JP2013538191A5

JP2013538191A5 - 病的血管新生および腫瘍細胞侵襲性の阻害のための治療法としてならびに分子イメージングおよび標的化送達のための抗ＤＥｓｐＲ阻害剤

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Publication number: JP2013538191A5
Application number: JP2013520889A
Authority: JP
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2014-02-20

Description

「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどを含むがこれらに限定されない哺乳類を意味する。好ましくは、対象はヒトである。患者も本明細書では対象である。
[本発明1001]
ＤＥｓｐＲ（二重エンドセリン／ＶＥＧＦシグナルペプチド受容体）に特異的に結合し、かつＤＥｓｐＲ生物活性を低減または阻害する、単離された抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1002]
前記ＤＥｓｐＲが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む、本発明1001の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1003]
SEQ ID NO:1の残基1〜9を含むＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する、本発明1001または1002の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1004]
ＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）の結合部位において、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する、本発明1001〜1003のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1005]
前記ＶＥＧＦシグナルペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1004のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1006]
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、本発明1001〜1005のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1007]
SEQ ID NO:4の配列を含む可変重（Ｖ _Ｈ）鎖アミノ酸配列を含む、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1008]
SEQ ID NO:9の配列を含む可変軽（Ｖ _Ｌ）鎖アミノ酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1009]
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体がヒト化抗体またはその抗体断片である、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1010]
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびSEQ ID NO:7からなる群から選択される配列を含む1つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む、本発明1001〜1006または1009のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1011]
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群から選択される配列を含む1つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む、本発明1001〜1006または1009〜1010のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1012]
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体が、複合抗体またはその抗体断片である、本発明1001〜1005のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1013]
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびSEQ ID NO:からなる群から選択される配列を含む1つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む、本発明1012の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1014]
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群から選択される配列を含む1つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む、本発明1012または1013の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1015]
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:13〜SEQ ID NO:17からなる群から選択される可変重（Ｖ _Ｈ）鎖アミノ酸配列を含む、本発明1012〜1014のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1016]
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:19からなる群から選択される可変軽（Ｖ _Ｌ）鎖アミノ酸配列を含む、本発明1012〜1014のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1017]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｃ55またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体である、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1018]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｂ2、7Ｃ5Ｃ55、またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体によって示される結合パターンと類似した結合パターンを示す、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1019]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｂ2、7Ｃ5Ｃ55、またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体によって示されるアビディティと類似したアビディティを示す、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1020]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｂ2、7Ｃ5Ｃ55、またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1021]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｃ55またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体の1つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1022]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｂ2、7Ｃ5Ｃ55、またはＧ12Ｅ8によって発現または産生されるモノクローナル抗体の1つまたは複数の生物学的特徴を有する、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1023]
ハイブリドーマ7Ｃ5Ｂ2、7Ｃ5Ｃ55、またはＧ12Ｅ8によって発現または産生される抗体により結合されるＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する、本発明1001〜1006のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1024]
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ'断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'） ₂ 断片、単鎖断片、ダイアボディ、または直鎖抗体である、本発明1001〜1023のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1025]
抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片に結合されてＤＥｓｐＲに特異的な免疫結合体を形成する薬剤をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1026]
前記抗体またはその抗体断片に結合される薬剤が、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、小分子、ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、または微小気泡である、本発明1025の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
[本発明1027]
本発明1001〜1026のいずれかのＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
[本発明1028]
血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1029]
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、癌または腫瘍である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生、血管新生緑内障、骨粗鬆症、および再狭窄からなる群から選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1032]
1つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤の投与をさらに含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍成長を阻害し、腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1034]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記腫瘍血管系細胞が、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1033の方法。
[本発明1036]
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1037]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
腫瘍細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1039]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
ＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、オートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する方法であって、治療的に有効な量の本発明1027の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1041]
前記対象がアルツハイマー病またはハンチントン病を有する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
ＤＥｓｐＲ標的化による分子イメージング方法であって、標的部分に結合される有効量の本発明1027の医薬組成物を投与する工程と、前記標的部分に結合された本発明1027の医薬組成物の有無を、分子イメージングを用いて決定する工程とを含む、方法。
[本発明1043]
前記分子イメージングが、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記標的部分が、抗体、ＤＥｓｐＲ結合ペプチドリガンド、小分子、ナノ粒子、ポリマー、アプタマー、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1042または1043の方法。
[本発明1045]
ＤＥｓｐＲ発現の決定により腫瘍を層別化または分類する方法であって、本発明1001〜1026のいずれかのＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片と細胞とを接触させる工程と、前記接触の後に、前記抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が前記細胞に結合するかどうかを決定する工程とを含み、前記ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の前記細胞への結合により、前記細胞がＤＥｓｐＲを発現することが示される、方法。
[本発明1046]
前記細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、腫瘍間質細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記腫瘍間質細胞が、線維芽細胞、筋線維芽細胞、炎症細胞、星状細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記接触される細胞が、組織生検、パラフィン包埋切片、または凍結切片内にある、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強するための方法であって、標的化超音波送達を用いて、有効量の本発明1027の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達する工程を含み、前記治療薬の送達が、本発明1027の医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して増強される、方法。
[本発明1050]
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、本発明1049の方法。
[本発明1051]
ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減するための方法であって、標的化超音波送達を用いて、有効量の本発明1027の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達する工程を含み、前記治療薬の毒性が、本発明1027の医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して低減される、方法。
[本発明1052]
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、本発明1051の方法。
[本発明1053]
ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングと、治療薬のＤＥｓｐＲ標的化送達とを組み合わせるための方法であって、有効量の治療薬および標的部分に結合される本発明1027の医薬組成物を対象に投与する工程と、分子イメージングを用いて、標的部分に結合された本発明1027の医薬組成物の有無を決定する工程とを含む、方法。
[本発明1054]
前記分子イメージングが、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、本発明1053または1054の方法。
[本発明1056]
血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1057]
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、癌または腫瘍である、本発明1056の使用。
[本発明1058]
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生、血管新生緑内障、骨粗鬆症、および再狭窄からなる群から選択される、本発明1057の使用。
[本発明1059]
癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1060]
1つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤をさらに含む、本発明1059の使用。
[本発明1061]
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍成長を阻害し、そして腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1062]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1061の使用。
[本発明1063]
前記腫瘍血管系細胞が、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1062の使用。
[本発明1064]
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1065]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1064の使用。
[本発明1066]
腫瘍細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1067]
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、本発明1066の使用。
[本発明1068]
ＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象においてオートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1069]
前記対象がアルツハイマー病またはハンチントン病を有する、本発明1068の使用。
[本発明1070]
標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1071]
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、本発明1070の使用。
[本発明1072]
標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減する際に使用するための、本発明1027の医薬組成物。
[本発明1073]
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、本発明1072の使用。

ＤＥｓｐＲ（以前は、Ｄｅａｒと呼ばれ、ＤｅａｒとしてＧｅｎＢａｎｋに寄託）欠損またはノックアウト（Ｄｅａｒ^−／−）マウスを用いて、ＤＥｓｐＲが胚発生において重要な血管新生プレーヤーであることを示す。パワードップラー分析を用いて、組織血管分布の低下を示す成体ハプロ不全（＋／−）マウスにおいてみられるように、ＤＥｓｐＲが成体組織血管分布に寄与することを示す。Ａ〜Ｅは、基礎的および血管新生の両方の管形成条件下で、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（図３Ａ〜３Ｃ）および微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）において免疫染色することによって、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが検出されることを示す。重要なことには、ＨＵＶＥＣ（図３Ｄ）およびＨＭＥＣ（図３Ｅ）の血管新生アッセイにおいて、抗ＤＥｓｐＲ（Ａｂ１）および抗ＶＥＧＦｓｐ（Ａｂ２）の両抗体を用いて、血管新生の新生血管の管長の阻害が見られる（ＨＵＶＥＣおよびＨＭＥＣの両方に対して、Ｔｕｋｅｙの全ペアワイズ多重比較Ｐ＜０．００１）。作成される新生血管の分枝および相互接続を含む他の血管新生パラメータについても同様の知見が認められた。Ａ〜Ｄは、免疫染色を用いて、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが腫瘍細胞においても検出され、細胞膜および核膜内にＶＥＧＦｓｐおよびＤＥｓｐＲが共存していることを実証する。ＤＥｓｐＲの細胞膜および核膜発現は多数の腫瘍細胞型において検出され、抗ＤＥｓｐＲ療法が種々の癌型に対して有効であることが示される。ＤＥｓｐＲ発現は、ヒト肺非小細胞癌ＮＣＩ−Ｈ７２７、肺巨細胞腫ＴＩＢ−２２３／ＧＣＴ、乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図４Ａ〜４Ｃ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、膀胱癌２５３ＪＢＶ、結腸腺癌ＳＷ４８０、肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ、メラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２、骨肉腫ＭＧ−６３、卵巣腺癌ＨＴＢ−１６１／ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、前立腺腺癌ＰＣ−３ｍｍ２、および膵癌ＣＲＬ−１４６９／ＰＡＮＣ−１において検出される（図４Ｄ）。Ａ〜Ｃは、ＨＣＩ−Ｈ２９２肺粘表皮癌、およびＨＥＰＧ２肝細胞癌（図５Ａ）、およびＣＣＬ−８６／ＲａｊｉＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫においてＤＥｓｐＲ発現が検出されなかったことを示し、従って陽性観察の特異性が示される。ＮＣＩ−７２７肺癌細胞（図５Ｂ）における知見は、Ｇｒ．ＩＩＩ肺腺癌の腫瘍切片の免疫染色で確証される（図５Ｃ）。Ａ〜Ｂは、対照（Ｃ）および免疫前抗体治療（ＰＩ）とは対照的に、転移性乳房腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１細胞株の２つの検査細胞株において、抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体治療によるＤＥｓｐＲ阻害が腫瘍細胞侵襲性を阻害することを示す。抗ＤＥｓｐＲ治療されたラット（□）が、模擬処理した対照（■）と比較して最小限の腫瘍成長を示したことを示す。両側ｔ−検定^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００１。Ａ〜Ｄは、免疫組織化学的分析を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞と同様に乳房腫瘍細胞においてＤＥｓｐＲが発現され（図８Ａ）、正常な乳房組織では発現されない（図８Ｂ）ことを示す。さらに、治療されたラットの残存腫瘍は、腫瘍細胞の内腔への侵食による腫瘍血管の内皮の破壊を示した模擬処理した腫瘍（図８Ｄ）とは対照的に、血管の正常化（図８Ｃ）を示した。選択されたモノクローナル抗体の特徴付けを示す。モノクローナル抗体２Ｅ４Ａ８、２Ｅ４Ｂ１１、２Ｅ４Ｈ１０、５Ｇ１２Ｅ８、７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５、８Ｅ７Ｄ１１、８Ｅ２Ｆ６、Ｅ２Ｇ４および８Ｅ７Ｆ８を、標準手順を用いる間接的なＥＬＩＳＡによって検査した。以下のように、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含有する上清からの連続希釈を検査した：１＝１／２、２＝１／４、３＝１／８、４＝１／１６、５＝１／３２、６＝１／６４、７＝１／１２８、８＝１／２５６、９＝１／５１２、１０＝１／１０２４、１１＝１／２０４８および１２＝１／４０９６。検査したモノクローナル抗体のウェスタンブロット分析を示す。特異性を確認するために、低（５Ｇ１２Ｅ８）、中（２Ｅ４Ｈ６）、および高アフィニティ（７Ｃ５Ｂ２）モノクローナル抗体を、サブクローン上清およびその後のその後精製された抗体と共に検査した。抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、ヒトＤＥｓｐＲの推定１０ｋＤのタンパク質に特異的である。ウェスタンブロット分析は、ヒトＤＥｓｐＲの期待される１０ｋＤ分子量のタンパク質を検出するために、Ｃｏｓ１ヒトＤＥｓｐＲトランスフェクト細胞から抗原として単離される全細胞タンパク質を用いて実施され、一次抗体は、３つの選択されたクローンの精製抗体およびサブクローン上清を１０％のゲル濃度で含んだ。３．０７ｇのＴｒｉｓ、１４．４ｇのグリシン、２００ｍｌのメタノール、８００ｍｌのｄＨ_２Ｏのトランスファー緩衝液と共にニトロセルロース（ＰＩＥＲＣＥ）を使用した。ＨＲＰ−抗マウス多価免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ＃０４１２）１：１００，０００、ＥＣＬ試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＫｉｔ＃３４０９４）、染色試薬ＫｏｄａｋＲＰ−Ｘ−Ｏｍａｔ、およびｘ−フィルム（ＫｏｄａｋＸ−ｆｉｌｍ＃ＸＢＴ−１）を使用した。ウェスタンブロット結果は、相対アフィニティに関係なく抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の特異性を実証し、従って、２つ以上の成功した抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体が同定される。結果は、最高の相対アフィニティおよび特異性を有するモノクローナル抗体クローンがクローン７Ｃ５Ｂ２であることを示す。Ａ〜Ｃは、ＤＥｓｐＲに対するモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２およびポリクローナル抗体調製物による血管新生の異なるパラメータの阻害を示す。７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は、管形成を受けるＨＵＶＥＣ、膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１、および乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫染色することが示された。図１１Ａは、新生血管の複雑さの尺度としての分枝点の平均数を示し、新生血管密度の尺度としての管の全長が図１１Ｂに示される。図１１Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２によるインビトロの血清誘導性ＨＵＶＥＣ管形成の濃度依存性阻害を示す。２％のＦＢＳ（対照）、または２％のＦＢＳ＋モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（０．０５〜５００ｎＭ）が補充された基本培地中、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上に成長させた。血清誘導性管形成の割合は、対照条件下で成長させたＨＵＶＥＣと、指示されたモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２補充培地中で成長させたＨＵＶＥＣとの間の差異として決定した。インビトロ管形成アッセイにおけるウェル当たりの管の全長の％およびウェル当たりの分枝点の総数が与えられる。データは、平均±標準誤差で示される。各実験条件を５つのレプリカウェルにおいて実施した。管の全長のＥＣ_５０＝４．３４±０．４５ｎＭ、＃分枝点のＥＣ_５０＝３．９７±０．５１ｎＭ。Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌（図１２Ａ）およびＰＡＮＣ−１膵癌（図１２Ｂ）細胞株における腫瘍細胞侵襲性を阻害することを実証する（Ｐ＜０．００１^＊、＜０．０１^＊）。図１２Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞侵襲の阻害の用量反応曲線を示す（ＥＣ_５０＝３．５５±０．３２ｎＭ）。データは、５回の繰り返しの平均±標準誤差である。^＊Ｐ＜０．００１、^＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡ、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。Ａ〜Ｄは、インビトロ血清誘導性ＨＵＶＥＣ管形成に対する抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）の効果を示す（確立したインビトロ血管新生アッセイ）。２％のＦＢＳ（対照Ｃ１）、または２％のＦＢＳ＋ポリクローナル抗ｈＤＥＳＰＲ抗体の免疫前ＩｇＧアイソタイプ対照（５００ｎＭ、対照Ｃ２）、または２％のＦＢＳ＋抗ｈＤＥＳＰＲｍＡＢのＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（５００ｎＭ、Ｃ３対照）、または２％のＦＢＳ＋ポリクローナル抗ｈＤＥｓｐＲ（５００ｎＭ、Ｐ）、または２％のＦＢＳ＋モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（５００ｎＭ、Ｍ）が補充された基本培地中、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上に成長させた。インビトロ管形成アッセイを用いて、ウェル当たりの形成された管の平均数定量分析は図１３Ａに示され、ウェル当たりの分枝点の平均数は図１３Ｂに示され、ウェル当たりの接続の平均数は図１３Ｃに示され、ウェル当たりの管の平均全長（ｍｍ）は図１３Ｄに示される。データは、平均±標準誤差で示される。各実験条件を５つのレプリカウェルにおいて実施した。統計的有意差（それぞれの対照条件と比較して）は以下のように示される：^＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。Ａ〜Ｂは、抗ヒトＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いて、同じスライド上の腫瘍および正常組織を表すコア生検標本で構成されるヒト腫瘍組織アレイの免疫組織化学的分析を示す。ホルマリン固定したパラフィン包埋コア生検切片を用いて、特異性および検出感度を最適化する条件をまず検査した。二重免疫蛍光実験を実施して、ヒトＤＥｓｐＲ発現およびＣＤ１３３発現（後者は癌幹細胞のマーカーとしての機能を果たす）を評価した。抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を１：１０、市販の抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を１：２０希釈で用いて、抗原回復を実施した。抗ヒトＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いるヒト腫瘍組織アレイの代表的な免疫組織化学的分析により、図１４Ａに示されるように、ＩＩ期の肺癌腫瘍細胞においてｈＤＥｓｐＲ（Ａｌｅｘａ−５６８ｒｅｄ）の発現の増大が検出された。いくつかの腫瘍細胞はヒトＤＥｓｐＲおよびＣＤ１３３の両方に対して二重陽性で免疫染色され、他の腫瘍細胞は、ＣＤ１３３に対してのみ免疫染色された。これらの観察は、ヒトＤＥｓｐＲがＣＤ１３３陽性癌幹細胞、およびＣＤ１３３陰性腫瘍細胞にも存在することを実証する。図１４Ｂに示されるように、対照的に、正常な肺標本は、ヒトＤＥｓｐＲまたはＣＤ１３３に対して免疫染色を示さない。Ａ〜Ｂは、正常なヒト膵臓には最小限のＤＥｓｐＲ発現があり（図１５Ｂ）、α平滑筋アクチンが正の対照としての機能を果たすが、対照的に、ＩＶ期の膵癌腫瘍細胞および腫瘍血管はＤＥｓｐＲ発現の増大を示す（図１５Ａ）ことを示す。Ａ〜ＤはＤＥｓｐＲ標的化超音波分子イメージングを実証し、ＤＥｓｐＲ特異的抗体（図１６Ａ）がＤＥｓｐＲ＋内皮病変（図１６Ｂ）および栄養血管の血管新生（図１６Ｃ）を検出することを示す。コントラスト強度の定量化は、統合されたＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓＭｉｃｒｏ−ｉｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて行われ（図１６Ｄ）、ＤＥｓｐＲ（−）内皮および栄養血管における低コントラスト強度、およびアイソタイプ−微小気泡対照のいずれとも対照的に、ＤＥｓｐＲ＋頸動脈内皮および栄養血管におけるコントラスト強度の増大を実証する。Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡおよびペアワイズ多重比較。抗ＤＥｓｐＲ抗体はビオチン化され、超音波分析およびイメージングのためにストレプトアビジン−ＰＥＧ被覆された市販の微小気泡に結合される。Ａ〜Ｆは、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を用いて、ヒト乳房組織におけるＤＥｓｐＲ発現（図１７Ａ〜１７Ｃ）、正常、グレード−１、Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＥｓｐＲ発現（図１７Ｄ〜１７Ｆ）の免疫組織化学的分析を示す。図１７Ａは正常な乳房組織を示し、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは乳房筋上皮細胞におけるａＳＭＡ発現を検出するが、上皮細胞および微小血管におけるＤＥｓｐＲの発現は検出されない。図１７ＢはＤＥｓｐＲおよびＤＡＰＩ核染色の２Ｘ−免疫蛍光オーバーレイを示し、正常な乳房組織においてＤＥｓｐＲ発現がないことを確認する。図１７ＣはＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光および拡散コントラスト（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎｃｏｎｔｒａｓｔ）イメージング（ＤＩＣ）の４Ｘ−オーバーレイであり、正常な乳房上皮および内皮における組織モルホロジー、ａＳＭＡの発現、およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を描写する。図１７Ｄは、Ｇｒ．Ｉ−Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイであり、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、および乳房組織におけるａＳＭＡとの共存を検出する。図１７Ｅは、パネル１７Ｄに示される乳癌のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイであり、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。図１７Ｆは、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲ、ＤＩＣの４Ｘ−オーバーレイであり、上皮細胞および微小血管の組織モルホロジーを有するＤＥｓｐＲ空間的発現を解明する。バー＝２０ミクロン。Ａ〜Ｆは、正常な膵臓組織（図１８Ａ〜１８Ｃ）正常、およびグレード−３、Ｔ３膵管癌（図１８Ｄ〜１８Ｆ）におけるＤＥｓｐＲ発現のモノクローナル抗体免疫組織化学的分析を示す。図１８Ａは、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイによる正常膵臓組織が、微小血管において最小限のＤＥｓｐＲ発現を検出することを示す。図１８Ｂは、組織モルホロジーのＤＩＣイメージングと共に、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩの４Ｘ−免疫蛍光オーバーレイを示す。図１８Ｃ（左）は、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイを示し、（右）は、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ、および組織モルホロジーのための拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４ｘ−オーバーレイを示し、正常な内皮におけるａＳＭＡの発現およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を示す。図１８Ｄは、Ｇｒ．３−Ｔ３膵管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイが、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現およびａＳＭＡとの共存を検出することを示す。図１８Ｅは、図１９Ｄに示される画像のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイを示し、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。図１８Ｆは、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲの３Ｘ−オーバーレイを示し、膵管癌細胞におけるＤＥｓｐＲ発現の増大を示す。バー＝２０ミクロン。Ａ〜Ｅは、代表的な造影超音波（ＣＥＵ）画像を示し、コントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）が描かれる。図１９Ａは、ＭＢ_ＤのＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングを示す。遺伝子導入ラット−Ｒ１は、ＣＥＵ陽性イメージングおよび音響破壊の後のＣＩＳピークの特徴的な降下を実証する（｜）。図１９Ｂは、その後の遺伝子導入ラット−Ｒ１におけるアイソタイプ微小気泡（ＭＢ_Ｃ）イメージングを示し、低ピークのＣＩＳレベルならびにＣＩＳの破壊前および破壊後の「平らな（ｆｌａｔ−ｌｉｎｅ）」パターン（ＣＩＵ陰性イメージングを示す）を示す。図１９Ｃは、非遺伝子導入ラット−Ｒ２におけるＭＢ_ＤＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングを示し、ＭＢ_ＣＣＥＵ陰性イメージングと同様のＣＥＵ陰性イメージングを実証する。図１９Ｄは、種々の研究群の中のＣＩＳ差（Δ）のグラフを示し、ＴｇＭＢ_ＤＣＥＵ＋群におけるＣＥＵ陰性イメージングのイメージングが他のＣＥＵ陰性群から区別されることが記録される。図２０Ｅは、全ての遺伝子導入ラット（Ｔｇ＋）および非遺伝子導入ラット（ｎｏｎＴｇ）の間のＣＩＳ差のグラフを示す。斜線バーは、ＭＢ_Ｄ注入ＣＥＵ＋と、ＭＢ_Ｄ注入ＣＥＵ遺伝子導入ラットとの間の閾値を表す。ＭＢのボーラス注射の１分後の血液プール、ＣＥＵ画像は、種々のラットの中での同等のＭＢ注入および動きアーチファクトからの最小限のコントラスト強度シグナルを実証する。１−Ｐｒｅ、標的（もしあれば）のＭＢへの接着を可能にするために、そして内腔中の最小限の（もしあったとしても）循環ＭＢを記録するために、ボーラス注入の４分後から得られる音響破壊前ＣＥＵ画像。ＣＩＳプロット上の＃１に相当する画像。２−Ｐｏｓｔ、散乱プロット上の＃２に相当する音響破壊後のＣＥＵ画像。ＣＩＳ−ｐｌｏｔ、代表的な対象領域（水色で包囲）におけるコントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）の散乱プロット。＃１、音響破壊前に検出されたＣＩＳ；＃２、音響破壊後に検出されたＣＩＳ（２）。黒線およびその後の間隙は、ＣＩＳ散乱プロットにおける音響破壊の期間を記す。ＭＢ_Ｄ、ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡；ＭＢｃ、対照アイソタイプ標的化微小気泡；Ｔｇ、遺伝子導入ラット；非Ｔｇ、非遺伝子導入対照ラット；ＣＥＵ＋、ＣＥＵ陽性イメージング；ＣＥＵ−、ＣＥＵ陰性イメージング、Δ コントラスト強度、破壊前／破壊後ＣＩＳ差；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ａ〜Ｈは、代表的なＭＢ_Ｄ特異的造影超音波（ＣＥＵ）陽性画像を示し、遺伝子導入ラット、Ｒ３における接着ＭＢ_Ｄ微小気泡の音響破壊の複雑なパターンが示される。図２０Ａは代表的なＣＥＵ画像を示し、ボーラス注入の１分後に頸動脈内腔を充満する循環ＭＢ_Ｄの血液プールが記録される。ＣＣＡ、総頸動脈；ＥＣＡ、外頸動脈；ＩＣＡ、内頸動脈；^＊、ＣＣＡ分岐点。図２０Ｂ〜２０Ｄは、パネル２０Ｅ中の対応する対象領域（ＲＯＩ）指すために同じ破線ブロックが記された、コントラスト強度シグナルの散乱プロットを示す。（２０Ｂ）白い実線；（２０Ｃ）、白い斜線；（２０Ｄ）白い点線のＲＯＩ。図２０Ｅは、散乱プロットｂ、ｃ、ｄ上の＃１に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、音響破壊前の直前の接着ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢ_Ｄ）が記録される（黒い線）。接着ＭＢ_Ｄは、白い実線、白い斜線、および白い点線で包囲された３つのＲＯＩにおいて見られる。図２０Ｆは、散乱プロットｂ〜ｄ上の＃２に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、異なるＲＯＩの＃１におけるレベルとそれぞれ比較したシグナル強度の音響後破壊低下が示される。図２０Ｇは、散乱プロットｂ〜ｄ上の＃３に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、異なるＲＯＩにおけるコントラスト強度シグナルにおける音響後破壊二次ピークが示される。図２０Ｈは、散乱プロット上の＃４に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、アイソタイプ対照またはＭＢ_Ｄ注入ＣＥＵ陰性画像において観察されるベースラインレベルに近づくコントラスト強度シグナルの低下が記録され、低バックグラウンドＣＩＳレベルが実証される。Ａ〜Ｈは、ラット−Ｒ１（パネル２１Ａ〜２１Ｄ）、およびラット−Ｒ３（パネル２１Ｅ〜２１Ｈ）に対応する、ＤＥｓｐＲ陽性分子イメージングを用いる頸動脈の代表的な組織学的および蛍光免疫染色分析を示す。図２１Ａは、頸動脈内皮のマッソントリクローム染色切片を示す。図２１Ｂ〜２１２Ｃは、ＤＥｓｐＲ発現の蛍光免疫染色およびＤＡＰＩ核染色がオーバーレイされた微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を示す。図２１Ｄは、内皮のＤＩＣ画像がオーバーレイされた対照のアイソタイプａｂ免疫染色およびＤＡＰＩ核染色を示す。図２１Ｅは頸動脈マッソントリクローム染色切片を示し、外膜栄養血管の新血管の増大が示される。囲まれた領域は図２１Ｆではより高い倍率で示され、ｒｂｃ−充填栄養血管が記録される。図２１Ｇは蛍光免疫染色を示し、栄養血管および周囲細胞におけるＤＥｓｐＲ陽性発現が検出される。図２１ＨはαＳＭＡおよびＤＥｓｐＲによる二重免疫染色を示し、ＤＥｓｐＲ陽性新血管におけるαＳＭＡの同時発現が検出される。→、接着ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡ＭＢ_Ｄ；白い矢じりは、パネル２１Ｇおよび２１Ｈにおける栄養血管の新生血管を指し示す；ｍ、培地；バー＝１０ミクロンパネル２１Ａ〜２１Ｄ、２１Ｆ；２０ミクロンパネル２１Ｅ、２１Ｇ、２１Ｈ。Ａ〜Ｅは、ＭＢ_Ｄ特異的ＣＥＵ陽性イメージング（２２Ｂ、２２Ｃ）およびＣＥＵ陰性イメージング（２２Ｄ、２２Ｅ）を示すラットからの頸動脈の代表的な蛍光免疫染色分析を示す。図２２Ａは、破壊前ＣＩＳピークレベルの散乱ドットプロットを示し、ＭＢ_Ｄ特異的ＣＥＵ陽性（ＣＥＵ＋）とＣＥＵ陰性（ＣＥＵ−）イメージングとの間の閾値（斜線バー）が強調される。図２２Ｂは、頸動脈内皮および拡張した栄養血管のＤＥｓｐＲ陽性免疫染色；培地中の平滑筋細胞（ＳＭＣ）におけるαＳＭＡ陽性免疫染色を示す。いくらかの栄養血管の新血管はＤＥｓｐＲおよびαＳＭＡに対して二重免疫染色される。図２２Ｃは、対応するＤＩＣ画像を示し、頸動脈および栄養血管の構造層が示される。図２２Ｄは、ＣＥＵ陰性イメージングを示すラット頸動脈（本明細書では、非Ｔｇラット−Ｒ２で示される）において、代表的な最小限〜全くないＤＥｓｐＲ発現を示す。ＣＥＵ陰性遺伝子導入ラットの頸動脈から同様の画像が得られる。αＳＭＡ免疫染色は、培地中のＳＭＣの発現を検出する。培地中の低レベルのαＳＭＡ免疫染色は両方の頸動脈における合成ＳＭＣ表現型を示し、高血圧のリモデリングと一致する。図２２Ｄは、対応するＤＩＣ場像を示し、頸動脈および外膜の構造層が示され、栄養血管の拡張はない。バー＝２０ミクロン（２２Ｂ、２２Ｃ）、１０ミクロン（２２Ｄ、２２Ｅ）。ｍ、培地；ａｄｖ、外膜；白い小さい矢印、内皮；白い大きい矢印、栄養血管。Ａ〜Ｇは、インビトロでの抗ヒトＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢ_Ｄ）のヒト内皮細胞ＨＵＶＥＣへの結合の位相コントラスト蛍光顕微鏡分析を示す。増大するＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢ_Ｄ）対細胞比は、（２３Ａ）８×、（２３Ｂ）８０×、および（２３Ｃ）８００×である。（２３Ｄ）アイソタイプ対照（ＭＢ_Ｃ）は８００×であり、（２３Ｅ）非標的化対照ＭＢ_Ｏは８００×である。（２３Ｆ）ＨＵＶＥＣの％であり、結合ＭＢ（■）およびＭＢ結合なし（□）である。図２３Ｇは、ＭＢ対細胞比を増大させて、結合細胞当たりのＭＢの数（平均＋／−ｓｅｍ）を示す。ＭＢ_Ｄは、アイソタイプ対照ＭＢ_Ｃおよび対照非標的化ＭＢ_Ｏと比較する。^＊＊＊、ＡＮＯＶＡＰ＜０．０００１。Ａ〜Ｆは、肝臓（２４Ａ〜２４Ｃ）および膵臓（２４Ｄ〜２４Ｆ）の非癌性および癌性組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２４Ａ）隣接の正常肝臓組織；（２４Ｂ、２４Ｃ）２人の患者からの肝癌Ｔ−２；（２４Ｄ）、隣接の正常膵臓組織；（２４Ｅ、２４Ｆ）２人の患者からの膵管癌グレードＩＩＩ−ＩＶ。黒い矢印、微小血管；発現にほぼ比例する色の強度を有する、ＤＥｓｐＲ陽性免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン。Ａ〜Ｆは、ヒト組織アレイ：胃（２５Ａ〜２５Ｃ）および乳房（２５Ｄ〜２５Ｆ）の非癌性および癌性組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２５Ａ）隣接の正常胃組織；（２５Ｂ）胃癌Ｔ−３、（２５Ｃ）胃癌の肺への転移；（２５Ｄ）線維症を有する隣接の正常乳房組織；（２５Ｅ）胸部髄様癌（ｂｒｅａｓｔｍｅｄｕｌｌａｒｙｃａｒｃｉｎｏｍａ）Ｔ−２；（２５Ｆ）乳房腫瘍のリンパ節への転移。黒い矢印、血管内皮；発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ陽性免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン。Ａ〜Ｆは、肺および結腸の非癌性および癌組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２６Ａ）隣接の正常肺；（２６Ｂ）Ｇｒ−Ｉ肺腺癌；（２６Ｃ）、Ｇｒ．ＩＩＩ，Ｔ２肺腺癌；（２６Ｄ）隣接の正常結腸；（２６Ｅ、２６Ｆ）結腸腺癌Ｇｒ．ＩＩＩ−ＩＶ、Ｔ２。白い矢印、内皮；黒い矢印→、癌細胞における核膜のＤＥｓｐＲ免疫染色。発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン２６Ａ〜２６Ｃ；２５ミクロン２６Ｄ；１０ミクロン２６Ｅ、２６Ｆ。Ａ〜Ｆは、種々の組織型の癌細胞株におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２７Ａ）非小細胞肺癌細胞株、＃ＮＣＩ−Ｈ７２７；（２７Ｂ）結腸癌、ＳＷ４８０Ｄｕｋｅ型Ｂ；（２７Ｃ）膵癌、ＰＡＮＣ−１；（２７Ｄ）乳腺癌転移、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；（２７Ｅ）膀胱癌２５３ＪＢＶ；（２７Ｆ）前立腺腺癌ＰＣ−３ｍｍ２。→、癌細胞における核膜のＤＥｓｐＲ免疫染色、発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロンＡ〜Ｆ。Ａ〜Ｂは、ヒト特異的抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の特徴付けを示す。（２８Ａ）１０の候補モノクローナル抗体クローンの間接ＥＬＩＳＡによる分析が示される。１μｇ／ｍｌのｍＡｂを含有する上清からの連続希釈は、以下のように検査した：１＝１／２、２＝１／４、３＝１／８、４＝１／１６、５＝１／３２、６＝１／６４、７＝１／１２８、８＝１／２５６、９＝１／５１２、１０＝１／１０２４、１１＝１／２０４８および１２＝１／４０９６。白いひし形、選択されたＭａｂ７ｃ５ｂ２クローン、オープンシンボル、他のすべて。（２８Ｂ）精製Ｍａｂ（レーン１〜３）、および「スーパークローン」上清（レーン４〜６）、および対照としての機能を果たすＰＢＳ（レーン７）のウェスタンブロット分析が描かれる。レーン１および４の７Ｃ５Ｂ２Ｍａｂを選択（ひし形）。抗ＤＥｓｐＲＭａｂ免疫染色および抗ＶＥＧＦｓｐ免疫染色によるＨＵＶＥＣの二重免疫染色を実施し、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐの共存を決定した。Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体によるＤＥｓｐＲ阻害が、インビトロＨＵＶＥＣアッセイにおいて血管新生を低減することを実証する。抗ＤＥｓｐＲＭａｂを用いるＨＵＶＥＣのＤＥｓｐＲ免疫染色を実施した。（２９Ａ）ＥＣ_５０＝４．３４＋／−０．４５ｎＭを有する管の全長／ウェル（○）、およびＥＣ．_５０３．９７＋／−０．５１ｎＭを有する管の分枝点の数（●）を測定する、血管新生の抗ＤＥｓｐＲＭａｂ阻害の用量反応曲線。（２９Ｂ）対照の非処置細胞（３０Ｃ）、免疫前血清（ＰＩ）およびＰａｂおよびＭａｂそれぞれのＩｇＧ２ｂアイソタイプ（Ｉｓｏ）対照と比較した、抗ＤＥｓｐＲポリクローナル（Ｐａｂ）およびモノクローナル（Ｍａｂ）抗体によるＤＥｓｐＲ阻害の際の管の全長変化の分析。（２９Ｃ）対照（Ｃ、ＰＩ、Ｉｓｏ）と比較した、ＰａｂおよびＭａｂ抗ＤＥｓｐＲａｂ阻害により阻害される分枝点の平均数（＃）の分析。データは、４回の繰り返しの平均＋／−ｓｅｍで表される。^＊、Ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体によるＤＥｓｐＲ阻害が、インビトロＨＵＶＥＣアッセイにおいて血管新生を低減することを実証する。抗ＤＥｓｐＲＭａｂによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＰＡＮＣ−１膵癌細胞株のＤＥｓｐＲ陽性免疫染色を実施した。（３０Ａ）ＭＤＡ＝ＭＢ−２３１乳癌細胞侵襲性の抗ＤＥｓｐＲＭａｂにより増大するＤＥｓｐＲ阻害の用量反応曲線（黒）、ＥＣ_５０＝３．５５＋／−０．３２ｎＭ。（３０Ｂ〜３０Ｃ）対照の非処置細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（３１Ｂ）、およびＰＡＮＣ−１膵臓細胞株（３１Ｃ）と比較した、抗ＤＥｓｐＲＭａｂ阻害により阻害される細胞侵襲性の分析。全てのデータは、４回の繰り返しの平均＋／−ｓｅｍで示される；^＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。Ａ〜Ｆは、ヒト乳房組織におけるＤＥｓｐＲ発現の免疫組織化学的分析を示す。（３１Ａ〜３１Ｃ）正常；（３１Ｄ〜３１Ｆ）グレード−１、Ｔ１侵襲性腺管癌。３１Ａ．正常乳房組織：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは、乳房筋上皮細胞においてａＳＭＡ発現を検出するが、上皮細胞（白い三角の矢じり→）および微小血管（白い円形矢じり）におけるＤＥｓｐＲの発現は検出しない。３１Ｂ、ＤＥｓｐＲおよびＤＡＰＩ核染色の２Ｘ−免疫蛍光オーバーレイは、正常乳房組織においてＤＥｓｐＲ発現がないことを確認する。３１Ｃ、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光および拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４Ｘ−オーバーレイは、組織モルホロジー、正常乳房上皮および内皮におけるａＳＭＡの発現、およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を描く。３１Ｄ、Ｇｒ．Ｉ−Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイは、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、および乳房組織におけるａＳＭＡとの共存を検出する。３１Ｅ、パネルｄに示される乳癌のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイは、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。３１Ｆ、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲ、ＤＩＣの４Ｘ−オーバーレイは、組織モルホロジーと共にＤＥｓｐＲの空間的発現を明らかにする。（白い三角の矢じり→）、上皮細胞；（白い円形矢じり）、微小血管。ＤＥｓｐＲ陽性；ａＳＭＡ陽性；ＤＡＰＩ核染色；ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲの共存；バー＝２０ミクロン。Ａ〜Ｆは、抗ＤＥｓｐＲＭａｂを用いる膵臓組織におけるＤＥｓｐＲ発現の免疫組織化学的分析を実証する。（３２Ａ〜３２Ｃ）正常；（３２Ｄ〜３２Ｆ）グレード−３、Ｔ３膵管癌。（３２Ａ）正常膵臓組織：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは、パネル３２Ｂにおいてより良く見られる微小血管における最小限のＤＥｓｐＲ発現を検出する。（３２Ｂ）４Ｘ−免疫蛍光オーバーレイ：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ、および組織モルホロジーのＤＩＣイメージング。（３２Ｃ）左：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイ；右：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩおよび組織モルホロジー拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４ｘ−オーバーレイは、正常内皮において、ａＳＭＡ発現および非／最小限のＤＥｓｐＲの発現を示す。（３２Ｄ）Ｇｒ．３−Ｔ３膵管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイは、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、およびａＳＭＡとの共存を検出する。（３２Ｅ）パネル３２Ｄに示される画像のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイはＤＥｓｐＲ発現を強調する。（３２Ｆ）ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲの３Ｘ−オーバーレイは、膵管癌細胞におけるＤＥｓｐＲ発現の増大（白い→）を示す。上皮細胞；（白い円形矢じり）、微小血管。ＤＥｓｐＲ陽性；ａＳＭＡ陽性；ＤＡＰＩ核染色；ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲの共存；バー＝２０ミクロン。７Ｃ５Ｂ２ハイブリドーマから得られる抗体のＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル分離を実証する。ＳＹＢＲ（登録商標）ＳａｆｅＤＮＡゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃａｔ．ｎｏ．Ｓ３３１０２）によりゲルを染色し、紫外光に関して撮影した。サイズマーカー（Ｌ）は、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ^ＴＭ１ＫｂＰｌｕｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓｃａｔ．ｎｏ．ＳＭ１３３１）である。ＩｇＧＶＨ、ＩｇＭＶＨ、ＩｇκＶＬおよびＩｇλＶＬのそれぞれに対する定常領域プライマーを有するマウスシグナル配列に対する縮重プライマープールを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。７Ｃ５Ｂ２抗体の可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:４）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:３）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。複合７Ｃ５Ｂ２抗体の可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:９）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:８）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１３）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２１）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１４）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２２）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１５）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２３）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１６）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２４）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１７）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２５）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１８）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２６）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１９）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:２７）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。

従って、本明細書には、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体または改変されたヒト抗体の産生において使用するための可変重鎖および軽鎖配列が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、
Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V S G F S L T S Y D I S W I R Q P P G K G L E W L G V I W T G G G T N Y N S A F M S R L T I S K D N S K S T V Y L Q M N S L R A E D T A I Y Y C V R D R D Y D G W Y F D V W G Q G T T V T V S S (SEQ ID NO: 13);
Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V S G F S L T S Y D I S W I R Q P P G K G L E W L G V I W T G G G T N Y N S A F M S R L T I S K D N S K N T V Y L Q M N S L R A E D T A I Y Y C V R D R D Y D G W Y F D V W G Q G T T V T V S S (SEQ ID NO: 14);
Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V S G F S L T S Y D I S W I R Q P P G K G L E W L G V I W T G G G T N Y N S A F M S R F T I S K D N S K N T V Y L Q M N S L R A E D T A I Y Y C V R D R D Y D G W Y F D V W G Q G T T V T V S S (SEQ ID NO: 15);
Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V S G F S L T S Y D I S W I R Q P P G K G L E W L G V I W T G G G T N Y N S A F M S R L T I S K D N S K N T V Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C V R D R DY D G W Y F D V W G Q G T T V T V S S (SEQ ID NO: 16); および
Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V S G F S L T S Y D I S W I R Q P P G K G L E W L G V I W T G G G T N Y N S A F M S R F T I S K D N S K N T V Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C V R D R D (SEQ ID NO: 17の残基1〜100)
からなる群から選択される可変重（Ｖ_Ｈ）鎖アミノ酸配列を含むことができる。

材料および方法
細胞株および抗体の発生
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＰＳ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。ＰＡＮＣ−１細胞は、高グルコース、１０％ＦＢＳおよびＧＰＳを有するＤＭＥＭ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で保持した。ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣは、ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手し、２％ＦＢＳおよびＧＰＳを含有するＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉａ−２（ＥＧＭ−２）中に保持した。モノクローナル抗体の発生は、ｈＤＥｓｐＲの９アミノ酸ＤＥｓｐＲＮＨ_２末端ペプチド、Ｍ_１ＴＭＦＫＧＳＮＥ_９（SEQ ID NO:２０）を抗原として用いて、ＰｒｏＭａｂＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって特注で実施した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングおよび候補モノクローナル抗体の最初の特徴付けは、遊離ｈＤＥｓｐＲ抗原ペプチドを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより実施した。

ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によるモノクローナル抗体の特徴付け
Ｍ_１ＴＭＦＫＧＳＮＥ_９（SEQ ID NO:２０）抗原ペプチドを、マイクロタイタープレートのウェル上に直接被覆した。一次抗体の適切な希釈物を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルを、１：９０００のＨＲＰ標識化抗ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡｃａｔ＃Ａ０１６８）と共に３７℃で１時間インキュベートした。３，３'５，５'−テトラメチルベンジジン基質（３７℃で１０分間のインキュベーション）の添加によって反応を視覚化し、４５０ｎｍで分光光度的に読み取った。ウェスタンブロット分析は、ｈＤＥｓｐＲを安定的に発現するＣｏｓ１細胞トランスフェクタントからの全細胞タンパク質抽出物（４０μｇ）［１７］と、ｈＤＥｓｐＲ特異的合成ペプチドに対して産生された、対応する候補モノクローナル抗体とを等量で用いて、記載されるように行った［１７］。免疫反応性のｈＤＥｓｐＲ（１０ｋＤａのポリペプチド）は、ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる化学発光により検出した。