JP2013519378A - 低分子ｒｎａ分子の検出のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、多重反応における、低分子ＲＮＡ分子の検出のための組成物および方法を提供する。本明細書に記載されるアッセイおよびキットは、癌、発生性疾患および変性性疾患、神経障害、ならびに幹細胞障害が挙げられるが、これらに限定されない障害を同定、診断およびモニターするために適用可能である。本発明は、（ａ）タグであって、ここで該タグは、第１のＤＮＡ配列、およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含み、ここで該第１のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む、タグ；ならびに（ｂ）ブリッジであって、ここで該ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列、および該タグの該第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、ブリッジを含む組成物を提供する。

Description

（関連出願）
本出願は、２０１０年２月１１日に出願された米国仮特許出願６１／３０３，５１７からの優先権を主張し、上記米国仮特許出願は、その全容が、本明細書に援用される。

（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関し、具体的には、混合物中の標的核酸分子の検出、同定、および定量の分野に関する。

（発明の背景）
ヒト身体におけるすべての細胞は、同じ遺伝物質を含むが、同一の遺伝子は、それら細胞のうちのすべてにおいて活性であるわけではない。遺伝子発現パターンにおける改変は、生物学的機能に対して顕著な効果を有し得る。遺伝子発現におけるこれらバリエーションは、改変された生理学的および病的プロセスのコアになる。従って、病的な細胞と比較して、正常細胞における遺伝子の発現を同定および定量することは、新薬および診断標的の発見を補助し得る。

核酸は、それらの特定のポリヌクレオチド配列に基づいて、検出および定量され得る。既存の検出および定量の方法の根底にある基本的原理は、標識された相補的プローブ配列の、サンプル中の目的の標的配列へのハイブリダイゼーションである。二重鎖の形成は、上記サンプル中の上記標的配列の存在を示す。

この技術（分子ハイブリダイゼーションといわれる）は、複雑な混合物中で特定の核酸配列を同定および分析するための有用なツールであった。この技術は、例えば、生物学的サンプル中の種々の微生物の核酸配列を検出するために、診断において使用されてきた。さらに、ハイブリダイゼーション技術は、個体間の遺伝的差異もしくは多型をマップするために使用されてきた。さらに、これら技術は、細胞の異なる集団においてもしくは異なる遺伝子で処理された細胞において、遺伝子発現における変化をモニターするために使用されてきた。

ハイブリダイゼーション技術での低分子ＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子の同定は、いくつかの特有な困難を示す。代表的ｍｉＲＮＡ標的の長さの短いＲＮＡ分子への検出プローブのハイブリダイゼーションは、低い融解温度で生じ、複数の検出部分による同時の結合を妨げる。低い融解温度ハイブリダイゼーションは、単一の核酸だけが異なり得るｍｉＲＮＡ配列を標的とするために複数のプローブの特異的結合には不都合である。さらに、ｍｉＲＮＡ配列は、非常に種々のハイブリダイゼーション融解温度を生じる一定の長さもしくは保存された長さを有するにもかかわらず、大きな多様性を示す。

従って、複雑な混合物中の標的核酸分子の正確かつ敏感な検出、同定および定量が必要である。特に、複雑な混合物もしくは多重反応において、低分子ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ分子）の特異的検出が必要である。

（発明の要旨）
本発明の組成物および方法は、複雑な混合物もしくは多重反応において、低分子ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ分子）の特異的検出のために長期間必要とされてきた解決法を提供する。これは、上記標的低分子ＲＮＡと、特有なタグの特異的付着を指向するブリッジ分子との間のハイブリダイゼーションの融解温度を標準化することによって、単一の温度での特有な配列特異的タグ分子への任意の低分子ＲＮＡ分子の連結によって達成され得る。上記連結されたタグは、その後、タグ化低分子ＲＮＡの混合集団の融解温度を標準化し、このことは、上記混合集団が多重ハイブリダイゼーションアッセイに供されることを可能にする。上記アッセイにおいて、同じ温度で配列特異的様式において、低分子ＲＮＡを区別することは可能である。

具体的には、本発明は、（ａ）タグであって、ここで上記タグは、第１のＤＮＡ配列およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含み、ここで上記第１のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む、タグ；ならびに（ｂ）ブリッジであって、ここで上記ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、ブリッジ、を含む組成物を提供する。

この組成物の一局面において、上記第２のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ分子もしくはその一部分に相補的である。上記ＲＮＡ分子の一部分は、上記ＲＮＡ分子の全長より短い。特定の局面において、上記一部分は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、もしくは上記ＲＮＡ分子の全長の間での任意のパーセンテージ点である。さらに、上記一部分は、連続もしくは非連続のいずれかである。

上記組成物の別の局面において、上記タグの第１のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡを含む。ここで上記異質ＤＮＡは、いずれの他のＤＮＡとも、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列以外の上記組成物中のＲＮＡ分子とも、交差ハイブリダイズしない。代わりに、もしくはさらに、上記異質ＤＮＡは、ＤＮＡおよび上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列以外の上記組成物中のＲＮＡ分子のうちの１５％未満と交差ハイブリダイズする。具体的には、上記異質ＤＮＡ配列は、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下もしくは上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列以外の上記組成物中のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の間の任意のパーセンテージ点で交差ハイブリダイズする。上記組成物の特定の局面において、上記タグは、異質ＤＮＡから構成される第１のＤＮＡ配列を含み、上記異質ＤＮＡは、上記組成物中の任意の既知のＤＮＡもしくはＲＮＡに対して１５塩基以下の最大連続相動性で、３５塩基にわたって８５％以下である。あるいは、上記異質ＤＮＡは、任意の既知のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ配列に対して１５塩基以下の最大連続相動性で、３５塩基にわたって８５％以下の同一性を有する。さらに、上記異質ＤＮＡは、ゲノム（ここから、上記標的ＲＮＡ分子が転写される）に由来するかもしくは上記ゲノムによって転写される任意の既知のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列に対して１５塩基以下の最大連続相動性で、３５塩基にわたって８５％以下の同一性を有する。標的ＲＮＡ分子は、任意の種（動物、植物、細菌、真菌およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）のゲノムに由来するかもしくは上記ゲノムによって転写される。好ましい種は、哺乳動物（霊長類、このミズ育波、ヒトおよび齧歯類（ウサギ、ラットおよびマウスが挙げられる）が挙げられる）である。

上記タグの特定の局面において、上記第１のＤＮＡ配列および上記レポーター付着領域は、接線方向（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）もしくは重複している。上記第１のＤＮＡ配列および上記レポーター付着領域は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、もしくはその間の任意のヌクレオチド数の範囲のＤＮＡヌクレオチド数が重複し得る。さらに、上記第１のＤＮＡ配列および上記レポーター付着領域は、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％、もしくはその間の上記第１のＤＮＡ配列のヌクレオチドの任意のパーセンテージの範囲に及ぶ、上記第１のＤＮＡ配列中に存在するヌクレオチド総数のパーセンテージが重複し得る。特定の局面において、上記レポーター付着領域は、上記第１のＤＮＡ配列内に全体的に含まれ得る。

上記組成物の一実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、連続している。あるいは、上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドを含むリンカー分子によってつながれる。上記組成物の特定の局面において、上記リンカー分子は、２〜１００個の間のデオキシリボヌクレオチド、および具体的には、２〜１０個の間のデオキシリボヌクレオチド、１０〜２０個のデオキシリボヌクレオチド、２０〜３０個のデオキシリボヌクレオチド、３０〜４０個のデオキシリボヌクレオチド、４０〜５０個のデオキシリボヌクレオチド、５０〜６０個のデオキシリボヌクレオチド、６０〜７０個のデオキシリボヌクレオチド、７０〜８０個のデオキシリボヌクレオチド、８０〜９０個のデオキシリボヌクレオチド、９０〜１００個のデオキシリボヌクレオチド、もしくはその間の任意の数のデオキシリボヌクレオチドを含む。上記リンカー分子は、任意の種から得られるかもしくは任意の種に由来するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（異質もしくは合成配列を含む）を含み得る。

上記組成物の特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。他の局面において、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。

上記組成物の好ましい局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、実質的に同じ融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、もしくはその間の任意の程度以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。好ましくは、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、もしくは５℃の中で融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。

上記組成物の別の実施形態において、上記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む。この実施形態の一局面において、上記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列の一部分を含む。

上記組成物の別の実施形態において、上記ＲＮＡは、非コードＲＮＡを含む。例示的非コードＲＮＡとしては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、およびｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい局面において、上記非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。代わりにもしくはさらに、上記ＲＮＡ分子は、１０〜３００個の間のリボヌクレオチドを含む。

上記組成物の特定の実施形態において、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、完全な相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。代わりに、もしくはさらに、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、部分的相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。特定の局面において、部分的相補性は、完全未満もしくは１００％未満の相補性として定義される。あるいは、部分的相補性は、１００％未満、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、もしくはその間の任意のパーセンテージ値での結合として定義される。

本発明は、（ａ）以下：（１）タグであって、ここで上記タグは、第１のＤＮＡ配列およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含む、タグ；ならびに（２）ブリッジであって、ここで上記ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含むブリッジ、を含む組成物；ならびに（ｂ）ボリュームエクスクルーダー（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｄｅｒ）およびヌクレアーゼからなる群より選択される物質、を含むキットをさらに提供する。必要に応じて、上記キットは、リガーゼをさらに含む。

上記キットの一実施形態において、上記選択された物質は、ボリュームエクスクルーダーである。好ましいボリュームエクスクルーダーの非限定的例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

上記キットの別の実施形態において、上記選択された物質は、ヌクレアーゼである。上記ヌクレアーゼは、好ましくは、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼである。ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼの非限定的例は、λエキソヌクレアーゼである。

上記キットの特定の実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、連続している。あるいは、上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、リンカー分子によって繋げられる。上記キットの特定の局面において、上記リンカー分子は、２〜１００個の間のデオキシリボヌクレオチド、および具体的には、２〜１０個の間のデオキシリボヌクレオチド、１０〜２０個のデオキシリボヌクレオチド、２０〜３０個のデオキシリボヌクレオチド、３０〜４０個のデオキシリボヌクレオチド、４０〜５０個のデオキシリボヌクレオチド、５０〜６０個のデオキシリボヌクレオチド、６０〜７０個のデオキシリボヌクレオチド、７０〜８０個のデオキシリボヌクレオチド、８０〜９０個のデオキシリボヌクレオチド、９０〜１００個のデオキシリボヌクレオチド、もしくはその間のデオキシリボヌクレオチドの任意の数を含む。上記リンカー分子は、異質配列を含む、任意の種から得られるかもしくは任意の種に由来するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を含み得る。

上記キットの他の実施形態において、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。さらなる実施形態において、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。

好ましい実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、実質的に同じ融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、もしくはその間の任意の程度以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。好ましくは、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、もしくは５℃以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。

別の好ましい実施形態において、上記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む。

上記キットの特定の実施形態において、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、完全な相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。代わりに、もしくはさらに、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、部分的相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。特定の局面において、部分的相補性は、完全未満もしくは１００％未満の相補性として定義される。あるいは、部分的相補性は、１００％未満、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％の相補性での、またはその間の任意のパーセンテージ値での結合として定義される。

本発明は、ＲＮＡ分子を検出するための方法をさらに提供し、上記方法は、（ａ）少なくとも１個のＲＮＡ分子を含むサンプルを提供する工程；（ｂ）タグを提供する工程であって、ここで上記タグは、第１のＤＮＡ配列およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含む、工程；（ｃ）ブリッジを提供する工程であって、ここで上記ブリッジは、上記ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、工程；ならびに（ｄ）緩衝液を提供する工程；（ｅ）３７〜９５℃の間で上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを特異的にアニーリングさせる工程；（ｆ）３７〜９５℃の間で上記アニーリング反応物を保持する工程；（ｇ）リガーゼ緩衝液を提供する工程；（ｈ）リガーゼを、３７〜９５℃の間で上記アニーリングされた反応生成物に提供する工程；（ｉ）３７〜９５℃の間の１つ以上の温度で上記ＲＮＡ分子を上記タグに連結する工程；ならびに（ｊ）上記シグナルを検出する工程、を包含する。

特定の実施形態において、ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法は、３７〜９５℃の間で上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを特異的にアニーリングさせる前に、上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを変性する工程をさらに包含する。

この方法の別の実施形態において、工程（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、および（ｉ）は、４３〜５２℃の間で行われる。

他の実施形態において、ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法は、３７〜９５℃の間で上記アニーリング反応物を保持した後に、ボリュームエクスクルーダーを提供する工程をさらに包含する。ボリュームエクスクルーダーの非限定的例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

特定の実施形態において、上記方法は、３７〜９５℃の間で上記ＲＮＡ分子を上記タグに連結した後に、ヌクレアーゼを上記連結反応に提供する工程をさらに包含する。一局面において、上記ヌクレアーゼは、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼである。上記ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼの非限定的実施例は、λエキソヌクレアーゼである。

ＲＮＡ分子を検出するこの方法の好ましい実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、連続している。あるいは、上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、リンカー分子によって繋げられる。この方法の特定の局面において、上記リンカー分子は、２〜１００個の間のデオキシリボヌクレオチド、および具体的には、２〜１０個の間のデオキシリボヌクレオチド、１０〜２０個のデオキシリボヌクレオチド、２０〜３０個のデオキシリボヌクレオチド、３０〜４０個のデオキシリボヌクレオチド、４０〜５０個のデオキシリボヌクレオチド、５０〜６０個のデオキシリボヌクレオチド、６０〜７０個のデオキシリボヌクレオチド、７０〜８０個のデオキシリボヌクレオチド、８０〜９０個のデオキシリボヌクレオチド、９０〜１００個のデオキシリボヌクレオチド、もしくはその間のデオキシリボヌクレオチドの任意の数を含む。上記リンカー分子は、異質配列を含む、任意の種から得られるかもしくは任意の種に由来するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を含み得る。

ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法の別の実施形態において、上記ＲＮＡは、非コードＲＮＡを含む。例示的な非コードＲＮＡとしては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、およびｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。この方法の好ましい局面において、上記非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。

ＲＮＡ分子を検出するこの方法の特定の実施形態において、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。他の実施形態において、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。

ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法の好ましい実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、実質的に同じ融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、１℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、もしくは互いにその間の任意の程度以内で融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。好ましくは、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、もしくは５℃以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。

ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法の一実施形態において、上記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む。

ＲＮＡ分子を検出するためのこの方法の特定の局面において、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、完全な相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。代わりに、もしくはさらに、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、部分的相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。特定の局面において、部分的相補性は、完全未満もしくは１００％未満の相補性として定義される。あるいは、部分的相補性は、１００％未満、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％の相補性での、またはその間の任意のパーセンテージ値での結合として定義される。

本発明は、複数のＲＮＡ分子の多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のための方法をさらに提供し、上記方法は、（ａ）複数のＲＮＡ分子を含むサンプルを提供する工程；（ｂ）複数のタグを提供する工程であって、ここで各タグは、第１のＤＮＡ配列およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着する少なくとも１個のレポーター付着領域を含む、工程；（ｃ）複数のブリッジを提供する工程であって、ここで各ブリッジは、１個のＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含み、ここで各ブリッジは、ＲＮＡ分子の１種およびタグの１種に特異的にアニーリングし、ここで上記タグの１種は、上記ＲＮＡの１種が上記タグに結合される場合にＲＮＡ分子の他の種と比較して、ＲＮＡ分子の１種を異なって標識するシグナルを生じる、工程；（ｄ）緩衝液を提供する工程；（ｅ）３７〜９５℃の間で上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを特異的にアニーリングさせる工程；（ｆ）３７〜９５℃の間で上記アニーリング反応物を保持する工程；（ｇ）リガーゼ緩衝液を提供する工程；（ｈ）リガーゼを、３７〜９５℃の間で上記アニーリング反応物に直接提供する工程；（ｉ）３７〜９５℃の間の１つ以上の温度で上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを、連結する工程；ならびに（ｊ）１種以上のシグナルを検出する工程、を包含する。

一実施形態において、複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法は、３７〜９５℃の間で上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを特異的にアニーリングさせる前に、上記ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを変性する工程をさらに包含する。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の別の実施形態において、工程（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、および（ｉ）は、４３〜５２℃の間で行われる。

特定の実施形態において、複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法は、３７〜９５℃の間で上記アニーリング反応物を保持した後に、ボリュームエクスクルーダーを提供する工程をさらに包含する。上記ボリュームエクスクルーダーの非限定的例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。代わりに、もしくはさらに、上記方法は、３７〜９５℃において上記ＲＮＡ分子を上記タグに連結した後に、ヌクレアーゼを上記連結反応物に提供する工程をさらに包含する。一局面において、上記ヌクレアーゼは、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼである。上記ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼの非限定的な例は、λエキソヌクレアーゼである。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の好ましい実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、連続している。あるいは、上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、リンカー分子によってつながれる。この方法の特定の局面において、上記リンカー分子は、２〜１００個の間のデオキシリボヌクレオチド、および具体的には、２〜１０個の間のデオキシリボヌクレオチド、１０〜２０個のデオキシリボヌクレオチド、２０〜３０個のデオキシリボヌクレオチド、３０〜４０個のデオキシリボヌクレオチド、４０〜５０個のデオキシリボヌクレオチド、５０〜６０個のデオキシリボヌクレオチド、６０〜７０個のデオキシリボヌクレオチド、７０〜８０個のデオキシリボヌクレオチド、８０〜９０個のデオキシリボヌクレオチド、９０〜１００個のデオキシリボヌクレオチド、もしくはその間の任意の数のデオキシリボヌクレオチドを含む。上記リンカー分子は、異質配列を含む、任意の種から得られるかもしくは任意の種に由来するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を含み得る。

別の好ましい実施形態において、上記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の別の実施形態において、上記ＲＮＡ分子は、非コードＲＮＡを含む。上記非コードＲＮＡの非限定的な例としては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、もしくはｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、上記非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の特定の実施形態において、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第２のＤＮＡ配列および上記ＲＮＡ分子は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する。他の実施形態において、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、３７〜９５℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。あるいは、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列および上記タグの上記第１の配列は、４４〜５３℃の間の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の好ましい実施形態において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、実質的に同じ融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、もしくはその間の任意の程度以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。好ましくは、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、もしくは５℃以内の融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。

複数のＲＮＡ分子のこの多重検出法の一実施形態において、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、完全な相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。代わりに、もしくはさらに、上記ＲＮＡ分子および／もしくは上記タグは、部分的相補性で上記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む。特定の局面において、部分的相補性は、完全未満もしくは１００％未満の相補性として定義される。あるいは、部分的相補性は、１００％未満、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、もしくはその間の任意のパーセンテージ値での結合として定義される。

本発明はまた、核酸ブリッジ分子を作製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）ＲＮＡ分子を選択する工程；（ｂ）上記ＲＮＡ分子のセグメントを選択する工程であって、上記ＲＮＡ分子の上記セグメントは、３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記ＲＮＡ分子の上記セグメントに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子と、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する工程；（ｃ）第１のＤＮＡブリッジ分子を生成する工程であって、上記第１のＤＮＡブリッジ分子は、３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記ＲＮＡ分子の上記セグメントに特異的にハイブリダイズする工程；（ｄ）タグを選択する工程であって、ここで上記タグは、異質配列であるＤＮＡ配列を含む、工程；（ｅ）上記タグのセグメントを選択する工程であって、上記タグの上記セグメントは、３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記タグの上記セグメントに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子と、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する工程；（ｆ）３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記タグの上記セグメントに特異的にハイブリダイズする第２のＤＮＡブリッジ分子を生成する工程；ならびに（ｇ）上記第１のＤＮＡブリッジ分子と、上記第２のＤＮＡブリッジ分子とを一体化させ、それによって、３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記標的ＲＮＡ分子の上記セグメントおよび３７〜９５℃の間の融解温度を有する上記タグの上記セグメントに特異的にハイブリダイズする上記核酸ＤＮＡブリッジ分子を形成する工程を包含する。

核酸ブリッジ分子を作製するためのこの方法の特定の実施形態において、上記一体化する工程は、上記第１のＤＮＡブリッジ分子を上記第２のＤＮＡブリッジ分子に連結する工程を包含する。あるいは、上記一体化する工程は、上記第１のＤＮＡブリッジ分子の配列および上記第２のＤＮＡブリッジ分子の配列を含む核酸ＤＮＡブリッジ分子を合成する工程を包含する。

核酸ブリッジ分子を作製するこの方法の好ましい実施形態において、上記第１のＤＮＡブリッジ分子および上記第２のＤＮＡブリッジ分子は、実質的に同じ融解温度を有する。特定の局面において、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、もしくはその間の任意の程度以内で融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。好ましくは、上記ブリッジの上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、互いに１℃、２℃、もしくは５℃以内で融解温度を有する核酸二重鎖を形成する。

核酸ブリッジ分子を作製するこの方法の別の好ましい実施形態において、上記第２のＤＮＡブリッジ分子は、上記タグの第１のＤＮＡ配列の５’末端から選択される。具体的には、上記第２のＤＮＡ分子は、２〜５個のヌクレオチド、２〜１０個のヌクレオチド、２〜２０個のヌクレオチド、２〜３０個のヌクレオチド、２〜４０個のヌクレオチド、２〜５０個のヌクレオチド、２〜６０個のヌクレオチド、２〜７０個のヌクレオチド、２〜８０個のヌクレオチド、２〜９０個のヌクレオチド、２〜１００個のヌクレオチドもしくは上記タグの第１のＤＮＡ配列の５’末端に由来するヌクレオチドの間の任意の範囲を含む、上記タグの第１のＤＮＡ配列の一部分から選択される。好ましくは、上記第２のＤＮＡ分子は、上記タグの第１のＤＮＡ配列の５’末端から２〜１０個の間のヌクレオチドもしくは２〜２０個の間のヌクレオチドを含む、上記タグの第１のＤＮＡ配列の一部分から選択される。

核酸ブリッジ分子を作製するこの方法の特定の実施形態において、上記ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖は、４３〜５２℃の間の融解温度を有する。代わりに、もしくはさらに、上記ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、４３〜５２℃の間の融解温度を有する。

核酸ブリッジ分子を作製するためのこの方法の好ましい実施形態において、上記第１のＤＮＡブリッジ分子および上記第２のＤＮＡブリッジ分子は、連続している。あるいは、上記第２のおよび第３のＤＮＡ配列は、リンカー分子によって繋げられる。この方法の特定の局面において、上記リンカー分子は、２〜１００個の間のデオキシリボヌクレオチド、および具体的には、２〜１０個の間のデオキシリボヌクレオチド、１０〜２０個のデオキシリボヌクレオチド、２０〜３０個のデオキシリボヌクレオチド、３０〜４０個のデオキシリボヌクレオチド、４０〜５０個のデオキシリボヌクレオチド、５０〜６０個のデオキシリボヌクレオチド、６０〜７０個のデオキシリボヌクレオチド、７０〜８０個のデオキシリボヌクレオチド、８０〜９０個のデオキシリボヌクレオチド、９０〜１００個のデオキシリボヌクレオチド、もしくはその間の任意の数のデオキシリボヌクレオチドを含む。上記リンカー分子は、異質配列を含む、任意の種から得られるかもしくは任意の種に由来するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を含み得る。

核酸ブリッジ分子を作製するためのこの方法の他の実施形態において、上記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡである。あるいは、上記ＲＮＡ分子は、非コードＲＮＡを含む。好ましくは、上記非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。

特に、上記ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡであるが、本明細書で提示されるすべての実施形態に関して、核酸ブリッジ分子を作製するためのこの方法のそれら実施形態において、上記第１のＤＮＡブリッジ分子は、完全な相補性で上記ＲＮＡ分子にハイブリダイズする。あるいは、上記第１のＤＮＡブリッジ分子は、部分的相補性で上記ＲＮＡ分子にハイブリダイズする。本明細書で提示されるすべての実施形態に関して、上記第２のＤＮＡブリッジ分子は、完全な相補性で上記タグにハイブリダイズする。あるいは、上記第２のＤＮＡブリッジ分子は、部分的相補性で上記タグにハイブリダイズする。特定の局面において、部分的相補性は、完全未満もしくは１００％未満の相補性として定義される。あるいは、部分的相補性は、１００％未満、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、もしくはその間の任意のパーセンテージ値での結合として定義される。

図１は、Ｔｍ（摂氏度（℃））に対するヒトｍｉＲＮＡのパーセンテージ（％）として、ヒトｍｉＲＮＡ融解温度（Ｔｍ）分布を示すグラフである。 図２は、キメラＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の模式図である。ここで上記レポーター付着領域（Ａ）は、上記ＤＮＡタグを含み、上記ＤＮＡ配列（Ｃ）および（Ｄ）は、上記ブリッジを含む。 図３は、キメラＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の模式図である。ここで上記レポーター付着領域（Ａ）およびさらなる配列（Ｂ）は、上記ＤＮＡタグを含み、上記ＤＮＡ配列（Ｃ）および（Ｄ）は、上記ブリッジを含む。 図４は、ゲル電気泳動アッセイの写真である。４５〜５２℃の範囲の温度で完了し、ｍｉＲＮＡ、タグおよびその対応するブリッジを含む成功裏の連結反応の結果が、示される。 図５Ａは、肺組織から単離された総ＲＮＡに対する、骨格筋から単離された総ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。図５Ｂは、結腸組織から単離された総ＲＮＡに対して、心臓組織から単離された総ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。 図５Ｃは、肺組織から単離された総ＲＮＡに対する、心臓組織から単離された総ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。図５Ｄは、骨格筋から単離された総ＲＮＡに対する、結腸組織から単離された総ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。 図６Ａは、骨格筋、肺、結腸、および心臓組織から単離された総ＲＮＡにおける、ヒトｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、およびｍｉＲ−３０の発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。図６Ｂは、骨格筋、肺、結腸、および心臓組織から単離された総ＲＮＡにおけるヒトｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１の発現レベルを示すグラフである。サンプルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットを使用して測定した。 図７は、同じ組織原から集められたホルマリン固定され、パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）か、または凍結ヒト肝臓サンプルのいずれかから精製した総ＲＮＡのうちの１００ｎｇに対して実施した５５個のヒトｍｉＲＮＡについての、多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現活性の結果を示すグラフである。結果は、町治した凍結肝臓コントロールにおける計数に対する、マッチしたＦＦＰＥ肝臓ＲＮＡにおける計数として表される。 図８は、２回の技術的複製の相関を示すグラフである。ここで６７６個のヒトｍｉＲＮＡについての多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイを、ヒト脳総ＲＮＡのうちの１００ｎｇに対して実施した。上記データは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）計数（技術的複製♯１）に対するｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）計数（技術的複製♯２）として示す。 図９Ａは、多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイにおいて基準ブリッジプールおよび改変体ブリッジプールでアッセイした５個の基準（左）、改変体１（中央）、もしくは改変体２（右） 合成ｍｉＲＮＡの混合物を示す一連のグラフである。上記グラフは、３つの混合物の各々が、基準（黒棒）、改変体１（白棒）、および改変体２（灰色棒）のブリッジプールについてアッセイした場合の計数結果を示す。図９Ｂは、５個のｍｉＲＮＡの各々について６０％ 基準（黒）、３０％ 改変体１（白）、および１０％改変体２（灰色）を含む混合物を測定するために使用されるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイからの結果を示すグラフである。このアッセイにおいて測定された各種の相対量は、各ｍｉＲＮＡの総シグナルのうちのパーセンテージとして示される。

（詳細な説明）
本発明は、ｍＲＮＡ遺伝子発現の多重分析のための感度の高いハイブリダイゼーションベースの技術を提供する。本発明の特定の実施形態において、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムが使用される。上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムを使用するｍＲＮＡ検出実験において、高いハイブリダイゼーション反応温度（代表的には、６５℃）は、７０〜１００塩基標的領域の特異的標的／レポーター相互作用を促進する。このようなアッセイは、このような短い配列の低い融解温度（Ｔ_ｍ）に起因して、低分子核酸種（例えば、ｍｉＲＮＡ）の検出を可能にしない。従って、本発明は、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットにおいて使用され得る新規なアッセイを提供することによってこの問題を解決する。これは、本明細書に記載されるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムと適合性であり、モデル系としてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して、短いＲＮＡの特異的かつ感度の高い検出を可能にする。上記アッセイは、低分子ＲＮＡの各別個の種に特異的ＤＮＡタグを付着させ、それによって、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの標準的ハイブリダイゼーション条件と適合性であるように十分高いＴ_ｍでキメラＲＮＡ−ＤＮＡ標的を作ることを含む。上記タグの付加は、単一のサンプルが、数百種もの低分子ＲＮＡについて同時にアッセイされ得るように、多重様式で行われ得る。本発明の重要な特徴は、上記タグ付着反応の特異性および効率が多重フォーマットで維持されるように、狭く規定された反応条件下での各タグの非常に特異的な付着である。ここで別個の相互作用のすべてが、同時にかつ同一の反応条件下で生じる。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが約２１〜２３個のヌクレオチドの、小さな内因性の調節性の非コード一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは一般に、非常に多くの配列多様性を示す一方で、ｍｉＲＮＡの小さなグループ（ｍｉＲＮＡファミリー）は、＞９０％ 配列同一性で存在する。ほぼ同一の種の特異的検出のためのハイブリダイゼーションベースのアッセイは、上記標的種のＴ_ｍ付近でハイブリダイゼーションが起こるときに最も感度が高い。このような条件は、標的種とミスマッチ種との間の熱力学的不安定化を最大にすることによって、ほぼ同一の配列の間の交差ハイブリダイゼーションを大いに減少させる。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡの全体的な配列多様性は、それらのハイブリダイゼーションの特異的多重検出を複雑にする。なぜなら、それは、標的間で至適ハイブリダイゼーション温度（すなわち、標的Ｔ_ｍ）が変動することを意味するからである（図１）。上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットの第２の重要な特徴は、天然に存在する低分子ＲＮＡ配列の種々のＴ_ｍの標準化を可能にする各合成ＤＮＡタグの標的特異的設計である；言い換えると、個々のタグは、根底にある生物学的ＲＮＡ配列のＴ_ｍに関わらず、最終的なＲＮＡ−ＤＮＡキメラ等価物のＴ_ｍを作製するように設計される。このことは、その後のハイブリダイゼーション検出アッセイが多様な種すべてについて単一の温度で行われることを可能にし、よって、検出反応の多重化を可能にする。

（マイクロＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらの標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をタンパク質へと翻訳するのを阻害することによって作用すると仮定される、低分子の調節性非コードＲＮＡである。ＭｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ変性を引き起こすかもしくは翻訳自体を阻害するかのいずれかによって、ｍＲＮＡ翻訳を阻害する。

ＭｉＲＮＡは、長さが約２１〜２３個のヌクレオチドである一本鎖のＲＮＡ分子である。ＭｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡから転写される内因性および外因性遺伝子によってコードされる；しかし、ｍｉＲＮＡは、代表的には、ポリペプチド配列へと翻訳されない。よって、ｍｉＲＮＡは、「非コードＲＮＡ」として当該分野でみなされる。用語「内因性」遺伝子とは、本明細書で使用される場合、個体のゲノム内で天然に起こるすべての遺伝子を包含することが意味される。用語「外因性」遺伝子とは、本明細書で使用される場合、個体のゲノム内で天然には存在しないすべての遺伝子を含むことが意味される。例えば、ｍｉＲＮＡは、ウイルスによって外因性に導入され得る。

本発明のＭｉＲＮＡ分子は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、および成熟ｍｉＲＮＡを含む。成熟ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡからｐｒｉ−ｍｉＲＮＡへと最初に転写される。Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、各々長さが約７０ヌクレオチドである少なくとも１個（ポリシストロンユニットから転写される場合、最大６個まで）のヘアピンループ構造を含む。単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、複数のｍｉＲＮＡを含む能力がある。Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはまた、ＲＮＡ編集に供され得る。ここで上記ｍｉＲＮＡプロセシングもしくは特異性が改変される。Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、細胞核において、各ヘアピン構造（ステムへの２個のらせんＲＮＡターン）の基部から約１１ヌクレオチドを切断して、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを形成する。ジグザグ切断（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）が、上記ヘアピンループアームの末端に導入され、３’末端に２個のヌクレオチドの突出部および５’末端にホスフェートを生じて、長さが約７０ヌクレオチドのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを生成する。細胞質において、上記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは切断され、上記成熟ｍｉＲＮＡ鎖およびその反対側の相補的ｍｉＲＮＡ＊鎖を含む長さが約２０〜２５ヌクレオチド対の不完全なｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖を生じる。上記パッセンジャー鎖、もしくは相補的ｍｉＲＮＡ鎖＊は、通常は分解され、定常状態では、細胞柱に低レベルで存在するが、上記二重鎖の両方の鎖が異なるｍＲＮＡ集団を標的とする機能的ｍｉＲＮＡになる場合もある。

用語「ｍｉＲＮＡ」は、配列特異的遺伝子サイレンシングもしくは干渉（例えば、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉核酸、短い干渉化学改変ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、および他の当該分野で認識されている等価物）を媒介し得る核酸分子を記載するために使用される他の用語に等価である。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子サイレンシング」とは、遺伝子、転写物および／もしくはポリペプチド生成物のダウンレギュレーション、ノックダウン、分解、阻害、抑制（ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ）、抑止（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、防止、もしくは低下した発現を記載することが意味される。遺伝子サイレンシングおよび干渉はまた、ｍＲＮＡ転写物をポリペプチドへ翻訳することの防止を記載する。ｍＲＮＡ転写物を分解するかもしくはｍＲＮＡ翻訳をブロックすることによって、翻訳が防止されるか、阻害されるか、もしくは低下させられる。

本発明のブリッジは、部分的配列相補性もしくは完全配列相補性のいずれかに基づいて、それらの標的ｍｉＲＮＡに特異的に結合する。例示的ｍｉＲＮＡは、以下の表１に提供される。

（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムプロトコルの概観およびデータフォーマット）
上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの基本は、アッセイされるべき各遺伝子に割り当てられた特有のコードである（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９９５９およびＧｅｉｓｓら．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８．２６（３）：３１７−３２５；これらの内容は、それら全体が本明細書に参考として援用される）。上記コードは、アッセイされるべき各標的の特有のバーコードを作る色つき蛍光スポットの規則正しいシリーズから構成される。プローブの対は、各標的に対して設計される（ビオチン化捕捉プローブおよび蛍光バーコードを有するレポータープローブ）。

特異的レポータープローブおよび捕捉プローブは、各標的に対して合成される。簡潔には、配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが、コード特異的レポーター分子に付着する。捕捉プローブは、各表的に対する第２の配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ビオチンを含むユニバーサルオリゴヌクレオチドに連結することによって作製される。レポータープローブおよび捕捉プローブは、タンパク質イルのハイブリダイゼーション混合物「プローブライブラリー」へとすべてプールされる。

すべての標的の発現レベルは、単一の多重ハイブリダイゼーション反応において測定される。上記サンプルは、上記プローブライブラリーと合わせられ、ハイブリダイゼーションが溶液中で起こる。ハイブリダイゼーション後、三者のハイブリダイズした複合体が、上記捕捉プローブおよびレポータープローブに存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに連結した磁性ビーズを使用する２工程手順において精製される。この２部分からなる精製プロセスは、上記ハイブリダイゼーション反応が、大過剰の標的特異的プローブでの完了へと駆動されることを可能にする。なぜなら上記標的特異的プローブは、最終的に除去されるからである。従って、上記サンプルの結合および画像化に干渉しない。すべてのハイブリダイゼーション後工程は、特注の液体取り扱いロボット（Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でロボットにより取り扱われる。

精製反応物は、プレップステーションによってサンプルカートリッジの個々のフローセルへと置かれ、上記捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆表面に結合させられ、電気泳動にかけられ、上記レポータープローブを伸長させ、そして固定化される。加工処理後、上記サンプルカートリッジは、完全自動化画像化およびデータ収集デバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ）へと移される。標的の発現レベルは、各サンプルを画像化し、標的が検出されるコードの倍数を計数することによって測定される。各サンプルに関して、代表的には、上記結合表面の約１０ｍｍ^２を表す６００視野（ｆｉｅｌｄｓ−ｏｆ−ｖｉｅｗ）（ＦＯＶ）が画像化される（１３７６×１０２４ピクセル）。代表的な画像化密度は、多重化の程度、ＲＮＡの量、および全体的な標的発現レベルに依存して、１００〜１２００計数レポーター／視野である。データは、サンプルあたりの計数／標的を列挙する単一のスプレッドシートフォーマットで出力される。

（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイサンプル調製プロトコル）
上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイにおいて、上記ｍｉＲＮＡサンプルは、これらが上記のｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） 分析システムのプローブハイブリダイゼーション反応へと導入され得る前に、タグ化されなければならない。別段示されなければ、提供される例におけるデータを、以下のｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットサンプル調製プロトコルの実施形態、続いて、上記でおよびＧｅｉｓｓらにおいて簡潔に記載された標準的ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） アッセイプロトコルを使用して、生成した。

アニーリング緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ，７５０ｍＭ ＫＣｌ）を、タグプールと混合した。上記タグプールは、表２に記載されるものに類似の上記合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のセットの６０ｎＭ各々を含む。このプールの正確な組成は、測定されている特異的ｍｉＲＮＡに依存する。ブリッジプールの等量が、上記混合物に添加される。上記ブリッジプールは、表３に記載されるものに類似の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のセットの５５ｎＭ各々からなる。このプールの正確な組成は、測定されている特異的ｍｉＲＮＡに依存し、上記タグプールのプロフィールをマッチさせる。１００ｎｇの総ＲＮＡもしくは規定された量の合成ＲＮＡ標的（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が添加される。ＤＥＰＣ処理水（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を添加して、各反応の容積を標準化した。サンプルを変性させ、サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でアニーリングした（℃）。５０％ ＰＥＧ−４０００（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ／ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の等パーツ混合物を、添加のために調製した。サンプルを、上記サーモサイクラーから一時的に取り出し、ＰＥＧ／リガーゼ緩衝液ストック溶液を、各チューブに添加し、サンプルを混合し、遠心分離した。チューブを上記サーモサイクラーに戻し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を、上記サーモサイクラーからそれらを取り出すことなく、上記サンプルに直接添加した。すべてのサーモサイクラー反応を、４５〜５０℃の範囲の温度において行った（図４）。

λエキソヌクレアーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を、室温において各サンプルに添加した。サンプルを、３７℃において２時間にわたってインキュベートし、７０℃において熱不活性化し、冷却した。サンプルを、ＤＥＰＣ処理水で１０倍希釈し、製造業者の指示書に従って、ｍｉＲＮＡ検出のためのコードセット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を使用して、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ハイブリダイゼーション反応において基質として使用する。

リガーゼの装填は、２４サンプルあたり約６分間かかるはずである。４８℃でのヒートブロック上の反応チューブへのリガーゼの直接添加は、重要な工程である。そうすることができなければ、特に、アッセイ特異性に関して、アッセイ性能の低下を生じる。

本明細書に記載される変性、アニーリング、連結、および精製反応は、例えば、３７〜９５℃にわたるより広い温度範囲内で行われ得る。具体的には、本明細書に記載される変性、アニーリング、連結、および精製反応は、以下の範囲（３７〜４５℃、４４〜５３℃、４５〜５２℃、４５〜５０℃、５０〜５５℃、５５〜６０℃、６５〜７０℃、７０〜７５℃、７５〜８０℃、８５〜９０℃、および９０〜９５℃が挙げられるが、これらに限定されない）のうちの１つ以上で行われる。あるいは、本明細書で記載される変性、アニーリング、連結、および精製反応は、以下の範囲（３７〜４５℃、３７〜５０℃、３７〜５５℃、３７〜６０℃、３７〜６５℃、３７〜７０℃、３７〜７５℃、３７〜８０℃、３７〜８５℃、３７〜９０℃、および３７〜９５℃が挙げられるが、これらに限定されない）のうちの１つ以上で行われる。
以下の例におけるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）は、上記アッセイからのデータは、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムによって６００視野において検出される計数として表す。計数は、上記標的ＲＮＡの発現レベルと相関する。

以下、表１における対応するｍｒＲＮＡの検出に適した例示的タグおよびブリッジ配列が示される。

（ブリッジおよびタグの設計）
上記低分子ＲＮＡ標的への特異的核酸タグの付加は、２つの主要な目的にかなう：１）それは、各ＲＮＡ種に強く特有の識別子を付加し、ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて密接に関連したＲＮＡ標的間を区別しやすくする；および２）それは、異なるＲＮＡ標的のためのハイブリダイゼーションアッセイが、同じ温度で多重化され得るように、上記標的の機能的Ｔ_ｍの操作および均一化を可能にする。

偽陽性シグナルをもたらす交差ハイブリダイゼーションを回避するために、上記タグ配列は、上記低分子ＲＮＡ標的配列が由来する生物のトランスクリプトームにおける任意の他の配列に関連するべきではない。必要に応じて、上記タグ配列は、同じタグを使用して、任意の生物についてｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）低分子ＲＮＡ調製物アッセイキットを生成し得るように、任意の既知の生物のトランスクリプトームに関連するべきではない。交差ハイブリダイゼーション回避は、上記タグ配列を生成するために出発点として、Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ）データベースからの新規な配列を使用することによって達成した。

合成の容易さのために、上記核酸タグを、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして設計し、上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、各ＲＮＡの３’末端に共有結合的に連結させ、検出のためのキメラＲＮＡ−ＤＮＡ標的を形成した。上記検出アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ’ｓ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムに基づく）は、上記標的への２個の隣接するプローブ（各々、Ｔ_ｍ ７６℃〜８４℃を有する）のハイブリダイゼーションに依拠する。上記最終的なＲＮＡ−ＤＮＡキメラ標的を、２つの領域（レポーター付着領域および捕捉付着領域（各々、Ｔ_ｍ 約７６℃〜８４℃を有する））を含むように設計した。

上記タグの連結は、個々にかつ多重化した状況の両方において、非常に特異的でなければならない。この特異性は、一方の末端において上記低分子ＲＮＡに、かつ他方の末端において上記特異的タグに配列特異的様式でアニーリングし（図２）、上記ＲＮＡおよびその割り当てられたタグを非常に近くで一緒にし、２つの間の共有結合を形成するために連結事象を可能にするＤＮＡオリゴヌクレオチドブリッジの個々の設計を介して達成される。低分子ＲＮＡの数百もの異なる種の、それらそれぞれのタグへの連結を多重化する能力を、上記ブリッジ／ＲＮＡ／タグ相互作用のＴ_ｍの計算に基づいて、上記ブリッジ配列およびタグ配列の注意深い設計によって達成した。その結果、上記ブリッジのすべては、計算されたＴ_ｍが４４℃〜５３℃の間である狭い温度範囲内でそれらの標的ＲＮＡおよびタグに特異的にアニーリングする。これらトリミングされた配列の例は、表４に示される。

すべてのＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍ計算を、Ａｌｌａｗｉ Ｈ．Ｔ．，ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．（１９９７） Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ＮＭＲ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｇ−Ｔ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０５８１−１０５９４およびＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．Ｊｒ，Ａｌｌａｗｉ Ｈ．Ｔ．，Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ Ｐ．Ａ．（１９９６）． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：３５５５−３５６２に記載される方法を使用して行った。

すべてのＲＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍ計算を、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．，Ｎａｋａｎｏ Ｓ．，Ｋａｔｏｈ Ｍ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ａ．，Ｎａｋａｍｕｔａ Ｈ．，Ｏｈｍｉｃｈｉ Ｔ．，Ｙｏｎｅｙａｍａ Ｍ．，Ｓａｓａｋｉ Ｍ．（１９９５）． Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄ ｄｕｐｌｅｘｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１−１１２１６およびＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．Ｊｒ，Ａｌｌａｗｉ Ｈ．Ｔ．，Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ Ｐ．Ａ．（１９９６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：３５５５−３５６２に記載される方法を使用して行った。上記ＤＮＡ／ＲＮＡ計算におけるＮａ^＋濃度の調節は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａらにおける上記ＤＮＡ二重鎖係数を使用して行ったことに注意のこと。

（タグおよびブリッジの設計）
配列の出発プールを、配列のＥｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｕｋｐｍｃ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｃｇｉ？ａｒｔｉｄ＝４８６４０６において公に入手可能）から配列を選択することによって生成した。

次いで、これら配列は、それらを３５塩基の領域に分け、それらの推定Ｔ_ｍを計算することによって、加工処理される。「レポーター付着プール」を、７６℃〜８４℃の間のＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍを有する３５塩基の配列から作った。第２の「全体プール」を、無作為の長さの残りの配列から作った。各々の短いＲＮＡ配列（図２および図３において点線として示される）に関して、３５塩基の配列を、上記レポーター付着プールから任意に選択し、上記レポーター付着領域として割り当てた（図２〜３，フラグメントＡ）。上記低分子ＲＮＡの逆相補体（ＲＮＡ−ＲＣ配列）を生成し、上記ＲＮＡ−ＲＣがＤＮＡ鎖であった二重鎖の上記推定ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍを計算した。この計算の結果に基づいて、各特異的低分子ＲＮＡ配列についての上記タグおよびブリッジの設計を、２つの設計ストラテジー（タイプ１およびタイプ２）のうちの一方に割り当てた。

（タイプ１設計）
タイプ１タグおよびブリッジ計を、図２に図示する。上記ＲＮＡ逆相補体ＤＮＡ二重鎖（ＲＮＡ−ＲＣ ＤＮＡ二重鎖）の上記計算されたＲＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍが、７６℃〜８４℃の間であった場合、図２におけるフラグメントＡは、全長タグを規定し、上記短いＲＮＡ配列（例えば、上記ｍｉＲＮＡ配列）は、捕捉付着領域を定義した。上記ブリッジ配列（図２，フラグメントＣ＋Ｄ）を、その後、２部分（上記低分子ＲＮＡブリッジセグメント（Ｃ）および上記タグブリッジセグメント（Ｄ））で計算した。上記低分子ＲＮＡブリッジセグメントを、上記ＲＮＡ−ＲＣ ＤＮＡ配列をとり、計算されたＲＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍが４４℃〜５３℃の間である、最も５’末端における配列のフラグメントを同定することによって生成した。上記タグブリッジセグメントを、上記レポーター付着領域（Ａ）の逆相補体をとり、計算されたＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍが４４℃〜５３℃の間である最も３’末端における配列のフラグメントを同定することによって生成した。完全ブリッジ配列を、上記低分子ＲＮＡブリッジセグメントの５’末端を、上記タグブリッジセグメント（Ｃ＋Ｄ）の３’末端に連結することによって作った。

（タイプ２設計）
タイプ２タグおよびブリッジ設計を、図２に図示する。上記ＲＮＡ−ＲＣ ＤＮＡ二重鎖の計算されたＴ_ｍが７６℃未満であった場合、無作為のサイズのＤＮＡ配列のさらなるセグメントを、全体プール配列から選択し、上記ＲＮＡ−ＲＣの５’末端に付加し、この合わされた配列の推定ＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍを計算した。この部分が最終的ハイブリダイゼーションアッセイにおいて形成する上記実際の二重鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ二重鎖であるが、計算を、ＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用を反映するように単純化した。このプロセスを、７６℃〜８４℃の間の推定ＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍを有する配列組み合わせが見いだされるまで、反復した。配列のこのさらなるセグメントを、図３においてセグメントＢとして示す。次いで、全長タグを、Ｂを、Ａの５’末端へ連結することによって作った（図３）。セグメントＢを合わせた上記低分子ＲＮＡ配列は、上記捕捉付着領域を定義した。

上記ブリッジ配列（Ｃ＋Ｄ，図３）を、２部分（上記低分子ＲＮＡブリッジセグメント（Ｃ）および上記タグブリッジセグメント（Ｄ，図３））で計算した。上記低分子ＲＮＡブリッジセグメントを、上記のタイプ１設計において記載されるものと同一の様式において生成した。上記タグブリッジセグメントを、上記タイプ２タグ配列（Ｂ＋Ａ，図３）の逆相補体をとり、計算されたＤＮＡ／ＤＮＡ Ｔ_ｍが４４℃〜５３℃の間である最も３’末端における配列のフラグメントを同定することによって、生成した。上記完全ブリッジ配列を、上記低分子ＲＮＡブリッジセグメントの５’末端を、上記タグブリッジセグメント（Ｃ＋Ｄ）の３’末端に連結することによって作った。

（異質ＤＮＡ配列）
用語「異質ＤＮＡ配列」とは、任意の既知のゲノムと最小限のもしくは無視できる程度の交差反応性を有する無作為化ＤＮＡ配列を記載する。候補異質ＤＮＡ配列の相同性および／もしくは同一性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴプログラムを使用することによって、特定の種もしくはすべての種においてすべての既知の配列と比較される。異質ＤＮＡ配列は、遺伝子も、それらの調節性エレメントもコード市内。むしろ、上記異質ＤＮＡ配列は、本発明の組成物、方法、およびキット内の非コード機能を有する。

異質ＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む分子と、標的サンプル、ゲノム、細胞、動物、もしくはそれらの抽出物（例えば、標的ＲＮＡ分子、非対応ブリッジ、非対応タグ、非対応レポーター分子）から単離される分子との間の相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）を最小にするかもしくは防止するために、本発明の組成物、方法、およびキット内で使用される。標的ＲＮＡ分子および対応するブリッジ、おおびタグは、部分的配列相補性もしくは完全配列相補性のいずれかを共有するのに対して、標的ＲＮＡ分子は、非対応ブリッジもしくはタグと、部分的配列相補性も完全配列相補性も、いずれも共有しない。レポーター分子および対応するタグは、部分的配列相補性もしくは完全配列相補性のいずれかを共有するのに対して、レポーター分子は、非対応タグとは部分的配列相補性も、完全配列相補性も、いずれも共有しない。

タグ分子、レポーター分子、およびブリッジ分子は、異質ＤＮＡ配列を含む。タグおよび対応するブリッジ内に含まれる上記異質ＤＮＡ分子は、互いに特異的にハイブリダイズし、最適には、上記変性、アニーリング、連結、および／もしくは精製反応の間に、上記組成物中に存在する他の分子には特異的にハイブリダイズしない。あるいは、タグおよび対応するブリッジ内に含まれる上記異質ＤＮＡ分子は、互いに特異的にハイブリダイズし、好ましくは、上記変性、アニーリング、連結、および／もしくは精製反応の間に、上記組成物に存在する他の分子に対して１５塩基未満の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満の相同性を有する。異質ＤＮＡ配列を含むレポーター分子は、上記精製反応後に対応するタグ化ｍｉＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得、最適には、上記組成物に存在する他の分子には特異的にハイブリダイズしない。あるいは、異質ＤＮＡ配列を含むレポーター分子は、上記精製反応後に対応するタグ化ｍｉＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得、好ましくは、上記組成物に存在する他の分子に対して１５塩基未満の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満の相同性を有する。

本発明によって包含される例示的異質ＤＮＡ配列は、任意の既知のゲノムＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列に対して１５塩基未満の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって８５％以下の同一性を有する。さらに、上記異質ＤＮＡは、標的ＲＮＡ分子が転写されるゲノムに由来するかもしくは上記ゲノムによって転写される任意の既知のゲノムＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列に対して１５塩基未満の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって８５％以下の同一性を有する。標的ＲＮＡ分子は、任意の種（動物、植物、細菌、真菌およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）のゲノムに由来するかもしくは上記ゲノムによって転写される。標的ＲＮＡ分子が由来する好ましい種としては、哺乳動物が挙げられ、最も好ましくは、ヒト、霊長類、およびマウスが挙げられる。

異質ＤＮＡ配列は、すべての既知のＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対して１５塩基以下の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満の相同性を有する。具体的には、異質ＤＮＡ配列は、組成物もしくはキットにおけるすべての上記ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対して１５塩基以下の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満の相同性を有する。具体的には、上記異質ＤＮＡ配列は、組成物もしくはキットにおけるＤＮＡおよびＲＮＡ分子の１５塩基以下の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満、１０％、５％、２％、１％もしくはその間の任意のパーセンテージ点の相同性を有する。

異質ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ、もしくは具体的には、異質ＤＮＡを含むブリッジの一部分にハイブリダイズし得る。具体的には、上記異質ＤＮＡ配列は、上記ブリッジの上記第３のＤＮＡ配列以外の、上記組成物における任意のＤＮＡおよびＲＮＡ分子と１５塩基以下の最大連続相同性で、３５〜５０塩基にわたって１５％未満、１０％、５％、２％、１％もしくはその間の任意のパーセンテージ点の相同性を有する。

（核酸分子）
本発明は、ブリッジおよびタグ、例えば、低分子ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ分子を含む）を結合する単離されおよび精製された核酸分子を提供する。例示的タグ分子としては、配列番号１１〜２０のデオキシリボ核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。例示的ブリッジ分子としては、配列番号２１〜３０のデオキシリボ核酸分子が上げられるが、これらに限定されない。

本発明の他の局面において、単離された核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子およびＤＮＡブリッジおよびタグ）は、１個以上の挿入、欠失、反転、フレームシフト、転座、組換え、もしくは置換を含む配列を結合する。

本発明の単離された核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、ならびにすべての当該分野で認識されるアナログ、誘導体、もしくはこれらのハイブリッド分子を含む。本発明の単離された核酸分子はまた、ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを合成するための試薬（例えば、単離された全長遺伝子、転写物、ｃＤＮＡ分子、プライマー、ベクター、プラスミド、内因性もしくは天然に存在するＲＮＡ分子、ブリッジ、タグ、およびこれらのフラグメント）を含む。

本発明の単離された核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に存在する大部分の他の核酸とは異なるＲＮＡ配列、ＤＮＡ、もしくは「異質」ＤＮＡ配列を結合するように操作される。さらに、「単離された」核酸分子は、他の細胞物質も、組換え技術によって生成される場合には培養培地も、化学合成される場合には化学前駆体も、他の化学物質も、実質的に含まない。核酸分子は、他のコード配列もしくは調節性配列に融合され得、なお「単離された」とみなされ得る。非ヒトトランスジェニック動物に存在し、動物において天然には存在しない核酸分子はまた、「単離された」とみなされる。例えば、ベクター中に含まれる組換え核酸分子は、「単離された」とみなされる。「単離された」核酸分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、および溶液中で精製された（部分的にもしくは実質的に）ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離された核酸分子のインビボもしくはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。さらに、単離されたＲＮＡ分子としては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、およびｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従う単離された核酸分子としては、合成で生成されたこのような分子がさらに挙げられる。

一般に、単離された核酸分子は、ＲＮＡ分子、ブリッジ、もしくはタグ（上記標的ＲＮＡ、ブリッジ、もしくはタグ配列のいずれかの側に隣接するヌクレオチド配列を有する）に結合するように操作された１個以上の配列を含む。隣接する配列は、上記標的化ＲＮＡ、ブリッジもしくはタグおよび／または異種ヌクレオチド配列と天然に会合したヌクレオチド残基を含み得る。好ましくは、上記隣接する配列は、上記標的ＲＮＡ、ブリッジ、もしくはタグ配列、または全長遺伝子程度の長さ、全コード配列、もしくは非コード配列（もしくは任意のその一部分（例えば、エキソン、イントロン、または５’もしくは３’非翻訳領域）のいずれかの側にある最大約５００個まで、３００個、１００個、６０個、５０個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、８個、もしくは４個のヌクレオチド（その間の任意の他の長さ）である。

本明細書で使用される場合、用語「フラグメント」は、上記フラグメントが由来する、上記単離された核酸分子より短い単離された核酸分子を記載することが意味される。本発明の単離された核酸分子のフラグメントは、上記フラグメントが由来する上記単離された核酸分子の任意の一部を含み得るか、これからなり得るか、またはこれを含み得る。フラグメントは、代表的には、少なくとも約８個以上のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約１０個以上のヌクレオチド、およびさらにより好ましくは、少なくとも約１５個以上のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは、長さが少なくとも約８個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２５０個、もしくは５００個（もしくはその間の任意の他の数）のヌクレオチドを含み得る。上記フラグメントの長さは、その意図される用途に基づく。次いで、標識されたプローブが、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、もしくはｍＲＮＡをスクリーニングして、目的の領域に対応する核酸を単離するために、使用され得る。さらに、プライマーおよびプローブは、例えば、ＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ遺伝子、ブリッジもしくはタグとのＲＮＡ分子の交差反応性、ブリッジもしくはタグ配列とのＲＮＡ分子の相同性、ブリッジもしくはタグ配列とのＲＮＡ分子の同一性をアッセイする目的で、またはＲＮＡ分子もしくは遺伝子、ブリッジ分子、またはタグ分子の特異的領域をクローニングするために、増幅反応において使用され得る。

本発明の単離された核酸分子は、種々の核酸増幅法のうちのいずれか１つの生成物である、ＲＮＡ分子、ブリッジもしくはタグをさらに含む。上記核酸増幅法は、核酸サンプル中の目的のポリヌクレオチドのコピー数を増大させるために使用される。このような増幅法は、当該分野で周知であり、上記増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号；および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｄ． Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７，１９８８）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号；および同第５，４２２，２５２号）、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）、連結直線状増殖法（ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、および等温増幅法（例えば、核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ））、ならびに自立配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４，１９９０）が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法論に基づいて、当業者は、本明細書で開示されるＲＮＡ分子もしくは遺伝子に対して５’側もしくは３’側にある任意の適切な領域において容易にプライマーを設計し得る。さらに、増幅法は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子、ブリッジ、もしくはタグをインシリコで合成する工程を包含する。

本明細書で使用される場合、本発明の「増幅されたポリヌクレオチド」は、分子の数が、試験サンプル中のその出発量と比較して、インビトロで行われる任意の核酸増幅法によって少なくとも２倍増大した、単離された核酸分子である。他の好ましい実施形態において、増幅されたポリヌクレオチドは、試験サンプル中のその出発量と比較して、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、もしくはさらに１００００倍の増大の結果である。一般に、増幅されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約１０個のヌクレオチドである。より代表的には、増大されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約１５個のヌクレオチドである。本発明の好ましい実施形態において、増幅されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約２０〜２５個のヌクレオチドである。本発明のより好ましい実施形態において、増幅されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、もしくは１００個のヌクレオチド、またはその間の任意の値である。本発明のなお別の好ましい実施形態において、増幅されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約１００個、２００個、もしくは３００個のヌクレオチド、またはその間の任意の値である。本発明の増幅されたポリヌクレオチドの全体の長さは、上記目的のＲＮＡ分子が存在するエキソン、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは遺伝子全体程度の長さであり得る一方で、増幅された精製物は、代表的には、長さが約１，０００個以下のヌクレオチドである（しかし、特定の増幅法は、長さが１０００個のヌクレオチドより長い増幅された生成物を生じ得る）。

一実施形態において、本発明は、例えば、配列番号１〜３５のヌクレオチド配列を含むか、上記ヌクレオチド配列から本質的になるか、もしくは上記ヌクレオチド配列からなる核酸分子を提供する。本明細書に記載される技術は、検出を可能にするために、上記アッセイにおいて使用されるべき核酸分子の制限の内数およびバリエーションを提供するために使用され得る。核酸分子は、ヌクレオチド配列が、上記核酸分子の最終的なヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部である場合に、上記ヌクレオチド配列を含む。このような様式において、上記核酸分子は、上記ヌクレオチド配列のみであり得るか、またはさらなるヌクレオチド残基（例えば、上記ヌクレオチド配列もしくは異種ヌクレオチド配列と天然に会合する残基）を有し得る。このような核酸分子は、１個から数個のさらなるヌクレオチドを有し得るか、またはより多くのさらなるヌクレオチドを含み得る。核酸分子は、最終的な核酸分子が、上記核酸配列および調節性配列もしくは維持配列のみを含む場合に、ヌクレオチド配列から本質的になる。調節性配列および維持配列は、上記ヌクレオチド配列が発現され、そして／または翻訳されることを可能にする配列である。核酸分子は、上記核酸分子の最終的なヌクレオチド配列が、その核酸配列のみを含む場合に、ヌクレオチド配列を含む。種々のタイプのこれら核酸分子がどのように容易に作成され得、単離され得るかの簡単な説明は、以下に提供され、このような技術は、当業者に周知である（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。

単離された核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）において、またはＤＮＡの形態（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）において存在し得る。これらは、例えば、分子クローニングによって得られてもよいし、化学合成技術によって生成されてもよいし、もしくはこれらの組み合わせによって生成されてもよい（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。さらに、単離された核酸分子はまた、部分的にもしくは完全に、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，５２７，６７５号；同第５，６２３，０４９号；同第５，７１４，３３１号）の１つ以上のタイプの形態にあり得る。上記核酸（特に、ＤＮＡ）は、二本鎖もしくは一本鎖であり得る。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）もしくは相補的な非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＰＮＡのセグメントは、合成核酸分子を提供するために、例えば、ヒトゲノムもしくは任意のゲノムのフラグメント（異質配列（ＤＮＡもしくはＲＮＡの場合）もしくは単一ヌクレオチド、短いオリゴヌクレオチドリンカーが挙げられる）から、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得る。核酸分子は、参照として本明細書で提供される配列を使用して容易に合成され得る；オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡオリゴマー合成技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｏｒｅｙ，「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ： ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎｅ；１５（６）：２２４−９、およびＨｙｒｕｐら，「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｊａｎｕａｒｙ； ４（１）：５−２３を参照のこと）。さらに、大規模自動化オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ合成（アレイもしくはビーズ表面または他の個体死自体上での合成を含む）は、市販の核酸合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．） ３９００ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒもしくはＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、および本明細書で提供される配列情報を使用して、容易に達成され得る。

本発明は、改変された、合成の、もしくは天然に存在しないヌクレオチド、または構造エレメントもしくは当該分野で公知である他の代替の／改変された核酸化学物質を含む核酸アナログを包含する。このような核酸アナログは、例えば、検出試薬（例えば、プライマー／プローブ）として有用である。さらに、これらアナログを含むキット／システム（例えば、ビーズ、アレイなど）はまた、本発明によって包含される。例えば、本発明の多型配列に基づくＰＮＡオリゴマーが、具体的には企図される。ＰＮＡオリゴマーは、リン酸骨格がペプチド様骨格で置換されているＤＮＡのアナログである（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）、Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１），ＷＯ９６／０４０００）。ＰＮＡは、相補的なＲＮＡもしくはＤＮＡに、従来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログより高い親和性および特異性でハイブリダイズする。ＰＮＡの特性は、伝統的なオリゴヌクレオチドおよびペプチドで達成不能な新規な分子生物学および生化学適用を可能にする。

用語「単離された核酸分子」は、天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡのみを含む分子に制限されないだけでなく、化学改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをも包含する。特定の実施形態において、上記単離された核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。ＲＮＡ分子、ブリッジ、もしくはタグにおいて作製される化学改変の非限定的な例としては、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび／もしくは反転デオキシ非塩基残基組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。これら化学改変は、ＲＮＡ分子、ブリッジもしくはタグにおいて使用される場合、これら分子の機能を妨げ、安定性を増大させる。

ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドリンカーは、ＲＮＡ分子、ブリッジもしくはタグへと組み込まれ得る。非ヌクレオチドリンカーは、非塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、もしくは他のポリマー化合物（例えば、ポリエチレングリコール（例えば、２〜１００個の悦連グリコールユニットを有するもの））から構成され得る。具体例としては、以下によって記載されるものが挙げられる：ＳｅｅｌａおよびＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１１３，１９８７；ＣｌｏａｄおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４，１９９１；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９，１９９１；Ｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２５８５，１９９３およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１７５１，１９９３；Ｄｕｒａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０；ＭｃＣｕｒｄｙら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０：２８７，１９９１；Ｊｓｃｈｋｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：３０１，１９９３；Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９９１４（１９９１）；Ａｒｎｏｌｄら，国際公開ＷＯ ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎら，国際公開ＷＯ ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚら，国際公開ＷＯ ９５／１１９１０ならびにＦｅｒｅｎｔｚおよびＶｅｒｄｉｎｅ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００，１９９１。「非ヌクレオチド」とは、１個以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖に組み込まれ得る任意の基もしくは化合物（糖および／もしくはリン酸置換基のいずれかが挙げられる）をさらに意味し、残りの塩基がそれらの酵素活性を示すことを可能にする。上記基もしくは化合物は、例えば、糖のＣ１位において通常認識されるヌクレオチド塩基（例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミジン）を含まないという点で、非塩基であり得る。

核酸の結合特性および／もしくは安定性を改善する核酸改変のさらなる例としては、塩基アナログ（例えば、イノシン、インターカレーター（米国特許第４，８３５，２６３号）および副溝結合剤（米国特許第５，８０１，１１５号））の使用が挙げられる。従って、核酸分子への本明細書中での言及は、ＰＮＡオリゴマーおよび他の核酸アナログを含む。核酸アナログおよび当該分野で公知の代替の／改変された核酸化学物質の他の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００２）に記載されている。本発明の単離された核酸は、以下が挙げられるが、これらに限定されない塩基アナログから構成される：ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうちのいずれか（例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ−６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル１−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄマンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、２，６−ジアミノプリン、および２’−改変アナログ（例えば、Ｏ−メチル、アミノ−、およびフルオロ−改変アナログが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）。

特定の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、ブリッジおよびタグは、ヌクレアーゼ耐性基（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アルキル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、および２’−Ｈ）での改変によって安定性を高めるように改変される（総説については、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ １７：３４，１９９２；Ｕｓｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４を参照のこと）。

改変（塩基、糖および／もしくはリン酸）を有する核酸分子を化学合成すると、リボヌクレアーゼによるそれらの分解が防止される。このことは、本明細書に記載されるアッセイの効率を増大させる。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら，国際公開ＷＯ ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５，１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４，１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４，１９９２；Ｕｓｍａｎら，国際公開ＷＯ ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉら，国際公開ＷＯ ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら，米国特許第６，３００，０７４号を参照のこと。上記参考文献はすべて、本明細書に記載される単離された核酸分子の塩基、リン酸および／もしくは糖部分に対して作製される種々の化学改変を記載する。

一実施形態において、本発明は、１個以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／もしくはアルキルシリルを含むリン酸骨格改変、置換を有する、ＲＮＡ分子、ブリッジ、およびタグを提供する。オリゴヌクレオチド骨格改変の総説については、ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＬｅｕｍａｎｎ，「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ＶＣＨ，３３１−４１７，１９９５、およびＭｅｓｍａｅｋｅｒら，「Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，ＡＣＳ，２４−３９，１９９４を参照のこと。

配列番号１〜３５として同定されるものが挙げられるが、これらに限定されない上記各散文詩のさらなる改変体（例えば、天然に存在する対立遺伝子改変体（ならびにオルソログおよびパラログ）もしくは変異誘発技術によって生成される合成改変体）は、当該分野で周知の方法を使用して、同定および／もしくは生成され得る。このようなさらなる改変体は、配列番号１〜３５として開示される核酸配列（もしくはそのフラグメント）と、少なくとも７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有するヌクレオチド配列を含み得る。従って、本発明は、配列番号１〜３５の配列と比較して、配列改変のとくていの程度を有する単離された核酸分子を具体的に企図する。

本発明のＲＮＡ分子、ブリッジおよびタグは、固相合成のような技術を介して慣用的に作製される。このような合成の装置は、いくつかの業者によって販売されている（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）。当該分野で公知のこのような合成の任意の他の手段は、さらにもしくは代わりに使用される。オリゴヌクレオチド（例えば、上記ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体）を調製するための類似の技術を使用することは周知である。

オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１：３−１９，１９９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／５４４５９；Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５；Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７；Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３−４５，１９９８；およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載されるように、当該分野で公知のプロトコルを使用して合成される。ＲＮＡ分子の合成は、例えば、Ｕｓｍａｎら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７；Ｓｃａｒｉｎｇｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３，１９９０；およびＷｉｎｃｏｔｔら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５；Ｗｉｎｃｏｔｔら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７に記載されるように、一般的手順に従う。

２つの配列間の配列比較および％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））。これは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリクスもしくはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、およびギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４および長さ重みづけ１、２、３、４、５、もしくは６を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムの中に組み込まれている。

なお別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよびギャップ重みづけ４０、５０、６０、７０、もしくは８０および長さ重み付け１、２、３、４、５、もしくは６を使用して、決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列の間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれたＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長さペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用して決定される。

本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、他のファミリーメンバーもしくは関連配列を同定するために、配列データベースに対して検索を行うために「問い合わせ配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、上記ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われ得る。比較目的でギャップを入れたアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップを入れたＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが、使用され得る。ＢＬＡＳＴに加えて、当該分野で使用される他の検索および配列比較プログラムの例としては、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，３６５−３８９（１９９４））およびＫＥＲＲ（Ｄｕｆｒｅｓｎｅら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２０（１２）：１２６９−７１）が挙げられるが、これらに限定されない。バイオインフォマティクス技術に関するさらなる情報については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。

（治療適用）
本発明の組成物および方法は、病気もしくは障害を発症させるリスクのある被験体において遺伝子発現を検出するために使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、病気もしくは障害と診断された被験体、および診断もしくは予後の必要性のある被験体での遺伝子発現を検出するために使用される。本明細書に記載される組成物および方法は、疾患進行および遺伝子発現および調節のレベルに対する治療の有効性をモニターするために使用される。さらに、本明細書に提供される組成物および方法は、障害を発症させる個人的リスクおよび将来の子供に障害を伝えるリスクについて個体をスクリーニングするために使用される。胚性細胞は、障害の存在もしくは非存在について、本発明の組成物および方法を使用して試験される。

本発明は、特定の生物学的状態、特定の疾患（例えば、癌、遺伝的障害、発達障害、変性性障害、神経障害、幹細胞障害、もしくは他の生物学的状態）を発症させるリスクを決定するために使用され得る。さらに、本発明は、疾患の進行をモニターするか、もしくは治療への応答をモニターするために使用され得る。具体的には、本発明は、心臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、肝臓、前立腺、心臓、血管、骨髄、骨格筋、平滑筋、脳の種々の特定の領域（小脳扁桃、尾状核、小脳、脳梁、胎児、視床下部、視床が挙げられるが、これらに限定されない）、脊髄、末梢神経、網膜、鼻、気管、肺、口、唾液腺、食道、胃、小腸、大腸、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、卵管、子宮、胎盤、膣、入選、精巣、精嚢、陰茎、リンパ節、胸腺、および脾臓の疾患を検出するか、上記疾患の進行をモニターするか、もしくは上記疾患についての治療レジメンをモニターするために使用され得る。本発明は、特定の疾患（例えば、癌、遺伝的障害、発達障害、変性性障害、神経障害、幹細胞障害、もしくは他の生物学的状態）を検出するか、もしくは上記疾患の進行をモニターするか。もしくは上記疾患の治療レジメンをモニターするために使用され得る。

本発明の方法は、種々の被験体（哺乳動物を含む）を包含する。特定の実施形態において、上記哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、もしくはウシであるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、有利なことには、特定の障害の動物モデルを代表する被験体として使用される。好ましい被験体は、ヒトである。本発明の方法はまた、種々の被験体（非哺乳動物を含む）を包含する。これらとしては、トリ、は虫類、植物、細菌、真菌、原生動物およびウイルスが挙げられる。天然に存在するかもしくは合成の低分子ＲＮＡ分子を含む任意のサンプルが、上記アッセイの被験体として使用され得る。

（癌）
本発明の組成物および方法は、癌を発症するリスクのある細胞および被験体または癌を発症する素因を有し得るそれら細胞および被験体を同定するために使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、癌を発症するリスクのある被験体もしくは癌を発症した被験体を診断もしくは予後予測の目的で、癌細胞タイプ、癌サブタイプ、腫瘍グレード、もしくは癌ステージを区別するために使用される。本発明の組成物および方法は、腫瘍、癌、もしくは処置レジメンをモニターするか、またはこれらの進行をモニターするためにさらに使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、癌を発症する任意の遺伝的素因について個体をスクリーニングするために使用される。

用語「癌」とは、固形腫瘍、ならびに血液腫瘍および／もしくは血液悪性疾患を含む。「前癌細胞」もしくは「前癌性細胞」とは、前癌もしくは前癌状態である細胞増殖障害を発現する細胞である。「癌細胞」もしくは「癌性細胞」とは、癌である細胞増殖障害を発現する細胞である。任意の再現可能な測定手段は、癌細胞もしくは前癌性細胞を同定するために使用され得る。癌細胞もしくは前癌性細胞は、組織サンプル（例えば、生検団プル）の組織学的タイプ分類もしくはグレード分類によって同定され得る。癌細胞もしくは前癌性細胞は、分子マーカーの使用を介して同定され得る。

本発明の組成物および方法は、癌の重篤度をさらに決定するために使用される。なぜなら、癌は、ステージ、腫瘍グレード、および細胞外マトリクスを分解し、脈管化を誘導し、細胞接着を阻害し、そして転位を可能にする因子の発現によって特徴付けられるからである。

例示的な癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、小児大脳星細胞腫（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、基底細胞癌、皮膚癌（非メラノーマ）、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｕｒｉｎｇａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、骨関節癌（ｂｏｎｅ ａｎｄ ｊｏｉｎｔ ｃａｎｃｅｒ）、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳の癌、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｉｍａｌ ｔｕｍｏｒ）、視覚路および視床下部グリオーマ（ｖｉｓｕａｌ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｇｌｉｏｍａ）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、胃腸神経系癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ， ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｎｃｅｒ）、神経系リンパ腫、中枢神経系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群（Ｓｅｚｉａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫（ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、性腺外胚細胞腫（ｅｘｔｒａｇｏｎａｄａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、肝外胆管癌、眼の癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｉｄ ｔｕｍｏｒ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｇｌｉｏｍａ）、頭頸部癌、肝細胞（肝）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、眼の癌、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、カポージ肉腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、腎癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、口唇癌および口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、メラノーマ、眼内（眼）のメラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平上皮頚部癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、舌癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣低悪性度腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ ｌｏｗ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、膵島細胞膵臓癌、副鼻腔癌および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂および尿管移行上皮がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポージ肉腫、軟組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管および他の泌尿器器官の移行上皮がん、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍。

（発達障害および変性性障害）
本発明の組成物および方法は、発達障害もしくは変性性障害を発症するリスクのある細胞および被験体、または発達障害もしくは変性性障害を発症する素因を有し得る細胞および被験体を同定するために使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、発達障害もしくは変性性障害を現すリスクのある被験体もしくは発達障害もしくは変性性障害と診断された被験体を診断もしくは予後予測する目的で、発達障害、変性性障害、もしくは変性性障害からくる発達障害を区別するために使用される。本発明の組成物および方法は、発達障害、変性性障害、もしくは処置レジメンの進行をモニターするためにさらに使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、発達障害もしくは変性性障害を彼自身／彼女自身が現すことについて、または発達障害もしくは変性性障害を有する子供をもうけることについて、何らかの遺伝的素因に対して個体をスクリーニングするために使用される。

用語「発達障害」とは、妊娠期間もしくは早期の出産後発生の間に、個体において最初に現れる任意の障害を含む。早期の出産後発生は、出生から１８歳までの期間を包含する。発達障害は、しばしば、精神障害、感情障害、もしくは認知障害を引き起こす精神上の障害と類義語とみなされるが、用語「発達障害」は、上記要害と関連した特異的徴候もしくは症状にかかわらず、胎児もしくは１８歳以下の小児のいずれかに存在する任意の障害を包含することが意味される。さらに、発達障害は、代表的には、生物学的もしくは心理学的プロセスの不適切なもしくはうまく機能しない発生によって特徴付けられる。発達障害はまた、発生の間に存在し、そして成人において疾患（例えば、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症もしくはＡＬＳ、および統合失調症）を発症する個体のリスクを予測するかもしくは示す行動特性、家族歴、脳形態、もしくは遺伝的／バイオマーカーによって特徴付けられる。

特定の発達障害は、１つの発生領域に選択的に影響を及ぼし、発生の本質的にすべての他の領域には影響を及ぼさない（ｓｐａｒｉｎｇ）。特定の発達障害は、主に、聴覚、視覚、言語、もしくは代謝に影響を及ぼす。しかし、広汎性発達障害は、多くの基本的スキル（最も顕著なのは、他者とつきあう能力）の発達における遅延を含む。なぜなら、これら状態は、子供のコミュニケーションをとる能力および想像力を働かせる能力に影響を及ぼすからである。広汎性発達障害としては、自閉症および自閉症スペクトラム障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害、レット症候群、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、および特定されないが広汎性の障害が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な発達障害としてはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、アンジェルマン症候群、中枢性聴覚処理障害（ｃｅｎｔｒａｌ ａｕｄｉｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＣＡＰＤ）、脳性まひ、ダウン症候群、表出性言語障害、ＩｓｏＤｅｎｄｒｉｃ １５（省略型 ｉｄｉｃ（１５））、ランドウ・クレフナー症候群（Ｌａｎａｕ−Ｋｌｅｆｆｎｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、神経管欠損、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、プラダー・ウィリー症候群、発作性障害（ｓｅｉｚｕｒｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、癲癇、トゥレット症候群、ウィリアムス症候群、聴覚喪失、聾、盲、視力障害、黄疸／核黄疸、速話症（言語非流ちょう性（ｓｐｅｅｃｈ ｄｉｓｆｌｕｅｎｃｙ））、失認（視覚、聴覚、および体性感覚）、神経性無食欲症（ａｎｏｒｅｘｉａ ｎｅｒｖｏｓａ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、急性ストレス障害、適応障害、双極性障害、身体醜形障害、呼吸関連睡眠障害（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｌｅｅｐ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、喘息、短時間の精神病的エピソード（ｂｒｉｅｆ ｐｓｙｃｈｏｔｉｃ ｅｐｉｓｏｄｅ）、神経性過食症、統合失調症、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性運動性あるいは音声チック障害、概日リズム睡眠障害、行為障害、コミュニケーション／言語障害、コルネリアデランゲ症候群、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ファール病（もしくは特発性基底核石灰化）、片頭痛、新生物（良性および悪性）、全身性エリテマトーデス、自己免疫障害、糖尿病（Ｉ型）、ウィルソン病、ベル麻痺、先天性心疾患、小頭症、新生児脳炎、水頭症、パーキンソン病、ナルコレプシー、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、神経線維腫症、フォンヒッペル・リンダウ病、失読症、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎、遺伝性球状赤血球症、遺伝性乳癌卵巣癌症候群（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マルファン症候群、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、ムコ多糖症、糖原病、ガラクトース血症（ｇｌａｃｔｏｓｅｍｉａ）、血友病、男性型脱毛症、レーバー遺伝性視神経萎縮症（Ｌｅｂｎｅｒ’ｓ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、自己免疫疾患、口蓋裂、肥満、ゴーシェ病、レット症候群、毛細血管拡張性運動失調症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｇｉｅｃｔａｓｉａ）、ＱＴ延長症候群、アルポート症候群、壮年性脱毛症、ＳＲＹ性別決定、軟骨形成不全症、コケイン症候群、ディ・ジョージ症候群、脆弱Ｘ症候群、重症複合免疫不全症、ワーデンブルグ症候群、ウェルナー症候群、ツェルウェガー症候群、副腎白質ジストロフィー、グルコース・ガラクトース吸収不良症、遺伝性ヘモクロマトーシス、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、メンケス症候群、ニーマン・ピック症候群、ポルフィリン症、レフサム病、タンジャー病、テイ・サックス病、捻曲性骨異形成症、エリス・バン・クレフェルト症候群（軟骨外胚葉異形成症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症、サラセミア、クローン病、ベスト病、緑内障、網膜芽細胞腫、先天性副腎過形成、多腺性自己免疫症候群、多発性内分泌腫瘍、家族性地中海熱、高ＩｇＭを伴う免疫不全、シャルコーマリートゥース症候群、進行性骨化性線維異形成症、筋強直性ジストロフィー、本態性振戦、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳性運動失調、結節性硬化症、α−１アンチトリプシン欠損症、およびペンドレッド症候群。

用語「変性性障害」とは、成人個体に最初に示される任意の障害を含む。用語成人とは、１８歳から死亡するまでの期間を包含する。変性性障害は、しばしば、精神的障害、感情的障害、もしくは認知障害を引き起こす精神上の障害と類義語であるとみなされるが、用語「変性性障害」は、上記要害と関連した特定の徴候もしくは症状にかかわらず、１８歳以上の年齢の成人に存在する任意の障害を包含することが意味される。さらに、変性性障害は、代表的には、通常に機能する生物学的プロセスもしくは心理学的プロセスの規制解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および機能不全によって特徴付けられる。変性性障害は、遺伝的素因、環境因子、もしくは病原体（例えば、ウイルスもしくはプリオン）への曝露から生じ得る。

定時的な変性性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルツハイマー病、痴呆、老衰、失認（視覚、聴覚、および体性感覚）、急性ストレス障害、適応障害、双極性障害、身体醜形障害、呼吸関連睡眠障害（睡眠時無呼吸）、短時間の精神病的エピソード、神経性過食症、統合失調症、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、カプグラ（妄想）症候群、慢性疲労症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｑｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、概日リズム睡眠障害、行為障害、コミュニケーション／言語障害、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、循環障害（ｃｙｃｌｏｔｈｙｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、鬱病、耽溺、クッシング症候群（副腎皮質機能亢進症（ｈｙｐｅｒａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｉｓｍまたはｈｙｐｅｒｃｏｒｔｉｃｉｓｍ）ともいわれる）、新生物（良性および悪性）、脳卒中、糖尿病（ＩＩ型）、動脈瘤、心血管疾患（心疾患を含む）、メニエール病、聾、盲、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病、アテローム硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、進行性核上性麻痺、癌、テイ・サックス病、円錐角膜、黄斑変性、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｓ）、壮年性脱毛症、肥満、発作性夜間ヘモグロビン尿症、サラセミア、クローン病、ベスト病、緑内障、脳回転状脈絡網膜萎縮、シャルコーマリートゥース症候群、進行性骨化性線維異形成症、筋強直性ジストロフィー，変形性関節症、骨粗鬆症、関節炎、関節リウマチ。

（神経障害）
本発明の組成物および方法は、神経障害を発症させるリスクがある細胞および被験体もしくは神経障害を発祥させる素因を有し得る細胞および被験体を同定するために使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、神経障害を示すリスクがある被験体もしくは神経障害と診断された被験体を診断もしくは予後予測する目的で、神経障害を区別するために使用される。本発明の組成物および方法は、神経障害もしくは処置レジメンの進行をモニターするためにさらに使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、神経障害を彼自身／彼女自身が現すことについて、もしくは神経障害を有する子供をもうけることについて、何らかの遺伝的素因に対して個体をスクリーニングするために使用される。

用語「神経障害」とは、個体の神経系内に最初に示される任意の障害を含む。神経障害は、種々の徴候および症状とともにあり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：心理学的変化、気分変化、もしくは行動変化；１つ以上の感覚（視覚、聴覚、触覚）の喪失もしくは鋭敏さの低下；増大した疼痛もしくは灼熱感；協調もしくはバランスの欠如；記憶の喪失；随意運動もしくは不随意運動に対する制御の喪失；言語もしくはバランス；幻視もしくは幻聴；発作；頭痛；運動の低下；および最終的には、昏睡もしくは死亡。神経障害は、上記神経障害を発症させる遺伝的素因、上記個体の遺伝的素因を増強するように上記障害を誘導する１種以上の環境因子、または感染性因子（例えば、上記障害を誘導するかもしくは上記個体の遺伝的素因を増強するウイルス、細菌、真菌もしくはプリオン）への個体の曝露から生じ得る。

例示的神経障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、アンジェルマン症候群、双極性障害、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、中枢性聴覚処理障害（ＣＡＰＤ）、脳性まひ、ダウン症候群、表出性言語障害、ＩｓｏＤｅｎｄｒｉｃ １５（省略型 ｉｄｉｃ（１５））、ランドウ・クレフナー症候群、神経管欠損、発作障害、癲癇、トゥレット症候群、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、小児期崩壊性障害、失認（視覚、聴覚、および体性感覚）、神経性無食欲症、急性ストレス障害、適応障害、双極性障害、身体醜形障害、呼吸関連睡眠障害、短時間の精神病的エピソード、神経性過食症、統合失調症、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、カプグラ（妄想）症候群、慢性運動性あるいは音声チック障害、概日リズム睡眠障害、速話症（言語非流ちょう性）、行為障害、コミュニケーション／言語障害、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、鬱病、耽溺、ファール病（もしくは特発性基底核石灰化）、片頭痛、新生物（良性および悪性）、失語、麻痺、ベル麻痺、脳血管疾患、脳炎、水頭症、小頭症、パーキンソン病、三叉神経痛、ナルコレプシー、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、神経線維腫症、失読症、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、副腎白質ジストロフィー、毛細血管拡張性運動失調症、コケイン症候群、聾、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ゴーシェ病、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、メンケス症候群、フェニルケトン尿症、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳性運動失調、結節性硬化症、ニーマン・ピック症候群、レフサム病、テイ・サックス病、シャルコーマリートゥース症候群、進行性骨化性線維異形成症、筋強直性ジストロフィー、およびメニエール病。

（幹細胞障害）
本発明の組成物および方法は、「幹細胞」障害を発症するリスクのある細胞および被験体、もしくは幹細胞障害を発症する素因を有し得る細胞および被験体を同定するために使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、幹細胞障害を示すリスクのある被験体もしくは幹細胞障害と診断された被験体を診断もしくは予後予測する目的で、幹細胞障害を区別するために使用される。本発明の組成物および方法は、幹細胞障害もしくは処置レジメンの進行をモニターするためにさらに使用される。さらに、本発明の組成物および方法は、幹細胞障害を彼自身／彼女自身が示すことについて、もしくは幹細胞障害を有する子供をもうけることについて、何らかの遺伝的素因に対して個体をスクリーニングするために使用される。

用語「幹細胞障害」とは、個体の全能性を有する（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（もしくは全能の（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））、多能性の（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能の（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、少数能（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）、もしくは単能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞内に最初に示される任意の障害を含む。あるいは、もしくはさらに、幹細胞障害は、幹細胞を含む組成物を上記個体に投与することによって処置もしくは予防され得る任意の障害を含む。幹細胞は、娘細胞を生成するそれらの能力によって特徴付けられ、娘細胞のうちの一方は分化し、そのうちの他方は、未分化幹細胞のままである。幹細胞の能力は、特定の細胞運命に約束された娘細胞の分化能力に関連する。具体的には、用語全能性を有する幹細胞もしくは全能の幹細胞は、両方の胚性幹細胞を生じ得る幹細胞を記載するか、もしくは代わりに、上記幹細胞は、ヒト身体における細胞のあらゆるタイプを生成し得る。多能性幹細胞は、全能性を有する幹細胞より能力は制限さているが、これら幹細胞は、３種の胚葉（外胚葉、中胚葉もしくは内胚葉）のうちのいずれかに由来する細胞を生成し得る。多能の幹細胞は、多能性幹細胞より能力は制限されているが、これら幹細胞は、関連した系統内の細胞を生成し得る。多能の幹細胞は、しばしば、成体幹細胞とみなされる。なぜなら、それらは、例えば、成体の脳（ニューロンおよび神経膠のすべてのタイプを生じる神経幹細胞）および骨（血球のすべてのタイプを生じる骨髄幹細胞）で見いだされるからである。少数能の幹細胞は、多能の幹細胞より能力は制限されているが、これら幹細胞は、幾つかの関連するタイプの細胞を生成し得る。例えば、角膜上皮は、角膜細胞および結膜細胞のみを生成する少数能の幹細胞を含む。単能の細胞は、最も制限された細胞タイプである。なぜなら、それらは、それら自体の細胞タイプを再生できるに過ぎないからであるが、それらは、自己再生能を維持する。筋幹細胞は、単能の幹細胞の非限定的な例である。

例示的な幹細胞障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、神経管欠損、発作障害、癲癇、聴覚喪失、聾、盲、視覚障害、黄疸／核黄疸、速話症（言語非流ちょう性）、失認（視覚、聴覚、および体性感覚）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、 慢性運動性あるいは音声チック障害、概日リズム睡眠障害、アルツハイマー病、痴呆、老衰、糖尿病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、鎌状赤血球貧血もしくは鎌状赤血球症、毛細血管拡張性運動失調症、コケイン症候群、ディ・ジョージ症候群、重症複合免疫不全症、ポルフィリン症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、サラセミア、家族性地中海熱、高ＩｇＭを伴う免疫不全、シャルコーマリートゥース症候群、進行性骨化性線維異形成症、筋強直性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳性運動失調、およびゴーシェ病。

（キット）
キットは、少なくとも１つのタグ（例えば、表２示されるとおり）、少なくとも１個のブリッジ（例えば、表３に示されるとおり）、およびボリュームエクスクルーダーもしくはヌクレアーゼのいずれかである物質を含む組成物を含む。あるいは、キットは、１個以上のタグ（例えば、表２に示されるとおり）、１個以上のブリッジ（例えば、表３に示されるとおり）、およびボリュームエクスクルーダーもしくはヌクレアーゼのいずれかである物質を含む組成物を含む。タグは、上記ブリッジとは別個に提供される。あるいは、タグは、ブリッジを含む混合物中に提供される。なぜなら、タグとブリッジ分子との交差ハイブリダイゼーションの程度は、無視できるからである。特定の実施形態において、キットはまた、リガーゼを含む。特定の実施形態において、キットは、少なくとも１つのタグ、少なくとも１つのブリッジおよびリガーゼを含み得る。これら実施形態において、キットはまた、ボリュームエクスクルーダーもしくはヌクレアーゼを含み得る。

好ましいリガーゼの非限定的例は、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼであるが、すべてのリガーゼが、本発明によって含まれる。リガーゼは、ＥＣ ６．１（ホルム炭素−酸素結合（ｆｏｒｍ ｃａｒｂｏｎ−ｏｘｙｇｅｎ ｂｏｎｄｓ））、ＥＣ ６．２（ホルム炭素−酸素結合）、ＥＣ ６．３（ホルム炭素−窒素結合（ｆｏｒｍ ｃａｒｂｏｎ−ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｓ））、ＥＣ ６．４（ホルム炭素−炭素結合（ｆｏｒｍ ｃａｒｂｏｎ−ｃａｒｂｏｎ ｂｏｎｄｓ））、ＥＣ ６．５（ホルムリン酸エステル（ｆｏｒｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄｓ））、およびＥＣ ６．６（ホルム窒素−金属結合（ｆｏｒｍ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｍｅｔａｌ ｂｏｎｄｓ））といわれるクラスへとしばしば分けられる。代わりに、もしくはさらに、リガーゼは、それらが結合する分子のタイプによって分類される。ＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡリガーゼ（タイプＩ〜ＩＶ）が企図される。上記Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが本明細書で示されるが、他の天然の、組換えの、合成の、もしくは操作されたリガーゼは、本発明によって包含される。

好ましいボリュームエクスクルーダーの非限定的例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは本明細書で示されるが、他のポリエーテル分子が、本発明によって包含され、これらとしては、エチレンオキシドポリマーのサイズによって変動するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）およびポリオキシエチレン（ＰＯＥ）が挙げられる。類似のサイズ、電化、およびＰＥＧへの可溶性を有する他の天然の、組換えの、合成の、もしくは操作されたポリマーは、本発明によって包含される。具体的には、ＰＥＧは、水、メタノール、ベンゼン、ジクロロメタンに溶解性であり、ジエチルエーテルおよびヘキサンに不溶性である。

ヌクレアーゼの非限定的な例は、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼである。λエキソヌクレアーゼが本明細書で示されるが、他の天然の、組換えの、合成の、もしくは操作されたエキソヌクレアーゼは、本発明によって包含される。

キットさらに、必要に応じて、コントロールＲＮＡ分子を含む。コントロールＲＮＡ分子は、好ましくは、単離されかつ精製されたｍｉＲＮＡ分子であり、これに対してコントロールブリッジが特異的にハイブリダイズし、そしてこれに対して特異的タグが連結される。その対応するコントロールブリッジおよびタグ分子が提供され、よって標識される。

キットはまた、閉じ込められた組成物および物質を取り扱うための指示書、ならびに上記閉じ込められた組成物および物質を使用して、単一のもしくは多重化した変性、アニーリング、連結、および／もしくは精製反応を行うためのプロトコルを含む。さらに、上記指示書は、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） 分析システムを使用して検出するために、得られるタグ化ＲＮＡ分子を調製するためのガイダンスを提供する。

（実施例１：ＭｉＲＮＡ検出キットプロトコル）
上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡサンプル調製キットは、特有のオリゴヌクレオチドタグをｍｉＲＮＡに連結し、これら短いＲＮＡが上記標準的ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） 遺伝子発現アッセイにおいて高い特異性および感度で検出されることを可能にするための試薬を提供する。上記ｍｉＲＮＡタグ連結反応は、総ＲＮＡのバックグラウンドにおいて行われ得る。

サンプル調製は、多重化された、それらの標的ｍｉＲＮＡへの上記特異的タグのアニーリング、連結反応、および連結されていないタグを除去するための酵素精製を含んだ。各ｍｉＲＮＡとその適切なタグとの間の配列特異性を、アニーリングおよび連結温度の注意深い、段階的な制御によって確実にした。コントロールＲＮＡは、ユーザーが、上記反応の各工程を介して連結効率および特異性をモニターすることを可能にした上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ヒトｍｉＲＮＡサンプル調製キットにおいて含まれた。上記サンプル調製反応のための合計実践時間（ｈａｎｄｓ−ｏｎ ｔｉｍｅ）は、約３０分間、経過時間は約３時間であった。

上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイを、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムで行った。上記システムは、２つの機器、ハイブリダイゼーション後加工処理のために使用されるプレップステーションおよびデータ収集のために使用されるデジタル分析器から構成されていた。

ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プレップステーションの２工程の磁性ビーズベースの精製を使用して洗い流した。上記捕捉プローブおよび上記レポータープローブに相補的な短い核酸配列で誘導体化した磁性ビーズを、逐次的に使用した。第１に、標的／プローブ複合体を含む上記ハイブリダイゼーション混合物を、上記捕捉プローブ上の配列に相補的な磁性ビーズに結合させた。洗浄工程を行って、過剰なレポータープローブおよび非標的細胞転写物を除去した。洗浄後、上記捕捉プローブおよび標的／プローブ複合体を、上記ビーズから溶出した。これを、上記レポータープローブ上の配列に相補的な磁性ビーズへとハイブリダイズさせた。さらなる洗浄を行って、過剰な捕捉プローブを除去した。最後に、上記精製した標的／プローブ複合体を上記ビーズから溶出し、データ収集のために上記カートリッジに固定化した。

データ収集を、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）デジタル分析器で行った。デジタル画像を加工処理し、上記バーコード計数を、カンマ区切り値（ＣＳＶ）フォーマットにおいて表にした。

（材料）

（サーモサイクラー）
上記ｍｉＲＮＡサンプル調製プロトコルに使用されるサーモサイクラーは、加熱したふた（例えば、表１．２に列挙されるＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＢｉｏＲａｄモデル）を有した。加熱したふた付きの他のサーモサイクラーも、十分に機能すると予測され、上記アッセイキットは、適切な精嚢を確認するためのコントロールを含む。上記サーモサイクラーは、このアッセイを使用する前に、較正されるべきである。

上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ調製プロトコルは、すべての反応工程の注意深い温度制御を使用した。加熱されたふた付きサーモサイクラーを、この手順のために使用した。始まる前に、上記サーモサイクラープロトコルを、以下のようにプログラムした。

（ＭｉＲＮＡサンプル調製プロトコル）
すべての実験を、１２セットのアッセイにおいて設計した。以下のプロトコルは、１２アッセイのうちの１セットについてである。すべての試薬は、１２反応のありコートで供給する。
１．ＲＮＡサンプルを、ＤＥＰＣ（もしくはＲＮＡｓｅ非含有）Ｈ_２Ｏを使用して、３３ｎｇ／μＬに標準化した。
２．上記ｍｉＲＮＡアッセイコントロールの１：５００希釈物を、調製した。４９９μＬ ＤＥＰＣ Ｈ_２Ｏを、滅菌美章園心チューブの中で、上記ｍｉＲＮＡアッセイコントロールの１μＬへと添加した。上記チューブを、ボルテックスすることによって混合、短時間遠心分離にかけ、氷上で保存した。
３．アニーリングマスターミックスを、１３μＬのアニーリング緩衝液、２６μＬのｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡタグ試薬および工程２において調製した６．５μＬの上記１：５００ ｍｉＲＮＡアッセイコントロール希釈物を合わせることによって、調製した。これを、ピペットで上下させることによって十分に混合した。
４．３．５μＬの上記アニーリングマスターミックスを、各チューブにアリコートに分けた。
５．３μＬ（１００ｎｇ）のＲＮＡサンプルを、各チューブに添加した。チューブにキャップをし、軽くたたいて混合し、遠心分離にかけた。
６．上記ストリップを、上記サーモサイクラーの中に入れ、上記アニーリングプロトコルを開始した。
７．１９．５μＬ ＰＥＧを、１３μＬ 連結緩衝液と合わせて、連結マスターミックスを調製した。
８．上記アニーリングプロトコルの完了後、上記サーモサイクラーが４８℃に達したとき、２．５μＬの上記連結マスターミックスを各チューブに添加した（上記サーモサイクラーを、工程９および工程１０に関して４８℃で維持されるように、静置した）。上記チューブを軽くたたいて、混合し、遠心分離にかけた。
９．上記チューブを、４８℃のサーモサイクラーに戻し、上記ふたを閉め、上記チューブを４８℃において５分間にわたってインキュベートした。
１０．上記サーモサイクラーを開け、上記キャップをチューブから注意深く外し、上記チューブを上記ブロックの上に残し、１．０μＬのリガーゼを各チューブに直接添加し、その間にそれらを４８℃でインキュベートした。上記ピペットチップをチェックして確認し、上記リガーゼのすべてを上記反応系に添加した。混合する必要はなかった。
注意：ＰＥＧは粘性であり、ゆっくりとピペットですって、上記混合物の中に正確に移すことを確実にした。これを、ピペットで上下させることによって十分に混合した。
注意：工程１０に関しては、上記チューブを上記サーモサイクラーから外さず、上記チューブの温度を４８℃で維持した。
１１．リガーゼを上記最後のチューブに添加した直後、上記チューブに再度キャップをし、ヒートブロック中に置いた。上記サーモサイクラーを閉じ、上記連結プロトコルを開始した。
１２．連結プロトコルの完了後、１μＬ 連結クリーンアップ酵素を、各反応系に添加した。上記チューブを、この工程のために上記ヒートブロックから外した。上記チューブを軽くたたいて、混合し、遠心分離にかけた。
１３．上記チューブを上記サーモサイクラーに戻し、上記精製プロトコルを開始した。
１４．精製プロトコルの完了後、４０μＬ ＤＥＰＣ（もしくはＲＮＡｓｅ非含有）Ｈ_２Ｏを、各サンプルに添加した。これを十分に混合し、遠心分離にかけた（必要であれば、この段階において、上記精製サンプル調製反応を、最大数週間にわたって、−２０℃で貯蔵した）。上記ハイブリダイゼーションプロトコルに進む前にサンプルを変性させた（ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションプロトコルの工程５）。

（ハイブリダイゼーションプロトコル）
上記最終ハイブリダイゼーション反応系は、以下の成分を含んでいた：１０μＬ レポーターコードセット、１０μＬ ハイブリダイゼーション緩衝液、上記ｍｉＲＮＡサンプル調製プロトコルから５μＬ アリコート、および５μＬ 捕捉プローブセット。
１．上記レポーターコードセットおよび捕捉プローブセット試薬の両方のアリコートを、冷凍庫から出して、氷上で融解した。上記アリコートを数回転倒して十分に混和した。上記試薬を短時間、＜１０００ｒｐｍにおいて遠心分離にかけた。
２．１３０μＬの上記レポーターコードセットおよび１３０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液を含むマスターミックスを、上記ハイブリダイゼーション緩衝液を、上記レポーターコードセットを含む上記チューブに添加することによって作った。上記マスターミックスを転倒混和し、遠心分離にかけた。
３．チューブにラベルを付けた。
４．２０μＬのマスターミックスを、上記１２本のチューブの各々に添加した。
５．上記ｍｉＲＮＡサンプル調製プロトコルのサンプルを、８５℃において５分間にわたって変性させ、氷上で急冷した。上記ｍｉＲＮＡサンプル調製プロトコルからの５μＬ アリコートを、各チューブに添加した。上記アッセイの設定の間に、上記チューブをたたくかもしくは転倒混和することによって、混合を行った。
６．上記サーモサイクラーを予め６５℃へと温め、次いで、３０μＬ 容積を使用してプログラムし、温度を計算し、ふたおよび「永遠」時間設定を加熱した。
７．５μＬの捕捉プローブセットを、６５℃に置く直前に各チューブに添加した。チューブにキャップをし、上記試薬を、上記ストリップチューブを数回転倒し、たたいて、完全に混合されることを確実にすることによって混合した。上記チューブを＜１０００ｒｐｍにおいて短時間遠心分離にかけ、直ぐに、上記チューブを、上記６５℃のサーモサイクラーの中に入れた。
８．ハイブリダイゼーションアッセイを、少なくとも１２時間にわたってインキュベートした。ハイブリダイゼーションを、加工処理の準備ができるまで６５℃で放置した。最大ハイブリダイゼーション時間は、３０時間を超えなかった。
９．上記サーモサイクラーからいったん外したら、本発明者らは、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） プレップステーションでハイブリダイゼーション後加工処理を直ぐに進めた。

（実施例２：多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットは、高い特異性でｍｉＲＮＡの個々の種を区別する）
５５個の異なるｍｉＲＮＡについてのアッセイの多重セットを、上記連結において３ｐＭでおよび最終ハイブリダイゼーション反応において３００ｆＭで存在する個々の合成ｍｉＲＮＡ標的に対して行った（表５）。１０個の標的に対する代表的データおよびその対応する１０個のアッセイ（５５個の多重アッセイの部分セット）を示す。データは、６００視野あたりの計数である。上記多重セット内の各アッセイは、検出されるように設計されている上記ｍｉＲＮＡに対して強い特異性を示す。

（実施例３：多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） アッセイキットは、異なる組織タイプにおけるＭｉＲＮＡ発現レベルを明らかにする）
ＭｉＲＮＡは、ある範囲の組織において類似のレベルで発現され得るが、多くは、異なる組織タイプにおいて異なった発現も示す。これら実験において、６１９個のヒトｍｉＲＮＡに対する多重ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイを、種々のヒト組織から精製した総ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）に対して行った。上記組織としては、肺、骨格筋、結腸および心臓が挙げられる。データを、対様式のセットで比較した。数百ものマイクロＲＮＡを、各サンプル中で特異的に検出した。図５Ａ〜Ｄにおいて、対角線上にあるデータ点は、両方の組織において類似のレベルで発現されたｍｉＲＮＡである。対角線の外側にあるものは、２つの組織タイプにおいて異なって調節されたｍｉＲＮＡを代表する。これら結果は、非常に多重化した状況における上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットが、数百もの低分子ＲＮＡの差次的発現を測定する能力があることを示す。

図６Ａ〜Ｂは、同じデータセットからとり、４つの組織タイプにおける幾つかの特異的ｍｉＲＮＡの差次的発現を強調する。図６Ａにおいて、６個のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３３ａ、−１４３、−１６、−２１、−２９ａおよび−３０ｂ）の異なる発現レベルは、約０〜２５，０００計数の範囲まで認められ得る一方で、図６Ｂは、肺および結腸組織において本質的に検出されないが、骨格筋において２００，０００を超える計数および心臓組織において７５，０００計数を与えるヒトｍｉＲ−１の筋肉特異的発現を示す。これらデータは、非常に多重化された状況における上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットが、発現レベルの広い範囲にわたる所定のｍｉＲＮＡの特異的発現における差異を測定できる能力があることを示す。

（実施例４：ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットは、臨床サンプルにおいてＲＮＡを同定する）
種々のサンプルタイプにおいてＲＮＡを検出する能力は、遺伝子発現アッセイにおいて重要な特徴である。低分子ＲＮＡの分野における特に重要な興味は、臨床サンプル中のそれらの発現レベルを測定する能力である。ここでそれらは、予後情報、診断情報もしくは治療情報を提供し得る。臨床組織サンプルは、頻繁に、ホルマリン固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルとして保存される。このことは、上記標的ＲＮＡ構造の改変をもたらす。すべての遺伝子発現アッセイが、ＦＦＰＥサンプルから単離されたＲＮＡと適合性であるわけではない。総ＲＮＡを、ｍｉＲＥａｓｙ ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、製造業者の指示に従ってＦＦＰＥサンプルから単離し、これらサンプルを使用して上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットから得たデータを、凍結サンプルとして貯蔵した同じ組織から単離した総ＲＮＡを使用して得たデータと比較した。これら実験の結果は、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットが、ＦＦＰＥサンプル中の低分子ＲＮＡを、総ＲＮＡ中と同じ特異性および感度で検出し得ることを実証する。図７に示される代表的データセットは、上記２つのサンプルタイプに由来するデータの間で極めて高い相関を示す（Ｒ^２値は０．９９より大きい）。

（実施例５：ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットは、多重フォーマットを提供する）
ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットは、多重フォーマットにおいて再現性のあるデータを生じる。図８は、６７６個のヒトｍｉＲＮＡに対する多重アッセイを、１００ｎｇのヒト脳参照総ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に対して行った２回の技術的複製からのデータの相関を示す。上記２つの複製実験からのデータは、極めて高い相関を示す（Ｒ^２値は０．９９９より大きい）。

（実施例６：ｎＣｏｕｎｔｅｒ ｍｉＲＮＡ発現アッセイキットは、ｍｉＲＮＡの３’配列改変体のプロファイリングを可能にする）
ｍｉＲＮＡの３’配列改変体を研究するために、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイブリッジを作り得る。これは、上記改変ｍｉＲＮＡの上記タグ化を指向する。ここで、本発明者らは、目的の各ｍｉＲＮＡについて２個の最も一般的な３’改変体（任意に改変体１および改変体２と称される）を測定した。各サンプルを、３つに分け、基準ブリッジプール、上記改変体１ブリッジプールおよび上記改変体２ブリッジプールで別個にアッセイした。この実験において、上記ブリッジは、上記改変体を上記基準配列と同じタグに指向し、従って、別個のアッセイにおいて検出されなければならなかった。各改変体を特有のタグに指向し、同じアッセイにおいてすべての改変体の検出を可能にするブリッジを設計することもまた可能である。上記プラットフォームの特異性は、５個の基準ｍｉＲＮＡ、改変体１、もしくは改変体２の合成ｍｉＲＮＡの混合物を、上記３つのブリッジプールの各々でアッセイすることによって示された。本発明者らは、各ブリッジプールが、他の改変体の最小のバックグラウンド検出を伴って、上記目的のｍｉＲＮＡ種を信頼性高く区別することを見いだした（図９Ａ）。本発明者らはまた、６０％ 基準ｍｉＲＮＡ、３０％ 改変体１、および１０％ 改変体２を含む合成ｍｉＲＮＡの混合物をアッセイしたところ、一般に、基準ｍｉＲＮＡ 対 改変ｍｉＲＮＡの正確な比が、識別され得ることを見いだした（図９Ｂ）。これら結果は、上記ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） ｍｉＲＮＡ発現アッセイが、ｍｉＲＮＡの３’配列改変体の発現を調査するために、強いプラットフォームを提供することを実証する。

（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するのであって、限定することは意図されない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。

本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての米国特許および公開もしくは非公開の米国特許出願は、参考として援用される。本明細書で引用されるすべての公開された外国特許および特許出願は、本明細書に参考として援用さらえる。本明細書で引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩの寄託は、本明細書に参考として援用される。本明細書で引用されるすべての他の刊行された参考文献、文書、写本および科学文献は、本明細書に参考として援用される。

本発明は、その好ましい実施形態を参照しながら具体的に示されかつ記載されてきたが、形態および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく本明細書で行われ得ることは、当業者によって理解される。

Claims (17)

1. （ａ）タグであって、ここで該タグは、第１のＤＮＡ配列、およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含み、ここで該第１のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む、タグ；ならびに
   （ｂ）ブリッジであって、ここで該ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列、および該タグの該第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、ブリッジ
   を含む組成物。
2. 前記ブリッジの前記第２のＤＮＡ配列および前記第３のＤＮＡ配列は、連続している、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＲＮＡは、非コードＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記非コードＲＮＡは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、もしくはｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ブリッジの前記第２のＤＮＡ配列および前記ＲＮＡ分子は、３７〜９５℃の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ブリッジの前記第２のＤＮＡ配列および前記ＲＮＡ分子は、４３〜５２℃の融解温度を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記ブリッジの前記第３のＤＮＡ配列および前記タグの前記第１の配列は、３７〜９５℃の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する、請求項１に記載の組成物。
9. 前記ブリッジの前記第３のＤＮＡ配列および前記タグの前記第１の配列は、４３〜５２℃の融解温度を有するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する、請求項１に記載の組成物。
10. 前記ブリッジの前記第２のＤＮＡ配列および前記第３のＤＮＡ配列は、実質的に同じ融解温度を有する核酸二重鎖を形成する、請求項１に記載の組成物。
11. 前記第３のＤＮＡ配列は、異質ＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記ＲＮＡ分子および／もしくは前記タグは、完全な相補性で前記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
13. 前記ＲＮＡ分子および／もしくは前記タグは、部分的な相補性で前記ブリッジに特異的にハイブリダイズする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
14. （ａ）組成物であって：
    （１）タグであって、ここで該タグは、第１のＤＮＡ配列、およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含む、タグ；ならびに
    （２）ブリッジであって、ここで該ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列、および該タグの該第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、ブリッジ
    を含む、組成物；ならびに
    （ｂ）ボリュームエクスクルーダーおよびヌクレアーゼからなる群より選択される物質、
    を含む、キット。
15. ＲＮＡ分子を検出する方法であって、該方法は、
    （ａ）少なくとも１個のＲＮＡ分子を含むサンプルを提供する工程；
    （ｂ）タグを提供する工程であって、ここで該タグは、第１のＤＮＡ配列、およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着するレポーター付着領域を含む、工程；
    （ｃ）ブリッジを提供する工程であって、ここで該ブリッジは、ＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列、および該タグの該第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含む、工程；
    （ｄ）緩衝液を提供する工程；
    （ｅ）該ＲＮＡ分子、該ブリッジ、および該タグを、３７〜９５℃で特異的にアニーリングさせる工程；
    （ｆ）該アニーリング反応物を、３７〜９５℃で保持する工程；
    （ｇ）リガーゼ緩衝液を提供する工程；
    （ｈ）リガーゼを、３７〜９５℃でアニーリング反応物に直接提供する工程；
    （ｉ）該ＲＮＡ分子を、３７〜９５℃の１つ以上の温度で該タグに連結する工程；ならびに
    （ｊ）該シグナルを検出する工程、
    を包含する、方法。
16. 複数のＲＮＡ分子の多重検出の方法であって、該方法は、
    （ａ）複数のＲＮＡ分子を含むサンプルを提供する工程；
    （ｂ）複数のタグを提供する工程であって、ここで各タグは、第１のＤＮＡ配列、およびシグナルを生成する１個以上のレポーター分子が付着する少なくとも１個のレポーター付着領域を含む、工程；
    （ｃ）複数のブリッジを提供する工程であって、ここで各ブリッジは、１個のＲＮＡ分子に相補的な第２のＤＮＡ配列、および１個のタグの第１のＤＮＡ配列に相補的な第３のＤＮＡ配列を含み、ここで各ブリッジは、ＲＮＡ分子のうちの１種およびタグのうちの１種に特異的にアニーリングし、ここで該タグのうちの１種は、該ＲＮＡ分子のうちの１種が該タグに結合される場合にＲＮＡ分子のうちの他の種と比較して、該ＲＮＡ分子のうちの１種を異なって標識するシグナルを生成する、工程；
    （ｄ）緩衝液を提供する工程；
    （ｅ）該ＲＮＡ分子、該ブリッジ、および該タグを、３７〜９５℃で特異的にアニーリングさせる工程；
    （ｆ）該アニーリング反応物を、３７〜９５℃で保持する工程；
    （ｇ）リガーゼ緩衝液を提供する工程；
    （ｈ）リガーゼを、３７〜９５℃でアニーリング反応物に直接提供する工程；
    （ｉ）該ＲＮＡ分子、該ブリッジ、該およびタグを、３７〜９５℃の１つ以上の温度で連結する工程；ならびに
    （ｊ）１種以上のシグナルを検出する工程、
    を包含する、方法。
17. 核酸ブリッジ分子を作製する方法であって、該方法は、
    （ａ）ＲＮＡ分子を選択する工程；
    （ｂ）該ＲＮＡ分子のセグメントを選択する工程であって、該ＲＮＡ分子のセグメントは、３７〜９５℃の融解温度を有する該ＲＮＡ分子の該セグメントに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子と、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する、工程；
    （ｃ）３７〜９５℃の融解温度を有する該ＲＮＡ分子の該セグメントに特異的にハイブリダイズする第１のＤＮＡブリッジ分子を生成する工程；
    （ｄ）タグを選択する工程であって、ここで該タグは、異質配列であるＤＮＡ配列を含む、工程；
    （ｅ）該タグのセグメントを選択する工程であって、該タグのセグメントは、３７〜９５℃の融解温度を有する該タグの該セグメントに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子と、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する、工程；
    （ｆ）３７〜９５℃の融解温度を有する該タグの該セグメントに特異的にハイブリダイズする第２のＤＮＡブリッジ分子を生成する工程；ならびに
    （ｇ）該第１のＤＮＡブリッジ分子と、該第２のＤＮＡブリッジ分子とを一体化させ、３７〜９５℃の融解温度を有する該標的ＲＮＡ分子の該セグメントおよび３７〜９５℃の融解温度を有する該タグの該セグメントに特異的にハイブリダイズする該核酸ＤＮＡブリッジ分子を形成する工程、
    を包含する、方法。