JP2013542190A - 乳癌治療剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、患者の癌を治療又は予防する方法であり、患者に治療有効量のRANKL阻害剤を投与することを含む方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌治療分野に関連する。
ELLIS et al., Breast Cancer Research and Treatment, 118 (1) (2009): 81-87は、抗癌剤としてアロマターゼ阻害剤を用いる乳癌治療の過程で、乳癌患者の骨ミネラル密度を増大させるために、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂを投与することを記載している。
TOMETSKO et al., Bone, 47 (2010): 325-326は、骨転移におけるＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬの役割に関する。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の活性の重要なメディエーターと考えられているが、腫瘍の増殖も強力に促進する。幾つかの乳癌及び前立腺癌の細胞株もＲＡＮＫを発現することが開示されており、そのため、これらの癌は骨転移を引き起こす性質を有する。
CANON et al., Bone, 40 (6) (2007):145, CANON et al., Europ. J. of Cancer, 4 (12) (2006): 166-167, CANON et al., Cancer Treatment Reviews, 34 (2008): 60,及びTOMETSKO et al., J. Bone and Mineral Res., 21 (2006): 346 (Abstract)は、骨転移した癌の腫瘍増殖を治療するために、ＲＡＮＫＬ阻害剤のＯＰＧを使用することを開示している。
HOLLAND et al., Cancer Biology and Therapy, 9 (7) (2010): 539-550は、骨転移した乳癌の治療における、ＲＡＮＫＬ阻害剤（ＲＡＮＫ−Ｆｃ）単独又はアポトーシス誘導リガンド(ｒｈＡｐｏ２Ｌ)との組み合わせ投与の比較を含んでいる。
AKIYAMA et al., J. Pharmacy and Pharmacology, 62 (4) (2010): 470-476は、骨肉腫の治療における、ＲＡＮＫ−Ｆｃの投与に関する。
ZHANG et al., J. Clin. Invest., 107 (10) (2001): 1235-1244は、インビトロでの骨転移性前立腺癌細胞に関する。
LEE et al., Bone, 48 (1) (2010): 88-95は、前立腺癌の骨転移に関する。当該文献は、転移性前立腺癌の効果を調査する様々な医薬剤及び研究をまとめている。
LEIBBRANDT et al., Europ. J. of Clin. Invest., 39 (10) (2009): 842-850は、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ及びＯＰＧの破骨細胞及び骨芽細胞における役割、並びに骨転移形成への破骨細胞及び骨芽細胞の関与について論じている。
WO 99/53942は、心臓血管疾患の治療におけるＯＰＧの使用を開示している。
WU et al., J. Bone and Mineral Res., 20 (1) (2005): 107-116は、破骨細胞のＦａｓ介在アポトーシスの制御因子としてのＲＡＮＫＬを開示している。
BHARTI et al., Apoptosis, 9 (6) (2004): 677-690は、破骨細胞前駆細胞のアポトーシスにおけるＲＡＮＫＬの役割に関する。
MOLYNEUX et al., J. Clin. Invest., 120 (9) (2010): 3310-3325は、骨腫瘍抑制遺伝子としてのPrkar1aの研究に関し、当該遺伝子は、骨肉腫の腫瘍形成の過程でＲＡＮＫＬの過剰発現を誘導できる。
PARK et al., J. Korean Med. Sci., 18 (4) (2003): 541-546は、乳癌の骨転移におけるＯＰＧ及びＲＡＮＫＬの役割を論じている。
本発明の目的は、この欠点に煩わされない代替的な抗癌治療剤を提供することである。
ＮＦ−κＢリガンドの受容体活性化因子(ＲＡＮＫＬ、あるいはＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥ、ＯＰＧＬ、ＴＮＦＳＦ１１)及びその受容体ＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）は、破骨細胞の発達及び活性化に必須である。ＲＡＮＫＬの阻害は、骨の減少を防止するものとして承認され、当該治療の潜在的な患者は数百万人に及ぶ(US 6,017,729, EP 0 873 998, EP 0 911 342, US 5,843,678, WO 98/46751, WO 98/54201)。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫのいずれの発現も、ヒトの原発性乳癌及び乳癌細胞株において観察され、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系は、細胞の増殖又は死に対して影響せず、上皮細胞癌の骨転移を制御出来ることを提示している。
US 2008/107597及びWO 2010/022120 A1は、抗ＲＡＮＫＬ抗体及びそれらの疾患の多重度に関連する骨量低下の阻害、又は「ＲＡＮＫＬ関連疾患」の治療における使用を開示している。
WO 02/098362において、ＲＡＮＫアンタゴニストを用いた非高カルシウム血症患者における癌の治療が提案されている。しかしながら、具体的な治療手段が開示されておらす、このパテントファミリーは最終的に拒絶されている。
骨及びカルシウム代謝及び炎症症状に関連する疾患の治療におけるＲＡＮＫＬの公知の使用は、例えばWO 2007/128564に記載されている。
乳癌は、ヒトの最もありふれた癌の一つであり、欧米において、平均で女性の８人に１人が生涯で乳癌に罹患する。Women's Health Initiative (WHI)及びMillion Women Studyは、ホルモン補充治療(ＨＲＴ)が、乳癌の発生リスク及び死亡率の増大に関与することを示している。特に、ＨＲＴ及び避妊のために数百万人の女性に使用されるメドロキシプロゲステロン(ＭＰＡ)等の合成プロゲステロン誘導体(プロゲスチン)は、乳癌発生のリスクを顕著に増大させる。
エストロゲンやその合成誘導体(プロゲスチン)を含むプロゲステロンは、更年期症状を改善するために閉経後の女性において複合ホルモン補充治療(ＨＲＴ)に使用される。エストロゲン及びプロゲスチンは、ホルモン避妊剤としても使用され得る。
タモキシフェンは、胸部組織のエストロゲン受容体のアンタゴニストである。閉経後の女性におけるホルモン陽性早期乳癌に対する標準的な内分泌(抗エストロゲン)治療である。エストロゲン受容体をブロックすることにより、ホルモン補充治療を阻害もし得る。
本願発明の目的は、癌を予防又は治療するための治療法及び手段を提供することである。
本発明は、癌におけるＲＡＮＫＬの特定の役割、並びに治療又は予防目的で癌関連ＲＡＮＫＬメカニズムに干渉する方法及び手段に関する。ＲＡＮＫＬは、ＤＮＡダメージにより誘導される癌を発生させる突然変異の後の細胞死を防止するため、癌を発生させる突然変異から細胞を防御する働きに関与することが認められる。形質転換突然変異が生じた細胞の生存は、癌細胞の重要な性質の一つである。この活性におけるＲＡＮＫＬの新しく発見された役割は、癌の発生及び進行を治療及び予防するＲＡＮＫＬ活性の阻害を可能とする。破骨細胞及び骨芽細胞に対して作用することにより骨転移の発生の過程にＲＡＮＫＬが関与していることは知られていたが、ＲＡＮＫＬが、癌細胞の発生に直接作用することは知られていなかった。
本発明は、特に、転移癌細胞から遠隔の原発腫瘍の予防又は治療における、有効成分としてＲＡＮＫＬ阻害剤を使用する癌治療に関する。
本発明において、癌治療は、患者の体内の癌細胞を減少させること、又は少なくとも当該疾患の更なる進行を防止することとして理解されるべきである。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、例えばUS 2008/107597, WO 2010/022120 A1, US 6,740,522, US 7,411,050, EP 2003203 A1等で広く知られている抗体、又はUS 2004/167072に開示されるポリペプチド阻害剤を含む。これらの従来のＲＡＮＫＬ阻害剤のいずれも、本発明に使用され得る。
ＲＡＮＫＬは、樹状細胞及び破骨細胞の機能を制御する細胞表面受容体ＲＡＮＫの公知のリガンドである。本発明において、癌の発生における更なるメカニズムが発見された。ＲＡＮＫＬは、ホルモンに影響される癌の発生を促進する。そのようなホルモンは、各人の正常のホルモンのバックグラウンド由来のものであってもよく、又は人工的に投与されてもよい(例えば更年期障害のホルモン補充治療、又は避妊剤として)。更に、このリガンドの癌における細胞メカニズム及び作用が調査され、特定された。
ＲＡＮＫＬの効果、「ＲＡＮＫＬ活性」は、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合及びその結果引き起こされる活性化を含む。ＲＡＮＫは、更に、ＩＫＫα、ＩκＢα、Ｐ−ＮＦκＢ及びサイクリンＤ１、並びにＩｄ２−ｐ２１、ＭＡＰＫ、Ｅｒｋ及びｐ３８経路を活性化する。これらの因子のいずれかの活性の変化は、癌細胞の生存率を低下させるのに、又は治療若しくは予防法に使用できる。これらのタンパク質のほとんどは細胞内に存在し、ＲＮＡｉ等によりそれらの活性又は発現を細胞内で阻害することにより、それらの機能を阻害することが出来る。ＲＡＮＫＬ及びＲＡＮＫは細胞外の標的であるが、ＲＮＡｉ等の細胞内の阻害手段によっても活性を変化させられる。
本発明において、ＭＰＡ等のプロゲスチンのインビボ投与が、細胞内の重要な破骨細胞分化因子であるＲＡＮＫＬの強力な誘導を引き起こすことが判明した。これらの細胞におけるＲＡＮＫＬ又はその受容体のＲＡＮＫの阻害又は不活性化は、プロゲスチン誘導性増殖を妨げる。重要なことに、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ阻害は、プロゲスチン駆動性癌の発生を減少し、発生を遅延し、そして癌幹細胞の自己再生を低下させた。ＲＡＮＫＬは骨転移に影響することが知られているが、本発明は、一般的な癌及び転移が関与しない癌を治療する可能性を初めて提供するものであり、転移は、本発明の治療の標的ではない。好ましくは、前記癌は、原発性癌である。当該癌は、非転移性であってもよい。
先行技術(WO 02/098362)において、ＲＡＮＫアンタゴニストの癌治療における使用が示唆されていた。しかしながら、この示唆に基づく治療手段は、結局開示されていない。本発明において、特に好ましい標的は、増殖のためのホルモンシグナルに依存する細胞である。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ駆動性癌の発生における重要な要素は、ホルモンのバックグラウンドである。本発明において、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬの癌形成作用は、性ホルモン、特にホルモン補充治療又は避妊用に女性に広く投与される、プロゲステロン及びその誘導体(プロゲスチン)に関連している。従って、本発明の好ましい態様に係るＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬアンタゴナイズ治療は、性ホルモン又はその機能的誘導体が過剰に存在する患者を治療するためのものである。本発明において治療又は予防される癌として、原発性乳癌を含む乳癌が挙げられる。
好ましい態様において、前記癌は、増殖がホルモンに依存する癌である。そのようなホルモンは、女性ホルモン、例えばプロゲステロン又はエストロゲン等であってもよい。癌細胞は、ホルモン受容体、特にプロゲステロン受容体及び/又はエストロゲン受容体を有していてもよい。エストロゲン受容体の例は、ＥＳＲ１（ＥＲアルファ鎖を含む）、ＥＳＲ２（ＥＲベータ鎖を含む）又はヘテロマー受容体、例えばＥＲアルファ及びＥＲベータ鎖の混成受容体である。そのような受容体の存在は、細胞においてホルモンシグナリングが要求されることを示唆する。特に、このシグナリングは、ＲＡＮＫＬ介在性であってもよい。好ましくは、前記ホルモンシグナリングは、プロゲステロン受容体が介在してもよい。特定の態様において、前記癌は、プロゲステロン受容体を有するが機能的なエストロゲン受容体を有しない癌細胞を含む。
ホルモンによるＲＡＮＫＬの活性化は、ＤＮＡダメージ誘導性の細胞死から癌又は癌前駆細胞を保護する。故に、これらのホルモンは、ＲＡＮＫＬ活性を増大することにより、癌を支持し得る。本発明において、治療される好ましい癌の種類は、発生の過程で性ホルモン依存性を示す癌、特に乳癌又は前立腺癌である。更なる癌の種類として、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病/Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞腫瘍、大型顆粒リンパ球白血病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、骨髄性新生物、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、骨髄異形成症候群、及び慢性骨髄増殖性疾患が挙げられる。特に好ましくは、前記癌は、肺癌、乳癌、胸部癌(mammary cancer)、黒色腫、肉腫、前立腺癌、頭頸部癌、原発起源が不明な癌、リンパ腫、白血病、腎臓癌及び消化管癌から選択される。好ましくは、前記癌は、ホルモン駆動癌様乳癌又は前立腺癌である。そのようなホルモンは、エストロゲン若しくはプロゲステロン、又はそれらの人工の機能的同等物、例えばプロゲスチン、又はＲＡＮＫＬを誘導することが知られている他の因子、例えばＰＴＨｒＰ(副甲状腺ホルモン関連タンパク質)又はビタミンＤである。前記癌は、上皮起源であってもよい。好ましくは、前記癌は、その起源の組織中で、例えば乳癌又は胸部癌の場合胸部で、又は前立腺癌の場合は前立腺で治療又は予防される。
本発明において、前記癌は、原発性癌であってもよい。本明細書中に示すように、原発性癌の発生は、ＲＡＮＫＬ活性の阻害により予防又は遅延され得る。故に、前記原発性癌は、治療又は予防され得る。加えて、再発した癌の治療又は予防も可能である。
一つの態様において、本発明は、患者の癌の予防又は治療に使用されるＲＡＮＫＬ阻害剤を提供し、ここで、当該患者は、ホルモン治療を受けており、好ましくはホルモン補充治療を受けており、好ましくは当該治療にエストロゲン、プロゲステロン又はプロゲスチンが使用され、又はホルモン避妊を受けている。
「治療」という用語は、癌患者に対して有益な効果、特に癌細胞の減少、癌の更なる進行の防止を指すものとして解釈され得るが、必ずしも絶対的な治癒の意味ではなく、可能ではあるが本発明により必ずしも要求されない。
同様に、「予防」は、癌の発生の確実な防止に常に成功することとして解釈されないが、患者の癌の発生の相対的な減少、又は癌の発生の遅延、即ち予防的治療として解釈される。癌の予防は、本発明の特段の利益である。ＲＡＮＫＬ誘導性のアポトーシスに対する保護は癌の発生における本質的なステップであるから、癌の発生においてこのステップを阻害して、癌の兆候をしばらくの間防止又は遅延させることが出来る。本発明における治療又は予防は、良性腫瘍又は瘤の治療に使用され得るため、癌の形成における更なる発生を阻害する。
患者の正常のホルモンレベルは、通常、本発明における癌の発生に関与するＲＡＮＫＬ経路の引き金を引くのに充分である。場合によっては、ホルモンレベルは、生理的又は人為的な原因により、患者の体内で増大している。そのようなホルモンレベルの増大は、ＲＡＮＫＬ関連の癌の発生及び進行を増大させ得るため、好ましい態様において、本発明における治療対象は、ホルモン、特に性ホルモン、例えばプロゲステロン(又は合成機能的類似物、プロゲスチン)、又はエストロゲン等のホルモンのレベル、例えば血中濃度が増大している。ホルモン補充治療のための、又はホルモン避妊のための（特にプロゲステロン及びその誘導体）、患者への女性ホルモンの投与は、ＲＡＮＫＬ経路を介して、癌、特に乳癌又は前立腺癌等のホルモン駆動性癌のリスクを増大させる。更に、前更年期等の内在的プロゲステロン系の何らかの下方制御は、癌のリスクを増大させる。一方、ＲＡＮＫＬ阻害剤の投与は、乳癌のリスクを低下させ得て、又は乳癌の治療に使用され得る。機構的に、ＲＡＮＫＬ活性は、乳癌細胞をアポトーシスから保護し、癌形成的突然変異に関して、乳癌の生存率を増大させる。故に、ＲＡＮＫＬ活性の低下は、かかる保護的効果を阻害し、その結果、癌細胞の死滅を増大させる。
患者は、性ホルモンを用いた治療を受けており、又は受けたことがあってもよい。本発明において、癌の発生におけるＲＡＮＫＬ活性は、性ホルモンにより、特にエストロゲン又はプロゲステロン若しくはその誘導体(プロゲスチン)に影響されることが見出された。故に、好ましい態様において、患者は、ホルモンで治療され、好ましくはエストロゲン、プロゲステロン又はプロゲスチンによるホルモン補充治療を受け、又はホルモン避妊を受けている。プロゲスチンの例として、メドロキシプロゲステロン(又はその酢酸塩、例えば17-酢酸塩)、ノルエチステロン、エチステロン、ノルエチノドレル、酢酸ノルエチンドロン、二酢酸エチノジオール、レボノルゲストレル、ノルゲストレル、デソゲストレル、ゲストデン、ノルゲスチメート、ドロスピレノン、ジエノゲスト、ネステロン、酢酸ノメゲストロール、トリメゲストロン、タナプロゲット、酢酸メゲストロール、エトノゲストレルが挙げられる。好ましくは、前記ホルモン又は誘導体は、プロゲスチンと同一の効果を有する。特に、前記ホルモンは、ＲＡＮＫＬを誘導する。
ホルモン補充治療において、又はホルモン避妊において、ホルモン、一般に性ホルモンのレベルは、プロゲステロンのレベルが増大するように上方制御されて、これが、ＲＡＮＫＬ経路を介して癌の発生と結び付き得る。故に、ホルモンによる治療又はホルモン避妊を受けている、又は受けたことのある患者は、乳癌が発生するリスクが増大している。これらの患者において、ＲＡＮＫＬ阻害剤の投与は、癌、癌の発生又は癌の進行の予防又は治療において、特に有効である。
特に、治療すべき患者で見られ得る高いプロゲスチン及び／又はプロゲステロンレベルは、例えば、血清濃度であり、又は0.2ng/ml以上、好ましくは0.3ng/ml以上である。
「ＲＡＮＫＬ阻害剤」は、ＲＡＮＫＬ活性を低下させる任意の化合物又は薬剤と理解されるべきである。任意のＲＡＮＫＬリガンド、特に、遊離ＲＡＮＫＬを不活性化し、ＲＡＮＫとの結合を競合的に阻害し、ＲＡＮＫの活性化を阻害する、抗ＲＡＮＫＬ抗体を含む。更に、ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ＲＡＮＫをブロックするＲＡＮＫアンタゴニスト、ＲＡＮＫＬ細胞受容体を含む。更に、ＲＡＮＫＬ自体、ＲＡＮＫ、ＩＫＫα、ＩκＢα、Ｐ−ＮＦκＢ、サイクリンＤ１（ＮＦκＢ経路阻害）、Ｉｄ２、ＭＡＰＫ Ｅｒｋ及びｐ３８を含む、ＲＡＮＫＬシグナリング経路のいずれかの要素がアンタゴナイズされ、又はｐ２１が増大又はアゴナイズされ（Ｉｄ２経路の阻害）、ＲＡＮＫＬシグナリングが阻害され、ＲＡＮＫＬ活性が低下する。Ｉｄ２経路は、細胞周期進行を阻害する主要なサイクリン依存的キナーゼ阻害剤であるｐ２１の転写リプレッサーとして機能する。故に、Ｉｄ２経路は、ｐ２１の情報制御を阻害して細胞の増殖を停止させる。
ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ＲＡＮＫＬ自体、ＲＡＮＫ、ＩＫＫα、ＩκＢα、Ｐ−ＮＦκＢ、サイクリンＤ１（ＮＦκＢ経路阻害）、Ｉｄ２、ＭＡＰＫ Ｅｒｋ及びｐ３８のいずれかを阻害又はアンタゴナイズし、又はｐ２１を増大又はアンタゴナイズし、又は好ましくはＲＡＮＫＬの阻害であるそれらの因子の２、３、４、５つ又は全てを併せ持つ。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ＲＡＮＫＬ濃度、特に血清濃度を低下させ、又はＲＡＮＫＬ発現を低下させる、任意の化合物であってもよい。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、細胞表面上、特に癌細胞表面上のＲＡＮＫＬ濃度を低下させ、及び／又はＲＡＮＫＬ発現を低下させ、及び／又はＲＡＮＫＬ結合に応答してのＲＡＮＫ活性化を低下させる。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、粗に、ＩＫＫαの細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。更に、ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ＩκＢαの細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。更に、ＲＡＮＫＬ阻害剤は、Ｐ−ＮＦκＢの細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、サイクリンＤ１の細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、Ｉｄ２の細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、ｐ２１の細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を増大させ得る。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、ＭＡＰＫ Ｅｒｋの細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。ＲＡＮＫＬ阻害剤は、更に、ｐ３８の細胞内濃度及び／又は発現及び／又は活性化を低下させ得る。
好ましくは、細胞の因子をアンタゴナイズするため、siＲＮＡが投与されて、これらの因子の発現及び機能を低下させる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的に遺伝子発現を抑制するメカニズムである。ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、真核細胞の特定の遺伝子機能を抑制する高度に効果的な手段である。細胞及び生物に適用された場合、ＲＮＡｉは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを導入した後、ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡを分解する。様々なＲＮＡｉの方法が公知であり、植物細胞、ショウジョウバエ及びヒト黒色腫細胞における遺伝子発現制御手法として一般的に知られているものは、例えばUS 2002/0162126及びUS 2002/0173478に記載されている。本発明の方法及び組成物に使用されるｓｉＲＮＡは、ＲＡＮＫＬシグナリング経路の所望の分子又はそのような分子の組み合わせを標的とするように選択される。そうして、それらは標的遺伝子に対応する様々なＲＮＡを標的とする。当業者は、本明細書中、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの変法、即ちハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡコンストラクト又は任意のそれらの類似物、二重鎖ＲＮＡ，ｍｉｃｒｏ（ｍｉＲＮＡ）、並びに様々なｓｉＲＮＡの形態、例えばｓｉＲＮＡ複製、ウイルス及び非ウイルスベクター中のスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び担体中のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。ＲＮＡＫＬのＲＮＡｉは、例えば、WO 2005/028633に記載されている。
当該技術分野において、ＲＮＡｉを使用して遺伝子発現を阻害する様々な方法が存在し、例えばWO 02/055692、WO 02/055693、EP 1144623B1及びWO 03/074654に記載されている。ｓｉＲＮＡ治療を使用することにより、いずれかの細胞内因子が標的となり、本発明のＲＡＮＫＬアンタゴナイズ及び阻害治療のために、阻害される。故に、そのような任意の化合物は、ＲＡＮＫＬ阻害剤として使用できる。
好ましい態様において、ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ＲＡＮＫＬ又はＲＡＮＫリガンド、好ましくは抗ＲＡＮＫＬ抗体、例えばデノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）であり、又はUS 2008/107597に開示されているものである。「抗ＲＡＮＫＬ抗体」は、任意の機能的類似体及び誘導体を含む、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）等を含む。ＲＡＮＫＬ活性に関連するタンパク質及び印紙、特にＲＡＮＫＬ及びＲＡＮＫ、並びにＲＡＮＫＬシグナリング経路のいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体も、本発明で意図される。当該抗体は、全長タンパク質、タンパク質の可溶化形態、又はその断片による免疫化により生産されてもよい。本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、組み換え抗体であってもよく、例えば軽鎖及び重鎖のマウス定常領域がヒト配列に置き換えられたキメラ抗体、又は相補鎖決定領域のみマウス起源であるＣＤＲグラフト抗体等であってもよい。本発明の抗体は、ヒト抗体であってもよく、例えば、ヒト抗体を産生できる組換え動物の免疫化により産生されたものであってもよい（WO 93/12227)）。抗体は、生体試料中のＲＡＮＫＬを検出するのに有用であるため、当該タンパク質を生産する細胞又は組織の同定を可能とする。また、ＲＡＮＫＬに結合する抗体（及び他の結合化合物とのブロック相互作用）は、ＲＡＮＫＬ阻害剤としての医薬的用途を有する。
ＲＡＮＫＬ阻害剤は、患者の体循環中で遊離ＲＡＮＫＬ濃度を減少させるのに適し、使用され得る。ＲＡＮＫはＲＡＮＫＬの唯一の天然の受容体ではない。オステオプロテギン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬ活性（ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合及びそのIKKα、IκBα、P-NFκB及びサイクリンD1を介した、又はId2-p21、MAPK Erk及びp38を介したシグナル経路）を低下させられる分泌性のデコイ受容体である。故に、ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬ阻害剤として投与されてもよい。更に、ＲＡＮＫ又はその可溶化形態自体が、ＲＡＮＫＬの遊離血清濃度を低下させるためのＲＡＮＫＬリガンド及び阻害剤として使用され得る。
前記阻害剤は、通常、治療有効量、即ち癌細胞の生存率を顕著に低下させるためにＲＡＮＫＬ活性を低下させられる量で、投与される。特定の態様において、前記ＲＡＮＫＬ活性は、正常なヒトの通常のレベルにまで抑制されてもよく、更に、ＲＡＮＫＬ活性は、通常のレベルを下回って低下させられてもよい。好ましくは、ＲＡＮＫＬ活性は25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、又は90%以上減少させられる。好ましい態様において、この減少は、ＲＡＮＫＬの血清レベルと一致する。
前記阻害剤は、抗癌治療、好ましくは放射線又は化学治療と組み合わせて、又はそれらを強化(priming)するために使用されてもよい。本発明のこの側面において、対象における癌治療の効率を増大させる方法が提供され、当該方法は、癌治療を必要とする対象に治療有効量のＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含み、ここで、当該対象は、小分子薬剤、血管新生阻害剤、腫瘍ワクチン、化学治療、免疫治療、放射線治療、遺伝子治療及びそれらの組み合わせからなる群から選択される癌治療にも供される。
ＲＡＮＫＬは、ＤＮＡの損傷に関連する細胞死から癌細胞を保護する機能を有する。ＲＡＮＫＬ活性を低下させてＲＡＮＫＬの癌保護作用を低下させることにより、細胞はＤＮＡ損傷により死滅しやすくなる。故に、好ましい態様において、癌は、ＲＡＮＫＬ阻害剤と、更に細胞に損傷を与える更なる抗癌治療、例えば放射線又は化学治療等とを組み合わせて添加することにより治療される。好ましくは、そのような更なる癌治療剤は、特定の組織、例えば胸部に特異的なものであってもよく、例えば局所的な化学治療剤の投与、又は当該組織の癌細胞を標的とするホーミング剤の投与であってもよい。
この態様において、本発明は、化学治療剤及びＲＡＮＫＬ阻害剤を含むキットにも関する。
更なる態様において、ＲＡＮＫＬ阻害剤は、ホルモン補充治療との組み合わせの使用、又はホルモン避妊との組み合わせの使用を提供し、これらは、乳癌細胞の発生のリスクを減少させる。
前記患者は、好ましくは哺乳類、特に好ましくは霊長類、尚もより好ましくはヒト、特に女性である。患者は、ホルモン、特に女性ホルモンによる治療を受けており、又は受けたことがあってもよい。そのような過去の治療は、５，４，３，２年前、又は36, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 又は1か月前であってもよい。患者、特にプロゲステロン又はプロゲスチンによるホルモン補充治療又はホルモン避妊を受けている女性は、癌の発生リスクが増大している。この増大したリスクを低下させるため、本発明は、上記のようなＲＡＮＫＬ阻害剤の組み合わせ使用を提供する。
更に、本発明は、癌患者のＲＡＮＫＬ活性を低下させる方法を提供し、当該方法は、当該患者にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む。
更なる態様において、本発明は、患者の癌細胞の量を減少させる方法に関し、当該方法は、当該患者にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む。
更に、本発明は、細胞のＤＮＡ損傷による細胞死を増大させる方法を教示し、当該方法は、RANK、RANKL、IKK-α 、IkB-α、P-NF-κ-B、 サイクリンD1、Id2、MAPK Erk、p38の阻害又はp21の増大、又はそれらの組み合わせを含み、特に、当該細胞にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与することによる、当該細胞におけるＲＡＮＫＬの阻害との組み合わせを含む。本発明に係る治療を受ける細胞は、ホルモン依存性癌が発生し得る組織、特に胸部組織の細胞であってもよく、癌細胞であってもよい。更に、前記細胞は、上皮細胞又は癌幹細胞であってもよい。特に、上皮由来の癌は、本発明の方法により効果的に治療され得る。特に好ましい態様において、前記癌は、乳腺上皮細胞起源である。更に、ＲＡＮＫＬ阻害は癌幹細胞に顕著な効果を及ぼし、そのような幹細胞を含む癌を予防又は減少させられる。
好ましい治療又は予防方法は、上記のように、患者がホルモン治療、好ましくはホルモン補充治療、好ましくはプロゲステロン又はプロゲスチンによる治療、又はホルモン避妊を受けていることを特徴とする。
上記のように、特に女性ホルモンによるホルモン治療は、乳癌のリスクを増大させるため、本発明の治療又は予防方法において、好ましくは、患者は、当該治療の前に、又は当該治療の期間中に、そのようなホルモン治療を受けている。ホルモンの過去の投与は、１，２，３，４，５年又はそれ以上前であってもよい。
更なる側面において、本発明は、ＲＡＮＫＬ阻害剤及びプロゲステロン又はプロゲスチンから選択されるホルモン又はその誘導体、又はホルモン避妊剤を含有する、医薬組成物を提供する。
上記のように、ＲＡＮＫＬ阻害は、女性ホルモン、特にエストロゲン、プロゲステロン又はプロゲスチンによる癌発生のリスクを減少させられる。更に、そのようなホルモンとＲＡＮＫＬ阻害剤との組み合わせの投与の教示も、本発明により提供される。そのようなホルモンは、ホルモン補充療法又はホルモン避妊として使用されてもよい。
ホルモン避妊製剤の最もありふれた種類のものは、エストロゲンとプロゲスチンの両方を含有し、又はプロゲステロン又はその合成類似体(プロゲスチン)のみを含有するプロゲステロン製剤である。ホルモン依存性癌の発生のリスクを低下させるため、本発明は、女性ホルモン避妊剤を含むホルモン治療剤とＲＡＮＫＬ阻害剤の組み合わせ使用を提供する。
治療的又は予防的使用における医薬組成物又は製剤は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料及び／又は助剤を含有してもよい。また、本発明は、治療有効量のＲＡＮＫＬ阻害剤を含有する医薬組成物を提供する。「治療有効量」という用語は、特定の投与条件又は経路において治療効果を提供する量を意味する。前記組成物は、液体又は凍結乾燥状態であってもよく、様々なｐＨ値及びイオン強度の希釈剤（Ｔｒｉｓ、酢酸又はリン酸緩衝剤）、Ｔｗｅｅｎ又はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ等の可溶化剤、ヒト血清アルブミン又はゼラチン等の担体、チメロサール又はベンジルアルコール等の保存料、及びアスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤を含有してもよい。具体的な組成物の選択は、治療される状態、投与経路及び所望の薬物動態パラメーターを含む、多くの要素に依存する。ｓｉＲＮＡ製剤は、好ましくは、リポソーム製剤として投与される。
本発明は、上記のようなホルモン治療剤、及びＲＡＮＫＬ阻害剤を含むキットに関する。そのようなキットは、ホルモン治療剤及びＲＡＮＫＬ阻害剤の別個の投与を可能とする。
溶解性、安定性、血漿半減期及び生体利用効率を増大させるために、水溶性ポリマーで修飾されたＲＡＮＫＬ阻害剤を含有する組成物も包含する。また、長期間の調整放出を行うために、ＲＡＮＫＬ阻害剤が、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル又はベシクルに包摂されることも想定される。可溶性ＲＡＮＫＬ阻害剤は、腹腔内投与に適した微小粒子に製剤化されてもよい。
本発明の組成物は、皮下、静脈内、又は筋肉内のいずれかの注射により、又は経口、経鼻、腹腔内、又は直腸投与により投与されてもよい。最終的に選択される投与経路は、多くの要素に依存し、当業者により確かめられる。
また、本発明は、本発明の治療有効量の抗ＲＡＮＫＬ阻害核酸(ｓｉＲＮＡ)と医薬として許容される助剤とを含有する医薬組成物を提供する。核酸組成物は、ＲＡＮＫＬ又は上記のようなＲＡＮＫＬシグナリング経路の一部又は全部のコーディング領域、及び／又は隣接領域を、アンチセンス治療レジメンの一部として細胞及び組織に送達するのに適している。
好ましい態様において、本発明は、以下のように定義される。
１．対象の癌を治療又は予防する方法であり、当該対象に治療有効量のＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
２．癌細胞のアポトーシスを増大させる方法であり、当該癌細胞にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
３．前記癌が乳癌又は前立腺癌である、項１又は２のいずれかに記載の方法。
４．前記癌が、性ホルモン受容体、好ましくはプロゲステロン又はエストロゲン受容体を有する癌細胞を含む、項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
５．前記癌が、原発性癌である、又は前記癌細胞が原発性癌の細胞である、項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
６．患者のホルモン依存性癌の治療又は予防において使用されるＲＡＮＫＬ阻害剤であり、好ましくは、当該癌が、性ホルモン受容体、好ましくはプロゲステロン又はエストロゲン受容体を有する癌細胞を含む、阻害剤。
７．前記患者が、ホルモン治療、好ましくはプロゲステロン又はプロゲスチンによるホルモン補充治療を、好ましくはホルモン避妊を受けたことがある、項６に記載の阻害剤。
８．前記癌が乳癌、胸部癌又は前立腺癌である、項６又は７のいずれかに記載の阻害剤。
９．前記癌が上皮細胞起源である、項６〜８のいずれか１項に記載の阻害剤。
１０．更なる抗癌治療、好ましくは放射線又は化学治療と組み合わせられる、又はそれらを強化する、項６〜９のいずれか１項に記載の阻害剤。
１１．原発性癌を治療又は予防する、又は癌の再発を治療又は予防する、項６〜１０のいずれか１項に記載の阻害剤。
１２．ホルモン治療、好ましくは性ホルモンを用いたホルモン補充治療又はホルモン避妊と組み合わせて使用される、ＲＡＮＫＬ阻害剤。
１３．癌の発生のリスクを減少させる、項６〜１２のいずれか1項に記載の阻害剤。
１４．癌患者のＲＡＮＫＬ活性を低下させる方法であり、当該患者にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
１５．患者の癌細胞の量を減少させる方法であり、当該患者にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
１６．細胞のＤＮＡダメージによる細胞死を増大させる方法であり、好ましくは当該細胞にＲＡＮＫＬ阻害剤を投与することにより、当該細胞中のＲＡＮＫ又はＲＡＮＫＬ又はＩＫＫ−αを阻害する工程を含む、前記方法。
１７．前記患者又は細胞がホルモン治療を受けたことがある、項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記ホルモンが、プロゲステロン又はプロゲスチンである、項１４〜１７のいずれか1項に記載の方法。
１９．前記ホルモン治療が、ホルモン補充治療、又はホルモン避妊剤の投与を含む、項１４〜１８のいずれか1項に記載の方法。
２０．前記ＲＡＮＫＬ阻害剤が、ＲＡＮＫＬ又はＲＡＮＫリガンド又はｓｉＲＮＡである、項１〜１９のいずれか1項に記載の阻害剤又は方法。
２１．前記ＲＡＮＫＬ阻害剤が抗ＲＡＮＫＬ抗体である、項２０に記載の阻害剤又は方法。
２２．前記抗ＲＡＮＫＬ抗体がＤｅｎｏｓｕｍａｂである、項２１に記載の方法。
２３．前記細胞が胸部組織細胞又は乳癌細胞であり、又は前記癌が胸部組織細胞又は乳癌細胞から選択される癌性細胞を含む、項１〜２２のいずれか1項に記載の阻害剤又は方法。
２４．前記細胞が上皮細胞又は基底細胞又は癌幹細胞であり、又は前記癌が、上皮細胞又は基底細胞又は癌幹細胞から選択される癌性細胞を含む、項１〜２３のいずれか1項に記載の阻害剤又は方法。
２５．ＲＡＮＫＬ阻害剤、及びエストロゲン、プロゲステロン若しくはプロゲスチンから選択されるホルモン若しくはその誘導体、又はホルモン避妊剤を含有する医薬組成物。
２６．更に、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料及び/又は助剤を含有する、項２５に記載の組成物。
２７．ホルモン治療に使用される、項２５又は２６のいずれかに記載の組成物。
２８．前記ホルモン治療が、避妊又はホルモン補充治療である、項２７に記載の組成物。
２９．化学治療剤及びＲＡＮＫＬ阻害剤を含有するキット。
３０．ＲＡＮＫＬ阻害剤、及びエストロゲン、プロゲステロン、又はプロゲスチンから選択されるホルモン又はその誘導体、又はホルモン避妊剤を含むキット。
本発明は、以下の図面及び実施例により更に詳述されるが、それらの具体例に限定されることはない。
プロゲステロン誘導体ＭＰＡが、ＲＡＮＫを介して、インビトロでＲＡＮＫＬ発現及び胸部上皮細胞の増殖を引き起こすことを示す。(a)、(b) プロゲステロン誘導体ＭＰＡによるＲＡＮＫＬ発現の誘導を示す。未産の野生型の雌に、徐放型ＭＰＡペレットを皮下移植し、又は偽手術を行った。(a)、移植の3日後、qRT-PCRにより、精製胸部上皮細胞中のRANKL mRNAを判定した。データは、偽処理に対する倍数で示す(+/-sem)(n＝3)。(b)、MPA処理の3日後の胸部上皮細胞におけるプロゲステロン受容体(PR、赤)及びRANKL(緑)のIn situ Ki67免疫染色を示す。(c)、MPA皮下移植の3日後に対象から単離した乳腺上皮細胞においてアッセイされたが、プロラクチン受容体突然変異体(PRL-R KO)雌においてはアッセイされていない、可溶性RANKLタンパク質の誘導を示す。偽処理された対照の同腹及びPRL-R KO雌の乳腺が、対照として示される。(d)、偽処理及びMPA移植の3日後の対照の同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖を示す。増殖は、In situ Ki67免疫染色により決定された。(e)、(f)対照においてMPA処理された乳腺の幹細胞に富むCD24+CD49high集団(MaSC)の顕著な増大は、RANKΔmam乳腺では見られなかった。(e)、代表的なFACSプロフィールは、8週齢未産雌をMPA又は偽処理したもの由来の胸部MaSCのLineage陰性(CD31- (内皮細胞) CD45- (造血細胞) TER199- (赤血球系細胞))のCD24及びCD49発現を示す。(f)、MPA又は偽処理した未産RANKΔmam及び同腹対照の雌のMaSCに富むCD24+CD49high集団を定量した。全てのMaSC実験において、マウスは、MPAで3日間処理された。集団+/- semあたりn=4である。* P < 0.05; *** P < 0.001 (スチューデントt検定)。
RANKはプロゲスチン駆動胸部癌の発生率及び発生をコントロールする。(a)、MPA/DMBA腫瘍形成スキームを示す。未産6週齢雌マウスにMPAペレットを皮下移植し、図に示すように8週間DMBAを経口投与した。(b) MMTV-Cre rankfloxed/Δ 雌(RANKΔmam) (n=14)及び同週齢の同腹対照の雌(n=19)を図2aに示すようにMPAペレット及びDMBAで処理したものの触知可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージで表現する。対照の腫瘍発生率の中間値は、最後のDMBA処理後11日で、RANKΔmam雌は30日であった。(c)最後のDMBA処理後22日の同腹対照及びRANKΔmam雌から単離した胸部腫瘍の組織切片を示す。サイトケラチン５染色を示している。倍率はx20である。(d)、(e)、最後のDMBA処理後7日(d)及び22日(e)における対照及びRANKΔmam雌のその場の及び浸潤胸部癌の数を示す。データはマウス+/- semあたりの平均値として示す。遺伝型あたりマウスn=3。各マウスについて10個の乳腺全てを解析した。* P < 0.05 (スチューデントt検定)。下部のパネルは、対照の雌における典型的な浸潤性の腺癌の組織切片を示す。H&E染色切片及びKi67増殖マーカーの免疫染色を示す。倍率はx20である。
RANKは、NFκBシグナリング、接触非依存的増殖、及び放射線誘導上皮アポトーシスからの保護を誘導する。(a)、RANKL刺激(1μg/ml)に応答した単離したマウス乳腺上皮細胞(MEC)における、リン酸化(P)IKKα、全IKKα、リン酸化(P)p65 NFκB、全p65 NFκB、リン酸化(P)IκBα、及び全IκBαのウエスタンブロッティングを示す。ローディング対照としてβアクチンを示す。(b)対照、RANKΔmam、及びIKKαΔmam雌で発生したプールされた後期胸部腺癌(各レーンn＝4)における、IKKα、IKKβ、IKKγ、リン酸化(P)p65 NFκB、全p65 NFκB、リン酸化(P)IκBα、及び全IκBαのウエスタンブロッティングを示す。ローディング対照としてβアクチンを示す。(c)、対照、RANKΔmam、及びIKKαΔmam雌で発生した後期胸部腺癌におけるRANK、サイクリンD1及びp21のmRNAの発現を示す。発現は、qRT-PCRで判定された。データは、平均値+/- semである。群あたりn=4である。(d)、ソフトアガーコロニー形成アッセイ。RANKL(1μg/ml)又はEGF(100ng/ml)の刺激に応答したソフトアガー中でのヒトSKBR3乳癌細胞の増殖を示す。接触非依存的な肉眼で見えるコロニーがRANKL存在下での培養18日後に形成されたが、コロニー形成はデコイ受容体OPG(1μg/ml)により予防された。無刺激SKBR3細胞を対照とした。(e)、MPAペレット及びDMBAで処理したIKKαΔmam (n=10)及び同週齢の同腹の雌(n=11)における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示す。対照の腫瘍発生率の中間値は、最後のDMBA処理後10日で、IKKαΔmam雌は24日であった。(f)、(g)、偽手術又はMPAペレットを移植した対照及びRANKΔmam雌の同腹におけるγ放射線(5Gray)誘導胸部上皮細胞のアポトーシスを示す。アポトーシスは、活性カスパーゼ3における免疫染色により検出された。(f)、乳腺切片の上皮細胞のアポトーシスを示す核を示す(矢印)。倍率はx40である。(g)、胸部上皮のアポトーシスの定量を行った。各マウスについて、最低5000個の各をカウントした。結果は平均値+/- semとして示す。群あたりマウスn＝3。* P < 0.05; ** P< 0.02(スチューデントt検定)。
RANKは、癌幹細胞の自己新生をコントロールする。(a)、胸部癌幹細胞、即ち腫瘍出発細胞(TIC)の自己新生は、RANK発現を必要とする。MPA/DMBA-処理RANKΔmam及び対照同腹の雌から回収した胸部腫瘍細胞を7日間培養し、僅かな割合の初代細胞がマンモスフィアを形成した(第1パセージ)。初代マンモスフィアを単一細胞に分解し、それらの第2マンモスフィアを形成する能力をアッセイした(第2パセージ)。対照同腹由来の腫瘍細胞は培養7日後に第2マンモスフィアが形成されたが、RANKΔmam雌においては形成されなかった。(b)、MPA/DMBA-処理RANKΔmam及び対照同腹の雌における初代及び第2パセージ(F1及びF2)マンモスフィアの定量を行った。結果は平均値+/- semとして示す。群あたりマウスn＝3。* P < 0.05; ** P< 0.02(スチューデントt検定)。
プロゲステロン誘導体MPAは、インビボでRANKL発現を引き起こす。(a)〜(d)、プロゲステロン誘導体MPAによるRANKL発現の誘導を示す。未産の野生型の雌に、徐放型ＭＰＡペレットを皮下移植し、又は偽手術を行った。(a)、移植又は偽手術の3日又は6日後、ウエスタンブロッティングにより、単離された乳腺上皮細胞におけるRANKLタンパク質の発現がアッセイされた。βアクチンをローディング対照とした。右パネルにおいて、組換えマウスsRANKL及び組換えヒトtmRANKLタンパク質を分子量比較のために示す。データは8頭の試験された動物の代表である。(b)、3つのRANKLアイソフォームの配置図を示す(Ikedaらより)。RANKL１及び2の膜貫通ドメインを強調している(TM、黒四角、aa48〜71)。RANKL２は、細胞内ドメインのaa14〜44を欠くが、RANKL3は、全細胞内ドメインと膜貫通ドメインにあたるaa1〜118を欠く。数字はアミノ酸残基を示す。(c)、MPA処理3日後の精製胸部上皮細胞における全(t)RANKL、RANKL1、RANKL2及びRANKL3 mRNAの発現を示す。(d)、上記(c)のRT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動を示す。(e)、細胞の表面からRANKLを切り取る様々なプロテアーゼのmRNA発現を示す。mRNAは、MPA移植3日後のqRT-PCRにより、精製胸部上皮細胞において判定された。データは、偽処理に対する倍数で示す(+/-sem)(群あたりn＝3)。* P< 0.05; ** P < 0.005; *** P < 0.001 (スチューデントt検定)。
MPAは、ヒト乳癌細胞株においてRANKL発現を引き起こさない。(a)、MPA刺激(0.1μM)後の培養MECとヒト乳癌細胞におけるRANKL mRNA発現を解析した。発現は、無刺激細胞又は所定の時点でMPAで刺激した細胞におけるqRT-PCRにより判定した。我々は、SKBR3細胞を除いてRANKLの誘導を確認できなかった。しかしながら、これらの細胞において、誘導は、インビボのMPA試行の後に我々が観察した2000倍超のRANKLの増大と比較すると僅かな増大であった。(b)、(c)、ヒト乳癌細胞株(b)、並びに短期培養(パセージ<3)胸部上皮細胞(MEC)及び新たに精製した初代MEC(c)のプロゲステロン受容体(PR)mRNAを判定した。データはqRT-PCRにより取得され、MCF10A(b)及び精製初代MEC(c)に対する倍数として示す(+/- sem) (n=3)。
K5-Creマウスと交配した雌は、妊娠中に小葉腺胞(lobulo-alveolar)の異常を示す。(a)、K5-Creと交配した未産及び泌乳(L1) RANKfl/Δ雌の胸部組織と対照同腹の乳腺のホールマウント解析を行った。妊娠野生型雌(矢印)における胞は小葉腺胞構造を形成するが、この発達は、K5-Cre RANKfl/Δ雌において、未発達な胞芽(rudimentary alveolar bud)(矢印)でアレストされる。(b)、RANKflox/Δ及びRANKflox/Δ; K5-Cre+雌由来の精製胸部上皮細胞のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。(c)、対照BALBｃヌード(nu/nu)雌の乳腺は、ホールマウント解析で泌乳1日(L1)での正常小葉腺胞構造を示し、野生型乳腺組織を移植した「クリアー」nu/nuマウスにおいてL1で正常小葉腺胞構造を示し、そしてRANKfl/Δ; K5-Cre乳腺組織を移植した「クリアー」nu/nuマウスにおいてL1で異常な小葉腺胞が発達した。外科的洗浄後のnu/nuマウスの脂肪体(Fat pad)も示す。全て倍率はx5である。
妊娠MMTV-Cre, RANKfl/Δ雌における泌乳乳腺の正常の形成。(a)、未産同腹対照及びMMTV-Cre, RANKfl/Δ雌の胸部組織のH&E解析は、正常の胞／管上皮構造を示す。倍率はx10(上)及びx40(下)である。(b)、MMTV-Creと交配した未産及び泌乳(L1) RANKfl/Δ雌の胸部組織と対照同腹の乳腺をホールマウント解析した。MMTV-Cre誘導のRANKの欠失は、泌乳乳腺の形成に影響しなかった。(c)、RANKflox/Δ及びRANKflox/Δ; MMTV-Cre雌由来の精製胸部上皮細胞のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。RANKflox/Δ; MMTV-Cre動物は、以後RANKΔmamと表記する。
MPAは、乳腺におけるRANKL発現及び上皮の増殖を誘導する。(a)〜(c)、図1の(d)と同様に、偽処理及びMPA移植の3日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖の定量を示す。(a)、データは、各遺伝子型の偽処理した雌に対する全Ki67陽性上皮細胞の相対変化として示す。マウスあたり最低1000個の乳腺上皮細胞がカウントされた。遺伝子型あたりマウスはn＝3とした。** P < 0.005; *** P < 0.001 (スチューデントt検定)。(b)、MPA皮下移植3日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺の腺房あたりのKi67免疫染色細胞のIn situ定量を示す。対照の雌では腺房の〜80%が中〜高度の増殖のサインを示したが、雌において、腺房の60%以上が、非常に低い増殖速度を示した。(c)、発情期依存的なバックグラウンドの増殖レベルをコントロールするため、過排卵した偽処理対照同腹及びRANKΔmam雌を解析した。乳腺あたり1000個以上の細胞がカウントされた。遺伝子型あたりn＝３である。(b)及び(c)において、データは、増殖細胞の数+/- semが低(上皮細胞の＜20%がKi67+)、中(上皮細胞の２０〜８０%がKi67+)及び高(上皮細胞の>80%がKi67+)の腺房／管のパーセンテージとして示される。*** P < 0.001; * P < 0.03(スチューデントt検定)。(d)、PBS又はRANKL(1μg)を腹腔内注射した1日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖を示す。増殖は、In situ Ki67免疫染色により判定された。倍率はx40である。(e)、PBS又はRANKL(1μg)を腹腔内注射した1日後の上皮増殖の定量を示す。Ki67陽性細胞の平均のパーセンテージ+/- semを示す。* P < 0.03; n=5 (スチューデントt検定)。
RANKΔmamマウスにおけるプロゲスチン駆動胸部癌の生存曲線。(a)、(b)、MPAは、胸部上皮細胞においてRANKL発現を誘導する。未産野生型雌をDMBA又は油ビヒクル経口投与で処理し、徐放性MPAペレットを皮下移植し、又は偽手術を行った。(a)、移植／経口投与の3日後、qRT-PCRにより、精製胸部上皮細胞中のRANKL mRNAを判定した。データは、偽処理と比較した倍数変化+/- semとして示す。群あたりのマウスはn=3とした。(b)、油ビヒクル、DMBA、MPA又は偽手術で処理した3日後、ウエスタンブロッティングにより、精製胸部上皮細胞の細胞ライゼートにおける可溶性RANKLタンパク質(19kDa)の発現をアッセイした。βアクチンをローディング対照とした。MPAにおいてのみRANKL mRNAの誘導及びタンパク質発現が認められ、DMBA又は油ビヒクル単独では認められなかった。(c)、MPAペレット及びDMBAで処理した、RANKΔmam (n=14)における、及びMMTV-Cre有り(Cre+対照; n=13)又は MMTV-Cre無し(Cre- 対照; n=9)の同齢同腹対照雌における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の腫瘍の無いマウスのパーセンテージとして示す。Cre+及びCre-対照群の間で、顕著な差は見られなかった。Cre+対照における腫瘍発生の中間値は、最後のDMBA処理後9日であったが、Cre-対照は11日であり、RANKΔmam雌は30日であった。(d)、RANKflox/+; MMTV-Cre+及びRANKflox/Δ ; MMTV-Cre+ (RANKΔmam)雌のMPA/DMBA誘導胸部腫瘍のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。RANKΔmam雌由来の腫瘍は、全て、ほとんど完全な欠失を示した。(e)、MPA/DMBA処理後のRANKΔmam (n=9)及び同齢同腹対照の雌(n=9)の全生存率におけるKaplan Mayer解析を示す。中間生存率は、対照ではRANKΔmam 48日であり、RANKΔmam雌では93日であった。
RANKΔmam雌における扁平腺癌の発生。(a)、(b)、最後のDMBA処理後7日(a)及び21日(b)の対照同腹及びRANKΔmam雌から単離した胸部腫瘍の組織切片を示す。H&E及びEカドヘリン染色が示され、これらは、対照同腹及びRANKΔmam雌の腫瘍中の管腺癌の典型的な特徴である。サイトケラチン14(K14)の発現は、対照及びRANKΔmam雌の両方における基底細胞起源を示す。しかしながら、RANKΔmam雌は、典型的な扁平化生の特徴を示す傾向がある。全ての倍率はx20である。
Mx-Cre RANKfloxed/Δ及び NeuT RANKΔmamマウスにおける胸部癌の発生。(a)、MPAペレット及びDMBAで処理したMx-Cre rankfloxed/Δ (n=4)及び同齢のMx-Cre rank+/Δ同腹対照の雌(n=6)における触診可能な胸部癌の発生を示す。Mx駆動Creレコンビナーゼは、8日間で4回のポリI:C腹腔内注射(200mlPBS 中200μg)により活性化された。データは最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示す。顕著な差は見られなかった。(b)、Mx-Cre rankfloxed/Δマウスにおける非欠失RANKfloxed遺伝子座(fl/+)及び欠失誘導後(Δ)のサザンブロットを示す。(c)、Mx-Cre rankfloxed/Δマウスにおける欠失誘導後(Δ)の様々な機関のサザンブロットを示す。胸腺、心臓、肝臓及び脾臓において様々な程度の欠失(50〜100%)が見られるが、RANKfloxed遺伝子座の欠失は、精製胸部上皮細胞(MEC)では誘導されなかった。(d)、NeuT RANKΔmam (NeuT, MMTV-Cre+ rankfloxed/Δ) 雌(n=18)及び同齢 NeuT (NeuT MMTV-Cre+ rank+/Δ)対照同腹の雌(n=17)における触診可能な胸部癌の発生を示す。顕著な差は見られなかった。(e)、NeuT MMTVCre+ rankfloxed/Δ由来の腫瘍及び同腹NeuT MMTVCre+ RANK+/Δ雌由来の胸部癌のサザンブロットにより、腫瘍におけるRANK欠失を評価した。
NeuT RANKΔmam雌における腫瘍形成。(a)〜(c)、対照及びNeuT RANKΔmam雌マウスで検出された典型的な腺癌の組織切片を示す。6月齢の雌の乳腺における、サイトケラチン5(a)、サイトケラチン14(b)、及びEカドヘリン(c)、染色が示される。NeuTを発現しない(NeuT-)同腹RANKΔmam雌由来の乳腺を対照として示す。(d)、偽処理又はMPA処理未産マウスから単離した胸部上皮細胞(MEC)、MPA駆動胸部腺癌、及びNeuT、Pym、Neu、及びNeu/TGFβトランスジェニックマウス由来の胸部腫瘍における、RANKL mRNA発現を示す。RANKL mRNAは、qRT-PCRにより判定された。データは、偽処理群に対する倍数変化として示す(+/- sem)。群あたりn=3である。(e)、様々な遺伝的マウスモデルから単離した様々な腫瘍、並びに対照RANKΔ/+及びRANKΔmam雌のMPA駆動腫瘍におけるRANKLタンパク質発現を示す。組換えマウスsRANKLタンパク質は、分子量の比較のために示される。βアクチンは、ローディング対照として示される。
MECにおけるRANKL/RANK下流シグナリング。(a)、妊娠中の泌乳乳腺のRANKL-RANK誘導形成をコントロールする遺伝的に確認されたシグナリング経路の概要を示す。(b)、RANKL刺激(1μg/ml)に応答した単離初代マウス乳腺上皮細胞における、リン酸化(P)AKT、全AKT、リン酸化(P)ERK1/2、リン酸化(P)p38-MAPK、及びp38-MAPKのウエスタンブロッティングを示す。データは4回の実験の代表である。
MPAは、RANKL/RANK NFκB経路を活性化し、サイクリンD1発現を引き起こす。(a)、MPAによるNFκB経路の活性化及びサイクリンD1発現を示す。未産RANKΔmam及び同腹対照の雌に、徐放型MPAペレットを皮下移植し、又は偽手術した。(a)、MPA処理3日後のRANKΔmam及び同腹対照の雌の胸部上皮細胞のリン酸化(P)IκBαを検出するためのIn situ免疫染色を示す。(b)、 MPA処理3日後のRANKΔmam及び同腹対照の雌の単離された胸部上皮細胞におけるサイクリンD1及びRANKLのウエスタンブロット解析を示す。組換えマウスsRANKLタンパク質を分子サイズ比較のために示す。βアクチンは、ローディング対照として示す。
RANKL/RANK下流シグナリング経路。RANKL刺激(1μg/ml)に応答したSKBR3乳癌細胞におけるリン酸化(P) p65 NFκB、全p65 NFκB、リン酸化(P) IκBα、全IκBα、リン酸化(P) ERK1/2、全ERK1/2、リン酸化(P) p38-MAPK、及び p38-MAPKのウエスタンブロッティングを示す。データは3回の実験の代表である。(b)、通常の増殖培地(対照、10%SCS添加DMEM)、又はRANKLの存在下(1μg/ml)で培養されたSKBR3乳癌細胞の増殖曲線を示す。細胞の数は、3日間の生細胞カウント(トリパンブルー排出)により判定された。(c)、MPAペレット及びDMBAで処理したNFATc1Δmam (n=10)及び同齢同腹対照(n=16)雌における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示される。顕著な差は見られなかった。(d)、NFATc1Δmam及び同腹対照の雌の精製胸部上皮細胞(MEC)及びMPA駆動胸部腫瘍におけるNFATｃ1 mRNA発現の定量を示す。mRNAは、qRT-PCRにより判定された。データは、対照に対する倍数の変化として示される(+/- sem)。群あたりn=5である。* P < 0.05 (スチューデントt検定)。
RANKLは、γ放射線に応答したアポトーシスから初代マウス胸部上皮細胞及びヒトSKBR3乳癌細胞を保護する。(a)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)に応答した単離された初代マウス乳腺上皮細胞におけるγH2AX、リン酸化(P) Chk1、全Chk1, p53及びβアクチンについてのウエスタンブロット解析を示す。(b)、(c)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)後の、(b)胸部上皮細胞及び(c)SKBR3ヒト乳癌細胞をプロピジウムヨーダイド(PI)染色してFACSで解析した。データは、3回以上の実験の代表である。DNA量が<2nのアポトーシス細胞は、サブG1領域に見られる。サブG1(M1)、G1相(M2)、S/G2/M相(M3)及びDNA量が>4nのポリプロイド細胞のパーセンテージは、所定の時点で示される。
RANKLは、ドキソルビシンに応答したアポトーシスから初代マウス胸部上皮細胞及びヒトSKBR3乳癌細胞を保護する。(a)、(b)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下の遺伝子毒性剤ドキソルビシン(Dox、1μM)下でインキュベートした、(a)、胸部上皮細胞、及び(b)、SKBR3ヒト乳癌細胞のFACS解析を示す。データは、3回以上の実験の代表である。サブG1(M1)、G1相(M2)、S/G2/M相(M3)及びDNA量が>4nのポリプロイド細胞のパーセンテージは、ドキソルビシン処理後24時間及び36時間において評価される。(c)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)後6時間における、Bim、Puma及びNoxaプロアポトーシス遺伝子のmRNA発現を示す。データは、対照に対する倍数の変化として示される(+/- sem)。 n=3、* P < 0.05; ** P < 0.005(スチューデントt検定)。
IKKαは、放射線誘導上皮アポトーシスからのMPA誘導保護を媒介する。(a)、(b)、IKKαΔmam雌におけるγ放射線に対する胸部上皮細胞のアポトーシスの誘導の低下を示す。同腹対照及びIKKαΔmam雌を、MPAペレット皮下移植又は偽手術に供し、そしてγ放射線(5Gray)を照射した。MPAペレットは、γ放射線照射の3日前に移植された。照射24時間後、活性カスパーゼ3の免疫染色によりアポトーシスが検出された。(a)、乳腺切片において、上皮細胞にアポトーシス核が認められる(矢印)。倍率はx40である。(b)、胸部上皮アポトーシスの定量を示す。各マウスにおいて5000個以上の核がカウントされた。結果は、平均値+/- semとして示される。群あたりのマウスはn=3である。* P < 0.05(スチューデントt検定)。
ウエスタンブロットの定量。実験あたり3つ以上の独立したウエスタンブロットについてデンシトメトリーが実施された。データは、図1b、図1c、図3a、及び図3bのウエスタンブロットにおいて示される。所望のタンパク質の発現量は、βアクチンローディング対照を用いて補正された。リン酸化データの定量は、各全タンパク質のバントを用いて補正された。* P <0.05; ** P < 0.001(スチューデントt検定)。
実施例１：マウス
Rankfloxedマウスが最近作製された。要するに、Rank遺伝子座を有しないマウスを作製するために、rankfloxedマウスが、βアクチンCreユビキタスデリーターマウスと交配させられた。rankfloxed又はrankΔ遺伝子座を有するマウス及びMMTV-CreマウスをBALBｃバックグラウンド上に7回バッククロスした後、MMTV-Cre rankΔ/floxedが作製された。MMTV-NeuTマウスは、Guido Forni, Milanから提供して頂いた。MMTV-Cre (stock # 003553) 及びMx-Creマウス(stock # 003556)はJackson Laboratoryから取得された。K5-Cre、IKKαfloxed及びNFATc1floxedマウスは、既に記載されている(2〜4)。マウスの遺伝型は、PCR及びサザンブロット解析により判定された。全ての実験において、同一のブリーディングからの同腹マウスのみが使用された。全てのマウスは、制度的ガイドラインに従い交配及び維持された。
腫瘍におけるRANKの欠失及びCreの効果
RankΔmam雌で発生した腫瘍のサザンブロットは、RANKの欠失を示し、いくつかの残りの野生型のバンドが観察された(図10c)が、これは、他の細胞腫及び又はエスケーパー細胞の存在により説明され得る。Cre陰性対照の雌及びMMTV-Creトランス遺伝子を発現する同腹において腫瘍発生の差は見られず、これは、Creの発現が、MPA/DMBA胸部腫瘍モデルで腫瘍の発生率に影響しないことを示唆する(図10d)。
実施例２：MPA/DMA誘導胸部癌形成
MPA/DMBA処理は、公知のように実施された(５，６)。要するに、6週齢マウスをケタミンキシラジンで麻酔し、徐放型Medroxyprogesterone Acetat (MPA)ペレット(50mg、90日放出；Innovative Research of America)を右脇腹に皮下移植した。図2aに概説したように、その後8週間に6回、200μlのDMBA(コットンシード油に希釈5mg/ml)を経口投与した。胸部腫瘍の発生は、触診により判断した。Cre陰性対照の雌及びMMTV-Creトランス遺伝子を発現する同腹において腫瘍発生に差は見られず、これは、Creの発現自体はMPA/DMBA胸部腫瘍モデルにおいて腫瘍の発生に影響しないことを示唆する。
実施例３：胸部組織移植
移植実験のために、未産3週齢ドナーから胸部上皮組織を切り出し、公知のように(7)、それを3週齢ホストnu/nuマウスの胸部脂肪体に移植した。手術の3週間後、ホストをつがわせ、胸部組織を解析のために切り出した。
実施例４：組織学、ホールマウント及び免疫組織化学
組織学的解析のために、5μm切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。乳腺のホールマウント染色は、公知のように実施された(8)。イムノペルオキシダーゼ染色のため、パラフィン包埋切片を脱水し、抗原エピトープを10mMクエン酸緩衝剤又は超音波を使用して露出させた。切片を、サイトケラチン5、サイトケラチン14、Eカドヘリン、抗Ki67(Novocastra)及び抗活性カスパーゼ3(Cell Signalling)に対する抗体とインキュベーションし、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で可視化した。組織形態的指標(増殖及びアポトーシス)は、陽性上皮細胞数を全上皮細胞数で割って算出され、Ki67染色では核の数は1000個以上で、活性カスパーゼ3染色では5000個以上であった。
実施例５：ウエスタンブロット
ヒト乳癌細胞株SKBR3及び初代非形質転換マウス胸部上皮細胞を、組み換えマウスRANKLref. 9で刺激し、又はしなかった。腺癌を対照及び突然変異マウスから単離し、タンパク質ライゼートを調製した。ウエスタンブロットを、標準的なプロトコルを使用して実施した。要するに、ブロットを1xTBS 0.1% Tween-20 (TBST)中5%BSAで１時間ブロッキングし、一次抗体(説明書に従いTBSTで希釈した)で一昼夜4℃でインキュベートした。マウスRANKL (AF462; R&D), Cyclin D1 (Santa Cruz #Sc-8396), β-アクチン(Sigma), リン酸化(P) NFκB (#3033), NF-κB (#4767), リン酸化(P) IκBα (#2859), IκBα (#4814), リン酸化(P) IKKα (#2681), IKKα (#2678), IKKβ (#2678), IKKγ (#2685), リン酸化(P) Akt (#3787), Akt (#9272), リン酸化(P) Erk1/2 (#9101), Erk1/2 (#9102), 及び p38-MAPK (#9212), p53 (#2524), リン酸化(P) Chk1 (#2348), Chk1 (#2345) (全て Cell Signaling), p38-MAPK (AF869; R&D), 及びγH2Ax (Ser139 #07-164 Millipore)に反応する一次抗体を使用した。ブロットをTBSTで30分間3回洗浄し、HRPコンジュゲート二次抗体(1：2000、Promega)で1時間室温でインキュベートし、TBSTで30分間3回洗浄し、ECLで可視化した。
実施例6：qRT-PCR
腫瘍の全RNAを、説明書に従い、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用して調製した。全RNA(2μg)は、定量的(q)RT-PCR解析に供した。以下のプライマーが使用された。
β-アクチン順プライマー: 5’- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3’;
β-アクチン逆プライマー: 5’-CCTGAACCCTAAGGCCAACCG -3’.
RANKL 順プライマー: 5’ - CTGAGGCCCAGCCATTTG -3’
RANKL 逆プライマー: 5’ - GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG -3’
RANK 順プライマー: 5’ - CTTGGACACCTGGAATGAAG -3’
RANK 逆プライマー: 5’ - CAGCACTCGCAGTCTGAGTT -3’
CyclinD1 順プライマー: 5’ - CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA-3’
CyclinD1 逆プライマー: 5’ - GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG-3’
p21 (Cdkn1a) 順プライマー: 5’ - GTGGCCTTGTCGCTGTCTT -3’
p21 (Cdkn1a) 逆プライマー: 5’ - GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG -3’
tRANKL 順プライマー: 5’ - GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC-3’
RANKL1 順プライマー: 5’ - GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC-3’
RANKL2 順プライマー: 5’ - TGCGCACTCCGGCGTCCCG-3’
RANKL3 順プライマー: 5’ - CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG-3’
RANKLcom. 逆プライマー: 5’ - TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3’
Puma 順プライマー: 5’ -CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT -3’
Puma 逆プライマー: 5’ -CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC -3’
Noxa 順プライマー: 5’ -ACTTTGTCTCCAATCCTCCG -3’
Noxa 逆プライマー: 5’ - GTGCACCGGACATAACTGTG-3’
Bim 順プライマー: 5’ - GTTGAACTCGTCTCCGATCC-3’
Bim 逆プライマー 5’ - GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3’
実施例７：DNAダメージ応答
細胞周期のアレスト及びアポトーシスの測定のために、マウス胸部上皮細胞及びSKBR3ヒト乳癌細胞を6ウェルプレートに100000細胞／ウェルの細胞密度で播種し、そして24時間培養した。これらの細胞を、組換えRANKL(1μg/ml)の存在下又は非存在下、ドキソルビシン(1μM)又はγ放射線(2Gray)で処理した。細胞周期のアレスト及び死細胞の数は、プロビジウムヨーダイド染色を使用して判定された。インビトロで乳腺上皮細胞死を判定するため、対照及びRANKΔmam同腹雌を、合計の線量5Gray(Gy)でγ放射線処理した。6時間後、乳腺を単離して、アポトーシスの指標である活性カスパーゼ3で免疫染色した(Cell Signaling)。
実施例8：初代胸部上皮細胞のFACS解析
胸部上皮サブ集団のＦＡＣＳ解析のために、以下の組織分解プロトコルを使用して、単細胞懸濁液を作成した。鼠蹊部の両方の脂肪体からリンパ節を取り除き、脂肪体を、50ｍｌファルコンチューブ中の2ｍｌの完全Ｅｐｉｃｕｌｔ培地(EpiCult-B増殖サプリメント、10ng/ml bFGF (SCT Catalog #02634), 10 ng/ml EGF (SCT Catalog #02633), 4μg/mlヘパリン(SCT Catalog #07980), 2.5ml FBS (5%)及び抗生物質を添加したＥｐｉＣｕｌｔ−Ｂ基本培地(StemCell Technologies SCT Catalog #05610))に2.5xコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ(例えばマウスあたり500μl 10xコラゲナーゼ+ 1.5ml Epicult) (SCT Catalog #07912)を加えたものの中で、37℃で2.5時間消化した。強く撹拌した後、ペレットを10mLのHF培地(Hanks Balanced Salt Solution Modified SCT Catalog #07913 + 2% FBS)で洗浄した。そして、ペレットを、予め温めておいたトリプシン‐EDTA2ml中に再懸濁した。もう一度10mlのHFで洗浄した後、ペットを予め温めておいた(37℃)2mlのディスパーゼに200μlの1 mg/mL DNAse I (SCT Catalog #07900)を添加したものの中で再懸濁した。HFによる最後の洗浄の後、細胞をカウントし、FACS染色用に調製した。100万個の細胞を、以下の抗体でインキュベーションした。内皮細胞をラベルするビオチンコンジュゲート抗CD31 (#553371; BD)、及び造血系細胞をラベルするビオチン化CD45+及びTer119+ (StemSepマウスキメラカクテル#13058C; Stem Cell Technologies; 3.5μl/100ul vol)、室温、10分間。造血及び内皮細胞は、ストレプトアビジンコンジュゲートAPC (#554067; BD)を使用するFACSにより排除された。抗CD49f (#551129; BD) 及びCD24 (#553261; BD)による染色は、公知のように（10、11）、胸部幹細胞集団を同定するのに使用された。
実施例9：癌幹細胞アッセイ
胸部癌幹細胞、即ち腫瘍出発細胞（TIC）の自己新生は、公知のように(6、12)、マンモスフィアアッセイを使用してアッセイされた。要するに、同程度のサイズ(1cm3)の腫瘍をすりつぶし、2.5xコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ(SCT Catalog #07912)を添加した完全EpiCult培地中で消化した。そして、2x105個の細胞を、6ウェル超低接着プレート(Corning Costar)中で、B27 (Invitrogen), 20ng/ml EGF (Protech), 及び20 ng/ml bFGF (Sigma)を添加した無血清EpiCult培地中で培養した。7日間の培養で形成された初代マンモスフィアを穏やかな遠心分離(800rpm)で回収し、トリプシンを用いて(0.05%、10分)消化して単細胞の懸濁物とし、そして上記のように、それらの二次マンモスフィアを形成する能力をアッセイした。
実施例１０：接着依存的増殖
ソフトアガー中の細胞の増殖能力を、公知のようにアッセイした(13)。要するに、DNAグレードアガロース(DMEM中1%)を底層として使用し(6ウェルプレート中に2ml)、1.5mlアガロース(DMEM中0.3%)中に2x104個のSKBR3細胞を播種した。細胞は、10%FCSを添加した1.5mlDMEMで重層され、24日間培養された。
実施例１１：プロゲステロンアッセイ
・第１のインキュベーション：ビオチン化モノクローナルプロゲステロン特異的抗体及びルテニウム複合体でラベルされたプロゲステロン誘導体の存在下、30μlの試料を、ダナゾールとインキュベーションして、プロゲステロンを放出させた。試料由来のプロゲステロンは、抗体結合部位において、ラベルされたプロゲステロンと競合する。
・第２のインキュベーション:ストレプトアビジン被覆微小粒子を添加した後、前記複合体は、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用により固相に結合する。固相に結合したラベルされたプロゲステロン誘導体の量は、試料のプロゲステロン量と反比例する。
・当該反応混合物を測定セルに充填する。当該セル中で、前記微小粒子は、電極表面に磁気的に捕捉される。未結合の基質は、ProCellで除去される。電極に電圧をかけると、光電子増倍管により測定される化学発光放射を誘導する。
・結果は、2点キャリブレーションにより装置特異的に作成されるキャリブレーション曲線及び試薬バーコードにより提供されるマスター曲線により判定される。
試薬 ワーキング溶液
M ストレプトアビジン被覆微小粒子(透明キャップ)、1ボトル、6.5ml：ストレプトアビジン被覆微小粒子、0.72mg/mL；保存料。
R1 抗プロゲステロンAb~ビオチン(灰色キャップ)、１ボトル、10ml：ビオチン化モノクローナル抗プロゲステロン抗体(マウス)0.15mg/L、リン酸緩衝剤25mmol/L, pH7.0; 保存料。
R2 プロゲステロン-ペプチド~Ru(bpy)2+ (黒色キャップ)、１ボトル、8ml：プロゲステロン(植物起源)とルテニウム複合体との会合、10ng/ml; リン酸緩衝剤25mmol/L, pH7.0; 保存料。
実施例12：統計
本明細書中の全ての値は、平均semとして表される。群間の比較は、スチューデントt検定により行われた。腫瘍発生のKaplan-Meier解析において、ログランク検定が実施された。P 0.05は、統計的に顕著なものとして受け入れられた。ログランク検定に加えて、post-hoc power解析が実施され ((PS Power and Sample Size Calculations、 biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize)、実験動物の数あたり等しい腫瘍発生回数の帰無仮説を正しく否定する可能性を計算した。RANKΔmam動物を含む試験において、帰無仮説は、0,933の確率(パワー)で否定され、IKKαΔmam動物の場合は0.766である。この帰無仮説の試験に関連するI型誤差確率は0.05である。ヒトデータは、ペアt検定、Mann Whitney U検定又はSpearmanランク検定を使用して解析された。
実施例１３：RANKLレベルに対するプロゲスチンの効果
雌のマウスにMPA(酢酸メドロキシプロゲステロン、代表的なプロゲスチン)ペレットを移植して、RANK発現を試験した。MPA処理は、単離された胸部上皮細胞においてRANKL mRNAの2000倍以上の誘導をもたらした(図1a)。RANKLのデコイ受容体オステオプロゲステリン(OPG)、PTHｒP(RANKLを誘導する)、及びTRAIL(OPGと結合する)は、単離された胸部上皮細胞のRANK mRNA発現を変化させなかった。免疫組織化学により、乳腺におけるRANKLタンパク質の誘導が確認された(図1b)。単離された胸部上皮細胞のウエスタンブロッティングも、RANKLの19kDa可溶性形態の誘導を示し(図5a)、これは、選択的スプライシング (図5b〜d)、及び細胞表面からRANKLを刈り取る2つのプロテアーゼMMP14及びADAM17/TACEの誘導(図5e)による可能性が最も高い。インビトロ細胞培養アッセイにおけるMPAに応答するRANKL誘導は観察されず(図6a-c)、これは、プロゲスチン自体はRANKL発現を誘導するのに不十分であることを示す。MPAは乳癌細胞のプロラクチン受容体及びプロラクチンの転写を誘導し、プロラクチンはJak2/Stat5シグナリングを介してRANKLを直接誘導するため、MPAがプロラクチン受容体ノックアウトマウスの乳腺においてRANKLを誘導するか否かが試験された。MPAは雌対照マウスにおいてRANKLタンパク質の実質的な生産を引き起こすが、我々は、プロラクチン受容体突然変異におけるRANKL誘導を検出し得なかった(図1c)。このデータは、MPAが、プロラクチン受容体を介して乳腺におけるRANKL発現を引き起こすこと、及び／又はプロラクチン及びMPAがRANKL誘導において協調していることを示唆する。
実施例１４：RANKL/RANK機能不全マウスにおけるRANKLレベルに対するプロゲスチンの効果
MPA媒介腫瘍形成におけるRANKL/RANKの役割を試験するため、K5-Cre及びMMTV-Cre媒介RANK遺伝子座除去を使用して、胸部上皮細胞においてRANKを除去した(K5-Cre rankflox/Δ マウス及びMMTV-Cre rankflox/Δ マウス)。いずれのマウスも健康に見え、骨構造やリンパ節形成も正常であった。予想通り、K5-Cre rankflox/Δマウスは、成熟期に正常に見える乳腺を呈したが、これらのマウスは、母乳を分泌する小葉腺胞構造が妊娠中に発達しなかった(図7a, b)。これらの効果は、移植実験を使用した細胞自律的であった(図7c)。MMTV-Cre rankflox/Δマウスにおいて、未産雌における乳腺の発達及び妊娠期の母乳を分泌する小葉腺胞構造の形成は、正常に見えた(図8a-c)。正常の生理学における幾つかの細胞集団に影響し得るK5-Cre rankflox/Δマウスにおける発生の効果の問題を排除するため、MMTV-Cre rankflox/Δマウスは、全ての更なる実験に使用された。これらのMMTV-Cre rankflox/Δ突然変異マウスは、以後RANKΔmamと表記する。
実施例１５：プロゲスチン投与によるRANKL活性化のメカニズム
野生型の集団において、MPA処理は、胸部上皮細胞の増殖を引き起こす。MPAが誘導する胸部上皮細胞の増殖は、RANKΔmam雌において顕著に低下した(図1d、図9a〜c)。故に、未産雌へのRANKL腹腔内注射は、RANKを介した乳腺上皮細胞の増殖を引き起こした(図9a、e)。最近、内生的プロゲステロンは、妊娠期(15)及び発情周期(16)におけるLin-CD24+CD49fhi幹細胞の数に影響することが報告された。いずれの研究も、系は、インビボ完全抗体ブロッキング試験及びRT−PCR発現に基づいて暗示されたが、これが二次的な効果ではなく哺乳類上皮細胞におけるRANKL-RANKの直接の効果であるか否かはわからなかった。故に、MPA等のプロゲスチンもLin-CD24+CD49fhi細胞を増幅できるか否かをアッセイした。MPA処理は、Lin-CD24+CD49fhi細胞を2倍増幅した。そのような増幅は、MPA処理したRANKΔmam雌では起こらなかった(図1e、f)。これらのデータは、RANKL/RANK系がLin-CD24+CD49fhi細胞の増幅をコントロールするという最初の遺伝的な証明を提供する。
図１６：対照及びRANKL/RANK欠損マウスにおける、RANK/RANKLを介した癌発生に対するプロゲスチンの影響
Women's Health Initiative (WHI)及びMillion Women Studyにおいて、プロゲスチンは、乳癌の発生と疫学的に関連していた。プロゲスチン駆動乳癌は、雌マウスでモデル化されており、DNAダメージ薬剤ジメチルベンズアントラセン(DMBA)の存在下、徐放型MPAペレットの移植は胸部癌を引き起こす(図2a、図10a、b)。
対照雌において、MPA/DMBA処理は、触診可能な乳癌の急速な発生を誘導した。興味深いことに、RANKΔmam雌マウスにおいて、MPA/DMBA誘導胸部癌の発生に顕著な遅延が観察された(図2b、図10c、d)。RANKΔmam雌における腫瘍発生の遅延は、生存率の顕著な向上も引き起こした(図10e)。RANKΔmam雌で発生した腫瘍のサザンブロッティングにおいて、RANKの欠失が確認された(図10c)。対照及びRANKΔmam雌で発生した全ての腫瘍は、サイトケラチン(CK)５及びCK14陽性基底細胞サブタイプのE-カドヘリン発現管腺癌の典型的な組織病理を示した(図2c、図11a、b)。しかしながら、RANKΔmam雌で生じた管腺癌は、扁平新生物の発展領域を頻繁に発生させた(図2c、図11a、b)。これらの組織病理的変化と同様に、対照及びRANKΔmam雌の胸部腺癌の遺伝子発現プロフィールは、遺伝子クラスタリングにより評価されるように、分子署名の区別できる相違を示した。
実施例１７：プロゲスチン試行及びDNAダメージの後の癌の発生
RANKΔmamがプロゲスチン誘導胸部癌の発生の遅延を示したので、今度は、MPA/DMBA試行後早期の胸部腫瘍の発生を解析した。最後のDMBA処理の1週間後、全てのRANK発現対照雌は、既に、複数のIn situ腺癌を呈しており、浸潤性の胸部腫瘍もあった。対照的に、RANKΔmam動物は、最後のDMAB試行の1週間後、In situで観察された癌は非常に僅かで、浸潤性の胸部癌は認められなかった(図2d)。最後のDMBA試行から3週間後、In situの癌の発生は、対照とRANKΔmam雌の間で同等であったが、浸潤性の癌は、尚もRANKΔmam雌では非常に低頻度であった(図2a)。更に、増殖はRANKΔmam雌の癌において顕著に低下した(図2d、e)。肝臓、心臓、筋肉及び増殖期間を含む複数の他の組織においてRANKの欠失が見られたが、胸部上皮細胞では見られず、Mx-Cre rankflox/floxマウスの使用は、MPA/DMBA誘導胸部癌の発生を遅延しなかった(図12a〜c)。これは、RANK/RANKL機能不全の効果が、胸部上皮細胞に限定されることを示唆する。更に、乳癌の遺伝的モデルであるMMTV-NeuT トランスジェニックマウスにおいて、RANKの乳腺特異的欠失は、胸部癌の発生(図12d、e)又は腺癌の組織病理学(図13a〜c)を変化させなかった。故に、胸部上皮細胞におけるRANKの遺伝的不活性化は、プロゲスチン駆動胸部癌の発生の顕著な減少及び遅延を引き起こす。
実施例１８：RANKLシグナリング
胸部上皮細胞におけるIKKα-NFκB-CyclinD1を介したRANKL-RANKシグナリングは、図14aに示されている。RANKL刺激は、実際に、初代マウス乳腺上皮細胞(MEC)におけるNFκB及びIκBαのリン酸化を引き起こした(図3a)。加えて、MECのRANKL刺激は、p38−MAPK及びERKのリン酸化を引き起こした(図14b)。RANKがインビボでプロゲステロンの下流のNFκB-CyclinD1活性化を仲介するか否かを直接示すため、マウスをMPAで処理した。MPA処理の3日後、核へのリン酸化IκBαの蓄積が見られ、これは、活性NFκB経路の指標であり、また、胸部上皮細胞におけるサイクリンD1タンパク質の発現が誘導された。これらのいずれも、RANKΔmam雌では著しく低下した(図15a、b)。更に、対照及びRANKΔmam雌から単離したMPA/DMBA誘導哺乳類腺癌において、我々は、NFκB経路の阻害(図3b)及びサイクリンD1のmRNA発現の下方制御(図3c)を見出した。これらの初代腫瘍において、Id2経路により転写的に抑制される遺伝子であるp21mRNAの上方制御(図3c)も観察された(17)。Id２経路は、胸部上皮細胞においてRANKL/RANKの下流の経路であることが確認されている(17)。これらの知見をヒトに拡張するために、ヒトSKBR3乳癌細胞株がアッセイされた。RANKL刺激は、NFκB、p38-MAPK及び ERK活性化、並びにSKBR3細胞の増殖を誘導した(図16a、b)。更にRANKL刺激の効果を試験するために、インビボでの腫瘍形成に関連するこれらの細胞の接着非依存的な増殖能力をアッセイした(18)。重要なことに、EGFR刺激と類似して、RANKLに誘導されたSKBR3細胞のソフトアガー中の増殖(図3d)は、RANKシグナリングが増殖を引き起こすだけでなく、接着非依存的増殖を誘導する形質転換因子としても振る舞うことを示す。
破骨細胞において、NFκB経路を除いて、カルシニューリン-NFATｃ1シグナリング経路は、RANKL-RANK仲介破骨細胞形成に必須であることが見出された。NFATｃ１は、RANKL仲介破骨細胞形成の過程で、Id2経路によっても制御される。これらの重要なRANKL-RANK活性化経路がMPA/DMBA誘導胸部癌においても操作可能であるか評価するため、MMTV-Cre nfatc1flox/Δ(NFATc1Δmam)及び MMTV-Cre Ikkαflox/flox (IKKαΔmam)マウスを作製して、胸部上皮細胞においてNFATｃ１及びIKKαを欠失させた。いずれの突然変異マウスも健康に見え、アッセイされたいずれの期間においても機能不全を示さなかった。MPA/DMBAによる試行において、IKKαΔmamマウスは、胸部癌の発生の遅延を示した(図3e)。IKKαΔmamマウス由来の腫瘍において、IKKβ及びIKKγの正常な発現は見られたが、NFκBの活性化は低下しており、IκBタンパク質レベルは増大し、p65 NFκBリン酸化は減少し(図3b)、そしてNFκB標的遺伝子のサイクリンD1の発現が下方制御された(図3C)。これは、IKKαが、実際に、これらの癌において、NFκBシグナリングに必要であることを示唆する。予想された通り、Id２経路遺伝子のp21は、IKKαΔmamマウス由来の腫瘍に影響しなかった(図3c)。対照及びNFATc1Δmamマウスの間で、腫瘍発生における顕著な差は見られなかった(図16c、d)。これは、下流のシグナリングの必要性が、破骨細胞前駆体及び乳腺上皮細胞の間で異なることを示唆する。故に、乳腺上皮細胞において、NFATｃ１でなくIKKαの欠失が、プロゲスチン駆動乳癌の発生に影響する。
実施例１９：DNAダメージによるホルモン駆動癌発生
MPA処理は胸部上皮細胞の迅速かつ強力な増殖を誘導するが、MPA単独は、DNA突然変異を誘導する発がん物質を必要とする胸部癌を引き起こすのに充分でない。細胞周期アレストやアポトーシス等のDNAダメージに対する細胞応答におけるRANKLの役割を解析するため、マウス初代胸部上皮細胞(MEC)及びRANKL応答ヒト乳癌細胞株SKBR3を、DNA損傷剤ドキソルビシン又はγ放射線により処理した。RANKL処理は、機能的DNAダメージ応答の古典的なマーカーであるγH2AX 及びp53 の誘導又はChk1の活性化のいずれも引き起こさなかった(図17a)。更に、RANKLは、γ放射線(図17b、c)又はドキソルビシン(図18ａ、ｂ)によるDNAダメージ後の早期の細胞周期のアレストに影響しなかった。驚くべきことに、RANKL処理は、γ放射線(図17b、c)又はドキソルビシン(図18ａ、ｂ)が誘導したDNAダメージに応答した細胞死からの顕著な保護をもたらした。γ放射線が誘導するアポトーシス促進分子Bim、Puma及びNoxaの上方制御は、RANKLの存在下で起こらなかった(図18c)。インビボにおいて、雌マウスのγ放射線照射は、胸部上皮細胞のアポトーシスを5倍に誘導した(19)。故に、この公知のシステムが、γ放射線誘導細胞死に対するMPA-RANKL/RANKの効果を評価するのに使用された。MPA処理は、実際に、インビボで胸部上皮細胞をγ放射線誘導アポトーシスから保護した。胸部上皮細胞でのRANK発現の喪失は、MPAのγ放射線誘導細胞死に対する保護効果を無効にした(図3f、g)。更に、IKKα経路は、MPA誘導性のγ放射線後の胸部上皮の保護に関与していた(図19a、b)。故に、細胞周期の進行を促進するのに加え、MPAは、RANKL/RANK及びIKKαシグナリングを介して、DNAダメージ後の細胞死から細胞を保護できる。
実施例２０：腫瘍出発幹細胞
ヒト及びマウスにおいて、胸部腫瘍は、幹細胞集団から生じ得ることが示されている(20)。故に、RANKの喪失が、乳癌幹細胞、即ち腫瘍出発細胞(TIC)に影響するか否かを試験した。TICは、非接着性マンモスフィアを形成する能力により機能的に評価された(20)。対照及びRANKΔmam雌から単離した癌細胞は、初代マンモスフィアを形成できた。しかしながら、単一細胞に分散した細胞が二次マンモスフィアを形成する能力は、RANKΔmamマウス由来のTICにおいて、顕著に阻害された(図4a、b)これらのデータは、RANK活性又は発現の喪失が、癌幹細胞の自己新生能力を顕著に阻害することを示唆する。
実施例２１：考察
これらの結果に基づき、MPA等のホルモンがいかにしてRANKLを介して癌を駆動するかの分子メカニズムが明らかになった。MPAが、乳腺のRANKLの強力な誘導を引き起こす。かかるMPAに応答してのRANKLの誘導は、プロラクチン受容体及び恐らく他の中間物の発現を必要とする。胸部上皮細胞上のRANKを介したRANKLは、これらの細胞を細胞周期に移行させ、重要なことに、γ放射線を含むDNAダメージに応答するアポトーシスからマウス及びヒト胸部上皮細胞を保護する。更に、RANKL-/RANKは、乳癌幹細胞の自己新生及び接着非依存的増殖をコントロールする。故に、プロゲスチンが誘導したRANKL/RANKは、損傷を受けた胸部上皮に対して、乳癌が発生するのに重要な増殖及び生存の利点を提供する(21)。これらの効果は、少なくとも部分的に、IKKα-NFκBシグナリング経路を介して媒介される。
数百万人の女性が避妊及びホルモン補充治療においてプロゲステロン誘導体を服用している。そのようなホルモンは、乳癌発生のリスクの増大と疫学的に関連していた。本発明は、RANKL-RANK系が、プロゲスチン及び上皮癌形成の間の重要な分子的関連であることを示している。故に、RANKL阻害は、癌を予防及び／又は治療するための新しいアプローチである。また、RANKL阻害は、放射線又は他のDNA損傷薬剤等に基づく抗癌治療に対する癌細胞の感受性を強化するのにも使用され得る。
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21. Hanahan, D. & Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70 (2000).

Claims (22)

  1. 患者の原発性癌を予防する方法であり、患者に治療有効量のRANKL阻害剤を投与することを含む方法。
  2. 患者の原発性癌を治療する方法であり、原発性癌の起源の組織中の癌細胞を減少させるため、又は癌の進行を阻止するために、患者に治療有効量のRANKL阻害剤を投与することを含む方法。
  3. 癌細胞のアポトーシスを増大させる方法であり、癌細胞に治療有効量のRANKL阻害剤を投与することを含み、好ましくは当該癌細胞が原発性癌である方法。
  4. 前記癌が乳癌(breast cancer)又は前立腺癌である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記癌が、性ホルモン受容体、好ましくはプロゲステロン又はエストロゲン受容体を有する癌細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記癌がホルモン依存性癌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌、特にホルモン依存性癌の治療又は予防に使用される、RANKL阻害剤。
  8. ホルモン治療、好ましくはホルモン補充治療を受けていた、好ましくは当該ホルモンがプロゲステロン又はプロゲスチンであり、又はホルモン避妊を受けていた患者のホルモン依存性癌の治療又は予防に使用されるRANKL阻害剤。
  9. ホルモン治療、好ましくは性ホルモンのホルモン治療、特にホルモン補充治療と組み合わせて患者のホルモン依存性癌の治療又は予防に使用される、又はホルモン避妊と組み合わせて、特に癌発生のリスクを減少させるために使用される、RANKL阻害剤。
  10. 前記癌が、乳癌、胸部癌(mammary cancer)又は前立腺癌である、請求項７〜９のいずれか1項に記載の阻害剤。
  11. 前記癌が上皮細胞起源である、請求項７〜１０のいずれか1項に記載の阻害剤。
  12. 更なる抗癌治療、好ましくは放射線治療又は化学治療と組み合わせられる、又はそれらの効果を増大させる(priming)、請求項７〜１１のいずれか1項に記載の阻害剤。
  13. 原発癌を治療若しくは予防するための、又は癌の再発を治療又は予防するための、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の阻害剤。
  14. 前記ＲＡＮＫＬ阻害剤が、ＲＡＮＫＬ又はＲＡＮＫリガンド、好ましくは抗ＲＡＮＫＬ抗体、例えばＤｅｎｏｓｕｍａｂ、又はｓｉＲＮＡである、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の阻害剤。
  15. 前記癌が、胸腺組織細胞又は胸腺癌細胞、及び/又は上皮細胞又は基底細胞、及び/又は癌幹細胞から選択される癌性細胞を含む、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の阻害剤。
  16. ＲＡＮＫＬ阻害剤、及びエストロゲン、プロゲステロン若しくはプロゲスチンから選択されるホルモン若しくはその誘導体、又はホルモン避妊剤を含有する医薬組成物。
  17. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の治療に使用される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 更に、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料及び/又は助剤を含有する、請求項１６又は１７に記載の組成物。
  19. ホルモン治療に使用される、請求項１６又は１８に記載の組成物。
  20. 前記ホルモン治療が、避妊又はホルモン補充治療である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 化学治療剤及びＲＡＮＫＬ阻害剤を含有するキット。
  22. ＲＡＮＫＬ阻害剤、及びエストロゲン、プロゲステロン、又はプロゲスチンから選択されるホルモン又はその誘導体、又はホルモン避妊剤を含有するキット。
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