JP2013534416A - 新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 - Google Patents

新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＧＩＮ６１１）ＫＣＴＣ１１７０８ＢＰ又はその細胞抽出物、糖分解活性を示す新規酸化還元酵素、これをコード化する遺伝子及び組換えベクタータンパク質、又は組換えタンパク質をコード化する発現ベクターを含む組換え菌株等を提供し、これらを生触媒として使用して天然物を糖分解する方法を提供する。また、これらを利用して多様な天然物の無糖体を生産する方法を提供する。本発明の新規微生物から分離した新規な酵素は、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）群に属さず、酸化還元酵素群に属する酵素であって、天然物の糖分解活性を有する。この新規な酸化還元酵素は、天然物配糖体から糖を酸化させることにより、多様な無糖体を生産可能にする。

Description

本発明は、土壌から分離した新規微生物と、その微生物から分離した酸化還元酵素、ならびにこれらを利用した多様な植物配糖体の糖分解反応及び多様な無糖体を生産する方法に関する発明である。
高麗人蔘（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ． Ｍｅｙｅｒ）は、韓国、中国、日本等のアジア国家において伝統的に各種疾病の治療及び予防に使用されてきた薬材の一つである。ジンセノサイドと呼ばれる高麗人蔘サポニンは、こうした高麗人蔘の主要有効成分であって、抗老化、抗炎症、中枢神経系と心血管系及び免疫系における抗酸化活性、抗糖尿活性及び抗腫瘍活性等、多様な生理活性を有するものと知られている。
現在までに、約４０余種のジンセノサイドが分離同定されており、ダンマラン（ｄａｍｍａｒａｎｅ）構造の無糖体を含むグリコシド（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）であるジンセノサイドは、プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）系、プロトパナキサトリオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）系に大きく分けることができる。プロトパナキサジオール系サポニンに属するジンセノサイドは、主にＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄが大部分を占め、プロトパナキサトリオール系サポニンに属するジンセノサイドは、主にＲｅとＲｇ１が大部分である（図１、図２参照）。
ジンセノサイドは、摂取後、ヒトの腸内微生物によって代謝され、その代謝産物が多様な生理活性を有するものと知られている。たとえば、代表的なプロトパナキサジオール系サポニンであるＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃは、ヒトの腸内細菌によってＣＫに代謝され、プロトパナキサトリオール系サポニンであるＲｅとＲｇ１は、腸内細菌によってＲｈ１や或いはＦ１に代謝されて、多様な生理活性を示す。ＣＫの場合は、腫瘍の侵入を防ぎ、腫瘍形成を予防する抗転移又は抗癌効果を誘導するものと知られており、無糖体であるＰＰＤ（Ｓ）は、それに糖が付いているＲｈ２に比べて生理活性効果が高いという研究がある。
したがって、ジンセノサイドを、糖が減少した代謝産物の形態に転換させようとする研究が進められてきた。酵素的方法以外に、弱酸加水分解反応、アルカリ分解等の方法が報告されているが、こうした方法は、エピマー化（ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、ヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）等といった様々な副反応を引き起こさせるため、最近では、酵素や腸内微生物等を利用した活性ジンセノサイドへの転換方法が研究されている。しかし、報告された一部微生物の場合、大部分が腸内微生物であって嫌気性微生物である場合が多いため、産業的利用に限界がある。また、大部分の酵素が、無糖体に転換する活性がほとんどなく、それぞれの特異性を有するため、特定のジンセノサイドの生産にのみ応用され得るという限界を有している。
現在までに報告されたところによると、ジンセノサイドＲｂ１から腸内細菌によって代謝された産物であるＣＫまでの生変換についての研究は多く行われているが、無糖体についての生産研究は不足している。また、サポニン骨格に一つの糖を持っているジンセノサイドは、微生物酵素によってそれ以上分解されないものと多く報告されている。しかし、無糖体形態のジンセノサイドは、血流を介してより容易に吸収されて、活性型の化合物として作用するものと知られている。また、多様なジンセノサイドの骨格である無糖体の生産を通じて、所望の形態のジンセノサイドのみを特定して生産することができる基盤技術となり得る。したがって、ジンセノサイドの無糖体生産に関与する酵素を探索する必要があった。
韓国公開特許第１０−２０００−００６２１４０号公報 韓国特許第１０−０９４５５８７号公報 韓国特許第１０−０９４５５８６号公報
GenBack accession number : JC7628 GenBank accession number : NP_356278
したがって、本発明は、前記問題点を解決するために、新規微生物、その微生物から分離した糖分解活性を示す新規酸化還元酵素、並びにこれをコード化する遺伝子及び組換えタンパク質を用いた多様なジンセノサイドの無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体の生産方法を提供する。
本発明は、新規リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＧＩＮ６１１）ＫＣＴＣ１１７０８ＢＰ又はその細胞抽出物を提供する。
また、本発明は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又はその細胞抽出物を生触媒として使用する天然物の糖分解方法を提供する。
また、本発明は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又はその細胞抽出物を生触媒として使用して、多様な配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）から無糖体（ａｇｌｙｃｏｎｅ）を生産する方法を提供する。
また、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素又はそれを含む細胞抽出物を提供する。
また、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡ、配列番号２の配列からなるＤＮＡ、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、又は配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物を提供する。
また、本発明は、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素又は前記酸化還元酵素を含む細胞抽出物を提供する。
また、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群から選択される生触媒を使用する天然物の糖分解方法を提供する。
また、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群から選択される生触媒を使用して、多様な配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）から無糖体（ａｇｌｙｃｏｎｅ）を生産する方法を提供する。
また、本発明は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、又は配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素を含む細胞抽出物を製造する方法であって、ジンセノサイドを添加して酵素発現を誘導することを特徴とする細胞抽出物の製造方法を提供する。
一般的に、ジンセノサイド糖分解酵素は、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）群に属する酵素として知られている。本発明においては、既存に知られていたグルコシダーゼ群に属していない酸化還元酵素群に属する酵素がジンセノサイドの糖分解活性を有することを確認した。この新規な酸化還元酵素は、既存の糖分解関連酵素群の配列と完全に相違し、酸化還元酵素群と配列類似度があり、天然物配糖体において糖を酸化させることにより自発的な糖分解を誘導して糖を分解する機能をする。
プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ：ＰＰＤ）系ジンセノサイドを示す。 プロトパナキサトリオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ：ＰＰＴ）系ジンセノサイドを示す。 ジンセノサイドＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｋ（ＣＫ）から糖分解を通じて無糖体ＰＰＤ（Ｓ）を生産する目的反応を示したものである。 新規な酸化還元酵素を通じた反応性分析結果である。星印は、酸化されたＣＫを、三角印はＰＰＤ（Ｓ）を示す。線３は３時間反応結果であり、線４は１２時間反応結果である。時間の経過につれて、基質であるＣＫは減少し、中間体に該当する酸化されたＣＫは増加した後に減少する傾向を示し、最終産物であるＰＰＤ（Ｓ）は、時間の経過につれて持続的に増加することを示したものである。 図４において分析された、酸化されたＣＫの質量分析結果を示したものである。 完全培地とＭ９／ジンセノサイド培地において発現されるタンパク質を比較したＳＤＳポリアクリルアミドゲルの結果を示したものである。 完全培地とＭ９／ジンセノサイド培地において培養されたセルから製造されたタンパク質を利用して、反応性を比較した結果を示したものである。 ジンセノサイドを炭素源として育つ新規土壌微生物リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の１６Ｓ ＤＮＡ配列を示したものである。 リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１から生産された酸化還元酵素のアミノ酸配列、及びこれをコード化する遺伝子配列を示したものである。 新規酸化還元酵素の反応メカニズムを示したものである。 新規酸化還元酵素の多様なジンセノサイド及びイソフラボンに対する反応性結果として、本酵素がグルコースに特異的に反応性があることを示したものである。 カメリアシドＡとカメリアシドＢの混合物の糖分解活性を測定した結果を示したものである。 イカリインの糖分解活性を測定した結果を示したものである。
本発明において使用される用語は、当業界において通常的に使用されるものであって、当業者であれば誰でも理解することができるものであるが、本明細書において簡略に説明すると、次のとおりである。
（１）ジンセノサイド：高麗人蔘サポニンであり、高麗人蔘の有効成分
（２）コンパウンドＫ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｋ：ＣＫ）：２０−Ｏ−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（２０−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（３）ジンセノサイドＲｈ２：３−Ｏ−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（３−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（４）ジンセノサイドＦ２：３−Ｏ−（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシー）−２０−Ｏ−（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル）−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（３−Ｏ−（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙ）−２０−Ｏ−（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（５）ジンセノサイドＲｂ１：３−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシー）（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（３−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（６）ジンセノサイドＲｂ２：３−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシー）（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０−Ｏ−［（アルファ−Ｌ‐アラビノピラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（３−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（７）ジンセノサイドＲｃ：３−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシー）（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０−Ｏ−［（アルファ−Ｌ‐アラビノフラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（３−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（８）ジンセノサイドＲｂ３：３−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシー）（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐キシロピラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（３−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（９）ジンセノサイドＦ１：２０−Ｏ−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（２０−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（１０）ジンセノサイドＲｅ：６−Ｏ−［アルファ−Ｌ‐ラムノピラノシル（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０−Ｏ−（ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル）−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール（６−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０−Ｏ−（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）
（１１）ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）：ダイゼイン７−Ｏ−ベータ−Ｄ‐グルコシド（ｄａｉｄｚｅｉｎ ７−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
（１２）ＰＰＤ（Ｓ）：２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（１３）コンパウンドＹ：２０−Ｏ−［（アルファ−Ｌ‐アラビノピラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（２０−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（１４）コンパウンドＭｃ：２０−Ｏ−［（アルファ−Ｌ‐アラビノフラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（２０−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（１５）コンパウンドＭｘ：２０−Ｏ−［（ベータ−Ｄ‐キシロピラノシル）（１，６）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（２０−Ｏ−［（ｂｅｔａ−Ｄ‐ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，６）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）
（１６）ＰＰＴ（Ｓ）：２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール（２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）
（１７）ジンセノサイドＲｇ２：６−Ｏ−［アルファ−Ｌ‐ラムノピラノシル（１，２）−ベータ−Ｄ‐グルコピラノシル］−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール（６−Ｏ−［（ａｌｐｈａ−Ｌ‐ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）（１，２）−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−２０（Ｓ）−ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）
（１８）ダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）：７−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）クロモン−４−オン（７−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ）
（１９）イカリイン（Ｉｃａｒｉｉｎ）：３，４´，５，７−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｐｒｅｎｙｌｆｌａｖｏｎｅ−４´−Ｍｅ ｅｔｈｅｒ−３−Ｏ−ａｌｐｈａ−Ｌ‐ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ， ７−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
（２０）カメリアシドＡ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ａ）：ケンフェロール３−Ｏ−（２−Ｏ−ガラクトピラノシル−６−Ｏ−ラムノピラノシル）グルコピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ３−Ｏ−（２−Ｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｙｌ−６−Ｏ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（２１）カメリアシドＢ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ｂ）：ケンフェロール３−Ｏ−（２−Ｏ−キシロピラノシル−６−Ｏ−ラムノピラノシル）グルコピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ３−Ｏ−（２−Ｏ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ− ６−Ｏ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（２２）グリコン（Ｇｌｙｃｏｎｅ）：配糖体に結合された多様な糖分子
（２３）全細胞反応：細胞を破砕したり、酵素を分離精製したりすることなく、完全な細胞全体を利用した反応
（２４）酸化還元酵素：生体に必要なエネルギーを供給するために酸化還元反応を触媒する酵素。有機化合物の酸化は、大部分が脱水素によって起こる。
（２５）酸化還元酵素抽出物：酸化還元酵素が含まれたリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又は酸化還元酵素を発現する組換えタンパク質の細胞を破砕して得た細胞抽出液
（２２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器：Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）−Ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ
（２６）ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
（２７）ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応−ＤＮＡのある領域を特異的に増幅させる方法
（２８）ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）、ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎからｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎまでの配列をいう
（２９）クローニング：ＤＮＡ切片を組換えＤＮＡクローニングベクターに混入させ、こうした組換えＤＮＡを使用する宿主細胞を形質転換させる方法
（３０）ｂｐ：塩基対
本発明は、新規リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＧＩＮ６１１）微生物又はその細胞抽出物を提供する。本発明においては、多様なジンセノサイド混合物を炭素源として使用して育つ微生物を選別し、選別された微生物のジンセノサイドＣＫを基質として使用した反応性の有無を観察した結果、高い反応性を有することを確認した。
また、本発明の一実施例は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又はその細胞抽出物を生触媒として使用する天然物の糖分解方法を提供する。
前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体、又はフラボノイド配糖体であってよいが、これらに限定されない。
また、本発明の一実施例は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又はその細胞抽出物を生触媒として使用して、多様な配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）から無糖体（ａｇｌｙｃｏｎｅ）を生産する方法を提供する。
前記配糖体は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体、又はフラボノイド配糖体であってよいが、これらに限定されない。
前記無糖体は、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体、又はフラボノイド無糖体であってよいが、これらに限定されない。
前記ジンセノサイド配糖体は、特に制限されるものではないが、たとえば、ジンセノサイドコンパウンドＫ（ＣＫ）、ジンセノサイドＲｈ２、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＦ１、及びジンセノサイドＲｅからなる群より選択されたものを挙げることができ、具体的に、ジンセノサイドコンパウンドＫ（ＣＫ）であってよい。
前記ジンセノサイド無糖体は、特に制限されるものではないが、たとえば、ジンセノサイドＰＰＤ（Ｓ）、ジンセノサイドコンパウンドＹ、ジンセノサイドＭｃ、ジンセノサイドコンパウンドＭｘ、ジンセノサイドＰＰＴ（Ｓ）、及びジンセノサイドＲｇ２からなる群より選択されたものを挙げることができ、具体的に、ジンセノサイドＰＰＤ（Ｓ）であってよい。
前記ジンセノサイド配糖体とジンセノサイド無糖体は、下記表１に示すことができる。
前記イソフラボン配糖体は、特に制限されるものではないが、たとえば、ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）を挙げることができる。
前記イソフラボン無糖体は、特に制限されるものではないが、たとえば、ダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）を挙げることができる。
前記フラボノイド配糖体は、特に制限されるものではないが、たとえば、イカリイン（Ｉｃａｒｌｉｎ）、カメリアシドＡ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ａ）又はカメリアシドＢ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ｂ）を挙げることができる。
また、前記糖分解方法は、天然物の配糖体から糖を酸化させて分解する方法である。たとえば、グルコースの場合、グルコース残基の３位ヒドロキシ基（ＯＨ）を酸化させて自発的に糖分解が起こることになる。
前記糖は、特に制限されるものではないが、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであってよい。
本発明の一実施例は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素又は前記酸化還元酵素を含む細胞抽出物を提供する。前記酸化還元酵素は、好ましくは、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１から分離精製して得たものであってよい。
本発明の一実施例は、配列番号３のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列又は前記酸化還元酵素をコード化するＤＮＡ配列を提供する。前記配列は、具体的に配列番号２である。前記ＤＮＡは、好ましくはリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１から分離精製して得た酸化還元酵素をコード化するＤＮＡである。
また、本発明の一実施例は、配列番号３の配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを提供する。このとき、糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであってよい。
本発明の一実施例は、前記配列番号３のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列、前記配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡ配列、又は前記配列番号２からなるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
本発明の一実施例は、前記組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞及び前記宿主細胞を含む細胞抽出物を提供する。
本発明の一実施例は、配列番号３の配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上相同性を有し、天然物の糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び前記酸化還元酵素を含む細胞抽出物を提供する。
本発明において、前記酸化還元酵素は、制限されるものではないが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．とスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．又はステノトロフォモナーゼ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｅ）ｓｐ．から由来してよい。
本発明の一実施例は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群より選択される生触媒を使用する天然物の糖分解方法を提供する。
本発明の一実施例は、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群より選択される生触媒を使用して、多様な天然物の無糖体を生産する方法を提供する。前記方法は、具体的に、前記生触媒を使用して多様な配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）から無糖体（ａｇｌｙｃｏｎｅ）を生産する方法であり、より具体的に、前記生触媒を使用して、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産する方法である。
本発明の一実施例は、リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、又は配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素を含む細胞抽出物を製造する方法において、ジンセノサイドを添加して酵素発現を誘導することを特徴とする細胞抽出物の製造方法を提供する。
ジンセノサイド糖分解活性を有する酵素を含む微生物の選別
本発明は、土壌微生物の選別のために、本発明者らが下記表２の組成成分からなるジンセノサイドの混合物を炭素源として含む最小培地を構成し、これを利用して土壌からジンセノサイドＣＫに活性を有する酵素を含む微生物を選別した。下記表２は、ジンセノサイド混合物を炭素源とした最小培地成分である。
本発明の最小培地を利用する選別方法は、成長速度に応じて微生物を選別する簡単な方法であり、糖分解活性が低い微生物は培養段階において自発的に除去されるため、活性が高い酵素を含む高活性微生物を選別することができる。
本発明において選別された微生物は新規なものであって、発明者らは、その１６ｓ ｒＲＮＡ部分配列をコード化するＤＮＡ配列の特徴を通じてリゾビウム種として把握し、これをリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１と命名した。また、これをＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に、２０１０年６月４日付にて寄託した。寄託番号は、ＫＣＴＣ１１７０８ＢＰである。
本発明の選別されたリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１から分離した糖分解酵素を利用して基質特異性を確認した結果、この微生物は、ジンセノサイドＣＫに高い活性を示し、ジンセノサイドＣＫ以外の多様なジンセノサイドに糖分解活性があることを知ることができた。本発明者らは、また、前記微生物を破砕してこれを遠心分離し、遠心分離液の上澄み液から活性酵素を含む細胞抽出物を生産した。
糖分解酵素抽出物を生触媒として利用したジンセノサイド無糖体の生産方法
前記収得した微生物又は生産された糖分解酵素抽出物、ジンセノサイドＣＫにより構成された反応液から無糖体ＰＰＤ（Ｓ）を生産する。本発明の微生物又は生産された酵素抽出物を生触媒として反応液に添加して、反応を開始する。
本発明において使用することができる基質は、ジンセノサイドＣＫ以外に、ＰＰＤ系に属するジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｄ、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｈ２があり、ＰＰＴ系に属するジンセノサイドＲｅ、ジンセノサイドＦ１がある。また、イソフラボン系のダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）や、フラボノイド系のイカリイン、カメリアシドＡ又はカメリアシドＢがある。
以下、本発明の実施例を参照しながら、本発明について詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するために例示的に提示したものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明なことである。
実施例１）リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の選別
土壌試料１０ｇを、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５０ｍＬに添加して、常温で２時間攪拌した。混濁液を、濾過紙を利用して浮遊物を濾過した後、濾過された微生物溶液を前記表２の最小培地１０ｍＬに０．２ｍＬ添加し、３０℃で３日間培養する過程を３回繰り返した後、培養液０．２ｍＬを前記液体最小培地と１．５％寒天により構成される固体最小培地に塗抹して、３０℃で２４時間培養し、それぞれの微生物を液体最小培地に３ｍＬずつ培養して反応させ、ジンセノサイドＣＫに活性の高いコロニーを同定した結果、リゾビウム種と命名した。
実施例２）糖分解酵素抽出物の製造
酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）により構成され培地（以下、完全培地）に培養された細胞をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で３回洗浄して、回収された細胞外部の培地成分を除去した。回収された細胞を、細胞の５倍の体積の２０ｍＭリン酸緩衝溶液、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｉｏｌ（ＤＴＴ）により構成された緩衝溶液（以下、破砕溶液）に混濁した後、超音波破砕機を利用して細胞を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上澄み液を回収して最終的な糖分解酵素抽出物を生産した。
実施例３）ジンセノサイド添加による糖分解酵素の発現誘導
表２に提示した液体最小培地（以下、Ｍ９／ジンセノサイド培地）を利用して培養された細胞を、ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄して、回収された細胞外部の培地成分を除去した。回収された細胞を、５倍の体積の破砕溶液に混濁した後、超音波破砕機を利用して細胞を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上澄み液を回収して、最小培地で発現誘導された糖分解酵素を含む細胞抽出物を生産した。
実施例４）完全培地とＭ９／ジンセノサイド培地において製造されたタンパク質の反応性及び発現量の比較
前述した実施例２と実施例３において生産された細胞抽出物のタンパク質量を定量した後、同一の量のタンパク質を使用してジンセノサイドＣＫに対する反応性を比較した。比較した結果、実施例３において生産された細胞抽出物が、実施例２において生産された細胞抽出物に比べて高い反応性が示されることを確認することができた。これを図７に示した。同一の量のタンパク質を使用して反応を送った後、各タンパク質の量に応じて反応性を比較した。結果から見られるところのように、実施例２の完全培地で培養されたセルから製造されたタンパク質の場合、５００以上のタンパク質使用時にジンセノサイドＣＫが完全にＰＰＤ（Ｓ）に変換されるのに対し、実施例３のＭ９／ジンセノサイド培地に培養されたセルから製造されたタンパク質は、１００以上においてジンセノサイドＣＫがＰＰＤ（Ｓ）に変換されることを見ることができた。また、２つの抽出物のタンパク質発現の差を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により比較して、図６に示した。図６において、矢印で表示されたものは、実施例２と実施例３における酵素抽出物のタンパク質発現の程度を比較したときに発現量が異なるタンパク質を示したものである。
実施例５）糖分解酵素の分離精製
新規リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１から図３に示した反応を遂行する酵素を精製するために、１０Ｌジンセノサイドを添加した表２の液体最小培地を利用して微生物を培養した。培養した微生物を、実施例２と同様の方法で酵素抽出物を製造した。製造された酵素抽出物を、６０〜７０％飽和されたアンモニウムサルフェート沈殿分画法を通じて準備した。準備されたタンパク質を、ＦＰＬＣ及び複数のカラムを利用して分離精製した。分離精製されたタンパク質は、最終的に、Ｎａｔｉｖｅ‐ｇｅｌを利用して最終反応性を確認した。
実施例６）精製された酵素を利用したジンセノサイドＣＫのアクティブ調査
実施例５において精製された酵素を利用して、ジンセノサイドＣＫに対する活性を調査した。約１００μｇの酵素液と、０．１ｍＭのＣＫ、５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）を利用して反応体積と同一の量のエチルアセテートを添加後に反応を終了させた後、これをＨＰＬＣを利用して分析した。分析に使用した条件は、８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）等溶離として利用した。結果は、図４に示し、三角印で表示したピークはＰＰＤ（Ｓ）に該当し、星印で表示したピークは酸化されたＣＫを示したものであり、時間の経過につれて、酸化されたＣＫは増加した後に減少し、ＰＰＤ（Ｓ）は継続的に増加することを知ることができた。したがって、新規発見された酵素により、ジンセノサイドＣＫの酸化過程を経て糖が分解されるということを知ることができた。これを図１０に示した。
実施例７）新規酵素のＮ‐末端及び内部ペプチド配列の決定
実施例５において分離精製して得られた酸化還元酵素のＮ‐末端アミノ酸の配列は、１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動後に節をＰＶＤＦ膜に移した後（バイオラッド）、エドマン分析手法を利用するｐｒｏｃｉｓｅ ４９１ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ、カリフ）を利用して決定した。内部ペプチドの配列決定は、配列決定用トリプシン（プロメガ）により処理した後、得られたペプチド断片の配列をＬＴＱ‐ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を利用して分析した後、ＰＥＡＫＳプログラムを利用して配列を決定した。
実施例８）リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１からの全細胞ＤＮＡの単離
完全培地に培養された細胞を、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離して細胞を沈殿させた。上層液を除去し、細胞を１０ｍＬのｌｙｓｉｓ緩衝溶液（１５％スクロース、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液）に溶かした後、１．２ｍＬ ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）と０．１３ｍＬ ｐｒｏｎａｓｅを添加後、３７℃で１０分間放置した。その後、１０％ＳＤＳ １ｍＬを入れ、７０℃で１０分間放置後、氷水に１０分間放置した。その後、５Ｍ酢酸カリウム２．５ｍＬを入れ、氷水に１５分間反応させた。前記溶液の量と同一の量のフェノール−クロロホルム混合物（５０：５０）を入れ、３０分混合した後、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を獲得した。得られた溶液の０．５倍に達するクロロホルムを加え、徐々に混合した後、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を獲得した後、５０／ｍＬの量に達するようにＲＮａｓｅ処理後、３７℃で１時間反応させた。その後、０．８倍に達するイソプロパノールを添加後、２．５倍に達する８０％エタノールを添加し、徐々に揺らした後、パスツールピペットを利用して全細胞ＤＮＡを収集して、１．５ｍＬマイクロチューブに移した後、乾燥させた後に滅菌水に溶かして使用した。
実施例９）ＰＣＲを利用した糖分解酵素の遺伝子配列解析
実施例７を経て得られたＮ‐末端アミノ酸配列と内部配列からプライマーを作製した後、実施例８の過程を経て分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として利用して、酸化還元酵素の部分ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片に特異的に付くプライマーを作製し、逆転写（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法を利用して残りの配列を取得し。Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲに使用された鋳型は、ゲノムＤＮＡ断片をＨｉｎｄ III制限酵素で切断した後、リガーゼを処理してセルフライゲーションがなされたＤＮＡライブラリを使用した。
実施例１０）発現用ベクターへの組換え及び形質転換された大腸菌における発現
得られた酸化還元酵素の遺伝子配列は、それぞれＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素で消化して、その分画をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ‐１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションして組換えプラスミドを生成し、発現用大腸菌であるＲｏｓｅｔｔａ‐ｇａｍｉ２（ＤＥ３）に形質転換させた。得られた形質転換大腸菌は、アンピシリンを含有した培地において培養し、細胞懸濁度が０．３〜０．７となったときにＩＰＴＧを付加し、２０℃で１５時間をさらに培養することにより、酵素の発現を誘導した。
実施例１１）配列番号３の新規酵素と類似度６５％以上の３つの酵素のジンセノサイド及び天然物由来グリコシドのグルコース分解反応性の調査
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．又はステノトロフォモナーゼ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｅ）ｓｐ．由来の、配列番号３と６０％以上のアミノ酸類似度がある酵素をクローニングして、ジンセノサイドに対するグルコース分解反応性を調査した。各微生物由来の酵素は、ジンセノサイドのグルコース残基に、酸化反応を通じて糖分解することを確認した。
実施例１２）誘導発現された酵素を利用した無糖体生産活性の測定
実施例１１において発現が誘導された酵素を、実施例２の酵素製造方法で製造した後、ジンセノサイドＣＫを基質として、無糖体生産活性を測定した。
実施例１３）、多様なジンセノサイド及びイソフラボンを基質とした活性の測定
ジンセノサイドＲｈ２、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｅ、及びイソフラボン系ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）を基質として、前記反応方法に従って反応させた後、同一の量のエチルアセテートを添加して抽出した後、エチルアセテート層を乾燥させた後、エタノールに再び溶かした後、マルディ質量分析器を利用して活性を測定した。
実施例１４）多様な無糖体構造による糖分解活性の測定及びグリコンに対する基質特異性の調査
リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１由来の酸化還元酵素から発現が誘導された酵素を、フラボノイド系イカリイン（Ｉｃａｒｌｉｎ）、カメリアシドＡ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ａ）、カメリアシドＢ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｄｅ Ｂ）を基質として、前記反応方法に従って反応させた後、マルディ質量分析器を利用して活性を測定した結果、カメリアシドＡに付いているガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の酸化反応及び糖分解活性を確認した。また、カメリアシドＢに付いているキシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）の酸化反応及び糖分解活性を確認した。すなわち、フラボノイド系の無糖体構造に結合された糖に対する糖分解活性を示し、グルコース以外に、ガラクトース、キシロースを酸化させた後、糖を分解する機能があることを確認した（図１２及び図１３）。
実施例１５）グリコン結合に対する基質特異性の調査
４−ニトロフェニルアルファ−Ｄ‐グルコピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４−ニトロフェニルベータ−Ｄ‐グルコピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４−ニトロフェニルアルファ−Ｄ‐ガラクトピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４−ニトロフェニルベータ−Ｄ‐ガラクトピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を利用して、アルファ結合及びベータ結合に対する酵素の特異性を調査した結果、アルファとベータともに活性があることを確認した（表３）。

Claims (28)

  1. 新規リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＧＩＮ６１１）ＫＣＴＣ１１７０８ＢＰ。
  2. 請求項１に記載のリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の細胞抽出物。
  3. 請求項１に記載のリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又は請求項２に記載の細胞抽出物を生触媒として使用する天然物の糖分解方法。
  4. 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項３に記載の天然物の糖分解方法。
  5. 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドＫ（ＣＫ）、ジンセノサイドＲｈ２、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｅ、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドＡ及びカメリアシドＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の天然物の糖分解方法。
  6. 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項３に記載の天然物の糖分解方法。
  7. 前記グルコースは、グルコース残基の３位ヒドロキシ基（ＯＨ）を酸化させて分解することを特徴とする、請求項６に記載の天然物の糖分解方法。
  8. 請求項１に記載のリゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１又は請求項２に記載の細胞抽出物を生触媒として使用して、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産する方法。
  9. 配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素。
  10. 請求項９に記載の酸化還元酵素を含む細胞抽出物。
  11. 請求項９に記載の酸化還元酵素をコード化するＤＮＡ。
  12. 配列番号２の配列からなる、請求項１１に記載のＤＮＡ。
  13. 請求項１１又は１２に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
  14. 請求項１３に記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞を含む細胞抽出物。
  16. 配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、天然物の糖分解活性を有する酸化還元酵素。
  17. 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項１６に記載の酸化還元酵素。
  18. 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドＫ（ＣＫ）、ジンセノサイドＲｈ２、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｅ、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドＡ及びカメリアシドＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の酸化還元酵素。
  19. 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項１６に記載の酸化還元酵素。
  20. 前記酸化還元酵素は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産することを特徴とする、請求項１６に記載の酸化還元酵素。
  21. 前記酸化還元酵素は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．又はステノトロフォモナーゼ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｅ）ｓｐ．から由来することを特徴とする、請求項１６に記載の酸化還元酵素。
  22. 請求項１６に記載の酸化還元酵素を含む細胞抽出物。
  23. 天然物の糖分解方法であって、
    配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群より選択される生触媒を使用する天然物の糖分解方法。
  24. 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項２３に記載の天然物の糖分解方法。
  25. 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドＫ（ＣＫ）、ジンセノサイドＲｈ２、ジンセノサイドＦ２、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｂ２、ジンセノサイドＲｃ、ジンセノサイドＲｂ３、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｅ、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドＡ及びカメリアシドＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の天然物の糖分解方法。
  26. 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース又はキシロースであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項２３に記載の天然物の糖分解方法。
  27. 無糖体を生産する方法であって、
    配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群から選択される生触媒を使用して、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産する方法。
  28. 細胞抽出物の製造方法であって、
    リゾビウムｓｐ．ＧＩＮ６１１の細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号３のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号２の配列からなるＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、又は配列番号３の配列と６０％以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素を含む細胞抽出物を製造する方法であり、ジンセノサイドを添加して酵素発現を誘導することを特徴とする細胞抽出物の製造方法。
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