JP2013545758A - 増殖性キナーゼｃｄｋ４及びｃｄｋ６の阻害による虚血からの腎組織の保護 - Google Patents

増殖性キナーゼｃｄｋ４及びｃｄｋ６の阻害による虚血からの腎組織の保護 Download PDF

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Abstract

本発明は、虚血による障害から細胞及び／又は組織を保護するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、虚血に曝された患者又は、虚血の危険にある患者に投与されるサイクリン依存性キナーゼ４／６（ＣＤＫ４／６）阻害剤の保護作用に関する。
【選択図】 なし

Description

本出願は、２０１０年１１月１７日出願の米国特許仮出願61/458,140に基づく優先権を主張し、本明細書にはその全体が取り込まれている。
本発明は、米国国立保健研究所により与えられた助成金番号R43AI084248の援助の下で米国政府の支援を受けて行われた。従って、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
この発明は、虚血による障害から健康な細胞を保護するための方法及び組成物に関する。例えば、本発明は、哺乳動物の患者の腎臓のような特定の組織及び／又は細胞において薬理学的静止を誘導するためのサイクリン依存性キナーゼ4/6（CDK4/6）阻害剤の使用に関し、それによってその患者の臨床結果を向上させる。
虚血障害から腎臓を保護することが証明されている治療法が存在しないため、現在腎臓がそれ自身で治ることができる時まで患者を支援することが管理されている。管理戦略には、ボリューム状態、リン結合剤、及び、必要に応じて透析を調節するために利尿薬の使用が含まれている。注目すべきは、これらの治療法は、いずれも腎臓修復過程の自然経過を変えるものではなく、いくつかの証拠は、利尿剤と透析が、腎臓の障害を悪化させる可能性を示唆している。
従って、虚血及び/又はこれに関連する事象が発生することが予測されている患者、発生する危険のある患者、又は既に発生した患者を保護するための実用的な方法に対して継続的な必要性がある。
いくつかの実施態様では、本発明は、治療を必要とする患者の細胞又は組織が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前又は後に、この細胞又は組織における虚血及び／又はこれに関連する事象による障害を軽減する方法であって、この細胞又は組織が障害後にＣＤＫ４／６に依存して増殖することにより特徴付けられ、この患者に、薬学的有効量の、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害する化合物を投与する段階から成る方法である。
いくつかの実施態様では、本発明は、治療を必要とする患者の腎細胞又は腎組織が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前又は後に、この細胞又は組織における虚血及び／又はこれに関連する事象による障害を軽減する方法であって、この患者に、薬学的有効量の、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害する化合物を投与する段階から成る方法である。
いくつかの実施態様では、このＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物は、患者が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前に、と同時に又はその後に、患者に投与される。いくつかの実施態様では、このＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物は、患者が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝された後、約２４〜約４８時間の間に患者に投与される。
いくつかの実施態様では、このＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物は、選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。いくつかの実施態様では、この選択的ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６以外のサイクリン依存性キナーゼの不十分な阻害剤である。
いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、心臓手術、又は低血圧エピソードに関連するこの他の手術である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、ＣＴスキャン、ピロログラム(ｐｙｌｏｒｏｇｒａｍｓ)又はアルチオグラフィー（ａｒｔｉｏｇｒａｐｈｙ）に使用される造影剤の投与である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、血液量減少（例えば、血液が失われることによる）及び／又は低血圧の期間に関連する外傷である。
いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、アスピリン、イブプロフェン、タクロリムス及び／又はシクロスポリンなどの腎血流量を減少させる薬剤の投与である、いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、動脈塞栓により又はインサイチュー動脈又は静脈血栓症により引き起こされる急性の組織虚血又は梗塞である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、臓器の血流の軸捻又は他の一時的な解剖学的破壊である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象が、移植前の腎臓同種移植片の採取、輸送及び／又は冷蔵である。
本発明の目的は、患者に有効量のCDK4/6阻害化合物を投与することによって患者の健康な細胞を虚血の影響から保護する方法を提供することである。
本発明の目的は、上記で述べられたとおりであるが、この目的は、本発明によって、全部又は部分的に達成され、他の目的は、説明が進むにつれて、以下の最善に記載されているように、添付の図面に関連しながら、明らかになるであろう。
CDK4/6阻害は、一次正常ヒト腎近位上皮細胞にG1休止を誘導する。この細胞を種々の濃度(0 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM又は1μM)の6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン(PD 0332991)で16時間処理し、細胞周期の分析を行った代表的ヒストグラムを示す。細胞を回収し、固定し、染色し、フローサイトメトリーで分析した。データはソフトウェアMod-Fit(R) from Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, USA)で処理した。CDK4/6阻害剤の濃度が上がると共に、クリーンなG1休止期部分が増加し、細胞毒性は見られなかった。 CDK4/6阻害は、一次正常ヒト腎近位上皮細胞にG1休止を誘導する。この細胞を種々の濃度(0 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM又は1μM)の6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン(PD 0332991)で16時間処理し、細胞周期の分析を行った。細胞を回収し、固定し、染色し、フローサイトメトリーで分析した。データはソフトウェアMod-Fit(R) from Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, USA)で処理した。図中に、G1期（ダイアモンド形）、G2/M期（四角形）及びS期（三角形）における細胞の割合(%)を示す。 CDK4/6阻害は、一次正常ヒト腎近位上皮細胞の増殖を阻害する。この細胞は種々の濃度(0 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM又は1μM)の6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン(PD 0332991)で72時間処理された。インキュベート後、CellTiter-Glo(R) (Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA)を用いて細胞増殖を定量した。データは4回の繰り返し実験の平均を示す（相対発光量(RLU)、+/-標準偏差）。
図３Ａは、CDK4/6阻害剤の単回投与後の虚血再潅流障害（IRI）後の、上皮細胞への5-ブロモ-2-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みを調べるための投薬スケジュールを示す。虚血再潅流障害（IRI）の１時間前に、強制経口投与により、マウスに6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-（5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ）-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン（PD0332991; 150 mg/kg）又はビヒクル（乳酸ナトリウム緩衝液）を投与した。障害(IRI)の21時間後に、BrdU（100 mg/kg体重）を腹腔内注射により投与した。マウスをBrdU注射の3時間後に屠殺し、腎上皮細胞へのBrdUの取り込みを定量した。 図３Ｂは、CDK4/6阻害剤の２回投与後の虚血再潅流障害（IRI）後の、上皮細胞への5-ブロモ-2-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みを調べるための投薬スケジュールを示す。虚血再潅流障害（IRI）の１時間前に、強制経口投与によりPD0332991又はビヒクルを投与した。さらに2時間後、マウスをPD0332991又はビヒクルで２度目の処理を行った。第２の投与の22時間後に、マウスは、２度目のBrdUの注射を受けた。BrdUの２度目の注射の3時間後、マウスを屠殺し、腎臓の上皮細胞へのBrdUの取り込みを定量した。
図４Ａは、CDK4/6阻害剤による治療により、虚血の24時間後に上皮細胞がS期に入ることが防止されることを示す棒グラフである。図４Ａの右側のグラフは、図３Ａに示す投薬スケジュールに従って虚血再潅流障害（IRI）の1時間前に、ビヒクルで処理された5匹のマウス（白色バー）、及び6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン（即ち、PD 0332991）で1度処理された６匹のマウス（黒色バー）の、5-ブロモ-2-デオキシウリジン（BrdU）陽性細胞の平均データを示す。双方向ANOVA、＊＊＊p＜0.001（ボンフェローニの事後検定）。図４Ａの左側のグラフは、ビヒクル（白色バー）又はPD0332991（黒色バー）で処理されたマウスのデータを示すが、このマウスは虚血再潅流障害を受けていない（CLK）。 図４Ｂは、CDK4/6阻害剤による治療により、虚血の48時間後に上皮細胞がS期に入ることが防止されることを示す棒グラフである。図４Ｂの右側のグラフは、虚血再潅流障害（IRI）を受け、図３Ｂに示す投薬スケジュールに従って、ビヒクル（白色バー、n=5）、又は6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン（PD 0332991、黒色バー、n=6）で２度処理されたマウスの5-ブロモ-2-デオキシウリジン（BrdU）陽性細胞の平均データを示す。双方向ANOVAによる解析によれば＊＊＊p＜0.001であった（ボンフェローニの事後検定）。図４Ｂの左側のグラフは、ビヒクル（白色バー）又はPD0332991（黒色バー）で処理されたマウスのデータを示すが、このマウスは虚血再潅流障害を受けていない（CLK）。 6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン（即ち、PD 0332991）の処理により、両側性虚血再潅流障害の24時間後に、血清クレアチニンレベルが低下することを示す図である。基準の血清クレアチニンは手術の7日前に測定され、ビヒクル投与群と薬物投与群との間に顕著な差は無かった（それぞれ、0.050 mg/dL±0.044と0.044 mg/dL±0.044）。手術の24時間後のビヒクル投与群の血清クレアチニンは2.27mg/dL±0.0732であり、薬物投与群の血清クレアチニンは1.74mg/dL±0.143であった。ビヒクル投与群はN=8、薬物投与群はN=9であった。双方向ANOVAによる解析によれば＊＊＊p＜0.001であった（ボンフェローニの事後検定）。
本明細書で用いる略語は次の意味である：
%=パーセント、μg=マイクログラム、μL=マイクロリットル、μM=マイクロモル、BrdU=5-ブロモ-2-デオキシウリジン、CAT＝コンピュータ体軸断層撮影法、CDK=サイクリン依存性キナーゼ、CDK4/6=サイクリン依存性キナーゼ4 及び／又はサイクリン依存性キナーゼ 6、CT=コンピュータ断層撮影、dL=デシリットル、DMSO=ジメチルスルホキシド、g=グラム、h=時間、IC50=50% 阻害濃度、i.p.=腹腔内、IRI=虚血再潅流障害、kg=キログラム、mg=ミリグラム、nM=ナノモル、PD=6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン(PD 0332991とも呼ばれる)、RLU=相対的光単位、SEM=平均値の標準誤差
本発明を、現在の代表的実施態様が示される添付の実施例を参照しながら詳細に説明する。しかし、本発明は、異なる形態で実施でき、本明細書に記載した実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、この開示が徹底的かつ完全となり、当業者に完全に実施態様の範囲を十分に伝えるように提供される。
別に定義しない限り、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許及びこの他の参考文献は、本明細書にその全体が取り込まれる。
明細書及び特許請求の範囲に渡って、提示される化学式又は化学名は、全ての活性光学及び立体異性体並びにラセミ混合物を、これらの異性体及び混合物が存在する場合、その範囲に含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、虚血及び虚血を誘導する腎臓の毒素の急性毒性作用から腎臓を保護することができる。後に腎臓の再生を促進するために、腎障害の前、その間又はその直後に、経口的に利用可能で非毒性である低分子キナーゼ阻害剤が投与される。
腎臓の増殖が、腎障害に応答して誘導されることが示されている。本明細書に初めて開示されるように、虚血後の腎臓増殖はCDK4/6のキナーゼ活性に依存することが明らかになった。例えば、図4A及び図4Bに示すように、虚血後の腎細胞増殖を、CDK4/6阻害剤の投与により低下させることができる。さらに、腎障害を取り巻く一定期間の間、一定の循環ネフロトキシンはさらに、細胞周期依存的に腎障害を増加させうる。従って、CDK4/6阻害薬の薬理学的使用を通じて、腎上皮細胞を一時的にG1に保持すること（薬理学的静止又はPQ）により、循環ネフロトキシンが除去された後に、腎臓腎修復を可能にすることができる。図5を参照されたい。虚血障害時における一時的PQは、その後の腎臓の回復を強化する。従って、本発明は、増殖している細胞が、外因性毒素に対して非常に敏感であり、従って一時的PQが治療的であるという発見を利用したものといえる。本発明は、腎臓虚血障害の前に、と同時に又はその後（例えば、20時間以内など）に、CDK4/6阻害剤（例えば、選択的CDK4/6阻害剤）を投与すること（例えば、経口又はＩＶ）を含む。腎障害を誘発する条件が逆転されるまで（一般に24〜48時間）、CDK4/6阻害剤の治療レベルを維持することができる。そして、その後、CDK4/6阻害剤を撤回することができ（腎臓で排他的に除去されない化合物を使用する）、腎再生増殖が起こり得る。例えば、低血圧を伴う手術（例えば、心臓バイパス移植）の前、腎同種移植片の移植（例えば、腎臓移植における冷虚血）前、又はヨウ素含有造影剤の使用（これは腎虚血を誘導する）の前に、PQを誘導することができる。このような傷害の24-48時間後に、ネフロトキシンが除去され及び/又は全身血圧が復元されたされたときに、PQを反転させることができる。
従って、本発明は、薬理学的静止が、腎傷害、特に腎虚血の形成に対する保護を提供するという観察に、部分的に関している。腎虚血は、何らかの理由（例えば、手術や外傷性ショック）による低血圧やいくつかの腎毒性薬（CATスキャンで使用されるヨウ素含有造影剤のような、但しこれに限定されるものではない）の傷害メカニズムにより引き起こされることがある。
Ｉ．定義
以下の用語は、当業者により良く理解されると信ずるが、以下の定義は本発明の説明を円滑にするために示すものである。
長年の特許法慣習に従い用語"ａ（１つ、ある）"、"ａｎ（１つ、ある）"及び"ｔｈｅ（その、この）"は、請求の範囲を含めて本申請で用いる際"１以上"を表す。従って、例えば、"a compound（ある化合物）"又は"a cell（ある細胞）"に関しては、複数のこのような化合物又は細胞等々を含む。
用語"comprising（から成る）"は、"including（含む）"、"containing（含む）又は"characterized by(により特徴付けられる)"と同様に、包含的又は制約が無く、付加的な、非列挙の要素又は方法段階を排除しない。"comprising（から成る）"は、名付けられた要素は必須であるが、他の要素も加えることが可能であり、それでも特許請求の範囲の構成物を形成することができることを意味する技術用語である。
用語"consisting of（のみから成る）"は、請求の範囲に明記してない全ての要素、段階又は内容物を除外する。成句"consist of（のみから成る）"が、プレアンブルに直ちに続かないで、請求の範囲の本体に現れる場合、示された要素のみに限定されるが、他の要素は、全体として請求の範囲から排除されない。
用語"consisting essentially of(本質的に、から成る)"は、請求範囲を、明記した材料又は段階に限定して、さらに請求範囲の発明事項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響しない材料又は段階を限定する。
用語"comprising（から成る）"、"consisting of（のみから成る）"及び"consisting essentially of(本質的に、から成る)"に関して、これらの３種の用語の１種が本明細書で用いられた時、本発明は、他の２種の用語のいずれかの使用を含めることができる。
２個の項目又は条件の記載に用いる場合、例えば、CDK4及び／又はCDK6、用語"及び／又は"は、両項目又は条件が存在する又は適用可能である状況に対して、及び両項目又は条件の１つだけが存在する、又は適用可能である状況を表す。従って、CDK4及び／又はCDK6阻害剤は、CDK4及びCDK6の両者を阻害する化合物、CDK4のみを阻害する化合物、又はCDK6のみを阻害する化合物であってもよい。
"健康な細胞"又は"正常な細胞"は、疾病（癌又は他の増殖性疾患）の症候又はマーカーを示さない患者のいかなる細胞をも意味する。いくつかの実施態様では、健康な細胞は腎細胞である。いくつかの実施態様では、健康な細胞は、腎臓などの組織内の細胞である。いくつかの実施態様において、この細胞又は組織は、傷害後に、CDK4/6に依存して増殖することによって特徴付けられ、いくつかの実施態様では、この傷害は虚血に関連している。
"虚血"は、組織又は臓器への血流が不十分であり、その結果、その組織又は臓器が代謝の要求を満たすことができないことに関する。虚血臓器又は組織への再潅流（血流の再開）は、過剰量の活性酸素種（ROS）と反応性窒素種（RNS）の産生をもたらし、そして酸化ストレスを引き起こすことがある。その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の変化、ATPの枯渇（これは虚血中またはその結果として発生する）、細胞内のカルシウムの増加、並びにタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びヌクレアーゼの活性化のような一連の事象をもたらし、細胞機能／完全性の損失につながる。
虚血再潅流障害（IRI）は、虚血状態にあった組織に血液循環が再起動された後に発生する障害のことをいう（例えば、移植又は自己移植のように、臓器を手術によって切り出し、再び取り付ける場合など）。この他の限定されない例として、このような障害は、臓器移植のために血液の循環を停止した後、心筋梗塞後に冠状動脈を経皮的冠動脈形成術（PTCA）、ステント又はバイパスで処理した後、及び脳卒中の患者に血栓崩壊剤を投与した後に、血液の循環を再起動したときにも発生する。この他の例として、心臓手術のために、しばしば心筋保護液を同時投与することにより、心臓への血流を一時的に停止した場合がある。またこの他の例として、手足に止血帯を施して、整形外科医による無血部分の手術のために手足への血流を中断する場合がある。このような障害は、腎臓、腸、心臓、肝臓、脳、甲状腺、皮膚、腸粘膜、聴覚系、肺、膀胱、卵巣、子宮、精巣、副腎、胆嚢、膵臓、膵島、胃、血管、又は筋肉（例えば、骨格筋、平滑筋又は心筋）組織、及びこれらの組み合わせのような、但しこれらに限定されない多くの組織で起こる。いくつかの実施態様では、この障害は、心臓、肺、腎臓組織、又はそれらの組み合わせで起こる。いくつかの実施態様では、この障害を被る細胞又は組織は、障害後CDK4/6に依存して増殖することによって特徴付けられる。
いくつかの実施態様では、この障害は腎臓細胞又は組織で起こる。従って、いくつかの実施態様において、本発明によって処理される（例えば、減少される又は防止される）べき虚血再潅流障害（IRI）には、腎臓虚血再潅流障害が含まれる。いくつかの実施態様では、腎細胞又は組織は、障害後CDK4/6に依存して増殖することによって特徴付けられる。
"虚血に曝される危険"は、将来虚血に曝されることが予測される患者又は将来偶然に虚血に曝される可能性のある患者を意味する。
"化合物の薬学的有効量"は、患者に有効な結果を効果的に生じさせる量を意味する。
いくつかの実施態様では、この有効量は、一時的に（例えば、数時間又は数日）患者の細胞に静止期を誘導するに必要な量をいう。
いくつかの実施態様では、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物は、長期毒性、抗酸化効果及び/又はエストロゲン作用等の、但しこれらに限定されないオフターゲット効果が無い（からフリーである）。この"〜が無い（からフリーである）"は、特にin vivoで又は細胞をベースとした検定に用いた場合、好ましくない又はオフターゲット効果を持たないCDK4/6阻害化合物に関することができる。
いくつかの実施態様では、この"〜が無い（からフリーである）"は、長期毒性、抗酸化効果、エストロゲン作用、チロシンキナーゼ阻害効果、CDK4/6以外のCDKに対する訴外効果、及び/又はCDK4/6非依存性細胞の細胞周期休止等の、但しこれらに限定されないオフターゲット効果を持たない、選択的CDK4/6阻害化合物に関することができる。
オフターゲット効果"が実質的にない（実質的にフリーな）"CDK4/6阻害剤は、いくつかの軽微なオフターゲット効果を持つことができるCDK4/6阻害剤であり、このオフターゲット効果は、CDK4/6依存性細胞を細胞毒性化合物から防護する阻害剤の防護能を妨害しない。例えば、オフターゲット効果"から実質的にフリーな"CDK4/6阻害剤は、この阻害剤がCDK4/6依存性細胞の選択的Ｇ１期停止をもたらす限り、他のＣＤＫに対するいくつかの軽微な阻害効果（例えば、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２に対するＩＣ５０が、＞０．５μＭ；＞１．０μＭ；又は＞５．０μＭ）を持つことができる。
"減少した"又は"妨げた"又はこれらの文法的同義語は、夫々、その効果を減少させること、又はその効果が完全に起こることから守ることを意味する。
"薬理学的静止"は、細胞周期が一時的に休止することを意味する。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、全ての脊椎動物種（例えば、哺乳類、鳥類等）について有効であり、これらをも用語"患者"に含むことを意図することは、理解されたいが、本発明の方法の治療の対象は好ましくはヒト患者である。
より詳細には、本明細書に、ヒト及び、絶滅の危機にある重要な哺乳類（例えば、シベリアトラ）、ヒトに対し経済的に重要な哺乳類（ヒトにより消費されるために農場で飼育されている動物）及び／又は、例えば、ヒト以外の肉食動物（例えば、ネコ及びイヌ、）スワイン（ブタ、ホッグ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダのような）、及びウマのように、ヒトに対し社会的に重要な哺乳類（ペットとして、又は動物園で飼われている動物）のような哺乳類の治療が含まれている。従って、本明細書に記載した本方法の態様は、家畜性スワイン（ブタ及びホッグ）、反芻動物、馬、家禽類等々の治療を含むが、これらに制限されない。
"アルキル基"は、線型（即ち、直鎖）、分枝型、又は環状、飽和、又は少なくとも部分的に飽和、及びいくつかの場合完全に不飽和型（即ち、アルケニル基及びアルキニル基）炭化水素鎖を含むＣ１〜２０を表わし、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基が含まれる。"分枝型"は、メチル基、エチル基又はプロピル基のような低級アルキル基が線型アルキル鎖に付加したアルキル基を表す。"低級アルキル基"は、１から８炭素原子（即ち、Ｃ１〜８アルキル基）例えば、１，２，３，４，５，６，７又は８炭素原子、を有するアルキル基を表す。"高級アルキル基"は、約１０から約２０炭素原子、例えば、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０炭素原子、を有するアルキル基を表す。ある態様において、"アルキル基"は特に、Ｃ１〜８直鎖アルキル基を表す。他の態様において、"アルキル基"は特に、Ｃ１〜８分枝鎖アルキル基を表す。
アルキル基を、任意に１個以上の、同一又は異なる、アルキル基置換基により置換することができる（"置換アルキル基"）。用語"アルキル基置換基"はアルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、ヒドロキシル基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基及びシクロアルキル基を含むが、これらに制限されない。アルキル鎖に沿って、任意に、１以上の酸素原子、イオウ原子又は置換窒素原子又は非置換窒素原子を挿入することができて、ここで、窒素置換基は、水素原子、低級アルキル基（本明細書ではまた、"アルキルアミノアルキル基"と表す）又はアリール基である。
従って、"置換アルキル基"は、本明細書で定義したように、アルキル基を含み、ここでアルキル基の１以上の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置き換えられ、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれる。
"アリール基"は、単一芳香族環、又は互いに融合した、又は共有結合で連結した、又はメチレン基又はエチレン基部分のような、しかしこれらに制限されない、一般的な置換基に結合した芳香族部分を表す。一般的な連結基はまた、ベンゾフェノンにおける様なカルボニル基、又はジフェニルエーテルにおける様な酸素原子、又はジフェニルアミンにおける様な窒素原子であってもよい。用語"アリール基"は、とりわけ複素環式芳香族化合物を含む。この芳香族環（複数もあり）は、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルエーテル基、ジフェニルアミン基及びベンゾフェノン基を含むことができる。特別の実施形態において、用語"アリール基"は、約５から約１０炭素原子、即ち５，６，７，８，９又は１０炭素原子を含む環状芳香族基を意味し、及び５−及び６−員環の炭化水素、及び複素環式芳香族環を含む。
アリール基は、任意に、１以上の同一又は異なる、アリール基置換基と置き換えることができて（"置換アリール基"）、ここで"アリール基置換基は"アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、アラルキルオキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アシル基、ハロ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルコキシカルボニル基、アシルオキシル基、アシルアミノ基、アロイルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アルキレン基及びＮＲ'Ｒ"を含み、ここでＲ'及びＲ"は、夫々独立に、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、及びアラルキル基である。
従って、"置換アリール基"は、本明細書で定義したように、アリール基を含み、ここでアリール基の１以上の原子又は官能基は、他の原子又は官能基と置き換えられ、官能基としては、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれる。
アリール基の特別な例としては、シクロペンタジエニル基、フェニル基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、ピラン基、ピリジン基、イミダゾール基、ベンズイミダゾール基、イソチアゾール基、イソクサゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、トリアジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基等々が含まれるが、これらに制限されない。
用語"ヘテロアリール基"は、芳香族環又は芳香族環類の骨格の少なくとも１原子が、炭素以外の原子である、アリール基を表す。従って、ヘテロアリール基は、窒素、酸素、イオウ原子を含むが、これらに制限されない、群から選択された１以上の非炭素原子を有する。
"アシル基"は、有機カルボン酸基を表し、ここでカルボキシル基の−ＯＨは他の置換体（即ち、ＲＣＯ−で表せるように、ここでＲは、アルキル基、又は本明細書で定義されたアリール基である）で置換される。従って、用語"アシル基"は、特に、アセチルフラン基及びフェナシル基のような、アリールアシル基を含む。アシル基の特別な例として、アセチル基及びベンゾイル基が含まれる。
"環状"及び"シクロアルキル基"は、約３から約１０個の炭素原子、例えば、３，４，５，６，７，８，９又は１０炭素原子の、非芳香属性単環式又は多環式環状システムを表す。このシクロアルキル基は、任意に、部分的に不飽和であってもよい。シクロアルキル基は、任意に、本明細書で定義したように、オキソ基及び／又はアルキレン基のような、アルキル基置換体により置換されてもよい。環状アルキル鎖に沿って、任意に、１以上の酸素、硫黄、又は置換した又は非置換の窒素原子を挿入することができて、ここで、窒素置換基は、水素、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基であり、従って、複素環式置換基を提供する。代表的な単環式シクロアルキル環は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、及びシクロヘプチル基を含む。多環式シクロアルキル環は、アダマンチル、オクタヒドロナフチル基、デカリン、樟脳、カンファン、及びノラダマンチルを含む。
"複素環"又は"複素環式基"は、環状環の１以上の骨格炭素原子が、ヘテロ原子（例えば、窒素、硫黄、又は酸素原子）により置き換えられたシクロアルキル基（即ち、本明細書に記載された非芳香環、環状基）を表す。複素環の例としては、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリン、ジオキサン、ピペリジン、ピペラジン、及びピロリジンが含まれるが、これらに制限されない。
"アルコキシル基"又は"アルコキシ基"は、アルキル−Ｏ−基を表し、ここでアルキル基は、既述の通りである。本明細書の用語"アルコキシル基"は、例えば、メトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、ｔ−ブトキシル基、及びペントキシル基と表すことができる。用語"オキシアルキル基"は、"アルコキシル基"と互換的に用いることができる。
"アリールオキシル基"又は"アリールオキシ基"は、アリール−Ｏ−基を表し、ここでアリール基は、置換アリール基を含み、既述の通りである。本明細書で用いる用語"アリールオキシル基"は、フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基、及びアルキル基、置換アルキル基、ハロ、又はアルコキシル置換フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基と表すことができる。
"アラルキル基"は、アリール−アルキル基を表し、ここでアリール基及びアルキル基は既述通りであり、また置換アリール基及び置換アルキル基を含む。アラルキル基の例として、ベンジル基、フェニルエチル基、及びナフチルメチル基が含まれる。
"アラルキルオキシル基"又は"アラルキルオキシ基"は、アラルキル−Ｏ−基を表し、ここでアラルキル基は既述通りである。アラルキルオキシル基の例として、ベンジルオキシル基がある。
"アミノ基"は、-NR'R''基を表し、ここでR'及びR''は夫々独立に、Ｈ原子、置換及び非置換アルキル基、シクロアルキル基、複素環式基、アラルキル基、アリール基、及びヘテロアリール基を含む群から選択される。いくつかの実施態様において、このアミノ基は-NH2である。"アミノアルキル基"及び"アミノアリール基"は、-NR'R''基を表し、ここでR'はアミノ基に対して定義されたものであり、及びR''は、夫々、置換又は非置換のアルキル基、又はアリール基である。
"アシルアミノ基"は、アシル−ＮＨ−基を表し、ここでアシル基は、既述の通りである。
"カルボニル基"は-(C＝O)-又は前に名付けた親置換基の炭素原子に付加した２重結合酸素置換体を表す。
"カルボキシル基"は、-COOH基を表す。
"ハロ"、"ハロゲン化物"又は"ハロゲン"は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基を表す。
"ヒドロキシル基"及び"ヒドロキシ基"は、-OH基を表す。
"オキソ基"は本明細書に既載の化合物を表し、炭素原子が、酸素原子に置き換えられる。
"シアノ基"は、-CN基を表す。
"ニトロ基"は、-NO2基を表す。
"チオ基"は、本明細書に記載の化合物を表し、炭素原子又は酸素原子が、イオウ原子に置き換えられる。
ＩＩ．化合物及び方法
いくつかの実施態様では、本発明は、虚血及び虚血を誘導する腎臓の毒素の急性毒性作用から腎臓を保護することができる。後に腎臓の再生を促進するために、腎障害の前、その間又はその直後に、経口的に利用可能で非毒性である低分子キナーゼ阻害剤が投与される。腎臓の増殖は、腎障害に応答して誘導される。図4A及び図4Bを参照されたい。腎障害を取り巻く期間、一定の循環ネフロトキシンはさらに、細胞周期依存的に腎障害を増加させる。従って、CDK4/6阻害薬の薬理学的使用を通じて、腎上皮細胞を一時的にG1に保持すること（薬理学的静止又はPQ）により、循環ネフロトキシンが除去された後に、腎臓腎修復を可能にすることができる。図5を参照されたい。虚血障害時における一時的PQは、その後の腎臓の回復を強化する。この発見は、増殖している細胞が、外因性毒素に対して非常に敏感であり、従って一時的PQが治療的であるという発見を利用したものといえる。この方法は、腎臓虚血障害の前に、と同時に又はその後（例えば、20時間以内など）に、CDK4/6阻害剤を投与すること（経口又はＩＶ）を含む。このCDK4/6阻害剤は選択的CDK4/6阻害剤であってもよい。腎障害を誘発する条件が逆転されるまで（一般に24〜48時間）、CDK4/6阻害剤の治療レベルを維持することができる。そして、その後、CDK4/6阻害剤を撤回することができ（腎臓で排他的に除去されない化合物を使用する）、腎再生増殖が起こり得る。例えば、低血圧（例えば、心臓バイパス移植）を伴う手術の前、又はヨウ素含有造影剤（腎虚血を誘導する）の使用の前に、PQを誘導することができる。このような傷害の24-48時間後に、ネフロトキシンが除去され及び/又は全身血圧が復元されたされたときに、PQを反転させることができる。
腎臓は通常静止臓器であるが、障害を受けたとき、細胞増殖により回復可能である。腎臓は、特に、血流減少や腎血流を減少させる毒素の結果として、虚血になり易い。虚血障害に続いて、上皮増殖が顕著に増加する。本明細書に示されているように、虚血障害後の増殖を、PQを誘導するCDK4/6阻害剤によって阻害することができる。図4A及び図4Bを参照されたい。障害後12-72時間継続するPQによって、腎障害時に産生される循環ネフロトキシンが除去され、それにより腎臓の回復の促進を可能とする。
Davisらの米国特許第6,369,086号（本明細書では、以後「０８６特許」という。）は、選択的CDK阻害剤は細胞毒性薬剤の毒性を制限する上で重要であり、化学療法誘導性脱毛症から防護するために使用できることを記載する。特に、この０８６特許は、特異的CDK2阻害剤としてオキシインドール化合物を記載する。関係する雑誌文献（Davis et al., Science, 291, 134-137 (2001)）は、CDK2阻害は、細胞周期停止をもたらし、細胞周期活性抗腫瘍薬剤に対する上皮細胞の感受性を減少させ、化学療法誘導性脱毛症を防護することができることを記載するようである。しかし、この雑誌文献は後に結果に再現性がないという理由で撤回された。雑誌論文の撤回により疑問が生じた、噂で言われるこれらの選択的CDK2阻害剤の防護的効果と反対に、いくつかの実施態様では、本発明は、虚血の影響から、腎組織及び/又は細胞のような組織及び/又は細胞を保護すること関係する。
CDK4/6阻害剤の保護効果は、阻害剤による前処理により患者に提供することができる（即ち、虚血の危険が予測されている患者又はその危険のある患者のCDK4/6阻害剤による前処置）。
いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、心臓手術、又は低血圧エピソードに関連するこの他の手術である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、ＣＴスキャン、ピロログラム(ｐｙｌｏｒｏｇｒａｍｓ)又はアルチオグラフィー（ａｒｔｉｏｇｒａｐｈｙ）に使用される造影剤の投与である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こすエピソードは、血流のない腎臓の輸送及び/又は貯蔵中に誘導される冷虚血を伴う、腎臓同種移植片の採取（例えば、死体の腎同種移植片の採取）である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、血液量減少（例えば、出血、脱水等による）及び／又は低血圧の期間に関連する外傷である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、アスピリン、イブプロフェン、タクロリムス及び／又はシクロスポリンのような、但しこれらに限定されない血流（例えば、腎血流）を減少させる薬剤の投与である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、動脈塞栓により又はインサイチュー動脈又は静脈血栓症により引き起こされる急性の組織虚血又は梗塞である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、臓器の血流の軸捻又は他の一時的な解剖学的破壊である。
本明細書では、用語"選択的CDK4/6阻害化合物"とは、CDK4及びCDK6の少なくとも１つを選択的に阻害する化合物、又はその主な作用がCDK4及び／又はCDK6の阻害によるものである化合物を表す。従って、選択的CDK4/6阻害剤は、一般的に、CDK4及び／又はCDK6に対して、他のキナーゼ又は他の酵素に対する５０％阻害濃度（IC50）より低いIC50を有する化合物である。またいくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4及び／又はCDK6に対して、他のCDK（例えば、CDK1及び CDK2）に対する化合物のIC50より、少なくとも2,3,4,5,6,7,8,9又は10倍低いIC50を有することができる。またいくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4及び／又はCDK6に対して、他のCDKに対する化合物のIC50より、少なくとも20,30,40,50,60,70,80,90又は100倍低いIC50を有することができる。またいくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4及び／又はCDK6に対して、他のCDKに対する化合物のIC50より100倍又は1000倍を超えて低いIC50を有することができる。いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害化合物は、CDK4及びCDK6の両者を選択的に阻害する化合物である。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害剤は、天然化合物（例えば、イソフラボン）ではない。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害剤は、１以上のチロシンキナーゼに対して劣る阻害剤である（例えば、＞１μＭ インビトロIC50）。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害剤は、セリン及び/又はトレオニンキナーゼに高度に有効な阻害剤である。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害剤は、ＣＤＫ１阻害剤として劣る（例えば、＞１μＭ インビトロIC50）。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害剤は、ＣＤＫ１に比べてＣＤＫ４又はＣＤＫ６に対して１０倍、５０倍又は１００倍有効な阻害性を持つことを特徴とする。
いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4/6依存性細胞の選択的Ｇ１期停止を誘導する（例えば、細胞をベースとしたin vitro検定で測定されたように）ことができる化合物である。従って、本発明の方法に従い選択的CDK4/6阻害剤を用いて処理した場合、Ｇ１期におけるCDK4/6依存性細胞の割合は増加するが、Ｇ２／Ｍ期及びＳ期のCDK4/6依存性細胞の割合は減少する。いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4/6依存性細胞の、実質的に純粋な（即ち、"きれいな"）Ｇ１細胞周期停止を誘導する化合物である（例えば、選択的CDK4/6阻害剤を用いた処理は、細胞の大部分が、標準的方法（例えば、ヨウ化プロピジウム（PI）染色又は他の方法）で定義されたＧ１期停止するように細胞周期停止を誘導し、Ｇ２／Ｍ期及びＳ期を合わせた周期にある細胞集団が、全細胞集団の中、20%、15%、12%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%又はそれ未満である。）。
非特異的キナーゼ阻害剤である、スタウロスポリンは、いくつかの種類の細胞においてＧ１期停止を間接的に誘導すると報告されているが（Chen et al., J. Nat. Cancer Inst., 92, 1999-2008 (2000)）、選択的CDK4/6阻害剤は、腎上皮細胞のような細胞におけるＧ１細胞周期停止を直接及び選択的に誘導することができ、長期の毒性が少なく、かつ虚血に曝される前に阻害剤を用いた長期にわたる（例えば、４８時間又はより長期）治療の必要無しに、防護を提供することができる。特に、いくつかの非選択的キナーゼ阻害剤が、CDK4タンパク質レベルを低下させることにより、いくつかの種類の細胞においてＧ１期停止を起こすことができるが、本発明の方法の利点は、いかなる理論に束縛されることなく、細胞(例えば、腎細胞)において細胞内濃度を減らすことなく、CDK4/6のキナーゼ活性を直接阻害する、選択的CDK4/6阻害剤の持つ阻害能に少なくとも部分的によると信じられる。
いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害化合物は、実質的にオフターゲット効果（特にCDK4及び／又はCDK6以外のキナーゼの阻害に関係する）がない化合物である。いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害化合物は、CDK4/6以外のCDK（例えば、CDK1 及びCDK2）について阻害剤として劣る（例えば、＞１μＭ IC50）。いくつかの実施態様において、CDK4/6阻害化合物は、選択的CDK4/6非依存性細胞の細胞周期停止を誘導しない。いくつかの実施態様において、選択的CDK4/6阻害化合物は、チロシンキナーゼの阻害剤として劣る（例えば、＞１μＭ IC50）。さらに、好ましくないオフターゲット効果として、長期毒性、抗酸化効果、及びエストロゲン様効果がある、がこれらに制限されない。
抗酸化効果は、当業者に既知の標準的検定で測定することができる。例えば、最早顕著な抗酸化効果を持たない化合物は、酸素ラジカルのような、フリーラジカルを顕著に捕捉しない。化合物の抗酸化効果は、ゲニステインのような、既知の抗酸化活性を持つ化合物と比較することができる。従って、顕著な抗酸化活性を持たない化合物は、ゲニステインに比べると、抗酸化活性が約２，３，５，１０，３０，又は１００倍低い化合物である。エストロゲン様活性もまた、既知の検定により測定することができる。例えば、非エストロゲン様化合物は、エストロゲン受容体と顕著に結合せず、及びこの受容体を活性化しない化合物である。実質的にエストロゲン様効果フリーである化合物は、エストロゲン様活性を持つ化合物、例えば、ゲニステイン、と比較して、エステロゲン様活性が約２，３，５，１０，２０，又は１００倍低い化合物である。
本発明の方法に従って用いることができるCDK4/6阻害剤は、全ての既知の低分子の（例えば、＜１０００ダルトン、＜７５０ダルトン又は＜５００ダルトンより低分子である）CDK4/6阻害剤、又はこれらの医薬的に許容された塩を含む。いくつかの実施態様において、その阻害剤は非天然化合物（即ち、自然界に見出されない化合物）である。いくつかの種類の化学化合物がCDK4/6阻害能を持つとして報告された（例えば、無細胞型検定において）。本発明法において有用な選択的CDK4/6阻害剤は、ピリド[2,3-d]ピリミジン(例えば、ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン、及び2-アミノ-6-シアノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-オン)、トリアミノピリミジン、アリール[a]ピロロ[3,4-d]カルバゾール、窒素含有ヘテロアリール置換尿素、5-ピリミジニルl-2-アミノチアゾール、ベンゾチアジアジン、アクリジンチオン、及びイソキノロンを含むが、これらに制限されない。
いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジンは、ピリド[2,3-d]ピリミジノンである。いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジノンは、ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンである。いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンは、アミノアリール基又はアミノヘテロアリール基により置換される。いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンは、アミノピリジン基により置換される。いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンは、2-(2-ピリジニル)アミノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンである。例えば、このピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン化合物は、その全体が参照文献として取り込まれているBarvianらの米国特許公開2007/0179118に記載の化学式（ＩＩ）の構造であってもよい。いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジン化合物は、6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド-[2,3-d]-ピリミジン-7-オン（即ち、PD 0332991）又はこの医薬的に許容可能な塩である（Toogood et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 2388-2406）。
いくつかの実施態様において、このピリド[2,3-d]ピリミジノンは、2-アミノ-6-シアノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-オンである。2-アミノ-6-シアノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-オンを含む選択的CDK4/6阻害剤は、例えば、Tu等により開示されている（Tu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3578-3581）。
本明細書の"トリアミノピリミジン"は、ピリミジン環の少なくとも３個の炭素が、化学式-NR1R2を持つ置換基で置き換えられているピリミジン化合物であり、ここでR1及びR2は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基、複素環、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立に選択される。各R1及びR2のアルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基、複素環、アリール基、及びヘテロアリール基は、さらに１以上の水酸基、ハロ基、アミノ基、アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基、複素環式基、アリール基、又はヘテロアリール基により置換されてもよい。いくつかの実施態様において、アミノ基の少なくとも１個は、構造-NHRを持つアルキルアミノ基であり、ここでRは、C1〜C6アルキル基である。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのアミノ基は、化学式-NHRを持つシクロアルキルアミノ基、又は水酸基により置換されたシクロアルキルアミノ基であり、ここでＲは、水酸基により置換された、又は非置換の、C3〜C7シクロアルキル基である。いくつかの実施態様において、少なくとも１個のアミノ基は、ヘテロアリール基−置換アミノアルキル基であり、ここでヘテロアリール基は、さらに、アリール基置換体により置換されてもよい。
アリール[a]ピロロ[3,4-d]カルバゾールは、ナフチル[a]ピロロ[3,4-c]カルバゾール、インドロ[a]ピロロ[3,4-c]カルバゾール、キノリニル[a]ピロロ[3,4-c]カルバゾール及びイソキノリニル[a]ピロロ[3,4-c]カルバゾールを含むが、これらに制限されない（Engler et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 2261-2267; Sanchez-Martinez et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 3835-3839; Sanchez-Martinez et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 3841-3846; Zhu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 1231-1235; 及びZhu et al., J. Med Chem., 2003, 46, 2027-2030）。適切な、アリール[a]ピロロ[3,4-d]カルバゾールはまた、米国特許公開2003/0229026及び2004/0048915に開示されている。
含窒素ヘテロアリール置換尿素は、尿素の窒素原子の１個が、含窒素ヘテロアリール基により置換されている、尿素部分を含む化合物である。含窒素ヘテロアリール基は、少なくとも１個の窒素原子を含む５から１０員のアリール基を含むが、これらに制限されない。従って、含窒素ヘテロアリール基は、例えば、ピリジン、ピロール、インドール、カルバゾール、イミダゾール、チアゾール、イソクサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、ピラジン、トリアゾール、テトラゾール、ピリミジン、ピリダジン、プリン、キノリン、イソキノリン、キノクサリン、シンノリン、キナゾリン、ベンズイミダゾール、フタリミド、等々を含む。いくつかの実施態様において、この含窒素ヘテロアリール基は、１個以上のアルキル基、シクロアルキル基、複素環式基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヒドロキシル基、ハロ基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、シアノ基、アルコキシル基、又はアミノ基により置換されてもよい。いくつかの実施態様において、含窒素ヘテロアリール置換尿素は、ピラゾール-3-イル尿素である。ピラゾールはさらに、シクロアルキル基又は複素環式基により置換されてもよい。
いくつかの実施態様において、このピラゾール-3-イル尿素は：
Figure 2013545758
 である（Ikuta, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 27548-27554）。本発明に従い使用することができる更なる尿素としては、米国特許公開2007/0027147に記載された化学式（Ｉ）のビアリール尿素化合物である。また、Honma et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 4615-4627; 及び Honma et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 4628-4640を参照されたい。
適切な5-ピリミジニル-2-アミノチアゾールCDK4/6阻害剤は、Shimamura等により開示されている（Shimamura et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3751-3754）。いくつかの実施態様において、この5-ピリミジニル2-アミノチアゾールは：
Figure 2013545758
 の構造を有する。
有用なベンゾチアジアジン及びアクリジンチオン化合物は、例えば、Kubo等により開示された化合物を含む（Kubo et al., Clin. Cancer Res. 1999, 5, 4279-4286 及びその全体が参考文献に取り込まれている米国特許公開2004/0006074）。いくつかの実施態様において、このベンゾチアジアジンは、１個以上のハロ基、ハロアリール基、又はアルキル基により置換される。いくつかの実施態様において、このベンゾチアジアジンは、4-(4-フルオロベンジルアミノ)-1,2,3-ベンゾチアジアジン-1,1-ジオキシド、3-クロロ-4-メチル-4H-ベンゾ[e][1,2,4]チアジアジン1,1-ジオキシド、及び3-クロロ-4-エチル-4H-ベンゾ[e][1,2,4]チアジアジン-1,1-ジオキシドからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、このアクリジンチオンは、１個以上のアミノ基又はアルコキシ基により置換される。いくつかの実施態様において、このアクリジンチオンは、3-アミノ-10H-アクリドン-9-チオン (3ATA)、9(10H)-アクリジンチオン、1,4-ジメトキシ-10H-アクリジン-9-チオン、及び2,2'-ジフェニルジアミン-bis-[N,N'-[3-アミド-N-メチルアミノ]-10H-アクリジン-9-チオン]]からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、本発明の方法の対象は、虚血に曝されたことがある、虚血に曝されている、又は虚血に曝されることが予測されている患者である。
一般に、CDK4/6阻害化合物は、虚血に曝される２４〜２０時間前から虚血に曝された２４〜４８時間後までの間に患者に投与することができる。しかし、望むのであれば、この時間を、虚血に曝される２４時間以前にまで拡大してもよい。さらに、後の投与が少なくともある程度の防護効果をもたらす限り、この時間を、虚血に曝された後２４時間以上から４８時間以上へ拡大してもよい。
いくつかの実施態様では、CDK4/6阻害剤を虚血前に患者に投与して、血漿中のCDK4/6阻害剤レベルを、虚血時に最大にすることができる。
望むのであれば、CDK4/6阻害剤の多数回投与を患者に行うことができる。あるいは、患者は、単回のCDK4/6投与を受けることができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、CDK4/6阻害剤（例えば、選択的CDK4/6阻害剤）の、虚血障害及び/又はこれに関連する事象から細胞や組織を保護する能力に関する。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の細胞又は組織が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前又は後に、この細胞又は組織における虚血及び／又はこれに関連する事象による障害を軽減する方法であって、この患者に、薬学的有効量の、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害する化合物を投与する段階から成る方法を提供する。この細胞又は組織は、例えば、腎臓、腸、心臓、肝臓、脳、甲状腺、皮膚、腸粘膜、聴覚系、肺、膀胱、卵巣、子宮、精巣、副腎、胆嚢、膵臓、膵島、胃、血管、又は筋肉の細胞若しくは組織である。いくつかの実施態様において、この細胞又は組織は、障害後CDK4/6に依存して増殖することによって特徴付けられ、いくつかの実施態様では、この障害は虚血に関連する。いくつかの実施態様において、この細胞又は組織は、腎臓（即ち、腎）細胞又は組織である。
患者が虚血又はこれに関連する事象に曝される前、曝されている間、又は曝された後のいずれの時においても、CDK4/6阻害剤を投与してもよい。いくつかの実施態様では、このCDK4/6阻害剤は、虚血又はこれに関連する事象に曝された後約24〜約48時間の間（例えば、24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47又は48時間）に患者に投与される。いくつかの実施態様では、このCDK4/6阻害剤は、虚血又はこれに関連する事象に曝される前（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間前）に患者に投与される。
いくつかの実施態様では、このCDK4/6阻害剤は選択的CDK4/6阻害剤である。
いくつかの実施態様では、この選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4及び／又はCDK6に対して、他のCDKに対するこの化合物のIC50より、少なくとも2,5,10,100又は1000倍低いIC50を有する。いくつかの実施態様では、この選択的CDK4/6阻害剤は、CDK4及び／又はCDK6以外のサイクリン依存性キナーゼ（例えば、CDK1）に対して劣る阻害剤である（例えば、IC50＞1μM）。
いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、心臓手術（例えば、バイパス手術）、又は低血圧エピソードに関連するこの他の手術である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こすエピソードは、血流のない腎臓の輸送及び/又は貯蔵中に誘導される冷虚血を伴う、腎臓同種移植片の採取（例えば、死体の腎同種移植片の採取）である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、造影剤の投与である。いくつかの実施態様では、この造影剤は、ＣＴスキャン、ピロログラム(ｐｙｌｏｒｏｇｒａｍｓ)又はアルチオグラフィー（ａｒｔｉｏｇｒａｐｈｙ）に使用される。いくつかの実施態様では、この造影剤はヨウ素含有造影剤である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、血液量減少（例えば、出血、脱水等による）及び／又は低血圧の期間に関連する外傷である。
いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、アスピリン、イブプロフェン、タクロリムス及び／又はシクロスポリンのような、但しこれらに限定されない血流（例えば、腎血流）を減少させる薬剤の投与である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、動脈塞栓により又はインサイチュー動脈又は静脈血栓症により、但しこれらに限定されない、引き起こされる急性の組織虚血又は梗塞である。いくつかの実施態様では、虚血を引き起こす事象は、臓器の血流の軸捻又は他の一時的な解剖学的破壊である。
III.活性化合物、塩、及び処方物
用語"活性化合物"は、CDK4/6阻害化合物、そのプロドラッグ（例えば、インビボ又はインビトロでCDK4/6阻害剤を形成することができる他の誘導体、但しこれらに限定されない）、その溶媒和物（例えば、水和物、但しこれに限定されない）及び/又はこれらの医薬的に許容された塩に関する。いくつかの実施態様では、この"活性化合物"は、選択的CDK4/6阻害化合物、そのプロドラッグ、その溶媒和物及び/又はこれらの医薬的に許容された塩である。活性化合物を、いかなる適切な方法でも患者に投与することができる。投与された活性化合物の量及びタイミングは、勿論、治療される患者、患者が曝されている、曝された、又は曝されると予想される虚血及び/又はこれに関連する事象の性質、投与の方法、活性化合物の薬物動力学的特徴、及び処方する医師の判断に依存する。従って、患者が多様なので、以下の投与量は、ガイドラインであり、及び医師が患者に対して適切と考える治療するために、医師は化合物の投与量を徐々に増量することができる。望ましい治療を考えて、医師は、年齢、患者の体重、既往症の存在、及び他の疾患の存在のような様々な因子をバランスすることができる。医薬処方物は、以下により詳細に考察するように、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は噴霧剤投与を含むが、これらに制限されない、いかなる投与ルートに対しても調製することができる。いくつかの実施態様において、この処方物は、移植レシピエントへの移植を意図された臓器（例えば、腎臓）又は組織のためのex vivoの保存溶液として調製することができる。
この使用が本明細書の態様の範囲内である、特定の活性化合物の治療上有効な投与量は、化合物から化合物、患者によって幾らか異なってもよく、患者の状態及び投与経路により異なってもよい。一般的提案として、約０．１から約２００ｍｇ／ｋｇの投与量は、治療上の有効性を持ち、ここで全ての重さは、活性化合物の重さに基づいて計算され、塩を用いる場合を含む。幾つかの態様において、投与量は、活性化合物の血清濃度が約１及び５μＭの間まで、又はより高い濃度を提供するに必要な化合物の量であってもよい。より高い濃度における毒性が心配ならば、静脈内投与量を、約１０ｍｇ／ｋｇまでのような、より低レベルに制限してもよく、ここで全ての重さは、活性化合物の重さに基づいて計算され、塩を用いる場合を含む。経口投与の場合、約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量を用いることができる。一般的に、約０．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでの投与量を筋肉内注射に用いることができる。幾つかの態様において、投与量は約１μｍｏｌ／ｋｇから約５０μｍｏｌ／ｋｇであってもよく、又は、任意に、静脈内又は経口投与に対して、約２２μｍｏｌ／ｋｇ及び約３３μｍｏｌ／ｋｇであってもよい。
本発明の方法に従い、本明細書に記載した医薬的に活性な化合物を、固体又は液体として経口的に、又は溶液、懸濁物又は乳濁液として、筋肉内、静脈内、又は吸入により投与することができる。幾つかの態様において、この化合物又は塩を、リポソーム懸濁液として、吸入、静脈内、又は筋肉内に投与することができる。吸入を通して投与する際、この活性化合物又は塩は、約０．５から約５μｍの、任意に約１から約２μｍまでの粒子サイズを持つ、複数の固体粒子又はドロップ状であってもよい。
医薬処方物は、全ての医薬的に許容された担体中の、本明細書に記載した活性化合物又はこの化合物の医薬的に許容された塩を含むことができる。溶液を望む場合、水溶性の化合物又は塩に関しては、水が選択される担体である。水溶性の化合物又は塩に関して、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、又はこれらの混合物のような有機媒体が適切である。後者の場合、有機媒体は、かなりの量の水を含むことができる。どちらの場合の溶液も、当業者が既知の適切な処方で滅菌することができて、及び一般的には０．２２μｍフィルターを通す。滅菌の後、この溶液を、ピロゲンを除いたガラスバイアルのような、適切な容器に分配することができる。この分配を、任意に無菌的方法で行うことができる。滅菌的密封をガラスバイアルに施し、必要なら、バイアルの内容物を凍結乾燥することができる。
活性化合物又はその塩に加えて、医薬処方物は、ｐＨ調節添加物のような、他の添加物を含むことができる。特に、有用なｐＨ調節試薬は、塩酸のような酸、塩基、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はグルコン酸ナトリウムのような緩衝剤を含む。さらに、この処方物は、抗菌保存剤を含むことができる。有用な抗菌保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、及びベンジルアルコールがある。抗菌保存剤は、一般的に、処方物が、複数回投与使用のためにデザインされたバイアルに置かれる際に用いられる。本明細書に記載した医薬処方物は、当業者に既知の方法で、凍結乾燥できる。
経口投与のために、医薬組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末等々の形をとることができる。クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムのような様々な賦形剤を含む錠剤が、ポリビニルピロリドン、砂糖、ゼラチン、及びアカシアのような結合剤と共に、澱粉、（例えば、ジャガイモ、又はタピオカ澱粉）及びある種の複合ケイ酸塩のような錠剤分解物質と共に用いられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及び滑石のような潤滑剤が錠剤作成目的に非常に有用である。同様の種類の固体組成物がまた、硬軟に調合したジェラチンカプセルの充填物として用いられる。これに関連する材料としてまた、ラクトース又はミルク砂糖及び高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。経口投与のために、水性の懸濁物及び／又はエリクシルを好む場合、本発明の化合物を様々な甘味料、芳香剤、着色剤、乳化剤、及び／又は懸濁化剤、及び水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びこれらの類似の組合せのような稀釈剤と組み合わせることができる。
本明細書に記載した発明の他の態様において、本明細書で記載した活性化合物、又はこの塩を、密閉した容器内に単位投与量の形で含む、注射可能な、安定な、滅菌した処方物を提供する。この化合物又は塩は、適切な医薬的に許容可能な担体とともに再構成し、患者へのこの化合物の注射に適した液体処方物を作成することができる、凍結乾燥物の形で提供される。この化合物又は塩が、実質的に非水溶性の場合、医薬的に許容された、充分量の乳化剤を充分量使って、水溶性担体中の化合物又は塩を乳化することができる。特に有用な乳化剤は、ホスファチジルコリン及びレシチンである。
本明細書で提供された他の態様は、本明細書に開示した活性化合物のリポソーム処方物を含む。リポソーム懸濁液の作成法は、当業者に既知である。化合物が水溶性の塩である時、従来のリポソーム技術を用いて、脂質小胞にこの化合物を取り込むことができる。このような例として、活性化合物が水に溶解度があるので、活性化合物は実質的に親水性中心又はリポソームのコアに取り込まれる。用いられる脂質層は、全ての従来の組成であることができて、及びコレステロールを含むことができるか、又はコレステロールフリーであってもよい。当該の活性化合物が、水に不溶な場合、再び従来のリポソーム作成技術を用いて、塩を、リポソームの構造をとる実質的に疎水性脂質２重層に取り込むことができる。どちらの場合も標準的超音波処理及び均一化技術を用いて、作成するリポソームはサイズを小さくできる。本明細書に開示した活性化合物を含むリポソーム処方物を、凍結乾燥して、凍結乾燥物とさせ、水のような医薬的に許容された担体を用いて再構成して、リポソーム懸濁物を再構成することができる。
吸入による噴霧物としての投与に適した医薬処方物がまた提供される。これらの処方物は、本明細書に記載した所望の化合物又はこの塩の溶液又は懸濁液、又はこの化合物又は塩の複数の固体粒子を含む。所望の処方物を小チャンバーに入れて噴霧化する。噴霧化は、圧縮空気又は超音波エネルギーにより行い、この化合物又は塩を含む複数の液滴又は固体粒子を形成することができる。この液滴又は固体粒子は、約０．５から約１０μｍ、任意に約０．５から約５μｍの粒子サイズの範囲に有るべきである。この固体粒子は、微粉化のような、当業者に既知のいかなる適切な方法によってでも、固体化合物又はこの塩を加工して得ることができる。任意に、固体粒子又は液滴のサイズは、約１μｍから約２μｍであってもよい。この点に関して、この目的を達成するために市販の噴霧器を用いることができる。この化合物を、その開示全体が本明細書の参考文献に取り込まれている米国特許第5,628,984号に示された方法で、吸入できる粒子の煙霧状の懸濁物を通して投与してもよい。
投与に適した煙霧剤としての医薬処方物が液体状の場合、この処方物は、水を含む担体中の水溶性活性化合物を含むことができる。処方物の表面張力を充分低下させ、噴霧器で使われた時、所定のサイズ範囲内の液滴を作ることができる、界面活性剤は存在してもよい。
指摘したように、水溶性及び非水溶性活性化合物が提供される。本明細書で用いるように、用語"水溶性"は、約５０ｍｇ／ｍＬより多量に水に可溶な全ての組成物を定義することを意味する。また、本明細書で用いるように、用語"非水溶性"は、約２０ｍｇ／ｍＬ未満の水への溶解度を持つ全ての組成物を定義することを意味する。幾つかの態様において、水溶性化合物又は塩は、好ましいが、他の態様において、非水溶性化合物又は塩は同様に好ましい。
本明細書の用語"医薬的に許容される塩"は、充分な医学的判定の範囲で、過度な毒性、炎症、アレルギー反応、等々無しに、患者（例えば、ヒト患者）と接触した使用に適し、合理的な利点／危険性比と釣り合い、意図した使用に有効であり、さらに本発明の化合物のできたら両性イオンの型である塩を表す。
従って、用語"塩"は、本発明の化合物の相対的に非毒性の、無機酸及び有機酸の付加塩を表す。これらの塩を、化合物の最終的分離と精製の間in situで製造することができる、又は塩基フリーの形に精製した化合物を適切な有機酸又は無機酸と別々に反応させ、及びこのように作成した塩を単離して製造してもよい。本発明の化合物が塩基性化合物である限り、様々な無機酸及び有機酸と反応して広く様々な異なる塩を形成してもよい。このような塩は、動物に投与するためには、医薬的に許可されなければならないが、実際上、最初、反応混合物から塩基性化合物を医薬的に許可されない塩として分離し、その後アルカリ性試薬との処理で、フリー塩基化合物に変換し、その後、このフリー塩基を医薬的に許可される酸付加塩に変換することがしばしば望ましい。塩基性化合物の酸付加塩は、従来の方法で塩を作成するために、フリー塩基型を十分量の所定の酸と接触させて調製する。このフリー塩基型は、塩型を塩基と接触させ、フリー塩基を従来の方法で単離して、産生できる。このフリー塩基型は、夫々の塩型と、極性溶媒への溶解度のようなある種の物理的特徴において幾らか異なるが、他の点で、本発明の目的のために、塩は夫々のフリー塩基と等価である。
医薬的に許可される塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土金属水酸化物のような金属又はアミンと共に、又は有機アミンの形で作成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、等々を含む、がこれらに制限されない。適切なアミンの例として、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン及びプロカインが含まれる、がこれらに制限されない。
酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法で塩を作成するために、フリー酸型を十分な量の所定の塩基と接触させて調製する。フリー酸型は、塩型を酸と接触させ、及び従来の方法でフリー酸を単離して産生してもよい。フリー酸型は、それぞれの塩型と、極性溶媒への溶解度のようなある種の物理的特徴において幾らか異なるが、他の点で、本発明の目的のために、塩は夫々のフリー酸と等価である。
塩を、塩化水素の、硝酸の、リン酸の、硫酸の、臭化水素の、ヨウ化水素の、リン酸の、等々のような、無機酸硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸１水素塩、リン酸２水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物から作成してもよい。代表的塩としては、臭化水素塩、塩化水素塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩メシラート、グルコヘプタン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩及びイセチオン酸塩、等々を含む。塩はまた、脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸、他、等々のような有機酸から作成される。代表的塩としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソブチル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、等々を含む。医薬的に許容される塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、等々のような、アルカリ及びアルカリ土金属をベースとしたカチオン、及び非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等々を含む、がこれらに制限されない、アミンカチオンを含むことができる。アルギニン塩、グルコン酸塩、ガラクツロン酸塩等々のアミノ酸塩もまた検討される。参考文献に取り込まれている、Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19を参照されたい。
以下の実施例は、例証となる実施形態を提供するものであり、如何なる方法によっても本願発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明及び当業者の一般的レベルを考えて、以下の実施例は例証のみを意図しており、当業者は、本発明の範囲から離れることなく、無数の変更、修正、及び変更を行うことができることを理解することができる。
本願発明の実施は、特記しない限り、タンパク質化学、生化学、ＤＮＡ組み換え技術及び薬理の分野における技術の範囲内の通常の方法を用いる。このような技術は多くの文献に完全に開示されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current edition); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutial Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B (1992)を参照されたい。PCT公開番号WO 2010/051127、WO 2010/039997、及びWO2010/132725もまた本明細書にその全体が取り込まれる。
実施例１
PDの合成
Figure 2013545758
反応機構１：ＰＤ合成
ＰＤを、反応機構１（化３）に示すように合成した。反応機構１（化３）に示す反応は、化合物Ｄの化合物Ｅへの変換、及び化合物Ｆの化合物Ｇへの変換反応を除いて、一般的に以前に報告された経路に従う（VandelWel et al., J. Med Chem., 48, 2371-2387 (2005); and Toogood et al., J. Med. Chem., 48, 2388-2406 (2005)）。
化合物Ｄの化合物Ｅへの変換：
Figure 2013545758
 化合物Ｄ（40g、169mmol）を無水THF（800mL）に窒素下で溶かし、及びこの溶液を氷槽で冷却し、ここにMeMgBrをゆっくり加え（エーテル中３Ｍ、160mL、480mmol）及び１時間攪拌した。水とEtOAcに分配する飽和NH4Cl水溶液を加えて反応を休止した。有機層を分離し、及び水層をEtOAcで抽出した。混合した有機層を塩水で洗浄し、MgSO4上で乾燥した。濃縮して中間産物をオイルとして得た（41.9g,98%）。
上記中間産物（40g、158mmol）を乾燥CHCl3（700mL）に溶かした。MnO2（96g、1.11mol）を加え、混合物を１８時間攪拌しつつ加熱乾留し、再度のMnO2（34g、395mmol）を加え、４時間乾留を続けた。Celiteパッドを通して濾過し、固体をCHCl3で洗浄した。濾過物を濃縮し、黄色固体化合物Ｅ（35g、88%）、Ｍｐ:75.8〜76.6℃。
化合物Ｆの化合物Ｇへの変換
Figure 2013545758
 化合物Ｆ（5g、18.2mmol）を無水DMF（150mL）に溶かし、及びNBS（11.3g、63.6mmol）を加えた。反応混合物を３．５時間、室温で攪拌し、H2O(500mL）に注ぎ、沈殿物を濾過し、H2Oで洗浄した。固体をEtOHから再結晶化し、化合物Ｇを白色固体（5.42g、80.7%）として得た。ｍｐ：210.6〜211.3℃。
PDの特徴付けデータ
LC-MS: 448.5 (ESI, M+H). 純度: 〜99%
1H NMR(300MHz, D2O): 9.00(s, 1H), 8.12 (dd, J = 9.3 Hz, 2.1Hz, 1H), 7.81(d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.46(d, J = 9.6Hz, 1H), 5.80-5.74 (m, 1H), 3.57-3.48(m, 8H), 2.48(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.13-1.94(m, 6H), 1.73-1.71(m, 2H).
13C NMR (75MHz, D2O): 203.6, 159.0, 153.5, 153.3, 152.2, 139.9, 139.4, 139.2, 133.1, 129.0, 118.7, 113.8, 107.4, 51.8, 42.2, 40.0, 28.0, 25.2, 22.6, 10.8.
実施例２
CDK4/6阻害による非血液組織及び細胞の保護
PD0332991のような有効で選択的なCDK4/6阻害剤は、一次正常ヒト腎近位上皮細胞にG1休止を誘導する。図１Ａと１Ｂを参照されたい。投与量が増えると共に、細胞周期のG0/G1期部分が増加し、G2/M期及びS期部分が減少することが観察される。こうすることによって、この細胞は薬理学的静止に入り、この静止から解放されるまでこの状態に保たれる。
一次正常ヒト腎近位上皮細胞は培養され、24時間後に0、10nM、30nM、100nM、300nM又は1μMの濃度のPD0332991に曝露される。この処理を16時間行った後、細胞を一般的方法により回収し、DNA染色までの間氷冷メタノール中に固定した。この細胞サンプルをプロセスし、そのDNAをヨウ化プロピジウム（PI）溶液で染色し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメーターのFCSファイルをVerity (Verity Software House, Topsham, Maine, USA)の細胞周期分析用ソフトウェアMod-Fit(R)を用いて分析した。これは、細胞周期部分を全細胞数に対する割合(%)で表示する。
CDK4/6阻害は、一次正常ヒト腎近位上皮細胞の増殖を阻害する。この細胞を９６ウェルのプレートに蒔種し、37℃及び5% CO2の加湿インキュベーターで24時間インキュベートした。24時間後に、この細胞を広範囲の投与量の有効で選択的なCDK4/6阻害剤（PD0332991）に曝露した。PD0332991の投与量は0、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μMであった。この曝露の72時間後に、CDK4/6阻害細胞を、製造者の仕様に従ってCellTiter-Glo(R) (Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA)で処理した。照度計でこのプレートを１秒／ウェルで読んだ。結果をMicrosoft Excel(R)で処理した。この阻害剤で72時間処理すると、対照(DMSO)に比べて、細胞増殖の阻害が投与量に依存するという結果が得られた（図２）。この結果は、図１Ａと１Ｂの結果と合わせると、非血液細胞はCDK4/6に依存して薬理学的静止に入り、増殖が抑制されることを示している。
実施例３
PD0332991によるマウスの治療、虚血再潅流障害（IRI）及びBrdUの腎上皮細胞への取り込み
化合物：実施例１の記載と同様にしてPD0332991を合成した。
薬物の調製と投与：PD0332991を最終濃度が15 mg/mlとなるように50mM乳酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）に溶解した。虚血再潅流手術の1時間前に、強制経口投与によりマウスに150 mg/kgのPD0332991又はビヒクルを投与した。
投薬スケジュール：図３Ａに示すようにIRI前にPD0332991又はビヒクル（乳酸ナトリウム緩衝液）を１度投与し、及び図３Ｂに示すようにPD0332991又はビヒクルを２度投与し（IRI前に１度及びIRI後に１度）、IRI後に腎細胞増殖をモニターした（腎上皮細胞におけるBrdUの取り込みに基づく）。IRIの21時間後、又はIRIの21時間後及び45時間後に、BrdU（100 mg/kg体重）を腹腔内注射した。最終BrdU投与の3時間後にこのマウスを屠殺した。BrdU陽性（BrdU（+））細胞を拡大して腎臓上皮細胞におけるBrdU（+）細胞の数を視覚的に数えて定量した。
両虚血再潅流障害：8週齢の雄マウスを、手術前に、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した（60 mg/kg体重、腹腔内）。この処置の間、体温を36.5℃〜37.5℃に制御した。腹膜まで両脇腹を切開して、両方の腎臓への接近を可能にした。腎臓が露出され、同時に非外傷微細動脈瘤クランプ（Roboz、Rockville、MD）を用いて両方の腎臓の腎茎を締め付けたので、虚血を誘発した。締め付けられた腎臓を28分間腹腔に戻し入れ、その後クランプを除去したので、再潅流傷害が起きた。脇腹切開を創傷クリップで閉じ、マウスを自分のホームケージで回復させた。
まとめ：IRIを受け、図３Ａに示す投薬スケジュールに従ってPD0332991を１度投与された腎臓は、IRIの24時間後にビヒクルで処置したマウスの腎臓よりも、顕著に低いBrdU（+）細胞数を示した（図４Ａ）。PD0332991を2度投与されたマウスもまた、IRIの48時間後にビヒクルで処置したマウスよりも、低いBrdUの取り込みを示した（図４Ｂ）。IRIを受けないマウスの腎臓細胞のBrdUの取り込みは低い（図４Ａ及び図４Ｂ）。
実施例４
PD0332991によるマウスの治療、バイラテラルIRI、血清クレアチニン測定
化合物：実施例１の記載と同様にしてPD0332991を合成した。
薬物の調製と投与：PD0332991を最終濃度が15 mg/mlとなるように50mM乳酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）に溶解した。虚血再潅流手術の1時間前に、強制経口投与によりマウスに150 mg/kgのPD0332991又はビヒクルを投与した。
両虚血再潅流障害：8週齢の雄マウスを、手術前に、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した（60 mg/kg体重、腹腔内）。この処置の間、体温を36.5℃〜37.5℃に制御した。腹膜まで両脇腹を切開して、両方の腎臓への接近を可能にした。腎臓が露出され、同時に非外傷微細動脈瘤クランプ（Roboz、Rockville、MD）を用いて両方の腎臓の腎茎を締め付けたので、虚血を誘発した。締め付けられた腎臓を28分間腹腔に戻し入れ、その後クランプを除去したので、再潅流傷害が起きた。脇腹切開を創傷クリップで閉じ、マウスを自分のホームケージで回復させた。
血清クレアチニン測定：手術の24時間後に、尾静脈血液をヘパリン処理されたマイクロヘマトクリット毛細管(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, Cat. #22-362-566)に集め、毎分5000回転（RPM）で15分間遠心分離した。上清を血清として保持した。血清クレアチニンを、10mMのホウ酸ナトリウム、240mMの水酸化ナトリウム及び10mMのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する緩衝液と混合した10mMのピクリン酸溶液を利用して、ベックマンクレアチニン分析装置2により測定した。血清クレアチニンはクレアチニン標準に対して測定され、デシリットル当たりミリグラムとして記録される。
まとめ：両側性虚血性再潅流傷害の1時間前に、マウスを50mM乳酸ナトリウム緩衝液又は150mg/kgのPD0332991を投与した。手術の24時間後に、尾静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管マイクロチューブに血液を回収した。回収した血液から血清を抽出し、血清クレアチニン測定を、ベックマンクレアチニン分析装置2により製造者の指示に従って測定した。ビヒクルの投与を受けた8匹のマウスの平均血清クレアチニンの測定値は2.27mg/dL±0.0732であり、PD0332991の投与を受けた9匹のマウスの平均血清クレアチニンの測定値は1.74mg/dL±0.143であった。薬物投与群とビヒクル治療群との対応のないt-検定による比較の結果、p値が0.0062の有意差があった。基準の血清クレアチニンも手術の7日前に測定してあり、ビヒクル投与群と薬物投与群の血清クレアチニンは、それぞれ、0.050 mg/dLと0.044 mg/dLの同様の平均レベルであった（図5）。
なお、本発明の様々な詳細は本発明の範囲から逸脱することなく変更できることが理解されるであろう。なお、上記の説明は、発明の例証の目的のためのものであって、発明を限定する目的のためのものではない。

Claims (13)

  1. 治療を必要とする患者の細胞又は組織が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前又は後に、この細胞又は組織における虚血及び／又はこれに関連する事象による障害を軽減する方法であって、この細胞又は組織が障害後にＣＤＫ４／６に依存して増殖することにより特徴付けられ、この患者に、薬学的有効量の、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害する化合物を投与する段階から成る方法。
  2. 治療を必要とする患者の腎細胞又は腎組織が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前又は後に、この細胞又は組織における虚血及び／又はこれに関連する事象による障害を軽減する方法であって、この患者に、薬学的有効量の、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害する化合物を投与する段階から成る方法。
  3. 前記ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物が、患者が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝される前に、と同時に又はその後に、患者に投与される請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物が、患者が虚血及び／又はこれに関連する事象に曝された後、２４〜４８時間の間に患者に投与される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を阻害する化合物が、選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記選択的ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６以外のサイクリン依存性キナーゼの不十分な阻害剤である請求項５に記載の方法。
  7. 虚血を引き起こす事象が、心臓手術、又は低血圧エピソードに関連するこの他の手術である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 虚血を引き起こす事象が、ＣＴスキャン、ピロログラム(ｐｙｌｏｒｏｇｒａｍｓ)又はアルチオグラフィー（ａｒｔｉｏｇｒａｐｈｙ）に使用される造影剤の投与である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 虚血を引き起こす事象が、血液量減少及び／又は低血圧の期間に関連する外傷である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 虚血を引き起こす事象が、アスピリン、イブプロフェン、タクロリムス及び／又はシクロスポリンなどの腎血流を減少させる薬剤の投与である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 虚血を引き起こす事象が、動脈塞栓により又はインサイチュー動脈又は静脈血栓症により引き起こされる急性の組織虚血又は梗塞である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  12. 虚血を引き起こす事象が、臓器の血流の軸捻又は他の一時的な解剖学的破壊である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  13. 虚血を引き起こす事象が、腎臓移植レシピエントにおける移植前の腎臓の採取及び／又は輸送である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
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