KR20240062800A - 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법 - Google Patents

뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240062800A
KR20240062800A KR1020220144720A KR20220144720A KR20240062800A KR 20240062800 A KR20240062800 A KR 20240062800A KR 1020220144720 A KR1020220144720 A KR 1020220144720A KR 20220144720 A KR20220144720 A KR 20220144720A KR 20240062800 A KR20240062800 A KR 20240062800A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
brain
tmao
disease
analog
midbrain
Prior art date
Application number
KR1020220144720A
Other languages
English (en)
Inventor
이미옥
이영선
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020220144720A priority Critical patent/KR20240062800A/ko
Publication of KR20240062800A publication Critical patent/KR20240062800A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

일 양상은 줄기세포로부터 배양된 뇌 유사체 및 뇌 유사체에 TMAO(trimethylamine N-oxide)를 처리하여 뇌 질환 모델을 제조하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 뇌 질환 모델은 노화와 관련된 변화와 신경 퇴행성 질환 사이의 관계를 연구하는 데 사용할 수 있는 효과가 있으며, 노화 및 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료하는 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법 {Aging and neurodegenerative Disease Model using brain organoid and method for screening aging and neurodegenerative diseases drug using thereof}
뇌 유사체(organoid)를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
노화란 나이가 들어감에 따라 생리적, 행동적, 심리적 변화를 동반한 신체의 퇴행성 변화와 함께 질병 발병에 기여하는 과정으로, 세포나 조직에서 생긴 손상이 축적되어 세포의 기능이 감소 또는 오작동되어 나타나는 현상을 의미한다. 중추신경계에서 발생하는 노화는 신경 변성과 관련이 있는데, 뇌와 같은 조직은 체세포분열이 끝난 세포(postmitotic cell)로 구성되어 있어 세포 내 손상에 더욱 민감하게 반응한다. 노화로 인해 중추신경계에서 발생하는 질환 중 하나인 신경 퇴행성 질환은 뇌 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 고유기능의 소실로 인해 여러가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 신경 퇴행성 질환으로 알츠하이머병, 파킨슨병, 루이소체 치매, 전두측두변성, 근위축성 측삭경화증, 무도병, 척수소뇌실조증 등이 있다.
파킨슨병은 신경 퇴행성 질환 중 가장 발병률이 높은 질환으로 중뇌 흑질의 도파민 세포가 사멸해 도파민 분비 부족으로 인해 발병하는 질환이다. 파킨슨병의 원인은 정확하지 않지만 노화가 진행되는 동안 발생한 산화스트레스 등으로 인한 단백질 응집으로 신경세포가 사멸되어 발생하는 것으로 추정된다. 노화와 파킨슨 병 사이의 연관성을 확인하고 발병 원인을 규명하기 위해 많은 동물 모델이 연구되고 있지만, 인간과 생리학적, 해부학적 특성이 다르다는 문제가 있다. 따라서 최근에는 보다 밀접한 연관성을 가진 유도만능줄기세포 기술이 각광받고 있다.
오가노이드(유사체, organoid)는 인간 장기의 복잡한 구조와 기능성을 근접하게 모방하기 위해 설계된 삼차원(3D) 다세포, 줄기세포 유래 미세조직이다. 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)에서 유래된 뇌 오가노이드는 인간 뇌 세포 유형 및 조직구조를 모방하여 인간의 뇌 발달 및 질병을 연구하기 위해 사용되고 있다. 하지만 DNA 손상, 미토콘드리아 ROS, 후성유전적 변화와 같은 노화관련 특징이 나타나지 않아, 후기에 발병하는 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데에 있어서 제한적이다.
이에, 본 발명에서는 뇌 유사체를 제조한 뒤 장내 미생물 대사산물인 TMAO를 처리하여 노화 및 신경 퇴행성 질환 모델을 제조하였으며, 이를 이용하여 노화 및 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제안하였다.
일 양상은 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하는 단계 및 상기 뇌 유사체에 TMAO를 처리하는 단계를 포함하는, 뇌 질환 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하고, 상기 뇌 유사체에 TMAO를 처리하여 제조된 뇌 질환 모델을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하고, 상기 뇌 유사체에 TMAO를 처리하여 제조된 뇌 질환 모델에 노화 및 신경 퇴행성 질환 치료제를 처리하여 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하는 단계 및 상기 뇌 유사체에 TMAO(trimethylamine N-oxide)를 처리하는 단계를 포함하는, 뇌 질환 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “줄기세포”는 미분화된 세포로써 특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 말한다. 여러 종류의 다른 세포를 생산할 수 있는 다중 분화능을 가지고 있어 우리 몸의 손상받은 부위의 세포들을 새로 재생할 수 있는 능력이 있다. 줄기세포는 자신과 동일한 세포를 만들어 낼 수 있는 자가 생산 능력, 특정 환경에서 특정 기능을 가지는 세포로 분화하는 분화능 및 면역세포와 반응하여 면역반응을 조절하는 면역조절능을 가진다. 줄기세포는 인체를 구성하는 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 특정 종류의 세포로 분화하는 조직 -특이적 줄기세포(tissue-specific stem cell)로 크게 나눌 수 있다.
상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 유래한 것일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cell)"는 발생중인 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 분리해 실험적으로 얻은 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 전인 포배기 배아 상태에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것이다. 배아줄기세포는 개체의 모든 조직으로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent) 또는 전능성(totipotent)을 특징으로 가지는 세포를 의미하며, 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 상기 줄기세포는 인간 배아줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)” 또는 “iPSC”는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능 분화성을 갖게 된 세포, 배아줄기세포처럼 모든 세포로 분화할 수 있고 분열 능력에 한계가 없는 세포를 의미한다. 상기 처리하는 방법은 화합물, 유전적 변환 또는 특정 조건으로 배양하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 유래의 유도만능줄기세포는 인간의 체세포 또는 인간의 분화된 세포를 처리하여 만능 분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 상기 체세포 또는 분화된 세포는 섬유아세포 유래할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 다양한 기원에서 유래할 수 있다. 바람직하게, 상기 줄기세포는 인간 유래 유도만능줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “분화(differentiation)”는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 구조나 기능이 특수화되어 본 세포와 다른 특징을 갖는 세포로 바뀌는 것을 의미한다. 본 명세서에서 분화는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라, 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체(embryonic body)의 형성도 포함하는 것일 수 있다. 배아줄기세포의 경우 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고, 그 뒤 특정 조직(예컨대, 중뇌 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 중뇌세포 등)로 분화될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “유사체” 또는 “오가노이드(organoi)”는 줄기세포를 3차원적으로 배양하거나 재조합하여 최소 기능을 할 수 있도록 만든 장기 유사체로, '미니 장기', '유사 장기'라고도 한다. 기존 2차원 배양접시에 세포를 배양하던 것과 다리, 3차원 세포 구조체를 하이드로겔 안에서 배양하는 것이 특징이며, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있다.
상기 뇌 유사체는 중뇌 유사체일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “중뇌 유사체”는 뇌의 일부분인 '중뇌'를 소규모로 만든 장기 유사체로써, 신경세포들이 연결돼 네트워크를 구성하고 있고, 서로 신호를 전달하며 신경전달물질을 만들어내는 등 사람 뇌에서 일어나는 작용을 그대로 가지는 것이 특징이다.
상기 뇌 유사체는 SOX2, FOXA2, TH, MAP2 및 GFAP로 이루진 군에서 선택된 1개 이상의 분화 마커를 발현할 수 있다.
상기 TMAO(trimethylamine N-oxide)는 심혈관질환 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 장내 미생물 대사산물이다. TMAO는 소고기, 돼지고기와 같은 붉은 육류 및 패스트 푸드와 같은 식품에 함유된 콜린, 베타딘, 엘-카르니틴 등이 trimethylamine(TMA)으로 분해된 후 간에서 산화되는 과정을 통해 최종 생성된다. 최근 연구에서 TMAO에 의해 유발되는 질환들에 대한 연구가 진행되고 있으며, 비만 및 당뇨병 등과 관련이 있다고 확인되었다. 또한, 노화됨에 따라 혈액과 뇌척수액에서 TMAO가 증가하며, TMAO를 처리할 경우 SAMP8, 3X Tg-AD 마우스 및 HUVEC 세포에서 노화 표현형, 신경 변성 및 인지 장애의 증가가 확인되었다.
상기 TMAO는 10uM 내지 10mM로 처리되는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 TMAO는 100uM 내지 1mM로 처리되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “신경 퇴행성 질환” 또는 “신경 퇴행성 질병”은 뇌의 퇴행성 변화와 관련된 모든 질환, 특히, 뇌 및/또는 뇌신경세포에서의 아밀로이드-베타의 응집 등의 요인에 의하여 유발될 수 있는 모든 질환 (뇌질환)을 포괄적으로 기재하기 위하여 사용된다. 일 구체예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전임상 알츠하이머병(preclinical alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병(Niemann-Pick disease), 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's ataxia), 마차도-조셉병(Machado-Joseph's disease), 루이 소체 치매(Lewy body dementia), 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파킨슨병"이란 종종 운동 기능 및 언어능력을 손상시키는 중추 신경계의 만성 및 진행성 퇴행성 질환을 의미할 수 있다. 파킨슨병은 중뇌 흑질의 도파민 세포가 사멸해 도파민 분비 부족으로 인해 발병하는 질환이다. 파킨슨병의 원인은 정확하지 않지만 노화가 진행되는 동안 발생한 산화스트레스 등으로 인해 α-Synuclein과 같은 단백질 응집으로 신경세포가 사멸되어 발생하는 것으로 추정된다.
본 명세서에서 용어 "알츠하이머병"이란 노인성 치매와 호환적으로 사용되고, 노인성 플라크, 신경염증 엉킴(tangles), 및진행성 신경 손실로 특징되는 특정 퇴행성 뇌질환과 관련된 정신적인 퇴화를 수반하는 질병을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "헌팅턴병"이란 헌팅턴 단백질을 암호화하는 유전자 내 3 염기 반복 팽창에 의해 야기되어, 무도증, 정신이상, 치매 등이 수반되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "루게릭병"이란 운동신경세포만 선택적으로 사멸되는 질환으로 대뇌 피질의 상위운동신경세포와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 모두가 점차적으로 파괴되는 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "픽병(pick's disease)"는 뇌의 신경세포의 진행성 파괴를 나타내는 질환을 의미할 수있다.
본 발명의 용어 "타우병증"이란 타우 단백질(세포 내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)이 뇌조직에 비정상적으로 축적됨에 의하여 뇌신경이 손상되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 파킨슨병의 연관성 확인을 위한 마커인 α-Synuclein 및 p-Tau과 같은 단백질의 비정상적 응집이 나타나는 것일 수 있다.
상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 IL6, TNFA 및 IFNG로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 염증 마커의 증가가 나타나는 것일 수 있다.
상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 ER 스트레스 관련 유전자의 증가 또는 감소가 나타날 수 있다. XBP1 또는 GRP78의 발현이 증가하는 것일 수 있다. 또는 pCREB의 발현이 감소하는 것일 수 있다.
상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 노화 관련 마커의 증가 또는 감소가 나타날 수 있다. P21(CDKN1A), P16(CDKN2A), TP53로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가하는 것일 수 있다. 또는 lamin A/C 및 Tri-Me-K9로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 감소하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 상기 줄기세포 및 중뇌 유사체의 배양에 사용되는 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 또는 mTESR(Stabilized feeder-free maintenance medium for human ES and iPS cells), E8(TESR-E8 medium for hESC/hiPSC maintenance), AlphaSTEM™ Naive hPSC Medium(Biocompare), PLUSTEM(HumanES/iPSC medium, Life science resaerch)을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 양상은 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하고, 상기 뇌 유사체에 TMAO를 처리하여 얻어지는 뇌 질환 모델을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 전술된 방법으로 제조된 뇌 질환 모델에 노화 및 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 처리하여 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 노화 및 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질은 TMAO가 처리된 뇌 유사체에 대하여 억제 활성을 가지는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, 새로운 뇌 질환을 연구할 수 있는 방법으로써 노화된 장내 환경과 뇌 사이의 기전을 연구할 수 있고, 노화에 의해 증가되는 TMAO와 신경 퇴행성 질환의 관계를 연구하는 데 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
또한 일 양상에 따른 방법에 의하면, 노화 및 신경 퇴행성 질환을 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하여 치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 중뇌 유사체의 제조 방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 hESC 및 성숙 2일차, 9일차, 4주차 중뇌 유사체의 대표적인 위상차 (phase-contrast)이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 중뇌 유사체에 TMAO를 처리하는 단계를 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 4는 성숙 2주차(2WM), 4주차(4WM)의 중뇌 유사체에서 분화 마커인 SOX2, FOXA2, TH, MAP2, GFAP를 면역형광염색으로 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 성숙 4주차(4WM)의 중뇌 유사체에서 면역형광염색으로 확인한 MAP2 및 GFAP를 고해상도로 나타낸 이미지이다.
도 6은 중뇌 유사체에서 발현되는 SOX2, FOXA2, TH, MAP2, GFAP의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7은 중뇌 유사체를 배양하는 배지로 분비된 도파민의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 성숙 8주차의 중뇌 유사체의 대표적인 위상차이미지 및 상기 위상차이미지에 나타난 중뇌 유사체의 크기를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 XBP1 및 GRP78의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 10은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 p-CREB 양성 세포의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 p-CREB 양성 세포의 양을 정량화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 CDKN1A, CDKN2A 및 TP53의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 12는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 p53 발현 세포의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 p53 발현 세포를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 Lamin A/C 및 Tri-Me-K9의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 Lamin A/C 및 Tri-Me-K9의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 나타나는 ERK의 인산화, CaMKII 및 BDNF를 보여주는 면역형광염색 이미지 및 ERK의 인산화, CaMKII 및 BDNF의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 TH, TUJ-1 양성 뉴런, 시냅스 마커인 PSD-95 및 Synaptophysin의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 TH, TUJ-1 양성 뉴런, PSD-95 및 Synaptophysin의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 성숙 8주차의 중뇌 유사체를 배양하는 배지로 분비된 도파민을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 폰타나-마손(Fontana-Masson) 염색으로 확인된 뉴로멜라닌(Neuromelanin) 및 상기 뉴로멜라닌을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 TH 양성 도파민성 뉴런 및 GFAP 양성 성상세포를 면역형광염색으로 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 19는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 활성화 성상세포 마커인 GFAP, S100β, IL-6, TNFA 및 IFNG의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 20은 성숙 30주차의 중뇌 유사체의 뉴런에서 발현되는 MAP2 및 인산화된 α-synuclein(ser129)을 면역형광염색으로 확인한 이미지와 상기 α-synuclein(ser129)의 축적을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 21은 성숙 30주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 p-Tau (ser202/thr205)를 면역형광염색으로 확인한 이미지 및 상기 p-Tau 축적을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 22는 성숙 30주차의 중뇌 유사체에서 나타나는 응집체를 면역형광염색으로 확인한 이미지 및 상기 응집체를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는바, 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
인간 배아줄기세포 및 hiPSCs를 이용한 본 발명은 공공기관 생명윤리위원회의 허가를 받아 수행되었다(서울, 대한민국, IRB no. P01-201409-ES-01, P01-201802-31-001).
실시예 1. 중뇌 유사체의 제조
1.1. 세포주 배양
사람 배아 줄기세포주인 H9(Wicell, Madison, WI, USA) 및 사람 iPSCs(LRRK2G2019S mutant PD-patient iPSC and gene corrected iPSC)를 마트리겔(Matrigel)이 코팅된 배양접시(corning)에서 1% Pen/Strep(Gibco)가 포함된 TeSR-E8 배지(STEMCELL Technologies)를 사용하여 배양하였다. 상기 세포는 ReLeSR(STEMCELL Technologies)를 사용해 계대배양하였고, 배지는 계대배양일에 교체해주었다.
1.2. 중뇌 유사체의 제조
실시예 1.1의 방법으로 배양된 세포주를 Accutase(MERCK)를 사용해 단일 세포로 분리시켜주었다. 분리된 세포는 1×104 cell/well의 농도로 초저부착 96웰 플레이트(Sbio)에 부착시켰다. 부착된 세포가 자기조직화하여 배아체를 형성하면 플레이트의 배지를 EBM 배지로 교체해주었다. EBM 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.
EBM 배지 조성
DMEM/F12 Gibco
KSR 20 % Gibco
Y27632 50 uM Tocris
CHIR99021 3 uM Tocris
IWP2 1 uM Biogems
dorsomorphin 2 uM Sigma
A83-01 2 uM PeproTech
β-mercaptoethanol 55 uM Gibco
FBS 3 % Gibco
bFGF 4 ng/ml PeproTech
heparin 1 ug/ml Sigma
NEAA 1 % Gibco
Pen/Strep 1 % Gibco
GlutaMAX 1 % Gibco
EBM 배지로 교체하여 24시간 배양한 후, BGM 배지로 교체해주었다. BGM 배지의 조성은 하기 표 2와 같다.
BGM 배지 조성
DMEM/F12 : Neurobasl medium 1:1 Gibco
N2 1 X Gibco
B27 w/o vitamin A 1 X Gibco
CHIR99021 3 uM Tocris
IWP2 1 uM Biogems
dorsomorphin 2 uM Sigma
A83-01 2 uM PeproTech
β-mercaptoethanol 55 uM Gibco
heparin 1 ug/ml Sigma
NEAA 1 % Gibco
Pen/Strep 1 % Gibco
GlutaMAX 1 % Gibco
BGM 배지로 교체하고 2일 후, 세포를 중뇌로 패턴화하기 위해 BGM 배지에 FGF8(PeproTech) 및 SAG(PeproTECH)를 추가하여 세포를 배양하였다. 상기 패턴화로 만들어진 중뇌 유사체는 growth factor-reduced matrigel (Corning)에 포매시켰다. 포매 시, 배양 배지에서 라미닌(Laminin)(BD Science) 및 인슐린(Thermo Scientific)을 추가하였고, CHIR99021, IWP2, dorsomorphin 및 A83-01은 제거해주었다. 배양 9일차에 matrigel에 포매된 중뇌 유사체는 초저부착 6웰 플레이트로 옮겨 60 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 배양하였다. 초저부착 6웰 플레이트에서 배양되는 중뇌 유사체는 BMM 배지를 사용하여 배양하였으며, 계대배양일에 배지를 교체해주었다. BMM 배지의 조성은 하기 표 3과 같다.
BMM 배지 조성
DMEM/F12: Neurobasl medium 1:1 Gibco
N2 1 X Gibco
B27 1 X Gibco
BDNF 10 ng/ml PeproTech
GDNF 10 ng/ml PeproTech
ascorbic acid 200 uM Sigma
db-cAMP 125 uM Biogems
β-mercaptoethanol 55 uM Gibco
heparin 1 ug/ml Sigma
NEAA 1 % Gibco
Pen/Strep 1 % Gibco
GlutaMAX 1 % Gibco
상기 중뇌 유사체를 제조하는 방법에 대한 간략한 모식도는 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 방법으로 제조되는 중뇌 유사체를 위상차현미경으로 확인한 이미지를 도 2에 나타내었다.
1.3. TMAO가 처리된 중뇌 유사체의 제조
상기 실시예 1.2.를 참조하여 제조된 중뇌 유사체를 배양한 지 4주가 지난 이후, 2일에 한 번씩 배지를 교체할 때마다 TMAO를 100 uM 또는 1mM의 농도로 처리해주었다. 상기 TMAO가 처리된 중뇌 유사체를 제조하는 방법에 대한 간략한 모식도는 도 2에 나타내었다.
참조예 1. 실험 재료 및 방법
1.1. RNA 분리 및 qPCR
상기 실시예 1.2. 및 실시예 1.3.을 참조하여 제조된 중뇌 유사체를 1XPBS로 세척하고, easy-BLUETM Total RNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 용해시켰다. 용해된 중뇌 유사체에 클로로포름 및 이소프로판올을 처리하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 원심분리한 뒤 차가운 70% EtOH로 세척하였으며, Nanodrop을 사용하여 RNA의 농도를 측정하였다. 이후, RNA의 양을 1200 ng로 맞춰준 뒤, Superscript IV 역전사효소(Thermo Scientific)를 사용하여 RNA를 cDNA로 합성해주었다. 합성된 cDNA의 유전자 발현량은 각 마커에 대해 Fast SYBRTM Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 및 프라이머를 사용하여 분석하였다. 각 마커의 발현 레벨은 TBP로 정규화하였다.
1.2. 면역세포화학
상기 실시예 1.2. 및 실시예 1.3.을 참조하여 제조된 중뇌 유사체를 6시간 동안 실온에서 4% PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 1XPBS로 세척하였다. 다음으로, 고정된 중뇌 유사체를 냉동 블록용 OCT(Sakura)에 포매하였다. 냉동된 중뇌 유사체는 cryostat(LEICA CM1520)을 사용하여 7 μm 슬라이스로 절단하였다. 절단된 샘플은 0.025% TBS-T에서 0.3% tritonX-100(Sigma)으로 1시간 동안 투과시킨 뒤 1시간 동안 0.025% TBS-T에서 3% BSA 및 0.02% sodium azide로 블로킹하였다. 이후 블로킹 된 샘플은 표적 단백질로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 표적 단백질은 하기 표 4와 같다. 표적 단백질로 반응시킨 샘플을 1X TBS-T로 세척하였다. 이후 샘플을 옅은 빛이 비치는 실온에서 Hoechst(Thermo Scientific)에 1:400의 비율로 희석된 이차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로 반응된 샘플은 형광 현미경(OLYMPUS, U-TBI90) 및 공초점 현미경(ZEISS LSM800)으로 관찰되었다.
표적 단백질 제조사 카탈로그 넘버
SOX2(SRY-box transcription factor 2) Seven Hills Bioreagent #WRAB1236
FOXA2(forkhead box protein A2) Seven Hills Bioreagent #WRAB1200
LMX1a Sigma #ab10533
Tuj1 BioLegend #802001
TH (tyrosine hydroxylase) Sigma #T1299
MAP2(microtubule-associated protein2) R&D #MAB933
GFAP (glial fibrillary acidic protein) DAKO #Z0334
pERK1/2 Cell signaling #9106s
pCREB(cAMP response element-binding protein) Cell signaling #9198S
p53 Santa cruze biotechnology #sc-126
Lamin A/C Santa cruze biotechnology #sc-376248
CaMKII (calmodulin-dependent protein kinase II) Novus biologicals #NB110-96869
BNDF (Brain-derived neurotrophic factor) Alomone labs #ANT-010
Tri-Me-K9 abcam #ab8898
PSD-95(postsynaptic density protein 95) Invitrogen #MA1-046
Synaptophysin abcam #ab32127
α-synuclein Millipore #AB9850
pTau Invitrogen MN1020
cleaved caspase 3 Cell signaling #9664s
1.3. ELISA
상기 실시예 1.2. 및 실시예 1.3.을 참조하여 제조된 중뇌 유사체에서 분비되는 도파민을 분석하기 위해, 제조사의 지침에 따라 도파민 ELISA 키트(Enzo, #ENZ-KIT188-0001)를 사용하여 중뇌 유사체에 의해 생성된 도파민을 분석하였다. 상기 중뇌 유사체의 배지 및 배지와 동일한 부피의 비오틴 검출 항체를 플레이트의 각 웰에 넣어주었다. 이후 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션 한 뒤 세 번 세척해주었다. 다음으로 플레이트의 각 웰에 HRP streptavidin conjugate working solution을 추가한 뒤 30분 동안 37℃에서 반응시켰다. 플레이트의 웰을 세척한 뒤 37℃의 옅은 빛에서 15분 동안 TMB 기질과 함께 인큐베이션하였다. 이후 각 웰에 정지 용액을 넣어준 뒤, 흡광도(optical density (OD)) 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(SpectraMax, M3 Multi-Mode Microplate Reader)를 사용하여 측정하였다.
1.4. 폰타나-마손(Fontana-Masson) 염색(멜라닌 염색)
상기 실시예 1.2. 및 실시예 1.3.을 참조하여 제조된 중뇌 유사체에 축적되는 뉴로멜라닌(neuromelanin)을 확인하기 위해, 폰타나-마손(Abcam, #ab150669)으로 뉴로멜라닌을 염색하여 시각화하였다. 상기 중뇌 유사체를 증류수로 세척한 뒤 45분 동안 60℃에서 ammoniacal silver solution과 반응시켰다. 이후, 증류수로 세척하고 실온에서 30초 동안 0.2% gold chloride solution과 반응시켰다. 이어서 중뇌 유사체를 증류수로 세척하고 실온에서 2분 동안 5% sodium thiosulfate solution과 반응시켰다. 마지막으로, 중뇌 유사체의 핵 및 세포질을 염색하기 위해 5분 동안 nuclear fast red solution과 반응시켰다. 염색된 중뇌 유사체를 100% EtOH로 탈수한 뒤 슬라이스에 고정하여 현미경으로 관찰하였다.
1.5. 응집체 염색
상기 실시예 1.2. 및 실시예 1.3.을 참조하여 제조된 중뇌 유사체에서 응집체를 확인하기 위해, 제조사의 지시에 따라 PROTEOSTAT Aggresome 검출 키트(Enzo, #ENZ-51035-K100)를 사용하여 응집체를 확인하였다. 상기 중뇌 유사체를 1XPBS로 10분씩 총 세 번 세척하였다. 이어서, 이중 검출 시약(1X Assay Buffer를 사용하여 1:2000 의 비율로 희석한 Dilute Aggresome Detection Reagent 및 1X Assay Buffer를 사용하여 1:1000의 비율로 희석한 Hoechst 33342)과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 1XPBS로 세척한 뒤 슬라이스에 중뇌 유사체를 고정하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
실험예 1. 중뇌 유사체의 분화 유도 확인
중뇌 유사체로의 분화가 잘 유도되었는지 확인하기 위해, SOX2, FOXA2, TH, MAP2, GFAP를 참조예 1.1. 내지 1.3.의 방법을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 4 내지 도 7에 나타내었다.
도 4는 성숙 2주차(2WM), 4주차(4WM)의 중뇌 유사체에서 SOX2, FOXA2, TH, MAP2, GFAP를 면역형광염색으로 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 성숙 2주차에 신경줄기세포 마커인 SOX2 및 도파민성 전구 마커인 FOXA2의 발현을 확인하였다. 또한 2주차부터 도파민성 뉴런 마커인 TH의 발현이 확인되었다. 성숙 4주차에는 TH, FOXA2 뿐만 아니라 성상세포 마커인 GFAP 및 신경교세포 분화를 나타내는 MAP2의 발현을 확인하였다
.
도 5는 성숙 4주차(4WM)의 중뇌 유사체에서 면역형광염색으로 확인한 MAP2 및 GFAP를 고해상도로 나타낸 이미지이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 성숙 4주차에서 확인한 MAP2 및 GFAP를 확대하여 확인한 결과 GFAP 양성 성상세포가 MAP2 양성 뉴런을 둘러싸고 있음을 확인하였다.
도 6은 중뇌 유사체에서 발현되는 SOX2, FOXA2, TH, MAP2, GFAP의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, SOX2는 성숙 2주차에 증가하였으나 4주차에서 감소하였고, MAP2는 분화가 진행됨에 따라 점차 증가하였다. 도파민성 뉴런 마커인 PAX3, LMX1A 및 TH는 2주차에 비해 4주차에서 감소하는 경향이 확인되었다.
도 7은 중뇌 유사체를 배양한 배지로 분비된 도파민의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 도파민의 분비는 줄기세포에선 확인되지 않았지만 4주차에 크게 증가하였다.
이상의 결과를 통해, 줄기세포에서 중뇌 유사체로 분화가 유도되었음을 신경줄기세포 마커, 도파민성 뉴런 마커, 성상세포 마커 등을 통해 확인하였다. SOX2, PAX3, LMX1A 및 TH의 경우 4주차에서 감소하는 경향이 나타났으나, 이는 중뇌 유사체로 분화됨에 따라 성상세포의 증가 및 도파민성 뉴런의 증가로 인해 나타나는 것임을 확인하였다.
실험예 2. TMAO 처리에 따른 세포 스트레스 및 노화 특성 확인
중뇌 유사체에 TMAO를 처리할 경우의 세포 내 소포체(ER) 스트레스와 노화의 특성을 평가하기 위해, 실시예 1.2.의 방법으로 제조된 중뇌 유사체 및 실시예 1.3.의 방법으로 제조된 TMAO 처리 중뇌 유사체를 사용하여 실험하였다. 실험은 참조예 1.1. 내지 1.2.의 방법을 통해 수행되었다. 그 결과를 도 8 내지 도 13에 나타내었다.
도 8은 성숙 8주차(TMAO 처리 4주차)의 중뇌 유사체의 대표적인 위상차이미지 및 상기 위상차이미지에 나타난 중뇌 유사체의 크기를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, TMAO의 처리 유무에 관계 없이 중뇌 오가노이드의 구체 및 세포 직경에는 유의한 차이가 없었다.
도 9는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 XBP1 및 GRP78의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, ER 스트레스 관련 유전자인 XBP1 및 GRP78은 TMAO가 처리된 중뇌 유사체에서 약간 증가하였다.
도 10은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 p-CREB 양성 세포의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 p-CREB 양성 세포의 양을 정량화를 나타낸 그래프이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, ER 스트레스로 억제되는 p-CREB는 TMAO가 처리된 중뇌 유사체에서 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
도 11은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 CDKN1A, CDKN2A 및 TP53의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 노화 관련 마커인 P21(CDKN1A), P16(CDKN2A) 및 TP53은 TMAO를 1mM 처리한 경우에 증가하였다.
도 12는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 p53 발현 세포의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 p53 발현 세포를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 노화 관련 마커인 p53은 핵에서 축적됨을 확인하였다.
도 13은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 Lamin A/C 및 Tri-Me-K9의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 Lamin A/C 및 Tri-Me-K9의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 후성유전학적 노화 마커이자 핵 및 크로마틴의 구조 안정성을 유지하는 lamin A/C와 Tri-Me-K9 또한 TMAO 처리에 따라 감소함을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, TMAO를 중뇌 유사체에 처리할 경우 ER 스트레스가 활성화되며, TMAO가 노화와 관련된 변화를 유도한다는 것을 확인하였다. 또한 TMAO의 처리는 핵과 크로마틴의 구조적 안정성을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
실험예 3. TMAO 처리에 따른 약화된 도파민성 뉴런 보호
TMAO의 처리가 중뇌 유사체에서 도파민에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시예 1.2. 및 1.3.의 방법으로 제조된 중뇌 유사체를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 참조예 1.2. 내지 1.4.의 방법을 통해 수행되었다. 그 결과를 도 14 내지 도 17에 나타내었다.
도 14는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 나타나는 ERK의 인산화, CaMKII 및 BDNF를 보여주는 면역형광염색 이미지 및 ERK의 인산화, CaMKII 및 BDNF의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 14에 나타낸 바와 같이, CREP의 인산화를 유도하는 ERK1/2와 CaMKII의 발현은 TMAO의 처리에 의해 농도의존적으로 감소하였다. CREB의 인산화로 유도되는 BDNF의 발현은 유사하게 확인되어 BDNF의 신호전달경로가 손상됨을 확인하였다.
도 15는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 TH, TUJ-1 양성 뉴런, 시냅스 마커인 PSD-95 및 Synaptophysin의 대표적인 면역형광염색 이미지 및 상기 TH, TUJ-1 양성 뉴런, PSD-95 및 Synaptophysin의 양을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 도파민성 뉴런 마커인 TH는 TMAO 처리에 의해 감소하였으며, 시냅스마커인 PSD-95 및 시냅토피신(Synaptophysin)은 TMAO를 처리할 경우 감소하였다. Tuj1에서는 TMAO 처리에 따른 유의미한 차이가 확인되지 않아 도파민성 뉴런이 TMAO에 처리에 의해 민감하게 반응함을 확인하였다.
도 16은 성숙 8주차의 중뇌 유사체를 배양하는 배지로 분비된 도파민을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 16에 나타낸 바와 같이, TMAO 농도 의존적으로 도파민의 분비가 감소하였다.
도 17은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 폰타나-마손(Fontana-Masson) 염색으로 확인된 뉴로멜라닌(Neuromelanin) 및 상기 뉴로멜라닌을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 뉴로멜라닌은 TMAO 처리 시 유의하게 증가함을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, 중뇌 유사체에 TMAO를 처리할 경우 중뇌 유사체의 도파민성 뉴런이 손실 및 기능저하, 뉴로멜라닌의 축적이 유도됨을 확인하였다. 또한, 이는 중뇌가 노화했을 때 나타나는 상태와 비슷하여 TMAO를 처리한 중뇌 유사체는 노화한 중뇌를 모방할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 성상세포 활성화 확인
노화된 뇌의 특징 중 하나인 성상세포 활성화의 확인을 위해, 참조예 1.1. 및 1.2. 의 방법으로 성상세포와 관련된 마커를 확인하였다. 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18은 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 TH 양성 도파민성 뉴런 및 GFAP 양성 성상세포를 면역형광염색으로 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 성상세포 활성화 마커인 GFAP의 발현은 TMAO를 처리한 경우 농도 의존적으로 증가하였으며, TH 양성 뉴런은 감소하였다.
도 19는 성숙 8주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 활성화 성상세포 마커인 GFAP, S100β, IL-6, TNFA 및 IFNG의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 중뇌 유사체에서 GFAP의 발현은 TMAO 처리에 의해 증가하였고, 염증성 사이토카인인 IL-6, TNFA 및 IFNG 또한 TMAO 처리에 의해 유의하게 증가하였다.
이상의 결과를 통해, TMAO의 처리가 중뇌 유사체에서 성상세포의 활성화를 유도한다는 것을 확인하였다. 또한 TMAO가 중뇌 유사체에서 성상세포 매개 염증반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 단백질 응집의 증가 확인
신경 퇴행성 질환 중 파킨슨병에서 나타나는 특징이 TMAO의 처리에 의해 나타나는지 확인하기 위해, 참조예 1.2. 및 1.5.의 방법으로 α-synuclein와 p-Tau 및 상기 단백질로 인한 응집체의 생성을 확인하였다. 그 결과를 도 20 내지 도 22에 나타내었다.
도 20은 성숙 30주차의 중뇌 유사체의 뉴런에서 발현되는 인산화된 α-synuclein(ser129)을 면역형광염색으로 확인한 이미지와 상기 α-synuclein(ser129)의 축적을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 20에 나타낸 바와 같이, TAMO를 1mM의 농도로 처리할 경우 α-synuclein의 증가를 확인하였다.
도 21은 성숙 30주차의 중뇌 유사체에서 발현되는 p-Tau (ser202/thr205)를 면역형광염색으로 확인한 이미지 및 상기 p-Tau 축적을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 21에 나타낸 바와 같이, TAMO의 처리에 의해 중뇌 유사체에서 p-Tau의 축적이 증가하였다.
도 22는 성숙 30주차의 중뇌 유사체에서 나타나는 응집체를 면역형광염색으로 확인한 이미지 및 상기 응집체를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 22에 나타낸 바와 같이, TMAO 처리 농도 의존적으로 단백질 응집이 증가하였다.
이상의 결과를 통해, 신경 퇴행성 질환에서 나타나는 단백질 응집이 증가함을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (20)

  1. 줄기세포를 배양하여 뇌 유사체를 제조하는 단계; 및
    상기 뇌 유사체에 TMAO(trimethylamine N-oxide)를 처리하는 단계; 를 포함하는, 뇌 질환 모델을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 유사체는 중뇌 유사체인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 유래의 배아줄기세포, 유도만능줄기세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 유사체는 SOX2, FOXA2, TH, MAP2 및 GFAP로 이루진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 증가가 나타나는 것인, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환은 신경 퇴행성 질환으로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 피질기저핵변성, 루이소체 치매, 전두측두변성, 근위축성 측삭경화증, 무도병, 척수소뇌실조증, 모세관 확장 실조, 니만피크병 및 헌팅턴병으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것인, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 TMAO를 10uM 내지 10mM로 처리하는 것인, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 α-Synuclein, p-Tau(phosphorylated Tau)의 축적이 나타나는 것인, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 IL6, TNFA 및 IFNG로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 증가가 나타나는 것인, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 ER 스트레스 관련 마커의 증가 또는 감소가 나타나는 것인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 ER 스트레스 관련 마커의 증가는 XBP1 및 GRP78로 이루어진 군에서 나타나는 것인, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 ER 스트레스 관련 마커의 감소는 pCREB의 감소가 나타나는 것인, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 P21(CDKN1A), P16(CDKN2A) 및 TP53로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 증가하는 것인, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 TMAO 처리에 의해 lamin A/C 및 Tri-Me-K9로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자 발현이 감소하는 것인, 방법.
  14. 청구항 1의 방법으로 제조된 뇌 질환 모델.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 뇌 질환 모델은 노화 및 신경 퇴행성 질환의 특징이 나타나는 것인, 뇌 질환 모델.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 피질기저핵변성, 루이소체 치매, 전두측두변성, 근위축성 측삭경화증, 무도병, 척수소뇌실조증, 모세관 확장 실조, 니만피크병 및 헌팅턴병으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것인, 뇌 질환 모델.
  17. 청구항 14의 뇌 질환 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 피검 물질이 처리된 뇌 유사체와 TMAO가 처리된 뇌 유사체에서 나타나는 특징을 비교하는 단계;
    및 TMAO가 처리된 뇌 유사체에서 나타나는 특징을 감소시키는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 뇌 질환 예방 또는 치료물질을 스크리닝 하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 TMAO가 처리된 뇌 유사체에서 나타나는 특징은 무처리 대조군에 비해 SOX2, FOXA2, TH, MAP2 및 GFAP로 이루진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 증가; α-Synuclein 및 p-Tau의 축적; XBP1 또는 GRP78의 증가; pCREB의 감소; P21(CDKN1A), P16(CDKN2A) 및 TP53로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현의 증가; lamin A/C 및 Tri-Me-K9로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자 발현의 감소;인 것인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 물질은 노화 및 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질인, 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
KR1020220144720A 2022-11-02 2022-11-02 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법 KR20240062800A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220144720A KR20240062800A (ko) 2022-11-02 2022-11-02 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220144720A KR20240062800A (ko) 2022-11-02 2022-11-02 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240062800A true KR20240062800A (ko) 2024-05-09

Family

ID=91075598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220144720A KR20240062800A (ko) 2022-11-02 2022-11-02 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20240062800A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7023820B2 (ja) 多分化能細胞および多能性細胞の分化を方向付けることによって発生させる皮質介在ニューロンおよびその他のニューロン細胞
Wang et al. Gain of toxic apolipoprotein E4 effects in human iPSC-derived neurons is ameliorated by a small-molecule structure corrector
JP6262205B2 (ja) ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導方法
Hu et al. Brain-derived neurotrophic factor modified human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived cholinergic-like neurons improve spatial learning and memory ability in Alzheimer’s disease rats
CN106103702B (zh) 制备端脑或其前体组织的方法
JP2019502407A (ja) 神経オルガノイド組成物および使用方法
KR20160040286A (ko) 도파민 뉴런의 제조 방법
EP2598635B1 (en) Corticogenesis of human pluripotent cells
Chen et al. Humanized neuronal chimeric mouse brain generated by neonatally engrafted human iPSC-derived primitive neural progenitor cells
Tian et al. Proinflammatory S100A9 regulates differentiation and aggregation of neural stem cells
KR101330649B1 (ko) 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교전구세포의 제조 방법
Kumar et al. Endogenous cerebellar neurogenesis in adult mice with progressive ataxia
KR20240062800A (ko) 뇌 유사체를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질환 모델 및 이를 이용한 노화 및 신경퇴행성 질병 치료제를 스크리닝 하는 방법
WO2008071960A2 (en) Methods of increasing neurogenesis
KR20240040102A (ko) 고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도
JP6844953B2 (ja) アルツハイマー病研究を標的にしたグリア細胞システム
Lovejoy et al. Engineered Cerebral Organoids Recapitulate Adult Tau Expression and Disease-relevant Changes in Tau Splicing
Takata et al. Analysis of Aβ-induced neurotoxicity and microglial responses in simple two-and three-dimensional human iPSC-derived cortical culture systems
KR20210078704A (ko) 중뇌 오가노이드 제조방법
Luo et al. Developmental deficits and early signs of neurodegeneration revealed by PD patient derived dopamine neurons
TWI822127B (zh) 改良式模擬神經病症之培養系統及方法
Kwak et al. Guidelines for manufacturing and application of organoids: brain
Kowalski Development of a quick, robust and chemically-defined differentiation protocol from human induced pluripotent stem cells towards cortical neurons to phenotype Alzheimer’s Disease
Miankoushki Studying the role of human Amyloid Precursor Protein (APP) during human cortical neurogenesis
KR20210078705A (ko) 파킨슨병 질환모델