JP2014508946A5

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Publication number: JP2014508946A5
Application number: JP2014500343A
Authority: JP
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2016-08-12
Anticipated expiration: 2032-03-19

Description

この目的のために、本発明によれば、所定サンプル中の各ターゲット分子に特異的なターゲット分子の消衰係数（ＴＥＣ）を定義し、この方法に組み込む。実際、所定濃度の所定分子は、それが検出されるサンプルに応じて、同じ強度のシグナルを発しない。同様に、所定サンプル中の同じ濃度の２つの異なる分子は、異なるシグナル強度を有する。ＴＥＣを計算して組み込むことにより、分析するべきサンプル中のターゲット分子のマススペクトルに関連するシグナル強度の変動を認識及び考慮することが可能になる。次いで、サンプルの性質及び前記サンプル中の分子の位置に関係なく、前記分子について得られたシグナルが前記分子の濃度を表すように、ＴＥＣを使用して前記シグナルを標準化できる。従って、分析サンプル中のターゲット分子について得られた質量分析結果から、分子を直接定量化することが可能である。

従って、本発明の一目的は、質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を同定及び／又は定量化するための方法であって、以下の工程：
ａ）分析するべきサンプルを支持体上に堆積させること；
ｂ）質量分析によってサンプルを分析して、前記サンプル中のターゲット分子のマススペクトルを得ること；
ｃ）ターゲット分子及びサンプルに特異的な消衰係数（ＴＥＣ）によって、前記サンプル中のターゲット分子のマススペクトルに関連するシグナルに重み付けすること；及び場合により
ｄ）重み付けしたターゲット分子のシグナルを使用して、サンプル中のターゲット分子の量を決定すること
を含む方法に関する。

この方法の重要な工程は、測定したシグナルの標準化にある。この目的のために、サンプル中のターゲット分子のシグナルとして選択したスペクトル特性を、分子及びサンプルに特異的な消衰係数（ＴＥＣ）によって重み付けする。この重み付けによりシグナルが標準化され、シグナルはシグナル発生源における分子の量だけに依存する。

ＴＥＣは、サンプルの性質及び／又はサンプル上のターゲット分子の位置に応じたターゲット分子のシグナル強度のロス又はゲインを、不活性サンプル支持体上の前記分子のシグナル又は標準分子のシグナルと比較して表すものである。ＴＥＣは、いくつかの要因、特にサンプルの起源（動物、植物、細菌、無機物）、表面の種類（組織、植物細胞、金属など）、化学環境、サンプルの化学的処理の有無などに依存する。生体組織のサンプルの場合、分子の消衰係数は、組織の消衰係数に対応する。

好ましくは、所定の種類のサンプル中の所定のターゲット分子について消衰係数（ＴＥＣ）を１回だけ計算し、所定の種類のサンプル中の前記ターゲット分子の各分析に再使用する。従って、有利には、いくつかの異なるサンプル中のターゲット分子のＴＥＣをリスト化するＴＥＣデータベースを所定のターゲット分子について作成し、様々なサンプル中の前記分子の各分析に使用できる。

質量分析によって心臓組織を直接分析する際の２種類の洗浄効果の例。（ａ）：マトリックス堆積物の前洗浄をせずに心臓組織から得られたシグナル。（ｂ）：マトリックス堆積前に９０％エタノール洗浄を使用して（ａ）に隣接する切片上の心臓組織から得られたシグナル。（ｃ）：マトリックス堆積前に１００％クロロホルム洗浄を使用して（ａ）に隣接する切片上の胃組織から得られたシグナル。（ａ）基準支持体（スライド）及び（ｂ）組織（ラット肝臓）上の消化モデルタンパク質（ウシ血清アルブミンと消化酵素としてトリプシン）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。ｍ／ｚ９２８フラグメント（ＹＬＹＥＩＡＲ）の例：組織上のペプチドに対する質量シグナルの消衰の観察（ＴＥＣ＝１．６２）。質量分析イメージングを使用する実行例による、本発明の方法の主要工程の略図。マウス全身のプロプラノロール分布の研究において、組織消衰係数を計算するための手順。（ａ）様々な器官又はターゲット領域を可視化するための、コントロールマウスの矢状切片の光学画像（１−スライド単独、２−脳、３−腎臓、４−肺、５−肝臓、６−心臓）。（ｂ）サンプル上のマトリックス及びサンプルから離れたマトリックスと混合した内部標準（プロプラノロール、ｍ／ｚ２６０の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオン）の分布の質量分析画像、及び強度スケール。腎臓におけるプロプラノロールの組織消衰係数を計算するための手順。図５Ａ：腎臓の光学画像。ターゲット器官内で等寸法の目的領域（ＲＯＩ）又は点領域の範囲を数箇所定める。図５Ｂ：ＲＯＩ及び中間ＲＯＩ（ＲＯＩ平均）による内部標準の平均強度の表。図６Ａ：器官又はターゲット領域ごとのプロプラノロール強度を要約した表。図６Ｂ：器官又はターゲット領域ごとのプロプラノロール強度のヒストグラム。組織消衰係数の計算。図７Ａ：数学的関係：ターゲット器官ごとのプロプラノロールについて計算したＴＥＣを要約した表。図７Ｂ：ターゲット器官ごとのプロプラノロールについて計算したＴＥＣのヒストグラム。ターゲット分子の検量線の決定。図８Ａ：標準範囲の堆積物の光学画像。図８Ｂ：標準範囲の質量分析画像、ターゲット分子の分布。図９Ａ：ターゲット分子の標準範囲のＲＯＩの平均強度を要約した表。図９Ｂ：検定線のグラフ。図９Ｃ：相関係数及び直線方程式。全身のターゲット分子（プロプラノロール）の質量分析画像上における定量化。図１０Ａ：ターゲット分子を注射した２０分後におけるマウスの矢状切片の光学画像、及び様々な器官又はターゲット領域（２−脳、３−腎臓、４−肺、５−肝臓、６−心臓）の可視化。図１０Ｂ：ターゲット分子（ｍ／ｚ２６０の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオン）を注射したｔ＝６０分後における分布の質量分析画像（強度による）。図１０Ｃ：ターゲット分子を注射したｔ＝２０分後における分布の質量分析画像をＴＥＣによって標準化し、ターゲット分子の単位面積あたりの量を得るための検定線に関連付けた後のもの。ターゲット分子のＭＳ画像上における定量化。様々な器官におけるターゲット分子の量を要約した表。ＴＥＣを使用して、器官ごとの平均強度及びピクセルから後者を計算するための手順の説明。腎臓におけるオランザピンの組織消衰係数を計算するための手順。図１２Ａ：コントロールマウス腎臓の矢状切片の光学画像。図１２Ｂ：サンプル上のマトリックス及びサンプルから離れたマトリックスと混合した内部標準（オランザピン、ｍ／ｚ３１３．３の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオン）の分布の質量分析画像、及び強度スケール。図１２Ｃ：腎臓におけるオランザピンについて計算したＴＥＣのヒストグラム。ターゲット分子の検量線の決定。図１３Ａ：標準範囲の質量分析画像、ターゲット分子の分布。図１３Ｂ：オランザピンのＭＳ画像に対する検定線、その方程式、その相関係数及びその検出限界、並びに定量化（fmol/mm²単位）の提示。２時間処理した腎臓におけるターゲット分子（オランザピン）の質量分析画像を使用した定量化。図１４Ａ：ターゲット分子を投与した２時間後におけるマウス腎臓の矢状切片の光学画像。図１４Ｂ：ターゲット分子（ｍ／ｚ３１３．３の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオン）を投与したｔ＝２時間後における分布の質量分析画像（強度による）。

次いで、コントロールサンプルの質量分析画像上において、スライド上の各器官について、等寸法の目的領域（ＲＯＩ）の範囲を数箇所定める。マススペクトルのピーク強度を基準シグナルとして選択した。各ＲＯＩ及び各目的器官についての内部標準の平均強度を記録した。各器官については、すべての対応するＲＯＩについて得られた強度から、平均強度（ＲＯＩ平均）を計算した。この平均ＲＯＩを使用して、研究した各器官におけるプロプラノロールの消衰係数を計算する。

次いで、コントロールサンプルの質量分析画像上において、スライド上の腎臓について、等寸法の目的領域（ＲＯＩ）の範囲を数箇所定める。マススペクトルのピーク強度を基準シグナルとして選択した。平均強度（ＲＯＩ平均）は、実施例１のように計算する。この平均ＲＯＩを使用して、腎臓におけるオランザピンの消衰係数を計算する。

Claims

質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法であって、以下の工程：
ａ）分析するべきサンプルを支持体上に堆積させること；
ｂ）質量分析によってサンプルを分析して、前記サンプル中のターゲット分子のマススペクトルを得ること；
ｃ）ターゲット分子及びサンプルに特異的な消衰係数によって、前記サンプル中のターゲット分子のマススペクトルに関連するシグナルに重み付けすること；及び場合により
ｄ）重み付けしたターゲット分子のシグナルを使用して、サンプル中のターゲット分子の量を決定すること
を含む、方法。
分析するべきサンプル中のターゲット分子の消衰係数が、基準媒体中のターゲット分子のシグナルと、サンプル中のターゲット分子のシグナルとの比又はその逆数に対応する、請求項１に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
分析するべきサンプル中のターゲット分子の消衰係数が、サンプル中の標準分子のシグナルと、サンプル中のターゲット分子のシグナルとの比又はその逆数に対応する、請求項１に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
同位体でラベリングされた既知濃度のターゲット分子を標準分子として使用する、請求項３に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
質量分析イメージングを使用し、同位体でラベリングされた既知濃度のターゲット分子をマトリックスと混合してから、得られた混合物をサンプル及び支持体の両方に塗布する、請求項４に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
同位体でラベリングされた既知濃度のターゲット分子をサンプル及び支持体の両方の上に堆積させる、請求項４に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
分析するべき所定の種類のサンプル中の所定のターゲット分子について消衰係数を１回だけ計算し、所定の種類のサンプル中の前記ターゲット分子の各定量化に再使用する、請求項１又は２に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝産物、小分子、又は質量分析によってイオン化され得る任意の分子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
分析サンプルが、有機サンプル又は無機サンプルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
ターゲット分子がタンパク質であり、検出工程ｂ）の前に、前記ターゲット分子の酵素的及び／又は化学的な前処理を実施し、前記前処理から得られたペプチドの少なくとも１個について検出及び定量化を行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
分析工程ｂ）の前に、サンプルを少なくとも１つの溶媒及び／又は少なくとも１つの洗浄剤で処理して、ターゲット分子の検出を最適化する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
ターゲット分子のマススペクトルに関連するシグナルが、前記マススペクトルのピーク強度、ピーク面積又は信号対雑音比に対応する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
質量分析イメージングを使用し、ターゲット分子のシグナル強度に分析サンプル上で直接重み付けして、前記サンプル中のターゲット分子の分布及び濃度を同時に可視化する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
質量分析イメージングを使用し、分析工程ｂ）の前に、サンプル上のマトリックス堆積物の均一性を基準マトリックス堆積物と比較して評価する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
前記サンプル中の少なくとも２つの異なるターゲット分子を同時に検出及び定量化する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の質量分析イメージングによってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
サンプルが少なくとも１つの組織の切片であり、質量分析イメージングによってターゲット分子を組織上で直接検出及び定量化する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の質量分析によってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
サンプルが動物全身の切片であり、質量分析イメージングによってターゲット分子を前記切片上で直接検出及び定量化して、動物の様々な組織における前記ターゲットの分布を同時に比較する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の質量分析イメージングによってサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出及び定量化するための方法。
コンピュータシステムが請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法の工程ｃ）を実行できるようにするのに適したコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読データ媒体。
少なくとも２つの異なる種類のサンプル中の少なくとも１つのターゲット分子についての消衰係数のデータベースを含む、請求項１８に記載のコンピュータ可読データ媒体。
質量分析イメージングに使用される少なくとも１つのマトリックスの基準シグナルのデータベースを含む、請求項１８又は請求項１９に記載のコンピュータ可読データ媒体。