían aumentadas (aunque esto no es estadísticamente significativo).

El metotrexato induce tolerancia a terapias con proteínas y a antígenos de tejido cardiaco trasplantado, anulando así las respuestas inmunitarias de las células B que están relacionadas con la producción y secreción de ADA y anticuerpos anti-aloinjerto. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que el metotrexato no solo puede ayudar a controlar el entorno celular después del tratamiento con alemtuzumab, sino que también puede inducir tolerancia a las autoproteínas y mitigar las respuestas inmunitarias de las células B que están relacionadas con la generación de autoanticuerpos que contribuyen al desarrollo y patología de enfermedades autoinmunitarias mediadas por células B.

Para probar esta hipótesis, se administró a los animales alemtuzumab mensualmente durante cinco meses. Se administraron 5 mg/kg de metotrexato a un grupo de animales durante tres días consecutivos solo después del primer tratamiento con alemtuzumab. Dos días antes y un día después de la quinta dosis de tratamiento con alemtuzumab, los animales se sacrificaron para su análisis. Se evaluaron los niveles séricos de citoquinas antes y después del tratamiento con alemtuzumab. Sorprendentemente, estos resultados sugieren que los niveles de las citoquinas proinflamatorias MCP-1, IL-13, IL-6 e IL-12 eran menores en animales tratados con metotrexato 24 horas después de la quinta dosis de alemtuzumab, cinco meses después de administrarles cualquier metotrexato (Fig. 36). Estas citoquinas no solo promueven las respuestas de las células B y el reclutamiento de células inmunitarias, sino que también pueden tener una función en las reacciones de hipersensibilidad. Estos datos sugieren que el metotrexato puede ayudar a impedir las reacciones asociadas a la infusión.

Ejemplo 15: El metotrexato induce inmunotolerancia a través de la inducción específica de poblaciones de células B reguladoras

Los datos de los autores de la invención muestran sorprendentemente que el metotrexato induce inmunotolerancia no por los medios esperados de matar células en proliferación como sugieren otros (Messinger et al., Genetics in Medicine 14: 135-142 (2012) y Lacaná et al., Am J Med Genet Part C Semin Med Genet 160C: 30-39 (2012)), sino a través de la inducción específica de poblaciones de células B reguladoras que expresan TGF-beta, IL-10 y FoxP3. Las células B de ratones hechos tolerantes a Myozyme® mediante un solo ciclo de metotrexato parecían transferir la inmunotolerancia a animales que no han recibido tratamiento previo. Además, tanto la IL-10 como el TGF-beta parecían ser necesarios para la inmunotolerancia inducida por metotrexato. En algunos subconjuntos de células, también parecía que el metotrexato inducía TGF-beta, que a su vez inducía IL-10 y FoxP3. Este mecanismo es novedoso e inesperado, y cuestiona el valor de un protocolo clínico de inmunotolerancia actual que implica el cotratamiento con tres ciclos de metotrexato, Rituximab® (un agente que agota las células B) y, opcionalmente, inmunoglobulina intravenosa (IGIV) (Messinger et al., véase antes). Aunque este tratamiento combinado parece tener éxito, los datos de los autores de la invención sugieren 1) que un solo ciclo de metotrexato potencialmente puede generar títulos de ADA incluso más bajos que los observados actualmente, y 2) que si se administran demasiado metotrexato y rituximab, es posible que la inmunotolerancia no se mantenga. Es posible que las dosis iniciales de rituximab no sean demasiado dañinas, ya que no se cree que el agotamiento de células B mediado por rituximab agote por completo todas las células B en la sangre y los tejidos. Como se observa con los estudios descritos en el presente documento, aunque alemtuzumab agota activamente las células B B10, el tratamiento con metotrexato todavía puede acceder a las células que parecen ayudar a mantener la tolerancia al alemtuzumab durante muchos meses después del ciclo inicial de metotrexato. Además, al tratamiento con rituximab le sigue rápidamente una mayor representación de células B transicionales, que, como se muestra en el presente documento, parecen estar influidas por el metotrexato para inducir y mediar la inmunotolerancia. Como estos datos mecanísticos son contradictorios e inesperados, un solo ciclo de metotrexato de dosis bajas es un método sorprendente y eficaz para inducir inmunotolerancia frente a, entre otras, terapias con proteínas agotadoras de linfocitos.

Como se ha descrito antes, varios subconjuntos de células B son significativamente mayores en el porcentaje de células y/o número de células poco después de la coadministración de metotrexato con un agente terapéutico de proteína. Además, estos subconjuntos parecen mayores en ratones hechos tolerantes con metotrexato mucho después de tratamiento de un solo ciclo de metotrexato (véase, p. ej., Figs. 24, 27 y 35). Juntos, estos datos sugieren que estas poblaciones de células pueden mediar activamente tanto en la inducción como en el mantenimiento de la inducción de la inmunotolerancia. Para confirmar más esta hipótesis, se investigó si estas poblaciones de células expresaban citoquinas y otras proteínas asociadas a menudo con la regulación inmunitaria.

Un tipo de célula asociado con la regulación inmunitaria son las células B B10. Las células B B10 tanto en seres humanos como en ratones se caracterizan por su expresión de IL-10 (Matsushita et al., J. Clin. Invest. 118: 3420-3430 (2008), Iwata et al., Blood 117: 530-541 (2011)), y solo pueden suprimir las respuestas inmunitarias en ratones competentes en IL-10. Las células B B10 aumentaban en ratones hechos tolerantes con metotrexato (Fig. 19), y los animales con inactivación génica de IL-10 no respondían a la inmunotolerancia inducida por metotrexato (Fig. 31). Se evaluaron las células B B10 aisladas de animales tratados con Myozyme® o Myozyme® y metotrexato para determinar la expresión de la proteína IL-10 por citometría de flujo. Aunque IL-10 se expresaba en células B10 de ambos grupos de tratamiento, el número de células B B10 que expresan IL-10 aumentaba en animales tratados con Myozyme® y metotrexato (Fig. 38). La IL-10 se expresaba en células B B10 tanto CD86+ activadas como CD86- no activadas después de dos días de cultivo (Fig. 39). Estudios previos parecen mostrar que la expresión de IL-10 se mide solo después de la estimulación in vitro de células por estimulantes tales como PMA/Ionomicina o LPS (Carter et al., J Immunol 186: 5569-5579 (2011); Yanaba et al., J Immunol 182: 7459-7472 (2009)). Sorprendentemente, en los estudios de los autores de la invención, las células B esplénicas cultivadas no necesitaban ninguna estimulación o manipulación para permitir la medición de IL-10, lo que sugiere más directamente que estas células B B10 expresan IL-10 in vivo. Los datos proporcionados en el presente documento se generaron en cultivos no estimulados. Además, creen haber demostrado por primera vez que el metotrexato puede expandir específicamente poblaciones de células que expresan IL-10. Además, estas poblaciones de células parecen expresar más IL-10 cuando se aíslan de animales tratados con Myozyme® y metotrexato que de animales tratados con Myozyme® solo (Fig. 54).

La expresión de TGF-beta está asociada con la regulación inmunitaria en las células T reguladoras y, a menudo, está relacionada con la expresión de IL-10 en las células T reguladoras. Además, algunos informes parecen indicar que las células B reguladoras pueden expresar TGF-beta. Aunque nunca se ha descrito que las células B B10 expresen TGF-beta, se decidió evaluar la expresión de TGF-beta en células B B10 de ratones tratados con Myozyme® solo o con Myozyme® y metotrexato usando citometría de flujo. Inesperadamente, se encontró que las células B B10 expresan TGF-beta, y que el número de células que expresan TGF-beta es mayor en animales hechos tolerantes por metotrexato (Fig.40A). Además, en estas células cultivadas, el TGF-beta se expresa en células B B10 tanto activadas (CD86+) como no activadas (CD86-) (Fig. 40B). Esta es una nueva observación adicional de que el tratamiento con metotrexato aumenta el número de células que expresan TGF-beta. Además, el metotrexato aumenta el nivel de expresión de TGF-beta (Fig. 55).

FoxP3 es otra proteína asociada con la regulación inmunitaria. FoxP3 es un marcador para células T reguladoras. No se ha descrito que FoxP3 sea expresada en células B B10 en ratones. Se investigó la expresión de FoxP3 en células B B10 en presencia y ausencia de inmunotolerancia inducida por metotrexato usando citometría de flujo. Las células B B10 parecen expresar FoxP3, como se observa en animales tratados con Myozyme® solo (Fig. 41A). El número de células B FoxP3+ parece que aumenta con el tratamiento tanto con metotrexato como con Myozyme® (Fig. 41B). Además, las células B B10 tanto activadas (CD86+) como las no activadas (CD86-) cultivadas parecen expresar FoxP3 (Fig. 41). Este era el primer informe de que las células B B10 expresan FoxP3. Se encontró que FoxP3 se expresaba en células B B10 tanto activadas (CD86+) como no activadas (CD86-) y la expresión de FoxP3 aumenta con el tratamiento con metotrexato (Fig. 56).

Debido a que los tipos de células B adicionales son significativamente mayores con la inmunotolerancia inducida por un solo ciclo de metotrexato, se evaluó si algunos de estos tipos de células expresaban IL-10, TGF-beta y FoxP3. Se encontró que las células B transicionales 2, transicionales 3 y foliculares expresaban IL-10 (Fig. 42), TGF-beta (Fig. 43) y FoxP3 (Fig. 44), lo cual era novedoso e inesperado para cada uno de esos subconjuntos de células B. Como se observaba con las células B10, el número absoluto de células de los subconjuntos de células B de IL-10, TGF-beta y FoxP3 era mayor con metotrexato (Figs. 42-44 B y C) en comparación con los ratones tratados con Myozyme® solo (Figs. 42-44 A y C). El tratamiento con metotrexato también induce aumentos estadísticamente significativos en IL-10, TGFbeta y FoxP3 en múltiples subconjuntos de células según se ve por el cambio en la intensidad media de fluorescencia de estas proteínas en animales tratados con Myozyme® solo o Myozyme® y metotrexato (Figs. 54-56).

Para investigar más las múltiples poblaciones de células B que expresan TGF-beta enriquecidas por el tratamiento con metotrexato y Myozyme®, a continuación se buscó determinar si se requiere TGF-beta para la inmunotolerancia inducida por metotrexato. Los animales se trataron con Myozyme® o Myozyme® y metotrexato con o sin la presencia de 5 mg/kg de anticuerpo anti-TGF-beta (1D11, Genzyme) o el control de isotipo (13C4) administrado tres veces por semana por inyección intraperitoneal a lo largo de todo el estudio. Los títulos de anticuerpos se evaluaron cada dos semanas en cuatro grupos diferentes de animales. Si se requiriera TGF-beta para la inmunotolerancia inducida por metotrexato, entonces se esperaría que los animales tratados con el anticuerpo anti-TGF-beta no presentaran títulos reducidos de anti-Myozima. Los títulos de la semana 6 se representan en Fig. 45, y sugieren que el TGF-beta puede ser necesario para la inmunotolerancia inducida por metotrexato. Debido a que este es un punto de tiempo temprano, solo algunos de los animales han tenido tiempo de generar respuestas anti-Myozyme. Es importante que en este punto de tiempo los títulos parecen similares a los que se muestran en Fig. 15C la semana 6, donde dos animales en los animales tratados con rhGAA sola y con rhGAA y metotrexato y 1D11 presentaban títulos altos. En comparación, ninguno de los animales tratados con rhGAA y metotrexato o rhGAA y metotrexato y 13C4 presentaba títulos altos.

Además, se aislaron los bazos de animales tratados con Myozyme® o Myozyme® y metotrexato a los que también se coadministró 1D11 o 13C4 siete días después de un solo tratamiento con Myozyme® o un solo tratamiento con Myozyme® y metotrexato. En este punto de tiempo, las células B transicionales 2, transicionales 3, B10 y foliculares que expresaban IL-10, TGF-beta y FoxP3 eran mayores en animales tratados con Myozyme® y metotrexato. Después, las células de cada grupo se juntaron y cultivaron durante dos días y después se evaluaron por citometría de flujo para determinar si el tratamiento anti-TGF-beta con 1D11 interfería con la expansión de las células que expresaban TGF-beta, IL-10 y FoxP3 en comparación con el anticuerpo de control de isotipo (13C4).

De manera bastante inesperada, el tratamiento con 1D11 interfería no solo con la expansión inducida por metotrexato de células que expresan TGF-beta, sino también con la expansión de algunos subconjuntos que expresan IL-10 y FoxP3. Esto era cierto específicamente para las células B B10 (Fig. 46) y células B foliculares (Fig. 47), aunque las células B foliculares FoxP3+ no parecían experimentar efectos de 1D11. En las células B transicionales 2 donde el tratamiento con 1D11 interfería con las células B transicionales 2 que expresan TGF-beta, no se observaron efectos con células B transicionales 2 IL-10+ (incluyendo células B transicionales 2 activadas; Fig. 48). Además, los efectos en las células B transicionales 2 FoxP3+ por 1D11 no parecían evidentes en este pequeño grupo de tratamiento a menos que se observaran las células B transicionales 2 CD86+ activadas. Es importante que estos datos sugieren que el TGF-beta inducido por metotrexato está asociado con IL-10 y FoxP3 solo en algunos tipos de células. Para las células B transicionales 3, aunque hay TGF-beta detectable en el subconjunto transicional 3 (Fig. 49), no hay un efecto evidente del tratamiento con 1D11 en estas células (P<0,05; Fig. 49). En particular, en las células B transicionales 3 CD86+ activadas, parece haber un mayor número de células B transicionales 3 IL-10+ en ratones tratados con 1D11. Esto puede sugerir que esta población podría estar expandiéndose para tratar de ayudar a compensar las pérdidas en el número de otros tipos de células debido al tratamiento con 1D11. También es de destacar que el tratamiento con 1D11 no afectaba a los niveles basales de IL-10, TGF-beta y FoxP3 en estas células (Fig. 50A-C, respectivamente), pero parecía influir en los efectos del metotrexato en las células que expresan esas citoquinas.

En resumen, interferir con TGF-beta por inyección de un anticuerpo para TGF-beta durante la inmunotolerancia inducida por metotrexato reduce el número de células que expresan TGF-beta en comparación con animales tratados con el control de isotipo. Además, los aumentos típicos observados con la tolerancia inducida por metotrexato en las células B B10 que expresan IL-10 y FoxP3 son inhibidos por el tratamiento con 1D11. El tratamiento con 1D11 parece que influye en los efectos del metotrexato en TGF-beta, IL-10 y/o FoxP3 en ciertos tipos de células B, pero no en todos los tipos de células B. Estas observaciones son sorprendentes y sugieren que el metotrexato induce TGF-beta, que a su vez induce IL-10 y potencialmente FoxP3 en ciertas células, tales como células B B10. Aunque la asociación de TGF-beta con IL-10 y FoxP3 parece que se ha descrito anteriormente, no se ha demostrado en estos tipos de células. Además, el metotrexato no se ha asociado simultáneamente con esta cascada de señalización compleja.

Hasta ahora, hemos demostrado que ciertas células B aumentan significativamente con la tolerancia inducida por metotrexato, y que esas células B expresan proteínas asociadas con la regulación inmunitaria (supresión). Para evaluar más directamente si las propias células B median la tolerancia inducida por metotrexato, se llevó a cabo un experimento de transferencia adoptiva para evaluar si las células B esplénicas totales de los ratones hechos tolerantes con metotrexato podrían transferir la inmunotolerancia a hospedantes sin tratamiento previo. Se llevó a cabo este experimento usando Myozyme® y un solo ciclo de tratamiento con metotrexato. Se aislaron los bazos de animales tratados con Myozyme® solo o con Myozyme® y metotrexato, 7 días después de un solo tratamiento de Myozyme® o Myozyme® y metotrexato (cuando los subconjuntos de células B mencionados anteriormente aumentaron con metotrexato), y después se purificaron todas las células B esplénicas. Después, esas células se transfirieron a ratones receptores que no habían recibido tratamiento previo de Myozyme® (Fig. 51A). Después de la transferencia, los receptores (junto con los animales de control que no habían recibido transferencia tratados con Myozyme® o Myozyme® y metotrexato) se trataron semanalmente con 20 mg/kg de Myozyme®. Se recogió sangre cada dos semanas para evaluar los títulos de anticuerpos anti-Myozyme. En el momento de la recolección de bazos, se evaluó un subconjunto de células B de cada grupo donante por citometría de flujo para confirmar los aumentos esperados en células B transicionales 2, transicionales 3, B10 y foliculares TGF-beta+, IL-10+ y/o FoxP3+. Se confirmó que los grupos donantes tenían el fenotipo esperado. El análisis de títulos sugería que las células B esplénicas totales aisladas de animales tratados con Myozyme® y un solo ciclo de metotrexato podrían transferir la inmunotolerancia a Myozyme® a hospedantes sin tratamiento previo (Fig. 51B). Esto respalda que las células B pueden mediar la inmunotolerancia inducida por metotrexato, y era la primera vez que se describía que las células B se enriquecen (y no se destruyen) con metotrexato para ayudar a mediar los efectos antiinflamatorios. Estos datos también cuestionan directamente el uso concomitante de un agente de agotamiento de células B con metotrexato para inducir inmunotolerancia, que se está realizando actualmente en pacientes (Messinger et al., véase antes y Lacaná et al., véase antes).

Ejemplo 16: El metotrexato mejora la patología del injerto

Los autores de la invención también han generado datos adicionales en el contexto de la globulina antitimocítica murina que demuestran que el metotrexato no agota las células T CD4+, CD8+, T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) y las células B CD19+ totales en animales normales (Fig. 52) y en animales trasplantados (Fig. 53). Cuando se comparan animales normales tratados con IgG de conejo no específica sola o en combinación con metotrexato, no había cambios significativos en las poblaciones de células en la sangre y el bazo (Fig. 52). Además, cuando se comparan las poblaciones aisladas de animales tratados con mATG sola o con mATG y metotrexato, no había un agotamiento mejorado. Más bien, se observa solo una extensión de los efectos de las células CD4+, CD8+ y T reguladoras mediados por mATG, que se debían lo más probablemente a una mayor exposición a mATG por el metotrexato (Fig. 52). Además, el tratamiento con metotrexato solo en animales que recibían un trasplante alogénico no agotaba esos subconjuntos de células particulares (Fig. 53). El menor número de células T CD4+ y CD8+ en animales tratados con mATG y metotrexato en comparación con animales tratados solo con mATG se puede explicar por el efecto prolongado de mATG en el contexto del tratamiento con metotrexato. Es importante que el metotrexato no inducía disminuciones en las células B como se hubiera esperado si el metotrexato estuviera matando las células B activadas para reducir las respuestas de anticuerpos en animales normales o trasplantados (Figs. 52 y 53). Estos datos sugieren que los efectos del metotrexato en los anticuerpos antifármaco pueden no ser mediados por el agotamiento inducido por el anti-folato de las células B activadas. Como se esperaba, el tratamiento con mATG tampoco tenía impacto en el número total de células B en este modelo de aloinjerto cardiaco modelo heterotópico. En general, el tratamiento combinado de mATG y metotrexato atenuaba la gravedad de la patología de rechazo del injerto y se asoció con una disminución del infiltrado de células T en el injerto, pero no con aumentos de células con un fenotipo de células T reguladoras. Esto está de acuerdo con los resultados generados en el contexto de Myozyme® y alemtuzumab.

Para evaluar tanto los cambios histológicos en los injertos de larga supervivencia como para comprender el mecanismo de la combinación de mATG y metotrexato en la supervivencia del injerto, se recogieron los injertos cardiacos y se evaluó la patología así como la composición celular. En particular, debido a que las células T reguladoras se han asociado con la supervivencia a largo plazo del injerto en el trasplante, son inducidas por Timoglobulina® y mATG, y se ha demostrado que son responsables del rechazo retardado del injerto después del tratamiento con mATG, se evaluaron las células CD3+Foxp3+, que llevan un fenotipo compatible con las células T reguladoras. Específicamente, se recogieron los injertos cardiacos del grupo tratado con combinación de mATG y metotrexato y del grupo singénico no tratado al menos 100 días después del trasplante. Se recogieron injertos de ratones no tratados y ratones tratados con mATG sola o metotrexato solo después del rechazo del injerto para comparación. Las secciones de tejido teñidas con H&E o tricrómico de Masson o anticuerpos anti-CD3 y anti-Foxp3 inmunoteñidos se evaluaron microscópicamente para determinar cambios histológicos indicativos de rechazo del trasplante, p. ej., miocarditis de leve a moderada, degeneración y necrosis miocárdica, vasculopatía del aloinjerto cardiaco (CAV) e infiltración de células T. El día 100, los aloinjertos de animales tratados conjuntamente con mATG y metotrexato pusieron de manifiesto lesiones de CAV de mínimas a leves y degeneración miocárdica y miocarditis de nada a mínima. Los cambios histológicos que sugieren el rechazo del injerto no fueron evidentes en los injertos singénicos en este punto de tiempo tardío (Fig. 54). Los aloinjertos del grupo tratado con la combinación presentaban infiltración leve de células T en el miocardio con unas pocas células que se infiltraban en los vasos sanguíneos miocárdicos. Los injertos singénicos contenían células T raras dentro del miocardio. Estaban presentes grupos de células T con células inmunopositivas dobles CD3 y Foxp3 ocasionales en el epicardio tanto de los injertos singénicos como de los aloinjertos tratados con combinación. Por lo tanto, los injertos de supervivencia prolongada mostraban signos mínimos de rechazo de injerto, lo que se correlaciona con una inflamación reducida.

Debido a que era probable que los efectos del tratamiento con la combinación de mATG y metotrexato ocurrieran más activamente cerca del momento del trasplante, también se evaluó la patología y se caracterizó el infiltrado celular de aloinjertos de corazón trasplantados 7 (para ratones no tratados) o 14 (para todos los grupos de tratamiento) días después del trasplante. Los aloinjertos no tratados presentaban patología de rechazo del injerto que incluía miocarditis, degeneración miocárdica y necrosis en las ramas tanto epicárdicas como intramiocárdicas de las arterias coronarias. Por el contrario, los aloinjertos aislados de animales tratados tanto con mATG como con metotrexato pusieron de manifiesto CAV menos grave. Esto era en comparación con aloinjertos de animales no tratados así como de animales tratados con mATG o metotrexato (Fig. 58). Como se esperaba, los injertos singénicos de ratones no tratados pusieron de manifiesto poca o ninguna patología en estos puntos de tiempo. Se observó infiltración de células T CD3+ en el miocardio y el epicardio en aloinjertos de ratones no tratados y los tratados con mATG o metotrexato solo. Algunas células T CD3+ también estaban presentes en el infiltrado de células inflamatorias asociado con las lesiones de CAV en estos injertos. Por el contrario, los aloinjertos de animales tratados con la combinación de mATG y metotrexato presentaban infiltración de células T CD3+ sustancialmente menor en el miocardio y sólo infiltración mínima de células T CD3+ en el epicardio. Los injertos cardiacos singénicos mostraban infiltración mínima de células T CD3+ solo en el epicardio. Una pequeña proporción de células T dentro de los infiltrados de células inflamatorias en el epicardio parecía tener un fenotipo de células reguladoras T como lo indica la inmunorreactividad doble de CD3 y Foxp3, pero esta frecuencia no parecía mayor dentro de los infiltrados inflamatorios que en otros grupos. Por lo tanto, la patología reducida también se observó temprano después del tratamiento con mATG y metotrexato y se asoció con una infiltración de células T tanto reducida como restringida por epicardio.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Metotrexato para usar en la inducción de inmunotolerancia en un sujeto que tiene una enfermedad o afección o que necesita trasplante de tejido, en donde el metotrexato se administra en un ciclo único que consiste en 1 día de administración de metotrexato o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 días consecutivos de administración de metotrexato; en donde el ciclo único de metotrexato se administra entre 48 horas antes y 48 horas después del inicio de un tratamiento con un agente terapéutico de proteína; y en donde

a) la enfermedad o afección es la esclerosis múltiple y el agente terapéutico es alemtuzumab;

b) la enfermedad o afección es una afección autoinmunitaria y el agente terapéutico es rituximab;

c) la enfermedad o afección es un trasplante de tejido u órgano, anemia aplásica o enfermedad de injerto contra huésped, y el agente terapéutico es un anticuerpo de conejo de globulina antitimocítica;

d) la enfermedad o afección es la enfermedad de Pompe y el agente terapéutico es alfa-glucosidasa humana recombinante; o

e) la enfermedad es la enfermedad de Fabry y el agente terapéutico es la alfa-galactosidasa A humana.

2. Metotrexato para el uso de la reivindicación 1, en donde la inducción de la inmunotolerancia comprende inhibir las respuestas de anticuerpos contra el agente terapéutico en el sujeto.

3. Metotrexato para el uso de la reivindicación 1, en donde la inducción de inmunotolerancia comprende:

a) aliviar una reacción de infusión al agente terapéutico en el sujeto;

b) reducir la autoinmunidad secundaria en el sujeto;

c) aumentar el porcentaje de células T reguladoras en la población de células T en el sujeto;

d) aumentar el porcentaje de células B reguladoras en la población de células B del sujeto; o

e) inhibir las respuestas de las células T en el sujeto.

4. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el sujeto es un ser humano.

5. Metotrexato para el uso de la reivindicación 1, en donde la inducción de inmunotolerancia comprende agotar los linfocitos en un ser humano y el sujeto es un paciente con esclerosis múltiple.

6. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la enfermedad o afección es la esclerosis múltiple y el agente terapéutico es alemtuzumab.

7. Metotrexato para el uso de la reivindicación 6, en donde la enfermedad o afección es la esclerosis múltiple remitenterecurrente.

8. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la enfermedad o afección es una afección autoinmunitaria y el agente terapéutico es rituximab.

9. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la enfermedad o afección es un trasplante de tejido u órgano, anemia aplásica o enfermedad de injerto contra huésped, y el agente terapéutico es un anticuerpo globulina antitimocítica de conejo.

10. Metotrexato para el uso de la reivindicación 9, en donde el tejido trasplantado es tejido renal o tejido cardiaco.

11. Metotrexato para el uso de la reivindicación 10, en donde el sujeto también recibe otro agente para la modulación inmunitaria.

12. Metotrexato para el uso de la reivindicación 11, en donde el agente para la modulación inmunitaria es un inmunosupresor.

13. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la enfermedad o afección es la enfermedad de Pompe y el agente terapéutico es la alfa-glucosidasa ácida humana.

14. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la enfermedad es la enfermedad de Fabry y el agente terapéutico es la alfa-galactosidasa A humana.

15. Metotrexato para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el metotrexato se administra en una cantidad eficaz de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg.