JP5822949B2 - ヒアルロン酸を含む人工唾液 - Google Patents

Description

本発明はヒアルロン酸を含む人工唾液に関する。

ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）は、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位よりなるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）である。グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、β（１→３）連結されており、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びグルクロン酸は、β（１→４）で連結されている。ＨＡは、眼球ガラス体液、関節の潤滑液及び細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）において豊富である。ＨＡの固有の生体適合性及び独特な物理的特性によって、ＨＡは、薬物伝達、生体適合物質の製造、眼球乾燥患者のための人工涙及び骨関節炎の症状緩和のための物質に使用される（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｕｍ、２００４；Ａｌｍｏｎｄ、２００７；Ｆａｍ ｅｔ ａｌ．２００７）。

人体唾液にＨＡの存在が知られており、唾液のＨＡは、唾液の潤滑、創傷治癒機能及び口腔粘膜を保護する役目に寄与する（Ｐｏｇｒｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｐｏｇｒｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。また、ＨＡは、抗カンジダ （ａｎｔｉ−Ｃａｎｄｉｄａ）活性を示すことが公知である。粘弾性の特性及び非−免疫原性（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｉｔｙ）に起因して（Ａｌｍｏｎｄ、２００７）、ＨＡは、口腔乾燥患者の唾液代替品の候補物質として考慮されることができ、特定濃度で人体唾液と類似な物性的特性を示すことが公知である（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１０）。

ＨＡが唾液で減少すること及び口腔乾燥症が発生することの関係が公知であり（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００９）、これは、ＨＡが口腔粘膜を保護し潤滑させる役目を行うものと判断される。さらに、ＨＡの傷治療活性及び潜在的抗カンジダ活性（Ａｂａｔａｎｇｅｌｏ、１９９９；Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００７）は、口腔粘膜傷及びカンジダ症（ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）に敏感な乾燥な口腔を有する患者に追加的な利益をもたらすことができる。

市販の口腔衛生製品によって唾液の抗菌能力を強化させるかまたは回復させようとする試みが行われてきた。上記製品に最も広く使用される抗菌タンパク質は、リゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）及びラクトペルオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）である（Ｔｅｎｏｖｕｏ、２００２）。上記抗菌剤は、カンジダ症に敏感な乾燥な口腔を有する患者の唾液の抗菌能力を回復させるために唾液代替剤に導入されてきた（Ｔｅｎｏｖｕｏ、２００２）。リゾチームの抗真菌活性（Ｔｏｂｇｉ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）及びペルオキシダーゼ （ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）システムの抗真菌活性（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．１９８３；Ｌｅｎａｎｄｅｒ−Ｌｕｍｉｋａｒｉ、１９９２；Ｗｅｌｋ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）は公知である。リゾチーム及びペルオキシダーゼが同時に使用されることによるカンジダに対する殺活性の向上効果が公知である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）。生体外実験結果が生体内でも同一に適用されることは、確かではないが、上記抗菌性補充物は、口腔乾燥患者のカンジダ症の発生を低減する。

口腔は、唾液代替物の物質及び唾液の分子が同時に存在することができる環境を提供する。したがって、唾液代替物のＨＡ分子は、また、人体唾液の抗菌性分子と相互作用する。ＨＡとリゾチーム間の複合体（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９９７）及びＨＡとペルオキシダーゼ間の複合体（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９０）の構造は、先行文献で提案されている。

但し、ＨＡがどれほどまたはどのようにＨＡがリゾチーム及びペルオキシダーゼの抗カンジダ 活性に影響を及ぼすかは知られていない。

Van Damme et al. Binding of Hyaluronan to Lysozyme at Various PHSA, Biochemistry International, 1991 Jul, 24(4), 605-13 Van Damme et al. Binding Properties of Glycosaminoglycans to Lysozyme-Effect of Salt and Molecular Weight, Archives of Biochemistry and Biopbysics, 1994 April, 310(1), 16-24 Moss et al. Dependence of Salt Concentration on Glycosaminoglycan-Lysozyme Interactions in Cartilage, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1997 December 1, 348(1), 49-55 Green et al. Depolymerization of Synovial Fluid Hyaluronic Acid(HA) by the Complete Myeloperoxidase(MPO) System May Involve the Formation of a HA-MPO Ionic Complex, The Journal of Rheumatology, 1990, 17:12, 1670-5

本発明は、ヒアルロン酸を含む人工唾液を提供する。

本発明は、人工唾液として適したヒアルロン酸の濃度、抗菌添加物であるリゾチーム及びペルオキシダーゼの濃度を提供する。

本発明は、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のヒアルロン酸を含む人工唾液において、リゾチーム３０μｇ／ｍｌまたはペルオキシダーゼ２５μｇ／ｍｌを含む人工唾液を提供する。

本発明の一具体例において、上記人工唾液に含まれたリゾチームが人工唾液全体に対して３０μｇ／ｍＬ濃度であるか、または上記人工唾液に含まれたペルオキシダーゼが人工唾液全体に対して２５μｇ／ｍＬ濃度であることができる。

本発明の他の具体例において、ヒアルロン酸の分子量は、特に制限されるものではなく、１００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａであることができる。

本発明による人工唾液は、口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療に使用されることができ、唾液分泌の低下による余病の予防または治療に使用されることができる。したがって、本発明は、ヒアルロン酸を含む口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療用人工唾液、または唾液分泌の低下による余病の予防または治療用人工唾液を提供する。

本発明による人工唾液は、人体唾液内の生理的範囲内にあり、適した抗菌活性を示すので、口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療に使用されることができ、唾液分泌の低下による余病の予防または治療に有用に使用されることができる。

図１は、ヒアルロン酸のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １０２３１成長阻害効果を示すグラフである。 図２は、ヒアルロン酸のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １８８０４成長阻害効果を示すグラフである。 図３は、ヒアルロン酸のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １１００６成長阻害効果を示すグラフである。

以下で、本願発明の例および比較例を参照として詳細に記載する。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されない。

本発明は、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のヒアルロン酸を含む人工唾液において、リゾチーム３０μｇ／ｍｌまたはペルオキシダーゼ２５μｇ／ｍｌを含む人工唾液を提供する。

本発明において上記ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体とその塩をすべて含む概念なので、本発明において用語「ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、またはヒアルロン酸とヒアルロン酸の混合物を意味する。上記ヒアルロン酸塩には、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトなどのような無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムなどのような有機塩がすべて含まれる。場合によって、これらの２つまたはそれ以上の組合が使用されることもできる。

リゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）は、細菌の細胞壁にある多糖類中のＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）の間のβ−１、４−グリコシド結合を加水分解する酵素であって、主に卵白、動物組職、鼻粘膜、唾、胃液、涙などに含有されており、殺菌及び抗菌活性を有する。

ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）は、Ｈ_２Ｏ_２（またはＣＨ_３ＯＯＨ）の存在でモノアミン類、ポリアミン類、モノフェノール類、ポリフェノール類、ロイコ色素、アスコルビン酸、シトクロムｃ、ＨＩなどをＨ_２Ｏ_２＋ＡＨ_２→２Ｈ_２Ｏ＋Ａの反応式で示すように酸化を触媒する酵素を意味する。

ヒアルロン酸は、唾液と類似な組成を有する緩衝溶液（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｂｕｆｆｅｒ）に０．５ｍｇ／ｍＬ濃度で作った場合、流動学側面において唾液代替剤として最も適している。また、抗菌添加物であるリゾチームは、３０μｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼは、２５μｇ／ｍｌを添加した場合、人体唾液内の生理的範囲内にあり、適した抗菌活性を示す。

本発明において、重量部は、重量比率を意味する。

抗菌添加物であるリゾチームが３０μｇ／ｍｌ未満であるか、またはペルオキシダーゼが２５μｇ／ｍｌ未満である場合、人工唾液の抗真菌活性が十分ではないことがある。

本発明の一具体例において、上記人工唾液に含まれたリゾチームが全体人工唾液に対して３０μｇ／ｍＬ濃度であるか、または上記人工唾液に含まれたペルオキシダーゼが全体人工唾液に対して２５μｇ／ｍＬ濃度であることができる。

本発明の他の具体例において、ヒアルロン酸の分子量は、特に制限されるものではなく、１００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａであることができる。

本発明による人工唾液は、口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療に使用されることができ、唾液分泌の低下による余病の予防または治療に使用されることができる。したがって、本発明は、ヒアルロン酸を含む口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療用人工唾液、または唾液分泌の低下による余病の予防または治療用人工唾液を提供する。

以下、本発明の理解を助けるために実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業界において平均的な知識を有する者に本発明をさらに完全に説明するために提供されるものである。

下記の製造例は、本発明による実施例に共通的に適用される製造例を提供するためのものである。

製造例１：ヒアルロン酸溶液
ヒアルロン酸（１，６３０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ ＳＡ）を唾液と類似な組成を有する緩衝溶液（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｂｕｆｆｅｒ、ＳＳＢ、０．０２１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０、３６ｍＭ ＮａＣｌ及び０．９６ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む）（Ｂｅｎｎｉｃｋ ａｎｄ Ｃａｎｎｏｎ、１９７８）または３つの異なる濃度のＲＰＭＩ １６４０ミディアムに溶解させた（０．５、１．０、及び２．０ｍｇ／ｍＬ）。

製造例２．リゾチーム及びペルオキシダーゼ
ニワトリ卵白リゾチーム（ｈｅｎ ｅｇｇ−ｗｈｉｔｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＨＥＷＬ）及び牛ラクトペルオキシダーゼ（ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ｂＬＰＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を本発明のそれぞれリゾチーム及びペルオキシダーゼとして使用し、これをＳＳＢに溶解させた。分析には、３０．０μｇ／ｍＬ ＨＥＷＬまたは２５．０μｇ／ｍＬ ｂＬＰＯの濃度を使用した。

実施例１：ＨＡの菌発育阻止活性
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １０２３１、１８８０４及び１１００６を実験に使用した。サブロー寒天培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ、ＳＤＡ）で育ったＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの１コロニーをサブロー寒天培地に接種し、１８時間３７℃で撹拌して培養した。細胞を収獲後、洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０ミディアムｍｌ当たり１ｘ１０^５細胞の濃度で再懸濁した。ＨＡの菌発育阻止活性を測定するために、ＨＡを多様な濃度のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを含む１００ｍＬ ＲＰＭＩ １６４０ミディアムに溶解させ（０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）、上記培養を３７℃で撹拌して培養した。増殖期は、培養の光学密度を６００ｎｍで１時間間隔で測定して決定し、ＨＡがない培養と比較した。上記実験を４回繰り返した。

ＨＡは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ成長に阻害効果を示し、阻害効果は、実験に使用されたＨＡ濃度に比例した。ＨＡの阻害効果は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １１００６株で最も大きく、ＡＴＣＣ １８８０４株で最も少ない（図１、図２及び図３参照）。

実施例２：ＨＡのカンジダに対する殺活性
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ １０２３１、１８８０４及び１１００６の１コロニーを１０ｍＬのＲＰＭＩ １６４０ミディアムに接種し、１８ｈ時間３７℃で撹拌して培養した。細胞を回収後、洗浄し、ＳＳＢにｍＬ当たり１ｘ１０^５細胞の濃度で再懸濁した。ＨＡのカンジダに対する殺活性を測定するために、２０μＬの細胞懸濁液を多様な濃度で４０μＬのＨＡに添加した（最終濃度０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）。サンプルを３７℃で１．５時間培養し、毎１５分ごとに混合した。培養の終わりにサンプルを１０倍希釈し、５０μＬ（１６７細胞）の希釈した細胞をＳＤＡ板に三連にプレートし、３７℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性を実験板上のコロニー個数とＨＡがない対照群の板上のコロニー個数を比較し、測定した。細胞生存力の損失率（１−対照群の板に対する実験板のコロニー個数の比）をさらに計算した。上記実験を６回繰り返した。

ＨＡ（最終濃度０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）は、測定可能なカンジダに対する殺活性を示さないし、すべての３つの株で対照群（ＨＡがない群）と比較して実験プレート上のコロニー数字は、有意な差を示さなかった。

実施例３：ＨＡがリゾチーム及びペルオキシダーゼのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡをカンジダ細胞とともに培養し、その後、抗菌酵素で処理した場合）
上記のように培養されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞懸濁液をＳＳＢにｍＬ当たり１ｘ１０^５細胞の濃度で適用し、その後、２０μＬの細胞懸濁液を同一の量のＨＡに添加した（最終濃度０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）。サンプルを３７℃で１ｈ時間撹拌しながら培養した。４０μＬの細胞懸濁液を２０μＬのＨＥＷＬ（最終濃度３０μｇ／ｍＬ）または２０μＬのペルオキシダーゼ（最終濃度２５μｇ／ｍＬ ｂＬＰＯ、１ｍＭ ＫＳＣＮ及び１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２）に混合し、その後、３７℃で１時間撹拌しながら培養した。培養の終わりにサンプルを１０倍希釈し、５０μＬ（１６７細胞）の希釈した細胞をＳＤＡ板に三連でプレートし、３７℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性及び細胞生存力の損失率を計算した。上記実験を８回繰り返した。

ＨＡは、リゾチーム及びペルオキシダーゼシステムのカンジダに対する殺活性に対して阻害効果を示し、上記阻害効果は、ＨＡ濃度に比例した。阻害程度は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株によって異なるが、１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬのＨＡで本実験に使用されたリゾチーム及びペルオキシダーゼシステムのカンジダに対する殺活性がほぼ全て阻害された（表１及び表２参照）。

ＨＡがリゾチームのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡをカンジダ細胞とともに培養し、その後、リゾチームで処理した場合）
ＨＥＷＬ、ニワトリ卵白リゾチーム；ＣＦＵ、コロニー形成数字

ＨＡがペルオキシダーゼのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡをカンジダ細胞とともに培養し、その後、ペルオキシダーゼで処理した場合）
ｂＬＰＯ、ウシラクトペルオキシダーゼ；ＣＦＵ、コロニー形成数字

実施例４：ＨＡがリゾチーム及びペルオキシダーゼのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡを抗菌酵素とともに培養し、その後、カンジダ細胞で処理した場合）
２０μＬのＨＡ溶液（最終濃度０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬのＨＥＷＬ（最終濃度３０μｇ／ｍＬ）または２０μＬのペルオキシダーゼ（最終濃度２５μｇ／ｍＬ ｂＬＰＯ、１ｍＭ ＫＳＣＮ及び１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２）に添加し、その後、３７℃で１時間撹拌しながら培養した。上記混合物を２０μＬの細胞懸濁液に添加し、３７℃で１時間撹拌しながら培養した。培養の終わりにサンプルを１０倍希釈し、５０μＬ（１６７細胞）の希釈した細胞をＳＤＡ板に三連でプレートし、３７℃で一晩培養した。カンジダに対する殺活性及び細胞生存力の損失率を計算した。上記実験を８回繰り返した。

まずＨＡが抗菌剤と培養された場合、ＨＡは、また、リゾチーム及びペルオキシダーゼシステムのカンジダに対する殺活性に対して類似な阻害効果を示した。１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬのＨＡで本実験に使用されたリゾチーム及びペルオキシダーゼシステムのカンジダに対する殺活性を無能力にした（表３及び表４参照）

ＨＡがリゾチームのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡをリゾチームとともに培養し、その後、カンジダ細胞で処理した場合）
ＨＥＷＬ、ニワトリ卵白リゾチーム；ＣＦＵ、コロニー形成数字

ＨＡがペルオキシダーゼのカンジダに対する殺活性に及ぼす影響（ＨＡをペルオキシダーゼとともに培養し、その後、カンジダ細胞で処理した場合）
ｂＬＰＯ、牛ラクトペルオキシダーゼ；ＣＦＵ、コロニー形成数字

Claims (5)

1. ０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のヒアルロン酸を含む人工唾液において、リゾチーム３０μｇ／ｍＬ又はペルオキシダーゼ２５μｇ／ｍＬを含む人工唾液。
2. 上記ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体、ヒアルロン酸塩、またはヒアルロン酸自体及びヒアルロン酸塩の混合物であり、上記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛及びヒアルロン酸コバルトから成る群から選択される無機塩又は、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムである有機塩である、請求項１に記載の人工唾液。
3. 上記ヒアルロン酸の分子量は、１００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａである、請求項１に記載の人工唾液。
4. 上記人工唾液は、口腔乾燥症または口腔カンジダ症の治療用である、請求項１に記載の人工唾液。
5. 上記人工唾液は、唾液分泌の低下による余病の予防または治療用である、請求項１に記載の人工唾液。