JP2014176330A - メチルシトシン検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、核酸を制限酵素により断片化する工程と、該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸との間で2本鎖核酸を形成させる工程と、該2本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、該固相上で該2本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、を有する方法。これにより、測定対象のシトシン以外はすべてグアニンと塩基対を形成し、抗体により検出されず、長大なゲノムから測定対象の塩基配列部分の特定のシトシンのメチル化の有無を選択的に検出する。
【選択図】図1
Description
本発明は、上記発明が有するこの欠点を解消し、抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシンの検出法を用いて、ゲノムDNAにおける特定のシトシンのメチル化を選択的に検出し、その定量性および信頼性を向上させる手法を提供することを目的とする。
先ず、測定対象のゲノムDNA試料に制限酵素を加えることにより、DNAを断片化した。生成するそれぞれのDNA断片の核酸配列は、用いる制限酵素によって定まる。これにより、測定対象の特定の位置のシトシンを含む、特定の配列からなる測定対象核酸を、ゲノムからその断片として切り出すことができる。
なお、従来、DNAの断片化では、超音波などが用いられてきたが、このような方法では、不特定多数の断片が発生するため、後に特定の配列を増幅させるPCR法などでは特段問題にならないものの、以下に述べるとおり、測定対象核酸と相補性を有する核酸を検出試薬として用いる、本発明のメチルシトシン検出法には適していない。
その後、測定対象核酸と、測定対象のシトシンが塩基対を形成すべき塩基以外が当該測定対象核酸と相補的な配列を有する1本鎖核酸とを混合し、ハイブリダイズさせて、2本鎖DNAを形成させた。
当該1本鎖核酸の塩基配列は、測定対象核酸と2本鎖を形成出来る相補性と長さを有しつつ、測定対象シトシンとは塩基対を形成しない配列とする。また、形成する2本鎖DNAの末端に不対塩基が残らないように、制限酵素による切断によって生じる測定対象核酸の末端配列を考慮して設計する。
その後、形成された2本鎖DNAを、1本鎖核酸に設けた固相結合部を介して、固相に結合させることにより、固相上に回収した。残りのDNA断片は、洗浄により除去する。
その後、固相上に結合された2本鎖DNAを抗体と反応させた。
相補核酸と2本鎖を形成することにより、測定対象核酸の非測定対象位置にメチルシトシンが存在していたとしても、当該メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成することで抗体に認識される可能性が大幅に減少する。一方、塩基対を形成していない測定対象位置のメチルシトシンは、高効率の抗原抗体反応により認識される。これによって、選択的にゲノムDNAにおける特定シトシンのメチル化状態を検出することができた。
(1)測定対象である核酸を、制限酵素で切断し断片化する。
特定の塩基配列を認識し、核酸を切断する制限酵素は様々なものが知られているが、測定対象となる塩基配列を挟むように切断される制限酵素を選択する。なお用いる制限酵素は1つでも良いし、2つの組み合わせでも良い。
(2)目的とする塩基配列と2本鎖を形成しつつ測定対象のシトシンが塩基対を形成しないように設計された塩基配列を有する1本鎖核酸を加えてハイブリダイゼーションを行う。
通常、ゲノムDNAは生体内では2本鎖を形成している。このため1本鎖核酸を加えた後、断片化された核酸の融解温度以上に一旦加熱し1本鎖とし、再度徐冷することで、1本鎖核酸とハイブリダイゼーションさせることが望ましい。さらに、1本鎖核酸と高効率にハイブリダイゼーションさせるために、1本鎖核酸を測定対象核酸に対し過剰に加えることが好ましい。さらに、1本鎖核酸の塩基配列は、形成される2本鎖DNAの末端に不対塩基が残らないように、制限酵素との組み合わせを考慮して設計する。なお、上記1本鎖核酸は、後ほど固相上に回収するために固相結合部も併せ持つようにする。
(3)測定対象とハイブリダイゼーションした固相結合部を有する2本鎖核酸を、固相結合部を利用して回収する。
回収する際には、その後の検出法に合わせた固相を用意しておくとよい。例えば、表面プラズモン共鳴法では、金や銀薄膜上へ回収することが望ましい。マイクロタイタープレートのウエルへ回収し、酵素免疫測定法として検出しても良い。基板のような平坦のものだけでなく、ポリスチレンや磁性を有する粒子上に回収しても良い。
(4)抗体を導入し、結合した抗体量を検出することにより、シトシンのメチル化率を測定する。
例えば抗メチルシトシン抗体を加えるのであれば、測定対象のシトシンがメチル化されていれば、2本鎖核酸へ抗メチルシトシン抗体が結合することになる。表面プラズモン共鳴法では、抗体を酵素や蛍光体で標識することなく、屈折率の変化から検出することが可能である。また、従来のイムノアッセイ法に用いられてきた一般的手法を幅広く用いることが可能である。当業者には自明であるが、例えば、抗体を酵素や蛍光体、放射性同位体、金属ナノ粒子で標識する方法がある。また、これら標識した2次抗体を導入しての検出も可能である。
〈1〉核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、
核酸を制限酵素により断片化する工程と、
該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸との間で2本鎖核酸を形成させる工程と、
該2本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、
該固相上で該2本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、
を有する方法。
〈2〉抗体が抗メチルシトシン抗体であることを特徴とする、〈1〉に記載の方法。
〈3〉固相結合部がビオチンであり、固相がアビジンであることを特徴とする、〈1〉または〈2〉に記載の方法。
〈4〉2本鎖核酸への抗体の結合量を、表面プラズモン共鳴法により抗体の結合を検出することによって、測定することを特徴とする、〈1〉〜〈3〉のいずれかに記載の方法。
〈5〉2本鎖核酸への抗体の結合量を、抗体として西洋わさびペルオキシターゼを標識した抗体を用い、該抗体を結合させた後、該西洋わさびペルオキシターゼの基質を加え、該西洋わさびペルオキシターゼの反応生成物による吸光度変化を検出することによって、測定することを特徴とする、〈1〉〜〈3〉に記載の方法。
〈6〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所が脱塩基部位となっている塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈1〉〜〈5〉に記載の方法。
〈7〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、2本鎖核酸の形成時に、測定対象のシトシンがバルジ構造内に配置される塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈1〉〜〈5〉に記載の方法。
〈8〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所がアデニン、シトシン、もしくはチミンとなっている塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈1〉〜〈5〉に記載の方法。
〈9〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸を、測定対象の断片化核酸濃度の1倍以上100倍以下の量、加えて、2本鎖形成させることを特徴とする、〈1〉〜〈8〉のいずれかに記載の方法。
〈10〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸の塩基配列が、制限酵素で断片化された測定対象核酸と2本鎖を形成した際に、該2本鎖核酸が平滑末端を形成する塩基配列であることを特徴とする、〈1〉〜〈9〉に記載の方法。
〈11〉制限酵素と、測定対象の断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及びビオチンを有する1本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体と、固相化したアビジンを組み合わせて構成される、核酸配列中のメチルシトシン検出用キット。
本発明により、測定対象のシトシン以外はすべてグアニンと塩基対を形成することとなり、これによって非測定対象のメチルシトシンは検出されないこととなったため、長大なゲノムから測定対象の塩基配列部分の特定のシトシンのメチル化の有無を選択的に検出することが可能になった。これにより、従来の抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシン検出技術に比べ、シトシンのメチル化の検出の選択性は大幅に向上する。
本発明では、ゲノム中の測定対象となる塩基配列を有する核酸(図1-1)のみを選択的に測定するにあたり、先ず制限酵素によりゲノムDNAを任意の位置で切断する。用いる制限酵素は、測定対象領域の塩基配列に合わせて適宜選択することが可能である。例えば、AluI酵素では、5’-AGCT-3’のみを認識し、G-C間の核酸を切断することが知られている。制限酵素により、測定対象領域の塩基配列の断片を作製する(図1-2)。制限酵素の選択により、測定対象領域の塩基配列が定まる。
次にビオチン化した1本鎖核酸を加える(図1-3)。ビオチンは固相結合部として用いている。該ビオチン化核酸の塩基配列は、制限酵素により断片化された測定対象領域の核酸と2本鎖を形成できる相補性を有しつつ、測定対象のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列となっている。このような塩基配列としては、例えば、測定対象核酸の完全相補鎖である塩基配列から、測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンのみを除去した塩基配列が挙げられる。この場合、形成される2本鎖DNAでは、測定対象シトシンは、DNAバルジ内に配置されることになる。また、同様のことは、完全相補鎖内の測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンを、シトシンやアデニン、チミンと置き換えることでも可能である。この場合、形成される2本鎖DNAでは、測定対象シトシンは塩基対を形成できない状態となっている。また、完全相補鎖内の測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンの塩基部位のみを除去してデオキシリボースを残し、脱塩基部位とすることも可能である。この場合も、形成される2本鎖DNAでは、測定対象シトシンは塩基対を形成できない状態となっている。
さらに、該ビオチン化核酸の塩基配列は、測定対象核酸と2本鎖を形成した際に、2本鎖核酸の末端を揃えることで不対塩基が存在しない平滑末端と呼ばれる状態にせしめることが好ましい。平滑末端にするには、制限酵素の切断箇所と、ビオチン化した1本鎖核酸の塩基配列を合わせることにより可能である。平滑末端が好ましい理由としては、2本鎖核酸の末端に飛び出した不対塩基中にメチルシトシンが存在すると、そのメチルシトシンに抗体が結合し、実際のメチル化率よりも高値になるためである。仮に2本鎖核酸の末端に不対塩基が存在したとても、その不対塩基がメチルシトシンでなければ抗メチルシトシン抗体に認識されないので直接問題とはならない。しかしながら、上述したように制限酵素と、ビオチン化した1本鎖核酸の塩基配列の組み合わせにより、平滑末端を形成することは比較的容易であり、2本鎖DNAの末端に不対塩基がないことが好ましい。
さらに、該ビオチン化核酸は、断片化された測定対象核酸の濃度と同じ、もしくは多くする方が好ましい。これは、測定対象核酸が、元々2本鎖を形成していた核酸と、再ハイブリダイゼーションする確率を減らすためである。しかしながら、大過剰に加えると、後に固相上での回収率が低下するため好ましくない。このため、加えるビオチン化核酸は、断片化された測定対象核酸の1〜100倍程度が好ましい。
測定対象核酸とビオチン化した1本鎖核酸をハイブリダイゼーションさせる(図1-4)。ハイブリダイゼーションさせる方法としては、一旦、測定対象となる断片化核酸の融解温度(Tm値と呼ばれる)以上に加熱し、その後徐冷する。徐冷の際には、Tm値付近で30分程度保持することにより、ハイブリダイゼーションの特異性が向上する。
その後、ビオチン化した1本鎖核酸とハイブリダイゼーションした測定対象核酸をアビジン−ビオチン結合を用いて回収する(図1-5)。ビオチンとアビジン(およびストレプトアビジン)は強固に結合することが知られている。アビジンは、後の測定方法に合わせて、予め固相表面に固定化しておくと便利である。例えば表面プラズモン共鳴法では、金薄膜表面にアビジンを固定化する。酵素免疫測定法は、ポリスチレンやポリビニルクロライド製のマイクロタイタープレートのウエル内に固定化する。また、アビジンを固定化した磁性ビーズを用いる方法も広く知られている。なお、アビジンの固定化方法については従来知られている手法を幅広く用いることが出来る。
上記、アビジン固定化基板上に、測定対象核酸とハイブリダイズしたビオチン化核酸を含む核酸混合物を導入することにより、アビジン−ビオチン結合によって、測定対象核酸のみが選択的に基板上に固定化される。その後、基板を洗浄することにより、ビオチン化した核酸とハイブリダイゼーションしていない、非測定対象核酸は除去される。
その後、ビオチン化核酸とハイブリダイズし、基板上に固定化された測定対象核酸に、抗メチルシトシン抗体を結合させる(図1-6)。表面プラズモン共鳴法では、抗体の結合による屈折率変化を観測するので、抗メチルシトシン抗体は標識する必要はなく、そのままで検出可能である。酵素免疫測定法では、予め抗メチルシトシン抗体を西洋わさびペルオキシターゼなどの酵素で標識しておくか、2次抗体法により検出する。
本実施例では、本発明によってDNA中のメチルシトシンを、表面プラズモン共鳴法により測定可能であることを確認した実験結果を示す。
ポリジメチルシロキサン基板は、流路(幅3mm、長さ10mm、深さ20μm)の鋳型となる基板にポリジメチルシロキサン(PDMS)のオリゴマー(コーニング社製)と硬化剤を混合し、60℃で2時間放置することにより硬化させた。その後、鋳型からはずし、流路を有するPDMS基板を得た。
金薄膜を有するガラス基板は、以下の様に作製した。18mm角のBK7ガラス基板上に、直径3mmの穴を2つ開けたシールを貼った。その後、マグネトロンスパッタ装置(日本シード社製)を用いて、該ガラス基板上にチタンを3nm堆積させた後、さらに金薄膜を50nm堆積させた。マグネトロンスパッタ装置から取り出した後、シールを剥がすことにより、直径3mmの金薄膜を2つ有するガラス基板を作製した(図2-1)。
金薄膜表面へのアビジンの固定化は、以下の様に行った。まず、エタノールにカルボン酸デカンチオールを溶解させて1mM溶液を作製した。該溶液に金薄膜を有するガラス基板を一晩浸漬することにより、金―チオール結合により、金表面をカルボン酸デカンチオールで修飾した(図2-2)。その後、5mMのN-ヒドロキシスルフォスクシンイミドと40mMのN,N’-diisopropylcarbodiimideを含むMESバッファ(pH6.0)を5μL、金薄膜の一方にのみ滴下し、室温で30分反応させることで、カルボン酸デカンチオールのカルボキシル基を活性化した。その後、純水で金薄膜を洗浄し、0.1mg/mLのストレプトアビジン(リン酸緩衝液,pH7.4で希釈)を室温で二時間反応させた(図2-3)。純水で洗浄後、1Mエタノールアミン(リン酸緩衝生理食塩水,pH7.4で希釈)を室温で15min反応させ不活化後、純水で洗浄した。最後に、流路を形成したポリジメチルシロキサン基板と金薄膜を有するガラス基板を貼り合わせることにより、センサ化した。
一方、CpGがメチル化されてないλDNAとしてUnmethylated λDNA(プロメガ社、カタログ番号D1521)を用い、同様に断片化試料を調製した。本λDNAはdamおよびdcmメチラーゼ活性が欠損しており、メチルシトシンを含んでいないものとして販売されているものである。
なお、本発明者らも、このλDNAを用いて調製した断片DNAにおいては、測定対象のCpG領域のメチル化が1%以下であることを、COBRA法で確認している。
リン酸緩衝液を用いて10倍希釈系列を作製し、希釈した試料を流速2μL/分で30分間導入することにより、ビオチン化核酸をセンサ内のストレプトアビジンで捕捉した(図3-2)。なお、センサの一方にのみストレプトアビジンを固定化しておくことで、ストレプトアビジン固定化金薄膜表面のみでビオチン化核酸を捕捉可能である。
ランニングバッファとして、リン酸緩衝液(0.1%ウシ血清アルブミン,0.05% Tween20を含む)をセンサに15分間導入し、洗浄してセンサの応答を安定させた後、10μg/mLの抗メチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社)を導入し、センサ内に捕捉されたビオチン化核酸への抗体の結合量を表面プラズモン共鳴角度の変化として観測した。なお、センサの一方にのみストレプトアビジンを固定化してあるため、ストレプトアビジンが固定化されていない金薄膜表面での表面プラズモン共鳴角度の変化を、測定対象核酸以外による非特異吸着量として考えることができる。このストレプトアビジンを固定化していない表面は必須ではないが、これを用いることで、非特異吸着量を測定時に簡便に見積もることができる。
本実施例では、本発明で用いるビオチン化核酸ついて、測定対象のシトシンと塩基対を形成しない塩基配列にすることが適していることを示す。
GAC TTC-3(5’末端から13塩基目のCはメチルシトシン)(配列番号3)を用いた。この測定対象核酸と以下の6種類のビオチン化核酸とを、実施例1と同様の手順で、おのおのハイブリダイゼーションさせた。
5’-GAA GTC AAC AGG AC GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号4)では、測定対象シトシンはバルジ内に配置されるように設計されている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACA GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号5)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がAとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACT GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号6)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がTとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACC GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号7)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がCとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACd GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号8)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基が脱塩基部位(AP siteと呼ばれる)となってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACG GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号9)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がGとなって、完全相補鎖になっている。
まず、2本鎖を形成させた1nMのDNAを30分間,10μL/分でセンサチップへ送液することでセンサ表面に捕捉した。その後、各種濃度(0.25,0.5,1,2.5,5,10,25,50nM)の抗メチルシトシン抗体を10分間,10μL/分で送液した。なお、ランニングバッファとして、GEヘルスケア社のHBS-EPバッファ(pH7.4,10mM HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05%v/v Surfactant P20を含む)を用いた。その後、抗体を含まないバッファを5分間,10μL/分で送液した。その後、再生溶液として、50mM Gly-NaOH(pH10.6)を30秒,60μL/minで送液した。本再生溶液の条件では、DNAの2本鎖は維持しつつ、抗原抗体反応が解離することを確認してあり、繰り返し抗体の送液が可能である。
本実施例の結果は、本発明で用いるビオチン化核酸の塩基配列は、測定対象のシトシンと塩基対を形成しない塩基配列を有することが必要であることを明確に示している。
本実施例では、本発明の方法によってDNA中のシトシンのメチル化率を、酵素免疫測定法により測定可能であることを確認した実験結果を示す。
本実施例では、本発明の方法においては、ビオチン化1本鎖核酸を、測定対象となる核酸断片濃度の1倍以上100倍以下の量、加えることが適当であることを示す。
Claims (11)
- 核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、
核酸を制限酵素により断片化する工程と、
該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸との間で2本鎖核酸を形成させる工程と、
該2本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、
該固相上で該2本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、
を有する方法。 - 抗体が抗メチルシトシン抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 固相結合部がビオチンであり、固相がアビジンであることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 2本鎖核酸への抗体の結合量を、表面プラズモン共鳴法により抗体の結合を検出することによって、測定することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 2本鎖核酸への抗体の結合量を、抗体として西洋わさびペルオキシターゼを標識した抗体を用い、該抗体を結合させた後、該西洋わさびペルオキシターゼの基質を加え、該西洋わさびペルオキシターゼの反応生成物による吸光度変化を検出することによって、測定することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所が脱塩基部位となっている塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、2本鎖核酸の形成時に、測定対象のシトシンがバルジ構造内に配置される塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所がアデニン、シトシン、もしくはチミンとなっている塩基配列を有する1本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸を、測定対象の断片化核酸濃度の1倍以上100倍以下の量、加えて、2本鎖形成させることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する1本鎖核酸の塩基配列が、制限酵素で断片化された測定対象の核酸と2本鎖を形成した際に、該2本鎖核酸が平滑末端を形成する塩基配列であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 制限酵素と、測定対象の断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及びビオチンを有する1本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体と、固相化したアビジンを組み合わせて構成される、核酸配列中のメチルシトシン検出用キット。
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