JP2014026194A - レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 レーザー光源1からの光が音響光学変調素子4を通過し、さらに第1の瞳伝達拡大レンズ系5等を通過し対物レンズ16に送られて、対象物Sで反射して戻ってくる。反射戻り光は受光素子18、24で受光され、第1のデータ処理部21が、音響光学変調素子4等の制御信号および強度情報や位相情報の信号を元に、対物レンズ16の焦点深度内での3次元画像を得る。この3次元画像と第2のデータ処理部27で得られた3次元の位置情報とが、第3のデータ処理部31において処理され、共焦点レーザー走査型顕微鏡と同等の分解能で深さ方向の定量化がされる。
【選択図】図1
Description
本発明は上記背景に鑑みてなされたもので、対象物の深さ方向の情報を定量化して求めることで3次元画像を取得可能とすると共に、焦点深度以上の高低差を持つ対象物においても定量化された3次元情報を取得可能なレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記2つの光を1次元走査あるいは2次元走査する走査素子面を有し、制御信号に基づき2つの光を走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された2つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
前記対物レンズおよび対象物のいずれかを2つの光の光路とされる光軸に沿って移動させて、これらの間の距離を相対的に変化させる移動手段と、
前記対象物からの反射光あるいは透過光を受光して光電変換し、かつ前記光変調器によって生じる2つの光の分離方向に沿って配置される2つ以上の分割受光素子からなる第1の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換された各々の信号を和算または差算し、これら和算または差算に基づいて2つの光の位相情報および強度情報を得る信号比較手段と、
前記信号比較手段の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とから、対物レンズの焦点深度内の3次元画像を構築する第1のデータ処理部と、
対象物からの反射戻り光の光強度データに基づき、前記走査光学素子の制御信号および前記移動手段による移動量より3次元の位置情報を構築する第2のデータ処理部と、
前記対物レンズの焦点深度内の3次元画像と光強度データに基づく3次元の位置情報とにより定量化された3次元画像を構築する第3のデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査型顕微鏡とされるものである。
また、本発明に係わる光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる音響光学変調素子と、前記音響光学変調素子にキャリア交流信号と正弦波信号を印加する信号発生器と、を含むことや、前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる空間光変調器と、前記空間光変調器に振幅または位相情報として正弦波状の格子縞を書き込み、キャリア交流信号と正弦波信号を印加して、前記格子縞を一定方向に移動させる信号発生器と、を含むことが好適である。
さらに、本発明に係わる光電変換部で作成されたビート信号は、前記受光素子を構成する複数の分割受光素子のすべての分割受光素子の和信号、または、前記複数の分割受光素子の対応する位置にある分割受光素子同士の差信号より取得するものが好適である。
また、本発明に係わる移動手段による移動は、ステッピングモータ駆動によるステージ移動、ピエゾ素子による直接またはステージ移動とされることが好適である。
レーザー光源から出射されたレーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に光変調器が出射する。つまり、周波数fcと周波数fmの電気信号で光変調器である音響光学変調素子を駆動すると、周波数fcをキャリアとするAM変調により、周波数fc+fmと周波数fc-fmを有する2つのビームが発生する。キャリア周波数である周波数fcを数十MHz程度とし、数MHz程度の周波数fmを付与すると、音響光学変調素子のブラッグ回折角はかなり大きくなる。
この2つの近接したビームによるビート信号は、対象物が反射物体である場合には、音響光学素子とほぼ共役な位置に配置された受光素子により取得することができ、対象物が透過物体である場合には、ファーフィールドではあるが対象物からあまり離れていない位置に配置した受光素子により取得することができる。
そして、第2のデータ処理部が、対象物からの反射戻り光の光強度データに基づき、走査光学素子の制御信号および移動手段による移動量より3次元の位置情報を構築し、また、第3のデータ処理部が、対物レンズの焦点深度内の3次元画像と光強度データに基づく3次元の位置情報とにより定量化された3次元画像を構築する。このことから、対象物が反射物体であれば表面のプロファイルが測定され、対象物が透過物体であれば、実質的な屈折率差あるいは厚みが測定される。
また、透過型にすれば、生物や細胞を生きたままリアルタイムかつ高い分解能で観察、計測できるので、細胞等を不活性化して計測する電子顕微鏡にはない大きな特徴ともなる。
つまり、ヘテロダイン検波して得られた信号を直交変換した強度情報と位相情報により、1回の2次元走査でアッベの回折限界を大幅に超える分解能を持つ3次元情報を取得可能なレーザー走査型顕微鏡が実現可能となる。
図1は、本実施例に係るレーザー走査型顕微鏡の構成を示すブロック図である。この図1に示すように、光学系として、レーザー光が出射されるレーザー光源1と光を分離するための光変調器である音響光学変調素子(AOM)4との間に、コリメーターレンズ2及びビーム整形光学系3が配置されている。これらレーザー光源1および音響光学変調素子4は制御基板14にそれぞれ接続されていて、この制御基板14により動作がそれぞれ制御されるようになる。音響光学変調素子4に、キャリア交流信号としての周波数fcと正弦波信号としての変調周波数fmを制御基板14に内蔵の信号発生器が印加する。
そして、この第1のデータ処理部21は、制御基板14により制御されている音響光学変調素子4及び1次元走査ディバイス11、13の制御信号および信号比較器20からの強度情報や位相情報の信号を元に対象物Sのプロファイル等を作成する。つまり、この第1のデータ処理部21によって、強度情報や位相情報に基づく対物レンズ16の焦点深度内での3次元画像が得られることになる。
また、本実施例では、制御回路14により制御されつつ、対物レンズ16を光軸Lに沿って高精度に移動させる移動手段である移動機構26が配置されている。この移動機構26としては、例えばステッピングモータ駆動によるステージ移動や、ピエゾ素子による直接またはステージ移動とすることが考えられる。
この移動機構26により対物レンズ16を移動させるのに伴い、制御回路14からの1次元走査ディバイス11、13の位置情報と移動機構26の位置情報とから、画素ごとに受光素子24で受光される光強度が最も高くなる焦点が合った位置を第2のデータ処理部27で求める処理をし、3次元の位置情報を構築する。但し、移動機構26は、対物レンズ16を移動させる代わりに対象物Sを移動させる機構としてもよく、この場合にも上記と同等の効果が得られる。
以上より、対物レンズ16の焦点深度より深い高低差を持つ対象物Sにおいても測定が可能となる。なお、第3のデータ処理部31は、得られた3次元画像データを電子データとして保存する機能を有する。
回折光が第1の瞳伝達拡大レンズ系5の光軸Lを通るよう、音響光学変調素子4から第1の瞳伝達拡大レンズ系5への入射角にθの傾きを持たせる。また、第1の瞳伝達拡大レンズ系5は2群のレンズからなるのに伴い、入射側レンズ群の焦点距離をfin 出射側レンズ群の焦点距離をfoutとしている。
Ea=Aexpj(2π(fo+fc+fm)t)
Eb=Bexpj(2π(fo+fc-fm)t+δ)
この複素振幅Ebの式のδは、ビームLAのスポットAを基準としたビームLBのスポットBの高さ方向の位相差を表わし、foは光の周波数を表す。なお、前述したように、この2つのスポット間隔は、音響光学変調素子4に加えた変調周波数fmと拡大光学系の倍率m4によって決定されるので、走査速度とは無関係である。
図4は、対象物Sの形状である「試料形状」と分割受光素子18A、18Bに戻ってくる光を模式的に示している。つまり、受光素子18を分割された分割受光素子18Aと分割受光素子18Bで構成することとし、さらに、分割受光素子18Aの信号の値をaとし、分割受光素子18Bの信号の値をbとする。そして、対象物Sの平面部に入射した光は分割受光素子18A、18Bに対称に入射し、これらの差動を取ると、b−aの値は0となる。
これに対して、図4(A)では、対象物Sの緩い右上がり傾斜斜面にスポットA、Bが位置していて、対象物Sの緩い右上がり傾斜斜面からの戻り光は、分割受光素子18B側に偏るので、b−aの値はプラスになる。
この際、受光素子18で得られた信号を元にして得られ位相情報は微分情報となるため、符号は維持され、強度情報はその絶対値となるため、符号はプラスとなる。
I=(Ea+Eb)(Ea+Eb)*=A2+B2+2ABcos(2π*2fmt+δ)
したがって、信号比較器20を用いて、周波数2fmのヘテロダイン検波の位相比較を行うことにより、位相差δを測定することができる。このようにすれば、変調周波数fmを高くし、かつ、ビームを非常に接近させることができるので、横分解能を高くすることができると同時に、データの取得を高速に行うことができる。
図6(A)に示すような「対物レンズ焦点深度」を超えた高さを有する断面形状の物体である対象物Sの高さを測定した場合には、下記のようになる。
従来型のレーザー走査型顕微鏡では、図6(B)に示す「従来型横分解能」のように、高い横分解能で連続値として3次元の形状が取得できるが、対物レンズ焦点深度より対象物Sの高さが高いため、「対物レンズ焦点深度」の範囲をずらして2つの画像を取得しなければならならず、またこれに伴い深さ方向の形状の定量化が難しかった。
さて、上記のように音響光学変調素子にキャリア信号fcと変調信号fmの掛け算信号(DSB変調)を与えると、実質上、回折光は2つの僅かに分離したfc±fmの周波数を持った光となる。対物レンズで収束されるとΔxだけ分離した2つのビームとなり、各ビームプロファイルをu(x)とする。この場合、対物レンズから離れた場所では、表面プロファイルとビームプロファイルの積のフーリエ変換となる。
E=∫(Aejθ(x) u(x)ejkxdx・ej(ωc-ωm)t+Aejθ(x+Δx) u(x)ejkxdx・ej(ωc+ωm)tとなる。
I(k)=A2∫ej(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’e-j2ωmt
+A2∫e-j(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’ej2ωmt・・・・・(1)式
ここでまず、2つの受光素子の和信号がどのようになるかを考える。対象物Sから離れた位置では、フーリエ変換面であると考えられるので、受光素子で受光できる最大空間周波数をKmaxとすると、和信号では強度Iが下記式から求められる。
I=∫I(k)dk(積分範囲は-KmaxからKmax)
=A2∫cos(θ(x)−θ(x’+Δx’)−2ωmt) u(x) u(x’)sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)dxdx’
sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)=Kδ(x-x’)となるので、以下の(2)式のようになる。
I=A2∫cos(θ(x) −θ(x+Δx) −2ωmt) u(x)2dx・・・・・(2)式
(2)式を変形すると下記の式を得る。
Iq=A2∫cos(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2dx・cos(2ωmt)
Ii=A2∫sin(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2dx・sin(2ωmt)
Θ=tan-1(∫sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx/∫cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx)・・・・・(3)式
I=∫I(k)dk(積分範囲は0からKmax)−∫I(k)dk(積分範囲は−Kmaxから0)
=A2∫sin(θ(x)−θ(x’+Δx’)−2ωmt) u(x) u(x’)( cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)dxdx’
(cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)=δ’(x-x’)+1/x(δ(x)-1)となるので、下記(4)式のようになる。
I=A2∫d/dx(sin(θ(x)―θ(x+Δx)―2ωmt) )u(x)2dx・・・・・(4)式
さらに、この(4)式を変形すると、下記のようになる。
Iq=A2∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx・cos(2ωmt)
Ii=−A2∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx・sin(2ωmt)
Θ=tan-1(−∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx/∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx))u(x)2dx)・・・・・(5)式
まず、(3)式では、ビームの中心距離Δxだけ離れた2点の位相差をu(x)の重み関数で、平滑化した結果として得られる位相差を示しているので、ビーム内の平均的な位相差を示している。これは、微分干渉顕微鏡と等価な処理である。
図7は、本発明の実施例の構成を示すブロック図である。本実施例では、実施例1において存在していたビームスプリッター10、集束レンズ22、ピンホール23、受光素子24及び光電変換部25を取り除き、偏光ビームスプリッター8で反射して分離された反射戻り光が受光素子18に送られる構成とされている。
但し、前記1次元撮像素子35は、ライン方向に前記結像レンズ34の回折限界受光素子サイズを持つ受光素子が配列された受光素子アレイでもかまわない。
実施例1と同様の移動機構26により対物レンズ16を高精度に移動させ、制御回路14からの1次元走査ディバイス11、13の位置情報とこの移動機構26の位置情報から、画素ごとに前記1次元撮像素子35で受光される光強度が最も高くなる焦点が合った位置を第2のデータ処理部27で求める処理をし、3次元の位置情報を構築する。なお、対物レンズ16を移動させる代わりに対象物Sを移動させる機構としても効果が同等である。
図8は、本発明の実施例の構成を示すブロック図である。本実施例においても、実施例1において存在していたビームスプリッター10、集束レンズ22、ピンホール23、受光素子24及び光電変換部25を取り除き、偏光ビームスプリッター8で反射して分離された反射戻り光が受光素子18に送られる構成とされている。さらに、本実施例では、偏光ビームスプリッター8と受光素子18との間の反射戻り光の光軸上に、集束レンズ22及び、この収束レンズ22の焦点面に収束レンズ22の回折限界スポット径程度の径を有するピンホール23がそれぞれ配置されている。
また、制御基板14から1次元走査ディバイス11、13の各制御信号に合わせて、前記した強度情報や位相情報に基づき、共焦点光学系によって狭められた対物レンズ16の焦点深度内における3次元の画像を構築する。
また、実施例1と同様の移動機構26により対物レンズ16を高精度に移動させ、画素ごとに焦点が合った高さを記憶させる。なお、対物レンズ16を移動させる代わりに対象物Sを移動させる機構としても効果が同等である。
図9は、本発明の実施例の構成を示す透過型の光学系のブロック図である。
本実施例では、主要な光学系は、実施例1におけるビームスプリッター10、受光素子18、光電変換部19、および信号比較器20を削除し、この替りに、対物レンズ16で集光された光は透過することになるので、対象物Sをはさんで対物レンズ16と反対側に受光素子28を配置した。
本実施例の場合、反射型に比較して、対象物Sに近接して受光素子28を配置することができるので、取得できる空間周波数を非常に高く設定することが可能となる。この結果、対象物Sの有する空間周波数の再現性が良くなるので、横分解能の更なる向上が可能となる。特に、生きたままの状態で、生物や細胞等の観察や計測を非常に高分解能で実施できる。これは、電子顕微鏡のような高倍率であっても生体を殺した状態でないと観測できない測定器とは大きく異なる特徴である。
図10は、本発明の実施例の構成を示す透過型の光学系のブロック図である。本実施例における主要な光学系は、実施例2における偏光ビームスプリッター8、1/4波長板9、受光素子18、光電変換部19、および信号比較器20を削除し、前記実施例4で述べた対象物Sをはさんで対物レンズ16と反対側に配置された受光系である受光素子28を加えたものであるため、詳細な説明を割愛する。
図11は、本発明の実施例の構成を示す光学系のブロック図である。実施例1から実施例3において述べた反射光学系に、対象物Sをはさんで対物レンズ16と反対側に配置された受光系である受光素子28を加えたものであるため、詳細な説明を割愛する。なお、本実施例の代表例としては、この図11に示す実施例1の構成に透過系を加えた構成であり、このような構成によれば、1台のレーザー走査型顕微鏡で反射像と透過像をそれぞれ撮像可能となり、また同時に撮像することも可能となる。
2 コリメーターレンズ
3 ビーム整形光学系
4 音響光学変調素子
5 第1の瞳伝達拡大レンズ系
6 ピンホール
7 制限開口
8 偏光ビームスプリッター
9 1/4波長板
10 ビームスプリッター
11 第1の1次元走査ディバイス
12 第2の瞳伝達拡大レンズ系
13 第2の1次元走査ディバイス
14 制御基板
15 第3の瞳伝達拡大レンズ系
16 対物レンズ
18 第1の受光素子
19 光電変換部
20 信号比較器
21 第1のデータ処理部
22 集束レンズ
23 ピンホール
24 第2の受光素子
25 光電変換部
26 対物レンズ移動機構
27 第2のデータ処理部
28 第3の受光素子
29 光電変換部
30 信号比較器
31 第3のデータ処理部
32 表示装置
33 ビームスプリッター
34 結像レンズ
35 1次元撮像素子
36 光電変換部
S 対象物
Claims (10)
- レーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記2つの光を1次元走査あるいは2次元走査する走査素子面を有し、制御信号に基づき2つの光を走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された2つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
前記対物レンズおよび対象物のいずれかを2つの光の光路とされる光軸に沿って移動させて、これらの間の距離を相対的に変化させる移動手段と、
前記対象物からの反射光あるいは透過光を受光して光電変換し、かつ前記光変調器によって生じる2つの光の分離方向に沿って配置される2つ以上の分割受光素子からなる第1の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換された各々の信号を和算または差算し、これら和算または差算に基づいて2つの光の位相情報および強度情報を得る信号比較手段と、
前記信号比較手段の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とから、対物レンズの焦点深度内の3次元画像を構築する第1のデータ処理部と、
対象物からの反射戻り光の光強度データに基づき、前記走査光学素子の制御信号および前記移動手段による移動量より3次元の位置情報を構築する第2のデータ処理部と、
前記対物レンズの焦点深度内の3次元画像と光強度データに基づく3次元の位置情報とにより定量化された3次元画像を構築する第3のデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。 - レーザー光源から射出された直線偏光であるレーザー光を円偏光に変換すると共に、対象物からの円偏光である反射戻り光を再び透過させて、前記レーザー光と偏波面が直交する直線偏光にする1/4波長板と、
前記レーザー光と偏波面が直交している反射戻り光を光路から分離する偏光ビームスプリッターと、
前記偏光ビームスプリッターにより分離された戻り光を集光するレンズと、
前記レンズの焦点面に配置された空間フィルタと、
空間フィルタを透過した反射戻り光を受光して光電変換することで光強度データを得る第2の受光素子と、
を有することを特徴とする請求項1記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 走査光学素子が、
前記2つの光を前記光変調器の回折方向に沿って走査する第1の走査光学素子と、
前記2つの光を第1の走査光学素子と直交する方向に沿って走査する第2の走査光学素子と、
を含み、
前記第1の走査光学素子と前記第2の走査光学素子との間に配置されて、対象物からの反射戻り光を分離するビームスプリッターと、
前記ビームスプリッターにより分離された戻り光を集光して結像するレンズと、
第2の受光素子として前記レンズの焦点面に位置し、かつ前記光変調器によって生じる2つの光の分離方向に沿って配列される複数の分割受光素子からなる1次元撮像素子と、
を有し、
第2のデータ処理部が、前記1次元撮像素子により受光して光電変換された反射戻り光の光強度データに基づき、前記走査光学素子の制御信号および前記移動手段による移動量より3次元の位置情報を構築することを特徴とする請求項1記載のレーザー走査型顕微鏡。 - レーザー光源から射出された直線偏光であるレーザー光を円偏光に変換すると共に、対象物からの円偏光である反射戻り光を再び透過させて前記レーザー光と偏波面が直交する直線偏光にする1/4波長板と、
前記レーザー光と偏波面が直交している反射戻り光を光路から分離する偏光ビームスプリッターと、
前記偏光ビームスプリッターにより分離された戻り光を集光するレンズと、
前記レンズの焦点面に配置されたピンホールと、
を有し、
前記第1の受光素子が、該ピンホールを透過した光を受光することにより第2の受光素子を兼ねることができ、
該第1の受光素子の受光に伴い、前記第1のデータ処理部が、共焦点光学系により狭められた対物レンズの焦点深度内の3次元の画像を構築することを特徴とする請求項1記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記第1の受光素子が、対象物を透過した光を対象物の直下で受光することを特徴とする請求項1から請求項4の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- 前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる音響光学変調素子と、
前記音響光学変調素子にキャリア交流信号と正弦波信号を印加する信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項1から請求項5のいずれかに記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる空間光変調器と、
前記空間光変調器に振幅または位相情報として正弦波状の格子縞を書き込み、キャリア交流信号と正弦波信号を印加して、前記格子縞を一定方向に移動させる信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項1から請求項5のいずれかに記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記光学素子は、ガルバノミラーやレゾナントミラーによる1次元走査素子、非線形光学結晶やフォトニック結晶を用いた光走査ディバイス、2つの1次元走査ディバイスと瞳伝達拡大レンズ系よりなる2次元走査光学系、または、1次元または2次元のマイクロミラーディバイスとされることを特徴とする請求項1から請求項7の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- 前記光電変換部で作成されたビート信号は、前記受光素子を構成する複数の分割受光素子のすべての分割受光素子の和信号、または、前記複数の分割受光素子の対応する位置にある分割受光素子同士の差信号より取得することを特徴とする請求項1から請求項8の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- 前記移動手段による移動は、ステッピングモータ駆動によるステージ移動、ピエゾ素子による直接またはステージ移動とされることを特徴とする請求項1から請求項9の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
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