JP6310470B2 - 前立腺がんを処置するための方法 - Google Patents

Description

本発明の背景
本発明の分野
本発明は、がんの処置に関する。より具体的には、本発明は、前立腺がんの処置に関する。

関連技術の概要
米国の男性における最も一般的な悪性腫瘍として、前立腺がんは、依然として治りにくい疾患である。他のヒトがんとは対照的に、前立腺がんは、アンドロゲン性のステロイドに極度に依存し、該ステロイドは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を通じてそれらの生物学的作用を発揮する^１、２。

ＡＲ活性化のための古典的なモデルは、リガンドの結合によって誘導される構造変化、核移行の増加、および標的遺伝子の転写を調節する近位プロモーターまたは遠位エンハンサーにおけるアンドロゲン応答配列(androgen-responsive element)への結合を含む^３。ＡＲに調節される遺伝子は、前立腺腫瘍細胞の成長、浸潤および転移に不可欠である^２、３。より重要なことに、近年の研究は、クロマチンに対するＡＲ結合動態が前立腺がん細胞において変化し、細胞状況に依存して、種々のケースにおいて遺伝子発現に対して種々の効果をもたらすことを示す^４〜６。したがって、ＡＲに媒介される転写の分子メカニズム、特に新薬によって標的にされ得る分子メカニズムを完全に理解することが非常に重要である。

進行性前立腺がん患者への第一選択処置(first line treatment)は、アンドロゲン合成経路を阻害するか、またはＡＲ機能に拮抗するかのいずれかによってＡＲシグナリングを抑制する、アンドロゲン遮断療法である^２。アンドロゲン遮断療法に強く応答していたにもかかわらず、患者はしばしば、より悪性度の高い、治療抵抗型の、去勢抵抗性(castration refractory)前立腺がん（ＣＲＰＣ）と称する疾患を再発する^７、８。近年の研究は、ＣＲＰＣ腫瘍細胞のほとんどが、内因性アンドロゲンシグナリング系を利用し続け、ＡＲ機能の回復を通じてそれらの成長を駆動することを示した^９〜１１。ＡＲ再活性化のメカニズムは、ＡＲ遺伝子増幅、リガンド非依存性のＡＲのトランス活性化、または、細胞内アンドロゲン合成の活性化を含む^{１２〜１４}。新規の抗アンドロゲン治療剤は、新しい強力なテストステロン合成インヒビター（アビラテロン）^{１５、１６}および高親和性の抗ＡＲ薬（MDV-3100、エンザルタミドとしても知られる）^{１７、１８}を含み、ＣＲＰＣを処置するために開発されつつある。

臨床研究は、これら薬物が生存優位性を与えることを示したが^{１３、１９〜２１}、ＣＲＰＣは未だ、治癒されるようになることとは程遠く、これら薬物に対する抵抗性を獲得した後の新しい有効な処置を必要とする。アンドロゲンシグナリングを遮るための既存の方法は全て、リガンドの産生またはリガンド−受容体結合(association)を阻害することに頼っているが、これらは、がんにおいて、ＡＲ再活性化の多重メカニズムによって克服され得る。いくつかの新規な抗ＡＲ薬は近年、ＡＲタンパク質分解を誘導することによってＡＲシグナリングを遮るように開発されている^{２２〜２４}。しかしながら、近年の研究は、ＡＲが、特定のがん促進遺伝子を誘導するのみならず、アンドロゲン合成、ＤＮＡ合成および増殖に関与する他の遺伝子もまた抑えることを示した^２５。ＡＲの作用全てを遮るか、またはＡＲ分解を誘導することによる後者の遺伝子の活性化は、アンドロゲン依存性（ＡＤ）からアンドロゲン非依存性（ＡＩ）の状態へのＰＣａ細胞の推移を刺激し得る。

したがって、前立腺がん患者において、活性過多のアンドロゲンシグナリングを遮断し、ホルモン療法の有効性を伸ばすために、ＡＲに媒介される転写を増強する他の分子を標的にする戦略を開発する必要がある。特に、ＡＲに媒介される転写の誘導を阻害するためであって、ＡＲによる転写を抑えるためではない、という戦略を開発する必要がある。

本発明の概要
本発明は、前立腺がん患者において、活性過多のアンドロゲンシグナリングを遮断し、ホルモン療法の有効性を伸ばすために、ＡＲに媒介される転写を増強する他の分子を標的にする新しい戦略を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、リガンド−ＡＲ相互作用に非依存的に機能するＡＲシグナリングの阻害のための新規方法を発見し、該方法は、２つの密接に関わる転写調節セリン／スレオニンキナーゼであるＣＤＫ８およびＣＤＫ１９の阻害に基づく。

ＣＤＫファミリーのよりよく知られているメンバー^２６とは対照的に、密接に関わるＣＤＫ８およびＣＤＫ１９は、転写を調節するが細胞周期は進行させず、それらの枯渇は、正常細胞^２７または多くの腫瘍細胞^{２８、２９}の成長を阻害しない。ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９は、転写調節メディエーター外においても作動し得る^{３１、３２}、該メディエーター複合体の構成要素の２種のアイソフォームである^３０。初期の研究は、ＣＤＫ８を、基本転写開始因子ＩＩＨ^３３および転写活性化因子の一群^３４のその負の調節に基づき、転写共抑制因子(co-repressor)として描写していた。しかしながら、近年の一連の報告は、ＣＤＫ８が、ｐ５３経路^３５、Ｗｎｔ／β−カテニン経路^３６、血清応答ネットワーク^２８、ＴＧＦβシグナリング経路^３５、ならびに、甲状腺ホルモン受容体^３７およびステロール調節エレメント結合タンパク質^３８−依存性の転写を含む、生物医学的関連性のある多重シグナリング経路において、正の転写調節因子としての役割を果たすことを実証した。

がんに関し、ＣＤＫ８は、メラノーマおよび大腸がん^{３６、３９}においてがん遺伝子として認識されており、近年ではがん幹細胞の表現型に関係するとされていた^４０。ＣＤＫ８とは対照的に、その脊椎動物パラログであるＣＤＫ１９は、ほとんどの組織においてＣＤＫ８と同じくらい高く発現されていないため、よく研究されてこなかった。しかしながら、ＣＤＫ１９は、正常の前立腺において発現する^４１。ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９の高い発現レベルはまた、乳がんおよび白金で処置された卵巣がんにおける低い無再発生存の予測マーカーとしても見出された^２９。さらに、ＣＤＫ８は、正常組織、結腸がんおよび線維肉腫細胞の、損傷によって誘導される腫瘍促進パラクリン活性のメディエーターであることが示された^２９。しかしながら、ＣＤＫ８またはＣＤＫ１９を、前立腺がんのＡＲ活性またはアンドロゲン非依存的成長と結び付ける優先的証拠は存在しなかった。

本発明は、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９のうち１以上に対する選択的インヒビターの有効量を対象へ投与することを含む、対象において前立腺がんを処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、インヒビターは、ＣＤＫ１９を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターは、２００ｎＭ未満のＫｄでＣＤＫ８を阻害し、および／または１００ｎＭ未満のＫｄでＣＤＫ１９を阻害する。

いくつかの態様において、前立腺がんは、アンドロゲン非依存性である。いくつかの態様において、前立腺がんは、アンドロゲン受容体遺伝子の増幅、アンドロゲン受容体遺伝子の突然変異、アンドロゲン受容体のリガンド非依存性トランス活性化および細胞内アンドロゲン合成の活性化のうち１つまたは２つ以上に起因してアンドロゲン非依存性である。
いくつかの態様において、インヒビターは、ＮＦ−κＢの活性亢進を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターは、基底のＮＦ−κＢレベルの亢進を阻害しない。

図面の簡単な説明
図１Ａは、ＣＤＫ１９タンパク質が、ＡＲ陰性（ＤＵ１４５およびＰＣ３）の前立腺がん細胞株、あるいは線維肉腫（ＨＴ１０８０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）および結腸癌（ＨＣＴ１１６）細胞と比較して、ＡＲ陽性（ＬＮＣａＰ、ＬＮ３、Ｃ４２、ＣＷＲ２２ｒｖ１）の前立腺がん細胞において、より高いレベルで発現することを示す。図１Ｂは、ＣＤＫ１９タンパク質が、ＡＲ陰性（ＰＣ３）の前立腺がん細胞、非悪性の前立腺上皮細胞（ＲＷＰＥ−１）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）および結腸癌（ＨＣＴ１１６）細胞と比較して、ＡＲ陽性（ＬＮＣａＰ、ＬＮ３、Ｃ４２、ＣＷＲ２２ｒｖ１）の前立腺がん細胞において、より高いレベルで発現することを示す。図１Ｃは、ＣＤＫ１９のＲＮＡが、ＡＲ陰性（ＰＣ３）の前立腺がん細胞、非悪性の前立腺上皮細胞（ＲＷＰＥ−１）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）および結腸癌（ＨＣＴ１１６）細胞と比較して、ＡＲ陽性（ＬＮＣａＰ、ＬＮ３、Ｃ４２、ＣＷＲ２２ｒｖ１）の前立腺がん細胞において、より高いレベルで発現することを示す。図１Ｄは、アンドロゲン処置が、ＣＤＫ８タンパク質を下方調節する一方、アンドロゲン枯渇が、ＬＮＣａＰ細胞において、ＣＤＫ１９およびＣＤＫ８タンパク質発現を上方調節することを示す。

図２Ａは、アンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ細胞のセネキシン(Senexin)Ａによる処置が、アンドロゲンが補充されたかまたはアンドロゲンを欠乏させたかのいずれかの条件下で、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ２、ＴＭＰＲＳＳ２およびＰＧＣ等のいくつかのアンドロゲン応答性遺伝子の、アンドロゲンにより刺激される転写活性化を有意に阻害することを示す。図２Ｂは、アンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ細胞のセネキシンＢによる処置が、アンドロゲンが補充された条件下で、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ２、ＳＧＫ１、ＫＬＦ５およびＰＧＣ等のいくつかのアンドロゲン誘導性遺伝子の、アンドロゲンにより刺激される転写活性化を有意に阻害することを示す。図２Ｃは、アンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ細胞のセネキシンＢによる処置が、ＡＲ、ＯＰＲＫ１、ＳＴＸＢＰ６およびＣＤＫ８等のいくつかのアンドロゲンによって阻害される遺伝子の阻害を妨げないことを示す。

図３は、セネキシンＢ（１μＭおよび４μＭにて）による、アンドロゲンを欠乏させたＬＮＣａＰ細胞の１時間の前処置は、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ２、ＴＭＰＲＳＳ２およびＰＧＣ等の、いくつかのアンドロゲン応答性遺伝子の、アンドロゲンに刺激される転写を有意に阻害すること示す。

図４Ａは、ＣＤＫ８とＣＤＫ１９をともに発現し、かつ全長の野生型ＡＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、セネキシンＡ（１μＭおよび５μＭ）は、Ｒ１８８１の存在下では、アンドロゲン応答コンストラクト（ＰＳＡ遺伝子プロモーター下のホタルルシフェラーゼレポーター）の活性化を有意に阻害するが、アンドロゲンフリーの培地中ではしないことを示す。図４Ｂは、ＣＤＫ８とＣＤＫ１９をともに発現し、かつ全長の野生型ＡＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、セネキシンＡ（１μＭおよび５μＭ）は、Ｒ１８８１の存在下では、アンドロゲン応答コンストラクト（ＰＧＣ遺伝子プロモーター下のホタルルシフェラーゼレポーター）の活性化を有意に阻害するが、アンドロゲンフリーの培地中ではしないことを示す。

図５は、ＣＤＫ８とＣＤＫ１９をともに発現し、かつ全長の野生型ＡＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、セネキシンＢは、Ｒ１８８１の存在下では、アンドロゲン応答コンストラクト（ＰＳＡ遺伝子プロモーター下のホタルルシフェラーゼレポーター）の活性化を有意に阻害するが、アンドロゲンフリーの培地中ではしないことを示す。

図６Ａは、ＬＮＣａＰ派生物であるＬＮ３およびＣ４−２ならびにＣＷＲ２２派生物であるＣＷＲ２２ｒｖ１アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞は、アンドロゲンが枯渇した条件下（ＣＳＳ培地中）で充分に生育するが、このアンドロゲン非依存性の生育がセネキシンＢにより強力に阻害されたことを示す。図６Ｂは、５μＭのセネキシンＢが、アンドロゲンが枯渇した条件下（ＣＳＳ培地中）で、ＬＮＣａＰ派生物であるＬＮ３の生育を強力に阻害し、ＣＷＲ２２派生物であるＣＷＲ２２ｒｖ１アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞の生育を有意に阻害すること、ならびに１０μＭのMDV3100（エンザルタミド）が、アンドロゲンを欠乏させた同じ条件下で、ＬＮＣａＰ−ＬＮ３細胞の生育は弱く阻害するが、ＣＷＲ２２ｒｖ１細胞の生育は阻害しないことを示す。図６Ｃは、ＬＮＣａＰ派生物であるＬＮ３およびＣ４−２ならびにＣＷＲ２２派生物であるＣＷＲ２２ｒｖ１のアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞が、アンドロゲン依存性の親のＬＮＣａＰ細胞と比較して、３日間のアンドロゲン欠乏（ＡＤ３）後にＡＲ依存性遺伝子であるＰＳＡおよびＫＬＫ２を高発現すること、ならびに、セネキシンＢが、アンドロゲン非存在下で生育したアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株３種全てにおいて、ＰＳＡおよびＫＬＫ２の発現を下方調節することを示す。図６Ｄは、５μＭのセネキシンＢが、アンドロゲン非存在下で生育したアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ−ＬＮ３およびＣＷＲ２２ｒｖ１において、ＰＳＡおよびＫＬＫ２の発現を強力に下方調節するのに対し、１０μＭのMDV3100（エンザルタミド）は、アンドロゲンが枯渇した同じ条件下で、ＬＮＣａＰ−ＬＮ３細胞においてＰＳＡの発現を弱く下方調節し、ＫＬＫ２の発現を下方調節せず、ＣＷＲ２２ｒｖ１細胞においてＰＳＡおよびＫＬＫ２のいずれの発現も下方調節しないことを示す。

図７は、アンドロゲンが枯渇したＣＳＳ培地中のＰＣ−３細胞の生育が、セネキシンＢによって阻害されることを示す。

図８は、ヌードマウスにおけるＬＮ３異種移植片の腫瘍容積成長曲線に対するセネキシンＢ処置の効果を示す。 図９は、マウス体重に対するセネキシンＢ処置の効果を示す。 図１０は、最終腫瘍重量に対するセネキシンＢ処置の効果を示す。

好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９のうち１以上に対する選択的インヒビターの有効量を対象へ投与することを含む、対象において前立腺がんを処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、インヒビターは、ＣＤＫ１９を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターは、２００ｎＭ未満のＫｄでＣＤＫ８を阻害するおよび／または１００ｎＭ未満のＫｄでＣＤＫ１９を阻害する。本発明の目的において、「ＣＤＫ８／１９の特異的インヒビター」は、それらが特定の他のＣＤＫを阻害する程度を大きく超えて、ＣＤＫ８あるいはＣＤＫ８およびＣＤＫ１９を阻害する小分子化合物である。いくつかの態様において、かかる化合物はさらに、ＣＤＫ９を大きく超える程度に、ＣＤＫ８を阻害する。好ましい態様において、かかる大きく超える程度は、ＣＤＫ９より少なくとも２倍大きい。本発明において有用な化合物は、ともに係属中のUS特許公開公報20120071477および20120071477ならびにPCT公報WO2013/116786に記載されている。阻害の程度は、ともに係属中のPCT公報WO2013/116786に教示されるアッセイによって測定される。

いくつかの態様において、前立腺がんは、アンドロゲン非依存性である。いくつかの態様において、前立腺がんは、アンドロゲン受容体遺伝子の増幅、アンドロゲン受容体遺伝子の突然変異、アンドロゲン受容体のリガンド非依存性トランス活性化および細胞内アンドロゲン合成の活性化のうち１つまたは２つ以上に起因してアンドロゲン非依存性である。

いくつかの態様において、インヒビターは、ＮＦ−κＢの誘導活性を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターは、基底のＮＦ−κＢレベルの上昇を阻害しない。用語「誘導されるＮＦκＢ転写活性」は、ＮＦκＢにより行われる転写機能が、基底のＮＦκＢ転写活性レベルを超えて行われることを意味する。用語「基底のＮＦκＢ転写活性」は、正常な状態の下で、すなわち疾患または障害の非存在下での細胞において、ＮＦκＢによって行われる転写機能のレベルを意味する。いくつかの態様において、細胞の核における活性型ＮＦκＢの量は増加しないが、むしろＮＦκＢのレベルのみが上昇する。

用語「処置すること」は、少なくともいくつかの疾患の兆候または症状を低減するか、取り除くことを意味する。用語「対象」はヒトを含む。用語「投与すること」、「投与」などは、以下でさらに述べられる。

いくつかの態様において、本発明の化合物は、生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤として投与される。用語「生理学的に許容し得る」は一般に、化合物の有効性を妨げず、かつ対象の健康状態と両立し得る材料を指す。用語「担体」は、賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソーム被包、または生理学的に許容し得る製剤における使用について当該技術分野において周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特徴が、特定の適用についての投与経路に依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含有する生理学的に許容し得る製剤の調製は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990等に記載されている。活性のある化合物は、処置される患者に重篤な毒性作用を及ぼさずに、予防的または治療的な有効量を患者へ送達するのに充分な量で、生理学的に許容し得る担体または希釈剤に含まれる。用語「有効量」または「充分な量」は一般に、少なくとも１種の疾患もしくは障害の症状または兆候の低減あるいは排除に影響を及ぼすのに充分な量を指す。

本発明の方法において、本発明の化合物の投与は、限定せずに非経口、経口、腫瘍内、舌下、経皮、局所、鼻腔、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、経粘膜、膣内を含むいずれかの好適な経路によって、経皮パッチによって、または点眼剤もしくはマウスウォッシュの形態でなされ得る。化合物または医薬製剤の投与は、疾患の症状または代理マーカーを低減するのに有効な投薬量および期間で、知られている手順を使用して実行され得る。

以下の例は、本発明をサポートする特定の態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しない。

例１
前立腺がんにおけるＣＤＫ８およびＣＤＫ１９の発現
図１Ａは、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＨＥＫ−２９３（胎児腎臓）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳がん）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）ならびに前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性）、アンドロゲン非依存性のＬＮＣａＰ派生物Ｃ４−２およびＬＮ３およびアンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞株ＣＷＲ２２ｒｖ１、ＤＵ１４５およびＰＣ−３における、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＡＲおよびＧＡＰＤＨ（正規化の基準）の免疫ブロッティングを示す。以下の一次抗体を、免疫ブロッティングのために使用した：ヤギ−抗ＣＤＫ８（Santa Cruz, sc-1521）、ウサギ−抗ＣＤＫ１９（Sigma, HPA007053）、ウサギ−抗ＡＲ（Santa Cruz, sc-13062）およびマウス−抗ＧＡＰＤＨ（Santa Cruz, sc-32233）。ＣＤＫ８は、唯一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては有意により低い発現を示すが、全細胞株において類似した発現レベルを示す。一方、ＣＤＫ１９は、ＨＴ１０８０およびＨＣＴ１１６細胞においては、ほぼ検出不可能であるが、ＡＲを発現する全ての前立腺がん株において発現する。

図１Ｂは、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＨＥＫ−２９３（胎児腎臓）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）、ＲＷＰＥ−１（不死であるが形質転換していない前立腺上皮細胞）ならびに前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性）、アンドロゲン非依存性のＬＮＣａＰ誘導体Ｃ４−２およびＬＮ３ならびにアンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞株ＣＷＲ２２ｒｖ１およびＰＣ−３における、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＡＲ、ヌクレオリンおよびＧＡＰＤＨ（後者の２つは正規化の基準である）の免疫ブロッティングを示す。ＣＤＫ８は、全細胞株において類似した発現レベルを示す一方、ＣＤＫ１９は、ＡＲを発現するこれらの前立腺がん株において、他の全ての細胞株とは相対的に、強力に発現される。故に、上昇したＣＤＫ１９発現は、ＡＲを発現する前立腺がん細胞と関連する。

図１Ｃは、図１Ｂにおける免疫ブロッティング分析のために使用した同じ細胞株における、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９のｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。ｑＰＣＲの結果は、ＣＤＫ８全細胞株において類似のＲＮＡ発現を示す（ＰＣ３細胞において最も高いレベルが観察された）のに対し、ＣＤＫ１９は、ＡＲを発現する前立腺がん細胞において、他のどの細胞株よりもはるかに高いＲＮＡ発現を示し、免疫ブロッティングの結果と一致する。

図１Ｄは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した完全培地中またはチャコール処理済み(charcoal-stripped)血清（ＣＳＳ）培地（アンドロゲンが欠乏させた、ＡＤ）中または１００ｐＭのアンドロゲンアゴニストＲ１８８１（メチルトリエノロンとしても知られている）を補充したＣＳＳ培地中、示された日数の間培養されたアンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ細胞における、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９およびα−チューブリン（正規化の基準、Sigma, T5168）の発現を示す。この分析は、アンドロゲン処置がＣＤＫ８を下方調節する一方、アンドロゲンの欠乏が、ＬＮＣａＰ細胞においてＣＤＫ８およびＣＤＫ１９タンパク質を上方調節することを示し（図１Ｄ）、これは、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９の発現がＡＲを介して調節されることを示すものである。

例２
ＡＲ活性に対するＣＤＫ８／１９インヒビターの効果
ＡＲ活性におけるＣＤＫ８／１９の役割を試験するために、我々は、Senex Biotechnology, Inc.（Senex）により開発され、セネキシンＡ（SNX2-1-53としても知られる）およびセネキシンＢ（SNX2-1-165としても知られる）と称する、ＣＤＫ８／１９の選択的小分子インヒビターを使用した。セネキシンＡは、近年の論文^２９に、セネキシンＢは、PCT公報WO2013/116786に記載されている。これら小分子は、ＣＤＫ８／１９のＡＴＰポケットに選択的に結合することによって、これらキナーゼ活性を阻害する。セネキシンＢは、セネキシンＡと比較して、より低いＫｄ（ＣＤＫ８では１４０ｎＭ、ＣＤＫ１９では８０ｎＭ）でＣＤＫ８／１９キナーゼ活性を阻害し、より高い水溶性（５０ｍＭに達する）を保有する。

３ｄの間、標準的な培養培地（ＦＢＳ）中、または、５ｄの間、アンドロゲンを欠乏させた（ＣＳＳ）培地（ＡＤ、アンドロゲン除去）中、または、アンドロゲン除去５日後２４ｈｒの間、アンドロゲンを補充した培地（５００ｐＭのＲ１８８１）中（ＡＤ→＋Ａ）、培養されたＬＮＣａＰ細胞における、示されるアンドロゲン応答遺伝子の発現に対するセネキシンＡ（５μＭ）の効果を評価した。アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ細胞のセネキシンＡによる処置によって、アンドロゲンを補充した、またはアンドロゲンを欠乏させた条件下において、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ２、ＴＭＰＲＳＳ２およびＰＧＣ等のいくつかのアンドロゲン応答遺伝子の、アンドロゲンにより刺激される転写活性化が有意に阻害された（図２Ａ）。

５ｄの間、アンドロゲンを欠乏させた（ＣＳＳ）培地中（Ａ−）、または、アンドロゲン欠乏５日後２４ｈｒの間、アンドロゲンを補充した培地（５００ｐＭのＲ１８８１）中（Ａ＋）で培養されたＬＮＣａＰ細胞における、示されたアンドロゲン応答遺伝子の発現に対するセネキシンＢ（１μＭおよび４μＭ）の効果もまた評価した。アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ細胞のセネキシンＢによる処置によって、アンドロゲンを補充した条件下、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＳＧＫ１、ＫＬＦ５およびＰＧＣ等のいくつかのアンドロゲン応答遺伝子の、アンドロゲンにより刺激される転写活性化が有意に阻害された（図２Ｂ）。他方、セネキシンＢによる同じ細胞の処置は、ＡＲ、ＯＰＲＫ１またはＳＴＸＢＰ６等のアンドロゲンにより阻害されるいくつかの遺伝子の阻害を妨げなかった（図２Ｃ）。アンドロゲン添加によってもまた、ＣＤＫ８の発現が阻害され（しかしＣＤＫ１９のはされない）、セネキシンＢはこの阻害を妨げなかった（図２Ｃ）。それ故に、ＣＤＫ８／１９の阻害は、アンドロゲンによる遺伝子発現の誘導のみを阻害するが、その抑制は阻害しないという特に有益な効果を有する。

３ｄの間ＣＳＳ培地中［Ｒ１８８１（−）］、または、アンドロゲン欠乏２日後２４ｈｒの間アンドロゲンを補充した培地（５００ｐＭのＲ１８８１）中［Ｒ１８８１（＋）］で培養されたＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲン応答遺伝子の発現に対するセネキシンＢの効果を測定した。セネキシンＢをＲ１８８１処置の１ｈｒ前に加え、ＲＮＡサンプルを回収するまで培養系中に維持した。遺伝子発現を、正規化の基準としてハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａを用いて、ｑＰＣＲにより測定した（＊：セネキシンＢとＤＭＳＯとの間でｐ＜０．０５）。アンドロゲンを欠乏させたＬＮＣａＰ細胞のセネキシンＢによる前処置によって、これらの遺伝子の、アンドロゲンに刺激される転写が有意に阻害された（図３）。これは、ＣＤＫ８／１９が、前立腺がん細胞においてアンドロゲンシグナリングを正に調節することを示唆する。

ＡＲ活性化におけるＣＤＫ８／１９の役割を確認するため、我々は、ＣＤＫ８とＣＤＫ１９をともに発現するＨＥＫ２９３細胞（図１Ａ）におけるプロモーター活性アッセイによって、セネキシンＡおよびセネキシンＢの阻害効果を分析した。全長の野生型ＡＲをＨＥＫ−２９３細胞において過剰発現させたとき、セネキシンＡまたはセネキシンＢのいずれも、Ｒ１８８１の存在下でアンドロゲン応答コンストラクト（ＰＳＡ遺伝子プロモーター下のホタルルシフェラーゼレポーター）の活性化を有意に阻害したが、アンドロゲンフリーの培地中ではしなかった（図４Ａおよび図５）。類似の結果が、他のアンドロゲン応答プロモーター（ＰＧＣ）においても観察された（図４Ｂ）。これらの結果は、ＣＤＫ８／１９がＡＲ機能を正に調節することを示す。

例３
アンドロゲンが枯渇した培地中のアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞における細胞の生育およびＡＲＧ発現に対するＣＤＫ８／１９インヒビターの効果
ＣＲＰＣ患者のほとんどにおいて、前立腺がん腫瘍細胞は、低アンドロゲン環境またはＡＲアンタゴニストの存在にかかわらず、それらのＡＲ活性を取り戻している。我々は、ＣＤＫ８／１９インヒビターであるセネキシンＢが、親のアンドロゲン依存性前立腺がん細胞株の、去勢後に再発したかまたは転移性の異種移植片に由来する、いくつかのアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ派生物であるＬＮ３およびＣ４−２ならびにＣＷＲ２２派生物であるＣＷＲ２２ｒｖ１を含む）において、アンドロゲン非依存性の生育を阻害するか試験した。アンドロゲンフリーの培地中、ＡＲを発現するアンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞の生育に対するセネキシンＢの効果を測定した。２×１０^５個の前立腺がん細胞を、種々の濃度のセネキシンＢを有するＣＳＳ培地中に播種し、示される日数の間培養した後、総細胞数を計数した（ｎ＝４）。これらアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞は、アンドロゲンが枯渇した条件下（ＣＳＳ培地中）で充分に生育したが、このアンドロゲン非依存性の生育は、セネキシンＢにより強力に阻害された（図６Ａ）。

我々はまた、ＣＳＳ培地中、セネキシンＢもしくはアンドロゲンアンタゴニストMDV3100（エンザルタミド）の存在または非存在下、アンドロゲン非依存性の細胞株であるＬＮＣａＰ派生物のＬＮ３およびＣＷＲ２２派生物のＣＷＲ２２ｒｖ１の生育も分析した。２×１０^５個の細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照、５μＭのセネキシンＢまたは１０μＭのMDV3100を有するＣＳＳ培地中に播種し、示される時間培養した後、総細胞数を計数した（ｎ＝３）。図６Ｂは、セネキシンＢが、ＬＮＣａＰ−ＬＮ３の成長を強力に阻害し、ＣＷＲ２２ｒｖ１細胞の成長を有意に阻害したのに対し、MDV3100はＬＮＣａＰ−ＬＮ３細胞の成長を弱く阻害し、アンドロゲンが枯渇した同じ条件下でＣＷＲ２２ｒｖ１細胞の成長を阻害しないことを示す。

これらの細胞の内因性ＡＲ活性は、ＡＲ依存性遺伝子ＫＬＫ３（ＰＳＡ）およびＫＬＫ２のｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析により判断した。アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞におけるＫＬＫ２およびＫＬＫ３（ＰＳＡ）の発現に対するセネキシンＢの効果を測定した。図６Ｃは、３日間のアンドロゲン欠乏条件（ＡＤ３）下、ＬＮＣａＰおよびアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株における基底の遺伝子発現ならびにＣＳＳ培地中培養され（２ｄ）、セネキシンＢまたはビヒクル対照により２４時間処置された細胞における遺伝子発現を示す。＊：セネキシンＢとＤＭＳＯ間でｐ＜０．０５。

３種全てのアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株が、アンドロゲン欠乏３日後のアンドロゲン依存性である親のＬＮＣａＰ細胞と比較して、これら遺伝子のはるかに高い発現を示した（ＡＤ３、図６Ｃ）。驚くことに、セネキシンＢは、ＬＮＣａＰ細胞においてアンドロゲンにより刺激されるＰＳＡ／ＫＬＫ２発現を阻害する（図３）のと同じ程度有効的に、アンドロゲンの非存在下で生育した３種全てのアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株においてＰＳＡおよびＫＬＫ２の発現を下方調節した（図６Ｃ）。図６Ｄは、アンドロゲン非存在下で生育したＬＮＣａＰ−ＬＮ３およびＣＷＲ２２ｒｖ１細胞におけるＰＳＡおよびＫＬＫ２の発現に対する、５μＭのセネキシンＢおよび１０μＭのMDV3100（エンザルタミド）の効果を比較する。セネキシンＢが、両方のアンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞株において、ＰＳＡおよびＫＬＫ２発現を強力に下方調節するのに対し、MDV3100はアンドロゲンが枯渇した同じ条件下で、ＬＮＣａＰ−ＬＮ３細胞においてＰＳＡの発現を弱く下方調節し、ＫＬＫ２の発現を下方調節せず、ＣＷＲ２２ｒｖ１細胞において、ＰＳＡおよびＫＬＫ２のいずれの発現も下方調節しない。

これらの結果は、セネキシンＢが、アンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞において、これらの細胞が低アンドロゲン環境で増殖するために必要とするリガンド非依存性ＡＲシグナリングを抑制することを示唆する。セネキシンＢが、ＣＷＲ２２ｒｖ１細胞において、細胞生育を阻害することが可能であり、アンドロゲンにより調節される遺伝子の発現を下方調節することが可能であるという所見は、この細胞株における恒常的なアンドロゲンシグナリングが、トランケートされたＡＲによってなされることから^４２、特に興味深いものである。このトランケート形態は、Ｃ末端のトランケーションがリガンド結合ドメインを欠失させ、それをリガンド非依存性とすることから、ＡＲのリガンド結合ドメインを標的にするように設計された現在の抗アンドロゲン薬に抵抗性である。故に、ＣＤＫ８／１９はまた、アンドロゲン非依存性の前立腺がん細胞における活性化ＡＲ（全長、変異型またはトランケート型）により媒介される活性のある転写において、重要な役割を果たす可能性もある。

我々はまた、セネキシンＢが、ＡＲを発現せず（図１Ａ）、そしてＡＲ非依存性のメカニズムを通じてアンドロゲン非依存性の表現型を発現したアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株ＰＣ−３の生育を阻害するかについても試験した。ＰＣ−３細胞生育は、転写因子ＮＦκＢの阻害により阻害されることが以前に示されており^{４３〜４５}、ＣＤＫ８／１９の阻害は、ＮＦκＢ転写活性の誘導を低減することがSenexにより発見された（PCT公報WO2013/040153）。アンドロゲンフリーの培地中のＰＣ−３前立腺がん細胞生育に対するセネキシンＢの効果を測定した。２×１０^５個のＰＣ−３細胞を、種々の濃度のセネキシンＢを有するＣＳＳ培地中に播種し、示される日数の間培養した後、総細胞数を計数した（ｎ＝４）。＊：セネキシンＢとＤＭＳＯとの間でｐ＜０．０５。図７に示されるとおり、アンドロゲンが枯渇したＣＳＳ培地中のＰＣ−３細胞の成長が、セネキシンＢによって阻害された。それ故に、ＣＤＫ８／１９の阻害は、種々のメカニズムを通じてアンドロゲン非依存性を発現したアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞のアンドロゲン非依存的成長を阻害する。

例４
ＣＤＫ８／１９インヒビターのセネキシンＢは、ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ−ＬＮ３細胞のin vivo異種移植片成長を阻害する
６〜８週齢のオスのヌードマウス（Jackson Laboratory）に、２百万個のＬＮ−ＣａＰ ＬＮ３（ＬＮ３）前立腺がん細胞をMatrigelとともに、右わき腹に皮下注射した。目に見える腫瘍が、注射後１４日までに形成された。類似の腫瘍容積を有するマウスをその後、２群へとランダム化し、４０ｍｇ／ｋｇのセネキシンＢまたは等容積のビヒクル溶液を２週間（１週につき５日間）、毎日ｉ．ｐ．注射により処置した。腫瘍サイズを、１週につき３回ノギスにより測定し、長さ×幅×幅×０．５の方程式により算出した。図８に示されるとおり、セネキシンＢ処置は、ビヒクル対照で処置されたマウスと比較して、オスのヌードマウスにおいてＬＮ３細胞の腫瘍成長を劇的に阻害する。セネキシンＢ処置は、宿主の体重に対する効果はなく（図９）、処置マウスは、ビヒクル対照群のマウスと同程度に健康的に見えた。実験の終了時に、各群からのマウスを犠死させ、最終腫瘍重量を決定した。図１０に示されるとおり、セネキシンＢで処置されたマウスにおいて発生した腫瘍の重量は、対照群からの腫瘍の重量より有意に小さかった。これは、図８の腫瘍容積測定で観察された差異と一致した。要約すれば、本データは、ＣＤＫ８／１９キナーゼ活性の阻害が、進行性前立腺がん細胞の腫瘍成長を阻むための潜在的な治療方法であることを示唆する。

Claims (7)

1. 前立腺がんを処置するための医薬組成物であって、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９のうち１以上に対する選択的インヒビターの有効量を含み、前記インヒビターは、セネキシンＡ、セネキシンＢ、およびそれらの組み合わせから選択される、前記医薬組成物。
2. インヒビターが、ＣＤＫ１９を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. インヒビターが、ＣＤＫ８を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
4. インヒビターが、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１９を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前立腺がんが、アンドロゲン非依存性である、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前立腺がんが、アンドロゲン受容体遺伝子の増幅、アンドロゲン受容体遺伝子の突然変異、アンドロゲン受容体のリガンド非依存性トランス活性化および細胞内アンドロゲン合成の活性化のうち１つまたは２つ以上に起因してアンドロゲン非依存性である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. インヒビターが、ＮＦ−κＢの活性亢進を阻害する、請求項１または５に記載の医薬組成物。