KR20130118870A

KR20130118870A - 유방암 치료제

Info

Publication number: KR20130118870A
Application number: KR1020137009817A
Authority: KR
Inventors: 조셉 페닝거; 다니엘 슈라멕
Original assignee: 아이엠비에이 - 인스티튜트 퓌어 몰레쿨라레 바이오테크놀로지 게엠베하
Priority date: 2010-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2013-10-30
Also published as: RU2013118325A; EP2618833B1; CN103384530A; JP2017039771A; CL2013000801A1; CA2811556A1; BR112013006673A2; AU2011306917B2; MX2013003076A; EP2618833A2; EP2433644A1; WO2012038504A2; AU2011306917A1; IL225442A0; US10143747B2; NZ608207A; US20190030161A1; JP6133778B2; US20130216550A1; JP2013542190A

Abstract

본 발명은 치료적 유효량의 RANKL 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

유방암 치료제{BREAST CANCER THERAPEUTICS}

본 발명은 암 치료제 분야에 관한 것이다.

문헌[ELLIS et al., Breast Cancer Research and Treatment, 118 (1) (2009): 81-87]은 항암제로 아로마타제 억제제를 이용하는 치료 동안에 유방암 환자에서 골밀도(bone mineral density)를 증가시키기 위한 데노수맵(Denosumab)의 투여를 기술한다.

문헌[TOMETSKO et al., Bone, 47 (2010): 325-326]은 골 전이에서 RANK/RANKL의 역할에 관한 것이다. RANKL은 결과적으로 종양 성장을 촉진하는, 파골세포 활성의 결정적인 매개자로 알려져 있다. 일부 유방암 및 전립선암 세포주는 RANK를 발현하여, 이에 따라 골 전이를 형성하는 능력을 갖는 것으로 기재되어 있다.

문헌[CANON et al., Bone, 40 (6) (2007):145, CANON et al., Europ. J. of Cancer, 4 (12) (2006): 166-167, CANON et al., Cancer Treatment Reviews, 34 (2008): 60, 및 TOMETSKO et al., J. Bone and Mineral Res., 21 (2006): 346 (Abstract)]은 암 골 전이의 종양 성장을 치료하기 위한 RANKL 억제제 OPG의 사용을 개시한다.

문헌[HOLLAND et al., Cancer Biology and Therapy, 9 (7) (2010): 539-550]은 유방암 골격 전이의 치료에서 RANKL 억제제(RANK-Fc) 단독 또는 아폽토시스-유도성 리간드(rhApo2L)의 병용 투여의 비교를 포함한다.

문헌[AKIYAMA et al., J. Pharmacy and Pharmacology, 62 (4) (2010): 470-476]은 골육종의 치료에서 RANK-Fc의 투여에 관한 것이다.

문헌[ZHANG et al., J. Clin. Invest., 107 (10) (2001): 1235-1244]은 시험관 내에서 골 전이성 전립선암 세포에 관한 것이다.

문헌[LEE et al., Bone, 48 (1) (2010): 88-95]은 전립선암의 골 전이에 관한 것이다. 이 문헌은 상이한 약학적 제제 및 전이성 전립선암의 영향을 조사하는 연구를 요약한다.

문헌[LEIBBRANDT et al., Europ. J. of Clin.Invest., 39 (10) (2009): 842-850]은 조골세포 및 파골세포에 대한 RANK, RANKL 및 OPG의 기능, 및 이들의 골 전이 형성과의 관련성에 대한 검토 문헌이다.

WO 99/53942는 심혈관 질환의 치료에서 OPG의 사용을 개시한다.

문헌[WU et al., J. Bone and Mineral Res., 20 (1) (2005): 107-116]은 파골세포의 Fas-매개된 아폽토시스의 조절자로서의 RANKL를 개시한다.

문헌[BHARTI et al., Apoptosis, 9 (6) (2004): 677-690]은 파골세포 전구체의 아폽토시스에서 RANK의 역할에 관한 것이다.

문헌[MOLYNEUX et al., J. Clin. Invest., 120 (9) (2010): 3310-3325]은 골육종 종양형성 동안에 RANKL 과발현을 유도할 수 있는 골 종양 저해 유전자로서의 Prkar1a에 대한 연구에 관한 것이다.

문헌[PARK et al., J. Korean Med. Sci., 18 (4) (2003): 541-546]은 유방암 골 전이에서 OPG 및 RANK의 역할에 대한 논의를 포함한다.

본 발명의 목적은 이러한 결점으로부터 방해받지 않는 대안적인 항암 요법을 제공하는 것이다.

NF-κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL, 또한 ODF, TRANCE, OPGL, TNFSF11로도 알려짐) 및 그의 수용체 RANK(TRANCE-R, TNFRSF11A)는 파골세포의 발달과 활성화에 필수적이다. RANKL 억제는 잠재적으로 수백만의 환자들에서 골 손실을 예방하는 것으로 입증되었다. RANK 및 RANKL은 클로닝되고 특성이 분석되었다(US 6,017,729, EP 0 873 998, EP 0 911 342, US 5,843,678, WO 98/46751, WO 98/54201). RANKL과 RANK 발현 모두 인간의 원발성 유방암 및 유방암 세포주에서 관찰되었으며 RANKL/RANK 시스템이 증식 또는 사멸 감수성에 영향을 주지 않으면서 상피성 종양의 골 전이를 조절할 수 있음이 제안되었다¹⁴.

US 2008/107597 및 WO 2010/022120 A1은 항-RANKL 항체 및 다수의 질환과 관련된 골 손실을 억제하기 위한 또는 "RANKL-관련 질환"의 치료를 위한 이의 사용을 기술한다.

WO 02/098362는 RANK 길항제를 이용한 비-고칼슘혈증 환자에서 암의 치료를 제안한다. 그러나, 어떠한 치료요법도 개발되지 않았고, 결국 이 환자 패밀리는 포기되었다.

골과 칼슘 물질대사 및 염증성 상태와 관련된 질환을 치료하기 위한 RANKL의 확립된 용도가 예컨대, WO 2007/128564에 기술된다.

유방암은 인간에서 가장 흔한 암 중 하나이며 미국 및 유럽에서 평균 8명 중 1명에 이르는 여성이 그의 일생을 통해 영향을 받을 것이다. 여성 건강 발의(Women's Health Initiative, WHI) 및 백만 여성 연구(Million Women Study)에 따르면, 호르몬 대체 요법(HRT)이 우발적이고 치명적인 유방암 발생의 증가된 위험과 관련이 있는 것으로 나타났다. 특히 HRT 및 피임법을 위해 수백만의 여성이 사용한 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA)와 같은 합성 프로게스테론 유도체(프로게스틴)는 유방암 발생의 위험을 현저하게 증가시킨다.

에스트로겐 뿐만 아니라 그의 합성 유도체(프로게스틴)를 포함하는 프로게스테론은 폐경후 여성에서 폐경기 증후군을 경감시키기 위해 호르몬 대체 요법(HRT)과 병용하여 사용된다. 에스트로겐 및 프로게스틴은 또한 호르몬 피임제로서 사용될 수 있다.

타목시펜(Tamoxifen)은 유방 조직에서 에스트로겐 수용체의 길항제이다. 이는 폐경기-후 여성에서 호르몬-양성인 초기 유방암에 대한 표준 내분비(항-에스트로겐) 치료요법이다. 이는 또한 에스트로겐 수용체를 차단함으로써 호르몬 대체 요법을 억제할 것이다.

본 출원 명세서의 목적은 암을 예방 또는 치료하기 위한 치료 방법 및 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 암에서 RANKL의 특이적 역할 및 치료 또는 예방을 목적으로 암 관련된 RANKL 기전을 방해하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. RANKL가 DNA 손상에 의해 유도된 이러한 돌연변이 후 세포 사멸을 예방하기 때문에, 발암성(cancerogenous) 돌연변이로부터 세포를 보호하는데 관여하는 것으로 밝혀졌다.형질전환시키는 돌연변이에도 불구한 세포의 생존은 암 세포의 하나의 핵심 성질이다. 이 활성에서 새로 밝혀진 RANKL의 역할은 RANKL의 활성 억제가 암 발생 및 진행을 치료하고 예방하는 것을 가능하게 한다. 용골세포 및 조골세포에 대한 영향으로 인해 골 전이 형성 동안에 RANKL이 관여함이 알려져 있었다고 하더라도, RANKL가 암 세포 형성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있음은 알려져 있지 않았다.

본 발명은 특히 전이성 암 세포 뿐만 아니라 원발성 종양의 예방 또는 치료에 있어 활성 제제로서 RANKL 억제제를 사용하는 암 요법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 암 요법은 환자의 신체에서 암 세포의 감소로서 또는 질환의 추가적인 진행을 적어도 예방하는 것으로 이해되어 진다. RANKL 억제제는 예를 들면, US 2008/107597, WO 2010/022120 A1, US 6,740,522, US 7,411,050, EP 2003203 A1로부터 널리 알려진 항체, 또는 US 2004/167072에 개시된 폴리펩티드 억제제를 포함한다. 임의의 이들 기존의 RANKL 억제제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

도 :
도 1. 프로게스테론 유도체 MPA는 RANK를 통한 생체 내(in vivo) RANKL 유전자 발현 및 유방의 상피세포 증식을 촉발한다.
a,b, 프로게스테론-유도체 MPA에 의한 RANKL 발현의 유도. 무산부(nulliparous) 야생형 암컷(females)은 서방형 MPA 펠렛을 피하 조직에 이식하거나, 모의 수술로 처리하였다. a. RANKL mRNA를 이식 3일 후 qRT-PCR에 의해 정제된 유방의 상피세포에서 측정했다. 데이터는 모의 처리와 비교하여 배수 변화로 나타냈다(+/- sem)(n=3). b, MPA 처리 3일 후 유방 상피세포에서 프로게스틴 수용기(PR, 빨간색)와 RANKL(초록색)의 Ki67의 인시츄(in situ) 면역염색. c, MPA의 피하조직 이식 후 3일째에서 프로락틴(prolactin) 수용기 돌연변이 KO 암컷에서가 아닌, 대조군으로부터 분리한 유선 상피세포에서 분석된 가용성 RANKL 단백질의 유도. 모의 수술한 대조군 한 배 새끼와 PRL-R KO 암컷으부터의 유선을 대조군으로 보여준다. d, 모의 처리와 MPA 이식 후 3일 된 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷의 유선에서 상피의 증식. Ki67의 인 시츄(in situ) 면역염색에 의해 증식을 결정하였다. e,f, RANK^△ ^mam 유선이 아닌, 대조군의 MPA 처리한 유선에서 줄기세포가 풍부한 CD24⁺CD49^high 집단(MaSC)의 현저한 증가. e, MPA- 또는 모의 처리된 8주령 처녀 암컷으로부터의 유선 MaSCs의 혈통 음성(CD31^-(상피세포) CD45^-(조혈모세포) TER199^-(적혈구 세포))의 CD24와 CD49 발현을 보여주는 대표적인 FACS 프로파일. f, MPA- 또는 모의 처리 처녀 암컷 RANK^△ ^mam와 대조군 한 배 새끼의 유선으로부터의 MaSC가 풍부한 CD24⁺CD49^high 집단의 정량. 모든 MaSCs 실험에 대하여 생쥐를 3일 동안 MPA로 처리하였다. 그룹당 n=4 +/-sem. *P< 0.05; *** P<0.001 (스튜던트의 t-검정(Student's t-test)).
도 2. RANK는 프로게스틴(progestin)-유도 유선암(mammary cancer)의 발생율 및 발병을 조절한다.
a, MPA / DMBA 발암 계도(scheme). 무산부 6주령 암컷 생쥐의 피하조직 내에 MPA 펠렛을 이식하고, 표시된 대로 8주 동안 DMBA를 경구적으로 처리하였다. b, 도 2a에 표시된 대로 MMTV-Cre rank^floxed ^/△(RANK^△ ^mam) 암컷 (n=14) 및 MPA 펠렛과 DMBA로 처리된, 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷(n=19)에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후에 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타낸다. 종양 발병의 중간값은 대조군의 경우 마지막 DMBA 처리 후 11일이고, RANK^△ ^mam 암컷의 경우 DMBA 처리 후 30일이었다. c, 마지막 DMBA 처리 후 22일째의 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷으로부터 분리한 유선 종양의 대표적인 조직학적 절편. 사이토케라틴(Cytokeratin)5 염색을 보여준다. 배율 X20배. d, e, 마지막 DMBA 처리 후 7일째(d) 및 22일째(e)에 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷에서 상피 내 암종 및 침습성 유선암의 개수. 결과는 생쥐 당 평균값 +/- sem으로 나타내었다. 유전자형 당 생쥐 n=3. 각각의 생쥐에 대하여 모든 10개의 유선을 분석하였다. *P<0.05 (스튜던트의 t-검정). 하부 패널은 대조군 암컷에서 전형적인 침습성 선암이 있는 대표적인 조직학적 절편을 보여준다. RANK^△ ^mam 암컷의 경우, 정상적인 선포 형태(7일째)와 상피내 암종(22일째)이 나타났다. H&E 염색된 절편과 증식 마커인 Ki67의 면역염색을 보여준다. 배율 X20.
도 3. RANK는 NFkB 시그널링 및 부착-비의존적 성장을 유도하고, 방사선-유도 상피성 아폽토시스로부터 보호한다. a, RANKL 자극(1 ㎍/㎖)에 대하여 분리된 일차 생쥐 유선 상피세포(MECs)에서 인산화된(P) IKKα, 전체 IKKα, 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IκBα, 및 전체 IκBα에 대한 웨스턴 블럿팅. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. b, 대조군, RANK^△ ^mam, IKKα^△ ^mam 암컷에서 발달된 유선의 선암종 말기 단계의 풀(pool)에서 IKKα, IKKβ, IKKγ, 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IkBα 및 전체 IkBα에 대한 웨스턴 블럿팅 (각각의 레인에 대해 n=4). β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. c, 대조군, RANK^△ ^mam, IKKα^△ ^mam 암컷에서 발달한 말기 유선 선암종에서 RANK, 사이클린 D1, 및 p21 mRNA의 발현. 발현은 qRT-PCR로 결정하였다. 결과는 평균값 +/- sem이다. 그룹당 n=4. d, 반고형-한천(agar) 콜로니 형성 분석. RANKL (1㎍/㎖) 또는 EGF (100ng/ml)의 자극에 대하여 반고형-한천에서 인간 SKBR3 유방암 세포의 성장. RANKL의 배양에서, 부착-의존적인, 육안으로 보이는 콜로니가 18일 후에 형성되며, 이는 유인 수용체(decoy receptor)인 OPG (1㎍/㎖)에 의해 저해되었다. 대조군은 비자극된 SKBR3 세포였다. e, MPA 펠렛 및 DMBA로 처리한 IKKα^△ ^mam (n=10) 및 연령 맞춤 한 배 새끼 대조군(n=11) 암컷에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 대조군에 대한 종양 발현의 중간값은 마지막 DMBA 처리 후 10일이었으며, IKKα ^△ ^mam 암컷에 대해서는 24일이었다. f, g, 모의 수술을 하거나 MPA 펠렛을 이식한 대조군과 RANK ^△ ^mam 암컷 한 배 새끼에서 γ-방사선조사(5 Gray)는 유선 상피세포의 아폽토시스를 유도했다. 아폽토시스는 활성 케스파제-3(caspase-3)에 대한 면역염색에 의해 검출되었다. f, 대표적인 유선 절편에 대하여 상피세포의 아폽토시스 핵들(화살표들)이 나타났다. 배율 X40배. g, 유선 상피세포 아폽토시스의 정량. 각각의 생쥐에 대하여 최소한 5000개의 핵을 계수하였다. 보여준 결과는 평균값 +/- sem이다. n = 그룹 당 3마리. *P<0.05; **P<0.02 (스튜던트의 t-검정)
도 4. RNAK는 암 줄기세포의 자가 재생을 조절한다. a. 유선암 줄기세포, 즉 종양 개시 세포(TICs)의 자가 재생은 RANK 발현을 필요로 한다. MPA/DMBA 처리된 RANK^△ ^mam와 대조군 한 배 새끼 암컷 유래의 유선 종양세포를 7일 동안 배양하였고, 작은 비율의 일차세포는 맘모스피어(mammospheres)를 형성하였다 (제 1 계대). 일차 맘모스피어는 이후 단일 세포들로 소화 분해되었고, 이차 맘모스피어를 형성하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다 (제 2 계대). RANK^△ ^mam 암컷이 아닌 대조군 한 배 새끼로부터의 종양세포는 재플레이팅 후 7일째 결정된 이차 맘모스피어를 형성할 수 있었다. b, MPA / DMBA 처리된 RANK^△ ^mam과 대조군 한 배 새끼 암컷 유래의 제 1 및 제 2 계대(F1 및 F2) 맘모스피어의 정량. 보여준 결과는 평균값 +/- sem. n = 그룹 당 3마리. *P<0.05; **P<0.02 (스튜던트의 t-검정)
도 5. 프로게스테론-유도체 MPA는 생체 내 RANKL 발현을 유도한다.
a-d, 프로게스테론-유도체 MPA에 의한 RANKL 발현의 유도. 무산부 야생형 암컷의 피하조직에 서방성 MPA 펠렛을 이식하거나 모의 수술로 처리하였다. a, 막투과성(tm)과 가용성(s) RANKL 단백질의 발현을 MPA 펠렛 이식 또는 모의 수술 후 3일째와 6일째에 웨스턴 블럿팅에 의해 분리된 유선 상피세포에 대하여 분석하였다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 나타내었다. 재조합 쥐 sRANKL 및 재조합 인간 tmRANKL 단백질을 우측 패널에 분자 크기 비교를 위해 나타내었다. 결과는 검사된 8마리 동물을 대표한다. b, Ikeda 등으로부터 변형된 3가지 RANKL 아이소폼의 도식적인 묘사. RANKL1과 RANKL2의 막 투과 도메인이 표시된다(TM, 검은색 상자, 아미노산 48-71 범위). 전체 세포 내 도메인 뿐만 아니라 막 투과 도메인에 걸친 RANKL2는 세포 내 도메인의 아미노산 14-44가 결여된 반면에 RANKL3은 아미노산 1-118이 결여되어 있다. 숫자들은 아미노산 잔기를 표시한다. c, MPA 처리 3일 후 정제된 유선 상피세포에서 전체(t) RANKL, RANKL1, RANKL2, 및 RANKL3 mRNA의 발현. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. d, c에서와 같은 RT-PCR 산물들의 대표적인 아가로스 겔. e, 세포 표면으로부터 RANKL을 박리시키는(shed) 것으로 알려진 다양한 프로테아제의 mRNA 발현. mRNA를 MPA 이식 후 3일째에 qRT-PCR에 의해 정제된 유선 상피세포에서 결정하였다. 결과는 모의 처리와 비교하여 배수변화로 나타내었다. (+/- sem) (그룹당 n=3). * P< 0.05; ** P < 0.005; *** P < 0.001 (스튜던트의 t-검정).
도 6. MPA는 인간 유방 종양 세포주에서 RANKL 발현을 촉발하지 않는다. a, MPA(0.1μM) 자극 후 인간 유방암 세포 뿐만 아니라 배양된 MECs에서 RANKL mRNA 발현의 분석. 비자극세포나 MPA로 자극된 세포에서 표시된 시점에 대한 발현을 qRT-PCR로 결정하였다. SKBR3 세포를 제외하고는 RANKL의 유도가 발견되지 않았다; 그러나, 이러한 세포에서도 유도는 생체 내 MPA 시험처리 후 관찰된 RANKL의 2000배 이상 증가와 비교하면 단지 조금 증가 되었을 뿐이다. b-c, 프로게스테론 수용기(PR) mRNA를 일련의 인간 유방암 세포주(b) 및 단기간 배양된 (계대< 3) 유선 상피세포(MECs)와 새롭게 정제된 일차 MECs에서 측정하였다(c). 결과는 qRT-PCR에 의해 획득하였고, MCF10A(b) 및 정제된 일차 MECs와 비교하여 배수 변화로 나타내었다(c) (+/- sem) (n=3).
도 7. K5-Cre 생쥐와 이종교배한 RANK^fl ^/△암컷은, 임신 중에 결손 소엽-꽈리 발달(defective lobulo-alveolar deveolopment)을 나타낸다.
a, 대조군 한 배 새끼의 유선과 비교하여 K5-Cre와 이중 교배된 무산부 및 수유(L1) RANK^fl ^/△ 암컷의 유선 조직의 전조직 표본(Whole-mount) 분석. 소엽-꽈리 구조로부터 임신 중인 야생형 암컷에서의 꽈리(화살표), 반면에 이러한 발달은 K5-Cre RANK^fl ^/△암컷의 경우 흔적 꽈리 싹(화살표)에서 정지한다. b, RANK^flox ^/△과 RANK^flox/△ K5-Cre+ 암컷으로부터 유래한 정제된 유선 상피세포의 서던 블럿. 게놈 DNA를 PvuII, SphI으로 분해 후, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자(fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자(fl/+; 3.9 kb)를 표시한다. c, 수유 1일째(L1)에 정상적인 소엽-꽈리 구조를 보여주는 대조군 BALBc 누드(nu / nu) 암컷유래 유선의 전 조직 표본 분석으로, 야생형 유선 조직을 이식한 "소거된(cleared)" nu/nu 생쥐의 L1에서의 정상적인 소엽-꽈리 구조, 및 RANK^fl ^/△; K5-Cre 유선조직을 이식한 "소거된" nu / nu 생쥐의 L1에서의 결손 소엽-꽈리 구조. 수술적으로 소거 후 nu/nu 생쥐의 지방 패드를 또한 보여준다. 모든 배율 X5.
도 8. 임신 중인 MMTV-Cre, RANK^fl ^/△ 암컷에서 젖을 분비하는 유선의 정상적인 형성.
a, 정상적인 꽈리/도관 상피 구조를 보여주는 무산부 한 배 새끼 대조군과 RANK^fl/△; MMTV-Cre 암컷의 유선 조직의 H&E 분석. 배율 X10(상부)와 X40(하부 패널). b, 대조군 한 배 새끼들의 유선들과 비교하여 MMTV-Cre와 이종교배한 무산부 및 유선 (L1) RANK^fl ^/△ 암컷 유선 조직의 전조직표본 분석. RANKL의 MMTV-Cre 매개 제거는 수유 유선의 형성에 영향을 미치지 않았다. c, RANK^flox ^/△와 RANK^flox ^/△; MMTV-Cre 암컷으로부터 유래한 정제된 유선 상피 세포의 서던 블럿. PvuII와 SphI로 게놈 DNA를 분해한 후에, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자 (fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자 (△; 3.9 kb)가 표시된다. RANK^flox ^/△; MMTV-Cre 동물은 이후에 RANK^△ ^mam으로 나타낸다.
도 9. MPA는 유선에서 RANKL 발현과 상피 증식을 유도한다.
a-c, 도 1d에서 보는 것처럼 모의 처리와 MPA 이식 후 3일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷의 유선에서 상피 증식의 정량. a, 결과는 각각의 유전자형의 모의 수술한 암컷과 비교하여 전체 Ki67⁺상피세포에서 상대적인 변화로 나타낸다. 생쥐 당 적어도 1000개의 유선 상피세포를 계수하였다. n = 유전자형 당 생쥐 3마리 ** P < 0.005; *** P < 0.001 (스튜던트의 t-검정). b, MPA 피하 이식 후 3일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷의 유선 유래 선포(acinus) 당 Ki67 인시츄(in situ) 면역염색한 세포의 정량. 대조군 암컷에서 ~80%의 선포가 중등도 내지 고등의 증식 징후를 보인 반면, RANK^△ ^mam 암컷에는 60% 이상의 선포가 매우 낮은 증식율을 나타냈다. c, 에스트러스-의존적 배경 증식 수준을 조절하기 위해서, 과배란된 모의 수술한 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷을 분석하였다. 유선당 적어도 1000개의 세포를 계수하였다. n = 유전자형 당 3마리. b와 c에서, 결과는 증식 세포의 낮은(상피세포의 <20%가 Ki⁺임). 중간(상피세포의 20-80%가 Ki67⁺임), 및 높은(상피세포의 >80%가 Ki67⁺임) 갯수(+/- sem)를 갖는 선포/도관의 비율로 나타내었다. *** P < 0.001; * P < 0.03 (스튜던트의 t-검정). d, PBS 또는 RANKL (1 ㎍)의 복강 내 주사 후 1일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam암컷의 유선에서의 상피 증식. 증식은 Ki67 인시츄(in situ) 면역염색에 의해 결정하였다. 배율 X40. e, PBS 또는 RANKL (1 ㎍)의 복강 내 주사 후 1일째에 상피증식의 정량. Ki67 양성 세포의 평균 비율(+/- sem)을 보여준다. * P < 0.03; n=5 (스튜던트의 t-검정).
도 10. RANK^△ ^mam 생쥐에서 프로게스틴-유도된 유선암의 생존 곡선
a,b, MPA는 유선 상피세포에서 RANKL 발현을 유도한다. 무산부 야생형 암컷을 DMBA 또는 오일 담체의 경구-위관투여(oral-gavage)로 처리하거나, 서방성 MBA 펠렛을 피하조직에 이식하거나, 모의 수술로 처리하였다. a, RANKL mRNA를 이식/경구 위관 투여 후 3일재에 qRT-PCR에 의해 정제된 유선 상피세포에서 측정하였다. 결과를 모의 처리(+/- sem)와 비교하여 배수 변화로 나타내었다. n=그룹당 3마리의 생쥐. b, 오일 담체, DMBA, MPA 처리 또는 모의 수술 후 3일째에 정제된 유선 상피세포로부터의 세포 파쇄액에 대하여 웨스턴 블럿에 의해 가용성(s) RANKL 단백질(19 kDa)의 발현을 분석하였다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. 흥미롭게도, DMBA 또는 오일 담체 단독이 아닌 MPA만이 RANKL mRNA와 단백질 발현을 유도하였다. c, 도 2a에 표시된 대로 MPA 펠렛과 DMBA로 처리된, RANK^△ ^mam(n=14)과 MMTV-Cre 함유(Cre⁺ 대조군; n=13) 또는 MMTV-Cre 비함유(Cre^- 대조군; n=9) 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. Cre⁺과 Cre^- 대조군 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 마지막 DMBA 처리 후 Cre⁺ 대조군의 경우 종양 발현의 중간값은 9일, Cre^- 대조군의 경우는 11일, RANK^△ ^mam 암컷의 경우는 30일이었다. d, RANK^flox ^/+; MMTV-Cre+ 양성과 RANK^flox ^/△, MMTV-Cre+과 (RANK^△ ^mam) 암컷에서 유래한 MPA/DMBA-유도 유선 종양의 대표적인 서던 블럿. PvuII와 SphI으로 게놈 DNA를 분해한 후, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자 (fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자(△; 3.9kb)를 표시한다. RANK^△ ^mam 암컷으로부터 유래된 모든 종양은 거의 완전히 제거되었다. e, MPA/DMBA 처리 후 RANK^△ ^mam(n=9)과 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷(n=9)의 전체적인 생존에 대한 케플랜 마이어 분석(Kaplan Mayer analysis). 마지막 DMBA 처리 후 대조군에 대한 생존의 중간값은 48일이며, RANK ^△ ^mam 암컷에 대한 생존의 중간값은 93일이었다.
도 11. RANK^△ ^mam 암컷에서 편평 선암종의 발달.
a,b, 마지막 DMBA 처리 후 7일(a)과 21일(b)째에 대조군 한 배 새끼와 RANK^△mam암컷으로부터 분리한 유선 종양의 대표적인 조직학적 절편. 대조군 한 배 새끼와 RANK^△ ^mam 암컷으로부터의 종양에서 도관 선암종의 전형적인 특징을 나타내는 H&E 염색과 E-캐드헤린(E-Cadherin) 염색을 나타내었다. 사이토케라틴 14 (K14) 발현은 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷 모두에서 기저 세포 기원을 증명한다. 그러나, RANK^△ ^mam 암컷은 편평상피화생(squamous metaplasia)의 성질을 보이는 경향이 있다. 모든 배율 X20.
도 12. Mx-Cre RANK^floxed ^/△와 NeuT RANK^△ ^mam 생쥐에서 유선암의 발병
a, 도 2a에 표시된 대로 MPA 펠렛과 DMBA로 처리한 Mx-Cre rank ^floxed ^/ ^△ (n=4)와 연령-맞춤 Mx-Cre rank ^+/ ^△ 한 배 새끼(n = 6)에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. Mx-유도된 Cre 재조합효소는 8일간의 과정에 걸친 4회의 폴리 I:C 복강주사에 의해 활성화하였다(200ml PBS 안에 200㎍). 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 유의미한 차이점은 발견되지 않았다. b, Mx-Cre rank ^floxed/ ^△ 생쥐에서 제거되지 않은 RANK^floxed ^/△대립유전자(fl/+) 및 제거(△) 유도 후의 서던 블럿. c, Mx-Cre rank ^floxed ^/△생쥐에서 제거(△)의 유도 후 다양한 기관의 서던 블럿. 흉선, 심장, 간 및 비장에서는 다양한 정도로 제거되는(50-100%) 반면에, RANK^floxed ^/△ 대립유전자의 제거는 정제된 유선 상피세포(MEC)에서는 유도되지 않았다. d, NeuT RANK^△ ^mam (NeuT , MMTV - Cre + rank ^floxed ^/△)암컷 (n=18)과 연령-맞춤 NeuT (NeuT MMTV - Cre + rank ^+/△) 대조군 한 배 새끼 암컷 (n=17)의 촉진가능한 유선 종양의 발병. 유의미한 차이점은 발견되지 않았다. e, 종양에서 RANK 제거를 조절하기 위한 NeuT MMTVCre + rank ^floxed ^/△로부터 유래한 종양 및 한 배 새끼의 NeuT MMTVCre+ RANK ^+/△암컷으로부터 유래한 유선암의 서던 블럿.
도 13. NeuT RANK^△ ^mam 암컷에서 종양 형성
a-c, 대조군과 NeuT RANK^△ ^mam 암컷 생쥐에서 검출된 전형적인 선암종을 나타내는 대표적인 조직학적 절편. 6개월령 암컷의 유선에서 사이토케라틴5 (a), 사이토케라틴14 (b), 및 E-캐드헤린(c) 염색을 나타내었다. NeuT를 발현하지 않는 한 배 새끼 RANK^△ ^mam 암컷(NeuT^-)으로부터의 유선을 대조군으로 나타내었다. d, MPA-유도된 유선 선암종에서, 모의 또는 MPA-처리한 처녀 생쥐로부터 분리한 유선 상피세포(MEC), 및 NeuT, Pym, Neu, Neu/TGFβ 형질전환 생쥐로부터 유래한 유선 종양에서 RANKL mRNA의 발현. RANKL mRNA는 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과는 모의 처리와 비교하여 배수 변화로 나타내었다(+/- sem). 그룹당 n = 3. e, 표시된 유전자 생쥐 모델로부터 분리한 다양한 종양 및 대조군 RANK^+/△와 RANK^△ ^mam 암컷에서 MPA-유도된 종양에서 RANKL 단백질의 발현. 재조합 쥐 sRANKL 단백질을 분자 크기 비교를 위해 나타내었다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다.
도 14. MECs에서 RANKL/RANK 하류에서 시그널링
a, 임신 동안 수유 유선의 RANKL-RANK 매개된 형성을 조절하는, 유전적으로 확인된 시그널링 경로의 도식적인 개요. b, RANKL 자극(1㎍/ml)에 대하여 분리된 일차 생쥐 유선 상피세포에서 인산화된 (P) AKT, 전체 AKT, 인산화된 (P) ERK1/2, 전체 ERK1/2, 인산화된 (P) p38-MAPK, 및 p38-MAPK에 대한 웨스턴 블럿팅. 결과는 4번의 실험을 대표한 것이다.
도 15. MPA는 NFκB 경로를 활성화하며, RANKL/RANK를 통한 사이클린D1 발현을 촉발한다.
a, MPA에 의한 NFκB 경로와 사이클린D1 발현의 활성화. 무산부 RANK^△ ^mam과 한 배 새끼 대조군 암컷에게 서방성 MPA 펠렛을 피하 이식하거나 모의 수술로 처리하였다. a, MPA 처리 3일 후, RANK^△ ^mam과 한 배 새끼 대조군 암컷의 유선 상피세포에서 인산화된(P) IκBα를 검출하기 위한 인시츄(in situ) 면역염색. b, MPA 처리 3일 후, RANK^△ ^mam과 한 배 새끼 대조군 암컷에서 분리된 유선 상피세포에서 사이클린D1과 RANKL의 웨스턴 블럿 분석. 재조합 쥐 sRANKL 단백질을 분자 크기 비교를 위해 나타내었다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다.
도 16. RANKL / RANK 하류 시그널링 경로.
a, RANKL 자극(1㎍/ml)에 대하여 인간 SKBR3 유방암세포에서 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IκBα, 인산화된(P) ERK1/2, 전체 ERK1/2, 인산화된(P) p38-MAPK 및 p38-MAPK에 대한 웨스턴 블럿팅. 결과는 3번의 실험을 대표한 것이다. b, 통상의 성장 배지(대조군, 10% FCS를 보충한 DMEM)에서 또는 RANKL (1㎍/ml)의 존재 하에 배양된 SKBR3 유방암 세포의 성장곡선. 3일 이상 살아있는 세포(트리판 블루 제외)를 계수하여 세포 개수를 결정하였다. c, MPA 펠렛과 DMBA를 처리한 NFATc1^△ ^mam(n = 10)과 연령-맞춤 한 배 새끼 대조군 암컷(n=16)에서 촉진가능한 유방 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 유의미한 차이점은 발견되지 않았다. d, NFATc1^△ ^mam과 한 배 새끼 대조군 암컷 유래의 정제된 유선 상피세포(MECs)와 MPA-유도된 유선 종양에서 NFATc1 mRNA 발현의 정량. mRNA는 qRT-PCR에 의해 측정하였다. 결과는 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다. (+/- sem). n = 그룹당 5마리. * P < 0.05 (스튜던트의 t-검정).
도 17. RANKL은 일차 쥐과의 유선 상피세포와 인간 SKBR3 유방암 세포를 γ-방사선조사에 대한 아폽토시스로부터 보호한다.
a, RANKL 자극의 존재 시 (1㎍/ml) 또는 부재시에 γ-방사선조사(2 Gray)에 반응하여 일차 생쥐 유선 상피세포에서 분리한 γH2AX, 인산화된 (P) Chk1, 전체 Chk1, p53, 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블럿 분석. b,c, RANKL 자극의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재시 γ-방사선조사(2 Gray) 후에 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI) 염색된 b, 유선 상피세포와 c, SKBR3 인간 유방암 세포의 FACS 분석. 결과는 적어도 3번의 실험을 대표하는 것이다. DNA 함량이 <2n인 아폽토시스 세포가 sub-G1 부위에 나타난다. Sub-G1(M1), G1-기(M2), S/G2/M-기(M3) 뿐만 아니라 DNA 함량이 > 4n인 다배수체 세포의 비율을 표시된 시점에 나타냈다.
도 18. RANKL은 일차 쥐과의 유선 상피세포와 인간 SKBR3 유방암세포를 독소루비신(doxorubicin)에 대한 아폽토시스로부터 보호한다.
a,b, RANKL의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재 시에 유전자 독성 물질인 독소루비신(doxorubicin, Dox, 1μM)과 함께 인큐베이션시킨, a, 유선 상피세포와 b, SKBR3 인간 유방암 세포의 FACS 분석. 결과는 적어도 3번의 실험을 대표하는 것이다. 독소루비신 처리 후 24시간 및 36시간 동안 Sub-G1(M1), G1-기(M2), S/G2/M-기(M3)의 세포 뿐만 아니라 DNA 함량이 >4n인 다배수체 세포의 비율을 나타냈다. c, RANKL 자극의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재시에 γ-방사선조사(2 Gray) 6시간 후에 전-아폽토시스(pro-apoptotic) 유전자인 Bim, Puma, 및 Noxa의 mRNA 발현. 결과는 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타낸다.(+/- sem). n=3. * P < 0.05; ** P < 0.005 (스튜던트의 t-검정).
도 19. IKKα는 방사선-유도된 상피성 아폽토시스로부터 MPA 유도된 보호를 매개한다.
a,b, IKKα^△ ^mam 암컷에서 γ-방사선조사에 대한 유선 상피세포 아폽토시스의 감소된 유도. 한 배 새끼 대조군과 IKKα^△ ^mam 암컷은 모의 수술하거나 MPA 펠렛을 이식하고 γ-방사선요법을 조사하였다(5 Gray). MPA 펠렛은 γ-방사선조사 3일 전에 이식하였다. 방사선조사 24시간 후에, 활성 카스파제 3에 대한 면역염색에 의해 아폽토시스를 검출하였다. a, 대표적인 유선 절편에 대하여 상피세포의 아폽토시스 핵(화살표)이 나타냈다. 배율 X40. b, 유방 상피세포 아폽토시스의 정량. 각 생쥐에 대하여 최소 5000개의 핵을 계수하였다. 나타낸 결과는 평균값 +/- sem이다. n=그룹 당 3마리. * P < 0.05 (스튜던트의 t-검정).
도 20. 웨스턴 블럿의 정량
실험 당 적어도 3번의 독립적인 웨스턴 블럿에 대하여 음영계측(densitometry)을 수행하였다. 웨스턴 블럿에 대한 결과를 도 1b, 도 1c, 도 3a, 및 도 3b에서 나타내었다. 표시된 단백질에 대한 발현 값은 β-액틴 로우딩 대조군으로 표준화하였다. 인산화의 정량을 위하여 결과를 각각의 전체 단백질 밴드에 대하여 표준화하였다. * P <0.05; ** P < 0.001 (스튜던트의 t-검정).

RANKL는 수지상 세포 및 파골세포의 기능을 조절하는 세포 표면 수용체 RANK의 리간드 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 암의 발생에 있어 추가적인 기전이 밝혀졌다. RANKL는 호르몬-영향을 받은 암 발생을 유도한다. 이러한 호르몬은 임의의 개체에서 정상적인 호르몬 배경(hormonal background)의 것일 수 있거나 인공적으로 (호르론 대체 요법, 또는 폐경기 치료에서 피임제로서) 투여된 것일 수 있다. 더욱이, 암에서 이 리간드의 세포 기전 및 활성을 조사하고 특성을 분석하였다.

RANKL의 효과(effect)인 "RANKL 활성"은 RANK에의 RANKL의 결합 및 그의 결과적인 활성화를 포함한다. RANK는 추가적으로 IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1 뿐만 아니라 Id2-p21, MAPK Erk 및 p38 경로를 차례차례 활성화시킨다. 임의의 이들 인자의 활성을 변형시키는 것은 치료 또는 예방 방법을 위해 또는 암 세포 생존능력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 대부분의 이들 단백질은 세포내이며 RNAi에 의해서와 같이 그의 활성 또는 발현을 세포내 억제시켜 그의 기능을 억제하는 것이 가능하다. RANKL 및 RANK는 세포외 표적이지만, 또한 세포내 표적화될 수 있다(예컨대, RNAi에 의해).

본 발명에 따르면 MPA와 같은 프로게스틴의 생체내 투여가 세포에서 NF-B 리간드(RANKL)의 핵심적인 용골세포 분화 인자 수용체 활성제의 대량 유도를 촉발시킴이 밝혀졌다. 이들 세포에서 RANKL 또는 그의 수용체의 억제 또는 불활성화는 프로게스틴-유도된 증식을 예방한다. 중요하게도, RANKL/RANK 억제는 프로게스틴-유도된 암의 현저하게 감소된 발병률 및 지연된 발병(onset) 및 암 줄기세포의 감소된 자가-재생 능력을 유도한다. RANKL이 종양의 골 전이에 영향을 미치는 것이 알려졌었다고 하더라도, 본 발명은 일반적으로 암, 및 전이가 본 발명의 치료의 표적이 아닌, 전이와 독립적인 암을 치료하기 위한 가능성을 최초로 제공한다. 바람직하게는 암은 원발성 종양이다. 암은 비-전이성일 수 있다.

이전 공개특허에서(WO 02/098362) 암 요법에서 RANK 길항제를 사용하는 것이 제안되었다. 그러나 최종적으로 어떠한 요법도 이 제안을 기반으로 하여 개발되지 않았다. 본 발명에 따르면, 특히 바람직한 표적은 성장이 호르몬 시그널링에 의존적인 세포이다. RANK/RANKL 유도된 암 발생에서 유의미한 인자는 호르몬 배경이다. 본 발명에 따르면 RANK/RANKL의 발암성 효과는 성 호르몬, 특히 호르몬 대체 요법에서 또는 피임제로서 여성에게 널리 투여되는 프로게스테론 및 이의 유도체(프로게스틴)와 연관된다. 따라서, 바람직한 구현예에 따른 RANK/RANKL 길항 요법은 상승된 성 호르몬 또는 이의 기능적 유도체를 갖는 환자를 치료하기 위한 것이다. 본 발명에 따라 치료되거나 예방되는 하나의 암은 원발성 유방암을 포함하는 유방암이다.

바람직한 구현예예서 암은 성장을 위해 호르몬에 의존적인 암이다. 이러한 호르몬은 프로게스테론 또는 에스트로겐과 같은 여성의 성 호르몬과 같은 성 호르몬일 수 있다. 암 세포는 호르몬 수용체, 특히 프로게스테론 수용체 및/또는 에스트로겐 수용체를 가질 수 있다. 에스트로겐 수용체의 예는 ESR1(ER 알파 쇄를 포함함), ESR2(ER-베타 쇄를 포함함) 또는 혼합된 ER-알파 및 ER-베타 쇄의 것과 같은 헤테로머(heteromeric) 수용체를 포함한다. 이러한 수용체의 존재는 세포에서 호르몬 시그널링의 필요성을 나타낼 수 있다. 특히, 이 시그널링은 RANKL-매개된 것일 수 있다. 바람직하게는 호르몬 시그널링은 프로게스테론 수용체에 의해 매개된다. 특별한 구현예에서 암은 프로게스테론 수용체를 갖지만 기능적 에스트로겐 수용체는 갖지 않는 암 세포를 포함한다.

호르몬에 의한 RANKL의 활성화는 DNA 손상 유도된 세포 사멸로부터 암 세포 또는 전-암성(pre-cancerous) 세포를 보호한다. 따라서 이들 호르몬은 증가된 RANKL 활성을 통해 암을 지지할 수 있다. 본 발명에 따라 진단된 암의 바람직한 유형은 발생 동안에 성 호르몬 의존성인 암, 특히 유방암 또는 전립선암이다. 암의 추가적인 유형은 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 비-호지킨 림프종; B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; 말초성 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종; NK 세포 종양; 거대 과립 림프구성 백혈병; 랑게르한스 세포 세포조직구 증식증; 골수성 종양형성증; 급성 골수성 백혈병; 급성 전 골수구성 백혈병; 급성 골수단구성 백혈병; 급성 단구성 백혈병; 골수이형성 증후군; 및 만성 골수이식성 장애를 포함한다. 특히 바람직한 암은 폐암, 유방암, 유선암(mammary cancer), 흑색종, 육종, 전립선암, 두경부암, 원발기원 불명 암(cancer of unknown primary origin), 림프종, 백혈병, 신장암, 및 위장암을 포함한다. 바람직하게는 암은 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬-유발(driven)-암이다. 이러한 호르몬은 에스트로겐 또는 프로게스테론과 같은 여성 성 호르몬, 또는 프로게스틴과 같은 이의 인공적인 기능적 등가물 또는 PTHrP(부갑상선 호르몬 관련-단백질) 또는 비타민 D와 같은 RANKL을 유도하는 것으로 알려진 다른 인자일 수 있다. 암은 상피성 기원의 것일 수 있다. 바람직하게는 암은 유방암 또는 유선암의 경우에는 유방에서 또는 전립선암의 경우에는 전립선에서와 같이 그의 기원 조직에서 치료되거나 예방된다.

본 발명에 따르면 암은 원발성암일 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같은 원발성 암성 발생은 RANKL 활성을 억제함으로써 예방되거나 지연될 수 있다. 그러므로 원발성암은 치료되거나 예방될 수 있다. 추가로 재발하는 암의 발생을 예방 또는 치료하는 것이 또한 가능하다.

일 구현예에 따르면 본 발명은 환자에서 암의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 RANKL 억제제를 제공하는데, 여기서 환자는 호르몬 치료, 바람직하게는 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴을 사용하는 호르몬 대체 요법, 또는 호르몬 피임법을 받은 환자이다.

"치료"는 추가적인 암의 진행을 예방하는 것을 비롯해, 암 환자에 대한 이로운 효과로서, 특히 암 세포의 감소로서 이해될 것이지만, 필수적으로 완전한 치유의 개념은 아니며, 물론 이는 가능하지만 본 발명에 의해 필수적으로 요구되는 것은 아니다.

유사하게, "예방하는"은 암의 발병을 항상 예방하는 완전한 성공이 아닌, 환자에서 암 발생 위험의 상대적인 감소로서 또는 암의 발병을 지연시킴으로써, 즉 예방적인 치료로서 이해될 것이다. 암의 예방은 본 발명의 특히 이로운 점이다. 아폽토시스에 대한 RANKL-유도된 보호가 암의 발생에서 근본적인 단계이기 때문에, 현재 암성 발생에서 이 단계를 억제하고 특정 시간 동안 암 징후(manifestation)를 예방하거나 지연시키는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 치료 또는 예방은 양성 종양 또는 결절을 치료하는데 사용될 수 있고, 따라서 암 형성에서 추가적인 발생을 억제할 수 있다.

환자의 정상 호르몬 수준은 일반적으로 본 발명에 따른 암 발생과 관련된 RANKL 경로를 촉발시키기에 충분할 수 있다. 특정한 조건에서 환자의 호르몬 수준은 환자에서 증가될 수 있으며, 이는 자연적이거나 인위적인 원인에 의한 것일 수 있다. 이러한 증가된 호르몬 수준은 RANKL 연관된 암 발생 및 진행을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 바람직한 구현예에서 본 발명에 따라 치료될 환자는 특히 프로게스테론(또는 합성의 기능적 아날로곤(analogon)인 프로게스틴) 또는 에스트로겐과 같은 성 호르몬의 증가된 호르몬 수준, 예컨대 혈액 농도를 갖는다. 호르몬 대체 요법 또는 호르몬 피임법(특정 프로게스테론 및 이의 유도체)을 위한 것 일 수 있는 환자에게 여성 성 호르몬의 투여는, 특히 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬 유도된 암의 RANKL 경로를 통해 암의 위험을 증가시킨다. 추가로, 폐경 전에서와 같은 내인성 프로게스테론 시스템의 임의의 탈조절(deregulation)은 암의 위험을 증가시킬 수 있다. 결과적으로, RANKL 억제제의 투여는 유방암의 위험을 감소시키거나 유방암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 기전적으로, RANKL 활성은 아폽토시스로부터 유방암 세포를 보호하고 발암성 돌연변이에 비추어 유방암 생존을 증가시킨다. 그러므로 RANKL 활성을 감소시키는 것은 이러한 보호 효과를 예방하고 증가된 암 세포 사멸을 유도한다.

환자는 성 호르몬을 이용한 요법을 받았거나 받았었을 수 있다. 암 발생에서 RANKL 활성이 성 호르몬, 특히 에스트로겐 또는 프로게스테론 또는 이의 유도체(프로게스틴)에 의해 영향받음이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 그러므로, 바람직한 구현예에서 환자는 호르몬으로 치료받거나, 바람직하게는 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴을 사용하는 바람직하게는 호르몬 대체 요법을 받거나, 호르몬 피임법을 받는다. 프로게스틴의 예는 메드록시프로게스테론(또는 이의 아세테이트, 예컨대 17-아세테이트), 노르에티스테론, 에티스테론, 노르에티노드렐, 노르에틴드론 아세테이트, 에티노디올 디아세테이트, 레보노르게스트렐, 노르게스트렐, 데소게스트렐, 게스토덴, 노르게스티메이트, 드로스피레논, 디에노제스트, 네스테론, 노메게스트롤 아세테이트, 트리메게스트론, 타나프로게트(tanaproget), 메게스트롤 아세테이트, 프라논, 에토노게스트렐이다. 호르몬 또는 유도체는 바람직하게는 프로게스틴적인 효과를 갖는다. 구체적으로 호르몬은 RANKL을 유도할 수 있다.

호르몬 대체 요법에서 또는 호르몬 피임법의 사용에 의해, 일반적인 성 호르몬의 호르몬 수준은 상향조절되어 본 발명에 따른 RANKL 경로를 통한 암의 발생과 관련될 수 있는 증가된 프로게스테론 수준을 유도한다. 그러므로, 호르몬 또는 호르몬 피임제를 받거나 이로 치료된 환자는 유방암이 발생할 위험이 증가되어 있다. 이들 환자에 대해, RANKL 억제제를 투여하는 것은 암, 암 발생 또는 암 진행을 치료 또는 예방하는데 특히 효과적이다.

치료될 환자에서 발견될 수 있는 특히 높은 프로게스틴 및/또는 프로게스테론 수준은 예컨대 혈청 농도 또는 적어도 0.2 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 0.3 ng/㎖이다.

"RANKL 억제제"는 RANKL 활성을 감소시킬 수 있는 임의의 화합물 또는 제제로서 이해되는 것이다. 이는 유리(free) RANKL을 불활성화시키고 RANK에의 RANKL의 결합 및 RANK의 활성화를 완전하게 예방하는 임의의 RANKL 리간드, 특히 항-RANKL-항체를 포함한다. 추가적인 RANKL 억제제는 RANK, RANKL 세포 수용체를 차단하는 RANK 길항제를 포함한다. 또한, RANKL 그 자체, RANK, IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1(NFκB 경로 억제), Id2, MAPK Erk 및 p38을 포함하는, RANKL 시그널링 경로에서 임의의 인자는 RANKL 시그널링을 예방하고 RANKL 활성을 감소시키기 위해 길항화되거나, p21 증가되거나 또는 작동화(agonized)(Id2 경로 억제)될 수 있다. Id2 경로는 세포 주기 진행을 억제하는 주요한 사이클린-의존적인 키나아제 억제제의 하나인, p21의 전사적 저해제로서 기능한다. 그러므로, Id2 경로는 상향조절되어 이에 따라 증식을 중단시키도록 p21에 대해 억제되어야만 한다.

RANKL 억제제는 RANKL 그 자체, RANK, IKKα, IκBα, P-NFκB, 사이클린D1, Id2, MAPK Erk 또는 p38 중 임의의 하나를 억제 또는 길항화하거나 p21 또는, 특히 바람직하게는 RANKL와, 바람직하게는 이들 인자의 적어도 2, 3, 4, 5개, 또는 모두의 임의의 조합을 증가 또는 작동화할 수 있다. RANKL 억제제는 RANKL 농도, 특히 혈청 농도를 낮추거나 RANKL 발현을 낮추는 임의의 화합물일 수 있다. RANKL 억제제는 추가적으로 세포 표면, 특히 암 세포 표면에서 RANK 농도를 낮추고/낮추거나, RANKL 결합에 대하여 RANK 발현 및/또는 RANK 활성화를 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 IKKα의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 IκBα의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 P-NFκB의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 사이클린D1의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 Id2의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 p21의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 MAPK Erk의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다. RANKL 억제제는 p38의 세포내 농도 및/또는 발현 및/또는 활성화를 추가적으로 낮출 수 있다.

세포 인자를 길항화하기 위해 바람직하게는 이들 인자의 발현 및 기능을 감소시키도록 siRNA 분자가 투여된다. RNA 간섭(RNAi)은 서열 특이적 방식으로 유전자 발현을 저해하기 위한 기전이다. RNA 간섭(RNAi)은 진핵 세포에서 특정 유전자 기능의 저해를 위한 고도로 효과적인 방법이다. 세포 및 유기체에 적용되는 경우, RNAi는 짧은 간섭 RNA(siRNA) 올리고 또는 짧은-헤어핀 RNA(shRNA) 인코딩 벡터의 형질감염시 표적 mRNA의 분해를 수반한다. 예를 들면, US 2002/0162126 및 US 2002/0173478에서 기술된 바와 같이 RNAi의 다양한 방법이 식물 세포, 초파리, 인간 흑색종 세포에서 유전자 발현을 변경시키기 위해 기술되고 일반적으로 알려져 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 siRNA는 RANKL 시그널링 경로의 목적한 분자 또는 이러한 분자들의 조합을 표적하도록 선택된다. 이런 방식에서 이들은 표적 유전자에 상응하는 다양한 RNA에 표적화된다. 본 명세서에 siRNA가 또한 혼성화 DNA/RNA 구조물 또는 이의 임의의 등가물, 이중-가닥화된 RNA, 마이크로RNA(miRNA), 뿐만 아니라 siRNA 중첩(duplication)과 같은 siRNA 형태, 바이러스 및 비-바이러스 벡터 내의 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 담체 내의 siRNA 또는 shRNA인 변경된 siRNA를 포함할 수 있음은 당업자에게 이해된다. RANKL RNAi는 예컨대 WO 2005/028633에 기술되어 있다.

예를 들면, WO 02/055692, WO 02/055693, EP 1 144 623 B1 및 WO 03/074654에서 기술된 바와 같이 RNAi를 사용하여 유전자 발현을 억제하기 위한 몇몇 방법이 본 기술분야에 존재한다. siRNA 요법을 사용함으로써 임의의 세포 인자는 본 발명의 RANKL 길항화 및 억제 요법을 위해 표적되고 억제될 수 있다. 그러므로, 임의의 이러한 화합물은 RANKL 억제제로서 사용될 수 있다.

바람직한 구현예에서, RANKL 억제제는 RANKL 또는 RANK 리간드, 바람직하게는 데노수맵과 같은 항-RANKL 항체이거나, US 2008/107597에 개시된 바와 같다. "항-RANKL-항체"는 Fab, F(ab)2, Fv와 같은 항체 단편, 또는 단일쇄 항체(scAb)를 포함하는 임의의 기능적 등가물 및 이의 유도체를 포함한다. RANKL 활성 관련 단백질 및 인자, 구체적으로 RANKL 시그널링 경로에서 특히 RANKL 및 RANK 및 임의의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 항체는 전장 단백질, 이 단백질의 가용성 형태, 또는 이의 단편을 이용한 면역화에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있거나, 경쇄 및 중쇄 상에 쥐 불변 영역이 인간 서열에 의해 대체된 키메라 항체와 같은 재조합 항체일 수 있거나, 상보성 결정 영역만이 쥐 기원인 CDR-이식된 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 예를 들면, 인간 항체를 생산할 수 있는 형질전환 동물의 면역화에 의해(WO 93/12227) 제조된 인간 항체일 수 있다. 항체는 생물학적 시료에서 RANKL을 검출하는데 유용하며, 이는 RANKL 억제제로서 치료적 용도를 갖는 RANKL에 결합(및 다른 결합 화합물과의 상호작용을 억제)하는 항체 뿐만 아니라 단백질을 생산하는 세포 또는 조직의 식별을 가능하게 한다.

RANKL 억제제는 환자의 순환에서 유리 RANKL 농도를 감소시키기에 적합하며 이를 위해 사용될 수 있다. RANK는 RANKL에 대한 유일한 천연 수용체가 아니다. 오스테오프로테긴(Osteoprotegin; OPG)은 RANKL 활성(RANK에의 RANKL의 결합 및 IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1을 통한 또는 Id2-p21, MAPK Erk 및 p38을 통한 그의 시그널링 경로)을 감소시킬 수 있는 분비된 유인(decoy) 수용체이다. 그러므로 OPG는 RANKL 억제제로서 투여될 수 있다. 더욱이 RANK 또는 그의 가용성 형태 그 자체는 RANKL 리간드 및 억제제로서 사용되어 RANKL의 유리 혈청 농도를 감소시킬 수 있다.

억제제는 일반적으로 RANKL 활성을 감소시켜 암 세포 생존력을 현저하게 저하시키는 양인 치료적 유효량으로 투여된다. 특정한 구현예에서, RANKL 활성은 평균 사람(person)의 정상 수준으로 저해될 수 있고, 더욱이 RANKL 활성은 평균 수준 이하로 감소될 수 있다. 바람직하게는 RANKL 활성은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 적어도 80% 또는 적어도 90%로 감소된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 감소는 RANKL 혈청 수준과 동일시한다.

억제제는 추가의 항암 요법, 바람직하게는 방사선요법 또는 화학요법과 병용 또는 초회감작을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 이 양태에 따르면 유효량의 RANKL 억제제를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 요법의 효능을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 개체에게 소-분자 약물, 신생혈관형성 억제제, 종양 백신, 화학요법, 면역요법, 방사선 요법, 유전자 요법 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암 요법이 또한 투여된다.

RANKL는 DNA 손상 관련 세포 사멸에 대하여 암 세포를 면역화하는 보호제로서 작용한다. RANKL 활성을 감소시키고 따라서 암세포에 대한 RANKL 보호 효과를 감소시킴으로써, 세포는 DNA 손상에 더 감수성이 된다. 그러므로, 바람직한 구현예에서 암은 RANKL 억제제 및 방사선 또는 화학요법과 같은 추가적인 세포 손상을 유도하는 추가의 항암 요법과 함께 치료된다. 바람직하게는 이러한 추가의 암 요법은 예컨대, 암 세포 조직을 표적하여 방사선 또는 화학요법 제제 중 어느 하나에 의한 추가적인 DNA 손상을 유도하는 국부화된 화학요법 제제 또는 귀소(homing) 제제를 투여함으로써 유방과 같은 특정 조직에서의 암에 대하여 특이적이다.

이 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 화학요법 제제 및 RANKL 억제제를 포함하는 키트에 관한 것이다.

추가적인 구현예에 따르면, RANKL 억제제는 특히 유방암 발생의 위험을 감소시키기 위해, 호르몬 대체 요법과 병용사용하거나 호르몬 피임법과 병용사용하도록 제공된다.

환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 바람직하게는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간, 특히 여성이다. 환자는 호르몬, 특히 여성 성 호르몬을 사용한 요법을 받거나 받았었을 것이다. 이러한 과거의 요법은 과거 5, 4, 3, 2, 년간 또는 과거 36, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개월(들)일 수 있다. 호르몬 대체 요법을 받고 있거나 호르몬 피임제, 특히 프로게스테론 또는 프로게스틴을 복용하고 있는 환자, 특히 여성은 암이 발생할 위험이 증가되어 있다. 이 증가된 위험을 감소시키기 위해, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 RANKL 억제제의 병용 사용을 제공한다.

본 발명은 상기 환자에게 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자에서 RANKL 활성을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명의 추가적인 양태는 상기 환자에게 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암 세포의 양을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은 바람직하게는 상기 세포에 RANKL 억제제를 투여함으로써, 상기 세포에서 RANK 또는 RANKL 또는 IKK-알파 또는 IkB-알파, P-NF-카파-B 또는 사이클린D1 또는 Id2 또는 MAPK Erk 또는 p38을 억제하거나 p21을 증가시키거나 이들의 임의의 조합, 특히 RANKL 억제와의 조합을 포함하는, 세포의 DNA 손상에 기인한 세포 사멸을 증가시키는 방법을 교시한다. 본 발명의 치료를 받는 세포는 호르몬 의존성 암이 발생할 수 있는 조직 세포, 구체적으로 유방(특별히, 예방 방법의 경우에) 또는 암 세포일 수 있다. 더욱이 상기 세포는 상피세포 또는 암 줄기세포일 수 있다. 특별히 상피성 기원 암은 본 발명의 방법에 의해 효과적으로 치료될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서 암은 유선 상피세포의 것이다. 더욱이 암 줄기세포에 대한 현저한 효과로서 RANKL 억제는 이러한 줄기세포를 포함하는 암을 예방하거나 감소시킬 수 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 또는 예방 방법은 환자가 상기 기술된 바와 같은 호르몬 치료, 바람직하게는 프로게스테론 또는 프로게스틴을 이용하는 바람직하게는 호르몬 대체 요법, 또는 호르몬 피임법을 받은 것을 특징으로 한다.

상기 언급한 바와 같이, 특히 여성 성 호르몬을 이용한 호르몬 치료는 유방암의 위험을 증가시키므로, 본 발명의 치료적 예방 방법에서는 바람직하게는 환자가 본 발명의 치료 방법 이전 또는 동안에 이러한 호르몬 요법으로 치료되어 왔다. 호르몬의 이전 투여는 과거 1, 2, 3, 4 또는 5 년 또는 그 이상일 수 있다.

추가적인 양태에서 본 발명은 RANKL 억제제 및 호르몬 또는 프로게스테론 또는 프로게스틴으로부터 선택된 이의 유도체, 또는 호르몬 피임제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

언급한 바와 같이, RANKL 억제는 여성 성 호르몬, 특히 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴에 의해 발생하는 암의 위험을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명에 의해 제공된 RANKL 억제제와 함께 이러한 호르몬을 투여하는 것이 권고된다. 이런 호르몬은 호르몬 대체 요법을 위해 사용되거나 호르몬 피임제로서 사용될 수 있다.

호르몬 피임제 제형의 가장 흔한 유형은 에스트로겐과 프로게스테론 둘 모두를 포함하거나, 단지 프로게스테론 또는 그의 합성 아날로그(프로게스틴) 중 하나를 함유하는 프로게스테론-단독 제형이다. 호르몬 의존성 암 발생의 위험을 감소시키기 위해, 본 발명은 RANKL 억제제와 함께 여성 성 호르몬 피임제를 포함하는 호르몬 치료제의 병용 사용을 제공한다.

치료 또는 예방적 사용을 위한 약학 조성물 또는 제형은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 치료적 유효량의 RANKL 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 용어 "치료적 유효량"은 특정한 조건 및 투여의 경로에 대한 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 조성물은 액체 내일 수 있거나 동결건조된 형태일 수 있으며 다양한 pH 값 및 이온 강도를 갖는 희석제(트리스, 아세테이트 또는 포스페이트 완충액), 트윈 또는 폴리소르베이트와 같은 가용화제, 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알코올과 같은 보존제, 아스코르브산 또는 메타중아황산 나트륨과 같은 항산화제를 포함할 수 있다. 특정한 조성물의 선별은 치료되는 상태, 투여의 경로 및 목적한 약동학적 매개변수를 포함하는 다수의 인자에 좌우될 것이다. siRNA 제형은 바람직하게는 리포솜 제형으로 투여된다.

본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 호르몬 치료제, 및 RANKL 억제제를 포함하는 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 호르몬 치료제 및 RANKL 억제제의 개별 투여를 가능하게 할 수 있다.

또한 가용성, 안정성, 혈장 반감기 및 생체이용률을 증가시키기 위하여 수용성 중합체로 변형된 RANKL 억제제를 포함하는 조성물이 포함된다. 조성물은 또한 연장된 기간에 걸친 제어 전달을 위해 리포솜, 미세유화제, 미셀 또는 소포체 내로 NKL 억제제의 도 포함할 수 있다. 가용성 RANKL 억제제는 폐 투여를 위하여 적합한 미세입자 내로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 주사, 피하 정맥내 또는 근육내 중 하나에 의해, 또는 경구, 비강, 폐 또는 직장 투여에 의해 투여될 수 있다. 결국 선택된 투여의 경로는 다수의 인자에 의존할 것이며 당업자에 의해 규명될 수 있다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 항-RANKL 억제성 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 핵산 조성물은 안티-센스 요법 레지멘의 부분으로서 세포 및 조직에 RANKL 또는 상기 기술된 바와 같은 RANKL 시그널링 경로에서 임의의 단백질의 코딩 영역 및/또는 인접(flanking) 영역의 일부 또는 전체를 전달하는데 적합할 것이다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 하기와 같이 정의된다:

1. 환자에게 치료적 유효량의 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법.

2. 암 세포에 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 세포 아폽토시스를 증가시키는 방법.

3. 정의 1에 있어서, 암이 유방암 또는 전립선암이거나, 정의 2에 있어서 암 세포가 유방암 세포 또는 전립선암 세포인 것인 방법.

4. 정의 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 암이 성 호르몬 수용체, 바람직하게는 프로게스테론 또는 에스트로겐 수용체를 가진 암 세포를 포함하는 것인 방법.

5. 정의 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 암이 원발성암이거나 암 세포가 원발성암의 세포인 것인 방법.

6. 환자에서 호르몬 의존성 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 RANKL 억제제로서, 암은 성 호르몬 수용체, 바람직하게는 프로게스테론 또는 에스트로겐 수용체를 가진 암 세포를 포함하는 것인 RANKL 억제제.

7. 정의 6에 있어서, 환자가 호르몬 치료, 바람직하게는 프로게스테론 또는 프로게스틴을 이용한, 바람직하게는 호르몬 대체 요법, 또는 호르몬 피임을 받은 것인 억제제.

8. 정의 6 또는 7에 있어서, 암이 유방암, 유선암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 억제제.

9. 정의 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 암이 상피세포 기원인 것을 특징으로 하는 억제제.

10. 정의 6 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 추가적인 항암 요법, 바람직하게는 방사선요법 또는 화학요법과 병용하거나 또는 초회감작(priming)하기 위한 것인 억제제.

11. 정의 6 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 원발성암을 치료 또는 예방하거나 암의 재발을 치료 또는 예방하기 위한 억제제.

12. 바람직하게는 성 호르몬인, 호르몬 요법, 특히 호르몬 대체 요법의 병용 사용 또는 호르몬 피임제와의 병용 사용을 위한 RANKL 억제제.

13. 정의 6 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 암이 발생하는 위험을 감소시키기 위한 억제제.

14. 환자에게 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 환자에서 RANKL 활성을 감소시키는 방법.

15. 환자에게 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 암 세포의 양을 감소시키는 방법.

16. 바람직하게는 세포에 RANKL 억제제를 투여하여 세포에서 RANK 또는 RANKL 또는 IKK-알파를 억제시키는 단계를 포함하는 세포의 DNA 손상에 기인한 세포 사멸을 증가시키는 방법.

17. 정의 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 환자 또는 세포가 호르몬 치료를 받은 것을 특징으로 하는 방법.

18. 정의 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 호르몬이 프로게스테론 또는 프로게스틴인 것인 방법.

19. 정의 14 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 호르몬 치료는 호르몬 대체 요법 또는 호르몬 피임제의 투여를 포함하는 것인 방법.

20. 정의 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, RANKL 억제제는 RANKL 또는 RANK 리간드 또는 siRNA인 것인 억제제 또는 방법.

21. 정의 20에 있어서, RANKL 억제제는 항-RANKL 항체인 것인 억제제 또는 방법.

22. 정의 21에 있어서, 항-RANKL 항체가 데노수맵인 것인 억제제 또는 방법.

23. 정의 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서. 상기 세포가 유방 조직 세포 또는 유방암 세포이거나 암이 유방 조직 세포 또는 유방암 세포로부터 선택된 암성 세포를 포함하는 것인 억제제 또는 방법.

24. 정의 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 상피세포 또는 기저세포 또는 암 줄기세포이거나 암이 상피세포 또는 기저 암세포 또는 암 줄기세포로부터 선택된 암성 세포인 것인 억제제 또는 방법.

25. RANKL 억제제 및 호르몬 또는 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴으로부터 선택된 이의 유도체 또는 호르몬 피임제를 포함하는 약학 조성물.

26. 정의 25에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 추가로 포함하는 조성물.

27. 정의 25 또는 26에 있어서, 호르몬 요법에 사용하기 위한 조성물.

28. 정의 27에 있어서, 호르몬 요법이 피임 또는 흐로몬 대체 요법인 것인 조성물.

29. 화학요법 제제 및 RANKL 억제제를 포함하는 키트.

30. RANKL 억제제 및 호르몬 또는 에스트로겐, 프로게스테론, 또는 프로게스틴으로부터 선택된 이의 유도체 또는 호르몬 피임제를 포함하는 키트.

본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해서, 이러한 특정한 실시예로 제한 되지 않으면서, 추가로 예시된다.

실시예 1: 생쥐.

Rank ^floxed 생쥐는 최근에 생성되었다¹. 간단히 말하면, Rank의 무반응 대립유전자를 보유한 생쥐(null allele)를 (rank ^△ 대립 유전자) 만들기 위하여, rank ^floxed 생쥐를 β-액틴-Cre 편재성 결손(ubiquitous deletion) 생쥐와 이종 교배하였다. MMTV-Cre rank^△/ ^floxed 생쥐를 생성하기 전에, rank ^floxed 또는 rank ^△ 대립 유전자를 보유 생쥐 뿐만 아니라 MMTV-Cre 생쥐를 BALBc 배경에 대해 7번 역교배(backcross) 하였다. MMTV-NeuT 생쥐는 친절하게도 이탈리아 밀라노의 Guido Forni가 제공하였다. MMTV-Cre 생쥐(스톡번호 003553)와 Mx-Cre 생쥐 (스톡번호 003556)는 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. K5-Cre, IKKα^floxed및 NFATc1 ^floxed 생쥐는 이전에 기술되었다² ^-4. 생쥐 유전자형을 PCR과 서던 블럿 분석에 의해 결정하였다. 모든 실험에서, 동종 번식 유래의 한 배 새끼 생쥐만을 사용하였다. 모든 생쥐는 규격화된 지침에 따라 사육하고 유지하였다.

종양에서 RANK 의 제거 및 Cre 효과.

RANK^△ ^mam암컷에서 발달한 종양의 서던 블러팅은 RANK의 제거를 보여주었으며(도 10c), 비록 일부 잔여 야생형 밴드가 관찰되었지만 이는 다른 세포 형태 및 다른 도망 세포(escaper cells)의 존재로 설명될 수 있다. Cre 음성 대조군 암컷과 MMTV-Cre 형질전환 유전자를 발현하는 한 배 새끼에서 종양의 발병에 있어서 차이점은 발견되지 않았는데, 이는 MPA/DMBA 유선 종양 모델에서 Cre 발현 자체가 종양의 발생빈도를 변경하지 않는다는 것을 나타낸다(도 10d).

실시예 2: MPA / DMBA -유도된 유선 암형성 .

MPA/DMBA 처리는 기술된 바와 같이 수행하였다⁵ ^,6. 간단히 말하면, 6주령의 암컷 생쥐를 케타민-자일라진(ketamine-xylazone)으로 마취했고, 서방성 메드록시프로게스테로 아세테이트(MPA) 펠렛(50mg, 90일 동안 방출; Innovative Research of America)을 수술적으로 오른쪽 옆구리 피하 조직에 이식하였다. 도 2a에 개략적으로 보여준 대로, 이후의 8주간에 걸쳐서 200㎕ DMBA (5mg/ml로 면실유에 희석됨)를 경구-급식으로 삽관(cannula) 6회 투여하였다. 유선 종양의 발병은 촉진에 의해 결정했다. Cre 음성 대조군 암컷과 MMTV-Cre 형질전환 유전자를 발현하는 한 배 새끼에서 종양의 발병에 있어서 차이점은 발견되지 않았는데, 이는 MPA/DMBA 유선 종양 모델에서 Cre 발현 자체가 종양의 발생빈도를 변경하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 유선조직 이식편 .

이식 연구를 위하여, 유선 상피 조직을 무산부 3주령 기증자로부터 분리하였고, 이전에 기술한 바와 같이⁷ 3주령의 숙주 nu / nu 생쥐의 내재성 상피가 없는 소거된 유선 지방 패드 내로 이식하였다. 수술 3주 후에 숙주를 짝지어 주었고, 분석을 위하여 유선 조직을 분리하였다.

실시예 4: 조직학, 전조직 표본, 및 면역조직화학.

조직학적 분석을 위하여, 5㎛ 절편을 잘랐고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다 (H&E). 이전에 기술한 대로⁸, 유선의 전조직 표본 염색을 수행하였다. 면역페록시다아제(immunoperoxidase) 염색을 위하여, 파라핀(paraffin)-포매 절편을 탈수시키고, 10 mM 시트레이트 완충액을 사용하거나 또는 전자렌지에 데워서 항원 에피토프를 노출시켰다. 절편을 사이토케라틴5, 사이토케라틴14, E-캐드헤린, 항-Ki67(Novocastra사) 및 항-활성 카스파제 3(Cell Signaling사)에 대한 항체로 인큐베이션 시켰고, 페록시다제-접합 이차항체를 사용하여 시각화하였다. 양성인 상피세포의 숫자를 상피세포의 전체 숫자로 나누어 조직형태계측 지수(증식과 아폽토시스)를 계산하였는데, Ki67 염색에 대해서는 절편당 적어도 1000개의 핵을, 활성화된 카스파제 3 염색에 대해서는 절편당 적어도 500개의 세포를 계수하였다.

실시예 5: 웨스턴 블럿팅 .

인간의 상피 유방 종양 세포주 SKBR3와 일차 비형질전환 생쥐 유선 상피세포를 비처리 상태로 방치하거나, 재조합 쥐 RANKL^ref ⁹로 자극하였다. 선암종은 대조군과 돌연변이 생쥐로부터 분리하였으며, 전체 단백질 파쇄액을 준비하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블러팅을 수행하였다. 간단히 말하면, 블럿을 1X TBS, 0.1% Tween-20(TBST)가 들어간 5% BSA로 1시간 동안 블록킹시키고, (제조사의 프로토콜에 따라 TBST로 희석된) 일차항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 생쥐 RANKL (AF462; R&D사), 사이클린 D1 (Santa Cruz사 #Sc-8396), β-액틴 (Sigma사), 인산화된(P) NFκB (#3033), NF-κB (#4767), 인산화된(P) IκBα(#2859), IκBα(#4814), 인산화된(P) IKKα(#2681), IKKα(#2678), IKKβ (#2678), IKKγ(#2685), 인산화된(P) Akt (#3787), Akt (#9272), 인산화된(P) Erk1/2 (#9101), Erk1/2 (#9102), 및 p38-MAPK (#9212), p53 (# 2524), 인산화된(P) Chk1 (# 2348), Chk1 (# 2345) (모두 Cell Signaling사 제품임), p38-MAPK (AF869; R&D사), 및 γH2Ax (Ser139 #07-164 Millipore사)에 반응하는 1차 항체를 사용하였다. 블럿을 TBST로 30분간 3번 세척하였고, HRP-접합된 이차항체(1:2000으로 희석, Promega사)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, TBST에 30분 동안 3번 세척하였고 ECL을 사용하여 시각화하였다.

실시예 6: qRT - PCR .

종양의 전체 RNA를 제조사의 지침에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen사)를 사용하여 준비하였다. 전체 RNA(2 ㎍)를 정량적 (q)RT-PCR 분석에 적용하였다. 다음 프라이머가 사용되었다 :

β-액틴 순방향 프라이머: 5'- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3';

β-액틴 역방향 프라이머: 5'-CCTGAACCCTAAGGCCAACCG -3'.

RANKL 순방향 프라이머: 5'- CTGAGGCCCAGCCATTTG -3'

RANKL 역방향 프라이머: 5'- GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG -3'

RANK 순방향 프라이머: 5'- CTTGGACACCTGGAATGAAG -3'

RANK 역방향 프라이머: 5'- CAGCACTCGCAGTCTGAGTT -3'

사이클린 D1 순방향 프라이머:5'- CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA -3'

사이클린 D1 역방향 프라이머:5'- GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG -3'

p21 (Cdkn1a) 순방향 프라이머: 5'- GTGGCCTTGTCGCTGTCTT -3'

p21 (Cdkn1a) 역방향 프라이머: 5'- GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG -3'

tRANKL 순방향 프라이머: 5'- GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC -3'

RANKL1 순방향 프라이머: 5'- GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC -3'

RANKL2 순방향 프라이머: 5'- TGCGCACTCCGGCGTCCCG -3'

RANKL3 순방향 프라이머: 5'- CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG -3'

RANKLcom. 역방향 프라이머: 5'- TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3'

Puma 순방향 프라이머:5'- CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT -3'

Puma 역방향 프라이머:5'- CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC -3'

Noxa 순방향 프라이머: 5'- ACTTTGTCTCCAATCCTCCG -3'

Noxa 역방향 프라이머: 5'- GTGCACCGGACATAACTGTG -3'

Bim 순방향 프라이머: 5'- GTTGAACTCGTCTCCGATCC -3'

Bim 역방향 프라이머: 5'- GCCCCTACCTCCCTACAGAC -3'

실시예 7: DNA 손상 반응.

세포주기 정지(rest)와 아폽토시스의 측정을 위해, 일차 생쥐 유선 상피세포와 SKBR3 인간 유방암 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 100000개 세포의 세포밀도로 접종하고, 24시간 동안 자랄 수 있게 놓아 두었다. 그 후 재조합 RANKL(1 ㎍/ml)의 존재 시 또는 부재 시에 세포를 독소루비신(doxorubicin(1μM))으로 처리하거나 γ-방사선조사(2 Gray)를 실시하였다. 세포주기 정지와 죽은 세포의 개수는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodine) 염색을 사용하여 결정하였다. 생체 내 유선 상피세포 사멸을 결정하기 위하여, 대조군과 RANK^△ ^mam 한 배 새끼 암컷에 5 Gray(Gy)의 총 선량으로 γ-방사선조사를 하였다. 6시간 후 유선을 분리하였고, 아폽토시스의 지표로 사용할 수 있는, 활성 캐스파제3(Cell Signaling사)에 대해 면역염색하였다.

실시예 8: 일차 유선 상피세포의 FACS 분석.

유선 상피 소집단의 FACS 분석을 위하여, 조직 분리를 위해 프로토콜을 단세포 부유액 생성을 위해 사용하였다: 양쪽 서혜부 유선 지방 패드로부터 림프절을 제거하였고, 이어서 지방 패드를 EpiCult-B 증식 보충제, 10ng/ml bFGF (SCT Catalog # 02634), 10 ng/ml EGF (SCT Catalog # 02633), 4㎍/ml 헤파린 (SCT Catalog # 07980), 2.5ml FBS (5%)와 항생제가 보충된 2ml의 완전 EpiCult 배지 (EpiCult-B 기본 배지(StemCell Technologies SCT사, Catalog # 05610))와 2.5x 콜라게나제/히알루로니다제(예컨대, 생쥐 당 500㎕ 10x 콜라게나제 + 1.5ml Epicult) (SCT Catalog # 07912)로 50ml Falcon 튜브에서 37℃로 2.5시간 동안 분해하였다. 격렬하게 섞은 후에, 펠렛을 10 mL HF 배지로 세척하였다(행크 균형 염 용액 변형된 SCT Catalog # 07913 + 2% FBS). 그 다음에 펠렛을 2ml의 미리-가온된 트립신-EDTA에 다시 부유시켰다. 10mL의 HF 배지로 한 번 더 세척한 후에, 펠렛을 2mL의 미리-가온된(37℃), 1 mg/mL DNAse I (SCT Catalog # 07900) 200㎕가 보충된 디스파아제(dispase) (SCT Catalog # 07913)에 다시 부유시켰다. HF에 마지막으로 세척한 후에 세포를 계수하였고, FACS 염색을 준비하였다. 백만개의 세포를 다음의 항체와 함께 실온에서 10분간 인큐베이션시켰다: 상피세포를 표지하는 바이오틴 (biotin)-접합된 항-CD31 (Catalog # 553371; BD사), 및 조혈모세포를 표지하는 바이오틴화된(biotinylated) Cd45⁺와 Ter119⁺ (StemSep murine chimera cocktail # 13058C; Stem Cell Technologies사; 3.5㎕/100㎕ 용량). 조혈모세포와 상피세포fmf 스트렙아비딘-접합된 APC(# 554067; BD사)를 사용하는 FACS에 의해 배제하였다. 이전에 기술한 대로¹⁰ ^,11, 유선 줄기세포 집단을 확인하기 위하여 항-CD49f (# 551129; BD사)와 CD24 (# 553261; BD사)로 염색을 사용하였다.

실시예 9: 암 줄기세포 어세이 분석. 유선암 줄기세포, 즉, 종양 개시 세포(TIC)의 자가-재생은 과거에 기술한 대로 맘모스피어 어세이를 사용하여 분석하였다⁶ ^,12. 간단히 말하면, 비슷한 크기의 종양 (1cm³ 용적)을 잘게 다져서, 2.5x 콜라게나제/히알루로니다제(SCT Catalog # 07912) 함유 완전한 EpiCult 배지에서 분해시켰다. 그 후, 6웰 초-저 부착 플레이트(Corning Costar사)를 사용하여, B27 (Invitrogen사), 20ng/ml의 EGF (Protech사) 및 20 ng/ml bFGF (Sigma사)가 보충된 무혈청 EpiCult 배지에서 2x10⁵개의 세포를 배양하였다. 7일 이상 형성된, 일차 맘모스피어를 부드러운 원심분리로 모았으며(800 rpm), 트립신(trypsin, 0.05%, 10분)으로 단세포 부유액으로 소화 분해하였고, 위와 같이 이차 맘모스피어를 형성하는 능력에 대하여 분석하였다.

실시예 10 : 부착- 비의존적 성장.

세포가 반고형 한천에서 자라는 능력을 이전에 기술한 대로 분석하였다¹³. 간단히 말하면, DNA 등급 아가로스(DMEM에 1%)를 바닥층으로 사용하였고(6웰 플레이트에 2ml), 1.5ml 아가로스(DMEM에 0.3%)에 2x10⁴개의 SKBR3 세포를 접종하였다. 세포를 10% FCS가 보충된 1.5ml DMEM으로 중첩하여 24일 동안 배양하였다.

실시예 11: 프로게스테론 분석.

ㆍ 1차 인큐베이션 : 30 μL 샘플을 바이오티닌 표지된 단일클론의 프로게스테론-특이적 항체와 루테늄 복합체(ruthenium complex)로 표지된 프로게스테론 유도체의 존재 하에서 프로게스테론을 분비하기 위해 Danazol과 함께 인큐베이션시켰다. 샘플로부터의 프로게스테론은 항체 결합 부위에 대하여 표지된 프로게스테론 유도체와 경쟁한다.

ㆍ 2차 인큐베이션 : 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 미세입자들의 첨가 후, 복합체는 바이오틴과 스트렙타비딘의 상호작용을 통하여 고체상에 결합하게 된다. 고체상에 결합한 표지된 프로게스테론 유도체의 양은 샘플의 프로게스테론 함량에 역으로 비례한다.

ㆍ 미세입자가 자기적으로 전극의 표면에 포획된 측정 셀(measuring cell) 내로 반응 혼합물을 흡입시킨다. 그 후에 결합되지 않은 물질들은 Procell로 제거하였다. 이어서 전극에 대한 전압의 적용은 광전자 배증기(photomultiplier)에 의해 측정되는 화학 발광성 방출을 유도한다.

ㆍ 결과는 2점 보정에 의해 기구-특이적으로 생성된 보정곡선 및 시약 바코드(barcode)를 통해 제공되는 모곡선(master curve)을 통하여 결정된다.

시약 - 작업 용액( Reagent - working solutions )

M 스트렙타비딘-코팅된 미세입자(투명한 캡), 한 개의 병, 6.5mL: 스트렙타비딘-코팅된 미세입자, 0.72mg/mL; 보존제.

R1 항-프로게스테론-항체~바이오틴(회색 캡), 한 개의 병, 10 mL: 바이오틴화된 단클론성 항-프로게스테론 항체 (생쥐) 0.15mg/L, 인산 완충액 25mmol/L, pH 7.0; 보존제.

R2 프로게스테론-펩티드~Ru(bpy)²⁺(검정 캡), 한 개의 병, 8mL: 루테늄 복합체(ruthenium compley)로 표지된 합성 펩티드에 결합된(식물성 기원의) 프로게스테론, 10 ng/mL; 인산 완충액 25 mmol/L, pH 7.0; 보존제.

실시예 12: 통계.

본 명세서의 모든 값은 평균들 (+/-)sem으로 나타내었다. 그룹간의 비교는 스튜던트의 t-검정으로 실시하였다. 종양 발병의 케플렌-메이어(Kaplan-Meier) 분석의 경우 로그 랭크 시험(log rank test)을 수행하였다. P 0.05를 통계적으로 유의하다고 받아들였다. 로그 랭크 시험에 추가로 실험동물의 숫자가 주어진 경우 동일한 종양의 발병 시점에 대한 귀무가설(null hypothesis)을 정확하게 거부하는 확률을 계산하기 위하여 포스트 혹 파워 분석(post-hoc power analysis)을 수행하였다(PS Power and Sample Size Calculations, 웹사이트 biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize). RANK^△ ^mam 동물을 포함한 연구의 경우, 귀무가설은 0.933의 확률 (파워)로 거부될 수 있고, IKKα^△ ^mam 동물은 0.766의 확률로 거부될 수 있다. 이 귀무가설의 시험과 관련된 유형 1 오류의 확률은 0.05 이다. 인간의 결과는 지시된 바에 따라 한 쌍의 t-검정인 맨 휘트니 유 테스트(Mann Whitney U test) 또는 스피어만 순위 검정(Spearman rank test)을 사용하여 분석하였다.

실시예 13: RANKL 수준에 대한 프로게스틴의 효과

MPA (메트록시프로게스트론 아세테이트, 대표적인 프로게스틴) 펠렛을 암컷 생쥐에 이식하였고, RANKL 발현을 분석하였다. MPA의 처리는 분리된 유선 상피세포에서 RANKL mRNA의 2000배 이상의 유도를 초래하였다(도 1a). RANK, RANKL 오스테오프로게스트린(osteoprogestrin, OPG) 유인 수용체의, PTHrP (RANKL을 유도하는 것으로 알려짐), 및 TRAIL (OPG와 결합하는 것으로 알려짐) mRNA 발현은 분리된 유선 상피세포에서는 변화되지 않았다. 면역조직화학법을 통해 유선에서 RANKL 단백질이 유도됨을 확인하였다(도 1b). 분리된 유선 상피세포의 웨스턴 블럿팅은 또한 19 kDa의 RANKL 가용성 형태의 유도를 나타내었고(도 5a), 이를 대부분은 대체 스플라이싱(도 5b-d) 뿐만 아니라, 세포 표면으로부터 RANKL을 박리시키는 것으로 알려진 2개의 프로테아제인, MMP14와 ADAM17/TACE 의 유도에 기인한 것일 것이다(도 5e). 시험관 내 세포 배양 분석에서 MPA에 대한 RANKL의 유도는 관찰되지 않았는데(도 6a-c), 이는 프로게스틴이 그 자체로는 RANKL 발현을 유도하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다. MPA가 유방암 세포에서 프로락틴(prolactin)과 프로락틴 수용체의 전사를 유도하고, 프로락틴이 Jak2/Stat5 시그널링을 통하여 RANKL을 직접적으로 유도할 수 있기 때문에, MPA가 프로락틴 수용체 녹아웃 생쥐의 유선에서 RANKL을 유도하는지 여부를 시험하였다. MPA가 암컷 대조군 생쥐에서 RANKL 단백질의 실질적인 생산을 유도하는 반면, 프로락틴 수용체 돌연변이체에서는 RANKL 유도가 검출되지 않았다(도 1c). 이 결과는 프로락틴 수용체를 통해서 유선에서 MPA가 대규모의 RANKL 발현을 촉발하고/하거나 프로락틴과 MPA가 RANKL 유도를 위해 협력함을 나타낸다.

실시예 14 : RANKL / RANK 손상 생쥐에서 RANKL 수준에 대한 프로게스틴의 효과 :

MPA-매개 종양형성에서 RANKL/RANK의 잠재적인 역할을 시험하기 위하여 유도성 RANK 대립유전자의 K5-Cre 및 MMTV-Cre 매개 절단을 이용해 유선 상피세포에서 RANK를 제거하였다(K5-Cre rank ^flox ^/△ 생쥐와 MMTV-Cre rank ^flox ^/ ^△생쥐). 양쪽 생쥐 계통은 건강한 것으로 보이며, 정상적인 골격 구조와 림프절 형성을 나타내었다. 예상한 대로, K5-Cre rank ^flox ^/△ 생쥐는 사춘기에서 명백하게 정상적인 유선 발달을 나타내었나; 이러한 생쥐에서는 임신 동안에 젖을 분비하는 소엽꽈리 구조가 발달하지 않았다(도 7a,b). 이러한 영향은 이식 수술을 이용하여 세포 자율적이었다(도 7c). MMTV-Cre rank ^flox ^/△생쥐에서, 무산부 암컷에서의 유선 발달과 임신시 젖을 분비하는 소엽꽈리 구조의 형성은 정상적으로 보였다(도 8a-c). 정상적인 생리현상에서 특정한 세포 집단에 영향을 줄 수 있는 발달 영향의 임의의 논란을 K5-Cre rank ^flox/△생쥐에서 배제하기 위하여, MMTV-Cre rank ^flox ^/△생쥐를 이후의 모든 실험에 사용하였다. 이러한 MMTV-Cre rank ^flox ^/△ 돌연변이 생쥐는 이하에서는 RANK^△ ^mam이라고 명명한다.

실시예 15: 프로게스틴 투여 시 RANKL 활성화의 기전

야생형 집단에서, MPA 처리는 유선 상피세포들의 대규모 증식을 촉발시킨다. 유선 상피세포들의 MPA-유도 증식은 RANK^△ ^mam 암컷에서 현저하게 감소하였다(도 1d; 도 9a-c). 따라서, 무산부 암컷으로 RANKL의 복강 내 주입은 RANK를 통한 유선 상피세포의 증식을 촉발시켰다(도 9d,e). 최근에는 내재적인 프로게스테론이 임신¹⁵과 발정주기¹ ⁶ 동안 Lin-CD24와 CD49f^hi 줄기세포의 개수에 영향을 미친다는 것이 보고되었다. 두 연구에서, RANKL/RANK시스템이 생체 내 전신의 항체 차단(blocking) 연구와 RT-PCR 발현을 기반으로 한 것이 의도되지만 이것이 이차적 영향이 아닌 유선 상피세포에서 RANKL-RANK의 직접적인 영향인지 여부는 알려져 있지 않다. 그러므로, MPA와 같은 프로게스틴이 또한 Lin-CD24⁺+CD49f^hi 세포를 확장할 수 있는지 여부를 분석하였다. MPA 처리는 Lin-CD24⁺+CD49f^hi 세포의 2배 확장을 야기했다. 이러한 확장은 MPA-처리된 RANK^△ ^mam 암컷에서는 일어나지 않았다(도 1e,f). 이러한 결과는 RANKL/RANK 시스템이 Lin-CD24⁺+CD49f^hi 세포의 확장을 조절한다는 첫 번째 유전적 증거를 제공한다.

실시예 16. 대조군과 RANK / RANKL 결손 생쥐에서 RANK / RANKL 을 통한 암 발달에 대한 프로게스틴의 영향

여성 건강 발의(WHI) 및 백만 여성 연구에 따르면, 프로게스틴의 사용은 유방암의 발병 및 발병빈도와 역학적으로 연관되어 왔다. 프로게스틴-유도된 유선암 DNA 손상 제제인 디메틸벤즈 안트라센(DMBA)의 존재시에 서방성 MPA 펠렛의 이식 유선암을 촉발한다(도 2a; 도 10a,b).

대조군 암컷에서, MPA/DMBA 처리는 촉진가능한 유선 종양의 신속한 발병을 유도하였다. 흥미롭게도, RANK^△ ^mam 암컷 생쥐에서, MPA/DMBA-유도한 유선암의 발병이 현저히 지연됨이 관찰되었다(도 2b; 도 10c,d). RANK^△ ^mam 암컷에서 지연된 종양의 발병은 또한 현저히 향상된 생존을 야기했다(도 10e). RANK^△ ^mam 암컷에서 발달한 종양의 서던 블럿팅으로 RANK의 효율적인 제거를 확인하였다(도 10c). 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷에서 발달한 모든 종양은 사이토케라틴(CK) 5와 CK14 양성 기저세포 아형(subtype)의 E-캐드헤린 발현 도관 선암종의 전형적인 조직병리학적 특징을 나타냈다(도 2c, 도 11a,b). 그러나, RANK^△ ^mam 암컷에서 발생하는 도관의 선암종은 종종 넓은 범위의 편평상피화생을 발달시켰다(도 2c, 도 11a,b). 이러한 조직병리학적 변화와 같은 맥락으로, 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷 유래의, 유선 암종의 발현 프로파일링을 유전자 클러스터링에 의해 분석된 바와 같이 분자적 특징에서 독특한 차이점을 나타냈다.

실시예 17: 프로게스틴의 시험처리와 DNA 손상 후 암의 발병:

RANK^△ ^mam는 프로게스틴-유도된 유선암에서 지연된 발병을 보여주었기 때문에, 이번에는 MPA/DMBA 시험처리 후 초기 단계에서 유선 종양의 발생빈도를 분석하였다. 마지막 DMBA 처리 1주일 후, 모든 RANK 발현 대조군 암컷은 이미 다발성 상피내 암종 및 심지어 침습적 유선 종양까지도 나타내었다. 대조적으로, 마지막 DMBA 시험처리 1주일 후, RANK^△ ^mam 동물에서는 상피내 암종은 거의 관찰되지 않았으며 침습적 유선 암종은 전혀 관찰되지 않았다(도 2d). 마지막 DMBA 시험처리 3주 후에, 상피내 암종의 발생빈도는 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷에서 비슷했으나, 침습적 암종은 RANK^△ ^mam 암컷에서 여전히 매우 드물었다(도 2e). 게다가, 증식은 RANK^△ ^mam 암컷으로부터의 종양에서 전형적으로 감소하였다(도 2d,e). Mx-Cre rank ^flox ^/ ^flox 생쥐를 사용한, 유선 상피세포가 아닌, 간, 심장, 근육, 및 조혈 부분을 포함하는 다양한 다른 조직에서 RANK의 제거는 MPA/DMBA-유도된 유선암의 발병을 지연시키지 않았는데(도 12a-c), 이는 RANK/RANKL 손상의 효과가 유선 상피세포에 한정된다는 것을 시사한다. 게다가, 유선암의 유전적 모델인 MMTV-NeuT 형질전환 생쥐에서, RANK의 유선 특이적인 제거는 유선암 발생 빈도(도 12d,e), 또는 선암종의 조직병리학적 특성을 변화시키지 않았다(도 13a-c). 이러한 NeuT 종양에서 매우 낮은 수준의 RANKL이 관찰되었다(도 13d,e). 그러므로, 유선 상피세포에서 RANK의 유전적 비활성화는 프로게스틴-유도된 유선암의 현저히 지연된 발병과 감소한 발생빈도를 야기한다.

실시예 18: RANKL 시그널링 :

유선 상피에서 IKKα-NFκB-사이클린 D1를 통한 RANKL-RANK 시그널링은 도 14a에 나타내었다. RANKL 자극은 실제로 일차 생쥐 유선 상피세포(MECs)에서 p65 NFκB와 IκBα의 인산화를 야기했다(도 3a). 게다가, MEC의 RANKL 자극은 p38-MAPK 및 ERK의 인산화를 촉발시켰다(도 14b). RANK가 생체 내 프로게스틴의 NFκB-사이클린 D1 활성화 하류를 매개하는지 여부를 직접적으로 보여주기 위하여, 생쥐에게 MPA를 시험처리하였다. 3일 동안의 MPA 처리는 활성화된 NFκB 경로를 나타내는, 인산화된 IκBα의 핵 축적과, 유선 상피세포에서 사이클린 D1 단백질 발현의 유도를 야기했으며, 이를 모두 RANK^△ ^mam 암컷에서 심하게 감소하였다(도 15a,b). 게다가, 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷에서 분리된 MPA/DMBA-유도된 유선 선암종에서, NFκB 경로의 손상된 활성화(도 3b) 및 사이클린D1의 하향조절된 mRNA 발현을 발견하였다(도 3c). 이러한 일차 종양에서 또한 전사적으로 Id2 경로에 의해 억제되는¹⁷, p21 mRNA의 상향조절이 관찰되었다(도 3c). Id2 경로는 유선 상피세포에서 RANKL/RANK에 대해 유전적으로 확인된 두 번째 하류 경로이다¹⁷. 이러한 발견을 인간에게까지 확장하기 위하여, 인간의 SKBR3 유방 종양세포를 분석하였다. RANKL 자극은 SKBR3 세포에서 NFκB, p38-MAPK, 및 ERK의 활성화 및 증식을 유도하였다(도 16a,b). RANKL 자극의 효과를 더 시험하기 위하여, 이러한 세포가 생체 내 종양 형성과 매우 연관이 있는¹⁸, 부착-비의존적 방식으로 자랄 수 있는 능력을 평가하였다. 중요하게도, EGFR 자극과 비슷하게, RANKL이 반고형 한천에서 SKBR3 세포의 성장을 유도함이 되었는데(도 3d), 즉, RANK 시그널링은 증식을 촉발시킬 뿐만 아니라 부착-비의존적 성장을 유도하기 위한 형질전환 제제로서 작용한다.

파골세포에서, NFκB 경로 이외에, 칼시뉴린(calcineurin)- NFATc1 시그널링 경로가 RANKL-RANK 매개 파골세포 형성에 필수적인 것을 발견하였다. NFATc1은 또한 RANKL 매개 파골세포 형성 동안에 Id2 경로에 의해 조절될 수 있다. 이러한 핵심적인 RANKL-RANK 활성화 경로가 또한 MPA/DMBA-유도된 유선암에서 작동 가능한 지 여부를 평가하기 위하여, 유선 상피세포에서 NFATc1과 IKKα를 제거하기 위해서 MMTV-Cre nfatc1 ^flox ^/△(NFATc1^△ ^mam)과 MMTV-Cre Ikkα^flox ^/ ^flox (IKKα^△ ^mam) 생쥐를 생성하였다. 양쪽 돌연변이체 생쥐 종족은 건강한 것으로 보였고, 분석한 어떠한 기관에서도 명확한 결함을 보이지 않았다. MPA/DMBA로 시험처리 했을 때, IKKα^△ ^mam 생쥐는 유선암의 지연된 발병을 보였다(도 3e). IKKα^△ ^mam 생쥐로부터의 종양에서 IKKβ와 IKKγ의 정상적인 발현이 발견되었으나, 증가된 IκB 단백질 수준과 감소된 p65 NFκB 인산화에 의해 결정된 것과 같이 감소된 NFκB의 활성(도 3b)과 NFκB 표적 유전자인 사이클린 D1(도 3c)의 하향조절된 mRNA 발현은 IKKα가 이를 종양에서 실제로 NFκB 시그널링에 요구된다는 것을 시사한다. 예상했던 대로, Id2 경로 유전자인 p21은 IKKα^△ ^mam 생쥐로부터의 종양에서 영향을 받지 않았다(도 3c). 대조군과 NFATc1^△ ^mam 생쥐 사이 종양의 발병에 있어 유의미한 차이는 관찰되지 않았는데(도 16c,d), 이는 파골세포 전구세포와 유선 상피세포 사이에 하류 시그널링 요구조건이 다르다는 것을 시사한다. 그러므로, 유선 상피세포에서, NFATc1이 아닌, IKKα의 제거는 프로게스틴-유도된 유선암의 발병에 영향을 미친다.

실시예 19: DNA 손상으로 인한 호르몬-유도된 암의 발생.

MPA 처리가 유선 상피세포의 신속한 대규모 증식을 유도 하더라도, MPA 단독으로는 DNA 돌연변이를 유도하기 위한 발암물질을 필요로 하는 유선암을 촉발하기에 충분하지 않다. 세포주기 정지와 아폽토시스와 같은 DNA 손상에 대한 세포 반응에서 RANKL의 역할을 분석하기 위하여, 생쥐 일차 유선 상피세포(MEC)와 RANKL-반응성 인간 유방암 세포주 SKBR3을 DNA 손상물질인 독소루비신(doxorubicin)이나 γ-방사선조사로 처리했다. RANKL 처리는 γH2AX와 p53 의 유도, 또는 기능적 DNA 손상 반응의 원형적(prototypic) 마커인 Chk1의 활성화를 변화시키지 않았다(도 17a). 게다가, RANKL은 γ-방사선조사(도 17b,c) 또는 독소루비신에 의한 DNA 손상 후 초기 세포주기 정지를 변화시키지 않았다(도 18a, b). 놀랍게도, RANKL 처리는 γ-방사선조사(도 17b,c) 및 독소루비신-유도된 DNA 손상(도 18a,b)에 대한 세포사멸로부터 뚜렷한 보호를 초래하였다. 기전적으로, 전-아폽토시스 분자인 Bim, Puma, 및 Noxa의 γ-방사선조사-유도된 상향조절은 RANKL의 존재시에 일어나지 않았다(도 18c). 생체 내에서 암컷 생쥐의 γ-방사선조사는 유선 상피세포의 아폽토시스의 5배 유도를 초래함을 나타내었다¹⁹. 그러므로 γ-방사선조사-유도된 세포사멸에 대한, MAP-RANKL/RANK 축의 효과를 평가하기 위하여 이러한 이전에 확립된 시스템을 사용하였다. MPA 처리는 생체 내에서 γ-방사선조사-유도된 아폽토시스로부터 유선 상피세포를 실제로 보호하였다. 유선 상피세포에서 RANK 발현의 손실은 γ-방사선조사-유도된 세포사멸에 대한 MPA-조사의 보호효과를 파기하였다(도 3f,g). 게다가, IKKα 경로는 γ-방사선조사 후 유선 상피의 MPA-유도된 유선 상피의 보호와 관련이 있었다(도 19a,b). 따라서, 세포주기 진행을 촉진하는 것에 더하여, MPA는 RANKL/RANK 및 IKKα 시그널링을 통하여 DNA 손상 후 세포사멸로부터 보호할 수 있다.

실시예 20: 종양 개시 줄기세포:

최근에 유선 종양이 줄기세포 집단으로부터 발생할 수 있다는 것이 인간과 생쥐에서 밝혀졌다²⁰. 그러므로, RANK의 손실이 유선암 줄기세포, 즉 종양 개시세포(TIC)에게 영향을 미치는지 아닌지 여부를 시험하였다. TIC는 비부착성 맘모스피어를 형성하는 이들의 능력에 의해 기능적으로 분석될 수 있다²⁰. 대조군과 RANK^△ ^mam 암컷으로부터 새로 분리한 암세포는 일차 맘모스피어를 형성할 수 있었으나, 단일세포의 부유 후 이차 맘모스피어를 형성하는 능력이 RANK^△ ^mam 생쥐 유래 TIC를 사용하여 현저하게 손상되었다(도 4a,b). 이러한 결과는 RANK 활성 또는 발현의 손실이 암 줄기세포의 자가재생 능력을 상당히 손상시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 21: 토론:

이러한 결과를 바탕으로, 어떻게 MPA와 같은 호르몬이 RANKL을 통해 암을 유도하는지에 대한 하기의 분자적 기전이 명백하다: MPA는 유선에서 RANKL의 엄청난 유도를 촉발한다. MPA에 대한 RANKL의 유도는 프로락틴 수용체 및 가능하게는 다른 중간산물의 발현을 요구한다. 유선 상피세포에서 RANK를 통한 RANKL은 이러한 세포를 세포주기로 유도하고, 중요하게도, γ-방사선조사를 포함한 DNA 손상에 대한 아폽토시스로부터 생쥐뿐만 아니라 인간 유선 상피세포를 보호한다. 게다가, RANKL/RANK은 유선암 줄기세포의 자가재생 및 부착-비의존적 성장을 조절한다. 그러므로, 프로게스틴-유도된 RANKL/RANK는 유선암을 개시하는 데 전제 조건인 손상된 유선 상피에 대해 성장과 생존 이점을 제공한다²¹. 이러한 효과는, 적어도 부분적으로는, IKKα-NFκB 시그널링 경로를 통해 매개된다. 수많은 여성들이 프로게스테론 유도체를 피임법 및 호르몬 대체요법에서 복용한다. 이러한 호르몬은 유방암이 발생하는 증가된 위험과 역학적으로 관련되어 왔다. 본 발명은 RANKL-RANK 시스템이 프로게스틴과 상피성 발암 사이의 중요한 분자적 연결고리라는 것을 보여준다. 그러므로 RANKL 억제는 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 새로운 접근법이다. RANKL 억제는 또한 방사선조사 또는 다른 DNA 손상 제제에 근거한 것과 같은 항암요법을 위해 주요 암세포에 사용될 수 있다.

참조문헌:

1. Hanada, R. et al. Central control of fever and female body temperature by RANKL/RANK. Nature 462, 505-9 (2009).

2. Tarutani, M. et al. Tissue-specific knockout of the mouse Pig-a gene reveals important roles for GPI-anchored proteins in skin development. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7400-5 (1997).

3. Gareus, R. et al. Normal epidermal differentiation but impaired skin-barrier formation upon keratinocyte-restricted IKK1 ablation.Nat Cell Biol 9, 461-9 (2007).

4. Aliprantis, A.O. et al. NFATc1 in mice represses osteoprotegerin during osteoclastogenesis and dissociates systemic osteopenia from inflammation in cherubism. J Clin Invest 118, 3775-89 (2008).

5. Aldaz, C.M., Liao, Q.Y., LaBate, M. & Johnston, D.A. Medroxyprogesterone acetate accelerates the development and increases the incidence of mouse mammary tumors induced by dimethylbenzanthracene. Carcinogenesis 17, 2069-72 (1996).

6. Cao, Y., Luo, J.L. & Karin, M. IkappaB kinase alpha kinase activity is required for self-renewal of ErbB2/Her2-transformed mammary tumor-initiating cells. ProcNatlAcadSci U S A 104, 15852-7 (2007).

7. Robinson, G.W. &Hennighausen, L. Inhibins and activins regulate mammary epithelial cell differentiation through mesenchymal-epithelial interactions. Development 124, 2701-8 (1997).

8. Fata, J.E. et al. The osteoclast differentiation factor osteoprotegerin-ligand is essential for mammary gland development. Cell 103, 41-50 (2000).

9. Lacey, D.L. et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93, 165-76 (1998).

10. Stingl, J. et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature 439, 993-7 (2006).

11. Shackleton, M. et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature 439, 84-8 (2006).

12. Dontu, G. et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.Genes Dev 17, 1253-70 (2003).

13. Freedman, V.H. & Shin, S.I. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth in semi-solid medium. Cell 3, 355-9 (1974).

14. Jones, D.H. et al. Regulation of cancer cell migration andbone metastasis by RANKL. Nature 440, 692-6 (2006).

15. Asselin-Labat, M.L. et al. Control of mammary stem cell function by steroid hormone signalling. Nature.

16. Joshi, P.A. et al. Progesterone induces adult mammary stem cell expansion. Nature.

17. Kim, N.S. et al. Receptor activator of NF-kappaB ligand regulates the proliferation of mammary epithelial cells via Id2. Mol Cell Biol 26, 1002-13 (2006).

18. Freedman, V.H. & Shin, S.I. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth in semi-solid medium. Cell 3, 355-9 (1974).

19. Ewan, K.B. et al. Transforming growth factor-beta1 mediates cellular response to DNA damage in situ. Cancer Res 62, 5627-31 (2002).

20. Pece, S. et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell 140, 62-73.

21. Hanahan, D. & Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70 (2000).

<110> IMBA - Institut Fur Molekulare Biotechnologie GmbH <120> Breast Cancer Therapeutics <130> IPA130276 <150> EP 10178346.2 <151> 2010-09-22 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gctcatagct cttctccagg g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cctgaaccct aaggccaacc g 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctgaggccca gccatttg 18 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gttgcttaac gtcatgttag agatcttg 28 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cttggacacc tggaatgaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cagcactcgc agtctgagtt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctgtgcgccc tccgtatctt a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggcggccagg ttccacttga g 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtggccttgt cgctgtctt 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gcgcttggag tgatagaaat ctg 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gcgccgggcc agccgagact ac 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gtcccacacg agggtccgct gc 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tgcgcactcc ggcgtcccg 19 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ccgagactac ggcggatcct aacag 25 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tcagtctatg tcctgaactt tgaaagcccc 30 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ccgcctgatg ccctccgctg tat 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cgggcccact cctcctcctc cac 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 actttgtctc caatcctccg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gtgcaccgga cataactgtg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gttgaactcg tctccgatcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gcccctacct ccctacagac 20

Claims

환자에게 치료적 유효량의 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 원발성암(primary cancer)을 예방하는 방법.
원발성암 기원의 조직에서 암 세포를 감소시키거나 또는 암 진행을 예방하기 위해 환자에게 치료적 유효량의 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 원발성암을 치료하는 방법.
암 세포, 바람직하게는 원발성암의 세포인 상기 암 세포에 RANKL 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 세포 아폽토시스(apoptosis)를 증가시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 암이 유방암 또는 전립선암이거나, 제3항에 있어서 암 세포가 유방암 세포 또는 전립선암 세포인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 성 호르몬 수용체, 바람직하게는 프로게스테론 또는 에스트로겐 수용체를 가진 암 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 호르몬 의존성 암인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 암, 특별히 호르몬 의존성 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 RANKL 억제제.
환자에서 호르몬 의존성 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 RANKL 억제제로서, 환자는 호르몬 치료, 바람직하게는 프로게스테론 또는 프로게스틴을 사용한, 바람직하게는 호르몬 대체 요법, 또는 호르몬 피임을 받은 것인 RANKL 억제제.
바람직하게는 성 호르몬인, 호르몬 요법, 특히 호르몬 대체 요법과 병용하여 환자에서 호르몬 의존성 암의 치료 또는 예방에 사용하거나 특히 암이 발생할 위험을 감소시키기 위해 호르몬 피임제와 병용하여 사용하기 위한 RANKL 억제제.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 유선암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 억제제.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 상피세포 기원인 것을 특징으로 하는 억제제.
제7항 내지 제11항에 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 항암 요법, 바람직하게는 방사선요법 또는 화학요법과 병용하거나 또는 초회감작(priming)하기 위한 억제제.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 원발성암을 치료 또는 예방하거나 암의 재발을 치료 또는 예방하기 위한 억제제.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, RANKL 억제제가 RANKL 또는 RANK 리간드, 바람직하게는 데노수맵(Denosumab)과 같은 항-RANKL 항체, 또는 siRNA인 것인 억제제.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 유방 조직 세포 또는 유방암 세포, 및/또는 상피세포 또는 기저세포 및/또는 암 줄기세포로부터 선택된 암성(cancerous) 세포를 포함하는 것인 억제제.
RANKL 억제제 및 호르몬 또는 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴 또는 호르몬 피임제로부터 선택된 이의 유도체를 포함하는 약학적 조성물.
제16항에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 치료에 사용하기 위한 조성물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 추가로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 조성물.
제16항 또는 제18항에 있어서, 호르몬 요법에 사용하기 위한 조성물.
제19항에 있어서, 호르몬 요법이 피임 또는 호르몬 대체 요법인 것인 조성물.
화학요법 제제 및 RANKL 억제제를 포함하는 키트.
RANKL 억제제 및 호르몬 또는 에스트로겐, 프로게스테론, 또는 프로게스틴으로부터 선택된 이의 유도체 또는 호르몬 피임제를 포함하는 키트.