JP2014012861A - 制御された生物学的特性を有する双性イオン性ベタインへのカチオン性ベタイン前駆体 - Google Patents
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Abstract
【課題】制御された生物学的特性を有する双性イオン性ベタインへのカチオン性ベタイン前駆体の提供。
【解決手段】本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマー、上記カチオン性ポリマーを作製するためのモノマー、上記ポリマーを含む表面、上記カチオン性ポリマーを含む治療剤送達系、上記送達系を用いて治療剤を投与する方法、ならびに上記カチオン性ポリマー、モノマー、表面および治療剤送達系を作製し、使用する方法を提供する。
【選択図】図7
【解決手段】本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマー、上記カチオン性ポリマーを作製するためのモノマー、上記ポリマーを含む表面、上記カチオン性ポリマーを含む治療剤送達系、上記送達系を用いて治療剤を投与する方法、ならびに上記カチオン性ポリマー、モノマー、表面および治療剤送達系を作製し、使用する方法を提供する。
【選択図】図7
Description
カチオン性ポリマーは、多くの特異な生物学的、化学的および物理的特性を有する。
カチオン性ポリマーが、DNAまたはタンパク質、または、遺伝子送達もしくは薬物送達のためのタンパク質を濃縮することができることは周知である。ポリカチオンは、細菌の膜を破壊する抗微生物剤として用いることができる。しかし、カチオン性ポリマーは細胞毒性を示し、それらの生物医学的な適用を制限するタンパク質と結合する傾向がある。抗微生物性材については、死滅微生物が表面に集積して、それらの抗微生物活性を減じることがある。
生物医学的な適用のためのカチオン性ポリマーの有用性にもかかわらず、それらの関連する欠点のない、カチオン性ポリマーの有利な特性を提供する新しいポリマー物質の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たすことを目指し、さらなる関連する利点を提供する。
本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマー、重合可能でありカチオン性ポリマーを提供するカチオン性モノマー、カチオン性ポリマーでコーティングされる表面、カチオン性ポリマーを表面に適用する方法、カチオン性ポリマーを含む治療剤送達系、カチオン性ポリマーを用いる治療剤を送達する方法、および、カチオン性ポリマーおよびカチオン性モノマーを作製する方法を提供する。
一態様では、本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマーを提供する。一実施形態では、カチオン性ポリマーは、
(a)ポリマー骨格;
(b)それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心;
(c)各カチオン性中心に結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基を含む。
(a)ポリマー骨格;
(b)それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心;
(c)各カチオン性中心に結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基を含む。
一実施形態では、カチオン性ポリマーは、式:
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)n (X−)n
を有し、上式で、PBはn個のペンダント基L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)を有するポリマー骨格であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり;nは、約10〜約10,000の整数である。
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)n (X−)n
を有し、上式で、PBはn個のペンダント基L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)を有するポリマー骨格であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり;nは、約10〜約10,000の整数である。
ある実施形態では、対イオンは疎水性の有機対イオンである。代表的な疎水性の有機対イオンには、C1〜C20カルボキシレートおよびC1〜C20アルキルスルホネートが含まれる。
ある実施形態では、対イオンは治療剤である。代表的な治療剤には、抗微生物性、抗細菌性および抗真菌性の薬剤が含まれる。一実施形態では、治療剤はサリチル酸である。
ある実施形態では、対イオンは、核酸(例えば、DNA、RNAおよびsiRNA)、アミノ酸、タンパク質およびペプチドから選択される。
ある実施形態では、加水分解性基は、加水分解時に疎水性の有機基を放出する。代表的な疎水性の有機基には、C4〜C20カルボキシレート(例えば、n−C4〜C20アルキル−CO2 −)が含まれる。
ある実施形態では、加水分解性基は、加水分解時に治療剤を放出する。代表的な治療剤には、抗微生物性、抗細菌性および抗真菌性の薬剤が含まれる。一実施形態では、治療剤はサリチル酸である。
カチオン性中心は、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムカチオン性中心から選択される。
ある実施形態では、RaおよびRbは、C1〜C10直鎖および分枝状アルキル基からなる群から、独立に選択される。
ある実施形態では、L1は−C(=O)O−(CH2)n−および−C(=O)NH−(CH2)n−からなる群から選択され、式中、nは1〜20の整数である。
ある実施形態では、L2は−(CH2)n−であり、式中、nは1〜20の整数である。
ある実施形態では、Aは、C、SOおよびPOからなる群から選択される。
ある実施形態では、RcはC4〜C20アルキルである。
ある実施形態では、X−は、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート;ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミド、ラクテートおよびサリチレートから選択される。
別の態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを作製するためのモノマーを提供する。一実施形態では、モノマーはカチオン性化合物であって、
(a)重合可能な基;
(b)第一のリンカーによって重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心;
(c)カチオン性中心に結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介してカチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基を含む化合物である。
(a)重合可能な基;
(b)第一のリンカーによって重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心;
(c)カチオン性中心に結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介してカチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基を含む化合物である。
一実施形態では、化合物は、式
CH2=C(Rd)−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−を有し、上式で、CH2=C(Rd)は重合可能な基であり、Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心を重合可能な基に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
CH2=C(Rd)−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−を有し、上式で、CH2=C(Rd)は重合可能な基であり、Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心を重合可能な基に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
L1、N+、Ra、Rb、L2、A(=O)−ORcおよびX−は、カチオン性ポリマーについて上で述べた通りである。
別の態様では、本発明は、上記のモノマーの1つまたは複数を重合させることから獲得できるポリマーを提供する。一実施形態では、上記のモノマーの1つまたは複数を重合させることから獲得できるポリマーは、ホモポリマーである。別の実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体には、ランダムおよびブロック共重合体が含まれる。一実施形態では、共重合体は、上記のモノマーの1つまたは複数を、1つまたは複数の第二のコモノマーと共重合させることによって獲得できる。代表的なコモノマーには、重合可能な双性イオンモノマー、疎水性モノマーおよびアニオン性モノマーが含まれる。
ある実施形態では、本発明のカチオン性モノマーから入手できるポリマーは、複数の反復単位(repeating unit)を有し、前記反復単位は、式:
−[CH2−C(Rd)]n−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−
を有し、上式で、−[CH2−C(Rd)]n−は、n個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し;Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;nは、10〜10,000であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
−[CH2−C(Rd)]n−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−
を有し、上式で、−[CH2−C(Rd)]n−は、n個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し;Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;nは、10〜10,000であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;A(=O)−ORcは、加水分解性基であって、AはC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
L1、N+、Ra、Rb、L2、A(=O)−ORcおよびX−は、カチオン性ポリマーについて上で述べた通りである。
一実施形態では、ポリマーはホモポリマーである。一実施形態では、ポリマーは共重合体である。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。他の実施形態では、共重合体は、疎水性の反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位から選択される反復単位を含む。
別の態様では、本発明は、本発明の1つまたは複数のポリマーで処理、コーティング、修飾されるか、さもなければそれを組み込む表面を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の1つまたは複数のポリマーで処理、コーティング、修飾されているか、さもなければそれを組み込む基材の表面を提供する。代表的な基材には、粒子、薬物担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズが含まれる。他の代表的な基材には、移植可能な医療装置、例えば耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、X線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置(LVAD)、動脈移植片、組織足場およびステントが含まれる。
基材の表面に対して本発明の1つまたは複数のポリマーを塗布、コーティング、修飾するか、さもなければ組み込む方法も提供される。ポリマーは、例えば、溶媒に溶解もしくは懸濁し、次にスピンコート、塗布または噴霧することを含む、様々な沈着技術によって表面に直接塗布することができる。あるいは、他の実施形態では、表面は、適するモノマーを含む従来の重合技術によってその上にポリマーが形成される基材であってよい。
本発明の別の態様では、治療剤送達系が提供される。一実施形態では、治療剤送達系は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む。代表的な治療剤には、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質が含まれる。一実施形態では、治療剤は、DNA、RNAまたはsiRNAなどの核酸である。ある実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体は、第一の反復単位および第二の反復単位を有する。適する第一の反復単位には第三級(3°)アミン基が含まれ、適する第二の反復単位には、第一級(1°)、第二級(2°)または第四級(4°)アミン基が含まれる。これらの共重合体は、3°/1°、3°/2°および3°/4°と命名することができる。一実施形態では、第二の反復単位には、第四級アミン基が含まれる(例えば、3°/4°共重合体)。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。
さらなる態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを用いる治療剤を投与する方法を提供する。この方法では、治療剤は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む治療剤送達系を投与することによって、それを必要とする対象に投与される。
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、付随する図と合わせて、以下の詳細な説明への参照によってそれがより深く理解されるにつれて、より容易に理解されるようになる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)ポリマー骨格;
(b)それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心;
(c)各カチオン性中心と結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基
を含むカチオン性ポリマー。
(項目2)
式
PB−(L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c ) n (X − ) n を有し、式中、
PBはn個のペンダント基L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c を有する前記ポリマー骨格であり;
N + は前記カチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンであり;
nは、約10〜約10,000の整数である、
項目1に記載のポリマー。
(項目3)
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目1または2に記載のポリマー。
(項目4)
前記対イオンがC1〜C20カルボキシレートおよびC1〜C20アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目5)
前記対イオンが治療剤である、項目1または2に記載のポリマー。
(項目6)
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目7)
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目8)
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目9)
前記加水分解性基が加水分解の際にC1〜C20カルボキシレートを放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目10)
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目11)
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目12)
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目13)
R a およびR b が、C1〜C10直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目14)
L 1 が−C(=O)O−(CH 2 ) n −および−C(=O)NH−(CH 2 ) n −からなる群から選択され、式中、nは1〜20の整数である、項目2に記載のポリマー。
(項目15)
L 2 が−(CH 2 ) n −であり、式中、nは1〜20の整数である、項目2に記載のポリマー。
(項目16)
Aが、C、SOおよびPOからなる群から選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目17)
R c がC1〜C20アルキルである、項目2に記載のポリマー。
(項目18)
X − が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート;ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目19)
(a)重合可能な基;
(b)第一のリンカーによって前記重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心;
(c)前記カチオン性中心と結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基
を含むカチオン性化合物。
(項目20)
式
CH 2 =C(R d )−L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c X −
を有し、式中、
CH 2 =C(R d )は前記重合可能な基であり、
R d は、水素およびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;
N + は前記カチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記重合可能な基に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、
項目19に記載の化合物。
(項目21)
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目19または20に記載の化合物。
(項目22)
前記対イオンがC1〜C20カルボキシレートおよびC1〜C20アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目23)
前記対イオンが治療剤である、項目19または20に記載の化合物。
(項目24)
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目25)
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目26)
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目27)
前記加水分解性基が加水分解の際にC1〜C20カルボキシレートを放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目28)
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目19または20記載の化合物。
(項目29)
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目30)
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目31)
R a およびR b が、C1〜C10直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目20に記載の化合物。
(項目32)
L 1 が−C(=O)O−(CH 2 ) n −および−C(=O)NH−(CH 2 ) n −からなる群から選択され、式中、nは1〜20の整数である、項目20に記載の化合物。
(項目33)
L 2 が−(CH 2 ) n −であり、式中、nは1〜20の整数である、項目20に記載の化合物。
(項目34)
Aが、C、SOおよびPOからなる群から選択される、項目20に記載の化合物。
(項目35)
R c がC1〜C20アルキルである、項目20に記載の化合物。
(項目36)
X − が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート;ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目20に記載の化合物。
(項目37)
項目19から36のいずれか一項に記載の化合物を重合させることによって得られるポリマー。
(項目38)
項目19から36のいずれか一項に記載の化合物および第二のモノマーを重合させることによって得られるポリマー。
(項目39)
複数の反復単位を有するポリマーであって、前記反復単位が、式
−[CH 2 −C(R d )] n −L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c X −
を有し、式中、
−[CH 2 −C(R d )] n −は、n個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し;
R d は、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;
nは、10〜10,000であり;
N + はカチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、ポリマー。
(項目40)
前記ポリマーがホモポリマーである、項目39に記載のポリマー。
(項目41)
前記ポリマーが共重合体である、項目39に記載のポリマー。
(項目42)
前記共重合体がランダム共重合体である、項目41に記載のポリマー。
(項目43)
前記共重合体がブロック共重合体である、項目41に記載のポリマー。
(項目44)
前記共重合体が、疎水性反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位からなる群から選択される反復単位を含む、項目41から43のいずれか一項に記載のポリマー。
(項目45)
基材の表面であって、項目1から18および37から44のいずれか一項に記載のポリマーを含む表面。
(項目46)
前記基材が、粒子、薬剤担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズからなる群から選択される、項目45に記載の表面。
(項目47)
前記基材が、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、X線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置(LVAD)、動脈移植片、組織足場およびステントからなる群から選択される移植可能な医療装置である、項目45に記載の表面。
(項目48)
(a)項目1から18および37から44のいずれか一項に記載のポリマー;および
(b)前記ポリマーと可逆的に結合する治療剤
を含む治療剤送達系。
(項目49)
前記治療剤が、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される、項目48に記載の送達系。
(項目50)
前記ポリマーが共重合体である、項目48に記載の送達系。
(項目51)
前記共重合体が第一の反復単位および第二の反復単位を含み、前記第一の反復単位は第三級アミン基を含み、前記第二の反復単位は第一級、第二級または第四級のアミン基を含む、項目50に記載の送達系。
(項目52)
前記第二の反復単位が第四級アミン基を含む、項目51に記載の送達系。
(項目53)
それを必要とする対象に項目48から52のいずれか一項に記載の治療剤送達系の有効量を投与することを含む、治療剤を投与するための方法。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)ポリマー骨格;
(b)それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心;
(c)各カチオン性中心と結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基
を含むカチオン性ポリマー。
(項目2)
式
PB−(L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c ) n (X − ) n を有し、式中、
PBはn個のペンダント基L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c を有する前記ポリマー骨格であり;
N + は前記カチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンであり;
nは、約10〜約10,000の整数である、
項目1に記載のポリマー。
(項目3)
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目1または2に記載のポリマー。
(項目4)
前記対イオンがC1〜C20カルボキシレートおよびC1〜C20アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目5)
前記対イオンが治療剤である、項目1または2に記載のポリマー。
(項目6)
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目7)
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目8)
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目9)
前記加水分解性基が加水分解の際にC1〜C20カルボキシレートを放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目10)
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目11)
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目1または2に記載のポリマー。
(項目12)
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目1または2に記載のポリマー。
(項目13)
R a およびR b が、C1〜C10直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目14)
L 1 が−C(=O)O−(CH 2 ) n −および−C(=O)NH−(CH 2 ) n −からなる群から選択され、式中、nは1〜20の整数である、項目2に記載のポリマー。
(項目15)
L 2 が−(CH 2 ) n −であり、式中、nは1〜20の整数である、項目2に記載のポリマー。
(項目16)
Aが、C、SOおよびPOからなる群から選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目17)
R c がC1〜C20アルキルである、項目2に記載のポリマー。
(項目18)
X − が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート;ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目2に記載のポリマー。
(項目19)
(a)重合可能な基;
(b)第一のリンカーによって前記重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心;
(c)前記カチオン性中心と結合している対イオン;および
(d)第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基
を含むカチオン性化合物。
(項目20)
式
CH 2 =C(R d )−L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c X −
を有し、式中、
CH 2 =C(R d )は前記重合可能な基であり、
R d は、水素およびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;
N + は前記カチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記重合可能な基に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、
項目19に記載の化合物。
(項目21)
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目19または20に記載の化合物。
(項目22)
前記対イオンがC1〜C20カルボキシレートおよびC1〜C20アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目23)
前記対イオンが治療剤である、項目19または20に記載の化合物。
(項目24)
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目25)
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目26)
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目27)
前記加水分解性基が加水分解の際にC1〜C20カルボキシレートを放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目28)
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目19または20記載の化合物。
(項目29)
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目19または20に記載の化合物。
(項目30)
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目19または20に記載の化合物。
(項目31)
R a およびR b が、C1〜C10直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目20に記載の化合物。
(項目32)
L 1 が−C(=O)O−(CH 2 ) n −および−C(=O)NH−(CH 2 ) n −からなる群から選択され、式中、nは1〜20の整数である、項目20に記載の化合物。
(項目33)
L 2 が−(CH 2 ) n −であり、式中、nは1〜20の整数である、項目20に記載の化合物。
(項目34)
Aが、C、SOおよびPOからなる群から選択される、項目20に記載の化合物。
(項目35)
R c がC1〜C20アルキルである、項目20に記載の化合物。
(項目36)
X − が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート;ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目20に記載の化合物。
(項目37)
項目19から36のいずれか一項に記載の化合物を重合させることによって得られるポリマー。
(項目38)
項目19から36のいずれか一項に記載の化合物および第二のモノマーを重合させることによって得られるポリマー。
(項目39)
複数の反復単位を有するポリマーであって、前記反復単位が、式
−[CH 2 −C(R d )] n −L 1 −N + (R a )(R b )−L 2 −A(=O)−OR c X −
を有し、式中、
−[CH 2 −C(R d )] n −は、n個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し;
R d は、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキルからなる群から選択され;
nは、10〜10,000であり;
N + はカチオン性中心であり;
R a およびR b は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され;
A(=O)−OR c は、AがC、S、SO、PまたはPOからなる群から選択され、R c が1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である加水分解性基であり;
L 1 は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;
L 2 は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;
X − は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、ポリマー。
(項目40)
前記ポリマーがホモポリマーである、項目39に記載のポリマー。
(項目41)
前記ポリマーが共重合体である、項目39に記載のポリマー。
(項目42)
前記共重合体がランダム共重合体である、項目41に記載のポリマー。
(項目43)
前記共重合体がブロック共重合体である、項目41に記載のポリマー。
(項目44)
前記共重合体が、疎水性反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位からなる群から選択される反復単位を含む、項目41から43のいずれか一項に記載のポリマー。
(項目45)
基材の表面であって、項目1から18および37から44のいずれか一項に記載のポリマーを含む表面。
(項目46)
前記基材が、粒子、薬剤担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズからなる群から選択される、項目45に記載の表面。
(項目47)
前記基材が、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、X線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置(LVAD)、動脈移植片、組織足場およびステントからなる群から選択される移植可能な医療装置である、項目45に記載の表面。
(項目48)
(a)項目1から18および37から44のいずれか一項に記載のポリマー;および
(b)前記ポリマーと可逆的に結合する治療剤
を含む治療剤送達系。
(項目49)
前記治療剤が、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される、項目48に記載の送達系。
(項目50)
前記ポリマーが共重合体である、項目48に記載の送達系。
(項目51)
前記共重合体が第一の反復単位および第二の反復単位を含み、前記第一の反復単位は第三級アミン基を含み、前記第二の反復単位は第一級、第二級または第四級のアミン基を含む、項目50に記載の送達系。
(項目52)
前記第二の反復単位が第四級アミン基を含む、項目51に記載の送達系。
(項目53)
それを必要とする対象に項目48から52のいずれか一項に記載の治療剤送達系の有効量を投与することを含む、治療剤を投与するための方法。
本発明は、ポリマー、ポリマーから作製される物質、ならびにポリマーおよびポリマー物質を作製および使用する方法を提供する。
本発明の一態様では、カチオン性ポリマーが提供される。本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解して双性イオンポリマーを提供することができる加水分解性基を含む。双性イオンポリマーは、正および負の電荷の均衡を有するポリマーである。双性イオンポリマーは、タンパク質吸着および細菌接着に高度抵抗性であることができる。双性イオンポリマー(例えば、ホスホベタイン、スルホベタインおよびカルボキシベタインポリマー)は、それらの生物模倣性質のために、高い生体適合性を示す。
制御された加水分解。カチオン性ポリマーの構造上の特徴の変動は、それらの制御された加水分解、ならびに生物学的、化学的および物理的な特性の制御を可能にする。加水分解の速度は、加水分解性基(例えば、エステルの場合、−OR)の性質の選択によってかなり影響を与えること、および制御することができる。
下記のように、ある実施形態では、本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解後に官能基を都合よく放出する。例えば、本発明のカチオン性エステルについては、加水分解エステルは−OR基を放出する。これらの実施形態では、放出される基は、治療剤(例えば、抗微生物性、抗細菌性、抗真菌性の薬剤)であってもよい。同様に、ある実施形態では、カチオン性ポリマーはそれらの対イオン(X−)を放出することができ、それらも、治療剤(例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質およびサリチル酸)であってよい。
遺伝子もしくは薬剤送達の担体としての用途については、複合体がその標的に到達する場合、コンジュゲートされたDNAまたはタンパク質を、カチオン性ポリマー担体の加水分解を通して放出することができる。抗微生物剤としての用途については、抗微生物性カチオン性ポリマーを双性イオンポリマーに変換し、有毒残留物を環境に残さないこと、および死菌を表面に残さないことができる。
加水分解性基を加水分解によってだけでなく、他の手段によって起こる切断(例えば、分解または侵食)によっても切断することができることはいうまでもない。カチオン性ポリマーは、とりわけ、酵素触媒反応、酸化還元、熱、光、イオン強度、pHおよび加水分解による環境変化によって、それらの対応する双性イオンポリマーに変換することができる。下記の治療剤送達用途については、切断はおそらく、酵素作用および/またはpH変化によって起こる。
本発明の代表的なカチオン性ポリマーおよびそれらの対応する双性イオンポリマー対応物を、下に記載する。
カチオン性ポリマー
本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解されるとポリマーを双性イオンにするアニオン基を提供する加水分解性基を含む。各ポリマーでは、加水分解性基の数はカチオン基の数と実質的に同等であり、したがって、加水分解性基が加水分解されると生じるポリマーは双性イオン性である。本明細書で用いるように、用語「双性イオンポリマー」は、実質的に同等数のカチオン基およびアニオン基を有するポリマーを指す。
本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解されるとポリマーを双性イオンにするアニオン基を提供する加水分解性基を含む。各ポリマーでは、加水分解性基の数はカチオン基の数と実質的に同等であり、したがって、加水分解性基が加水分解されると生じるポリマーは双性イオン性である。本明細書で用いるように、用語「双性イオンポリマー」は、実質的に同等数のカチオン基およびアニオン基を有するポリマーを指す。
本発明の代表的なカチオン性ポリマーは、式(I)
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)n (X−)n (I)
を有し、上式で、PBはn個のペンダント基(すなわち、L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)を有するポリマー骨格であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリール基から独立に選択され;A(=O)−ORcは加水分解性基であって、式中、AはC、S、SO、PまたはPOであり、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり;nは、約10〜約10,000である。式(I)のポリマーの平均分子量は、約1kDa〜約1,000kDaである。
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)n (X−)n (I)
を有し、上式で、PBはn個のペンダント基(すなわち、L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc)を有するポリマー骨格であり;N+はカチオン性中心であり;RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリール基から独立に選択され;A(=O)−ORcは加水分解性基であって、式中、AはC、S、SO、PまたはPOであり、Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり;L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり;L2は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり;X−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり;nは、約10〜約10,000である。式(I)のポリマーの平均分子量は、約1kDa〜約1,000kDaである。
式(I)のカチオン性ポリマーの加水分解は、式(II)
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)O−)n (II)を有する双性イオンポリマーを提供し、上式で、PB、L1、N+、Ra、Rb、L2、Aおよびnは上に述べた通りであり、A(=O)O−はアニオン基である。
PB−(L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)O−)n (II)を有する双性イオンポリマーを提供し、上式で、PB、L1、N+、Ra、Rb、L2、Aおよびnは上に述べた通りであり、A(=O)O−はアニオン基である。
この実施形態では、式(I)のポリマーは、n個のペンダント基を含み、式(III)
CH2=C(Rd)−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−
(III)
を有するモノマーの重合によって調製することができ、上式で、L1、N+、Ra、Rb、A(=O)ORcおよびL2、およびX−は、上で述べた通りであり、Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチル、C1〜C6アルキルおよびC6〜C12アリール基から選択される。
CH2=C(Rd)−L1−N+(Ra)(Rb)−L2−A(=O)−ORc X−
(III)
を有するモノマーの重合によって調製することができ、上式で、L1、N+、Ra、Rb、A(=O)ORcおよびL2、およびX−は、上で述べた通りであり、Rdは、水素、フッ素、トリフルオロメチル、C1〜C6アルキルおよびC6〜C12アリール基から選択される。
以下は、上記の式(I)〜(III)のポリマーおよびモノマーの記載である。
式(I)および(II)において、PBはポリマー骨格である。代表的なポリマー骨格には、ビニルモノマー(例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン)に由来するビニル骨格(すなわち、−C(R’)(R’’)−C(R’’’)(R’’’’)−、式中、R’、R’’、R’’’およびR’’’’は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択される)が含まれる。他の適する骨格には、双性イオン基に変換することができる加水分解性基を含むペンダントカチオン基を提供するポリマー骨格、およびカチオン基を含み、双性イオン基に変換することができるペンダント加水分解性基を提供する骨格が含まれる。他の代表的なポリマー骨格には、ペプチド(ポリペプチド)、ウレタン(ポリウレタン)およびエポキシ骨格が含まれる。
同様に、式(III)で、CH2=C(Rd)−は、重合可能な基である。上記のものを含む他の重合可能な基を、本発明のモノマーおよびポリマーを提供するために用いることができることはいうまでもない。
式(I)〜(III)で、N+はカチオン性中心である。ある実施形態では、カチオン性中心は、第四級アンモニウム(NがL1;Ra、RbおよびL2に結合)である。アンモニウムに加えて、他の有用なカチオン性中心には、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムが含まれる。
RaおよびRbは、水素、アルキルおよびアリール基から独立に選択される。代表的なアルキル基には、C1〜C10直鎖および分枝状のアルキル基が含まれる。ある実施形態では、アルキル基は、例えばアリール基(例えば、−CH2C6H5、ベンジル)を含む、1つまたは複数の置換基でさらに置換される。一実施形態では、RaおよびRbは、メチルである。代表的なアリール基には、例えばフェニルを含む、C6〜C12アリール基が含まれる。式(I)〜(III)のある実施形態については、R2またはR3は存在しない。
L1は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーである。ある実施形態では、L1は、L1の残りをポリマー骨格(または式(III)のモノマーの重合可能な部分)に結合させる官能基(例えば、エステルまたはアミド)を含む。官能基に加えて、L1はC1〜C20アルキレン鎖を含むことができる。代表的なL1基には、−C(=O)O−(CH2)n−および−C(=O)NH−(CH2)n−が含まれ、式中、nは1〜20(例えば、3)である。
L2は、カチオン性中心を加水分解性基(または、式(II)の双性イオンポリマーのアニオン基)に共有結合させるリンカーである。L2は、C1〜C20アルキレン鎖であることができる。代表的なL2基には−(CH2)n−が含まれ、式中、nは1〜20(例えば、1、3または5)である。
式(I)のカチオン性ポリマーの疎水性および加水分解速度は、L1および/またはL2によって制御することができる。L1またはL2の疎水性が強いほど、加水分解性基の加水分解および双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。
A(=O)−ORcは、加水分解性基である。加水分解性基は、エステル、例えばカルボン酸エステル(AはCである)、スルフィン酸エステル(AはSである)、スルホン酸エステル(AはSOである)、ホスフィン酸エステル(AはPである)またはホスホン酸エステル(AはPOである)であることができる。加水分解性基は、無水物であることもできる。Rcは、1つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である。
代表的なアルキル基には、C1〜C30直鎖および分枝状のアルキル基が含まれる。ある実施形態では、アルキル基は、例えばアリール基(例えば、−CH2C6H5、ベンジル)を含む、1つまたは複数の置換基でさらに置換される。ある実施形態では、RcはC1〜C20直鎖アルキル基である。一実施形態では、Rcはメチルである。別の実施形態では、Rcはエチルである。一実施形態では、RcはC3〜C20アルキルである。一実施形態では、RcはC4〜C20アルキルである。一実施形態では、RcはC5〜C20アルキルである。一実施形態では、RcはC6〜C20アルキルである。一実施形態では、RcはC8〜C20アルキルである。一実施形態では、RcはC10〜C20アルキルである。比較的遅い加水分解が所望される用途の場合、RcはC4〜C20 n−アルキル基またはC4〜C30 n−アルキル基である。
代表的なアリール基には、例えば置換されたフェニル基(例えば安息香酸)を含むフェニルを含む、C6〜C12アリール基が含まれる。
代表的なアシル基(−C(=O)Re)には、ReがC1〜C20アルキルまたはC6〜C12アリールであるアシル基が含まれる。
代表的なシリル基(−SiR3)には、RがC1〜C20アルキルまたはC6〜C12アリールであるシリル基が含まれる。
本発明のある実施形態では、加水分解生成物RcO−(またはRcOH)は、治療剤(例えば、抗微生物剤、例えばサリチル酸(2−ヒドロキシ安息香酸)、ベンゾエート、ラクテート、ならびに抗生物質および抗真菌性薬剤のアニオン形態)である。
ある他の実施形態では、加水分解生成物RcO−(またはRcOH)は、ラクテート、グリコレートまたはアミノ酸である。
式(I)のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、Rcによって制御することもできる。例えば、Rcによる立体的および/または速度論的効果により加水分解性基の加水分解がより遅いほど、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。
X−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。対イオンは、式(I)のカチオン性ポリマーの合成または式(III)のモノマーから生じる対イオンであってよい(例えば、Cl−、Br−、I−)。カチオン性中心の合成から最初に生成される対イオンは、他の適する対イオンと交換して、制御可能な加水分解特性および他の生物的特性を有するポリマーを提供することもできる。
式(I)のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、対イオンによって制御することもできる。対イオンの疎水性が強いほど、加水分解性基の加水分解はより遅く、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。代表的な疎水性対イオンには、カルボン酸、例えば安息香酸および脂肪酸アニオン(例えば、CH3(CH2)nCO2 −、式中、n=1〜19);アルキルスルホネート(例えば、CH3(CH2)nSO3 −、式中、n=1〜19);サリチレート;ラクテート;ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミドアニオン(N−(SO2CF3)2);およびそれらの誘導体が含まれる。他の対イオンを、塩化物、臭化物、ヨウ化物、サルフェート;ナイトレート;パークロレート(ClO4);テトラフルオロボレート(BF4);ヘキサフルオロホスフェート(PF6);トリフルオロメチルスルホネート(SO3CF3);およびそれらの誘導体から選択することもできる。
他の適する対イオンには、疎水性対イオン、および、治療活性のある対イオン(例えば、抗微生物剤、例えばサリチル酸(2−ヒドロキシ安息香酸)、ベンゾエート、ラクテート、ならびに抗生物質および抗真菌性薬剤のアニオン形態)が含まれる。
式(III)のモノマーについては、Rdは、水素、フッ化物、トリフルオロメチルおよびC1〜C6アルキル(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル)から選択される。一実施形態では、Rdは水素である。一実施形態では、Rdはメチルである。別の実施形態では、Rdはエチルである。
カチオン性ポリマーの構造上の特徴の変動は、それらの制御された加水分解、ならびに生物学的、化学的および物理的な特性の制御を可能にする。所望の制御されたポリマー加水分解を達成するために変更することができる、上記カチオン性ポリマーの構造上の特徴には、L1、L2、Ra、Rb、A、RcおよびX−が含まれる。一般には、ポリマーまたは記載の構造上の特徴が疎水性であるほど、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの加水分解はより遅い。
ホモポリマー、ランダム共重合体、ブロック共重合体。本発明のカチオン性ポリマーには、ホモポリマー、ランダム共重合体およびブロック共重合体が含まれる。
一実施形態では、本発明は、式(III)によって定義されるようなカチオン性モノマーを重合させることによって調製される、式(I)によって定義されるようなカチオン性ホモポリマーを提供する。式(I)によって定義されるポリマーを含む本発明のカチオン性ポリマーに付随する有利な特性を、他の重合物質に付与することができることはいうまでもない。
一実施形態では、本発明は、式(III)の2つの異なるカチオン性モノマーを共重合することによって調製されるランダム共重合体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、式(III)によって定義される本発明の1つまたは複数のカチオン性モノマーを、1つまたは複数の他のモノマー(例えば、疎水性のモノマー、アニオン性モノマーまたは双性イオンモノマー、例えばホスホリルベタイン、スルホベタインもしくはカルボキシベタインモノマー)と共重合することによって調製されるカチオン性反復単位を含む、ランダム共重合体を提供する。
一実施形態では、本発明は、カチオン性反復単位を含む1つまたは複数のブロック、および1つまたは複数の他のブロックを有するブロック共重合体を提供する。この実施形態では、カチオン性反復単位を含む1つまたは複数のブロックは、カチオン性反復単位(例えば、式(III)のカチオン性モノマーから調製されるホモポリマーまたは共重合体)だけを含む。あるいは、カチオン性反復単位を含む1つまたは複数のブロックは、カチオン性反復単位および他の反復単位(例えば、疎水性、アニオン性、双性イオン性の反復単位)を含む。
他の適するポリマー
本発明は、以下のポリマーも提供する。
本発明は、以下のポリマーも提供する。
一実施形態では、カチオン性ポリマーは、以下の構造を有し:
R2=原子なし、−H、−CH3、−C2H5
R3=−H、−CH3、−C2H5
x=1〜8。
R=任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート
Y=1〜10
Z=0〜22
またはC(=O)R’
R’=任意のアルキル鎖または芳香族基。
別の実施形態では、カチオン性ポリマーは、以下の構造を有し:
x=1〜5
y=1〜5
R1=H、またはアルキル鎖
R2=原子なし、H、またはアルキル鎖
R3=アルキル鎖。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
R3は、任意のアルキル鎖であり
R2、R4は任意のアルキル鎖であり
x=1〜18
y=1〜18
n>3。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
x=1〜18
y=1〜18
n>3。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
x=0〜11
n>3。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
x=1〜10
R=任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート。
y=1〜10
z=0〜22
またはC(=O)R’
R’=任意のアルキル鎖、芳香族基。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
x=1〜6
y=0〜6
R=任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート
y=1〜10
z=0〜22
またはC(=O)R’
R’=任意のアルキル鎖、芳香族基。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
x=0〜5。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
n>5
R=Hまたはアルキル鎖。
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
R2=Hまたは任意のアルキル鎖、例えばメチル
x、y=1〜6
R1=任意のアルキル鎖、
y=1〜10
z=0〜22
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し:
R1=任意のアルキル鎖。
式(I)のカチオン性ポリマーおよび究極的に式(II)の双性イオンポリマーを作製するために有用である、式(III)の3つの代表的なカチオン性モノマーを図1に例示する。図1を参照すると、カチオン性カルボキシベタインエステル基を運ぶペンダント基を有する、3つの正荷電のポリアクリルアミドを例示する。3つのモノマーは、第四級アンモニウム基(カチオン性中心)とエステル(加水分解性)基:CBAA−1−エステル(n=1);CBAA−3−エステル(n=3);およびCBAA−5−エステル(n=5)との間に、異なるスペーサー基(L2:−(CH2)n−)を有する。モノマーの重合は、対応するカチオン性ポリマーを提供する。3つのモノマーは、線状ポリマーを形成するフリーラジカル重合を用いて、または、SPRセンサーにポリマーブラシを調製する表面開始ATRPを用いて重合させた。異なるスペーサー基(L2)およびエステル基を有するポリマーは、異なる化学的、物理的および生物学的特性を有すると予想された。3つのモノマーの合成およびそれらの重合を、実施例1に記載する。
フリーラジカル重合を通して重合された線状ポリマーについては、それらの分子量は、水溶液でゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて測定した。ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルは、それぞれ、14kDa、13kDaおよび9.6kDaの平均分子量であった。
カチオン性ポリマーの加水分解は、双性イオンポリマー(すなわち、双性イオンポリカルボキシベタイン)を提供する。本発明の代表的なカチオン性ポリマーの加水分解は、実施例2で記載し、図2で図示する。図2で、nは1、3または5である(それぞれ、ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルに対応する)。3つのカルボキシベタインエステルポリマーを異なる水酸化ナトリウム濃度の下で溶解し、それらの加水分解挙動を研究した。しばらくして、1H NMRを用いてポリマーの上に保持されているエステル基を測定することによって、ポリマーの加水分解速度を分析した。すべての3つのポリマーは水中で安定であり、4日後に明白な加水分解は検出されなかった。NaOHの濃度は、カルボキシベタインエステルポリマーの加水分解のために重要である。図3は、NaOHの3つの異なる濃度で1時間処理した後の、ポリCBAA−3−エステルのNMRスペクトルを図示する。10mMの濃度のNaOH溶液については、わずかな加水分解が検出されただけであった(約3%)。100mM
NaOH溶液については、約82%のポリマーが加水分解された。1MのNaOH濃度については、ポリマーは1時間で完全に加水分解された。図4は、時間の関数としての、100mMまたは10mMのNaOHの下での加水分解速度をグラフ化する。図4を参照すると、これらの2つのNaOH濃度の下で、ほとんどの加水分解は最初の1時間で起こる。その後、加水分解速度は時間とともにわずかに変化する。
NaOH溶液については、約82%のポリマーが加水分解された。1MのNaOH濃度については、ポリマーは1時間で完全に加水分解された。図4は、時間の関数としての、100mMまたは10mMのNaOHの下での加水分解速度をグラフ化する。図4を参照すると、これらの2つのNaOH濃度の下で、ほとんどの加水分解は最初の1時間で起こる。その後、加水分解速度は時間とともにわずかに変化する。
上記したように、本発明のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、それらの構造を修飾することによって制御することができる。異なる加水分解挙動を得るために、エステル基(加水分解性基)、スペーサー基(L1およびL2)および対イオン(X−)などの様々な構造パラメータを有するカチオン性ポリマー。加水分解挙動は、ポリマー分子量を変えること、または他のモノマーと共重合することによって制御することもできる。加水分解性エステル基(例えばt−ブチルおよびアルキル置換シリル)または無水物基は、酸性または塩基性の条件下で容易に加水分解することができる。第四級アンモニウム基(カチオン性中心)とエステル(加水分解性)基との間のスペーサー基(L2:−(CH2)n−)を変えることも、加水分解速度を調整することができる。短いスペーサーは、加水分解速度を増加させることができる。さらに、親水性のアニオン(例えば、Cl−、Br−、I−、SO4)などの対イオンも加水分解速度を増加させ、低いポリマー分子量および他の親水性モノマーとの共重合も、加水分解速度を増加させるのを助ける。
タンパク質吸着
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、ポリマーで処理された表面へのタンパク質吸着の低減で有効な物質として、有利に用いることができる。カチオン性ポリマーは、低汚染性表面を調製するために用いることができる。これらの表面は、装置表面へのタンパク質吸着が有害である環境での装置のために、有利に使用することができる。
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、ポリマーで処理された表面へのタンパク質吸着の低減で有効な物質として、有利に用いることができる。カチオン性ポリマーは、低汚染性表面を調製するために用いることができる。これらの表面は、装置表面へのタンパク質吸着が有害である環境での装置のために、有利に使用することができる。
低いタンパク質吸着を有する表面の提供における本発明の代表的なカチオン性ポリマーの有用性を証明するために、実施例3に記載の代表的なカチオン性ポリマーからポリマーブラシを調製し、それらのタンパク質吸着を測定した。
3つのモノマー(CBAA−1−エステル、CBAA−3−エステルおよびCBAA−5−エステル)を、表面開始ATRPを用いてSPRセンサーの表面に移植した。XPS分析からの推定で、ポリマーブラシは、厚さが5〜20nmであった。3つのポリマーブラシの上の1mg/mLフィブリノーゲン溶液からのタンパク質吸着を、SPRを用いて測定した。フィブリノーゲンは粘着性のタンパク質で、医用材料の上での血小板凝集および血液凝固で重要な役割を演ずる。ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルのフィブリノーゲン吸着は、それぞれ195ng/cm2、255ng/cm2および600ng/cm2であった(図5A〜5Cを参照)。全3つのポリマーは、それらの正電荷のために明白なタンパク質吸着を有する。ポリCBAA−1−エステルは、より疎水性のL2(すなわち、それぞれC3およびC5)を有する他の2つのエステルと比較してそのより高い親水性のために、比較的より低いフィブリノーゲン吸着を有した。メチレンからプロピレン、さらにペンチレンへのL2の増加に伴い、ポリマーの疎水性が増加し、より高いフィブリノーゲン吸着をもたらす。
100mMで1〜2時間の加水分解の後、表面特性は劇的に変化した。図5A〜5Cは、3つのポリマーの各々を移植した表面が、フィブリノーゲン吸着に高度抵抗性である表面に変換されたことを示す。加水分解されたポリCBAA−1−エステルおよび加水分解されたポリCBAA−3−エステルを有する表面では、フィブリノーゲン吸着はSPRの検出限界である0.3ng/cm2未満である。加水分解されたポリCBAA−5−エステルの上でのフィブリノーゲン吸着は、約1.5ng/cm2であった。加水分解を制御することによって、ポリマー移植表面は、高タンパク質吸着からタンパク質吸着高抵抗性にそれらの特性を変えることができる。さらに、加水分解後に生じた双性イオンポリマーを有する表面は生体適合性であり、血液血漿/血清および細菌接着/バイオフィルム形成からの非特異的タンパク質吸着に高度抵抗性である。
抗微生物特性
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、抗微生物性特性を示す。本発明の代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物性特性の評価は、実施例4で記載される。
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、抗微生物性特性を示す。本発明の代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物性特性の評価は、実施例4で記載される。
カチオン性ポリカルボキシベタインエステルの抗微生物特性を評価するために、ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルのポリマー溶液を、E.coliとインキュベートした。2mMの濃度(反復単位モル濃度)で、ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルは、それぞれ95%、87.3%および46.2%の生細胞割合を示すことが判明した(図6を参照)。抗微生物活性は、L2の長さの増加と一緒に増加するようである。加水分解後、双性イオンポリマー、ポリCBAA−1、ポリCBAA−3およびポリCBAA−5は、それぞれ、93.7%、96.3%および95.3%の生細胞割合を示し、抗微生物活性は、双性イオンポリマー(すなわち、ポリカルボキシベタイン)へのカチオン性ポリマー(すなわち、ポリカルボキシベタインエステル)の加水分解に従って低下することを示す。
いくつかの両親媒性ポリカチオンを、それらの抗細菌活性について調査した。異なるポリカチオンの殺菌効率を比較するために、ポリカチオンのアルキルペンダント鎖長を調べた。第四級アミン基およびより長い疎水性ペンダント鎖を有するポリマーは、より高い疎水性のためにより良好な抗微生物活性を有することが分かる。カルボキシベタインエステルを有する小分子第四級アンモニウム化合物(QMC)は、それらがより長い炭化水素基を有する場合、速やかな殺菌作用を有することが見出された。これらのQMCは、腸内細菌の外膜および細胞質膜に結合し、細菌の膜内に浸透することができた。抗微生物効果は、本発明のカチオン性ポリマー(例えば、ポリカルボキシベタインエステル)のスペーサー長(L2)を増加させることで高まる。
ポリCBAA−5−エステルの抗微生物効力は、類似したアルキル鎖長を有する他の四級化ポリマーのそれと同等である。より高い抗微生物効力は、より長いアルキル鎖長(例えば、C1〜C20)で達成することができる。
従来の抗微生物性コーティングについては、死滅微生物および吸着タンパク質が表面に通常集積し、それらの抗微生物活性を劇的に低下させる。対照的に、本発明のカチオン性ポリマーから作製される抗微生物性コーティングは、双性イオンポリマーに加水分解され、様々な生体分子の吸着に高度抵抗性である表面を提供する。これらの双性イオンポリマーは、バルク材としておよび表面コーティングとして、無毒性、生体適合性および非汚染性である。
本発明の代表的な架橋双性イオンポリマー、ポリカルボキシベタインヒドロゲルは、無細胞傷害性で、カブトガニの血球溶解成分(LAL)エンドトキシンアッセイキット(Cambrex Bioscience、Walkerville、MD)を用いると、0.06単位(EU)/mL未満のエンドトキシンを含む。ポリカルボキシベタインヒドロゲルは、最高4週間の間マウスの皮下に移植した。結果は、ポリカルボキシベタインが、移植のためによく受け入れられているモデルの医用材料であるポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリラート)(ポリHEMA)ヒドロゲルのそれと同等のインビボ生体適合性を有することを示した。双性イオンポリマーの無毒特性は、それらのカチオン性ポリマー前駆体の毒性を変換し、死滅微生物および吸着タンパク質が表面に集積することを防止することができる非汚染特性をさらに提供する。
切替可能なポリマーコーティングおよび医療装置におけるそれらの使用
双性イオンポリマーに加水分解性である本発明のカチオン性ポリマーは、例えば医療装置を含む様々な装置の表面のコーティングとして、有利に用いることができる。この実施形態では、本発明のカチオン性ポリマーは、自己滅菌性および非汚染性能力を有する切替可能な生体適合性ポリマー表面を提供する。
双性イオンポリマーに加水分解性である本発明のカチオン性ポリマーは、例えば医療装置を含む様々な装置の表面のコーティングとして、有利に用いることができる。この実施形態では、本発明のカチオン性ポリマーは、自己滅菌性および非汚染性能力を有する切替可能な生体適合性ポリマー表面を提供する。
図7は、自己滅菌性および非汚染性能力を有する切替可能な生体適合性ポリマー表面の略図である。図7を参照すると、抗微生物性表面(a)は、細菌を効果的に死滅させる本発明の代表的なカチオン性ポリマー(すなわち、pCBMA−1 C2、図8を参照)でコーティングした表面である。加水分解後、(b)代表的なカチオン性ポリマーは非汚染性双性イオンポリマー(すなわち、pCBMA−1、pCBMA−1 C2エステルに対応するカルボキシレート)に変換され、表面にとどまっている死細菌は非汚染性双性イオンポリマー(すなわち、pCBMA−1)から放出され(c)、双性イオンポリマーでコーティングされている表面を提供し、それは、細菌接着に高度抵抗性である(d)。
本発明の物質(例えば、ポリマー、ヒドロゲル)は、生体適合性、抗微生物性および非汚染性の表面を提供するために表面をコーティングするために、有利に用いられる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の1つまたは複数の物質が適用された(例えば、コーティング、共有結合、イオン的に結合、疎水的に結合した)表面(すなわち、1つまたは複数の表面)を有する装置および材料を提供する。本発明の物質で有利に処理すること、本発明の物質を含むように、または本発明の物質を組み込むように修飾することができる代表的な装置には、以下のものが含まれる:
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する粒子(例えば、ナノ粒子);
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する薬剤担体;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する非ウイルス遺伝子送達系;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するバイオセンサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、バイオプロセスまたは生物分離のための装置、例えば、微生物懸濁液、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外ろ過およびダイアリープロセシングのための膜;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する移植可能なセンサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する皮下センサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、乳房インプラント、蝸牛インプラントおよび歯科用インプラントなどのインプラント;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するコンタクトレンズ;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する組織足場;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置(LVAD)、動脈移植片およびステントなどの移植可能な医療装置;ならびに
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤およびX線ガイドなどの医療装置。
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する粒子(例えば、ナノ粒子);
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する薬剤担体;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する非ウイルス遺伝子送達系;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するバイオセンサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、バイオプロセスまたは生物分離のための装置、例えば、微生物懸濁液、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外ろ過およびダイアリープロセシングのための膜;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する移植可能なセンサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する皮下センサー;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、乳房インプラント、蝸牛インプラントおよび歯科用インプラントなどのインプラント;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するコンタクトレンズ;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する組織足場;
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置(LVAD)、動脈移植片およびステントなどの移植可能な医療装置;ならびに
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤およびX線ガイドなどの医療装置。
移植された医用材料の上への微生物接着およびその後のバイオフィルムの形成は、生物医学装置の失敗の主因の1つである。抗菌性および非汚染性のコーティングの使用は、移植可能な材料の表面への微生物の付着および拡散の防止のための2つの戦略である。共有結合されている第四級アンモニウム化合物(QAC)を含む抗微生物性表面は、様々な微生物を効果的に死滅させることができることが判明した。QAC表面の主要な問題点は、抗微生物性コーティングの上にとどまる死滅微生物の付着であり、それは、免疫応答および炎症を誘発することができ、その抗微生物性官能基をブロックすることができる。さらに、そのような抗微生物性コーティングは、移植可能な医用材料としての非汚染性および生体適合性の要件を満たすことができない。ポリ(エチレングリコール)(PEG)誘導体または双性イオンポリマーは、細菌付着およびバイオフィルム形成を減少させる非汚染性材料として、広く用いられている。しかし、酸化損傷に対するPEGの感受性は、複合媒体でのその長期適用を制限している。ポリ(スルホベタインメタクリレート)(pSBMA)などの双性イオン物質は、細菌付着およびバイオフィルム形成を激減させることができ、また、未希釈の血漿および血清からのものでさえ、非特異的タンパク質吸着に高度抵抗性である。双性イオンコーティングは初期の付着を減少させ、表面への微生物の定着を遅らせることができるが、移植手術およびカテーテル挿入の間に、病原菌を患者に導入する可能性があり、それは移植装置の失敗につながる。このように、これらの微生物を除去するのに抗微生物剤の使用が必要となる。広域な用途のために表面応答性物質が開発されているが、抗微生物性および非汚染性の両方の能力を有する生体適合性物質を開発することは、まだ大きな難問である。
上記のように、一実施形態では、本発明は、非汚染性表面の利点を組み合わせ、1時間で99.9%を超えるEscherichia coli K12を死滅させることができ、カチオン性誘導体が非汚染性双性イオンポリマーに加水分解されると死菌の98%が放出される、切替可能なポリマー表面コーティングを提供する。pCBMA−1−C2(式(I)のカチオンポリマーであって、式中、L1は−C(=O)OCH2CH2−であり、L2は−CH2−であり、RcはCH2CH3であり、X−はBr−である)対照コーティングを、表面開始原子転移ラジカル重合(ATRP)によって、イニシエーターで被覆された金表面に移植した。得られたポリマーコーティングの、原子間力鏡検(AFM)によって測定した厚みは、26〜32nmであった(表1)。
E.coli K12の付着および放出は、加水分解の前後にpCBMA−1 C2表面で試験した。カチオン性pC8NMAおよび双性イオンpCBMA−2は、それぞれ陰性および陽性の非汚染性対照表面として、また、それぞれ陽性および陰性の抗微生物性対照表面として用いた。図10A〜10Fは、加水分解の前に大量の細菌がカチオン性pCBMA−1 C2およびpC8NMA表面に付着したが、双性イオンpCBMA−2表面には極めて少ない細菌細胞しか付着しなかったことを示す。pC8NMAと対照的に、pCBMA−1 C2は加水分解の後に大多数の細胞を放出したが、pCBMA−2は非汚染のままであった。図11は、加水分解の前後に全3つのポリマー表面にとどまっていた細菌細胞の量の定量データを示す。加水分解の前にはカチオン性pCBMA−1 C2およびpC8NMAの両方の表面に類似した量の細菌残留物があったが、pCBMA−2表面の付着細胞の量は、カチオン性pCBMA−1 C2およびpC8NMAの両方の表面のそれの0.3%未満である。細菌残留物の放出を試験するために、3つの表面をN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)緩衝液(10mM、pH10.0)に37℃で8日間インキュベートした。pCBMA−1 C2表面はポリ(N−(カルボキシメチル)−N,N−ジメチル−2−[(2−メチル−1−オキソ−2−プロペン−1−イル)−オキシ]エタナミニウム)(pCBMA−1)に加水分解され、死細菌細胞の98%が放出された。対照的に、pC8NMA表面では死細胞の放出は観察されなかった(p>0.1)が、pCBMA−2表面は非常に低い細菌接着を保持した。
付着細菌細胞の放出は、双性イオンpCBMA−1へのカチオン性pCBMA−1 C2の変換に依存する。ベタインエステルの加水分解速度は、いくつかの因子、例えば第四級アミンとカルボキシル基間のスペーサー(L2)の長さ、加水分解性基の性質、温度およびpH値によって影響される。用いたエステル基のポリマー鎖の大多数が加水分解された。ベタインエステルの加水分解速度は、細菌細胞およびタンパク質が表面に付着した後にも、より遅い。1つのメチレンスペーサー(L2)を有するpCBMA−1 C2を選択し、実験温度は、速い加水分解速度を達成し、生理的に関連した温度を提供するために37℃に設定した。タンパク質吸着結果(表2を参照)は、清潔なカチオン性pCBMA−1 C2表面は、37℃およびpH10.0でわずか24時間後に非汚染性双性イオン表面に加水分解されたが、非汚染性表面を形成し、107個の細胞・mL−1のE.coli K12懸濁液からの細菌の付着の後に細菌残留物を放出するのに、48時間を必要とすることを示した。1010個の細胞・mL−1の懸濁液から細菌細胞がpCBMA−1 C2表面に付着した場合、同じ加水分解条件の下で付着細菌の放出に8日を要した。
表面の非汚染性特性を測定するために、様々な表面への非特異的タンパク質吸着を、表面プラズモン共鳴(SPR)センサーで測定した(表2を参照)。pCBMA−1 C2および対照表面の加水分解条件を、SPRセンサーによりインシトゥーで調査した。図12Aおよび12Bは、pCBMA−1 C2および対照表面へのフィブリノーゲンの経時的吸着の、代表的なSPRセンサーグラムを示す。加水分解前のpCBMA−1 C2へのフィブリノーゲン吸着は、229.2ng・cm−2であった。CAPS緩衝液(pH10.0)との24時間のインキュベーションの後、pCBMA−1 C2表面への測定可能なタンパク質吸着はなかったが、そのことは、pCBMA−1 C2が非汚染性双性イオンpCBMA−1に完全に加水分解されることを示した。対照的に、pCBMA−1
C2の加水分解は、水またはN−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CEHS)緩衝液(pH9.0)のいずれでの24時間のインキュベーションの後にも完全でなかった。図12Bに示すように、表面を37℃で24時間CAPS緩衝液(pH10.0)とインキュベートした前後に、高いフィブリノーゲン吸着がpC8NMA表面で観察された。しかし、同一条件下でも、pCBMA−2表面は優れた非汚染特性を示し、2ng・cm−2未満のフィブリノーゲン吸収であった。この結果は、得られた双性イオン表面がタンパク質吸着に高度抵抗性であって、移植可能な医療装置の表面コーティングに必要とされる、超低汚染性表面として適格であることを示す。
C2の加水分解は、水またはN−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CEHS)緩衝液(pH9.0)のいずれでの24時間のインキュベーションの後にも完全でなかった。図12Bに示すように、表面を37℃で24時間CAPS緩衝液(pH10.0)とインキュベートした前後に、高いフィブリノーゲン吸着がpC8NMA表面で観察された。しかし、同一条件下でも、pCBMA−2表面は優れた非汚染特性を示し、2ng・cm−2未満のフィブリノーゲン吸収であった。この結果は、得られた双性イオン表面がタンパク質吸着に高度抵抗性であって、移植可能な医療装置の表面コーティングに必要とされる、超低汚染性表面として適格であることを示す。
この実施形態では、本発明は、抗微生物性および非汚染性の特性を組み込み、生体適合性である切替可能なポリマー表面を提供する。代表的なカチオン性ポリマー(すなわち、pCBMAの前駆体)は、細菌細胞を効果的に死滅させることができ、加水分解後に双性イオン非汚染性表面に切り替わり、死細菌細胞を放出する。さらに、生じた非汚染性双性イオン表面は、さらにタンパク質および微生物の付着を防止することができ、表面でのバイオフィルムの形成を減少させることができる。抗微生物性から非汚染性表面への切替可能な過程は、適用の特定の要件のために、これらのポリマーの加水分解速度の調節を通して調整することができる。
上記のように、本発明のカチオン性ポリマーは、疎水性の対イオンまたは治療活性(例えば、抗微生物性または抗細菌性の活性)を有する対イオンを含むことができる。サリチル酸対イオン(ポリCBMA−1 C2)を有する代表的なポリマーは、図13に例示するモノマー:CBMA−1 C2(「1」は2つの荷電基の間の1つの炭素を示し、「C2」はC2エステルを示す)から調製することができる。その対イオンとしてサリチル酸(SA)を加えたポリCBMA−1 C2ヒドロゲルは、1mM CBMA−1 C2 SAモノマー(図面13)を、1mlの溶媒(エチレングリコール:水:エタノール=1:2:1)中で0.05mMテトラエチレングリコールジメタクリレートと65℃で2時間共重合することによって調製した。生じたヒドロゲルは、脱イオン水に12時間浸した。ヒドロゲルは、直径1cmの円形ディスクに切断した。次に、ヒドロゲルディスクを、異なるpHおよびイオン強度の溶液に移し、25℃または37℃でインキュベートした。異なる時点で、水相を完全に除去し、新しい溶液を加えた。水相へのSAの放出は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定した。SAの放出速度は、時間で割った放出されたSAの量(mg/h)と定義される。pCBMA−1 C2 SAヒドロゲルからのSAの放出速度は、温度、イオン強度およびpHによって決まる。図14および図15は、より高いpHがSAの放出を促進し、より高いイオン強度がSAの放出速度をわずかに増加させることができることを示した。図14および図15を比較することによって、上昇温度が水およびリン酸緩衝食塩水(PBS)中でSAのより速い放出をもたらすことが観察される。SAの放出速度は、すべての条件で時間の関数として低下する。
治療薬送達
本発明の別の態様では、治療剤送達系が提供される。本発明のカチオン性ポリマーは、ポリマーと可逆的に結合することができる治療剤の送達における担体として有利に働く。一実施形態では、治療剤送達系は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む。本明細書で用いるように、用語「可逆的に結合する」は、結合相互作用(例えば、イオン性)を通してカチオン性ポリマーと効果的に縮合(すなわち、パッケージ化または結合)することができ、その後、送達系がその標的に到達すると放出させることができる治療剤を指す。適する治療剤には、関心の標的においてカチオン性ポリマーの加水分解および対応する双性イオンポリマーへのその変換の結果として、治療剤がポリマーから解離する標的への輸送の間、カチオン性ポリマーと結合するのに十分な電荷特性を有する小分子、核酸(例えば、遺伝子)、タンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、治療剤は、DNA、RNAまたはsiRNAなどの核酸である。
本発明の別の態様では、治療剤送達系が提供される。本発明のカチオン性ポリマーは、ポリマーと可逆的に結合することができる治療剤の送達における担体として有利に働く。一実施形態では、治療剤送達系は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む。本明細書で用いるように、用語「可逆的に結合する」は、結合相互作用(例えば、イオン性)を通してカチオン性ポリマーと効果的に縮合(すなわち、パッケージ化または結合)することができ、その後、送達系がその標的に到達すると放出させることができる治療剤を指す。適する治療剤には、関心の標的においてカチオン性ポリマーの加水分解および対応する双性イオンポリマーへのその変換の結果として、治療剤がポリマーから解離する標的への輸送の間、カチオン性ポリマーと結合するのに十分な電荷特性を有する小分子、核酸(例えば、遺伝子)、タンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、治療剤は、DNA、RNAまたはsiRNAなどの核酸である。
ある実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体は、第一の反復単位および第二の反復単位を有する。適する第一の反復単位には第三級(3°)アミン基が含まれ、適する第二の反復単位には、第一級(1°)、第二級(2°)または第四級(4°)アミン基が含まれる。これらの共重合体は、3°/1°、3°/2°および3°/4°と命名することができる。一実施形態では、第二の反復単位には、第四級アミン基が含まれる(例えば、3°/4°共重合体)。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。
さらなる態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを用いる治療剤を投与する方法を提供する。本方法では、治療剤は、治療剤送達系を投与することによって、それを必要とする対象に投与される。一実施形態では、本方法は、治療剤送達系の有効量を投与することを含む。本明細書で用いるように、用語「有効量」は、所望の治療作用の達成に十分な治療剤の量を含む送達系の量を指す。当業者は、対象、治療する状態および投与の方法に基づき、治療剤の有効量を容易に決定することができる。
核酸送達における本発明の代表的なカチオン性ポリマーの調製および有用性は、実施例5に記載する。
代表的なカチオン性ポリマー、ポリCBAA−1−エステル(14kDa)、ポリCBAA−3−エステル(13kDa)およびポリCBAA−5−エステル(9.6kDa)を溶解してポリマー溶液を提供し、プラスミドDNAと混合した。図16は、アガロースゲル上のプラスミドDNAの移動を示すが、それは、アガロースゲル電気泳動遅滞を通して、それらの電荷およびサイズに基づいてポリマーまたは複合体を分離することができる。バンド1は、DNAだけを含む。ポリマー溶液の添加で、高い分子量を有する1つのバンドだけが各場合について見出され、全3つのカチオン性ポリマーがプラスミドDNAを縮合させ、DNA/ポリマー複合体(バンド2、4および6)を形成することを示している。ポリCBAA−1−エステル/DNA複合体は、強い染色シグナルを示した。アガロースゲル電気泳動遅滞は、加水分解の前後の明白な変化を示す。100mM水酸化ナトリウムを用いる1時間の加水分解の後、3つのポリマー溶液はプラスミドDNAと複合体を形成することができず、混合液の全DNAがアガロースゲルの上で移動した(バンド3、5および7を参照)。
光散乱からの結果に基づくと、3つのポリマー、ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−3−エステルおよびポリCBAA−5−エステルのそれぞれは、それぞれ106、136および112nmの平均直径を有する複合体を形成した。粒子は、低い多分散でよく形成される(表2)。細胞による内在化を可能にするために、より小さなサイズのポリマー/DNA複合体(150nm未満)が望まれる。結果は、全3つのポリマーが、DNAを遺伝子送達担体のために適当なサイズで縮合させることができることを示す。全3つのポリマー/DNA複合体は、溶液中の迅速な分散を可能にする正電荷を有する。ポリCBAA−1−エステル、ポリCBAA−2−エステルおよびポリCBAA−3−エステルは、それぞれ+3.13±0.98、+6.47±0.33および+11.80±1.44の平均ζ電位を有した。
さらに、第三級アミンを「プロトンスポンジ」として導入することができる。第三級アミンは、生理的範囲の近くのpKa値を有する。これらのアミンは、プロトンの流入が酸性化および潜在的DNA分解を引き起こすエンドソーム区画を緩衝することができるので、この特性は細胞内送達のために有利である。プロトンのアミン媒介性結合は、プロトンスポンジ効果として知られる小胞膨潤および破裂をもたらすことができる、エンドソームとサイトゾルとの間の浸透勾配の形成をもたらす。
エンドソーム緩衝能を生体適合性と組み合わせるために、カルボキシベタインメタクリレート(CBMA)モノマーの第二級(2°−)、第三級(3°−)、第四級(4°−)アミン類似体を合成した。図17を参照。モノマーを、100%/0%、75%/25%、50%/50%、25%/75%および0%/100%の比で共重合させ、30〜35kDaのポリマーをもたらした。
次に、ポリマーを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするDNAを、別々のナノ粒子に縮合させた。ナノ粒子のサイズおよび表面電荷は、Brookhaven ZetaPALS器具で測定した(それぞれ、図18および19を参照)。75%4°/25%2°および50%4°/50%2°共重合体を除くすべてのポリマーが、クラスリン媒介エンドサイトーシスを通して細胞に入るのに十分小さなナノ粒子にDNAを縮合させることが判明した。すべての3°/4°および4°/2°共重合体はDNAを正に荷電したナノ粒子に縮合させたが、すべての2°/3°共重合体ナノ粒子は負に荷電した。正電荷は、特異的結合がない場合に細胞との静電的相互作用を可能にする。
次に、ナノ粒子を用いて、COS−7細胞をルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトさせた。3°/4°混合ポリマー、100%4°および75%4°/25%2°からのナノ粒子でトランスフェクトさせた細胞だけが、送達された遺伝子の測定可能な発現を有した。50/50の3°/4°共重合体は、トランスフェクションにおいて他の共重合体よりも1桁効率的であった。
トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞コロニーを、細胞生存度の尺度として、タンパク含有量について試験した。すべての混合アミンナノ粒子(2つの例外)が、培地だけで処理した細胞よりも優れていないものの、それと同等の細胞生存度を有することが判明した。混合アミンナノ粒子のトランスフェクション効率および細胞生存度を、ポリマー遺伝子送達の標準と広くみなされているポリ(エチレンイミン)(PEI)と比較した。図20を参照。3°および4°CBMAエステルの50/50混合物は、誤差の範囲内でPEIと同等のトランスフェクション効率を有した(CBMAについては3.3×106±1×106RLU/ウェル、対してPEIでは3.1×106±4×105RLU/ウェル)。
モノマー上の加水分解性部分の重要性を試験するために、第三級モノマーを、ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)で置換した。DMAEMAはCBMAエチルエステルの3°類似体に構造的に非常に類似しているが、その側鎖はアミン基の後ろで切断されている。したがって、それは同じエンドソーム緩衝能を有すると予想されたが、加水分解して双性イオン性になる能力がない。DMAEMAモノマーが同じ2°および4°モノマーで共重合された場合、生じた共重合体はベースラインのトランスフェクションだけを示し、エチルエステル基の加水分解が3°CBMAエステルのトランスフェクション能力の鍵であることを示した。図22を参照。
3°および4°CBMAエステルの50/50混合物から調製される共重合体の成功は、それが別々のサイズの正荷電のナノ粒子にDNAをパッケージ化することを可能にする正電荷、および、エンドソーム緩衝を可能にする第三級アミンのその均衡に帰することができる。これらの特性は、加水分解してDNAを放出し、非汚染性で生体適合性の副生成物を残すポリマー側鎖の能力によって、さらに高められる。
以下の実施例は、請求される発明を限定するものではなく、例示するために提供される。
(実施例1)
代表的なカチオン性ポリマーの合成および特性評価
材料。N−(3−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミド(>98%)を、TCI America、Portland、ORから購入した。ブロモ酢酸メチル(97%)、エチル4−ブロモ酪酸(≧97.0%)、エチル6−ブロモヘキサン酸(99%)、臭化銅(I)(99.999%)、臭化ブロモイソブチリル(BIBB98%)、11−メルカプト−1−ウンデカノール(97%)および2,2’−ビピリジン(BPY99%)、および2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)(AIBN98%)を、Sigma−Aldrichから購入した。フィブリノーゲン(ウシ血漿からの分画I)およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4、0.15M、138mM NaCl、2.7mM KCl)を、Sigma Chemical Co.から購入した。エタノール(無水200プルーフ)は、AAPER Alcohol and Chemical
Co.から購入した。実験で用いた水は、ミリポア純水装置を18.0MΩ.cmの最小比抵抗で用いて精製した。
代表的なカチオン性ポリマーの合成および特性評価
材料。N−(3−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミド(>98%)を、TCI America、Portland、ORから購入した。ブロモ酢酸メチル(97%)、エチル4−ブロモ酪酸(≧97.0%)、エチル6−ブロモヘキサン酸(99%)、臭化銅(I)(99.999%)、臭化ブロモイソブチリル(BIBB98%)、11−メルカプト−1−ウンデカノール(97%)および2,2’−ビピリジン(BPY99%)、および2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)(AIBN98%)を、Sigma−Aldrichから購入した。フィブリノーゲン(ウシ血漿からの分画I)およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4、0.15M、138mM NaCl、2.7mM KCl)を、Sigma Chemical Co.から購入した。エタノール(無水200プルーフ)は、AAPER Alcohol and Chemical
Co.から購入した。実験で用いた水は、ミリポア純水装置を18.0MΩ.cmの最小比抵抗で用いて精製した。
ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレート(1)を、Ilker, M. F.;Nuesslein, K.;Tew, G. N.;Coughlin, E. B.、「Tuning the Hemolytic and Antibacterial Activities of Amphiphilic Polynorbornene Derivatives」、Journal of the American Chemical Society126巻(48号):15870〜15875頁、2004年に記載の方法を用いて、BIBBおよび2の反応を通して合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.15 (t, J=6.9,
2H, OCH2), 2.51 (q, J=7.5, 2H, SCH2), 1.92 (s, 6H, CH3), 1.57−1.72 (m, 4H, CH2), および1.24−1.40 (m, 16H, CH2).
カチオン性モノマー合成
CBAA−1−エステル:(2−カルボキシメチル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、メチルエステル。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.15 (t, J=6.9,
2H, OCH2), 2.51 (q, J=7.5, 2H, SCH2), 1.92 (s, 6H, CH3), 1.57−1.72 (m, 4H, CH2), および1.24−1.40 (m, 16H, CH2).
カチオン性モノマー合成
CBAA−1−エステル:(2−カルボキシメチル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、メチルエステル。
N−(3−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミド(25mmol)、ブロモ酢酸メチル(37.5mmol)およびアセトニトリル(25mL)を、100mL丸底フラスコに加えた。混合液を、室温で6時間、窒素雰囲気の下で撹拌した。沈殿物を収集し、約500mLの無水アセトンで洗浄した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、白色粉末(96%収率)を得た。
1H NMR (300 MHz, D2O): 2.02 (m, 2H, −CH2−), 3.25 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.37 (t, 2H,
CH2−N+), 3.58 (m, 2H, CH2−N), 3.79 (s, 3H, O−CH3), 4.29 (s, 2H, CH2−C=O), 5.77 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.19 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.23 (m, 1H, =CH−CON−).
CBAA−3−エステル:(4−カルボキシプロピル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
1H NMR (300 MHz, D2O): 2.02 (m, 2H, −CH2−), 3.25 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.37 (t, 2H,
CH2−N+), 3.58 (m, 2H, CH2−N), 3.79 (s, 3H, O−CH3), 4.29 (s, 2H, CH2−C=O), 5.77 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.19 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.23 (m, 1H, =CH−CON−).
CBAA−3−エステル:(4−カルボキシプロピル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
N−(3−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミド(50mmol)、エチル4−ブロモブチレート(60mmol)およびアセトニトリル(25mL)を、100mL丸底フラスコに加えた。混合液を、室温で3日間、窒素雰囲気の下で撹拌した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、無色油(92%収率)を得た。
1H NMR (300 MHz, D2O):1.22 (t, 3H CH3), 2.00 (m, 4H, C−CH2−C), 2.47 (t, 2H, CH2−C=O), 3.06 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.28−3.35
(6H, CH2−NおよびCH2−N+−CH2 ), 4.14 (q, 2H, O−CH2), 5.75 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.19 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.26 (m, 1H, =CH−CON−).
CBAA−5−エステル:(6−カルボキシペンチル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
1H NMR (300 MHz, D2O):1.22 (t, 3H CH3), 2.00 (m, 4H, C−CH2−C), 2.47 (t, 2H, CH2−C=O), 3.06 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.28−3.35
(6H, CH2−NおよびCH2−N+−CH2 ), 4.14 (q, 2H, O−CH2), 5.75 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.19 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.26 (m, 1H, =CH−CON−).
CBAA−5−エステル:(6−カルボキシペンチル)3−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
N−(3−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミド(50mmol)、エチル6−ブロモヘキサノエート(55mmol)およびアセトニトリル(25mL)を、100mL丸底フラスコに加えた。混合液を、45℃で5日間、窒素雰囲気の下で撹拌した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、わずかに黄色を帯びた油(87%収率)を得た。
1H NMR (300 MHz, D2O): 1.20 (t, 3H CH3),
1.34 (m, 2H, C−C−CH2−C−C), 1.60−1.72 (4H, C−CH2−C−CH2−C), 2.00 (m, 2H, N−C−CH2−C−N), 2.34 (t, 2H, CH2−C=O), 3.04 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.24−3.37 (6H, CH2−NおよびCH2−N+−CH2), 4.12 (q, 2H, O−CH2), 5.75 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.20 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.24 (m, 1H, =CH−CON−).
代表的なカチオン性ポリマーの合成
表面開始ATRP。3つのモノマー、CBAA−1−エステル、CBAA−3−エステルおよびCBAA−5−エステルを、表面開始ATRPを用いて金コーティングSPRセンサーチップまたは金コーティングシリコンチップに融合させた。ポリマーブラシの調製および特性評価は、Zhang, Z.;Chen, S.;Chang, Y.;Jiang, S.、「Surface Grafted Sulfobetaine Polymers Via Atom Transfer Radical Polymerization as Superlow Fouling Coatings」。Journal of Physical Chemistry B110巻(22号)、:10799〜10804頁、2006年、およびZhang, Z.;Chen, S.;Jiang, S.、「Dual−Functional Biomimetic Materials: Nonfouling Poly(carboxybetaine) With Active Functional Groups for Protein Immobilization」、Biomacromolecules7巻(12号):3311〜3315頁、2006年に記載される。過去の刊行物。簡潔には、CuBr(1mmol)およびBr−チオールSAMを有するSPRチップまたは金ディスクを、窒素パージした反応試験管に入れた。CBAAエステル(6.5mmol)を有する脱気溶液(1:1の容量比の純水およびメタノール、10mL)およびBPY(2mmol、5mLの脱気したメタノール中)を、注射器で試験管に移した。窒素の下で1時間を超える反応の後、SPRチップまたは金ディスクを取り出し、エタノール、水およびPBS溶液で洗浄した。試料は、試験の前にPBS溶液で保存した。
1H NMR (300 MHz, D2O): 1.20 (t, 3H CH3),
1.34 (m, 2H, C−C−CH2−C−C), 1.60−1.72 (4H, C−CH2−C−CH2−C), 2.00 (m, 2H, N−C−CH2−C−N), 2.34 (t, 2H, CH2−C=O), 3.04 (s, 6H, N+(CH3)2), 3.24−3.37 (6H, CH2−NおよびCH2−N+−CH2), 4.12 (q, 2H, O−CH2), 5.75 (m, 1H, CH=C−CON−trans); 6.20 (m, 1H, CH=C−CON− cis), 6.24 (m, 1H, =CH−CON−).
代表的なカチオン性ポリマーの合成
表面開始ATRP。3つのモノマー、CBAA−1−エステル、CBAA−3−エステルおよびCBAA−5−エステルを、表面開始ATRPを用いて金コーティングSPRセンサーチップまたは金コーティングシリコンチップに融合させた。ポリマーブラシの調製および特性評価は、Zhang, Z.;Chen, S.;Chang, Y.;Jiang, S.、「Surface Grafted Sulfobetaine Polymers Via Atom Transfer Radical Polymerization as Superlow Fouling Coatings」。Journal of Physical Chemistry B110巻(22号)、:10799〜10804頁、2006年、およびZhang, Z.;Chen, S.;Jiang, S.、「Dual−Functional Biomimetic Materials: Nonfouling Poly(carboxybetaine) With Active Functional Groups for Protein Immobilization」、Biomacromolecules7巻(12号):3311〜3315頁、2006年に記載される。過去の刊行物。簡潔には、CuBr(1mmol)およびBr−チオールSAMを有するSPRチップまたは金ディスクを、窒素パージした反応試験管に入れた。CBAAエステル(6.5mmol)を有する脱気溶液(1:1の容量比の純水およびメタノール、10mL)およびBPY(2mmol、5mLの脱気したメタノール中)を、注射器で試験管に移した。窒素の下で1時間を超える反応の後、SPRチップまたは金ディスクを取り出し、エタノール、水およびPBS溶液で洗浄した。試料は、試験の前にPBS溶液で保存した。
ポリマー合成および特性評価
メタノール中の約0.3MのCBAA−1−エステル溶液を、窒素で30分間パージした。次に、イニシエーターとして3モル%AIBNを用いて、窒素下60℃で約48時間重合を実施して、ポリCBAA−1−エステルを提供した。ポリCBAA−3−エステルまたはポリCBAA−5−エステルの調製のために、溶媒としてエタノールを用いて同様の方法を適用した。ポリマーをエチルエーテルで洗浄し、次に溶媒を除去した。ポリマーの構造は、NMRで確認した。
1H NMR (300 MHz, D2O): ポリCBAA−1−エステル: 1.62 (br, 2H), 2.05 (br, 3H), 3.25−3.32 (br, 8H), 3.62 (br, 2H), 3.83 (s, 3H), 4.38 (s, 2H); ポリCBAA−3−エステル 1.21 (t, 3H), 1.61 (br, 2H), 2.04 (br, 5H), 2.50 (t, 2H), 3.37 (br, 6H), 3.12 (s, 6H), 4.14 (q, 2H); ポリCBAA−5−エステル: 1.22 (t, 3H), 1.37 (m, 2H), 1.62−1.80 (br m, 6H), 2.01 (br, 3H), 2.39 (t, 2H), 3.03 (s, 6H), 3.24
(br m, 6H), 4.12 (q, 2H).
線状ポリCBAAの分子量は、Waters Ultrahydrogel 1000カラムを備えたWaters Alliance 2695 Separations Moduleを用いて推定し、Waters 2414 Reflex Detectorで検出した。移動相は、0.5mL/分の流速の水溶液であった。器具およびカラムは、Polymer Laboratoriesからのポリ(エチレンオキシド)標準で較正した。すべての測定は、35℃で実施した。ポリマーの分子量は、WatersからのEmpower Proを用いて計算した。
メタノール中の約0.3MのCBAA−1−エステル溶液を、窒素で30分間パージした。次に、イニシエーターとして3モル%AIBNを用いて、窒素下60℃で約48時間重合を実施して、ポリCBAA−1−エステルを提供した。ポリCBAA−3−エステルまたはポリCBAA−5−エステルの調製のために、溶媒としてエタノールを用いて同様の方法を適用した。ポリマーをエチルエーテルで洗浄し、次に溶媒を除去した。ポリマーの構造は、NMRで確認した。
1H NMR (300 MHz, D2O): ポリCBAA−1−エステル: 1.62 (br, 2H), 2.05 (br, 3H), 3.25−3.32 (br, 8H), 3.62 (br, 2H), 3.83 (s, 3H), 4.38 (s, 2H); ポリCBAA−3−エステル 1.21 (t, 3H), 1.61 (br, 2H), 2.04 (br, 5H), 2.50 (t, 2H), 3.37 (br, 6H), 3.12 (s, 6H), 4.14 (q, 2H); ポリCBAA−5−エステル: 1.22 (t, 3H), 1.37 (m, 2H), 1.62−1.80 (br m, 6H), 2.01 (br, 3H), 2.39 (t, 2H), 3.03 (s, 6H), 3.24
(br m, 6H), 4.12 (q, 2H).
線状ポリCBAAの分子量は、Waters Ultrahydrogel 1000カラムを備えたWaters Alliance 2695 Separations Moduleを用いて推定し、Waters 2414 Reflex Detectorで検出した。移動相は、0.5mL/分の流速の水溶液であった。器具およびカラムは、Polymer Laboratoriesからのポリ(エチレンオキシド)標準で較正した。すべての測定は、35℃で実施した。ポリマーの分子量は、WatersからのEmpower Proを用いて計算した。
(実施例2)
代表的なカチオン性ポリマー加水分解
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、50mg/mLの濃度で、異なる濃度(10mM、100mMおよび1M)のNaOH溶液に溶解させた。適当な時間の後、希HCl溶液でポリマー溶液を中和し、水は減圧除去した。1H NMR分光法(D2O)を実施し、変化していないエステル基の量を測定し、内部標準として他の非加水分解性ペンダント基と比較することによって、分解速度を測定した。結果を、図3に示す。
代表的なカチオン性ポリマー加水分解
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、50mg/mLの濃度で、異なる濃度(10mM、100mMおよび1M)のNaOH溶液に溶解させた。適当な時間の後、希HCl溶液でポリマー溶液を中和し、水は減圧除去した。1H NMR分光法(D2O)を実施し、変化していないエステル基の量を測定し、内部標準として他の非加水分解性ペンダント基と比較することによって、分解速度を測定した。結果を、図3に示す。
(実施例3)
代表的なカチオン性ポリマーのタンパク質吸着および放出
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、タンパク質吸着について評価した。
代表的なカチオン性ポリマーのタンパク質吸着および放出
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、タンパク質吸着について評価した。
タンパク質吸着は、波長調査に基づくカスタムメイドのSPRセンサーで測定した。SPRチップをプリズムの基部に付着させ、屈折率マッチング流体(Cargille)を用いて光学接触を確立した。2つの独立した並流チャネルを有する二重チャネル流動セルを用いて、実験の間、液体試料を封じ込めた。臑動ポンプ(Ismatec)を利用して、流動セルの2つのチャネルに液体試料を送達した。PBS(0.15M、pH7.4)中の1.0mg/mLのフィブリノーゲン溶液を、0.05mL/分の流速で表面に流した。表面感受性SPR検出器を用いて、リアルタイムでタンパク質−表面相互作用を監視した。表面濃度(単位面積質量)の変化を測定するために、波長シフトを用いた。結果を、図5A〜5Cに示す。
(実施例4)
代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物特性
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの抗微生物特性について評価した。
代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物特性
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの抗微生物特性について評価した。
LB寒天プレート上で、E.coli K12を37℃で一晩別々の純粋な培養で先ず培養し、次に、それを振盪させながら37℃で24時間インキュベートした。4℃で保存される場合、寒天プレート上の培養物は2週間にわたって用いることができる。数個のコロニーを用いて、25mlのLB(20g/L)に接種した。これらの最初の培養物は、37℃で振盪させながら100rpmで18時間インキュベートし、次に、200mlの適当な培地で各種の第二の培養物に接種するために用いた。第二の懸濁培養物が600nmで1.0の光学濃度に到達したとき、4℃で10分間の8,000×gでの遠心分離によって細菌を収集した。細胞ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で3回洗浄し、その後、108個の細胞/mLの最終濃度にPBSで懸濁した。
細菌細胞を含む培養物を、30℃で前平衡させて振盪させた上記のポリマー懸濁液に加えたときに、代表的なポリマー溶液への細菌細胞の曝露を開始し、混合液を室温で30分間インキュベートした。最終溶液は約108個の細胞/mLのE.coli、および2mMの反復単位濃度を含み、それは、ポリマーの反復単位のモル濃度である(CBAAおよびCBAA−エステルの分子量に基づき約0.6〜0.76mg/mL)。細菌をLive/Dead BacLight(商標)(Invitrogen、USA)で染色し、その後、細菌懸濁液を0.2μm孔径のポリカーボネート膜フィルター(Millipore、USA)でろ過し、100×油浸レンズ付きのNikon Eclipse 80iに載せたCCD−CoolSNAPカメラ(Roper scientific,Inc.、USA)で直接観察した。生細胞および死細胞の数を、Cheng, G.;Zhang, Z.;Chen, S.;Bryers, J. D.;Jiang, S.、「Inhibition of Bacterial Adhesion and Biofilm Formation on Zwitterionic Surfaces」、Biomaterials28巻(29号):4192〜4199頁、2007年に記載のものと同じ顕微鏡で、FITCおよびローダミンフィルターを通してそれぞれ測定した。結果を、図6に示す。
(実施例5)
代表的なカチオン性ポリマーの核酸縮合および放出
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの核酸縮合および放出について評価した。
代表的なカチオン性ポリマーの核酸縮合および放出
実施例1に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの核酸縮合および放出について評価した。
ポリマー/DNA複合体の調製およびアガロースゲルシフトアッセイ。実施例1に記載のように調製された3つのカルボキシベタインエステルポリマーを、50mg/mLの濃度で水に溶解した。次に、DMSOを用いて、ポリマー溶液を14〜19mg/mLの濃度に希釈した。次に、水を加えて、1.6〜2.2mg/mLのポリマー最終濃度にした。500μLのポリマー/DMSO/水溶液を、撹拌下1.5mlのDNA溶液(34.5μg/mL)に徐々に加え、複合体またはナノ粒子を形成した。
8.3マイクロリットルの各ナノ粒子溶液を、1.7マイクロリットルの6×ローディングバッファー(Novagen、Madison、WI)と混合し、0.8%アガロースゲルに加えた。ゲルを、65Vで2.5時間流した。用いた対照は、1.7マイクロリットルの6×ローディングバッファーを含む8.3マイクロリットルの30マイクログラム/mL DNA水溶液であった。DNAバンドは、臭化エチジウム染色によって可視化した。結果を、図16に示す。
動的レーザー光線散乱およびζ電位測定。粒子サイズおよびζ電位の測定は、ZetaPALS動的光散乱検出器(Brookhaven Instruments Corp.、Holtsville、NY、USA;15mWレーザー、676nmの入射光線)を用いて行った。ポリマー/DNA複合体を上に述べたように調製し、次に、複合体を1.4mlの25mM Hepes緩衝液pH7.2に希釈した。相関関数を90°の散乱角度で収集し、粒子サイズは、Dynamic Light Scatteringソフトウェア(バージョン3.55)を用いて計算した。平均電気泳動移動度は、BIC PALSζ電位分析ソフトウェア(Ver 3.82)を用いて測定した。
例示的な実施形態を例示し、記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、それに様々な変更を加えることができることはいうまでもない。
排他的専有権または特権が請求される本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に定義される。
Claims (1)
- 本願明細書に記載された発明。
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