JP2013538563A - ヒト多能性細胞の皮質形成 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）における皮質形成を誘導するためのインビトロの方法に関する。該方法は、レチノイド・シグナリングを刺激し、且つＴＧＦβスーパーファミリー・シグナリングを阻害する条件下で細胞を培養することによる。本発明は、皮質ニューロンの製造に有用となる可能性があり、特に、患者に特有の皮質ニューロン；未成年及び大人で発症する神経病のモデリング；、及び、治療剤の開発等に有用となる可能性がある。

Description

本発明は、多能性ヒト細胞において皮質形成をインビトロで誘導する事に関する。

大脳皮質は、哺乳動物の中枢神経系の統合及び指令の中枢であり、ヒトの脳の４分の３超を構成する（Ｍｏｕｎｔｃａｓｔｌｅ， Ｖ．Ｂ． Ｔｈｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｃｏｒｔｅｘ， （Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ． １９９８）。大脳皮質に関する病気は、子供及び大人の疾病率及び死亡率の主要な原因となっており、てんかん及び自閉症等の進行性の症状から、アルツハイマー病等の晩年の神経変性症状まで、様々な範囲にわたる。げっ歯類モデルをもとに、大脳皮質の発達、機能、及び病気についての基本的な特徴について多くの研究がなされてきた。しかし、霊長類、及び特にヒトの大脳皮質は、幾つかの点でげっ歯類と違いがある（Ｆｉｎｌａｙ， Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８， １５７８−８４ （１９９５））。大脳皮質のサイズというのは、神経系のその他の部分と比べて著しく増加しているが、それに加えて、以下のような相違点が挙げられる：大脳皮質で発達中の幹細胞集団のサイズ、複雑さ、及び性質（Ｒａｋｉｃ， Ｐ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０， ７２４−３５ （２００９））；上層の多様性の増加、後に生じる神経細胞の種類、及び深層（ｄｅｅｐ ｌａｙｅｒｓ）における霊長類特異的なニューロン種の存在（Ｈｉｌｌ， Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４３７， ６４−７ （２００５））。胚の多能性幹細胞や人工多能性幹細胞（総じて、多能性幹細胞、ＰＳＣとよぶ）から、制御され且つ決められたやり方で、ヒトの皮質の発達をモデル化するという方法は、ヒトの皮質の発達、回路の形成、及び機能に関する機能的な研究や、皮質の病気のインビトロ・モデルを構築するための機能的な研究を可能にするための可能性を大いに秘めている。大脳皮質の主要な病気の多くが、シナプス機能の病気であるとするならば、当分野の目標は、インビボで見出されたネットワークと著しく類似するインビトロの皮質ネットワークを生成することである。

大脳皮質は、２つの主要なクラスのニューロンを含んでいる：約８０％は、興奮性の、グルタミン酸作動性投射ニューロンであり、皮質幹細胞及び前駆細胞によって生成する；一方で、残りの２０％は、ＧＡＢＡ作動性の介在ニューロンであり、皮質外から生成され、発達の過程で移動してくる（Ｗｏｎｄｅｒｓ， Ｃ．Ｐ ｅｔ ａｌ ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７， ６８７−９６ （２００６））。大人（成人）の皮質の６つの層に位置することが定められたグルタミン酸作動性投射ニューロンは、ステレオタイプな時系列順に発生し、最初は深層でニューロンが生成され、最後は上層でニューロンが生成される。マウスでは、こうしたプロセスは約６日かかり、一方で、ヒトの皮質神経生成（形成）では、７０日間にわたって続く（Ｃａｖｉｎｅｓｓ， Ｖ．Ｓ．， Ｊｒ ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １８， ３７９−８３ （１９９５））。一旦生成されると、異なるクラスの皮質投射ニューロンは、皮質層間（Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７， ４１９−５１ （２００４））での通常の局所的な微小回路を形成したり、並びに、更に長距離の皮質内外の接続を形成したりし、これには、皮質脊髄路、皮質視床及び脳梁の投射が含まれる（Ｆａｍｅ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ３４， ４１−５０ （２０１１）； Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｎｄｉｔｏ， Ｇ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４， ２７６−８９ （２００３））。

マウスのＥＳ細胞は、神経誘導の際に、ソニックヘッジホッグシグナリングを阻害することによって、大脳皮質ニューロンへインビトロで分化する能力があることが示されている（Ｂｉｂｅｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７， １００３−９ （２００４）； Ｇａｓｐａｒｄ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４５５， ３５１−７ （２００８）； Ｅｉｒａｋｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３， ５１９−３２ （２００８））。しかし、皮質の発達をモデル化しようと努力しているなかでの、共通の問題点としては、深層の早期発生ニューロンの生成については達成されたものの、皮質の神経形成の完全なプログラムが、培養中の多能性幹細胞からは実行されていない点があげられる。特にあてはまるのが、ＥＳ細胞からのヒト皮質形成（ｃｏｒｔｉｃｏｇｅｎｅｓｉｓ）のケースであり、該ケースでは、現在のところ、特定の、確定的で、且つ効率的な方法で達成できていない（Ａｕ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ３ ４７２−４ （２００８））。こうした失敗の理由の１つとして挙げられているのが、ＥＳ細胞からの分化誘導では、インビボでの皮質内で見られる複雑な幹細胞／前駆細胞集団を再現できない点である（Ｈａｎｓｅｎ， Ｄ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． ニューロン ７０， ６４５−６０ （２０１１））。

神経上皮性の脳室帯の細胞は、大脳皮質の一次幹細胞／前駆細胞の集団であるが、一方で、少なくとも２つの二次前駆細胞集団である、基底前駆細胞／脳室下帯細胞、及び外側脳室下帯（ｏＳＶＺ）細胞が、マウス、フェレット、及びヒトにおいて同定されている。３グループ全ての幹細胞／前駆細胞は、投射ニューロンを生成すると思われる（Ｈａｎｓｅｎ， Ｄ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４６４， ５５４−５６１ （２０１０）； Ｗａｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １４， ５５５−６１ （２０１１）； Ｆｉｅｔｚ， Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， ６９０−９ （２０１０））。そして、霊長類（そして、特にヒト）の大脳皮質におけるｏＳＶＺ細胞の数の増加は、ヒトの皮質のサイズの増加、並びに上層のニューロン種の多様化に寄与する主要なものとして提唱されてきた。

以前に示されたことではあるが、あるクラスの皮質ニューロンが、ヒトＥＳ細胞の集合培養において生成される（米国２０１００１６６７２０号明細書； Ｅｉｒａｋｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ３， ５１９−５３２ （２００８）； Ｌｉ， Ｘ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６， ４０５５−４０６３ （２００９））。しかし、ソニック・ヘッジホッグの阻害をしても単層培養において、ヒト多能性幹細胞から皮質形成する機能は見られなかった。神経幹細胞及び前駆細胞は、胚様体中間体を用いて、ヒトＥＳ細胞から分化させた（ＷＯ２００７１４２４４９）。

本発明は、ヒト多能性細胞に対して誘導をかけて、インビトロで高効率で皮質形成を行うための方法の開発に関する。本発明は、例えば、皮質ニューロンの製造に有用となる可能性があり、特に、患者に特有の皮質ニューロン；未成年及び大人で発症する神経病のモデリング；、及び、これらの病気に対する治療剤の開発等に有用となる可能性がある。

本発明の一態様は、以下の方法を提供する。
ヒト多能性細胞の皮質形成をインビトロで誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法：
（ｉ）単離されたヒト多能性幹細胞の集団を提供するステップ；及び
（ｉｉ）前記集団が皮質幹細胞及び前駆細胞に分化するように、レチノイド・シグナリングを刺激し、且つＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリングを阻害する培養条件下で、前記集団を培養するステップ。

皮質幹細胞及び前駆細胞は、培養中で維持することができ、保存することができ（例えば、従来技術を用いて凍結することができ）、又は本明細書に記載するように、治療や他の応用に利用することができる。

幾つかの実施形態において、皮質幹細胞及び前駆細胞は、皮質ニューロンに分化することができる。本発明の方法は更に以下のステップを含むことができる：
（ｉｉｉ）皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団が、大脳皮質ニューロンに分化することを可能にするステップ。

ヒト多能性幹細胞は、特殊化していない未分化の細胞であり、自身を複製したり、自己更新することができ、そして、全３つの初期胚葉層、即ち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の特殊な細胞へと発生することができる。しかし、栄養外胚葉を含めた全ての胚組織や胚体外組織に発生することができない（即ち全能性ではない）。ヒトの多能性幹細胞は、神経系統へとは分化しない（ｎｏｔ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）。

ヒト多能性細胞には、胚幹（ＥＳ）細胞や、非胚幹細胞が含まれ、そして、胎児や大人の体性幹細胞、及び非多能性細胞由来の幹細胞が含まれる。

適切なＥＳ細胞は、培養ｈＥＳ細胞株（例えば、Ｅｄｉ２、Ｈ９、又はｈＳＦ−６）から入手することができる。適切なヒト胚幹細胞の更なる例については以下の文献に記載されている：（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２： １１４５−１１４７ （１９９８）； Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：３９９−４０４ （２０００）； Ｃｏｗａｎ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５０， １３５３−１３５６（２００４）， Ｇａｇｅ， Ｆ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８ １５９−１９２ （１９９５）； ａｎｄ Ｇｏｔｌｉｅｂ （２００２） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５ ３８１−４０７）； Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ５（１）： ７９−８８ （２００３）；、また、オンラインでアクセス可能な以下のページも参照されたい：ＮＩＨ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｇｉｓｔｒｙ。

潜在的な臨床レベルのｈＥＳＣが以下の文献に記載されている：Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６５， １６３６−１６４１ （２００５）；及び Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４， １８５−１８７ （２００６）。

他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、非多能性細胞由来である人工多能性（ｉＰＳ）細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞について、後で詳述する。

ヒト多能性幹細胞は、１種以上の、以下の全能性に関連したマーカーを発現することができる：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリ・ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、及びＴｒａ−１−６０。好ましくは、ヒト多能性幹細胞が、Ｏｃｔ４を発現する。

ヒト多能性幹細胞は、神経細胞マーカー（例えば、Ｔｕｊ１）を発現しない。

細胞が発現するマーカーは、全能性に関連したマーカーも含めて、標準的な技術を用いて特定することができる：例えば、ＰＣＲ、ウェスタン・ブロッティング、免疫細胞化学、及び、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション。

本発明の方法において使用するためのヒト多能性細胞の集団は、従来の技術を用いて、多能性細胞株から、細胞を培養することによって得ることができる（Ｖａｌｌｉｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２７５， ４０３−４２１ （２００４）， Ｃｏｗａｎ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５０， １３５３−１３５６ （２００４）， Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４， ２３０−２３５ （２００６） Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６５， １６３６−１６４１ （２００５）， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｔ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４， １８５−１８７ （２００６））。例えば、本発明の方法において使用に適したヒト多能性細胞は、従来、以下のような形で培養することができる：支持細胞の層（例えば、放射状マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ））の上、培養ディッシュ内、適切な密度（例えば、１０⁵〜１０⁶細胞／６０ｍｍディッシュ）、又は条件付のフィーダー若しくは決められた培地を備える適切な基質上。本発明の方法において使用するためのヒト多能性細胞は、酵素的又は機械的な手段により継代することができる。ヒト多能性細胞のための適切な培養培地は以下の物を含む：ＳＣ培地（ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、添加物として、２０％の血清代替物、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、及び４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ ヒトｂＦＧＦ）、及びＥＳ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、添加物として２０％ ノックアウト血清置換代替物（ＫＳＲ）、６ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、１００ μｍ 非必須アミノ酸、１００ μＭ ２−メルカプトエタノール、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び５０ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。

インビトロの皮質形成誘導のためのヒト多能性幹細胞の集団は、実質的に１種以上の他の細胞種を含まないことが好ましい。上述したように、ヒト多能性細胞は、通常、ＭＥＦ支持細胞上で、培養され、維持される。ヒト多能性細胞は、任意の適切な技術により、支持細胞から分離することができる。例えば、細胞は短時間（例えば、１時間）ゼラチン上で培養することができ、その後、ゼラチンに結合していないヒト多能性細胞を、ゼラチンに結合しているＭＥＦから分離することができる。

後述するが、このことにより、胚様体が形成されることが回避される。

分離した後は、ヒト多能性細胞は、単層で適切な培地上で培養することができ、培地としては、例えば、１０ ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した上述のＳＣ培地又はＥＳ培地が挙げられる。好ましくは、培地は、Ｒｈｏ結合コイルドコイル含有する蛋白質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（例えば、 １０ μＭ）含むことができ、ヒト多能性細胞を、単細胞懸濁液中へ分離する際の細胞死を減少させることができる（Ｏｌｓｏｎ， Ｍ．Ｆ． （２００８）． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０： ２４２−８； Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｋ．ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５： ６８１−６， ＵＳ ２０１０／０００９４４２）。適切なＲＯＣＫ阻害剤が当分野で知られており、以下の物が挙げられる（＋）−４−［１（Ｒ）−アミノエチル］−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）ベンズアミド ジヒドロクロリド水和物； （１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキサミド ジヒドロクロリド； 及び Ｎ−（２−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル）−２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−２−カルボキサミド（全てＳｔｅｍｇｅｎｔ ＵＳＡ、又はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＵＳＡから入手可能）。

単層とは、基質（例えば、培養プレートの表面）上にある一層の細胞層のことである。ヒト多能性細胞の単層培養により、制御され且つ決められた分化を可能とし、胚様体の形成が回避される。胚様体は、幹細胞の制御されない分化によって形成される集合体であり、様々なタイプの分化細胞からなっており、そして、神経幹細胞を更にそこから精製しなければならなくなる。また、単層は、培養の長期間のイメージングも可能にすることができる。

胚様体を形成することなく、本明細書に記載したように、単層培養中で、ヒト多能性幹細胞を培養し、分化させることが好ましい。

インビトロでの皮質形成を開始する前に、単離されたヒト多能性幹細胞の集団は、増殖（ｅｘｐａｎｄ）させることできる。例えば、ヒト多能性幹細胞は、ＦＧＦ２シグナリングを刺激する条件下で、単層で培養することができる。幾つかの実施形態において、細胞は、ＦＧＦ２（例えば、 ５〜 ２０ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２， 好ましくは １０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培養培地中で培養することができる。適切な培養培地としては、上述したようにＳＣ培地やＥＳ培地が挙げられ、ＭＥＦ条件で、且つＦＧＦ２を添加した物であってもよい。

任意のほ乳類のＦＧＦ２を使用することができるが、好ましくは、ヒト線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を用いる（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ２２４７， 核酸配列 ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ： ４１３５２６９４， アミノ酸配列 ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ： ４１３５２６９５）。ＦＧＦ２は、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元（例えば、 Ｒ＆Ｄ， ミネアポリス， ＭＮ， ＵＳＡ）から入手することができる。

好ましくは、インビトロでの皮質形成を開始するためのヒト多能性幹細胞の集団は、単層培養で提供される。ヒト多能性細胞を単層培養するための方法は周知である。

単層培養中のヒト多能性細胞が、少なくとも８５％コンフルエント（即ち、細胞容器の表面の少なくとも８５％が細胞で覆われている）、少なくとも９０％コンフルエント、又は少なくとも９５％コンフルエントになったときに、皮質形成を誘導することが好ましい。

上述したように、皮質形成は、レチノイド・シグナリングを刺激し、ＴＧＦβスーパーファミリー・シグナリングを阻害する培養条件下でヒト多能性幹細胞を培養することによって開始される。

ＴＧＦβスーパーファミリー・シグナリングは、ＳＭＡＤ蛋白質（例えば ＳＭＡＤ１−３，５及び９）によって仲介され、ヒト多能性細胞においてＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリングを阻害することによって阻害することができる（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ２７５−２８０（２００９）， Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７ Ｄｅｃ；８（１２）：９７０−８２）。ＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリングは、前記神経誘導培地中のＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリング阻害剤によって阻害することができる。

好ましくは、一旦神経誘導が開始されると、ヒト多能性細胞の集団が、皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞に分化するまで、レチノイド・シグナリング刺激、並びにＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリング阻害は継続的に行われることが好ましい。

例えば、細胞は、以下を含む神経誘導培地で培養することができる：１種以上の因子であって、細胞内において、レチノイド・シグナリング刺激し、又は促進し、且つＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリングを阻害する因子。

前記神経誘導培地は、ヒト多能性幹細胞においてレチノイド・シグナリングを刺激するレチノイドを含むことができる。適切なレチノイドは、周知であり、以下の物が含まれる：レチノイン酸、ビタミンＡ（ａｌｌ ｔｒａｎｓレチノール）、酢酸レチノール。例えば、前記神経誘導培地は、０．０１ μＭ〜１０ μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノールを含むことができ、典型的には０．５ μＭを含むことができる。

多能性細胞においてレチノイド・シグナリングを刺激するための技術は周知である（例えば、以下の文献を参照されたい：国際公開２００８０７１９６０号明細書、米国特許出願２００７０２２４６５０号明細書、米国特許出願７６３２６７９号明細書、国際公開２００８０６０７９２号明細書、国際公開２００９０５８４５１号明細書、米国特許出願２００６００７３５８７号明細書、及び国際公開２００５０２１７２０号明細書）。

ＴＧＦβスーパーファミリー・シグナリングは、前記神経誘導培地中において、１種以上のＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリング阻害剤によって阻害することができる。ＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリング阻害剤には、ＴＧＦβシグナリング阻害剤及びＢＭＰシグナリング阻害剤を含めることができる。

前記神経誘導培地は、ＴＧＦβシグナリング阻害剤を含むことができる。ＴＧＦβシグナリングは、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３が介在した経路を通して発生し、ＴＧＦ−β１アクチビンレセプター−様キナーゼ（ＡＬＫ）ＡＬＫ−４、−５、及び−７によって介在されてもよい（Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７ Ｄｅｃ；８（１２）：９７０−８２）。ＴＧＦβシグナリング阻害剤は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３が介在したシグナリングを阻害することができる。

適切なＴＧＦβシグナリング阻害剤には、ＡＬＫ４，５及び７受容体の阻害剤が含まれ、例えば、以下の物が挙げられる：２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン 塩酸 （ＳＢ−５０５１２４）；４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンザミド（ＳＢ４３１５４２； Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ； Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＵＳＡ）、及び３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド （Ａ８３−０１； Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ； Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＵＳＡ）。

ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ−β１アクチビンレセプター−様キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤である。ＳＢ４３１５４２は、ＡＬＫ−４，−５及び−７の選択的且つ効能のある阻害剤であり、従って、ＢＭＰが介在するＳＭＡＤ ２／３のリン酸化をブロックする（Ｌａｐｉｎｇ， Ｎ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６２：５８−６４ （２００２））。

例えば、前記神経誘導培地は、５μＭ〜２０μＭのＳＢ４３１５４２を含むことができ、例えば約１０μＭ含むことができる。

ヒト多能性細胞においてＴＧＦβシグナリングを阻害するための方法は周知である（例えば、以下の文献を参照されたい：米国特許７２５０２９４号明細書、米国特許７５６０２８１号明細書、及び国際公開２０１００６３８４８１号明細書；Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ２７５−２８０（２００９））。

前記神経誘導培地は、ＢＭＰシグナリング阻害剤を含むことができる。ＢＭＰシグナリングは、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ８を介した経路を通して発生する。そして、該シグナリングは、ＴＧＦ−β１アクチビンレセプター−様キナーゼ（ＡＬＫｓ）−１、−２及び−３及び−６を介することができる（Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７ Ｄｅｃ；８（１２）：９７０−８２）。ＢＭＰシグナリング阻害剤は、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ８を介したシグナリングを阻害することができる。

適切なＢＭＰシグナリング阻害剤は、ヒト多能性幹細胞において、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ８（またはＳＭＡＤ９とも呼ばれる）を介した経路を通したシグナリングを阻害することができる。ＢＭＰシグナリングは、ＢＭＰのＩ型受容体であるＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、及びＡＬＫ６によって介在される。そして、適切なＢＭＰシグナリング阻害剤には、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、及びＡＬＫ６の受容体の阻害剤が含まれる。

適切なＢＭＰシグナリング阻害剤は、公知である（Ｃｕｎｙ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １８ ４３８８−４３９２； Ｙｕ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｎａｔ Ｍｅｄ １４ １３６３−９）。そして、該阻害剤には、以下の物が含まれる：ノギン、ドルソモルフィン、ホリスタチン、インヒビン、スクレロスチン、コーディン、ＣＴＧＦ、ホリスタチン、グレムリン、及び４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン （ＬＤＮ−１９３１８９ Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＵＳＡ）。

幾つかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤はノギンであってもよい。ノギンは、分泌されるホモダイマーの糖蛋白質であり、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーメンバーのシグナリングタンパク質に結合し、不活性化させる（例えば、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４））（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４２０， ６３６−６４２）。

任意の哺乳動物のノギンを用いることができる。例えば、ヒトノギン（ＮＯＧ）（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ９２４１， 核酸配列 ＮＭ＿００５４５０．４ ＧＩ： １８９３３９２４７， アミノ酸配列 ＮＰ＿００５４４１．１ ＧＩ： ４８８５５２３）、又はマウスノギン（Ｎｏｇ）（ＮＣＢＩ １８１２１， 核酸配列 ＮＭ＿００８７１１．２ ＧＩ： １５８１８７５２２ アミノ酸配列 ＮＰ＿０３２７３７．１ ＧＩ： ７１１０６７５）については、ルーチンの組み換え技術を用いて産生することができるし、又は販売元（例えば、Ｒ＆Ｄ システム、ミネアポリス， ＭＮ， ＵＳＡ）から入手することができる。

例えば、前記神経誘導培地は、２５０ ｎｇ／ｍｌ〜１０００ ｎｇ／ｍｌのノギンを含むことができ、例えば、約５００ｎｇ／ｍｌのノギンを含むことができる。

幾つかの実施形態において、ノギンは他の成分と結合してもよい。例えば、キメラのノギン分子（例えば、マウスノギン−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ システム）を用いることができる。

他の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン（６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン ジヒドロクロリド）であってもよい。ドルソモルフィンは、ＢＭＰのＩ型受容体であるＡＬＫ２、ＡＬＫ３、及びＡＬＫ６の阻害を通して機能する。従って、ＢＭＰを介したＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をブロックする。ドルソモルフィンは、胚形成に必要なＢＭＰシグナル、及び鉄の代謝を阻害する（Ｙｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４： ３３−４１）。ドルソモルフィンは、販売元（例えば、 Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ； Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＵＳＡ）から入手することができる。

多能性細胞において、ＢＭＰシグナリングを阻害するための方法は周知である（例えば以下の文献を参照されたい 国際公開２００８０２６１９８号明細書；Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ２７５−２８０（２００９））。

幾つかの好ましい実施形態では、前記神経誘導培地において、１種以上のＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリング阻害剤が、ＳＭＡＤ２／３が介在するシグナリング、及びＳＭＡＤ１／５／８が介在するシグナリングの両方を阻害する。例えば、上述したように、前記神経誘導培地は、ＴＧＦβシグナリング阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、及びＢＭＰシグナリング阻害剤（例えば、ノギン）を含むことができる。

前記神経誘導培地は、インシュリンを更に含むことができる。該インシュリンは、例えば、皮質幹細胞、前駆細胞、及びニューロンの生存率を向上させることができる。例えば、前記神経誘導培地は、１μｇ／ｍｌ〜１０ μｇ／ｍｌのインシュリンを含むことができ、例えば、約５ μｇ／ｍｌ含むことができる。

上述したように、ヒト多能性細胞は、ＴＧＦβスーパーファミリー（ＴＧＦβ及びＢＭＰの両方を含む）のシグナリングを阻害する条件下で培養するのが好ましい。これは、ＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリング経路の両方を阻害することによって達成することができる。そして、結果として、ヒト多能性細胞における全てのＳＭＡＤシグナリングを阻害する（例えば、ＳＭＡＤ１〜３、５及び９によって介在されるシグナリング）。

従って、適切な神経誘導培地は、上述したように、レチノイド、ＴＧＦβシグナリング阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びインシュリンを含むことができる。

また、神経誘導培地は、標準的な神経細胞培養試薬を含むことができる。例えば、培地は、基礎的な神経培養培地を含むことができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）にＮ２（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９７９ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６ １ ５１４−５１７； ＧＩＢＣＯ）を添加した物や、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した物が挙げられる。

他の適切な基礎的神経培養培地及び添加物は、周知であり、及び／又は販売元から入手できる。例えば、ＮＳ２１添加物（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ １７１ （２００８） ２３９−２４７）をＢ２７の代わりに使用することができる。

幾つかの実施形態において、１種以上のレチノイド、ＴＧＦβシグナリング阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びインシュリンを、標準培地の一部として添加することができる。例えば、レチノイン酸は、Ｂ２７培地添加物の成分として添加することができる。

基礎的神経培地には、必要に応じて、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン及びペニシリン）、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、及び還元剤（例えば、メルカプトエタノール）を添加してもよい。

適切な神経誘導培地は、神経誘導、神経形成、及び神経分化をサポートする標準的な培地を基礎とした物であってもよい。３Ｎ培地は、Ｎ２含有培地とＢ２７含有培地とを１：１の比率で、混合物した物を含むことができる。ここで、Ｎ２含有培地は、ＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２（ＧＩＢＣＯ）、インシュリン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した物を含む。そして、Ｂ２７含有培地は、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７添加物（ＧＩＢＣＯ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した物を含む。

典型的には、Ｎ２培地は、以下の物を含むことができる：５ μｇ／ｍｌ インシュリン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ μｍ 非必須アミノ酸、１００ μＭ ２−メルカプトエタノール、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び５０ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン。そして、Ｂ２７培地は、以下の物を含むことができる：２００ ｍＭ グルタミン、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び５０ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン。

上述した３Ｎ培地は、神経誘導培地を生成するために、ＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリング阻害剤を添加してもよい。

哺乳動物細胞の培養は公知である（例えば、以下の文献を参照されたい：Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃ． Ｈｅｌｇａｓｏｎ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｕ．Ｓ． （１５ Ｏｃｔ ２００４） ＩＳＢＮ： １５８８２９５４５１； Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ． （９ Ｄｅｃ ２００４） ＩＳＢＮ： １５８８２９２２２３； Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ （２ Ａｕｇ ２００５） ＩＳＢＮ： ０４７１４５３２９３， Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００６） ３１０：４０−５２， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ｅｄ． Ｒ． Ｌａｎｚａ） ＩＳＢＮ： ０１２４３６６４３０）。培地及びこれらの成分については、販売元から入手することができる（例えば、Ｇｉｂｃｏ， Ｒｏｃｈｅ， Ｓｉｇｍａ， Ｅｕｒｏｐａｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

標準的な哺乳動物細胞培養条件を用いることができる。例えば、３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素の条件を用いることができる。培地は、２日ごとに交換し、細胞は、重力によって設置されることが可能となることが好ましい。細胞は、適宜、細胞外マトリックス成分（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））でコーティングされた表面上で培養する。

ヒト多能性幹細胞は、前記神経誘導培地中で５日以上、１０日以上、又は１５日以上培養することができる。例えば、細胞は、最大で１５日間、２０日間、又は２５日間、典型的には、８〜１１日間培養することができ、ヒト多能性細胞が、皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞に転換することを可能にする。

上述したように、ヒト多能性細胞を前記神経誘導培地中で培養すると、細胞が皮質幹細胞及び前駆細胞へ分化することを誘導する。例えば、前記神経誘導培地で培養後は、集団中８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上のヒト多能性幹細胞が、皮質幹細胞及び前駆細胞へ分化することができる。

好ましくは、集団中９５％以上のヒト多能性幹細胞が、分化開始後１４日以内で、皮質幹細胞及び前駆細胞へと分化することができる。

皮質幹細胞及び前駆細胞は、未分化のヒト多能性幹細胞の娘細胞又は子孫であり、確定的な皮質表現型を有しており、元々の幹細胞と比べると分化能力が低くなっている。更に、皮質幹細胞及び前駆細胞は、例えば、任意のクラス又は層（例えば、大脳皮質の１層〜６層のいずれか１つの層のニューロン）の大脳皮質ニューロンに分化することができる。

本明細書に記載の、ヒト多能性細胞の神経誘導によって生成される皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、以下の２つの細胞の両方を含む：増殖可能で、多能性を維持した皮質細胞（皮質幹細胞）；及び、必ずしも自己更新する能力を持たない、能力がより限られた細胞（前駆細胞）。

皮質幹細胞及び前駆細胞は、培養中、神経上皮ロゼット（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｏｓｅｔｔｅｓ）を形成することができる。これらの神経上皮ロゼットは、皮質神経上皮のインビボでの性質を１種以上示すことができる（例えば、頂底極性（ａｐｉｃｏ−ｂａｓａｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ）；頂部での分裂（ａｐｉｃａｌ ｍｉｔｏｓｅｓ）、及び有意な量の脳室からはなれた（ａｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）領域での分裂。皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、頂端及び基底の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。

皮質幹細胞及び前駆細胞は、Ｐａｘ６を発現することができる。また、皮質幹細胞及び前駆細胞は、１種以上のＦｏｘＧ１、Ｅｍｘ１、Ｅｍｘ２、及びＣＯＵＰ−ＴＦ１を発現することができる。

また、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団のサブセット（即ち、基底細胞）は、Ｔｂｒ２を発現することができる。

皮質幹細胞及び前駆細胞は、多能性に関連するマーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリ・ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、及びＴｒａ−１−６０）を発現しない。

本発明の方法は、１種以上の皮質幹細胞及び前駆細胞マーカー、及び／又は１種以上の多能性細胞マーカーの発現を、集団の細胞内で、モニター又は検出するステップを含むことができる。これにより、前記神経誘導培地で培養した際に、集団の分化又は神経誘導の度合いを決定することが可能となる。

本発明の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞は、実質的に他の細胞種を含まないようにすることができる。例えば、細胞集団は、前記神経誘導培地で培養後、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。

好ましくは、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、他の細胞種を含まない度合いが十分であるため、精製の必要がない。

前記神経誘導培地で培養後、上述したように、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、前記神経誘導培地から単離したり、及び／又は除去したりすることができる。適切な技術については周知である。

幾つかの実施形態において、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、増殖させることができる。皮質幹細胞及び前駆細胞の増殖のための適切な培養条件には、ＦＧＦ２シグナリングを刺激する条件が含まれる。例えば、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を添加した増殖培地中で培養することによって増殖させることができる。例えば、培地は、１０〜４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含むことができる。

適切な増殖培地は、ＦＧＦ２を添加した上述の３Ｎ培地を含むことができる。他の適切な培地については、当業者にしてみれば明らかであろう。

皮質幹細胞及び前駆細胞の製造及び随意的な増殖の後、皮質幹細胞及び前駆細胞の神経形成を開始して、大脳皮質ニューロンの集団を生成することができる。

皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、神経形成を促進する条件で培養することができる。例えば、細胞は、増殖培地（例えば、上述したような３Ｎ培地）中で、ＦＧＦ２無しにした物で培養することができる。

皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、少なくとも４０日間、少なくとも６０日間、少なくとも８０日間、少なくとも１００日間、若しくは１００日超、又は神経形成が完了するか、若しくは十分な量の神経形成が発生するまで培養することができる。標準的な細胞培養技術を用いることができる。

大脳皮質ニューロンは、機能的グルタミン酸作動性投射ニューロンに十分に分化する。大脳皮質ニューロンは、以下の群から選ばれる１種以上のマーカーを発現することができる：Ｔｂｒ１、ＣＴＩＰ２、Ｃｕｘ１、Ｓａｔｂ２、Ｂｒｎ２、ｒｅｅｌｉｎ、Ｆｅｚｆ１、Ｆｅｚｆ２、Ｓｏｘ５、Ｂｈｌｈｂ５、Ｐｏｕ３ｆ１、及びＯｔｘ１（以下の文献を参照されたい Ｍｏｌｙｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００７ Ｊｕｎ；８（６）：４２７−３７）。

本発明の方法は、集団中の細胞において、１種以上の大脳皮質ニューロンのマーカー、並びに／又は１種以上の皮質幹細胞及び前駆細胞のマーカーの発現をモニター又は検出するステップを含むことができる。

大脳皮質ニューロンは任意のクラスであってもよい。例えば、前記ニューロンは、皮質層６、皮質層５、皮質層４、皮質層３、皮質層２、又は皮質層１のニューロンであってもよい。

異なるクラスの大脳皮質ニューロンは、神経クラスマーカーの発現によって特定することができる。例えば、層１ニューロンでは、ｒｅｅｌｉｎが発現；層２／３ニューロンでは、Ｂｒｎ２が発現；層２〜４ニューロンでは、Ｃｕｘ１及びＳａｔｂ２が発現；層５ニューロンでは、ＣＴＩＰ２、Ｐｏｕ３ｆ１／ＳＣＩＰ、又はＯｔｘ１が発現；層５皮質脊髄運動ニューロンでは、ＣＴＩＰ２が発現するが、Ｔｂｒ１は発現しない；及び層６ニューロンでは、Ｔｂｒ１及びＦｅｚｆ２が発現。

神経クラスマーカーの発現は、免疫細胞化学、蛍光抗体法、及びＲＴ−ＰＣＲを含めた適切な技術によって決定することができる。

大脳皮質ニューロンの異なるクラスは、皮質幹細胞及び前駆細胞の分化を開始した後、例えば８０、９０、又は１００日間にわたって、進行する形で形成することができる。幾つかの実施形態において、層５の皮質脊髄運動ニューロンが、表層（層２〜４）のニューロンとともに続いて出現する前に、深層６ニューロンは分化する。おおまかに等しい量で、深層と表層のニューロンを生成することができる。

所望のクラスの大脳皮質ニューロンが生成されるまで細胞を培養することができる。細胞培養中に存在する前記クラスのニューロンは、上述したように、神経クラスのマーカーの発現を検出することによってモニターすることができる。

幾つかの実施形態において、神経生成の速度は、例えば、培養培地にＦＧＦ２を添加したり、又は取り除いたりすることにより、制御して特定の神経細胞クラスの出現を遅くすることができる。本発明の方法は、細胞培養から特定のクラスのニューロン集団を単離するステップを含むことができる。例えば、皮質層６、皮質層５、皮質層４、皮質層３、皮質層２又は皮質層１のニューロンの集団を単離することができる。これらのニューロンは、後述するように治療や他の応用にわたって、有用となりうるものである。

幾つかの好ましい実施形態において、皮質層５のニューロンの集団を単離することができる。これらの中には、皮質脊髄運動ニューロンが含まれ、該ニューロンは、脊髄損傷、及び運動ニューロンの病気の治療若しくはモデリング、又はこれらの症状に対する治療剤のためのスクリーニングにおいて、特に有用となりうるものである。

本発明の方法によって生成された皮質ニューロン（特に、特定のクラス又はサブセットの皮質ニューロン（例えば、皮質脊髄運動ニューロン））は、実質的に、他の細胞種を含まない物であってもよい。幾つかの実施形態において、対象となる皮質ニューロンは、当業者にとって公知の任意の技術を用いて、細胞培養中に、他の細胞種又は細胞クラスから分離することができる。該技術の中には、抗体、又は磁気ビーズ、又は蛍光活性細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって、細胞外エピトープ（例えば、神経クラスマーカー等）を認識させることに基づくものも含まれる。

本明細書に記載の方法で生成された大脳皮質ニューロンは、機能的には、電気生理学的特性を示すことができ、そして、神経シナプスを形成することができる。大脳皮質ニューロン集団の興奮性のシナプス特性は、例えば、微小興奮性シナプス後電位（ｍＥＰＳＰ）の存在、又は集中したシナプトフィシンの免疫蛍光の存在を検出することにより、決定することができる。こうした事は、標準的な技術を用いて行うことができる。

上述したように、ヒト多能性幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。

ｉＰＳ細胞は、非多能性の、即ち完全に分化した先祖の細胞に由来する多能性細胞である。適切な細胞には、成人の線維芽細胞や、末しょう血液細胞が含まれる。通常、先祖となる細胞は、多能性遺伝子又は多能性蛋白質（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＳｏｘ１）を細胞内に導入することによって、再プログラムすることができる。前記遺伝子又は蛋白質は、任意の適切な技術によって分化した細胞に導入することができる。該技術には、ウィルス性又はプラスミドのトランスフェクションや、直接の蛋白質の送達等が含まれる。また、導入効率を上げる目的で前記細胞に他の遺伝子を導入してもよい（例えば、Ｋｉｆ遺伝子（例えば、Ｋｉｆ−１、−２、−４及び−５）；Ｍｙｃ遺伝子（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃ）；ｎａｎｏｇ；及びＬｉｎ２８）。多能性遺伝子又は蛋白質を導入した後、先祖細胞を培養することができる。多能性マーカーを発現する細胞は、単離及び／又は精製して、ｉＰＳ細胞の集団を生成することができる。ｉＰＳ細胞を製造するための技術は周知である（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００７； ４４８：３１３−７； Ｙａｍａｎａｋａ ６ ２００７ Ｊｕｎ ７；１（１）：３９−４９． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ． ２００８ Ｊｕｌ ３１； ４５４（７２０４）：６４６−５０； Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｃｅｌｌ． ２００７ Ｎｏｖ ３０； １３１（５）：８６１−７２． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ． ２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１−６； Ｋｉｍｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４７２−６．）

幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、個体から得られた健常な細胞（即ち、病気に関連した表現型又は遺伝子型を持たない細胞）由来であってもよい。幾つかの実施形態において、細胞は、損傷した又は機能不全の皮質ニューロンを有する患者（例えば、神経病、頭部の外傷、多発性硬化症、脳卒中、又は脊髄損傷を有する個体）から得られた物であってもよい。これらの細胞から生成された皮質ニューロンは、患者の治療に有用な物となりうる可能性がある。

幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、病気特有のｉＰＳ細胞であってもよい。病気特有のｉＰＳ細胞は、ある個体からの病気に関連した細胞（即ち、病気（例えば、神経病、例えば散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症、並びに脳性麻痺）に関連した表現型又は遺伝子型を有する細胞）に由来する物であってもよい。

ｉＰＳ細胞の製造のための細胞であって、病気に関連した細胞は、神経病に苦しむ個体、又は神経病になりやすい若しくは神経病のリスクがある個体から得ることができる。

神経病には、損傷した又は機能不全の皮質ニューロンに関連する病気が含まれる（例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症及び脳性麻痺）。

幾つかの好ましい実施形態において、神経病には、若年発症性の又は成人発症性の神経変性病が含まれる。

病気特有のｉＰＳ細胞は、本明細書に記載するように分化させて、神経病のモデルとして有用な皮質ニューロンの集団を生成することができる。特に、本明細書に記載するように病気特有のｉＰＳ細胞から生成された皮質ニューロンは、短時間枠（即ち、数週間又は数ヶ月）で病理を示すことができる。このことにより、治療用分子のスクリーニングを促進する。

幾つかの好ましい実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、ダウン症候群ｉＰＳ細胞（ＤＳ−ｉＰＳ細胞）である。ＤＳ−ｉＰＳ細胞は、ダウン症候群を有する個体から得られた細胞に由来するｉＰＳ細胞である（Ｐａｒｋ， Ｉ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ １３４， ８７７−８８６ （２００８））。

ダウン症候群／トリソミー２１は、ヒトの精神遅滞において最もありふれた遺伝的原因である（Ｗｉｓｅｍａｎ， Ｆ．Ｋ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８， Ｒ７５−８３ （２００９））。ダウン症候群を有する個体は、２１番目染色体上にあるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）遺伝子の存在に起因するアルツハイマー病（ＡＤ）の発症率が非常に高い（Ｒｕｍｂｌｅ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２０， １４４６−１４５２ （１９８９）； Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， １８２９５−１８２９８ （１９９６））。

本明細書に記載の方法によって、ＤＳ−ｉＰＳ細胞において、皮質形成をインビトロで誘導すると、２１番目の染色体の余分な複製を有する大脳皮質ニューロンが生成されることとなる。

これら大脳皮質ニューロンは、細胞培養において、ＡＤの病理を示す。例えば、ＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンは、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）のＡβ４２フラグメントを高いレベルで生成し、細胞内及び細胞外アミロイド・プラークを形成し、そして、プログラム細胞死の率が上昇する。

ＡＤの病理を有する皮質ニューロンを生成する方法においては、以下のステップを含むことができる；
上述したように、ＤＳ−ｉＰＳ細胞の集団の皮質形成をインビトロで誘導するステップ；
該ステップにより、ＡＤの病理を有する皮質ニューロンの集団を生成するステップ。

ＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンは、ＤＳ−ｉＰＳ細胞、又は該細胞由来の保存皮質幹細胞からの分化を開始して、１、２、３、４ヶ月又はそれ以上の間にＡＤの病理を示すことができる。

一旦生成されると、ＡＤの病理を有する皮質ニューロンは、例えば、スクリーニングでの使用を目的として、培養及び維持をすることができる。ＡＤの病理を有する皮質ニューロンを維持する方法は、以下のステップを含むことができる；
上述したように、ＤＳ−ｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンの集団を培養するステップ。

ニューロンを培養する方法は、周知である。

本発明の方法は、前記細胞内で、１種以上のＡＤの病理を測定又は検出するステップを更に含むことができる。

ＡＤの病理としては、以下のものが含まれる：Ａβ４２の発現レベルの上昇、ＡＢ４０（非毒性形態）に対するＡＢ４２の割合上昇；ニューロン内でのＡＢ４２レベルの情報；細胞外培地におけるＡＢ４２レベルの上昇；ＡＢ４２オリゴマー形成の上昇；高リン酸化されたＴａｕレベルの上昇；細胞内カルシウムレベルの上昇；細胞内及び細胞外アミロイド・プラーク形成の上昇；及びプログラム細胞死の率の上昇。

後で更に詳述するが、こうした病理は、例えば、スクリーニングの方法において有用となる可能性がある。

ダウン症候群を有する個体は、早老の症状を示す可能性がある。本明細書に記載の方法で、ＤＳ−ｉＰＳ細胞において皮質形成をインビトロで誘導すると、大脳皮質ニューロンが生成されることとなり、該ニューロンは、老化及び年齢に関連した認知低下の研究において有用となる可能性がある。

年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンを生成する方法では以下のステップを含むことができる：
上述したように、ＤＳ−ｉＰＳ細胞の集団の皮質形成をインビトロで誘導するステップ；
それによって、年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンの集団を生成するステップ。

ＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンは、ＤＳ−ｉＰＳ細胞、又は該細胞に由来する保存皮質幹細胞から分化を開始して１、２、３、４ヶ月又はそれ以上の間に、年齢に関連した病理を示すことができる。

一旦生成されると、年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンは、例えば、スクリーニングでの使用を目的として、培養及び維持をすることができる。年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンを維持する方法は、以下のステップを含むことができる：
上述したように、ＤＳ−ｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンの集団を培養するステップ。

年齢に関連した病理には、以下のものを含めることができる：成長の低下、プログラム細胞死の率の上昇、シナプス活動の低下、及び興奮性の活動の低下。

本発明の他の態様では、以下の物を提供する：上述したようなインビトロでの皮質形成の方法によって生成された単離大脳皮質ニューロン、又は単離皮質幹細胞及び前駆細胞、並びに上述したようなインビトロでの皮質形成の方法によって生成された単離大脳皮質ニューロン、又は単離皮質幹細胞及び前駆細胞の集団。

単離大脳皮質ニューロンの集団は、機能的に興奮特性を有するグルタミン酸作動性投射ニューロンを８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上含むことができる。前記集団は、介在ニューロンの含有量が１％未満であってもよく、好ましくは、介在ニューロンを全く含まず、又は、免疫細胞学の手法において検出できない程度の介在ニューロン量であってもよい。

単離皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。

本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞は、大脳新皮質細胞（ｄｏｒｓａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｃｅｌｌｓ）（即ち、これらの細胞は、皮質組織に特有である）である。

本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、後脳又は脊髄の幹細胞及び前駆細胞を含まない。

幾つかの好ましい実施形態において、ニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、機能不全の（例えば、損傷した又は病気をもった）大脳皮質を有する個体に由来するｉＰＳ細胞から生成される。これら皮質幹細胞及び前駆細胞、又はニューロンは、患者の治療において利用することができる。例えば、前記皮質細胞を投与して、機能不全の大脳皮質を有する個体（即ち、病気の又は機能不全の皮質ニューロンを有する個体）において、損傷した皮質ニューロンを置き換えることができる。

本発明の更なる態様は、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団を提供する。該集団は、ヒト又は動物の身体の治療方法において（例えば、機能不全の大脳皮質を有する患者の治療において）使用することを目的とする。また、本発明の更なる態様は、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団の使用を提供し、該使用は、機能不全の大脳皮質の治療における使用を目的とする薬品の製造における使用である。

機能不全の大脳皮質を有する個体は、損傷した、又は機能不全の皮質ニューロンに関連する病気（例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症、運動ニューロン病、脳性麻痺、多発性硬化症、又は脳卒中）を有する個体であってもよい。或いは、機能不全の大脳皮質を有する個体は、脳又は脊髄に対する損傷又は外傷に苦しむ個体であってもよい。例えば、上述したような方法で生成された皮質脊髄運動ニューロン（層５）は、脊髄損傷を治療するために使用することができる。

個体を治療するために使用される皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団は、該個体から得られた細胞に由来するｉＰＳ細胞から生成されることが好ましい。

治療への応用を目的として、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンは、臨床グレード（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）細胞であることが好ましい。

ある個体に投与される皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団は、遺伝的操作を行い、治療用分子（例えば、薬剤又は成長因子）を生成することができる（Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ Ｍａｒ；１３（５）：３７９−８８， Ｋｌｅｉｎ ＳＭ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５ Ａｐｒ；１６（４）：５０９−２１）。

医薬組成物、薬品、薬剤、又は他の組成物については、医薬的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存薬（防腐剤）、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の物質とともに、皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団を含むことができる。キャリア又は他の物質の正確な特性については、投与経路に依存することになるであろう。医薬組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又はキャリア、及び随意的に１種以上の他の成分と共に、皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団を混合することによって生成することができる。

前記組成物は、患者に投与することができ、例えば、上述したように、機能不全の皮質組織の治療（予防的な治療も含めることができる）を目的としたものであってもよい。

液体医薬組成物は、一般的に、液体キャリア（例えば、水、石油、動物性油、植物性油、鉱物油、又は合成油）を含む。生理食塩水溶液、組織培養培地若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）を含めることができる。

組成物は、非経口的に許容可能な水性溶液の形態であってもよく、該形態では、感染源が含まれておらず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する。当分野に関わるものであれば、例えば、塩化ナトリウム等の等張性のビヒクル、リンゲル注射、又は乳酸リンゲル注射を用いて適切な溶液を調製することは十分可能である。組成物は、人工的な脳脊髄液を用いて調製してもよい。

細胞は、任意の公知技術によって、患者に移植することができる（例えば、 Ｌｉｎｄｖａｌｌ， Ｏ． （１９９８） Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ． １３， Ｓｕｐｐｌ． １：８３−７； Ｆｒｅｅｄ， Ｃ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ６， ２０１−２０２； Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３３２， １１１８−１１２４； Ｆｒｅｅｄ， Ｃ．Ｒ．，（１９９２） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３２７， １５４９−１５５５， Ｌｅ Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ ２００４ Ｍａｙ １；３６３（９４１９）：１４３９−４１）。

本発明に従った組成物の投与は、「予防としての有効量」又は「治療としての有効量」であることが好ましい（場合によっては、予防を治療とみなすこともできるかもしれないが）。そして、該量とは、個体に対して利点を示すのに十分な量である。実際の投与する量、割合、及び時間変化は、治療対象の性質や深刻度によるだろう。治療の処方箋（例えば、投与量等の決定）については、一般的に実践する者、又は他の医療ドクターの責任の範囲内である。

組成物は、治療する症状に応じて、単独で投与することもでき、又は他の治療と組み合わせて同時に若しくは連続のいずれかで投与することができる。

他の好ましい実施形態において、ニューロン、皮質幹細胞及び前駆細胞、又はこれらの集団は、病気特有のｉＰＳ細胞、例えばＤＳ−ｉＰＳ細胞に由来する。

ニューロン、若しくは幹細胞及び前駆細胞、又はこれらの集団は、神経変性病の病理（例えば、細胞内又は細胞外の蛋白質の凝集、アポトーシスの上昇）を示すことができる。例えば、ＤＳ−ｉＰＳ細胞に由来するニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、ＡＤの病理を示すことができる。

神経変性病の病理を示す細胞は、治療薬の開発に有用となりうる有効な化合物のスクリーニングにおいて有用となる可能性がある。

本発明の他の態様は、上述したように、生成された大脳皮質ニューロンを、治療活性を有する化合物（神経病等の病気の治療において有用となり得る物）のスクリーニング方法において使用することに関する。

神経病の治療において有用な化合物のスクリーニング方法では、以下のステップを含むことができる：
上述した方法によって生成された単離大脳皮質ニューロンを、試験化合物に接触させるステップ；及び
前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。

例えば、試験化合物による効果を決定する対象としては、神経細胞の死／生存、成長、増殖、症状、集合、電気的な活動、シナプス活動、及び／又は遺伝子の発現等を挙げることができる。

幾つかの実施形態において、神経変性病の治療において有用な化合物のスクリーニングの方法は、以下のステップを含むことができる：
上述の方法で生成された単離大脳皮質ニューロンに対する神経毒性効果を、試験化合物が存在する場合と存在しない場合とで決定するステップ。

ニューロンに対する神経毒性効果を減少又は改善する試験化合物は、神経変性病の治療又は治療薬の開発において有用となる可能性がある。

神経毒素としては、神経変性病に関連する集合傾向の（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｎｅ）蛋白質（例えばＡＢ４２）を含めることができる。

また、本明細書に記載の方法で生成された大脳皮質ニューロンは、例えば、毒性試験において有用となる可能性がある。

幾つかの実施形態において、化合物の神経毒性を決定する方法は以下のステップをふくむことができる：
上述の方法で生成された単離大脳皮質ニューロンに前記化合物を接触させるステップ：、及び
前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。

例えば、以下の現象をかえる化合物は神経毒素と同定することができる：例えば、神経細胞の死／生存の増加若しくは減少、成長、増殖、症状、集合、電気的活動、シナプス活動、及び／又は遺伝子発現。

ニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、病気特有のｉＰＳ細胞に由来することが好ましく、例えば、皮質ニューロンの損傷又は機能不全に関連した病気（例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症及び脳性麻痺）に苦しむ個体から得られた細胞に由来するｉＰＳ細胞であることが好ましい。

病気特有のｉＰＳ細胞に由来するニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、神経病の病理（例えば、異常なシナプス活動又は電気的活動、細胞内又は細胞外での蛋白質の凝集、異常な遺伝子発現、又は細胞死の上昇）を示す可能性がある。

神経病の病理に対する試験化合物の効果を決定することが可能である。前記病理を減少又は阻害する化合物は、神経病の治療、又は神経病に対する治療薬の開発において潜在的に有用な物として特定される可能性がある。

神経学的な病理（例えば、アルツハイマー病の病理）は、分化を開始して、１、２、３、４、５、６週間又はそれ以上の間で、決定することができる。これらの病理は、試験化合物の効果を決定する目的で、１、２、３、４、５、６週間又はそれ以上の間で、測定することができる。

幾つかの好ましい実施形態において、アルツハイマー病の治療において有用な化合物のスクリーニング方法は、以下のステップを含むことができる：
上述の方法でＤＳ−ｉＰＳ細胞から生成された単離大脳皮質ニューロンを試験化合物に接触させるステップ；及び
前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。

例えば、試験化合物の効果を、以下の１種以上のアルツハイマー病の病理に関して決定することができる：例えば、Ａβ４２の発現レベル、ＡＢ４０（非毒性形態）に対するＡＢ４２の割合；ニューロン内のＡＢ４２レベル；細胞外培地内でのＡＢ４２レベル；ＡＢ４２オリゴマー形成；高リン酸化されたＴａｕのレベル；細胞内カルシウムレベル；細胞内及び細胞外アミロイド・プラークの形成；プログラム細胞死の率。

試験化合物で処理していないコントロールの細胞に比べて、これらの病理のいずれかが減少することにより、試験化合物は抗ＡＤ活性があり、アルツハイマー病の治療及び／又はＡＤ治療薬の開発に有用となる可能性を示すことができる。

アルツハイマー病の病理（例えば、ＡＢ４０（非毒性形態）に対するＡＢ４２の割合；ニューロン内のＡＢ４２レベル；細胞外培地内でのＡＢ４２レベル；ＡＢ４２オリゴマー形成；高リン酸化されたＴａｕのレベル；細胞内カルシウムレベル；Ａβ４２の発現；細胞内及び細胞外アミロイド・プラークの形成；及び／又はプログラム細胞死の率）は、標準的な技術を用いて測定することができる。例えば、アミロイド・プラークの進行は、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ ＴのアナログであるＢＴＡ１²⁴で生体染色（ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）することによって決定することができる。

本明細書に記載の方法では、皮質ニューロンにおいて１種以上の神経病の病理を減少又は改善する試験化合物を同定するステップを含むことができる。神経病の病理を減少する化合物は、神経病の治療、又は該化合物の設計のための化合物の候補となる。

皮質ニューロンにおいて１種以上の神経病の病理を減少又は改善する化合物を同定した後は、本発明の方法は、前記化合物の医薬的特性を最適化するために、該化合物を改変するステップを更に含むことができる。該ステップは、上述したようなモデリング技術によって成しうるものである。

試験化合物は、皮質ニューロンにおいて１種以上の神経病の病理を減少又は改善する能力を有する物として、１種以上の初期スクリーンニングを用いて同定されるが、１種以上の二次スクリーンニングを用いて更に評価することができる。

二次スクリーンニングは、インビトロ及び／又はインビボ（例えば、動物モデル）で、生物学的機能及び活性について試験することを含めることができる。例えば、病気の動物モデルにおいて神経病と関連する１種以上の症状又は病理を減少又は改善する試験化合物の能力を決定することができる。

皮質ニューロンにおいて、１種以上の神経病の病理を減少又は改善する試験化合物を同定した後は、前記化合物を単離及び／又は精製することができ、或いは、組み換え発現や化学合成の従来技術を用いて合成することができる。更に、化合物は、組成物の調製、即ち、組成物（例えば、薬品、医薬組成物、又は薬剤）の製造又は形成において製造したり、及び／又は使用することができる。これらの物は、神経病を治療するために個体に投与することができる。

本明細書に開示した内容を参照すれば、本発明に係る更なる様々な態様及び実施形態があることが当業者にとって明らかであろう。

本明細書で記述した全ての文献及びデータベース・エントリは、参照により、その内容全体を本明細書に組み込む。

本明細書で引用した細胞マーカーは、全て周知であり、完全な詳細情報については、公共のデータベース（例えば、オンラインＮＣＢＩデータベース）上で容易に入手できる。これらのマーカーの発現を検出するための抗体は、ルーチン技術で生成することが可能であり、又は販売元（例えば、 Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ， ケンブリッジ ＵＫ）から入手することが可能である。

本明細書で使用する「及び／又は」という表現（該表現において、「及び」を「並びに」に置き換えた場合や、「又は」を「若しくは」に置き換えた場合も同様）は、特定の二つの特性又は成分のうちのそれぞれであって、他方の要素を伴うもの、又は伴わないものである旨を特定して開示するものとして解釈すべきものである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）ＡとＢのそれぞれが、ちょうど本明細書において個別に列挙されたかのように、特定して開示するものとして解釈すべきものである。

特記しない限り、上述した特徴に関する記載や定義は、本発明のあらゆる特定の態様や実施形態に限定されない。そして、記載した全ての態様及び実施形態に等しくあてはまるものである。

本発明の特定の態様及び実施形態については、後述する図面及び表を参照しながら、例示的な意味合いで以下述べることとする。

脳室帯の幹細胞及び前駆細胞で発現する転写因子Ｆｏｘｇ１に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。該図に示すところによれば、皮質幹細胞の誘導は、５日後に始まり、２０日後にピークを迎える。一方で、Ｔｂｒ２を発現する細胞は、殆ど１週間後で出現し始める。エラーバーは、標準誤差である。 １５日間の神経誘導期間にわたって、Ｏｃｔ４発現ｈＥＳ細胞が、Ｐａｘ６発現神経幹細胞へと、高効率で分化したことを示す。アスタリスクは、検出可能なＰａｘ６発現細胞が０日目において存在しなかったこと、及びＯｃｔ４発現細胞が１５日目において存在しなかったことを示す。エラーバーは、標準誤差である。１５日目のＰａｘ６発現細胞に関するサンプル数は、ｎ＝３である。 皮質誘導の効率を定量化したものを示す。２つのｈＥＳＣ及び４つのｈｉＰＳＣ細胞株において、レチノイドが存在する場合又はしない場合での、Ｐａｘ６発現細胞のパーセンテージ（核のパーセンテージ、ＤＡＰＩによって検出）によって評価した。値は、各細胞株についておこなった３例の培養の平均である。エラーバーは、標準誤差である。 皮質ロゼット（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｒｏｓｅｔｔｅｓ）において見出されるＴｂｒ２＋ Ｋｉ６７＋細胞の割合を定量化したものを示す。ロゼット内の１５〜２０％の細胞が、異なるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの株に由来しているが、Ｔｂｒ２＋を発現している。Ｔｂｒ２＋集団の中で、約４０％が、Ｋｉ６７＋サイクリング前駆細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）である。 皮質ロゼットにおいて見出されるＴｂｒ２＋細胞の割合を定量化したものを示す。ロゼット内の１５〜２０％の細胞が異なるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの株に由来しているが、Ｔｂｒ２を発現している。 培養におけるｈＥＳＣからの神経分化の時間経過を示す。３５日までの培養中約７０％の細胞がＴｕｊ１発現ニューロンである。各時間ポイントのカウントは、ｎ＝３の培養例からのデータである。エラーバーは、標準誤差である。 １５日間の間隔にわたっての、Ｐａｘ６発現皮質幹細胞及び前駆細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ）へのＯｃｔ４発現ｈＥＳ細胞（Ａ、Ｃ、Ｅ）の分化を示す。スケールバーは、１００μｍである。 ｈＥＳ由来の皮質幹細胞及び前駆細胞が増殖性細胞である、極性をもった神経上皮ロゼット（Ｋｉ６７）を形成しているのを示す。該細胞では、多くの有糸分裂（ホスホ−ヒストン Ｈ３）が中心ルーメン（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌｕｍｅｎ）付近でおきている（図ｉではアスタリスク；図ｊでは白色矢印（下向きの矢印）が頂部（ａｐｉｃａｌ）有糸分裂を示す）。該ルーメンは神経上皮細胞の頂部表面から形成される（ＣＤ１３３， ｊ）。また、中心体心室での有糸分裂（Ａｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｉｔｏｓｅｓ）も通常見られる（図ｊ中の黄色矢印（右向き矢印）） 前記ロゼット内において、増殖性で、且つＫｉ６７陽性の細胞のサブセットが、ＳＶＺ特有の転写因子Ｔｂｒ２を発現していることを示す（白色矢印、図ｋ）しかし、Ｔｂｒ２発現細胞の大半は、新たに誕生した物であり、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（Ｄｃｘ）発現ニューロン（白色矢印，図ｌ）である。スケールバーについて、ｊ，ｍでは１００μm；ｋ，ｌについては５０μｍである。 ヒトＥＳ細胞からの皮質神経生成の順序を表し、通常の発達を再現している。深層及び上層ニューロンは、ｈＥＳＣから時系列順に生成している。層２／３のニューロン（Ｂｒｎ２）の前に、層５及び６のニューロン（Ｔｂｒ１及びＣＴＩＰ２）が発生している。各マーカーについては、Ｎ＝３例の培養をスコアした。エラーバーは、標準誤差である。 成人皮質の層における皮質投射ニューロンのクラスの図を表す。マウスのデータを元にしたものであり、図に示すように各クラスのニューロンで発現する転写因子を示す。ＣＰＮとは、脳梁投射ニューロン（ｃａｌｌｏｓａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）である。 早期又は後期にｈＥＳＣから誕生した皮質ニューロンの分化を示す。層６の皮質視床投射ニューロン（Ｔｂｒ１／ＣＴＩＰ２発現ニューロン、図ｇ， ｉ）及び層５の皮質脊髄運動ニューロン（図ｈ、ＣＴＩＰ２陽性、Ｔｂｒ１陰性ニューロン、図ｉ中の白色矢印）が両方とも存在している。ｊ）〜ｋ）は、上層、後期にｈＥＳＣから誕生した皮質ニューロンの分化を示す。これらのニューロンは、Ｃｕｘ１、Ｓａｔｂ２及びＢｒｎ２を発現する。スケールバー（ｇ−ｌ）は５０μｍである。 ヒトＥＳ株及びｉＰＳ株から生成した、異なるクラス皮質投射ニューロンの相対的な割合を示す。おおよそ等しい割合の深層及び上層ニューロンが全ての株から生成している。 図１３〜１７では、機能的なヒト皮質興奮性ニューロンがｈＥＳＣからインビトロで生成したこと示し、インビボでの発達を発生反復（再現）したものである。図１３は、膨大な数のニューロン（Ｔｕｊ１発現）が効率的に生成したこと、（ａ）そして、それが豊富な神経突起を有すること、（ｂ）ｈＥＳ細胞に由来することを示したものである。ほとんど全てのニューロンはグルタミン酸作動性であり、その証拠としては、細胞体及び神経突起において、小胞性グルタミン酸トランスポーターが存在することが挙げられる（白色矢印、図ｃ）。スケールバーは、（ａ）５０μｍ、（ｂ）２５μｍ、（ｃ）１０μｍである。 ヒトＥＳ由来皮質ニューロンが、インビトロで成熟して、自発的な活動電位を発火することを示した図である（ｄ， ｎ＝３ ニューロン）。成熟皮質ニューロンは、ｈＥＳ由来皮質ニューロンの培養中に観察されるように、電流注入に対して活動電位の発生を維持する（ｅ， ｎ＝２１ ニューロン）。また、これらのニューロンは、機能的なシナプスを形成し、頻繁なｍＥＰＳＰ（ｆ， ｎ＝１２ ニューロン）の存在によって示される。 多能性幹細胞由来の皮質ニューロンが分化を示して、成熟した電気生理学的特性を獲得したことを示す。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＰＳＣ由来の皮質ニューロンにおける電位依存性のナトリウム及びカリウムチャネルを示す。保持（静止）電位−８０ ｍＶから、＋４０への脱分極ステップのファミリーに対する電流応答を重ね合わせている。図１５Ａ、高速活性化及び非活性化のナトリウム内向き電流が、ＴＴＸを投与することにより完全にブロックされる。図１５Ｂ、４−ＡＰにより、高速活性化の一時的フラクションである外向きＫ電流がブロックされる。図１５Ｃは、ＰＳＣ由来の皮質ニューロンの電気生理学的な特性が経時的に成熟していることを示す。例えば、ステップ電流注入に応答して、活動電位の発火が変化している。図１５Ｄ及び１５Ｅは、ステップ電流注入に応答して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンが、非常に鋭い定期的なスパイク特性を発達させることを示す。 ｈＥＳＣ（Ｄ１）又はｈｉＰＳＣ（Ｄ２）に由来する皮質ニューロンのホールセル記録におけるｍＥＰＳＣの検出を示す。それぞれの場合において、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニストであるＣＮＱＸがｍＥＰＳＣの出現をブロックした。 ｈＥＳＣ（ｎ＝２０例；Ｅ１）及びｈｉＰＳＣ（ｎ＝２０例； Ｅ２）由来の皮質ニューロンからの平均ｍＥＰＳＣを示す。それぞれの場合において、ｍＥＰＳＣは、ＡＭＰＡ仲介電流に特徴的とも言える急速な開始（ａｒｒｏｗｈｅａｄ）を緩慢な減衰（ａｒｒｏｗ）を有する。 図１８〜３１は、ダウン症候群ｉＰＳ細胞を、機能的な皮質投射ニューロンに分化誘導することを示している。図１８は、極性を持った神経上皮ロゼット（Ｄ−Ｆ）において、１５日間隔で、Ｏｃｔ４発現ＤＳ−ｉＰＳ細胞（Ａ−Ｃ）が、Ｐａｘ６発現皮質幹細胞及び前駆細胞に分化することを示す。染色体分析によって、ＤＳ−ｉＰＳ細胞が４７本の染色体を含むことが確認された（Ｃ）。スケールバーは以下の通り、５０μｍ （ａ−ｅ）、１００μｍ（ｆ）。 ＤＳ−ｉＰＳは、全ての皮質層（深層（Ｔｂｒ１，ｇ）、及び上層（Ｃｕｘ１， Ｂｒｎ２， Ｓａｔｂ２， ｈ， ｉ））のニューロンを生成することを示す。。 おおよそ等しい数の深層及び上層ニューロンが生成していることを示す（ｊ）。各細胞特異的なマーカーは、ｎ＝３の培養である；エラーバーは、標準誤差である。スケールバーは５０ μｍである。 ＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンが、インビトロで機能的に成熟した物になることを示す。自発的な活動電位の発火が見られ（Ａ）、電流を注入すると連なった活動電位の発火が見られる（Ｂ）。 コントロール（Ｃｔｒｌ）の健全な皮質ニューロン及びＤＳ（ＤＳ）ｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンによるＡβ４０ペプチドの分泌を示す（各細胞株につきｎ＝３例の培養）。細胞培養培地は、４８時間ごとに集め、Ａβ４０ペプチド濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。細胞培養培地は、４８時間ごとに新しい物に完全に置き換えた。従って、Ａβ４０レベルは、４８時間という期間における分泌及び蓄積を反映している。緑色の矢印（グラフ中の下向き矢印）は、これらの培養において、神経の分化が顕在化し始めた所を示す。アスタリスクは、ある時間ポイント内において、コントロールと、ＤＳニューロンとの間で、Ａβ４０濃度に有意差がある（ｐ＜０．０２５）ことを示す。 チオフラビン・アナログＢＴＡ−１を用いて９０日間培養後、ｈＥＳ及びＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンについて、アミロイドを生体染色したものを示す。ＢＴＡ−１陽性の凝集物は、ＤＳ−ｉＰＳの神経培養（図ｂの矢印）に特異的に観察される。Ｈ９は：Ｈ９ｈＥＳ細胞由来の皮質ニューロンであり；、ＤＳは、ＤＳ１−ｉＰＳ４由来の皮質ニューロンである。スケールバーは１００μｍである。 Ａβ４２蓄積に関するドットブロット（ａ）及び定量化（ｂ）を表す。コントロール（Ｈ９）及びダウン症候群（ＤＳ）皮質ニューロンを６０日間培養し、４８時間にわたって細胞培養上澄みに蓄積した物を用いた。 膨大な量の細胞死（活性化カスパーゼ３）が、ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロン培養において観察されたことを示す。大半は、細胞内のＢＴＡ１陽性アミロイド凝集物（図ｌ中の矢印）を有するニューロンで見られる。アポトーシス細胞の定量化を定量化すると、ＤＳ由来の皮質ニューロンにおいて発生率が有意に高いことが見出された（各細胞種につきｎ＝３例の培養）。エラーバーは、標準誤差である。スケールバーは５０ μｍである。 ＡＰＰのフラグメントであって病原性であるＡβ４２フラグメントは、ＤＳ−ｉＰＳ細胞由来の皮質幹細胞培養においては見られず（ｅ）、また、ｈＥＳＣ由来の培養皮質ニューロンにおいても非常にまれであった（ｆ）。しかし、膨大な数の細胞内及び細胞外でのＡβ４２蓄積が、ＤＳ−ｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンを、６０〜９０日間培養した際に見られた。スケールバー、ｅ−ｇでは、１００μｍ；ｈでは、５０μmである。 ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロンを９０日間培養したものに対して、Ｚ−ｓｔａｃｋの３Ｄレンダリングを行ったところ、細胞外アミロイド・プラーク（矢印）が、皮質の神経突起周辺に見られたことを示す。スケールバーは２５μｍである。 Ｈ９及びＤＳ細胞からの皮質ニューロン培養におけるアミロイド凝集物を定量化したものを示す。神経の細胞体の平均直径よりも大きい凝集物について、各細胞種につき三例の培養で、カウントを行った。エラーバーは、標準誤差である。 ＤＳ皮質ニューロンが膨大な量の可溶性細胞外Ａβ４０及びＡβ４２ペプチドを７０日間の分化で生成していることを示す。ＤＳ線維芽細胞や、年齢的に一致したｈＥＳ由来皮質ニューロンの培養とは対照的である。分泌されたＡβ４０：Ａβ４２の割合は、４．６：１である。γセクレターゼをＤＡＰＴで４日間阻害すると、Ａβ４０及びＡβ４２の両方の製造が減少し、前記Ａβ４０：Ａβ４２の割合が７．５：１に変わる。より長期間、２１日間γセクレターゼ阻害を行うと、両方のＡβペプチドの製造は、検出できないレベルにまで減少する。 不溶性Ａβペプチドを定量化したものを表す。ＤＳ線維芽細胞、ｈＥＳ由来皮質ニューロン、及びＤＳ皮質ニューロンを培養して全細胞抽出した不溶性Ａβペプチドを定量化すると、検出可能なＡβは、不溶性フラクション中にあり、主にＡβ４２であることが示される。γセクレターゼ阻害をしても、培養中に存在する不溶性Ａβ４２の量についての有意な変化を示さない。 本明細書に記載の分化手順を図解したものを示す：二重のＳＭＡＤ阻害を組合せること（レチノイドを組み合せたもの）により、ＰＳＣを皮質幹細胞及び前駆細胞に分化させることができ、該細胞は、ＦＧＦ２をもちいて増殖／維持することができる。ＦＧＦ２を除去すると、神経生成を起こすことが可能となる。皮質幹細胞は、皮質細胞種の生成において、インビボで起こるのと同じ発達進行過程をたどる。全ての層の皮質投射は、ＰＳＣから発生し、該投射により、機能的で、興奮性の、グルタミン作動性のシナプスネットワークが形成される。

実施例
方法
ヒト多能性幹細胞培養
ヒトＥＳ細胞の研究は、ＵＫ幹細胞バンク及び幹細胞株の使用に関する運営委員会の承認を得た。そして、ヒト幹細胞株の使用のための実施のＵＫコード（ｔｈｅ ＵＫ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従い行った。ｈＥＳ（Ｈ９、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、及びＥｄｉ２、Ｊｅｎｎｙ Ｎｉｃｈｏｌｓより提供、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、及びｈｉＰＳ細胞株（ＤＳ１−ｉＰＳ４、Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ²²）の培養は、標準的な方法１３に従って、マイトマイシン処理マウス胚の線維芽細胞（ＭＥＦｓ）上で行った。要するに、細胞は、ｈＥＳＣ培地（全ての成分は、特記しない限りＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した：ＤＭＥＭ／Ｆ１２で以下の成分を含有する：２０％ ＫＳＲ、６ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ （ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）， １ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ， １００ μｍ 非必須アミノ酸、１００ μＭ ２−メルカプトエタノール、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び５０ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン。

大脳皮質への分化誘導
ｈＥＳＣ培地（添加物として、１０ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、及び１０ μＭ ＲＯＣＫ 阻害剤 （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））中で、ゼラチンーコートしたディッシュ上で、１時間、予めＡｃｃｕｔａｓｅ （Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を置くことによって、単一の細胞に分離した。その後、ｈＥＳＣ又はｉＰＳＣは、ＭＥＦから単離した。非接着性の多能性幹細胞を回収して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）でコートした１２ウェルプレートにまいた。各ウェルには、ＭＥＦ−条件ｈＥＳＣ培地（１０ ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２とともに）をいれた。いったん、細胞培養状態が、９５％のコンフルエンスに達したら、培養培地を変えて、神経誘導を開始した。変更後の培養培地は、神経誘導、神経生成、及び神経分化をサポートする（３Ｎ培地と呼ぶ）物であり、Ｎ２及びＢ２７を含有する培地を１：１で混合した物である。
Ｎ２培地は、以下の成分を含む：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２ （ＧＩＢＣＯ）、５ μｇ／ｍｌインシュリン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ μｍ 非必須アミノ酸、１００ μＭ ２−メルカプトエタノール， ５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン 及び ５０ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン；
Ｂ２７培地：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７、ビタミン Ａ （ＧＩＢＣＯ）、２００ ｍＭ グルタミン、５０ Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン。
神経誘導の間ＴＧＦβシグナリングを阻害するために、３Ｎ培地には、５００ ｎｇ／ｍｌマウスノギン−ＣＦキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１０ μｍ ＳＢ４３１５４２ （Ｔｏｃｒｉｓ）を添加した。細胞は、該培地中で、８−１１日間維持した。その間、特徴的な神経上皮細胞の形態を有する細胞が出現しないかどうかをもって、神経誘導の効果をモニターした。神経上皮細胞を、Ｄｉｓｐａｓｅで分離して回収した。そして、３Ｎ培地（該培地は、２０ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２を含む）中、そして、ポリ−オルニチン及びラミニンコートしたプラスチックプレート上に再度まいた。更に２日後、ＦＧＦ２を除去して分化を促進した。培養については、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてもう一度継代を行った。そして、ポリオルニチン及びラミニンコートしたプラスチックプレート上に、そして、３Ｎ倍地中に、５０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の濃度でまいた。それ以降毎日、最大で９０日間、培地を変えながら維持した。

免疫細胞化学及び定量化
培養物は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。そして、免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡の工程へと進んだ。本研究の為に用いた抗体は以下の通りである：Ｔｂｒ１ （Ａｂｃａｍ）， Ｔｂｒ２ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）， ＣＴＩＰ２ （Ａｂｃａｍ）， Ｐｒｏｍｉｎｉｎ／ＣＤ１３３ （Ａｂｃａｍ）， リン酸化ヒストン Ｈ３ （Ａｂｃａｍ）， Ｐａｘ６ （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）， Ｏｃｔ４ （Ａｂｃａｍ）， Ｋｉ６７ （ＢＤ）， Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）， β−Ｔｕｂｕｌｉｎ ＩＩＩ （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）， β−Ｔｕｂｕｌｉｎ ＩＩＩ （Ｃｏｖａｎｃｅ）， ｖＧｌｕｔ１ （Ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）， Ｃｕｘ１ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）， Ｂｒｎ２ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）， Ｓａｔｂ２ （Ａｂｃａｍ），切断カスパーゼ ３ （Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），Ａβ４２のＣ末端 （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。

一次抗体に対する二次抗体の検出は種特異的なものとした（Ａｌｅｘａ−ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

特異的な皮質神経マーカーを発現する細胞の数を定量するために、細胞培養物は、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一の細胞に分離した。そして、１００，０００ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で再懸濁した。２０，０００の細胞をＣｙｔｏｓｐｉｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、各ポリ−リシンコートガラススライド上に、設置した。共焦点顕微鏡用に固定し、染色した。神経培養中にアミロイドの生体染色を行うために、ＤＭＳＯに溶解したＢＴＡ−１（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度１００ｎＭで２０分間添加し、その後洗浄及びイメージングを行った。細胞カウントの統計的な比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を用いて行った。高解像度顕微鏡によるシナプスタンパク質のイメージングは、標準的な固定化及び染色技術を用いて行った。Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ ＯＭＸ システム （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を用いて視覚化した。

細胞外Ａβ４２の定量化は、ＤＳ及びＨ９皮質ニューロンを６５日間培養した物から得た１０μｌの細胞培養上澄み液をドットブロットすることによって行った。

ブロッティングする前に、上澄みは、濾過して、細胞の残骸を除去した（０．２２ μｍフィルター）。Ａβ４２は、Ａβ４２のＣ末端に特異的なポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて検出した。ドットブロットは、ＩｍａｇｅＪ （ＮＩＨ）を用いて定量化した。

Ａβペプチド検出及び定量化
分泌Ａβ４０及びＡβ４２の定量化は、ＤＳ、ｉＰＳコントロール及びＨ９ ｈＥＳ皮質ニューロンの培養物から得た５０μｌの細胞培養上澄みに対するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）法によって行った。水可溶性及び不溶性Ａβペプチドを定量化する目的で、皮質培養の全細胞抽出物から水可用性及びギ酸可溶性蛋白質フラクションを調製し、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で各ペプチドのレベルを測定した。γセクレターゼの阻害は、ＤＳ皮質培養中で、５０日の分化開始から、４８時間ごとにＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加することによって行った。

量的ＲＴ−ＰＣＲ
トータルＲＮＡは、ＥＳ及びＤＳ−ｉＰＳ培養の両方において、各時間ポイント（日数で５、１０、１５、２０及び２５）で、３例の培養物から単離した（Ｔｒｉｚｏｌ， Ｓｉｇｍａ）。トータルＲＮＡは、逆転写を行い、量的ＲＴ−ＰＣＲの為に使用した。該ＲＴ−ＰＣＴでは、Ｆｏｘｇ１及びＴｂｒ２に特異的なプライマーを用い、且つＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７０００ システムを用いた。

電気生理学
ホールセル電流クランプ記録を、人工的な脳脊髄液中、室温で行った。該液は以下の物を含有する（単位ｍＭ）：１２５ ＮａＣｌ， ２５ ＮａＨＣＯ₃， １．２５ ＮａＨ₂ＰＯ₄， ３ ＫＣｌ， ２ ＣａＣｌ₂， １ ＭｇＣｌ₂， ２５ グルコース，３ ピルビン酸。そして、９５％ Ｏ₂及び５％ ＣＯ₂でバブリングした。ホウ珪酸ガラス電極（抵抗６−１０ ＭΩ）内を、細胞内溶液を満たした。該液は、以下の物を含有する（単位ｍＭ）：１３５ Ｋ−グルコン酸、７ ＮａＣｌ、１０ ヘペス、２ Ｎａ₂ＡＴＰ、０．３ Ｎａ₂ＧＴＰ， ２ ＭｇＣｌ₂。赤外−ＤＩＣ光学を備えたＢＷ５０ＷＩ顕微鏡（オリンパス）を用いて細胞を観察した。記録は、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ａ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて行った。信号は、４ｋＨｚでフィルターをかけ、１６−ｂｉｔの解像度で且つ２０ｋＨｚでサンプリングを行い、Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）を用いて解析した。

ヒト皮質ニューロンのスライス培養
Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いて、胚マウスの脳（１６日目の胚）のＣｏｒｏｎａｌスライスを２５０μｍ厚さの切片として調製した。脳スライスを、Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート中の透過性膜インサート上で培養した。前膜の下には、Ｎ２Ｂ２７（３Ｎ）培地を添加した。早期ステージ（分化３５日）のヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンは、単一の細胞に分離した。そして、実質的には前述のように（２３）したマウス脳スライス上に、前記細胞をまいた。培養物は、１４日間維持し、その後、固定処理と、Ｔｂｒ１に対する抗体（マウス及びヒトの両方を認識する）、及びヒト特異的なＮＣＡＭ抗体を用いた免疫染色のための処理を行った。

結果
本発明者らは複数の異なるアプローチを探索した。そして、該アプローチにより、所定の培地及び公知のシグナリング経路を用いて、ｈＥＳ細胞を、最初に、単層培養内で、大脳皮質の神経幹細胞及び前駆細胞に分化誘導させることができた。

皮質幹細胞／前駆細胞については、転写因子Ｆｏｘｇ１、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ１／２及びＴｂｒ２がこれらの細胞で発現すること、そして、腹側終脳（ｖｅｎｔｒａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）又は更に尾側（ｍｏｒｅ ｃａｕｄａｌｌｙ）で通常発現する遺伝子（Ｎｋｘ２．１、Ｄｌｘ１及びＨｏｘＢ４）が発現しないことによって同定した。後述するが、ヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞から分化した神経幹細胞／前駆細胞が神経的な出力を行うことに基づいて、皮質に誘導されたことを最終的に示すものとする。

レチノイドは、マウス大脳皮質における神経幹細胞増殖から神経生成への遷移を制御し、マウスＥＳ細胞からグルタミン酸作動性ニューロンへの誘導を増大させる。レチノイドがないと、ｈＥＳ細胞からの神経誘導は、かなり効率が悪かった。

本発明者らが見出したところでは、レチノイド・シグナリングをＴＧＦβシグナリング阻害と組み合せることにより、ｈＥＳＣから大脳皮質幹細胞及び前駆細胞への分化を誘導する神経誘導を促進した。このアプローチを用いたところ、神経誘導開始１４日後では、培養中のほとんど全ての細胞（＞９５％）は、Ｐａｘ６を発現する神経幹細胞であった。

該アプローチにより誘導された神経幹細胞培養物は、Ｆｏｘｇ１のｍＲＮＡを非常に高いレベルで発現し、続いて、Ｔｂｒ２のｍＲＮＡを発現する（図１）。本発明者らは、ヒト胚幹細胞からの皮質分化がレチノイドに依存することが、他の多能性幹細胞株（ＥＳ及びｉＰＳの両方）に一般化できるかどうかを検証した。

本発明者らは、本明細書に記載の方法を用い、レチノイドの存在下及び非存在下で、２つのヒトＥＳＣ株及び４つのｉＰＳＣ株を神経幹細胞に分化させた。前記２つのｈＥＳＣ株は、２つの異なる施設で誘導された物であり（Ｈ９及びＥｄｉ２）、前記４つｉＰＳＣ株は、２つの異なるグループにより誘導された。Ｐａｘ６発現によって評価したところ、レチノイド非存在下では、二重のＳＭＡＤ阻害によるｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞からの皮質神経誘導は、不充分であった（図３）。Ｐａｘ６発現細胞のパッチを観察した。該細胞の量は、各培養中約２５％であった（図３）。しかし、大半の細胞は、Ｐａｘ６陰性であった。対照的に、レチノイド（レチノール酢酸及びａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノール）を含有させると、著しく効率的に全ての株が皮質神経幹細胞／前駆細胞へと分化する結果となった。ここで、殆ど全ての細胞でＰａｘ６（図３）及びＯｔｘ１／２を発現していた。このことは、由来や誘導方法に関係なく全てのｈＥＳ及びｈｉＰＳにあてはまった。

皮質幹細胞及び前駆細胞に特有な転写因子の組合せ（Ｐａｘ６， Ｆｏｘｇ１， Ｏｔｘ１／２ 及びＶｉｍｅｎｔｉｎ）の発現のほかに、本明細書で報告した皮質神経ロゼット（ｖｒｏｓｅｔｔｅ）細胞は、インビボで皮質神経上皮に特徴的な性質を示す。ヒトＥＳＣ由来の神経幹細胞は、神経誘導後、ロゼット構造を形成する（Ｒｏｖｅｌｅｔ−Ｌｅｃｒｕｘ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８， ２４−２６ （２００６）； Ｑｕｏｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ２３９−２４１ （１９９１））。皮質ロゼットは、明らかに頂底極性であり、ＣＤ１３３／ｐｒｏｍｉｎｉｎ、トランスフェリン受容体、及びａＰＫＣを、各細胞の頂極部（ａｐｉｃａｌ （ｌｕｍｉｎａｌ） ｅｘｔｒｅｍｅ）に局在化させた（図８ｊ）。更に、インビボで発生するが、各ロゼッタの頂／管腔表面に有糸分裂が数多く存在している。最後に、インビボで発生するが、これらは、セントロメア（ＡＳＰＭ及びＣＥＰ１３５蛋白質の局在化で視覚化）を各細胞の極頂端（ｅｘｔｒｅｍｅ ａｐｉｃａｌ ｅｎｄ）に局在化させ、典型的には各ロゼッタの管腔の中心まで伸長している（図８ｊ）。このことは、培養物内に、頂部（ａｐｉｃａｌ）及び底部（ｂａｓａｌ）の両方の皮質幹細胞及び前駆細胞が存在することと合致している。神経上皮ロゼットの管腔から移動した分裂細胞の大半は、Ｐａｘ６を発現する。

神経上皮であることを示す特性として、内部キネシン核移動（ＩＫＮＭ）の工程が挙げられる。該工程では、各幹細胞／前駆細胞の核の位置が細胞周期の間移動する：Ｇ１期の細胞の核は、頂部表面から出発して、基底表面の方向に向かって移動する。Ｓ期では、脳室／頂部表面から移動する。その後、Ｇ２期及び頂部表面での有糸分裂の間に核が、ある方向に移動する。頂部表面において、Ｍ期の核の大半が各ロゼッタの中心に局在化することにより、ＩＫＮＭがロゼッタ内で起こっていることが示された。これを確認すべく、本発明者らは、皮質ロゼット内での細胞の動きの微速度イメージングを用いて、核の動き及び有糸分裂を観察した。

ホスホ−ヒストンＨ３染色と合致して、大半の分裂は、頂部／管腔表面で起こった。そして、少数については、ロゼッタの末梢方向に向かって発生した。全ての頂部の分裂は、Ｇ２期まで進み、ここで、核は、脳室からはなれた領域から移動し、典型的には、幾つかの核径がロゼッタの管腔から移動した。該Ｇ２期においては、典型的には、頂部へ向かっての移動が、数時間にわたって起こった。ロゼットの分極を伴って、ＩＫＮＭが存在すること、並びに、頂部及び底部の両方の分裂が存在することは、皮質ロゼットが、円状の上皮ディスク（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｓｃｓ）を形成することにより、直線状のインビボ皮質神経上皮を模倣していることを示唆している。

インビボでの大脳皮質の発達において、皮質幹細胞の主な集団は、極性をもった、擬似的な層を形成した神経上皮を形成する。一方で、前駆細胞の二次集団は、内側及び外側脳室下帯（それぞれＳＶＺ及びｏＳＶＺと呼ぶ）内に見出される（Ｈａｎｓｅｎ， Ｄ．Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４６４， ５５４−５６１ （２０１０）； Ｆｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， ６９０−９ （２０１０））。本明細書で報告した方法で生じた神経幹細胞は、幹細胞及び前駆細胞について、以下のように、少なくとも２つ、可能であれば３つの集団を含む：ロゼッタ内の細胞の大半は、Ｐａｘ６＋／Ｏｔｘ＋／Ｋｉ６７＋であり、放射プロセスを伴って頂部基底部の極性をもった細胞であり、及びＩＫＮＭ及び頂部分裂を行う；第二の細胞集団は、脳室からはなれた領域及び基底部での分裂を行う；そして、第３の集団は、Ｔｂｒ２＋／Ｋｉ６７＋の集団である。Ｔｂｒ２陽性である増殖性細胞の小集団の存在（図８ｉ）は、外側脳室下帯（ＯＳＶＺ）前駆細胞と一致する。

約半分のＴｂｒ２発現細胞が、Ｋｉ６７を発現しており、且つ細胞周期が回っている前駆細胞（図４）であるが、その一方で、残り半分の細胞は、新たに誕生した細胞であり、インビボで発達中のヒト皮質において、上述した二重コルチン陽性ニューロンである（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ （２０１０） ｓｕｐｒａ）。Ｔｂｒ２／Ｋｉ６７＋の集団は、２５日目の各ロゼッタ中の細胞において平均１５％を占める（図５）。そして、幹細胞／前駆細胞集団からの神経出力に実質的に貢献している。

皮質神経生成は、培養培地からＦＧＦ２を除去することにより刺激されるが、ｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞からの神経誘導の後、２ヶ月間にわたって発生する（図６）。このことは、マウスでの６日の皮質神経生成期間（Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６， ６１８３−９６ （１９９６））と比べると、約７０日間の期間にわたるヒトにおける皮質神経生成と合致する（Ｃａｖｉｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。

ＰＳＣ由来の皮質幹細胞及び前駆細胞は、もっぱらグルタミン酸作動性投射ニューロンを発生させ、ＧＡＢＡ作動性の介在ニューロンについては検出可能なレベルで発生させない。神経生成の初期の波は、深層、即ち、Ｔｂｒ１を発現する層の投射ニューロンを含み、ロゼッタの皮質と同一であることを裏付ける。ロゼッタは、過程のなかで、比較的遅くアストロサイトを生成し始めた。アストロサイトは、約７０日で出現する。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、皮質誘導条件下では発生しないが、早期段階では、皮質ロゼットは、領域の同一性について柔軟性をもつ：ヘッジホッグ・シグナリング・アゴニストであるプラポモルヒネ（ｐｕｒａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）で処理すると、ロゼッタを腹側化させ、結果として、ＧＡＤ６７＋のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを発生させる。

ＰＳＣ由来皮質ニューロンの分化を更に評価するために、本発明者は、皮質スライス培養アッセイ（Ｐｏｌｌｅｕｘ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２， ＰＬ９ （２００２））を用いて、これらの移動能力、最終的な分化する能力、及びマウス大脳皮質内に適応する能力を分析した。分離したＰＳＣ由来ニューロンは、発達途中のマウスの脳（胚１４．５日）のＣｏｒｏｎａｌスライス上にまき、１４日間培養した。ヒトＰＳＣ由来皮質ニューロンは、マウス皮質内で数多く生存した。そして、神経突起を豊富に伸ばした。顕著な現象として、大半のヒトニューロンは、発達中のマウス皮質内で脳室表面に垂直に放射状に伸びていた。そして、サブセットは、辺縁帯にそって並んでいた。最後に、ヒトＰＳＣ由来ニューロンは、マウス皮質内で培養しているとき、該ニューロンの層のアイデンティティを維持していた。例えば、多くは、層６の転写因子Ｔｂｒ１を発現していた。

全てのほ乳類において皮質神経生成の鍵となる特徴は、皮質幹細胞及び前駆細胞の多能性であり、決まった時間順で異なる層の運命を有する興奮性グルタミン酸作動性ニューロンを生成させる能力である（Ｍｏｕｎｔｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。ｈＥＳ細胞からのヒト皮質形成は、インビボでの皮質の発達を再現する：各皮質層のヒト皮質投射ニューロンは、正確な時系列順で、且つ高い効率で、ｈＥＳ細胞から生成される。また、アストロサイトは、本発明の培養システム内で、後期段階で発生する。

成人の皮質のグルタミン酸作動性投射ニューロンは、ステレオタイプな時系列順で生成される。最初は深層ニューロンが生成され、最後に上層ニューロンが生成される。げっ歯類では、皮質グルタミン酸作動性ニューロンに関して、層の運命及び投射タイプの違いは、異なる転写因子の組合せで発現することによって規定することができる（図１１ａ）： Ｔｂｒ１＋／ＣＴＩＰ２−（低レベル又は存在しない）層 ６／皮質視床投射ニューロン；ＣＴＩＰ２＋／Ｔｂｒ１− 層 ５／皮質下投射ニューロン；Ｃｕｘ１＋／Ｂｒｎ２＋ 層 ２−４ ニューロン；及び、Ｓａｔｂ２＋層２−４脳梁投射ニューロン。

本発明者らは、ニューロン内でこれらの因子が発現することを利用して、７０日間の間隔にわたり、ＰＳＣから皮質投射ニューロンのサブタイプへの分化（ＦＧＦ２を除くことにより開始）の時間経過（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）を検証した。深層である層６ニューロン（Ｔｂｒ１＋）が最初に出現し、その後ＣＴＩＰ２発現層５及び６ニューロンが出現する。更に上の層では、Ｂｒｎ２／Ｃｕｘ１脳梁投射（層 ２−４）ニューロンが続いて分化する。２５−３０日の間に開始し、その後６５から８０日の間にＳａｔｂ２の発現が見られる（図１０−１２）。同一の時間順での投射ニューロン生成が、異なる４つのｈｉＰＳＣ株から観察された。上述した転写因子の組合せを用いて、培養７０日後の、異なる皮質投射ニューロンタイプの割合を定量した。重要な点であるが、おおよそ等しい数の深層及び表層ニューロンが本発明のシステムにおいて存在した（図１０−１２）。これは、マウスＥＳ細胞からの上層ニューロンの生成が減少したという以前の報告や、ヒトＥＳＣ由来の集合培養において上層ニューロンの製造が最小限となったという以前の報告とは対照的である。再度、ｈＥＳＣと、異なる４つのｈｉＰＳとから生成した異なる投射ニューロンのサブタイプの割合が著しく類似していた（図１０−１２）。インビボで起こるのと同様に、アストロサイトは、本発明の培養システムにおいて、後期段階で（全ての皮質層のニューロンの後で）発生した。

従って、本明細書に記載のｈＥＳ細胞由来のヒト皮質形成では、インビボでの皮質形成を再現する：各皮質層のヒト皮質投射ニューロンは、正確な時系列順で、且つ高い効率で、極性をもった神経上皮細胞から生成される。

神経生成を促進する条件で培養した場合、ｈＥＳ由来の皮質幹細胞及び前駆細胞は、グルタミン酸作動性投射ニューロンを専ら生成し、介在ニューロンについては検出可能なレベルでは生成しない（図１３）。機能性のシナプスは、微小興奮性後シナプス電位（ｍＥＰＳＰ）の存在、及びシナプトフィシンの免疫蛍光が集中することによって示されるが、培養して約９０日後、機能性のシナプスがｈＥＳ由来皮質ニューロン培養中で検出可能となった（図１４）。従って、インビトロで、数週間にわたって、これらのニューロンが自発的に活動電位を発火させ、成熟した発火特性を発達させる。

本発明者らは、ＰＳＣ由来皮質投射ニューロンが機能的なニューロンとして分化することを確認した（図１５Ａ，Ｂ）。個々の細胞（トータルでｎ＝５４例のニューロン）からのホールセルパッチクランプ記録によれば、電位依存性ナトリウム電流（テトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブロックされた）の存在と、電位依存性カリウム電流（一時的な成分が４−アミノピリジン（４−ＡＰ）によってブロックされた）の存在を示した。従って、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方に由来するＰＳＣ由来皮質ニューロンは、最終的には、適宜興奮性の細胞に分化する。

皮質投射ニューロンは、新生児のげっ歯類の皮質内で数日から数週間にわたって最終的には分化をし、成熟した発火特性を発達させる。同様のプロセスが、げっ歯類皮質ニューロンの初代培養でも起こる。ｈＥＳＣ由来及びｈｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンは、インビトロで、時間と共に増加する電流注入に応答して、活動電位のバーストを発火させる能力を成熟させる（図１５Ｃ）：若い方（２８日）のニューロンでは典型的には単発の活動電位を発火させた、一方で、古い（４９日）のニューロンでは、電流注入の後、最大５回の活動電位を発火させた。６５日までに、多くのニューロン（ｎ＝３２）において、電流注入のステップで刺激されたときに一連の活動電位の発火が活発になった。こうした成熟プロセスは、ｈＥＳ及びｈｉＰＳの両方に由来する皮質ニューロンにおいて観察された（図１５Ｄ，Ｅ）。そして、こうしたプロセスは、インビボで発生する成熟プロセスと同様であった。

シナプス発生は、神経ネットワーク形成において、重要なステップである。ＰＳＣ由来皮質投射ニューロン間での物理的なシナプス形成は、超解像（構造化照明）顕微鏡を用いて、前シナプス及び後シナプスの蛋白質局在化を視覚化して、検出した。シナプスについては、直径が１００ｎｍであり、樹状突起（ＭＡＰ２染色で検出）に見出され、前シナプス及び後シナプスの区画特有の蛋白質が並んでいる領域として定義した。シナプスを同定するために、２つの異なるペアの前シナプス及び後シナプスの蛋白質を使用した：ＰＳＤ９５（興奮性グルタミン作動性の後シナプス後肥厚において豊富）とシナプトフィシン（主要なシナプス小胞蛋白質）；及び、Ｈｏｍｅｒ１（広範に発現するシナプス後肥厚の蛋白質）と、シナプス前部蛋白質Ｍｕｎｃ１３−１。ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方で発生したニューロンの樹状突起の表面上では、１００ｎｍサイズの範囲でＰＳＤ９５が豊富に集まっていた。また、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方に由来する皮質ニューロンを培養した際に、２８日目で、並んでいるが重ならないで、約１００ｎｍで、シナプス前部（シナプトフィシン、Ｍｕｎｃ１３−１）及び後シナプス（ＰＳＤ９５， Ｈｏｍｅｒ１）蛋白質が豊富に集まっていた。最後に、観察された物理的なシナプスが機能するかどうかを試験するために、本発明者らは、ホールセルパッチクランプ記録を使用して、４５から１００日の間の培養で、微小興奮性シナプス後電位（ｍＥＰＳＰ）を検出した（トータルで、ｎ＝４８例のニューロン）。全てのｈＥＳＣ株及びｈｉＰＳＣ株から生成した培養物において、ｍＥＰＳＣを５−１０ｐＡの振幅で頻繁に検出した（図１６）。前記ｍＥＰＳＣは、ＡＭＰＡレセプターブロッカーＣＮＱＸによってブロックされた（図１６）。そして、ＡＭＰＡレセプター介在シナプス電流に特徴的なキネティクスを示した（急速な開始及び、遅くゆったりとした減衰）（図１７）。ヒトＰＳＣ由来皮質ニューロンは、培養中で、機能的なグルタミン酸作動性シナプスのネットワークを形成すると本発明者らは結論づけた。

患者特有の皮質ニューロンを生成するため、及び神経病（例えば、アルツハイマー病）のモデリングのための本発明の方法の可能性について検証するため、本発明者らはこのアプローチを用いて、病気特有のヒトの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を皮質ニューロンへと分化させた。ダウン症候群／トリソミー２１は、最もありふれた精神遅滞の遺伝的原因であり、約１／７００−８００出生で発生する（Ｗｉｓｅｍａｎ， Ｆ．Ｋ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８， Ｒ７５−８３ （２００９））。ダウン症候群である個体は、アルツハイマー病の発症率が非常に高く、該病気は、２１番目の染色体上にあるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）遺伝子の存在が原因となっている（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， １８２９５−１８２９８ （１９９６））。ヒトにおいてＡＰＰ遺伝子が二重に複製されると、結果として常染色体優性の早期発生の認知症となる。ＡＰＰ遺伝子量が増加したマウスでは、アミロイド・プラーク及びアルツハイマー型認知症に関する神経病理学的な特徴を発達させる。本発明者らは、ヒトの健康なコントロールｉＰＳ細胞と、ヒトのダウン症候群のｉＰＳ細胞（ＤＳ１−ｉＰＳ４２２）とを皮質ニューロンに分化させるべく、本明細書に記載のプロセスを適用した（図１８〜２１）。コントロールのｈｉＰＳ及びダウン症候群のｈｉＰＳ（ここでは、ＤＳ−ｉＰＳとよぶ）の細胞は、皮質幹細胞及び前駆細胞を高い効率で発生させ、再び、極性のある神経上皮ロゼットを発達させた（図１８）。各層の皮質ニューロンは、正確な時系列順で分化し、そして、ｈＥＳから分化するのと同一の時間スケールでＤＳ−ｉＰＳ細胞から分化した（図１９及び２０）。ｈＥＳ由来皮質ニューロンに関しては、これらのニューロンはグルタミン酸作動性であり、電気的活性がある（図２１）。

アルツハイマー病がインビボで進行する際に鍵となるステップは、大脳皮質のグルタミン作動性ニューロンによって、短い３８−４２アミノ酸であるＡβペプチドが、ＡＰＰから、生成される量が増えることである（Ｍｏｕｎｔｃａｓｔｌｅ １９９８ ｓｕｐｒａ）。このプロセスは、ダウン症候群の人々において１０代及び２０代で発生する可能性がある（Ｒｏｖｅｌｅｔ−Ｌｅｃｒｕｘ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８， ２４−２６ （２００６）。

本発明者らは、コントロール及びＤＳｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンによるＡβ４０及びＡβ４２ペプチドの分泌をモニターした（図２２）。通常、ニューロンでは、Ａβ４２よりもＡβ４０の生成が著しい。しかし、Ａβ４２は、アルツハイマー病における主要な病理的Ａβペプチドと考えられている。Ａβ４２が自己凝集をして、Ａβ４０も含むことができる可溶性及び不溶性オリゴマー、並びに不溶性線維及びプラークを形成する。Ａβ４０ペプチドの分泌は、コントロール及びＤＳ皮質ニューロンの両方で、神経分化を開始して数日以内に、低レベルで最初に検出可能となる（図２２）。しかし、ＤＳ皮質ニューロンは、その後１０日間にわたって、Ａβ４０の生成を高レベルにまで指数関数的に増加させる。一方で、コントロールのニューロンでのＡβ４０の生成は、一貫して低いまま維持される（図２２）。コントロール又はＤＳ皮質ニューロンによる病理的Ａβ４２ペプチドの分泌は、神経分化のこうした早期段階では検出されなかった。

一定時間にわたって、ＤＳ皮質ニューロンによるＡβ４０の生成が上昇したと仮定して、本発明者らは、チオフラビンＴアナログであるＢＴＡ１²⁴で、細胞内及び細胞外のアミロイドの凝集物を生体染色することにより、ＤＳ−ｉＰＳ由来の皮質ニューロンの培養中でのアミロイド・プラークの発達について、アッセイを行った（図２３）。皮質分化開始後３ヶ月にわたり、ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロンは、細胞内及び細胞外の両方で、ＢＴＡ１ラベルしたアミロイドの凝集物を生成する。一方で、同一の期間にわたるｈＥＳ由来皮質ニューロンの培養では、ＢＴＡ１陽性のニューロン又は細胞外凝集物は、ほとんど観察されなかった。

Ａβ４２ペプチドは、可溶性及び不溶性オリゴマーを形成し、アルツハイマー病の早期段階でシナプス機能を阻害する。Ａβ４２ペプチドは、ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロンによって非常に高レベルで生成され、細胞培養培地（図２４）中に蓄積される。

本発明者らは、活性化されたカスパーゼ−３染色でアッセイしたところ、検出可能な細胞内アミロイド凝集物を有する多くのＤＳ−ｉＰＳニューロンが、プログラムされた細胞死を起こすことを見出した（図２５）。

免疫蛍光及び共焦点顕微鏡が示すところによれば、ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロンの内側及び外側の両方で、数多くのＡβ４２を含有する凝集物が存在した。そして、細胞外Ａβ４２陽性の凝集物は、神経突起周辺に存在することが多く（図２６及び２７）、ＤＳ皮質ニューロンからのＡβ４２の生成量が経時的に増加することが示された。一方で、ｈＥＳ由来の皮質ニューロンの培養では、Ａβ４２の生成レベルがかなり低く（約１０分の１）、Ａβ４２含有凝集物が見出される頻度はかなり低かった（図２８）。アルツハイマー病において、Ａβ４２の生成量増加とプラークの形成は、大脳皮質における神経細胞死と関係がある。

分泌された可溶性の細胞内フラクションと、不溶性蛋白質フラクションとを、ＤＳ皮質ニューロン及びコントロールｈＥＳ皮質ニューロンの古い方の培養（７０日）から抽出し分析したところ、より古い方のＤＳニューロンは、４８時間の期間で、Ａβ４０及びＡβ４２の両方を、著しい量で分泌することが確認された。その一方で、ｈＥＳ皮質ニューロンは、Ａβ４０については少量生成し、Ａβ４２については検出可能なレベルの生成はなかった（図２９）。とりわけ、ＤＳ皮質ニューロンの培養において、Ａβ４２に対するＡβ４０の割合は、４．６：１であった。ＤＳ皮質ニューロンは、単純により多くのＡβペプチドを生成しているのではなく、生成されるＡβ４０及びＡβ４２の相対量も変化させていることを反映しており、これらのことは、インビボの散発性アルツハイマー病でも起こる。高レベルのＡβペプチド分泌は、ＤＳニューロン特異的であった。そして、ＤＳ線維芽細胞によるＡβペプチドの生成量は、殆ど検出不可能であった（図２９）。インビボでは、Ａβ４２ペプチドは、可溶性及び不溶性オリゴマーを形成し、アルツハイマー病の早期段階でのシナプス機能を阻害する（Ｐａｌｏｐ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３ ８１２−８１８ （２０１０））。分泌された可溶性Ａβ４０及びＡβ４２ペプチドがＥＬＩＳＡで検出されたほか、可溶性Ａβオリゴマーも、ＤＳ皮質ニューロンの細胞培養培地で存在した。

分泌された可溶性Ａβペプチドとは対照的に、可溶性細胞内Ａβペプチドレベルは、ＤＳ及びコントロールｈＥＳ由来皮質ニューロンの両方で、検出レベルを下回った（図３０）。しかし、不溶性Ａβ４０及びＡβ４２は、両方ともＤＳ皮質ニューロンの培養物の中で見出され、健全な皮質ニューロン培養物の中では見出されなかった（図３０）。ＤＳ培養物中における不溶性Ａβの大半は、Ａβ４２であって、Ａβ４０は、４分の１であった（図30）。これは、分泌されたＡβで見られた割合と逆であった。最後に、本発明者らは、ＤＳ−ｉＰＳ皮質ニューロンによるＡβ４０及びＡβ４２ペプチドの生成及び分泌がγセクレターゼ複合体の阻害によって減少させることができるかどうかを検証した。γセクレターゼは２つの非常に重要なプロテアーゼ複合体のうちの１つであり、ＡＰＰを切断して、Ａβペプチドを生成する。短期間（４日）、γセクレターゼを阻害したところ、Ａβ４０及びＡβ４２の生成がほぼ半分にまで減少した。一方で、長期間処理（２１日）したところ、両方のＡβペプチドの分泌は、検出可能なレベルを下回るまでに減少した（図２９）。しかし、ＤＳ皮質ニューロン培養中において、γセクレターゼを阻害しても、不溶性Ａβ４２の量を有意に減少させなかった（図３０）。これは、皮質ニューロン培養において、アミロイドを除去するためのクリアランス機構が欠如したことが原因である可能性が高い。

結論として、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞を大脳皮質ニューロンに分化させることができる方法を開発し、該方法はインビボでの発達を再現するものである。本発明の方法は、複数の特有のステップから成る：ヒトＰＳＣを分化誘導し皮質幹細胞及び前駆細胞の複合集団を形成するステップ；期間を延長して、皮質神経生成させるステップ；後期でアストロサイトを生成するステップ；神経末端を分化させて成熟した電気生理学的な特性を獲得するステップ；シナプスを生成しネットワークを形成するステップ。マウスＥＳＣの分化誘導についての以前の報告とは対照的に、本発明のシステムでは、皮質投射の多様性を再現しており、培養中数ヶ月の期間にわたって生成される、深層（早期に誕生）及び上層（後期に誕生）のニューロンの割合がほぼ等しくなっている。

本発明の方法において、重要なステップは、ヒトＰＳＣを皮質神経幹細胞／前駆細胞ロゼッタへ高効率で分化させること、及び本発明のシステムにおいて、頂部の前駆細胞と基底部の前駆細胞の両方を生成させることである。本発明者らは、ソニック・ヘッジホッグを阻害しても、皮質誘導を促進せず、本明細書で用いた神経誘導の条件の下で、ヒトＰＳＣから効率よく皮質誘導を行うためには、レチノイドが必要であることを見出した。こうした発見は、マウス大脳皮質において、神経幹細胞の増殖から神経生成に遷移するのをレチノイドが制御していること、マウスＥＳ細胞からのグルタミン酸作動性のニューロンの誘導がレチノイドに依存することと合致している。

初期のマウス皮質幹細胞／前駆細胞は、インビボと比べると上層／後発ニューロンの生成量がずっと少ないものの、インビトロで、クローン密度（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）成長させると、投射ニューロンを生成する。ＦＧＦ２はロゼッタ細胞を増殖させるために使用することができるが、この有糸分裂促進性であるＦＧＦ２を除去すると、本発明のシステムにおいて神経生成の開始を促す。各層の投射ニューロンの生成の時間的な順序は、本発明のシステムでは保存されている：深層、層６ニューロンが最初に出現し、一方で、層２／３では、最後にニューロンが生成される。その後、アストロサイトが出現する。マウスでは６日の間隔にわたって皮質神経生成が起こるが、これとは対照的に、ヒトの皮質神経生成は、インビボで約１００日間皮質神経生成が続く。本発明者らは、本発明のシステムにおける、投射ニューロンの生成期間は、ヒトの胚で見られる期間と近似していることを見出した：深層、層６ニューロンは、神経生成の開始から数日以内に生成され、一方で、上層の、Ｓａｔｂ２を発現する皮質下行性ニューロンは、約６０日より後になって初めて出現し始める。

ＰＳＣの分化誘導による全てのクラスの皮質投射ニューロンを生成する能力は、皮質ロゼット内に、頂部及び基底部両方の前駆細胞種が存在することが原因となっている可能性が高い。本発明者らは、皮質誘導後に、少なくとも２つの、そして、可能であれば３つの固有の集団を観察した。ロゼッタ内の細胞の大半は、Ｐａｘ６＋／Ｏｔｘ＋／Ｋｉ６７＋であり、放射プロセスを持ち、頂部−基底部の極性を持った細胞であり、ＩＫＮＭ及び頂部の有糸分裂を行う；幹細胞／前駆細胞の第二の集団は、基底部での有糸分裂を行う；そして、Ｔｂｒ２＋／Ｋｉ６７＋集団である。これらの集団は、発達中のヒト皮質において、３つの集団の幹細胞／前駆細胞に近似している：ＶＺ神経上皮細胞、ＳＶＺ細胞、及びｏＳＶＺ細胞。本発明のシステムで生成された幹細胞／前駆細胞の集団は、インビボでのヒト皮質で見出される投射ニューロン種の多様性を確実に生み出す能力があり、本発明のシステムによってヒト皮質前駆細胞種の複雑さをとらえられることを示唆している。

皮質誘導から興奮性シナプス及びネットワーク形成への皮質発達をモデル化する能力があれば、ヒト皮質の発達について将来的に機能的研究を行うことを可能にするであろう。そして、特有の皮質細胞種（例えば、皮質脊髄運動ニューロン）を生成するために利用することができる。該アプローチは、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣからの効率面で等しいため、病気のモデリング、そして、潜在的には治療を目的として患者特有の皮質ニューロンを生成することができる。

本発明者らは、ダウン症候群のｉＰＳ細胞由来の皮質ニューロンにおいて、早期に開始されるアルツハイマー病の進行を検証することにより、大脳皮質の病気及び成人発症性の神経病のモデリングのための本発明のシステムの潜在的な可能性を示した。インビボでは、典型的には数十年の期間起こるのと比べると、本発明のシステムでは、数ヶ月の期間にわたって、Ａβ４２の生成とアミロイド・プラークの形成が起こる。本明細書に記載の早期に開始するアルツハイマー病の病理をモデル化するためにＤＳ−ｉＰＳ由来のニューロンを使用すると、皮質シナプス機能及び神経変性においての、ＡＰＰ及び該ＡＰＰのペプチド産物の通常の機能及び病理学上の機能を分析するための、潜在的に強力なインビトロシステムが提供される。

Claims (26)

1. ヒト多能性細胞の皮質形成をインビトロで誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法：
   （ｉ）単離されたヒト多能性幹細胞の集団を提供するステップ；及び
   （ｉｉ）前記集団が皮質幹細胞及び前駆細胞に分化するように、レチノイド・シグナリングを刺激し、且つＴＧＦβスーパーファミリー・シグナリングを阻害する培養条件下で、前記集団を培養するステップ。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記培養条件が、ＴＧＦβ及びＢＭＰシグナリングを阻害する該方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法であって、前記集団が神経誘導培地中で培養され、該培地は、レチノイドを含み、且つ、１種以上のＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリング阻害剤を含む該方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記レチノイドが、レチノイン酸、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノール、又は酢酸レチノールである該方法。
5. 請求項３又は４に記載の方法であって、前記１種以上のＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナリング阻害剤が、以下から選択される該方法：４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記神経誘導培地が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド及びＮｏｇｇｉｎを含む該方法。
7. 請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記神経誘導培地がインシュリンを含む該方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記ヒト多能性幹細胞の集団が、少なくとも１５日間培養される該方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも９５％の前記集団が、皮質幹細胞及び前駆細胞に分化する該方法。
10. 前記請求項いずれか１項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団を増殖させるステップを含む該方法。
11. 前記請求項いずれか１項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団を保存するステップを含む該方法。
12. 前記請求項いずれか１項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団が、大脳皮質ニューロンに分化することを可能にするステップを含む該方法。
13. 前記請求項いずれか１項に記載の方法であって、前記ヒト多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である該方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が、損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する個体から得られた健全な細胞のサンプルに由来する該方法。
15. 請求項１３に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が、病気に関連した表現型又は遺伝子型を有する細胞のサンプルに由来する該方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が、ダウン症候群細胞のサンプルに由来するダウン症候群ｉＰＳ細胞（ＤＳ−ｉＰＳ）である該方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、前記ＤＳ−ｉＰＳ細胞から産生された前記大脳皮質ニューロンにおいて、１以上のアルツハイマー病の病理、又は年齢に関連した病理を、検出又は測定するステップを含む該方法。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって産生された、単離された皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞、又は単離された大脳皮質ニューロンの集団。
19. ヒト又は動物の身体の治療方法において使用するための、請求項１８に記載の集団。
20. 損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者を治療する方法において使用するための請求項１８に記載の集団。
21. 損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者を治療する方法であって、請求項１８に記載の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップを含む該方法。
22. 損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者の治療において使用するための薬品の製造における請求項１８に記載の集団の使用。
23. 請求項１８に記載の集団であって、前記細胞が、ＤＳ−ｉＰＳ細胞から産生され、１種以上のアルツハイマー病又は年齢に関連した病理を示す該集団。
24. 神経変性病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む方法：
    請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって製造された単離大脳皮質ニューロンを、試験化合物に接触させるステップ；及び
    前記ニューロンに対する試験化合物の効果を検出するステップ。
25. 請求項２４に記載の方法であって、前記大脳皮質ニューロンがＤＳ−ｉＰＳ細胞から製造され、１種以上の年齢に関連した、又はアルツハイマー病の病理に対する前記試験化合物の効果を検出する該方法。
26. 請求項２５に記載の方法であって、前記試験化合物による以下のものに対する効果を決定する該方法：Ａβ４２の発現レベル、ＡＢ４０に対するＡＢ４２の割合；ニューロン内のＡＢ４２レベル；前記細胞外培地におけるＡｂ４２のレベル；ＡＢ４２オリゴマー形成；高リン酸化されたＴａｕのレベル；細胞内カルシウムレベル；細胞内及び細胞外のアミロイド・プラークの形成；、及び単離された大脳皮質ニューロンの前記集団におけるプログラム化された細胞死の割合。