JP2014505051A - ヒアルロン酸を含む人工唾液 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒアルロン酸(1,630kDa、Sigma−Aldrich、St Louis、MO、U SA)を唾液と類似な組成を有する緩衝溶液(stimulated salivary buffer、SSB、0.021M Na2HPO4/NaH2PO4、pH7.0、36mM NaCl及び0.96mM CaCl2を含む)(Bennick and Cannon、1978)または3つの異なる濃度のRPMI 1640ミディアムに溶解させた(0.5、1.0、及び2.0mg/mL)。
ニワトリ卵白リゾチーム(hen egg−white lysozyme、HEWL)及び牛ラクトペルオキシダーゼ(bovine lactoperoxidase、bLPO)(Sigma−Aldrich、St Louis、MO、USA)を本発明のそれぞれリゾチーム及びペルオキシダーゼとして使用し、これをSSBに溶解させた。分析には、30.0μg/mL HEWLまたは25.0μg/mL bLPOの濃度を使用した。
Candida albicans ATCC 10231、18804及び11006を実験に使用した。サブロー寒天培地(Sabouraud dextrose agar、SDA)で育ったC.albicansの1コロニーをサブロー寒天培地に接種し、18時間37℃で撹拌して培養した。細胞を回収後、洗浄し、RPMI 1640ミディアムml当たり1x105細胞の濃度で再懸濁した。HAの菌発育阻止活性を測定するために、HAを多様な濃度のC.albicansを含む100mL RPMI 1640ミディアムに溶解させ(0.5、0.1及び2.0mg/mL)、上記培養液を37℃で撹拌して培養した。増殖期は、培養液の光学密度を600nmで1時間間隔で測定して決定し、HAがない培養液と比較した。上記実験を4回繰り返した。
C.albicans ATCC 10231、18804及び11006の1コロニーを10mLのRPMI 1640ミディアムに接種し、18h時間37℃で撹拌して培養した。細胞を回収後、洗浄し、SSBにmL当たり1x105細胞の濃度で再懸濁した。HAのカンジダに対する殺活性を測定するために、20μLの細胞懸濁液を多様な濃度で40μLのHAに添加した(最終濃度0.5、1.0及び2.0mg/mL)。サンプルを37℃で1.5時間培養し、毎15分ごとに混合した。培養の終わりにサンプルを10倍希釈し、50μL(167細胞)の希釈した細胞をSDA板に三連にプレートし、37℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性を実験板上のコロニー個数とHAがない対照群の板上のコロニー個数を比較し、測定した。細胞生存力の損失率(1−対照群の板に対する実験板のコロニー個数の比)をさらに計算した。上記実験を6回繰り返した。
上記のように培養されたC.albicansの細胞懸濁液をSSBにmL当たり1x105細胞の濃度で適用し、その後、20μLの細胞懸濁液を同一の量のHAに添加した(最終濃度0.5、1.0及び2.0mg/mL)。サンプルを37℃で1h時間撹拌しながら培養した。40μLの細胞懸濁液を20μLのHEWL(最終濃度30μg/mL)または20μLのペルオキシダーゼ(最終濃度25μg/mL bLPO、1mM KSCN及び100μM H2O2)に混合し、その後、37℃で1時間撹拌しながら培養した。培養の終わりにサンプルを10倍希釈し、50μL(167細胞)の希釈した細胞をSDA板に三連でプレートし、37℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性及び細胞生存力の損失率を計算した。上記実験を8回繰り返した。
HEWL、ニワトリ卵白リゾチーム;CFU、コロニー形成数字
bLPO、ウシラクトペルオキシダーゼ;CFU、コロニー形成数字
20μLのHA溶液(最終濃度0.5、1.0及び2.0mg/mL)を20μLのHEWL(最終濃度30μg/mL)または20μLのペルオキシダーゼ(最終濃度25μg/mL bLPO、1mM KSCN及び100μM H2O2)に添加し、その後、37℃で1時間撹拌しながら培養した。上記混合物を20μLの細胞懸濁液に添加し、37℃で1時間撹拌しながら培養した。培養の終わりにサンプルを10倍希釈し、50μL(167細胞)の希釈した細胞をSDA板に三連でプレートし、37℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性及び細胞生存力の損失率を計算した。上記実験を8回繰り返した。
HEWL、ニワトリ卵白リゾチーム;CFU、コロニー形成数字
bLPO、牛ラクトペルオキシダーゼ;CFU、コロニー形成数字
Candida albicans ATCC 10231、18804及び11006を実験に使用した。サブロー寒天培地(Sabouraud dextrose agar、SDA)で育ったC.albicansの1コロニーをサブロー寒天培地に接種し、18時間37℃で撹拌して培養した。細胞を収獲後、洗浄し、RPMI 1640ミディアムml当たり1x105細胞の濃度で再懸濁した。HAの菌発育阻止活性を測定するために、HAを多様な濃度のC.albicansを含む100mL RPMI 1640ミディアムに溶解させ(0.5、1.0及び2.0mg/mL)、上記培養を37℃で撹拌して培養した。増殖期は、培養の光学密度を600nmで1時間間隔で測定して決定し、HAがない培養と比較した。上記実験を4回繰り返した。
Claims (7)
- 0.4〜0.6mg/mL濃度のヒアルロン酸を含む人工唾液において、ヒアルロン酸100重量部に対してリゾチーム10〜12重量部及びペルオキシダーゼ7〜9重量部を含む人工唾液。
- 上記人工唾液に含まれたリゾチームは、全体人工唾液に対して50〜60μg/mLの濃度である、請求項1に記載の人工唾液。
- 上記人工唾液に含まれたペルオキシダーゼは、全体人工唾液に対して36〜43μg/mLの濃度である、 請求項1に記載の人工唾液。
- 上記ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体、ヒアルロン酸塩、またはヒアルロン酸自体及びヒアルロン酸塩であり、上記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトのような無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムのような有機塩である、請求項1〜3のいずれかに記載の人工唾液。
- 上記ヒアルロン酸の分子量は、100kDa〜10,000kDaである、請求項1〜3のいずれかに記載の人工唾液。
- 上記人工唾液は、口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療用である、請求項1〜3のいずれかに記載の人工唾液。
- 上記人工唾液は、唾液分泌の低下による余病の予防または治療用である、請求項1〜3のいずれかに記載の人工唾液。
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