JP2002017372A - グルコース−３−脱水素酵素およびその製造方法 - Google Patents
グルコース−３−脱水素酵素およびその製造方法Info
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- JP2002017372A JP2002017372A JP2000237709A JP2000237709A JP2002017372A JP 2002017372 A JP2002017372 A JP 2002017372A JP 2000237709 A JP2000237709 A JP 2000237709A JP 2000237709 A JP2000237709 A JP 2000237709A JP 2002017372 A JP2002017372 A JP 2002017372A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グルコース−３−脱水素酵素の遺伝子配列と
それに基づく該酵素の生産方法を提供すること。 【解決手段】 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株
よりグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝子を
取得し、さらに該遺伝子を組み込んでなる組み換えベク
ターを微生物に形質転換することによって得られた形質
転換体を培養し、該培養物から採取されるグルコース−
３−脱水素酵素およびその製造方法。
それに基づく該酵素の生産方法を提供すること。 【解決手段】 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株
よりグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝子を
取得し、さらに該遺伝子を組み込んでなる組み換えベク
ターを微生物に形質転換することによって得られた形質
転換体を培養し、該培養物から採取されるグルコース−
３−脱水素酵素およびその製造方法。
Description
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために種々検討した結果、グルコース−３−脱
水素酵素（Ｇ３ＤＨ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を
形質転換することによって得られた形質転換体を培養
し、該培養物からＧ３ＤＨを採取することによってＧ３
ＤＨを大量生産できることを見いだし、本発明に至っ
た。
達成するために種々検討した結果、グルコース−３−脱
水素酵素（Ｇ３ＤＨ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を
形質転換することによって得られた形質転換体を培養
し、該培養物からＧ３ＤＨを採取することによってＧ３
ＤＨを大量生産できることを見いだし、本発明に至っ
た。
【０００５】すなわち本発明はＧ３ＤＨをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクタ
ーで微生物を形質転換することによって得られることを
特徴とする形質転換体を培養して培養物からＧ３ＤＨを
採取することを特徴とするＧ３ＤＨの製造方法である。
伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクタ
ーで微生物を形質転換することによって得られることを
特徴とする形質転換体を培養して培養物からＧ３ＤＨを
採取することを特徴とするＧ３ＤＨの製造方法である。
【０００６】本発明は以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
質であるグルコース−３−脱水素酵素である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
【０００７】本発明は配列表・配列番号１に記載される
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素である。
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素である。
【０００８】本発明は以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
【０００９】本発明は配列表・配列番号１に記載される
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素をコードする遺伝子である。
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素をコードする遺伝子である。
【００１０】本発明は以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換もしくは付加されており、かつグルコー
ス−３−脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換もしくは付加されており、かつグルコー
ス−３−脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ
【００１１】本発明は配列表・配列番号２に記載される
塩基配列からなるＤＮＡを有するグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子である。
塩基配列からなるＤＮＡを有するグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子である。
【００１２】本発明は配列ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＨｉｓＴ
ｙｒＡｌａＩｌｅＶａｌＶａｌを含むグルコース−３−
脱水素酵素である。
ｙｒＡｌａＩｌｅＶａｌＶａｌを含むグルコース−３−
脱水素酵素である。
【００１３】本発明はまたＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｃｕｐｉｄａまた
はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ由来である
上記記載の遺伝子である
α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｃｕｐｉｄａまた
はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ由来である
上記記載の遺伝子である
【００１４】本発明は上記記載のグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター
である。
素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター
である。
【００１５】本発明は上記の組み換えベクターで形質転
換した形質転換体である。
換した形質転換体である。
【００１６】本発明は上記記載の形質転換体を培養し
て、該培養物からグルコース−３−脱水素酵素をを採取
するグルコース−３−脱水素酵素の製造方法ならびにそ
の方法で製造されるグルコース−３−脱水素酵素、さら
に本発明のグルコース−３−脱水素酵素を含む糖類アッ
セイキットおよび糖類センサーを提供する。
て、該培養物からグルコース−３−脱水素酵素をを採取
するグルコース−３−脱水素酵素の製造方法ならびにそ
の方法で製造されるグルコース−３−脱水素酵素、さら
に本発明のグルコース−３−脱水素酵素を含む糖類アッ
セイキットおよび糖類センサーを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明のＧ３ＤＨをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片はＧ３ＤＨ生産菌から得ることが
できる。該Ｇ３ＤＨ生産菌としては具体的にはＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ
ｃｕｐｉｄａＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ等の細菌をあげることができる。なかでもＨａｌｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．α１５株由来の水溶性Ｇ３ＤＨが好ま
しい。
伝子を含むＤＮＡ断片はＧ３ＤＨ生産菌から得ることが
できる。該Ｇ３ＤＨ生産菌としては具体的にはＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ
ｃｕｐｉｄａＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ等の細菌をあげることができる。なかでもＨａｌｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．α１５株由来の水溶性Ｇ３ＤＨが好ま
しい。
【００１８】該Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子はこれらの
菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することも
できる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧ３ＤＨ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得ることができる。
菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することも
できる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧ３ＤＨ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００１９】上記Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子として
は、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつＧ３ＤＨ性を有するタンパク質である
Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子が挙げられる。
は、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつＧ３ＤＨ性を有するタンパク質である
Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２０】さらに、（ｃ）配列表・配列番号２に記載
された塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）上記
（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加されており、かつＧ３ＤＨ活性を有す
るタンパク質をコードしているＤＮＡがある。
された塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）上記
（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加されており、かつＧ３ＤＨ活性を有す
るタンパク質をコードしているＤＮＡがある。
【００２１】本発明において、Ｇ３ＤＨをコードする遺
伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられ
る。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制
限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニア
ーな発現ベクターと両ＤＮＡをの平滑末端または付着末
端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組
換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素
活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｇ３ＤＨ
をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持す
る微生物を得る。
伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられ
る。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制
限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニア
ーな発現ベクターと両ＤＮＡをの平滑末端または付着末
端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組
換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素
活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｇ３ＤＨ
をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持す
る微生物を得る。
【００２２】次いで、上記組換えベクターを保持する微
生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベク
ターを分離、精製し、該発現ベクターからＧ３ＤＨをコ
ードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝
子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のよう
にして採取される。
生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベク
ターを分離、精製し、該発現ベクターからＧ３ＤＨをコ
ードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝
子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のよう
にして採取される。
【００２３】該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪
拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次
いで、これを溶菌させることによりＧ３ＤＨ遺伝子の含
有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法として
は、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施さ
れ、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的
破砕方法と組み合わせてもよい。
拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次
いで、これを溶菌させることによりＧ３ＤＨ遺伝子の含
有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法として
は、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施さ
れ、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的
破砕方法と組み合わせてもよい。
【００２４】上記のようにして得られた溶菌物からＤＮ
Ａを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。
Ａを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。
【００２５】微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断
する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などによ
り行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配
列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などによ
り行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配
列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００２６】クローニングする際のベクターとしては、
宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラ
スミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適し
ている。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄ
ａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示され
る。また、プラスミドとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｎ
ｃｈｉａｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵ
Ｃ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあ
るいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示さ
れる。
宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラ
スミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適し
ている。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄ
ａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示され
る。また、プラスミドとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｎ
ｃｈｉａｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵ
Ｃ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあ
るいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示さ
れる。
【００２７】クローニングの際、上記のようなベクター
を、上述したＧ３ＤＨをコードする遺伝子供与体である
微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベク
ター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮ
Ａの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる
必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片と
を結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方
法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端と
ベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当な
ＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応
じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内
のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製するこ
ともできる。
を、上述したＧ３ＤＨをコードする遺伝子供与体である
微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベク
ター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮ
Ａの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる
必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片と
を結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方
法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端と
ベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当な
ＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応
じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内
のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製するこ
ともできる。
【００２８】クローニングに使用する宿主微生物として
は、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で
外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限され
ない。一般的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５ α，ＸＬ−１ＢｌｕｅＭ Ｒなどを用いるこ
とができる。
は、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で
外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限され
ない。一般的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５ α，ＸＬ−１ＢｌｕｅＭ Ｒなどを用いるこ
とができる。
【００２９】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピ
テントセル法やエレクトロポーレーション法などを用い
ることができる。
法としては、例えば宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピ
テントセル法やエレクトロポーレーション法などを用い
ることができる。
【００３０】上記のように得られた形質転換体である微
生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧ３
ＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベ
クターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮ
Ａを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＧ３ＤＨ活
性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、
薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧ３
ＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧ３
ＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベ
クターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮ
Ａを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＧ３ＤＨ活
性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、
薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧ３
ＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００３１】上記の方法により得られたＧ３ＤＨ遺伝子
の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置によ
り解読した。また、Ｇ３ＤＨのアミノ酸配列は上記のよ
うに決定された塩基配列より推定した。
の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置によ
り解読した。また、Ｇ３ＤＨのアミノ酸配列は上記のよ
うに決定された塩基配列より推定した。
【００３２】上記のようにして、一度選択されたＧ３Ｄ
Ｈ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複
製できる組換えベクターへの移入は、Ｇ３ＤＨ遺伝子を
保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により
Ｇ３ＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断
片と結合させることにより容易に実施できる。また、こ
れらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム
処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーシ
ョン法などを用いることができる。
Ｈ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複
製できる組換えベクターへの移入は、Ｇ３ＤＨ遺伝子を
保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により
Ｇ３ＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断
片と結合させることにより容易に実施できる。また、こ
れらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム
処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーシ
ョン法などを用いることができる。
【００３３】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通
気攪拌培養を行うのが有利である。
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通
気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３４】培地の栄養源としては、微生物の培養に通
常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては
資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクト
ース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その
他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定
のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用さ
れる。
常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては
資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクト
ース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その
他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定
のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用さ
れる。
【００３５】培養温度は菌が成育し、Ｇ３ＤＨを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｇ３
ＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培
養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度であ
る。培地のｐＨは菌が発育し、Ｇ３ＤＨを生産する範囲
で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程
度の範囲である。
る範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｇ３
ＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培
養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度であ
る。培地のｐＨは菌が発育し、Ｇ３ＤＨを生産する範囲
で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程
度の範囲である。
【００３６】培養物中のＧ３ＤＨを生産する菌体を含む
培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一
般には、常法に従って、Ｇ３ＤＨが培養液中に存在する
場合はろ過、遠心分離などにより、Ｇ３ＤＨ含有溶液と
微生物菌体と分離した後に利用される。Ｇ３ＤＨが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤
及び界面活性剤を添加してＧ３ＤＨを可溶化し、水溶液
として分離採取する。
培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一
般には、常法に従って、Ｇ３ＤＨが培養液中に存在する
場合はろ過、遠心分離などにより、Ｇ３ＤＨ含有溶液と
微生物菌体と分離した後に利用される。Ｇ３ＤＨが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤
及び界面活性剤を添加してＧ３ＤＨを可溶化し、水溶液
として分離採取する。
【００３７】上記のようにして得られたＧ３ＤＨ含有溶
液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加
熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、
吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製さ
れたＧ３ＤＨを得ることができる。
液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加
熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、
吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製さ
れたＧ３ＤＨを得ることができる。
【００３８】カラムクロマイトグラフィーにより分離、
精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素
標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバン
ドを示す程度に純化されていることが好ましい。
精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素
標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバン
ドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３９】上記のようにして得られた精製酵素を、例
えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉
末化して流通させることが可能である。
えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉
末化して流通させることが可能である。
【００４０】本発明のＧ３ＤＨの一例は、以下に示すよ
うな理化学的性質を有する。 作法： 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理） 至適温度：約３０から５０℃ 至適ｐＨ：５から７ 分子量：６７ｋＤａ （ＳＤＳ変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量測定による） 水溶性である。
うな理化学的性質を有する。 作法： 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理） 至適温度：約３０から５０℃ 至適ｐＨ：５から７ 分子量：６７ｋＤａ （ＳＤＳ変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量測定による） 水溶性である。
【００４１】本発明において、Ｇ３ＤＨ活性の測定は５
９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭ
Ｓ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料お
よび基質としてグルコースをはじめとする各種糖類を基
質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰ
の６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡
し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。
９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭ
Ｓ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料お
よび基質としてグルコースをはじめとする各種糖類を基
質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰ
の６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡
し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。
【００４２】糖類アッセイキット 本発明はまた、本発明に従うグルコース−３−脱水素酵
素を含む糖類アッセイキットを特徴とする。本発明の糖
類アッセイキットは、本発明に従うグルコース−３−脱
水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含
む。典型的には、キットは、本発明のグルコース−３−
脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディ
エーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグル
コースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本
発明に従うグルコース−３−脱水素酵素は種々の形態
で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な
保存溶液中の溶液として提供することができる。
素を含む糖類アッセイキットを特徴とする。本発明の糖
類アッセイキットは、本発明に従うグルコース−３−脱
水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含
む。典型的には、キットは、本発明のグルコース−３−
脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディ
エーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグル
コースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本
発明に従うグルコース−３−脱水素酵素は種々の形態
で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な
保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００４３】糖類センサー 本発明はまた、本発明に従うグルコース−３−脱水素酵
素を用いる糖類センサーを特徴とする。電極としては、
カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極
上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、
架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入す
る方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導
電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいは
フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸
着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いても
よい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明
のグルコース−３−脱水素酵素をカーボン電極上に固定
化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。糖類の濃度の測定は、以
下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を
入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メ
ディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明のグルコース−３−脱水素酵素を固
定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参
照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボ
ン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった
後、グルコースなどの糖類を含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖類の濃
度を計算することができる。
素を用いる糖類センサーを特徴とする。電極としては、
カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極
上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、
架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入す
る方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導
電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいは
フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸
着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いても
よい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明
のグルコース−３−脱水素酵素をカーボン電極上に固定
化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。糖類の濃度の測定は、以
下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を
入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メ
ディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明のグルコース−３−脱水素酵素を固
定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参
照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボ
ン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった
後、グルコースなどの糖類を含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖類の濃
度を計算することができる。
【００４４】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１： Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株か
らの染色体ＤＮＡの調製 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株より染色体遺伝
子を常法にしたがって調製した。すなわち、同菌株をＭ
９Ｓ液体倍地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６％，ＫＨ２ＰＯ４
０．３％，ＮａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ４ ０．０１％，
ＣａＣｌ２ ０．０１％）を用いてこれに炭素源として
α−メチルグルコシドを終濃度０．４％となるように加
え、３０℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機
により回収した。この菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．５％ＳＤＳ、 た。ここに等量のフェノールークロロホルムを加えて室
温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収
した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウ
ムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色
体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい
とり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバ
ッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１： Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株か
らの染色体ＤＮＡの調製 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株より染色体遺伝
子を常法にしたがって調製した。すなわち、同菌株をＭ
９Ｓ液体倍地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６％，ＫＨ２ＰＯ４
０．３％，ＮａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ４ ０．０１％，
ＣａＣｌ２ ０．０１％）を用いてこれに炭素源として
α−メチルグルコシドを終濃度０．４％となるように加
え、３０℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機
により回収した。この菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．５％ＳＤＳ、 た。ここに等量のフェノールークロロホルムを加えて室
温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収
した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウ
ムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色
体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい
とり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバ
ッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００４５】実施例２： Ｇ３ＤＨのＮ末端アミノ酸配
列の決定 実施例１に従い、当該株を培養した。実施例１と同様に
して遠心分離機で回収したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株の細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で
破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモ
ニウムを３０％になるように添加して析出物を廃棄し、
水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて透析した。透析後の水溶液は、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（内径２２ｍｍ×２０ｃｍ）に吸着させ、０．
４５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ６．０を用いて直線勾配法により溶出させたとこ
ろ、Ｇ３ＤＨは０．３Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。これ
を凍結乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルア
ミドを用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、本発
明の酵素を分離した。こうして得られた酵素をポリビニ
リデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエン
サー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端ア
ミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素にはＰｒ
ｏＡｓｐＡｓｎＨｉｓＴｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌ
Ｖａｌ（ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶ）からなる１０残基から
構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
列の決定 実施例１に従い、当該株を培養した。実施例１と同様に
して遠心分離機で回収したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株の細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で
破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモ
ニウムを３０％になるように添加して析出物を廃棄し、
水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて透析した。透析後の水溶液は、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（内径２２ｍｍ×２０ｃｍ）に吸着させ、０．
４５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ６．０を用いて直線勾配法により溶出させたとこ
ろ、Ｇ３ＤＨは０．３Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。これ
を凍結乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルア
ミドを用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、本発
明の酵素を分離した。こうして得られた酵素をポリビニ
リデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエン
サー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端ア
ミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素にはＰｒ
ｏＡｓｐＡｓｎＨｉｓＴｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌ
Ｖａｌ（ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶ）からなる１０残基から
構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
【００４６】実施例３： Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子
のクローニング 実施例１で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで限定分解した。これをＣＩＡＰ処理した。一方、コ
スミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩをＢａｍＨＩ処理し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−
１５株由来の染色体ＤＮＡ断片がＳａｕ３ＡＩで限定分
解してえられたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られたＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅ ＭＲに形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒ
ＣｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性およ
びアンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオ
マイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液
体培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、Ｇ
３ＤＨ活性測定試薬に懸濁し、α−メチルグルコシドに
対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。そ
の結果、１株のグルコース−３−脱水素酵素活性を示す
クローンが得られた。
のクローニング 実施例１で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで限定分解した。これをＣＩＡＰ処理した。一方、コ
スミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩをＢａｍＨＩ処理し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−
１５株由来の染色体ＤＮＡ断片がＳａｕ３ＡＩで限定分
解してえられたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られたＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅ ＭＲに形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒ
ＣｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性およ
びアンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオ
マイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液
体培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、Ｇ
３ＤＨ活性測定試薬に懸濁し、α−メチルグルコシドに
対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。そ
の結果、１株のグルコース−３−脱水素酵素活性を示す
クローンが得られた。
【００４７】実施例４： サブクローニング 実施例３で得られたＧ３ＤＨをコードする遺伝子を含む
コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから目的遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の調製をおこなった。同コスミドから挿入遺伝子
断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ
断片に対して、制限酵素ＸｂａＩで処理を行い、得られ
た断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組
み込んだ。これらの挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１
８をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣ
Ｒ株に形質転換し、Ａｍｐ５０μｇ／ｍｌを含む寒天の
ＬＢ培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転
換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧ３
ＤＨ活性を実施例３と同様に調べた。その結果、一つの
形質転換体にＧ３ＤＨ活性を示す株がえられた。この形
質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片
を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認さ
れた。本プラスミドをｐＧ３ＤＨ１と命名した。
コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから目的遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の調製をおこなった。同コスミドから挿入遺伝子
断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ
断片に対して、制限酵素ＸｂａＩで処理を行い、得られ
た断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組
み込んだ。これらの挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１
８をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣ
Ｒ株に形質転換し、Ａｍｐ５０μｇ／ｍｌを含む寒天の
ＬＢ培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転
換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧ３
ＤＨ活性を実施例３と同様に調べた。その結果、一つの
形質転換体にＧ３ＤＨ活性を示す株がえられた。この形
質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片
を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認さ
れた。本プラスミドをｐＧ３ＤＨ１と命名した。
【００４８】実施例５： 塩基配列の決定 ｐＧ３ＤＨ１の挿入ＤＮＡ断片について制限酵素解析な
らびに常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿
入ＤＮＡ断片中に実施例２で明かとなったＧ３ＤＨのア
ミノ酸Ｎ末端配列、ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶが確認され、
この配列を含むオープンリーディングフレームが見つか
った。決定した塩基配列およびアミノ酸配列は派例つ番
号１および２に示す通りである。アミノ酸配列から求め
られる蛋白質の分子量は６３１７２Ｄａであり、Ｈａｌ
ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株Ｇ３ＤＨのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでもとめられた分子量６７ｋＤａにほぼ一致し
た。
らびに常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿
入ＤＮＡ断片中に実施例２で明かとなったＧ３ＤＨのア
ミノ酸Ｎ末端配列、ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶが確認され、
この配列を含むオープンリーディングフレームが見つか
った。決定した塩基配列およびアミノ酸配列は派例つ番
号１および２に示す通りである。アミノ酸配列から求め
られる蛋白質の分子量は６３１７２Ｄａであり、Ｈａｌ
ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株Ｇ３ＤＨのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでもとめられた分子量６７ｋＤａにほぼ一致し
た。
【００４９】実施例６： 組み換え大腸菌によるＧ３Ｄ
Ｈの生産 Ｇ３ＤＨの構造遺伝子を含むプラスミドｐＧ３ＤＨ１が
形質転換されている大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＧ３ＤＨ１を用いてＧ３
ＤＨの生産を行った。当該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で
１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌し
た。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破
砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この操作に
Ｈの生産 Ｇ３ＤＨの構造遺伝子を含むプラスミドｐＧ３ＤＨ１が
形質転換されている大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＧ３ＤＨ１を用いてＧ３
ＤＨの生産を行った。当該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で
１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌し
た。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破
砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この操作に
【００５０】実施例７； 糖類のアッセイ 本発明のグルコース−３−脱水素酵素を用いてグルコー
スをアッセイした。本発明のグルコース−３−脱水素酵
素（Ｇ３ＤＨ）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を
測定した。Ｇ３ＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフ
ェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４
μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール
（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグ
ルコースをはじめとする各種糖類を基質として加え３７
℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸
光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減
少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧ３ＤＨを用い
て、０．０１−１．０ｍＭの範囲でグルコース、１，５
−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒ
ｂａｍｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ
ａｍｉｎｅ、トレハロース、ラクトースの定量を行うこ
とができた。
スをアッセイした。本発明のグルコース−３−脱水素酵
素（Ｇ３ＤＨ）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を
測定した。Ｇ３ＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフ
ェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４
μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール
（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグ
ルコースをはじめとする各種糖類を基質として加え３７
℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸
光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減
少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧ３ＤＨを用い
て、０．０１−１．０ｍＭの範囲でグルコース、１，５
−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒ
ｂａｍｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ
ａｍｉｎｅ、トレハロース、ラクトースの定量を行うこ
とができた。
【００５１】 実施例８ 糖類センサーの作製および評
価 ２５ユニットの本発明のグルコース−３−脱水素酵素に
カーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。こ
れをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍ
ｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填
し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアル
デヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む
１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０
分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。
この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存し
た。作製した酵素センサーを用いて種々の糖類の濃度の
測定を行った。本発明のグルコース−３−脱水素酵素を
固定化した酵素センサーを用いて、０．０５ｍＭ−５．
０ｍＭの範囲でグルコース、１，５−ａｎｈｙｄｒｏ−
Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−β−
Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ、トレハ
ロース、ラクトースの定量を行うことができた。
価 ２５ユニットの本発明のグルコース−３−脱水素酵素に
カーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。こ
れをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍ
ｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填
し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアル
デヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む
１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０
分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。
この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存し
た。作製した酵素センサーを用いて種々の糖類の濃度の
測定を行った。本発明のグルコース−３−脱水素酵素を
固定化した酵素センサーを用いて、０．０５ｍＭ−５．
０ｍＭの範囲でグルコース、１，５−ａｎｈｙｄｒｏ−
Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−β−
Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ、トレハ
ロース、ラクトースの定量を行うことができた。
【００５２】
【発明の効果】上述のように、本発明においてＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．由来の水溶性グルコース−３−脱水
素酵素の遺伝子が単離された。また、大腸菌を宿主とし
て単離された該遺伝子をもとにＧ３ＤＨを組み換えＤＮ
Ａ技術で大量に調製できるようになった。
ｍｏｎａｓ ｓｐ．由来の水溶性グルコース−３−脱水
素酵素の遺伝子が単離された。また、大腸菌を宿主とし
て単離された該遺伝子をもとにＧ３ＤＨを組み換えＤＮ
Ａ技術で大量に調製できるようになった。
【図１】 図１は、本発明において用いたプラスミドＰ
Ｇ３ＤＨの構造を示す。
Ｇ３ＤＨの構造を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年９月８日（２０００．９．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明はグルコース−３−
脱水素酵素（以下Ｇ３ＤＨ）、該Ｇ３ＤＨをコードする
遺伝子、該Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子断片を組み込ん
でなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転
換された形質転換体、該形質転換体を培養することによ
るＧ３ＤＨの製造方法に関する。
脱水素酵素（以下Ｇ３ＤＨ）、該Ｇ３ＤＨをコードする
遺伝子、該Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子断片を組み込ん
でなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転
換された形質転換体、該形質転換体を培養することによ
るＧ３ＤＨの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコース−３−脱水素酵素は、グルコ
ースの３位の水酸基と反応して、これを酸化する作用を
有する酵素である。これまでに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉ ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９６７，２４２，３６６５−３６７２）、Ｆ
ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｊ．Ｂ ｉｏｃ
ｈｅｍ．１９８６，１００，１０４９−１０５５）、Ｃ
ｙｔｏｐｈａｇ ａ ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ（Ａｐｐ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ．１９９
６，５６，３０１−３１０）、Ｄｅｌｅｙａ（Ｈａｌｏ
ｍｏｎａ ｓ） ｓｐ．（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏ
ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，２ ２，２６９−２７
４）などがＧ３ＤＨを産生することが知られている。Ｇ
３ＤＨのうち、糖尿病の臨床マーカーである１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用することができるも
のは、特に臨床診断薬および臨床診断用センサーに用い
る酵素として非常に有望である。またスクロースやトレ
ハロースをはじめとして各種の糖類に反応する酵素は相
当する３ケト糖類の合成に有用である。
ースの３位の水酸基と反応して、これを酸化する作用を
有する酵素である。これまでに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉ ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９６７，２４２，３６６５−３６７２）、Ｆ
ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｊ．Ｂ ｉｏｃ
ｈｅｍ．１９８６，１００，１０４９−１０５５）、Ｃ
ｙｔｏｐｈａｇ ａ ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ（Ａｐｐ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ．１９９
６，５６，３０１−３１０）、Ｄｅｌｅｙａ（Ｈａｌｏ
ｍｏｎａ ｓ） ｓｐ．（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏ
ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，２ ２，２６９−２７
４）などがＧ３ＤＨを産生することが知られている。Ｇ
３ＤＨのうち、糖尿病の臨床マーカーである１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用することができるも
のは、特に臨床診断薬および臨床診断用センサーに用い
る酵素として非常に有望である。またスクロースやトレ
ハロースをはじめとして各種の糖類に反応する酵素は相
当する３ケト糖類の合成に有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は水溶性グルコ
ース−３−脱水素酵素の新規製造方法を提供することを
目的とする。
ース−３−脱水素酵素の新規製造方法を提供することを
目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために種々検討した結果、グルコース−３−脱
水素酵素（Ｇ３ＤＨ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を
形質転換することによって得られた形質転換体を培養
し、該培養物からＧ３ＤＨを採取することによってＧ３
ＤＨを大量生産できることを見いだし、本発明に至っ
た。
達成するために種々検討した結果、グルコース−３−脱
水素酵素（Ｇ３ＤＨ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を
形質転換することによって得られた形質転換体を培養
し、該培養物からＧ３ＤＨを採取することによってＧ３
ＤＨを大量生産できることを見いだし、本発明に至っ
た。
【０００５】すなわち本発明はＧ３ＤＨをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクタ
ーで微生物を形質転換することによって得られることを
特徴とする形質転換体を培養して培養物からＧ３ＤＨを
採取することを特徴とするＧ３ＤＨの製造方法である。
伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクタ
ーで微生物を形質転換することによって得られることを
特徴とする形質転換体を培養して培養物からＧ３ＤＨを
採取することを特徴とするＧ３ＤＨの製造方法である。
【０００６】本発明は以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
質であるグルコース−３−脱水素酵素である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
【０００７】本発明は配列表・配列番号１に記載される
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素である。
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素である。
【０００８】本発明は以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質。
【０００９】本発明は配列表・配列番号１に記載される
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素をコードする遺伝子である。
アミノ酸配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱
水素酵素をコードする遺伝子である。
【００１０】本発明は以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換もしくは付加されており、かつグルコー
ス−３−脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ
質であるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝
子である。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換もしくは付加されており、かつグルコー
ス−３−脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ
【００１１】本発明は配列表・配列番号２に記載される
塩基配列からなるＤＮＡを有するグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子である。
塩基配列からなるＤＮＡを有するグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子である。
【００１２】本発明は配列ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＨｉｓＴ
ｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌＶａｌを含むグルコース
−３−脱水素酵素である。
ｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌＶａｌを含むグルコース
−３−脱水素酵素である。
【００１３】本発明はまたＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｃｕｐｉｄａまた
はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ由来である
上記記載の遺伝子である
α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｃｕｐｉｄａまた
はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ由来である
上記記載の遺伝子である
【００１４】本発明は上記記載のグルコース−３−脱水
素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター
である。
素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター
である。
【００１５】本発明は上記の組み換えベクターで形質転
換した形質転換体である。
換した形質転換体である。
【００１６】本発明は上記記載の形質転換体を培養し
て、該培養物からグルコース−３−脱水素酵素をを採取
するグルコース−３−脱水素酵素の製造方法ならびにそ
の方法で製造されるグルコース−３−脱水素酵素、さら
に本発明のグルコース−３−脱水素酵素を含む糖類アッ
セイキットおよび糖類センサーを提供する。
て、該培養物からグルコース−３−脱水素酵素をを採取
するグルコース−３−脱水素酵素の製造方法ならびにそ
の方法で製造されるグルコース−３−脱水素酵素、さら
に本発明のグルコース−３−脱水素酵素を含む糖類アッ
セイキットおよび糖類センサーを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明のＧ３ＤＨをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片はＧ３ＤＨ生産菌から得ることが
できる。該Ｇ３ＤＨ生産菌としては具体的にはＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ
ｃｕｐｉｄａＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ等の細菌をあげることができる。なかでもＨａｌｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．α１５株由来の水溶性Ｇ３ＤＨが好ま
しい。
伝子を含むＤＮＡ断片はＧ３ＤＨ生産菌から得ることが
できる。該Ｇ３ＤＨ生産菌としては具体的にはＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ
ｃｕｐｉｄａＨａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ等の細菌をあげることができる。なかでもＨａｌｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．α１５株由来の水溶性Ｇ３ＤＨが好ま
しい。
【００１８】該Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子はこれらの
菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することも
できる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧ３ＤＨ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得ることができる。
菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することも
できる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧ３ＤＨ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００１９】上記Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子として
は、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつＧ３ＤＨ性を有するタンパク質である
Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子が挙げられる。
は、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつＧ３ＤＨ性を有するタンパク質である
Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２０】さらに、（ｃ）配列表・配列番号２に記載
された塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）上記
（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加されており、かつＧ３ＤＨ活性を有す
るタンパク質をコードしているＤＮＡがある。
された塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）上記
（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加されており、かつＧ３ＤＨ活性を有す
るタンパク質をコードしているＤＮＡがある。
【００２１】本発明において、Ｇ３ＤＨをコードする遺
伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられ
る。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制
限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニア
ーな発現ベクターと両ＤＮＡをの平滑末端または付着末
端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組
換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素
活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｇ３ＤＨ
をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持す
る微生物を得る。
伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられ
る。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制
限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニア
ーな発現ベクターと両ＤＮＡをの平滑末端または付着末
端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組
換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素
活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｇ３ＤＨ
をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持す
る微生物を得る。
【００２２】次いで、上記組換えベクターを保持する微
生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベク
ターを分離、精製し、該発現ベクターからＧ３ＤＨをコ
ードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝
子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のよう
にして採取される。
生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベク
ターを分離、精製し、該発現ベクターからＧ３ＤＨをコ
ードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝
子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のよう
にして採取される。
【００２３】該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪
拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次
いで、これを溶菌させることによりＧ３ＤＨ遺伝子の含
有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法として
は、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施さ
れ、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的
破砕方法と組み合わせてもよい。
拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次
いで、これを溶菌させることによりＧ３ＤＨ遺伝子の含
有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法として
は、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施さ
れ、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的
破砕方法と組み合わせてもよい。
【００２４】上記のようにして得られた溶菌物からＤＮ
Ａを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。
Ａを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。
【００２５】微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断
する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などによ
り行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配
列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などによ
り行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配
列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００２６】クローニングする際のベクターとしては、
宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラ
スミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適し
ている。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄ
ａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示され
る。また、プラスミドとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐ
ＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
あるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示
される。
宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラ
スミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適し
ている。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄ
ａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示され
る。また、プラスミドとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐ
ＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
あるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示
される。
【００２７】クローニングの際、上記のようなベクター
を、上述したＧ３ＤＨをコードする遺伝子供与体である
微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベク
ター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮ
Ａの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる
必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片と
を結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方
法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端と
ベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当な
ＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応
じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内
のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製するこ
ともできる。
を、上述したＧ３ＤＨをコードする遺伝子供与体である
微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベク
ター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮ
Ａの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる
必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片と
を結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方
法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端と
ベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当な
ＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応
じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内
のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製するこ
ともできる。
【００２８】クローニングに使用する宿主微生物として
は、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で
外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限され
ない。一般的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５ α．ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲなどを用いること
ができる。
は、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で
外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限され
ない。一般的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５ α．ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲなどを用いること
ができる。
【００２９】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピ
テントセル法やエレクトロポーレーション法などを用い
ることができる。
法としては、例えば宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピ
テントセル法やエレクトロポーレーション法などを用い
ることができる。
【００３０】上記のように得られた形質転換体である微
生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧ３
ＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベ
クターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮ
Ａを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＧ３ＤＨ活
性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、
薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧ３
ＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧ３
ＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベ
クターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮ
Ａを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＧ３ＤＨ活
性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、
薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧ３
ＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００３１】上記の方法により得られたＧ３ＤＨ遺伝子
の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置によ
り解読した。また、Ｇ３ＤＨのアミノ酸配列は上記のよ
うに決定された塩基配列より推定した。
の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置によ
り解読した。また、Ｇ３ＤＨのアミノ酸配列は上記のよ
うに決定された塩基配列より推定した。
【００３２】上記のようにして、一度選択されたＧ３Ｄ
Ｈ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複
製できる組換えベクターへの移入は、Ｇ３ＤＨ遺伝子を
保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により
Ｇ３ＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断
片と結合させることにより容易に実施できる。また、こ
れらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム
処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーシ
ョン法などを用いることができる。
Ｈ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複
製できる組換えベクターへの移入は、Ｇ３ＤＨ遺伝子を
保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により
Ｇ３ＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断
片と結合させることにより容易に実施できる。また、こ
れらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム
処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーシ
ョン法などを用いることができる。
【００３３】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通
気攪拌培養を行うのが有利である。
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通
気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３４】培地の栄養源としては、微生物の培養に通
常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては
資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクト
ース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その
他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定
のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用さ
れる。
常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては
資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクト
ース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その
他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定
のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用さ
れる。
【００３５】培養温度は菌が成育し、Ｇ３ＤＨを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｇ３
ＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培
養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度であ
る。培地のｐＨは菌が発育し、Ｇ３ＤＨを生産する範囲
で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程
度の範囲である。
る範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｇ３
ＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培
養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度であ
る。培地のｐＨは菌が発育し、Ｇ３ＤＨを生産する範囲
で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程
度の範囲である。
【００３６】培養物中のＧ３ＤＨを生産する菌体を含む
培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一
般には、常法に従って、Ｇ３ＤＨが培養液中に存在する
場合はろ過、遠心分離などにより、Ｇ３ＤＨ含有溶液と
微生物菌体と分離した後に利用される。Ｇ３ＤＨが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤
及び界面活性剤を添加してＧ３ＤＨを可溶化し、水溶液
として分離採取する。
培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一
般には、常法に従って、Ｇ３ＤＨが培養液中に存在する
場合はろ過、遠心分離などにより、Ｇ３ＤＨ含有溶液と
微生物菌体と分離した後に利用される。Ｇ３ＤＨが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤
及び界面活性剤を添加してＧ３ＤＨを可溶化し、水溶液
として分離採取する。
【００３７】上記のようにして得られたＧ３ＤＨ含有溶
液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加
熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、
吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製さ
れたＧ３ＤＨを得ることができる。
液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加
熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、
吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製さ
れたＧ３ＤＨを得ることができる。
【００３８】カラムクロマイトグラフィーにより分離、
精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素
標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバン
ドを示す程度に純化されていることが好ましい。
精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素
標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバン
ドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３９】上記のようにして得られた精製酵素を、例
えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉
末化して流通させることが可能である。
えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉
末化して流通させることが可能である。
【００４０】本発明のＧ３ＤＨの一例は、以下に示すよ
うな理化学的性質を有する。 作法： 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理） 至適温度：約３０から５０℃ 至適ｐＨ：５から７ 分子量：６７ｋＤａ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量測定による） 水溶性である。
うな理化学的性質を有する。 作法： 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理） 至適温度：約３０から５０℃ 至適ｐＨ：５から７ 分子量：６７ｋＤａ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量測定による） 水溶性である。
【００４１】本発明において、Ｇ３ＤＨ活性の測定は５
９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭ
Ｓ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料お
よび基質としてグルコースをはじめとする各種糖類を基
質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰ
の６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡
し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。
９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭ
Ｓ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料お
よび基質としてグルコースをはじめとする各種糖類を基
質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰ
の６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡
し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。
【００４２】糖類アッセイキット 本発明はまた、本発明に従うグルコース−３−脱水素酵
素を含む糖類アッセイキットを特徴とする。本発明の糖
類アッセイキットは、本発明に従うグルコース−３−脱
水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含
む。典型的には、キットは、本発明のグルコース−３−
脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディ
エーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグル
コースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本
発明に従うグルコース−３−脱水素酵素は種々の形態
で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な
保存溶液中の溶液として提供することができる。
素を含む糖類アッセイキットを特徴とする。本発明の糖
類アッセイキットは、本発明に従うグルコース−３−脱
水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含
む。典型的には、キットは、本発明のグルコース−３−
脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディ
エーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグル
コースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本
発明に従うグルコース−３−脱水素酵素は種々の形態
で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な
保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００４３】糖類センサー 本発明はまた、本発明に従うグルコース−３−脱水素酵
素を用いる糖類センサーを特徴とする。電極としては、
カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極
上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、
架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入す
る方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導
電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいは
フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸
着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いても
よい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明
のグルコース−３−脱水素酵素をカーボン電極上に固定
化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。糖類の濃度の測定は、以
下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を
入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メ
ディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明のグルコース−３−脱水素酵素を固
定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参
照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボ
ン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった
後、グルコースなどの糖類を含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖類の濃
度を計算することができる。
素を用いる糖類センサーを特徴とする。電極としては、
カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極
上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、
架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入す
る方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導
電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいは
フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸
着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いても
よい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明
のグルコース−３−脱水素酵素をカーボン電極上に固定
化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。糖類の濃度の測定は、以
下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を
入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メ
ディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明のグルコース−３−脱水素酵素を固
定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参
照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボ
ン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった
後、グルコースなどの糖類を含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖類の濃
度を計算することができる。
【００４４】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１：Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株から
の染色体ＤＮＡの調製 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株より染色体遺伝
子を常法にしたがって調製した。すなわち、同菌株をＭ
９Ｓ液体倍地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６％，ＫＨ２ＰＯ４
０．３％，ＮａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ４０．０１％，Ｃ
ａＣｌ２ ０．０１％）を用いてこれに炭素源としてα
−メチルグルコシドを終濃度０．４％となるように加
え、３０℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機
により回収した。この菌体を１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、
０．５％ＳＤＳ、 た。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室
温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収
した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウ
ムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色
体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい
とり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバ
ッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１：Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株から
の染色体ＤＮＡの調製 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株より染色体遺伝
子を常法にしたがって調製した。すなわち、同菌株をＭ
９Ｓ液体倍地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６％，ＫＨ２ＰＯ４
０．３％，ＮａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ４０．０１％，Ｃ
ａＣｌ２ ０．０１％）を用いてこれに炭素源としてα
−メチルグルコシドを終濃度０．４％となるように加
え、３０℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機
により回収した。この菌体を１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、
０．５％ＳＤＳ、 た。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室
温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収
した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウ
ムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色
体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい
とり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバ
ッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００４５】実施例２： Ｇ３ＤＨのＮ末端アミノ酸配
列の決定 実施例１に従い、当該株を培養した。実施例１と同様に
して遠心分離機で回収したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株の細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で
破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモ
ニウムを３０％になるように添加して析出物を廃棄し、
水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて透析した。透析後の水溶液は、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（内径２２ｍｍ×２０ｃｍ）に吸着させ、０．
４５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．０を用いて直線勾配法により溶出させたところ、
Ｇ３ＤＨは０．３ＭＮａＣｌにて溶出した。これを凍結
乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルアミドを
用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、本発明の酵
素を分離した。こうして得られた酵素をポリビニリデン
フルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー
（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端アミノ
酸配列の決定を行った。その結果、本酵素にはＰｒｏＡ
ｓｐＡｓｎＨｉｓＴｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌＶａ
ｌ（ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶ）からなる１０残基から構成
されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
列の決定 実施例１に従い、当該株を培養した。実施例１と同様に
して遠心分離機で回収したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
α１５株の細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で
破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモ
ニウムを３０％になるように添加して析出物を廃棄し、
水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて透析した。透析後の水溶液は、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（内径２２ｍｍ×２０ｃｍ）に吸着させ、０．
４５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．０を用いて直線勾配法により溶出させたところ、
Ｇ３ＤＨは０．３ＭＮａＣｌにて溶出した。これを凍結
乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルアミドを
用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、本発明の酵
素を分離した。こうして得られた酵素をポリビニリデン
フルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー
（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端アミノ
酸配列の決定を行った。その結果、本酵素にはＰｒｏＡ
ｓｐＡｓｎＨｉｓＴｙｒＡｓｐＡｌａＩｌｅＶａｌＶａ
ｌ（ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶ）からなる１０残基から構成
されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
【００４６】実施例３： Ｇ３ＤＨをコードする遺伝子
のクローニング 実施例１で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで限定分解した。これをＣＩＡＰ処理した。一方、コ
スミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩをＢａｍＨＩ処理し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−
１５株由来の染色体ＤＮＡ断片がＳａｕ３ＡＩで限定分
解してえられたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られたＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅＭＲに形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒＣ
ｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性および
アンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオマ
イシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液体
培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、Ｇ３
ＤＨ活性測定試薬に懸濁し、α−メチルグルコシドに対
する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。その
結果、１株のグルコース−３−脱水素酵素活性を示すク
ローンが得られた。
のクローニング 実施例１で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで限定分解した。これをＣＩＡＰ処理した。一方、コ
スミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩをＢａｍＨＩ処理し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−
１５株由来の染色体ＤＮＡ断片がＳａｕ３ＡＩで限定分
解してえられたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られたＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅＭＲに形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒＣ
ｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性および
アンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオマ
イシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液体
培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、Ｇ３
ＤＨ活性測定試薬に懸濁し、α−メチルグルコシドに対
する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。その
結果、１株のグルコース−３−脱水素酵素活性を示すク
ローンが得られた。
【００４７】実施例４： サブクローニング 実施例３で得られたＧ３ＤＨをコードする遺伝子を含む
コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから目的遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の調製をおこなった。同コスミドから挿入遺伝子
断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ
断片に対して、制限酵素ＸｂａＩで処理を行い、得られ
た断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組
み込んだ。これらの挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１
８をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣ
Ｒ株に形質転換し、Ａｍｐ５０μｇ／ｍｌを含む寒天の
ＬＢ培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転
換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧ３
ＤＨ活性を実施例３と同様に調べた。その結果、一つの
形質転換体にＧ３ＤＨ活性を示す株がえられた。この形
質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片
を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認さ
れた。本プラスミドをｐＧ３ＤＨ１と命名した。
コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから目的遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の調製をおこなった。同コスミドから挿入遺伝子
断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ
断片に対して、制限酵素ＸｂａＩで処理を行い、得られ
た断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組
み込んだ。これらの挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１
８をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣ
Ｒ株に形質転換し、Ａｍｐ５０μｇ／ｍｌを含む寒天の
ＬＢ培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転
換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧ３
ＤＨ活性を実施例３と同様に調べた。その結果、一つの
形質転換体にＧ３ＤＨ活性を示す株がえられた。この形
質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片
を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認さ
れた。本プラスミドをｐＧ３ＤＨ１と命名した。
【００４８】実施例５： 塩基配列の決定 ｐＧ３ＤＨ１の挿入ＤＮＡ断片について制限酵素解析な
らびに常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿
入ＤＮＡ断片中に実施例２で明かとなったＧ３ＤＨのア
ミノ酸Ｎ末端配列、ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶが確認され、
この配列を含むオープンリーディングフレームが見つか
った。決定した塩基配列およびアミノ酸配列は派例つ番
号１および２に示す通りである。アミノ酸配列から求め
られる蛋白質の分子量は６３１７２Ｄａであり、Ｈａｌ
ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株Ｇ３ＤＨのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでもとめられた分子量６７ｋＤａにほぼ一致し
た。
らびに常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿
入ＤＮＡ断片中に実施例２で明かとなったＧ３ＤＨのア
ミノ酸Ｎ末端配列、ＰＤＮＨＹＤＡＩＶＶが確認され、
この配列を含むオープンリーディングフレームが見つか
った。決定した塩基配列およびアミノ酸配列は派例つ番
号１および２に示す通りである。アミノ酸配列から求め
られる蛋白質の分子量は６３１７２Ｄａであり、Ｈａｌ
ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株Ｇ３ＤＨのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでもとめられた分子量６７ｋＤａにほぼ一致し
た。
【００４９】実施例６： 組み換え大腸菌によるＧ３Ｄ
Ｈの生産 Ｇ３ＤＨの構造遺伝子を含むプラスミドｐＧ３ＤＨ１が
形質転換されている大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＧ３ＤＨ１を用いてＧ３
ＤＨの生産を行った。当該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で
１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌し
た。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破
砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この操作により得られ
たＧ３ＤＨは３５２Ｕ／ｌとなり、同条件でα−１５株
により生産させた場合（５９Ｕ／ｌ）の約６倍の量の酵
素が得られた。
Ｈの生産 Ｇ３ＤＨの構造遺伝子を含むプラスミドｐＧ３ＤＨ１が
形質転換されている大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＧ３ＤＨ１を用いてＧ３
ＤＨの生産を行った。当該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で
１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌し
た。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破
砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０
分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。この操作により得られ
たＧ３ＤＨは３５２Ｕ／ｌとなり、同条件でα−１５株
により生産させた場合（５９Ｕ／ｌ）の約６倍の量の酵
素が得られた。
【００５０】実施例７； 糖類のアッセイ 本発明のグルコース−３−脱水素酵素を用いてグルコー
スをアッセイした。本発明のグルコース−３−脱水素酵
素（Ｇ３ＤＨ）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を
測定した。Ｇ３ＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフ
ェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４
μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール
（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグ
ルコースをはじめとする各種糖類を基質として加え３７
℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸
光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減
少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧ３ＤＨを用い
て、０．０１−１．０ｍＭの範囲でグルコース、１，５
−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒ
ｂａｍｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ
ａｍｉｎｅ、トレハロース、ラクトースの定量を行うこ
とができた。
スをアッセイした。本発明のグルコース−３−脱水素酵
素（Ｇ３ＤＨ）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を
測定した。Ｇ３ＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフ
ェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４
μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール
（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグ
ルコースをはじめとする各種糖類を基質として加え３７
℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸
光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減
少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧ３ＤＨを用い
て、０．０１−１．０ｍＭの範囲でグルコース、１，５
−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒ
ｂａｍｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ
ａｍｉｎｅ、トレハロース、ラクトースの定量を行うこ
とができた。
【００５１】 実施例８ 糖類センサーの作製および評
価 ２５ユニットの本発明のグルコース−３−脱水素酵素に
カーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。こ
れをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍ
ｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填
し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアル
デヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む
１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０
分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。
この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存し
た。作製した酵素センサーを用いて種々の糖類の濃度の
測定を行った。本発明のグルコース−３−脱水素酵素を
固定化した酵素センサーを用いて、０．０５ｍＭ−５．
０ｍＭの範囲でグルコース、１，５−ａｎｈｙｄｒｏ−
Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−β−
Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ、トレハ
ロース、ラクトースの定量を行うことができた。
価 ２５ユニットの本発明のグルコース−３−脱水素酵素に
カーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。こ
れをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍ
ｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填
し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアル
デヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む
１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０
分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。
この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存し
た。作製した酵素センサーを用いて種々の糖類の濃度の
測定を行った。本発明のグルコース−３−脱水素酵素を
固定化した酵素センサーを用いて、０．０５ｍＭ−５．
０ｍＭの範囲でグルコース、１，５−ａｎｈｙｄｒｏ−
Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ、Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−β−
Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ、トレハ
ロース、ラクトースの定量を行うことができた。
【００５２】
【発明の効果】上述のように、本発明においてＨａｌｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．由来の水溶性グルコース−３−脱水
素酵素の遺伝子が単離された。また、大腸菌を宿主とし
て単離された該遺伝子をもとにＧ３ＤＨを組み換えＤＮ
Ａ技術で大量に調製できるようになった。
ｍｏｎａｓ ｓｐ．由来の水溶性グルコース−３−脱水
素酵素の遺伝子が単離された。また、大腸菌を宿主とし
て単離された該遺伝子をもとにＧ３ＤＨを組み換えＤＮ
Ａ技術で大量に調製できるようになった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (9)
- 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質である
グルコース−３−脱水素酵素。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質 - 【請求項２】配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸
配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱水素酵素 - 【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質である
グルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝子。 （ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつグルコース−３−脱水素酵素活性を
有する蛋白質 - 【請求項４】配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸
配列からなる蛋白質であるグルコース−３−脱水素酵素
をコードする遺伝子。 - 【請求項５】以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質である
グルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝子。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換もしくは付加されており、かつグルコー
ス−３−脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項６】配列表・配列番号２に記載される塩基配列
からなるＤＮＡを有するグルコース−３−脱水素酵素を
コードする遺伝子。 - 【請求項７】配列ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＨｉｓＴｙｒＡｓ
ｐＡｌａＩｌｅＶａｌＶａｌを含むグルコース−３−脱
水素酵素。 - 【請求項８】請求項１〜７においてＨａｌｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．α１５株またはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｃｕｐｉ
ｄａ Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ由来で
あるグルコース−３−脱水素酵素をコードする遺伝子。 - 【請求項９】請求項１〜８のいずれかに記載のグルコー
ス−３−脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み
換えベクター。を目的とする。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000237709A JP2002017372A (ja) | 2000-06-30 | 2000-06-30 | グルコース−３−脱水素酵素およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000237709A JP2002017372A (ja) | 2000-06-30 | 2000-06-30 | グルコース−３−脱水素酵素およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002017372A true JP2002017372A (ja) | 2002-01-22 |
Family
ID=18729526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000237709A Pending JP2002017372A (ja) | 2000-06-30 | 2000-06-30 | グルコース−３−脱水素酵素およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002017372A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013534416A (ja) * | 2010-06-14 | 2013-09-05 | 株式会社アモーレパシフィック | 新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 |
-
2000
- 2000-06-30 JP JP2000237709A patent/JP2002017372A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013534416A (ja) * | 2010-06-14 | 2013-09-05 | 株式会社アモーレパシフィック | 新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 |
| US9394562B2 (en) | 2010-06-14 | 2016-07-19 | Amorepacific Corporation | Soil microorganism, novel oxidoreductase separated from the soil microorganism, gene encoding the oxidoreductase, and method for producing aglycones using the microorganism, the oxidoreductase and the gene |
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