JP2014023502A - 新規アミラーゼ及びその利用 - Google Patents

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Abstract

【課題】 広範囲な化合物（アグリコン）に対してマルトトリオースを糖転移できる新規なアミラーゼを提供し、マルトトリオースが結合した配糖体を効率よく合成する。
【解決手段】 本発明に係るアミラーゼは、１６ＳｒＲＮＡに配列番号５の塩基配列を有するkitasatospora sp.の放線菌（MK-1785株）から取得され、デンプン、アミロース、マルトペンタオース、マルトテトラオース、マルトトリオースに作用し、シクロデキストリン、デキストラン、プルランには作用せず、デンプン又はグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を供与体として、アルコール性水酸基及び／又はフェノール性水酸基を有する受容体にマルトトリオースを転移する糖転移活性を有するマルトトリオース生成アミラーゼである。
【選択図】図１６

Description

本発明は、新規アミラーゼ、具体的にはマルトトリオースを生成し、特異的にマルトトリオースを様々な化合物の水酸基に糖転移する新規なアミラーゼに関する。
マルトオリゴ糖生成アミラーゼは、デンプン等のα−グルカンを基質として、ある特定の重合度のマルトオリゴ糖を生成するエキソ型のアミラーゼであり、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなど種々のマルトオリゴ糖の生成に用いられている。例えば、特許文献１（特開平１１−２１５９９７号公報）には、ラクトース、ガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−マルトテトラオースなどのガラクトシル−グルコースオリゴ糖に、サーモモノスポラ属の放線菌が生産するα−アミラーゼを作用させて、高純度のβ−１,４−ガラクトシル−マルトースを生成させる方法が開示されている。また、特許文献２（特開２０１２−１６３０９号公報）には、デンプンやアミロースなどのデンプンに、ストレプトマイセス属の微生物が生産するマルトトリオースを生成するアミラーゼを作用させて、マルトトリオースを製造する方法が開示されている。
アミラーゼは糖の加水分解反応の他に、糖を他の化合物の水酸基に転移する糖転移反応を触媒する。この糖転移反応に着目して、種々の配糖体を製造することが古くから試みられている。例えば、特許文献３（特開平１０−２６２６６１号公報）には、デンプンを供与体に、単糖、糖アルコール、フェノール類、アルコール類を受容体（アグリコン）にしてバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）由来のα−アミラーゼによる糖転移反応によって受容体の配糖体を生成することが記載されている。この酵素は、加水分解反応によってデンプンからマルトースを特異的に生成し、糖転移反応によって配糖体を生成する。また、特許文献４（特開平６−２７７０８７号公報）には、アミロースやデンプンを糖供与体に、イソフラボンやカテキンなどのフェノール性水酸基を有する化合物を受容体にして、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の糖化型α−アミラーゼによる糖転移反応によってこれら化合物の配糖体を生成させることが記載されている。この酵素は、デンプンを加水分解し、グルコースやマルトース、マルトトリオース及び分岐オリゴ糖を生成し、グルコース、マルトース、マルトトリオース等を糖転移する。特許文献５（特開平６−２８４８９６号公報）には、マルトオリゴ糖分解能を有する糖化型アミラーゼのによって、デンプンやアミロペクチン、マルトオリゴ糖などを糖供与体として、カテキンやレゾルシノールなどのポリフェノールを受容体にした糖転移反応が記載されている。この方法によると、１つのグルコースが糖転移したモノグルコシド配糖体及び一つのマルトースが糖転移したジグルコシド配糖体が生成する。さらに、特許文献６（特開２０１１−５１９３３号公報）には、ＤＥ１以下の糊化デンプンを糖供与体に、アントシアニジンを受容体にして、バチルス（Bacillus）属やアスペルギルス（Aspergillus）属の微生物由来のα−アミラーゼによる糖転移反応によってこれら化合物の配糖体を生成させたことが記載されている。
このような配糖体は、受容体に糖が結合した化合物であるので、受容体の安定性や水溶性が向上する、また、糖が結合することにより受容体にはなかった薬理作用を発揮することなどが期待される。例えば、ハイロドキノンのグルコシドであるアルブチンはチロシナーゼ阻害活性を有し、優れた美白作用を発揮することは周知の事実である。また、特許文献７（特開平５−３９２９８号公報）には、コウジ酸のグルコシド配糖体が記載されており、このグルコシド配糖体はコウジ酸に比べて光や熱に対する安定性が向上し、シミやそばかすの防止効果や美白効果を発揮することが記載されている。さらに、特許文献８（特開２００４−９９４７２号公報）には、マルトースやマルトトリオースなどのマルトオリゴ糖とグリセロールが１分子対１分子の割合でグルコシル結合したα−マルトシルグリセロールが記載されている。この化合物は、グルコースとグリセロールが１分子対１分子の割合でグルコシル結合したα−グルコシルグリセロールに比べて甘味が抑えられるが、加熱安定性、ｐＨ安定性に優れ、さらに、α−グルコシダーゼだけでなくα−アミラーゼに対する阻害活性も有している。さらに、特許文献９（特開平８−３２５２８９号公報）には、ゴマの種子から抽出された新規リグナン配糖体が記載されている。この配糖体はリグナン化合物に、１〜３の糖残基がグリコシド結合した化合物であり、特許文献１０（特開平８−２３１９５３号公報）には当該化合物がヒドロキシラジカル消去剤として利用できることが記載されている。
ところで、上記のような配糖体の生成にエキソ型アミラーゼの糖転移反応を利用した場合、例えば特許文献７や８に記載されたようにグルコース残基の数が異なる複数の配糖体が同時に生成し、特定のグルコース残基を有する配糖体のみを選択的に製造することが困難であり、グルコース残基数の異なる混合物から目的とする特定の数のグルコース残基を有する配糖体を単離、精製する必要がある。
特定のグルコース残基数のマルトオリゴ糖のみを糖転移するアミラーゼとして、非特許文献１や非特許文献２には加水分解反応によってマルトトリオースのみを生成するStreptomyces griseus由来のアミラーゼが開示されている。これらのアミラーゼは、フェノールやアルコール性の水酸基への糖転移を行うかどうかは不明である。また、非特許文献３〜５にもマルトトリオースを生成するアミラーゼが記載されているが、これらのアミラーゼは何れもエンド型のアミラーゼであり、残基数の異なるグルコースが転移した複数の配糖体を生じる。また、非特許文献３〜５にもマルトトリオースを生成するアミラーゼが記載されているが、これらのアミラーゼは何れもエンド型のアミラーゼであり、残基数の異なるグルコースが転移した複数の配糖体を生じる。
さらに、例えば、非特許文献５に開示されたように、グルコース基転移酵素（CGTase：Glucanotransferase）を用いた糖転移反応によりトリグルコシル配糖体を合成する方法も知られているが、表１に示すように反応効率が悪い。また、表１に示すように、α−グルコシダーゼを用いる方法ではマルトトリオ―ス配糖体を合成することができない。
特開平１１−２１５９９７号公報 特開２０１２−１６３０９号公報 特開平１０−２６２６６１号公報 特開平６−２７７０８７号公報 特開平６−２８４８９６号公報 特開２０１１−５１９３３号公報 特開平５−３９２９８号公報 特開２００４−９９４７２号公報 特開平８−３２５２８９号公報 特開平８−２３１９５３号公報
Usui, T. et al., Carbohydrate Research, 250, 57-66, 1993 K. Wako, et al., Journal of the Japanese Society of Starch Science, 26, 175-181, 1979 M.Arai, T. et al., J. Ferment. Bioeng, 68, 56-57, 1989 Y. Takasaki et al., Agric. Biol. Chem, 55, 687-692, 1991 Takasaki, Agric. Biol. Chem, 49, 1091-1097, 1985 H. Nakano et al., Journal of Bioscience and Bioengineering 95, 583-588, 2003
本発明は、広範囲な受容体化合物（アグリコン）に対してマルトトリオースを糖転移できる新規なアミラーゼを提供し、マルトトリオースが結合した配糖体を効率よく製造することを目的とする。
本発明に係るアミラーゼは、デンプン又はグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を糖供与体として、アルコール性水酸基及び／又はフェノール性水酸基を有するアグリコンにマルトトリオースを転移する糖転移活性を有するマルトトリオース生成アミラーゼであって、次の物理化学的特性を有する。
（１）分子量
約７２,０００〜約４９,０００ダルトン
（２）基質特異性
デンプン、アミロース、マルトペンタオース、マルトテトラオースを基質とするが、シクロデキストリン、デキストラン、プルランには作用しない
（３）ｐＨ安定性及び至適ｐＨ
３７℃、１０分間の処理で、ｐＨ５.５〜７.５で安定であり、至適ｐＨは前記条件にて６.０である
（４）熱安定性及び至適温度
１ｍＭのＣａ2+イオン存在下、ｐＨ６.０、１０分間の処理で５５℃ｍで安定であり、至適温度は５５〜６０℃である
本発明に係る酵素を用いると、マルトトリオースがフェノールやアルコール性水酸基に糖転移した種々のマルトトリオースグルコシドを効率よく合成できる。
図１はMK-1785株及びKitasatospora setae の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示した図である。 図２は精製G3アミラーゼのSDS-PAGEの結果を示す画像である。 図３は精製G3アミラーゼのデンプン分解産物のTLC分析結果を示す画像である。レーン１〜９は、それぞれ０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０分反応させた反応結果物、レーンＭはマーカー（G2-G7）を示す。 図４は精製G3アミラーゼの熱安定性を示す図である。 図５は精製G3アミラーゼの至適温度を示す図である。 図６は精製G3アミラーゼのpH安定性を示す図である。 図７は精製G3アミラーゼの至適pHを示す図である。 図８はpTrc-G3Aのプラスミッドマップである。 図９は精製組み換えG3アミラーゼのSDS-PAGEの結果を示す画像である。 図１０はコウジ酸のG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。レーン１はマルトテトラオース（G4）のみを、レーン２はG4とコウジ酸を、レーン３はコウジ酸のみを基質としたものである。 図１１はカフェ酸及びバニリンのG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１２はハイドロキノンのG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１３はプロトカテク酸のG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１４はカテキンG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１５はp-ニトロフェノールのG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１６はG5を供与体としたグリセロールのG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１７はG4及び可溶性デンプンを供与体としたグリセロールのG3配糖体のTLC分析結果を示す画像である。 図１８はG3-GlyのTLC分析結果を示す画像である。レーン１は可溶性デンプンのみを、レーン２は２０％グリセロールと可溶性デンプンを、レーン３は４０％グリセロールと可溶性デンプンを、レーン４は６０％グリセロールと可溶性デンプンを基質としたもの、レーンＭはマーカー（G2-G7）を示す。 図１９は種々のアルコールとマルトテトラオース(G4)を基質とした反応結果物のTLC分析結果を示す画像である。 図２０は種々のアルコールとデンプンを基質とした反応結果物のTLC分析結果を示す画像である。
本発明に係るアミラーゼは、デンプン又はグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を供与体として、アルコール性水酸基及び／又はフェノール性水酸基を有する化合物を受容体に上記供与体からマルトトリオースを転移する糖転移活性を有するマルトトリオース生成アミラーゼであって、次の特性を有するアミラーゼである。
（１）分子量
約７２,０００〜約４９,０００ダルトン
（２）基質特異性
デンプン、アミロース、マルトペンタオース、マルトテトラオースを基質とするが、シクロデキストリン、デキストラン、プルランには作用しない。
（３）ｐＨ安定性及び至適ｐＨ
３７℃、１０分間の処理で、ｐＨ５.５〜７.５で安定であり、至適ｐＨは前記条件にて６.０である。
（４）熱安定性及び至適温度
１ｍＭＣａ2+イオン存在下、ｐＨ６.０、１０分間の処理で５５℃まで安定であり、至適温度は５５〜６０℃である。
本発明に係るアミラーゼはエキソ型のアミラーゼであって、デンプンやグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を基質としてマルトトリオースを特異的に生成する。本酵素は上記したように加水分解反応でマルトトリオースを生成するだけでなく、アルコール性水酸基やフェノール性水酸基にマルトトリオースを転移する糖転移活性を有する。
本発明に係るアミラーゼ（以下、本発明においては「G3Amy」と言うことがある。）は、土壌から単離されたKitasatospora sp. MK-1785株から取得される。MK-1785株は、配列番号５に示された塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分類法は、原核細胞の系統分類法として確立された方法であり、配列番号５に示された塩基配列と既知の当該遺伝子の塩基配列とを比較して、全く同一であれば同一種と判断される。MK-1785株の当該塩基配列は、表１に示すようにKitasatospora属の細菌と高い相同性を示すが、配列番号５に示された塩基配列と同一の当該塩基配列を有する細菌は報告されておらず、MK-1785株は新種であってKitasatospora属細菌の近縁種（Kitasatospora sp.）とみなされる。図１にKitasatospora sataeの標準株との対比を示す。本発明のアミラーゼを生成する放線菌は、例えば、T-76（後述）などのエンド型α−アミラーゼの阻害剤を用いてエンド型のα−アミラーゼを阻害することで、エキソ型アミラーゼである本酵素が効率よくスクリーニングされる。
本発明に係るタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、上記の糖転移活性及びアミラーゼ活性を有するアミラーゼ酵素タンパク質である。すなわち、本発明に係るアミラーゼは、配列番号２に示されたアミノ配列において３４番目のアミノ酸から７１８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するポリペプチドからなり、このポリペプチドは、１つのアミラーゼ触媒ドメインと、１つのアミラーゼＣ末端ドメイン及び２つのCBM20に分類されるデンプン結合ドメインを有する。本発明に係るアミラーゼタンパク質には、上記の糖転移活性及びアミラーゼ活性を有する限り、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列からなるアミラーゼ酵素タンパク質が含まれる。
また、本発明に係るタンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ上記の糖転移活性及びアミラーゼ活性を有する分子量が約６７,０００〜約４９,０００ダルトンであるアミラーゼ酵素タンパク質である。このタンパク質は、少なくとも上記配列番号３に記載のアミノ酸配列において１番目のアミノ酸から４５９番目のアミノ酸配列を有し、１つのアミラーゼ触媒ドメインと、１つのアミラーゼＣ末端ドメインを含み、Ｃ末端側に存在する２つのCBM20に分類されるデンプン結合ドメインの少なくとも一部又は全部が切除されたものである。配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、菌体外プロテアーゼによりデンプン結合ドメインが切除される場合がある。その切断位置は一定ではなく、例えば、放線菌の培養液から抽出した場合には分子量が約５８,０００ダルトン（SDS-PAGEにおける移動度による）であるアミラーゼ酵素タンパク質が得られる。すなわち、このタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列においてＣ末端から１００〜２００個程度のアミノ酸が欠如したタンパク質（分子量が約５８,０００のアミラーゼ酵素タンパクの場合には１２０〜１３０のアミノ酸が欠如している。）であって、少なくとも配列番号４に記載のアミノ酸配列（アミノ酸配列から計算された分子量は約４８,８００ダルトンである。）を有する。当該本発明に係るアミラーゼタンパク質には、上記の糖転移活性及びアミラーゼ活性を有する限り、配列番号３に記載のアミノ酸配列のＣ末端から１００〜２００個程度のアミノ酸が欠如したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列からなるアミラーゼ酵素タンパク質が含まれる。
本発明に係るアミラーゼをコードするＤＮＡは配列番号１に記載の塩基配列からなり、G3Amyをコードする遺伝子（G3Amy遺伝子）である。G3Amy遺伝子の構造遺伝子部分は、2154bpのORFからなり、３３アミノ酸のシグナル配列を含む７１８アミノ酸のG3Amy前駆体をコードする。また、本発明に係るＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでも有り得る。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、配列番号１に記載の塩基配列から設計されたＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、例えば、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて0.7〜1.0MのNaCl存在下６５〜６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（１倍濃度ＳＳＣとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用いて、６５〜６８℃で洗浄することによりハイブリダイズすることができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
本発明に係るアミラーゼは、例えば、Kitasatospora sp. MK-1785株のように、配列番号５に示された塩基配列を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に有するKitasatospora属の放線菌培養液から、抽出精製することにより得られる。また、上記本発明に係るＤＮＡ、例えば配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、さらには上記本発明のアミラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターが組み込まれた組換え体を培養することにより生産され得る。放線菌の培養や組換え体の培養方法や培養条件、培養した微生物から酵素を抽出・精製する方法は公知の方法が用いられ得る。また、組換え体となる宿主細胞やＤＮＡが組み込まれるベクターも公知のものが用いられ得る。自然界に存在する放線菌の培養液から抽出精製した場合には、CBM20に分類されるデンプン結合領域が欠損した分子量が約４９,０００〜約６７,０００ダルトン、例えば約５８,０００のアミラーゼが得られる。また、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを用いて生産された組換えアミラーゼの場合には、CBM20に分類されるデンプン結合領域を有する分子量が約７２,０００ダルトンのアミラーゼが得られる。この２種類のアミラーゼは、下に述べる糖転移活性を有している点では変わりがない。
本発明に係るアミラーゼは、デンプンやグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を供与体として、マルトトリオースを特異的に糖転移する糖転移活性を有する。従って、本発明に係るアミラーゼを用いて、マルトトリオースのみが転移した配糖体を合成できる。
本発明に係る配糖体の製造方法は、前記本発明に係るアミラーゼのマルトトリオ―ス特異的糖転移活性を利用する方法である。当該糖転移反応に用いられる供与体は、デンプンやグルコースの重合度が４以上であるマルトオリゴ糖である。マルトオリゴ糖は例えばマルトテトラオースであり、マルトペンタオースであり、マルトヘキサオースであり得る。また、デンプンはアミロースであり、アミロペクチンであり、これらの混合物であり得る。反応性を考慮すると、水溶性のデンプンが好ましく用いられる。糖受容体（アグリコン）は、アルコール性水酸基又はフェノール性水酸基を１以上有する化合物が対象となり、複数の水酸基を有する化合物、例えばポリフェノールでもよい。アルコール性水酸基を有する化合物は、例えば、メタノールであり、エタノールであり、プロピルアルコール（直鎖、分岐鎖を問わず）であり、ブタノール（直鎖、分岐鎖を問わず）であり、エチレングリコールであり、プロピレングリコールであり、グリセロールであり得る。また、フェノール性水酸基を有する化合物は、例えば、フェノールであり、ｐ−ニトロフェノールであり、ハイドロキノンであり、コウジ酸であり、バニリンであり、プロトカテク酸であり。カテキンであり、レゾルシノールであり、α−レゾルシン酸であり、ルチンであり、フラボンであり、イソフラボンであり得る。また、特許文献９に記載されたようなリグナン化合物でもあり得る。なお、２以上の水酸基を有する化合物との間では、いずれかの水酸基にマルトトリオースが転移した配糖体のみならず、２個以上の水酸基にマルトトリオースが転移した配糖体も生成され得る。
配糖体合成は、酵素反応を利用した一般的な条件で行うことができる。反応温度や反応ｐＨ、反応時間、供与体や受容体の基質濃度、溶媒は供与体や受容体の種類により適宜定められ、特段の制約はない。反応温度や反応温度は酵素の至適温度や至適ｐＨで行うのが好ましいが、反応温度は、例えば、３０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃であり、反応ｐＨは、例えば５.０〜８.０、好ましくは５.５〜７.５である。
本発明に係るアミラーゼは、デンプンの非還元末端からマルトトリオースを生成しながら分解するエキソ型アミラーゼなので、反応生成物中にマルトトリオース以外のオリゴ糖やグルコースはほとんど存在せず、高純度のマルトトリオースを製造できる。また、マルトトリオースを特異的に転移することから、他のα−アミラーゼや糖転移酵素を用いた反応に比べて生成反応物の精製が容易になり、配糖体の生産効率の向上が期待される。特に、マルトトリオース配糖体の製造が容易になることより、薬理作用を有する新規化合物の提供が期待され、配糖体化することによって安定性や溶解性の向上を図ることが期待される。
次に本発明について、下記の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。なお、下記の実施例はあくまでも例示であり、本発明は下記の実施例に限られることがないのはいうまでもない。
〔G3Amyの取得〕
１．スクリーニング
１次スクリーニングで土壌サンプルから放線菌を単離した。次いで２次スクリーニングとして、単離した放線菌から、放線菌由来の蛋白性アミラーゼ阻害剤T-76を用いて目的とするアミラーゼを生産する放線菌を単離した。蛋白性アミラーゼ阻害剤T-76は、放線菌の主要なエンド型アミラーゼを阻害することが知られており（M Hayakawa, H Nonomura, Actinomycetol., 3, 95-104, 1989）、これを用いればエンド型アミラーゼの影響を受けずに目的であるエキソ型アミラーゼをスクリーニングすることができる。
（１次スクリーニング）
採取された土壌サンプルを用いて、新井らの方法（M.Arai, T. Nishimura, K. Tanaka, T. Kawaguchi, H. Hayashi, Y. Shimazu, S. Murao, J. Ferment. Bioeng 68 56-57 (1989)）により１次スクリーニングを行った。
土壌サンプルのスパーテル小さじ一杯分を5mlの滅菌水に懸濁し、5分間程度静置した。この上清の200μlを1.8mlの前処理液に加え、40℃で20分間振盪した後、滅菌水で10倍に希釈した。この溶液の100μlを分離用培地に塗布し、30℃で5-7日間培養を行った後、生育した放線菌を単離した。単離した放線菌は保存用培地で保存した。前処理液、分離用培地、保存用培地の組成を表２〜４に示す。
（２次スクリーニング）
１次スクリーニングで単離した放線菌から、目的とするアミラーゼを生産する菌をスクリーニングした。候補株を、振盪用培地を10mlずつ分注した太試験管に植菌し、30℃で5日間振盪培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離（10,000rpm, 10min,4℃）することで培養上清を回収した。培養上清は4℃で保存した。振盪用培地の組成を表５に示す。
次に培養上清に含まれる分解産物を薄層クロマトグラフィによって検出した。保存した培養上清の10μlに、15μMのT-76を含む溶液10μl、1.5w/v％可溶性デンプン（MERCK社製）溶液30μlを加え、37℃で一晩反応させ、反応溶液を薄層クロマトグラフィに供した。MERCK社製（シリカゲル60,F254）のシリカゲルプレートを用い、展開溶媒として1-ブタノール：エタノール：クロロホルム：25％アンモニア＝4：5：2：8（容量比）の混液を用いた。展開後、よく乾燥させて再び同じ展開溶媒を用いて展開、乾燥させ、検出液を吹き付けた。検出液として濃硫酸100mlに対してバニリン１gを溶かした溶液を用いた。その後、120℃で数分間加熱し、発色させた。これにより、ある特定の重合度のマルトオリゴ糖のみ生成する株を有力株とした。
このように１次スクリーニングで単離した２０００株のすべての株について２次スクリーニングを行った結果、T-76阻害剤の存在下でマルトトリオース（G3）のみを生産する放線菌（MK-1785株）を得た。
２．MK-1785株の同定
G3アミラーゼ生産菌MK-1785株について、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、その配列を用いて帰属分類群を推定した。
16S rRNA遺伝子をPCRによって増幅し、回収された増幅断片をプラスミドであるpBluescript II KS (+) のECoR Vサイトに挿入した。その後、当該プラスミドを大腸菌DH5αF'に形質転換した。この形質転換体から抽出したプラスミドの挿入部分塩基配列をシークエンス解析により決定した。なお、シークエンス解析はバイオマトリックス社、Takara バイオ社ドラゴンジェノミクスセンターに委託した。
DNA断片の増幅は表６及び表７に示す条件にてPrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いて行った。また、増幅のために、放線菌の中で高度に保存されている領域をもとに設計された表８に示すプライマーを用いた。
これにより、MK-1785株の16S rRNA遺伝子の塩基配列の一部を決定した。当該塩基配列に基づきBLASTで検索したところ、MK-1785株Kitasatospora属と高い相同性を示した。その塩基配列及びBLAST結果を図１及び表９に示す。よって、本菌をKitasatospora sp. MK-1785株と命名した。マルトトリオース生成アミラーゼ生産放線菌は上記のようにStreptomyces属では公知であるが（非特許文献１や特許文献１０）が、Kitasatospora属の該アミラーゼ生産放線菌はこれまでに知られていない。
３．Kitasatospora sp. MK-1785株由来G3アミラーゼ（G3Amy）の精製
MK-1785株を大量培養して、G3アミラーゼの精製を行った。まず、表４に示した振盪用培地を用いて大量培養を行った。10mlの培地を入れた太試験管4本にMK-1785株を植菌し、30℃で3日振盪培養（140strokes/min）した。種培養により得られた培養液を2L容坂口フラスコ4本（計2L）に植菌して、30℃で3日間振盪培養（96strokes/min）を行った。
次に、培養液から酵素を回収及び精製を行った。前記培養液に、20%飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し溶解させた。これを、あらかじめ20%飽和量の硫酸アンモニウムを含む20mMトリス緩衝液（pH 7.0）で平衡化させたButyl-TOYOPEARL 650M（東ソー社製）に負荷した。同緩衝液で洗浄後、硫酸アンモニウムの飽和度が30-10%の逆グラジエントによって、樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。その結果、12%飽和硫酸アンモニウム濃度付近でアミラーゼ活性が検出された。この活性画分の一部について、T-76阻害剤存在下での可溶性デンプンの分解産物を薄層クロマトグラフィで確認したところ、G3のみが検出された。そこで、当該T-76阻害剤存在下でアミラーゼ活性が確認された画分を回収した。回収した活性画分を20mMトリス緩衝液（pH 7.0）で、一晩4℃で透析し、20mMトリス緩衝液（pH 7.0）で平衡化させたDEAE-TOYOPEAL 650Mに負荷し、アミラーゼ活性が確認された非吸着画分を回収した。
回収した非吸着画分をさらにSDS-PAGEに供した。SDS-PAGEに供したところ、単一なバンドとして検出され、当該バンドから電気泳動的に均一なアミラーゼを回収した。SDS-PAGEによる結果を図２に示す。また、精製過程における酵素活性、タンパク量を測定し、精製表にまとめた。精製表を表１０に示す。SDS-PAGE、酵素活性の測定、タンパク量の測定は下記方法により行った。
（SDS-PAGE）
SDS-PAGE（SDS-Polyacrylamide gel電気泳動）は、Leammli (1970) の方法に従って行った。分離ゲル、濃縮ゲルの2層を調製してゲルを作製した。試料溶液を2×sample buffer (0.125M Tris-HCl、20％glycerol、2％SDS、2％2-mercaptoethanol、0.001％bromophenol blue、pH 6.8)に等量混合し、100℃で10分間熱処理してSDS-PAGE用の試料とした。縦型スラブゲル電気泳動装置（ATTO社製）を用いて、泳動用緩衝液（0.1％SDS、25mM Tris base、192 mM glycine）の中で、試料が分離ゲルに到達するまでゲル1枚につき、10mAの一定電流を、分離ゲルに到達して以降は20mAの一定電流を流すことにより電気泳動を行った。泳動後、イオン交換水で洗浄し、染色液（0.2％CBB R-250、50％ethanol、10％acetic acid）に浸し、55℃で1時間振盪して染色した。その後、イオン交換水で洗浄し、脱色液（10％methanol、7.5％ acetic acid）に浸してゲルの上にキムワイプ（登録商標）を重ね、55℃で振盪することでゲルを脱色した。
（酵素活性の測定：Somogyi-Nelson法）
適当に希釈した粗酵素液200μlに300μlの基質溶液を加え、10分間、50℃にて反応させた。反応後、500μlのSomogyi液を加えて反応を停止させ、15分間、100℃にて煮沸した。その後、5分間、流水中で冷却し、500μlのNelson液を加えて攪拌した。30分間、室温にて放置し、3.5mlのイオン交換水を加え、攪拌した。その後、分光光度計で500nmの吸光度を測定した。同粗酵素液200μlに500μlのSomogyi液を加えたものに300μlの基質溶液を加えたものをブランクとした。生成した還元糖量を算出し、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖量を生成する酵素量を1Uとした。
（タンパク量の測定）
V-530型分光光度計（日本分光社製）を用いて、280nmの吸収を測定することによりタンパク量を求めた。
４．Kitasatospora sp. MK-1785株由来G3アミラーゼ（G3Amy）の同定
精製アミラーゼについて、可溶性デンプンと一定時間間隔で反応させた後、TLCによって反応産物を確認したところ、反応初期からG3のみを生成した。反応は、精製アミラーゼを適当に水で溶解した液10μlに1.5%可溶性デンプン400μlを加え反応させ、一定の間隔でサンプリングした。反応産物の検出は上記方法による薄層クロマトグラフィで行った。この結果を図３に示す。反応産物としてマルトトリオースのみが検出され、反応産物は経過時間とともに増加した。この結果、精製されたアミラーゼは、エキソ型のG3アミラーゼであることが分かった。
また、精製アミラーゼについて、次のN末端アミノ酸シークエンス解析を行ったところ精製アミラーゼのN末端アミノ酸配列は「(G,A,M)(Q,N,A)(T,P)PNGGDVIANLFQWN」であり、このN末端アミノ酸配列はゲノム配列が解読されたKitasatospora setae推定α-アミラーゼ遺伝子のアミノ配列と完全に一致した。
（N末端アミノ酸シークエンス解析）
精製アミラーゼをSDS-PAGE（分離ゲル：12.5％）に付した後、ゲルをブロッティング液C（0.02％SDS、25mM Tris base、20％methanol, 25mM boric acid）中で5分軽く振盪した。ゲルの大きさに切った濾紙（ADVANTEC社製No. 526）を6枚用意し、ブロッティング液A（0.02％SDS,300mM Tris base、 20％methanol）、ブロッティング液B（0.02％SDS、25mM Tris base、20％methanol）、ブロッティング液Cにそれぞれ2枚ずつ15分間浸した。ゲルの大きさに切ったPVDF膜（MILLIPORE社製 Pore Size：0.45μm）をメタノール中で10分間振盪し親水処理を行った後、ブロッティング液Cに15分間浸した。次にセミドライ式 ブロッティング装置（Bio-Rad社製）のマイナス極側から、濾紙2枚（ブロッティング液C）、ゲル、PVDF膜、濾紙2枚（ブロッティング液B）、濾紙2枚（ブロッティング液A）の順で重ね、プラス電極を乗せた。ゲル1cm2あたり2mAの定電流で50分間泳動し、タンパク質のPVDF膜への転写を行った。転写後のPVDF膜を超純水で軽く洗った後、染色液（0.1％CBB R-250、45％ethanol、10％acetic acid）で5min染色後、脱色液1（45％methanol、7％acetic acid）中で15min振盪し、超純水で3回洗った。最後に脱色液2（90％methanol、7％acetic acid）で40秒間振盪した後、PVDF膜を乾燥させ、シーケンスのサンプルとした。N末端アミノ酸シーケンス解析は、株式会社nippi バイオマトリックス研究所に委託した。
５．Kitasatospora sp. MK-1785株由来G3アミラーゼ（G3Amy）の酵素的性質
Ａ. 熱安定性、至適温度、pH安定性、pH反応性
G3アミラーゼ（G3Amy）について、熱安定性、至適温度、pH安定性、至適pHを調べた。酵素活性は上記Somogyi-Nelson法により調べた。これによると、pH安定性は12時間処理で5.5乃至7.5で80％以上の残存活性を有し、至適pHは6.0であった。また、熱安定性は1mMCa2+イオン存在下、10分処理で60℃まで80％以上の残存活性、20分処理で55℃まで80％以上の残存活性を有し、至適温度は55℃乃至60℃であった。また、トリス緩衝液によって酵素活性が阻害されることがわかった。これらの結果を図４〜７に示した。
（熱安定性）
精製G3アミラーゼを溶かした試料溶液（酢酸緩衝液pH6.0、1mMのCaCl2を含む）を、20〜60℃の各温度で、10分間処理し、氷冷後、その後の残存活性を37℃で測定した。
（至適温度）
上記試料溶液を30〜60℃の各温度に保温した基質溶液に添加し、10分間反応させ活性を測定した。基質溶液は1.5%可溶性デンプン溶液（酢酸緩衝液pH6.0、1mMのCaCl2 を含む）を用いた。
（pH安定性）
上記試料溶液をpH3〜11の間で、以下に示す80mMの各pH緩衝液で10倍希釈し、37℃、10分処理後、200mMトリス緩衝液pH7.0でさらに10倍希釈することで、残存活性を37℃、pH7.0で測定した。
pH3〜6 ：クエン酸緩衝液
pH6〜9 ：トリス緩衝液
pH9〜11 :グリシン緩衝液
（至適pH）
上記試料溶液をpH3〜9の間で、以下に示す各pHに調整した基質溶液と反応させたときの活性を調べた。基質を調製する際の各pHの緩衝液は下記のものを100mMで使用した。
pH3〜6 ：クエン酸緩衝液
pH6〜9 ：トリス緩衝液
Ｂ.基質特異性
基質として、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、アミロース、デキストラン、プルラン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースを終濃度1％になるように20mM酢酸バッファー（pH6.0、1mMのCaCl2を含む）に溶解または懸濁した。さらにアミロース溶液はオートクレーブ（121℃、20分間）を行った。各基質150μlに100μlの試料溶液を加え、経時的にサンプリングし、上記方法による薄層クロマトグラフィで分解産物を確認した。その結果、シクロデキストリン、デキストラン、プルランに対しては分解活性を示さず、アミロース、マルトオリゴ糖に対してはマルトトリオースまで分解した。
これまで幾つかのマルトトリオース生成アミラーゼが開示されているが、これらの酵素と比較すると、本発明に係る酵素（G3Amy）は他の酵素に比べて、熱安定性及び最適温度が高い。また、本発明に係る酵素は、マルトオリゴ糖分解反応の際、分解反応初期に基質としたマルトオリゴ糖よりも重合度の大きいマルトオリゴ糖を生成することが確認された。この反応機構はS. griseus 由来G3生成アミラーゼでも報告されており（非特許文献４)、糖転移反応産物であることが示唆された。また、弱いながらもマルトトリオース分解活性を示すことがわかった。これも前記S. griseus 由来G3生成アミラーゼと同様の性質であった。pH安定性、至適pH、熱安定性、至適温度、反応様式を表１１にまとめた。
６．クローニング
本酵素G3AmyのN末端配列がKitasatospora setaeの推定α-アミラーゼの配列と完全に一致したため、この推定アミラーゼ遺伝子を基に縮重プライマー（表１１参照）を設計した。この縮重プライマーを用いてPCRを行い、一部DNA断片を取得した。この取得断片の一部をプローブとしたサザン解析を行ったが、制限酵素地図を作成できなかった。そこで、約8kbのSph I消化断片に目的遺伝子全長が含まれていることを予想し、ゲノムライブラリーを作製、PCRを検出手段として用いたスクリーニングによって目的遺伝子の全長を取得した。
本菌のゲノムをSph Iで消化し、6kb付近のゲノム消化断片をアガロースゲルより回収した。この断片をSph I消化およびBAP処理を行ったpUC118に挿入し、大腸菌DH5αF'に形質転換した。形質転換体約1000株を上記表５及び表６に示す条件でPCRを行ってスクリーニングした結果、アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドを保持する形質転換体を1株取得した。この形質転換体から抽出したプラスミド（pUC-G3A）をいくつかの制限酵素で消化した断片をプラスミドpBluescriptII KS(-)にサブクローニングしたものに加え、6種のプライマーを用いてシークエンス解析を行った。その結果、pUC-G3Aにはアミラーゼ遺伝子全長を含んでいることがわかった。
シークエンス解析の結果、取得したpUC-G3Aにはアミラーゼ遺伝子全長を含んでいることがわかった。得られた遺伝子は2349bpのORFからなり、33アミノ酸のシグナル配列を含む718アミノ酸の前駆体タンパクをコードし、N末端側にα-アミラーゼ領域、C末端側にCBM20に分類されるデンプン結合領域が2コピー存在していた。さらに精製酵素のN末端アミノ酸配列と完全に一致する配列が見られ、得られた遺伝子は目的のG3Amy遺伝子であることが示唆された。またK. setae推定アミラーゼとのアミノ酸配列の相同性は85％であった。アミノ酸配列から計算される分子量は71,800であり精製酵素と比較して大きいため、精製酵素はC末端の領域でプロセシングを受けていることが示唆された。この実験によりエキソ型G3生成アミラーゼの1次構造が始めた明らかにされた。得られたG3Amy遺伝子全長を配列番号３に示す。
７．高発現ベクターの構築および発現
G3Amyを大量に得るために高発現ベクターを作製し、G3Amyの発現を行った。G3Amy全長遺伝子を含んだpUC-G3Aを鋳型とし、表１３に示すプライマーを用いて表５及び表６に示す条件でPCRを行いて増幅した。増幅のために、pBluescriptII KS（-）、pTrc99Aの各ベクターのマルチクローニングサイトへの遺伝子挿入を考えてプライマーを設計し、EcoR I、Nco I サイトを付加したG3amyNcoI_Fをforward primerに、終止コドンにBamH Iサイトを付加したG3amypET_Rをreverse primerに用いた。
次に、増幅した遺伝子を、まず、pBluescriptII KS（-）のEcoR I、BamH Iサイトに挿入して構築したプラスミドpBs-G3A2を大量調製した後、pBS-G3A2をNco I、BamH I サイトで消化して発現用ベクターpTrc99AのNco I、BamH Iサイトに挿入することで発現用プラスミドpTrc-G3Aを構築した。構築したpTrc-G3Aのプラスミドマップを図８に示す
pTrc-G3Aを大腸菌大腸菌JM109（DE3）に形質転換し、IPTG（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside：終濃度1mM)を含む2×TY培地で30℃および37℃の条件で培養した。得られた培養液をマイクロチューブに入れ、遠心分離によって菌体を回収し、500μlのトリス緩衝液（pH7.5）を加え懸濁した。これを氷水上で、Handy Sonic UR-20P（トミー精工社製）により超音波破砕した。超音波破砕は、Power control 7、30秒の条件で4回行い、細胞破砕液を調製した。細胞破砕液を遠心分離し、上清を回収し、これを可溶性画分とした。また、沈殿を500μlのトリス緩衝液（pH7.5）に懸濁しこれを不溶性画分とした。
培養後、可溶性画分及び不溶性画分中のアミラーゼ活性をそれぞれ確認したところ、30℃でIPTG添加時の発現量が最も高く、不溶性タンパクとして発現していなかったので、30℃でG3Amyを発現させることにした。また、G3Amyはペリプラズム画分に分泌していることがわかった。
８．G3Amyの大量生産
pTrc99Aをベクターとした時にG3Amyが高発現し、G3Amyはペリプラズム画分に分泌していることがわかったので、ペリプラズム画分からG3Amyを得ることにした。
pTrc99A-G3Amyを形質転換した大腸菌を100ml容三角フラスコ中に入った30mlの2×TY培地に植え、30℃にて一晩前培養した。さらに、5mlの前培養液を500mlの2×TY培地の入った2L坂口フラスコ4本に植え継ぎ、本培養を行った。培養開始6時間後に、IPTG（終濃度1mM）を添加し、さらに5時間培養した後に集菌した。
集菌した形質転換株を40mlの2×TY培地で一晩培養したものを前培養とし、500mlの2×TY培地1％に接種して24時間の培養を行なった。この培養液を遠心分離（10,000r.p.m.、10分間、25℃）で集菌し、200mlの25％スクロースを含む10mM Tris-HCl（pH7.0）で洗浄し、遠心分離（10,000r.p.m.、10 分間、25℃）を行ない集菌する作業を2回行なった。さらに、25％スクロース、1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl（pH 7.0）に菌体を懸濁して室温で10分間振盪し、遠心分離（10,000r.p.m.、10分間、25℃）により菌体と上層に分けた。次に集菌した菌体に氷上で冷やした200mlの蒸留水に懸濁し、4℃で10分間振盪した後、遠心分離（10,000r.p.m.、10分間、4℃）により得られた上層をペリプラズム画分とした。
得られたペリプラズム画分に20％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、溶解した。これを、あらかじめ20％飽和量の硫酸アンモニウムを含む20mM酢酸緩衝液（pH 6.0）で平衡化させたEther-TOYOPEARL 650S（東ソー社製）に負荷した。同緩衝液で洗浄後、硫酸アンモニウムの飽和度が20-0％の逆グラジエントによって、樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。アミラーゼ活性が確認された画分を回収した。得た活性画分を、20mM酢酸緩衝液（pH 6.0）で平衡化させたDEAE-TOYOPEAL 650M（東ソー社製）に負荷し、アミラーゼ活性が確認された非吸着画分を回収した。組み換えG3Amyの精製結果を表１４に、SDS-PAGE結果を図９に示す
表１４に示すように、ペリプラズム画分から、Ether-TOYOPEARL 650S、DEAE-TOYOPEAL 650Mの精製段階を経ることにより、電気泳動的に均一な酵素が得られた。また、元株の培養液に比べ約３０倍の活性量の精製酵素を得ることができた。
〔糖転移反応を用いた配糖体の合成１〕
得られた組み換えG3Amyを用いて、種々の配糖体を合成した。G3供与体としてマルトテトラオース（G4）、マルトペンタオース（G5）を、受容体としてハイドロキノン、コウジ酸、バニリン、フェルラ酸、カフェ酸、プロトカテク酸、p-ニトロフェノール、シリンガ酸、(+)-カテキンを用いた。供与体であるマルトオリゴを終濃度50mMとなるように水に溶解して使用した。受容体は水またはエタノールに出来る限り溶かしたものを用いて、表１４に示す反応組成で1h反応させた。
生成反応物を薄層クロマトグラフィにより確認した。シリカゲルプレートとして実施例１で使用したものと同様の薄層板を使用し、展開液として酢酸エチル：酢酸：水＝3：1：1（容量比）の混液を用いた。展開は必要に応じて数回行い、検出は硫酸バニリン又はUV検出で行った。結果例として、図１０に受容体がコウジ酸の場合を、図１１に受容体がそれぞれバニリンとカフェ酸の場合を、図１２に受容体がハイドロキノンの場合を、図１３に受容体がプロトカテク酸の場合を、図１４にカテキンの場合を、図１５にp-ニトロフェノールの場合を示す。
その結果、シリンガ酸以外の受容体で転移反応が生じ、G3配糖体が生成された。ヒドロキシ位を１つしか持たないバニリン、ニトロフェノールといった化合物はヒドロキシ基を２つ以上持つ化合物に比べて転移産物が少なかった。なお、プロトカテク酸については、可溶性デンプンからもG3配糖体が生成されることが確認された。
〔糖転移反応を用いた配糖体の合成２〕
次に、G3供与体としてマルトテトラオース（G4）、マルトペンタオース（G5）及び可溶性デンプンを、受容体としてグリセロールを用い、実施例２と同様の条件で糖転移反応を行った。なお、高濃度（４０v/v％以上）のグリセロールを用いる場合は表１６に示す反応組成液を用いた。その結果を図１６〜１８に示す。また、可溶性デンプンを供与体に、グリセロールを受容体にして検討したところ、可溶性デンプンからＧ３配糖体を合成できることがわかった。
〔糖転移反応を用いた配糖体の合成３〕
次に、アルコール性水酸基を有する化合物を受容体に、可溶性デンプンを供与体にして実施例２と同様にG3配糖体の生成を試みた。受容体は４０v/v％のアルコールを用いた。その結果を図１９及び図２０に示す。G3Amyはメタノール、プロパノール、ブタノールの水酸基に対し、マルトトリオースを糖転移することが確認された。
上記のように、本発明に係るG3Amyは、これまでに報告されたG3アミラーゼとは異なり、フェノール性水酸基のみならずアルコール性水酸基に対してもマルトトリオースを糖転移する。特に、グリセロールにグルコースが転移した配糖体であるグルコシルグリセロール（G1-Gly）はα−アミラーゼ活性を阻害することから糖の消化・吸収を抑制することができるため、機能性食品素材としての利用が期待されているが、グルコースよりも重合度の大きいG3-Glyの方がα-アミラーゼの阻害活性が高いことが知られている（非特許文献５）。G3-Glyを合成する方法として、CGTaseによる分子間転移反応を利用する方法もあるが、G3-Gly以外の配糖体も合成されるため精製が困難となる。G3Amyによる合成法はデンプンとグリセロールからG3-Glyを合成することができ、またグリセロール濃度を増加させることでG3の生成が抑えられ、反応主要物をG3-Glyにすることが可能であり、G3Amyによる合成法は従来の方法に比べG3-Gly合成に非常に優れていると言える。
本発明によると、可能性デンプンやマルトオリゴ糖を供与体にしてG3配糖体を特異的に生成する新規なG3アミラーゼが提供される。これにより、種々のG3配糖体の合成が従来に比べて容易に実施できる。

Claims (11)

  1. 配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖転移活性及びアミラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移活性及びアミラーゼ活性を有する分子量が約６７,０００〜約４９,０００ダルトンであるタンパク質。
  3. デンプン又はグルコースの重合度が４以上のマルトオリゴ糖を供与体として、アルコール性水酸基及び／又はフェノール性水酸基を有する受容体に上記供与体からマルトトリオースを転移する糖転移活性を有するマルトトリオース生成アミラーゼであって、次の特性を有するアミラーゼ。
    （１）分子量
    約７２,０００〜約４９,０００ダルトン
    （２）基質特異性
    デンプン、アミロース、マルトペンタオース、マルトテトラオースを基質とし、シクロデキストリン、デキストラン、プルランには作用しない
    （３）ｐＨ安定性及び至適ｐＨ
    ３７℃、１０分間の処理でｐＨ５.５〜７.５で安定であり、至適ｐＨは前記条件にて６.０である
    （４）温度安定性及び至適温度
    １ｍＭＣａ2+イオン存在下、ｐＨ６.０、１０分間の処理で５５℃まで安定であり、至適温度は５５〜６０℃である
  4. １６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列を有する細菌が産生する請求項３に記載のアミラーゼ。
  5. 請求項１又は２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
  7. 請求項５又は請求項６に記載のＤＮＡを含むベクター。
  8. 請求項７に記載のベクターを含む微生物。
  9. 請求項８に記載の微生物を培養する工程と、
    前記培養した微生物から請求項１又は２に記載のタンパク質を抽出する工程を有するアミラーゼの製造方法。
  10. １６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号５に記載された塩基配列を有する細菌。
  11. マルトトリオース残基を有する配糖体の製造方法であって、
    マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖又はアミロース、アミロペクチン、デンプンを供与体として、アルコール性水酸基及び／又はフェノール性水酸基を持つ化合物を受容体として、請求項１又は２に記載のタンパク質、請求項３又は４に記載のアミラーゼ若しくは請求項８に記載の微生物の培養液ないしは請求項９に記載の方法で製造したアミラーゼを作用させることを特徴とする配糖体の合成方法。
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