JP2013517780A - Ｍｖａの主なゲノム欠失を含むワクシニアウイルス変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、改変ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）のゲノムならびにベクター、特にこれを含むウイルス性ベクターを提供する。本発明はさらに、改変ワクシニアウイルスを提供する。本発明はさらに、特定の細胞型における複製能力に関してＶＡＣＶ内の変異の効果を判定するための方法を提供する。本発明は更に、改変ワクシニアウイルスの調製法を提供する。

Description

本発明は改変ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）ゲノムおよびベクター、特にこれを含むウイルス性ベクターを提供する。本発明はさらに、改変ワクシニアウイルスを提供する。本発明はさらに、上記材料のいずれかを含む単離細胞、特定の細胞型における複製能力に関してＶＡＣＶ内の変異の効果を判定するための方法を提供する。本発明はさらに、改変ワクシニアウイルスの調整法を提供する。

１９７０年代にＭａｙｒと同僚の先駆的な研究によって、ポックスウイルス感染に対するより安全なワクチンの開発が導かれた（２９、３０）。これはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）の連続的な継代によって達成されたものであり；５７０回のこのような継代後、ウイルスは「改変ワクシニアアンカラ」（ＭＶＡ）ウイルス（１６，１７）と再命名された。このウイルスの安全性および免疫原性については広く試験されており、制限された複製能ならびにヒトおよびその他の哺乳類におけるＭＶＡの神経病因性の両方について様々な文献に記載されている（１、１６〜１８、２０、２９）。これらの報告に基づき、一般にＣＥＦ細胞の５７０回目の継代後、ＭＶＡは均一で遺伝的に安定であると結論され（１６）、この断定は今日広く受け入れられている（２１、２９）。

これらの結論は、酵素消化によるＭＶＡおよびその祖先であるＣＶＡのＤＮＡマッピングによって支持され、これにより、ＣＶＡに比較して推定３０ｋｂのＤＮＡの損失をもたらすＭＶＡゲノム内の６個の欠失が明らかになった（２、２０）。ＭＶＡのヌクレオチド配列が決定され、遺伝子はワクシニアコペンハーゲン株に比較して注解され比較された（３）。１７７ｋｂと算出されたＭＶＡゲノムにより、欠失し、かつ改変された遺伝子のさらに詳細な分析が可能となった。これらのデータにより、ＭＶＡにおける哺乳類宿主域遺伝子の幾つかの欠損が明らかになり、このことが哺乳類細胞内での制限された複製の直接の証拠とされた（３）。

上に述べた６個の主要で大きな欠失に加え、ＣＶＡからＭＶＡへの継代において生じた遺伝子の断片化、切断、および点突然変異のような多くのより小さな変異があり、このような変異によってＭＶＡの減毒化の表現型が説明される（１９）。ＭＶＡは、もはや既知のポックスウイルスの免疫回避および病原因子の多くをコードしないが（３）、これがどのように哺乳類細胞におけるその表現型の不全およびｉｎ ｖｉｖｏでのその病原性の欠如を決定するかについては理解されていない。ＶＡＣＶに存在する４個の既知の宿主域遺伝子については、ＳＰＩ−１およびＫ１ＬのみがＭＶＡ内で欠失または切断されているが、Ｃ７ＬおよびＥ３Ｌは保存されている。ＳＰＩ−１およびＫ１Ｌの欠失はＭＶＡの宿主域を制限したが、選択した細胞株におけるこれらの再構成により、ＭＶＡ宿主域の制限は部分的にのみ逆転した（３３、３６）。ＣＶＡゲノムの大きな断片を用いるマーカーレスキュー実験により、ＳＰＩ−１、Ｃ７Ｌ、およびＫ１Ｌとは別の、少なくとも２個のさらなる宿主域遺伝子が、ＶＡＣＶゲノムの左の末端領域に存在し得ることが示された（３６）。

しかしながら、特定の研究はＭＶＡがヒト細胞内で複製できないことを示しているが（７、１７、２０、３２）、その他の研究は、ＭＶＡが様々なヒト細胞株、例えばＨｅＬａ（５、１２、３６）、２９３（１２）、およびＨａＣａｔ（６、９）内で制限された複製能をもつことを明確に示している。特にＭＶＡは、ヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）内ではとりわけ複製しない。

異なるヒト細胞型において幾つかのＭＶＡウイルスの複製を比較した（３１）。ＭＶＡ−Ｉ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ９８３２３６）は、その他の２つのＭＶＡウイルスに比較して非常に異なる複製特性を有しており、ほとんどのヒト細胞株がＭＶＡ−Ｉ７２１に対して許容的であり、実際にＨａＣａＴ、１４３Ｂ細胞内ではＣＶＡよりも高度に複製した（Ｉｄ．）。ＭＶＡ−５７２は、ＭＶＡウイルスに対して半許容的であることが示されるヒトＨａＣａＴ細胞株においてさえ複製した（Ｉｄ．）。ＭＶＡ−ＢＮＲは最も減毒化されたウイルスであり、試験したヒト細胞株のいずれにおいても複製しないことが明確に示された（Ｉｄ．）。

免疫抑制マウスはＭＶＡ−５７２およびＭＶＡ−Ｉ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ９８３２３６）によって死亡したが、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）によっては死亡しなかった（Ｉｄ．）。死亡した動物から分離したウイルスは、マウスへの接種に用いたＭＶＡ−５７２またはＭＶＡ−Ｉ７２１内に存在する変異形を示した（Ｉｄ．）。これらの亜集団は、変異をコードするか、またはＭＶＡに関連する欠失を６個よりも少なく含むことが示され、親ＭＶＡ株に比較して有意に変化した表現型を有した（Ｉｄ．）。従って、ヒト細胞株内でのこれらのウイルスの複製の間の相違は、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）には存在しない、ＭＶＡ−５７５およびＭＶＡ−Ｉ７２１のウイルス亜集団によるものであると考えられる。

従って、ワクシニアウイルスの新規な減毒化型、ならびにヒト細胞内でのワクシニアウイルス複製の基礎を決定するための方法および組成物が必要とされている。

本願発明者は、ＭＶＡおよび親ＣＶＡゲノムの両方を細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化し、次にクローン化したＣＶＡゲノム内に６個の主なＭＶＡ欠失を連続的に導入した。６個までの主なＭＶＡ欠失を含む、再構成した突然変異体ＣＶウイルスは、試験した１４の哺乳動物細胞株のうち１２において複製制限を検出せず；例外はウサギ細胞株のＲＫ１３およびＳＩＲＣであった。マウスにおいて、３個までの欠失を有するＣＶＡ変異体はわずかに増大した病原性を示したことから、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）の複製における遺伝子欠失はｉｎ ｖｉｖｏでの適応の取得をもたらし得ることが示唆される。５個または６個全ての欠失を含むＣＶＡ変異体の減毒化は中程度で、なお病原性を有する。欠失Ｖは、主にこれらの変異体の減毒化表現型に関与する。結論として、このような欠失ＶＡＣＶ変異形が、変異ワクシニアウイルス欠失変異体の調製における重要な中間体であるにもかかわらず、６個の主な欠失における３１の翻訳領域全ての喪失または切断は、強い減毒および高度に制限された宿主域を有する特定のＭＶＡ表現型の再生には十分でない。このようなワクシニアウイルス欠失変異体は、好ましくは宿主域の制限によって生じ、好ましくは非病原性であることによりＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮに類似する。実際に本願発明者の観察に基づくと、６個の主な欠失の外側にあるか、またはそれに付随するウイルス遺伝子の変異は、ＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮに類似する表現型に有意に貢献していると考えられる。事実、ＭＶＡの宿主域制限および非病原性は、おそらく主な欠失に関与する遺伝子の欠失と変異の協同的効果である。

従って、このために本発明は、とりわけ前記中間体のゲノム内に１以上の変異を導入することによって得られるこのような中間体（すなわちワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ））および変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）、ならびにｄＶＡＣＶｓおよびｍｄＶＡＣＶｓの調製法を提供する。従って本発明はそれ故、変異誘発を促進および／または加速することでＭＶＡ−ＢＮに類似するＶＡＣＶを進化させる手段および方法を提供する。これにより本発明は、ＭＶＡの公知の６個の欠失に加え、決定的に安全であるが高度に免疫原性のＭＶＡベクターのための遺伝子に対する有用な基礎を提供する。あるいは、本発明はＭＶＡ−ＢＮと同じ性質を有するＶＡＣＶ生成のための手段を提供する。

従って本発明の一態様は、
ａ）ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）のゲノムを提供すること；
ｂ）・ｄｅｌ Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置４０５２〜７４６５）；
・ｄｅｌ ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置２３１３９〜２５８８４）；
・ｄｅｌ ＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１５８８６７〜１６２４１３）；
・ｄｅｌ ＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１８０６３９〜１８７０９２）；
・ｄｅｌ Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１７４３８〜２２１５９）；および／または
・ｄｅｌ ＶＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１３５４８１〜１３９２６４）から選択される配列に対応する、欠失されるべき少なくとも１の配列をＶＡＣＶゲノムから欠失させることを含む方法によって得られるワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ）のゲノムを提供し、
ここでｄＶＡＣＶは少なくとも１のヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）において複製能力があり、かつ以下のウイルスのゲノムは否定される：ｖＰ６６８、ｖＰ６８１、ｖＰ７４９、ｖＰ７７４、ｖＰ７９６、ｖＰ８１１（２５）、ＭＶＡ−Ｉ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３６）（１）およびＶＡＣＶ株Ｔｉａｎ Ｔａｎ変異体ＭＶＴＴ_{２−ＧＦＰ}（３９、４０）。ｖＰ７５９も除外される（２５）。

このようなワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ）のゲノムは、変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）調製のための中間体であることが予想される。

本発明の関連態様は、上に提示したｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖおよび／またはｄｅｌ ＶＩ（ｄＶＡＣＶ）に対応する少なくとも１の配列を欠損するワクシニアウイルスを提供し、前記ｄＶＡＣＶは少なくとも１のヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）において複製能力があり、以下のウイルスは否定される：ｖＰ６６８、ｖＰ６８１、ｖＰ７４９、ｖＰ７７４、ｖＰ７９６、ｖＰ８１１（２５）、ＭＶＡ−Ｉ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３６）（１）およびＶＡＣＶ株Ｔｉａｎ Ｔａｎ変異体ＭＶＴＴ_{２−ＧＦＰ}（３９）。ｖＰ７５９も除外される（２５）。

ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２に示される配列を含む漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラは、「漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ−ＰＰ」（ＣＶＡ−ＰＰ）としてＥＣＡＣＣに寄託され、受託番号は１００６２９０１である。

本明細書で用いられる「ワクシニアウイルスゲノム」または「ＶＡＣＶゲノム」は、ｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、および／またはｄｅｌ Ｖそれぞれの欠失に先立ち、かつ少なくとも１の挿入、欠失、置換、または反転によるそれぞれの変異いずれかに先立つワクシニアウイルスの配列を意味する（以下でさらに考察する）。従って「ＶＡＣＶゲノム」は、天然から分離されたそれぞれの株に対するいずれかの型の欠失または変異を有する野生型ＶＡＣＶ配列であってよい。あるいは「ＶＡＣＶゲノム」は、１以上の天然の（すなわち天然で生じた）または人工の（すなわち人間により導入された）単数もしくは複数の欠失および／または単数もしくは複数の変異を既に含むが、本発明によるさらなる欠失および／または変異を導入するための出発物質として用いられることが意図された、特定の野生型株に対する配列であってもよい。

本明細書で用いられる「ワクシニアウイルスゲノムの欠失変異体」または「ｄＶＡＣＶゲノム」は、ｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、および／またはｄｅｌ ＶＩの少なくとも１に対応する配列が欠失した配列ワクシニアウイルスの配列を意味する。ｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、および／またはｄｅｌ ＶＩの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＭ５０１４８２によって登録されている単離されたＣＶＡの完全なコード領域への参照によって独自に同定され、ＥＣＡＣＣに受託番号１００６２９０１によって物的に寄託される。ワクシニアウイルスの好ましい欠失変異体は、本明細書に記載される漿尿膜ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）欠失変異体である。

本明細書でＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号ＡＭ５０１４８２を参照する際、これには２００７年１１月２１日のＡＭ５０１４８２のバージョンＡＭ５０１４８２．１、および２００９年１月３１日のバージョンＡＭ５０１４８２．１が含まれる。両バージョンの配列は、出願者が知る限り同一である。しかしながら疑わしい場合には２００７年１１月２１日のバージョンが好ましい。前記配列はＭｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌらによっても開示されている（２９）。

本配列のヌクレオチド位置４０５２〜７４６５はｄｅｌ Ｉに相当する。本配列のヌクレオチド位置２３１３９〜２５８８４はｄｅｌ ＩＩに相当する。本配列のヌクレオチド位置１５８８６７〜１６２４１３はｄｅｌ ＩＩＩに相当する。本配列のヌクレオチド位置１８０６３９〜１８７０９２はｄｅｌ ＩＶに相当する。本配列のヌクレオチド位置１７４３８〜２２１５９はｄｅｌ Ｖに相当する。本配列のヌクレオチド位置１３５４８１〜１３９２６４はｄｅｌ ＶＩに相当する。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２のこれらの配列領域もまたＭｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８，３２４９−３２５９によって提示されており（該文献３２５２頁の図２Ｂを参照）、ＭＶＡにおいて欠落しているＣＶＡゲノムの６領域に相当する。

本明細書で用いられる、「ＶＡＣＶ」と略される用語「ワクシニアウイルス」は、好ましくは、ＣＶＡと略される漿尿膜ウイルスを含む。従って、「ｄＶＡＣＶ」と略される用語「ワクシニアウイルスの欠失変異体」にはｄＣＶＡが含まれる。同様に、「ｍｄＶＡＣＶ」と略される用語「ワクシニアウイルスの変異欠失変異体」には「ｍｄＣＶＡ」が含まれる。

本明細書で用いられる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２の特定の部分に「対応する」配列（受託番号１００６２９０１によってＥＣＡＣＣに寄託されるウイルス「ＣＶＡ−ＰＰ」のゲノムに対応する）は、問題となる配列を標準的方法によってＡＭ５０１４８２と整列させた際、示された部分またはＡＭ５０１４８２の部分に対して有意な相同性を示す配列の伸展を指す。ＶＡＣＶの異なる株は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２のｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに類似するが、これらの配列と同一ではない配列を含んでよく、特に参照配列に対して異なるヌクレオチドを数個かまたはそれ以上含んでよい。ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２のｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに類似する、問題となる配列の伸展は、確立されたソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗバージョン２を「標準」または「プリセット」のパラメータに設定して用いることによる、標準的なｉｎ ｓｉｌｉｃｏアラインメント技術によって容易に決定できる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗバージョン２は、以下のアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌからオンラインで使用および／または取得されてよい。例えば、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩのいずれとも同一でないにもかかわらず、本発明の意味においてこれらの配列のいずれかに「対応する」配列は、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩを指定したＡＭ５０１４８２の部分配列の１以上に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有してよい。従ってｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに「対応する」配列には、上に示した、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２の所定の配列への参照による特定の配列が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる、列挙される複数の要素の間の接続詞「および／または」は、個々の、および組み合わせた選択肢両方を包含することが理解される。例えば２つの要素が「および／または」によって結合された場合、第１の選択肢は、第２要素なしでの第１要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１要素なしでの第２要素の適用性を指す。第３の選択肢は、第１および第２要素両方の適用性を指す。これらの選択肢のいずれの１も意味の範囲内にあることが理解されることから、本明細書で用いられる用語「および／または」の要件を満たす。１を超える選択肢の同時適用性もまた意味の範囲内にあることが理解されることから、本明細書で用いられる用語「および／または」の要件を満たす。

本明細書で用いられる「複製能力がある」は、所定の細胞内、例えば上に示した細胞株ＭＲＣ−５のような所定のヒト細胞株内でのウイルスの複製能を指す。特定の細胞内で複製できるウイルスは「複製能力がある」ことを意味するが、このような細胞内で複製できないウイルスは「複製能力がない」ことを指す。従って複製能力があるウイルスはときおり、選択された試験条件下で「複製」または「再生的複製」できるものとして記載される。ウイルスの増殖行動または増幅／複製は、細胞を感染させるため最初に用いた量（「入力力価」）に対する、感染細胞により産生されたウイルス（「出力力価」）の比によって表現されてよい。出力：入力の比は「増幅比」であり、この増幅比は、複製能力があるかまたはないことについての望ましい尺度を提供する。

増幅比は、複製能力の定量的尺度としても用いることができる。本明細書で用いられる「複製制限」または「複製減毒化」ウイルスは、問題となるウイルスが、所定の条件下で、同条件下での基準ウイルスの対応する能力に比較して、部分的または全体的に能力を損なうことを指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの設定（例えば細胞株）において、問題となるウイルスは「複製制限」と称される。ｉｎ ｖｉｖｏ の設定（例えば動物体内）において、問題となるウイルスは「複製減毒化」と称される。本明細書においてこれらの用語はこのように用いられる。複製能力の制限または減毒（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏそれぞれの設定に応じて）は増幅比を低下させる可能性があり、増幅比はなお１．０以上であるか、または１．０未満の値に低下する。前者の場合、ウイルスは同じ条件下で、その基準ウイルスよりも低いものの、なお複製能力を維持する。後者の場合、問題となるウイルスは「複製能力がない」。このように、「複製制限」または「複製減毒化」ウイルスは必ずしも「複製能力がない」わけではない。

増幅比１．０は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞の感染に用いた最初の量に同じである複製状態と定義され、これにより複製が起こったことが示され；増幅比１．０は、感染細胞内でそれぞれのウイルスに「複製能力がある」ことを意味する。増幅比＞１に対する同適用；増幅比＞１を生じるウイルスは、特定の細胞内でのそのウイルスの複製能力を示す。一方で増幅比＜１は、出力力価の入力力価未満の低下、細胞における再生複製の欠如、従って複製能力がないことを示す。特定の細胞内の特別のウイルスの増幅能力があるかまたはないことのそれぞれの程度は、測定された増幅比が１．０よりもどれだけ高いかまたは低いかに依存し得る。しかしながら、増幅比が選択された細胞内で１．０よりも大きいかまたは等しい限り、本発明の意味において「複製能力がある」ウイルスについて定量的に述べ得るが、本発明の意味において「複製能力がない」ウイルスは、１．０未満の増幅比に定性的に関連する。

所定の細胞内での所定のウイルス（本発明のコンストラクトを含む）の増幅比は、一般に当業者に公知である以下の方法によって測定されてよい。

一般に、所定のウイルスに複製能力があるかないかを決定するためには、選択した個別の単数または複数の細胞型に、「入力」力価で表される既知量の被検ウイルスを感染させる。入力力価は、ＴＣＩＤ_５０法による入力ウイルスの用量設定に許容的な細胞を用いて、複製性質の評価に先立って決定される（１４、２７）。望ましい入力力価を得るため、接種ウイルスは適切に希釈される。選択された細胞型への感染は全４日間置かれ、その後感染細胞の溶解によってウイルスサンプルが調製される。以下に述べるように、これらのウイルス試料を次にＣＥＦ指標細胞について用量設定する。これが「出力」力価である。入力力価に対する出力力価の比が１未満であるとき、被検ウイルスは試験条件下では複製能力がないことが示されるが、入力力価に対する出力力価の比が１以上であるとき、被検ウイルスは試験条件下で複製能力があることが示される（上記参照）。

被検ウイルスの複製性質を決定するため、選択した細胞を６ウェルプレートに５×１０^５細胞／ウェルの濃度でまき、２％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１９６５−０２６）中で３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートする。細胞培養液を除去し、細胞を接種ウイルスと共に３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で１時間インキュベートする。異なる細胞型それぞれへの感染に用いるウイルスの量は５×１０^４ＴＣＩＤ_５０である。これが上に述べたウイルスの「入力」力価である。３７℃にて１時間経過後、接種材料を吸引除去し、次に細胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、最後に１ｍｌ ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳを添加してプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて９６時間（４日間）インキュベートする。プレートを−８０℃で凍結することにより感染を停止させ、用量設定に備える。得られた、感染細胞の残りとインキュベーション培地を含む細胞ライセートは、出力力価を決定するために用量設定するウイルス試料である。従って、サンプルは細胞内および細胞外のウイルスを含む。

複製分析からのウイルス試料の用量設定分析（ワクシニアウイルス特異的抗体による免疫染色）：ウイルス出力力価の用量設定のため、ＣＥＦ細胞を９６ウェルプレートのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１８７０−０１０）、７％ＦＣＳ、１％抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４０−０６２）中に１×１０^４細胞／ウェルの濃度でまき、３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートする。感染実験を含む６ウェルプレートを３回凍結／融解し、ＲＰＭＩ増殖培地を用いて１０^−１〜１０^−１２の希釈物を調製する。ウイルス希釈物を試験細胞上に８通りに分配し、３７℃、５％ＣＯ_２にて５日間インキュベートしてウイルスを複製させる。試験細胞を１０分間固定し（アセトン／メタノール１：１）、風乾させ、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した後、インキュベーション緩衝液（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ）中で１：１０００に希釈したポリクローナルワクシニアウイルス特異的抗体（例えばＱｕａｒｔｅｔｔ Ｂｅｒｌｉｎ、カタログ番号９５０３−２０５７）と共に１時間ＲＴでインキュベートする。洗浄緩衝液で２回洗浄した後、インキュベーション緩衝液中で１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ番号Ｗ４０１１）をＲＴで１時間添加する。細胞を再び洗浄緩衝液で２回洗浄し、染色液（ＰＢＳで１：２希釈した３，３｀、５，５｀テトラメチル−ベンジジン発色基質（１．２ｍＭ；Ｓｅｒａｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ−００２−５−ＴＭＢ／））と共に１５分間ＲＴにてインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄する。顕微鏡を用い、プレート中の紫色を呈する感染細胞を記録する（付録３のスコア化シートを参照）。

紫の染色を示す全てのウェルをウイルス複製陽性として標識し、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒ法（ＴＣＩＤ_５０アッセイ）（１４、２７）を用いて力価を算出する。これが「出力」力価である。

入力および出力力価の両方について得られた値により、出力：入力の増幅比が、所定の細胞型における所定のウイルスの複製の程度の表示として算出されてよい。上記の手順を用い、選択した細胞株、例えばヒトＭＲＣ−５細胞において、特別のウイルスにどの程度複製能力があるかを容易に決定できる。

ｄＶＡＣＶは、上に定義したｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖおよび／またはｄｅｌ ＶＩに対応する１以上の配列を欠失させることにより得られる。ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する配列の欠失全ての可能な組み合わせは本発明に特異的に包含され、これらは例えばｄｅｌ ＩＩＩ単独、ｄｅｌ ＩＩおよびｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｉならびにｄｅｌ Ｖおよびｄｅｌ ＶＩなどに対応する配列である。このように、ｄＶＡＣＶは上に定義したｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、および／またはｄｅｌ ＶＩに対応する配列の１、２、３、４、５、または６の欠失を有し得る。好ましくは、ｄＶＡＣＶはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２への参照によるｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、およびｄｅｌ ＶＩの６個全てに対応する配列を欠失させた結果である。

ｄＶＡＣＶ、例えばｄＣＶＡは、例えば２９３、１４３Ｂ、およびＭＲＣ−５細胞株から選択されるヒト細胞株において複製能力がある。上述の意味で、ｄＶＡＣＶはヒト細胞株ＭＲＣ−５において複製能力があることが好ましい。ｄＶＡＣＶ、例えばｄＣＶＡは、細胞株、好ましくは本明細書に記載されるヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５において、上述のように測定された増幅率が５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００、または１０００よりも大きな複製能力があることが好ましい。

上述のように、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する配列は、ＭＶＡに至る途中の親ＣＶＡウイルスの多くの継代においてＣＶＡゲノムから失われた。ＭＶＡは、ワクチン接種される疾病に関連する抗原の源として作用するが、投与されるヒトホストの細胞に細胞壊死効果を導かないことから、ウイルスベースのワクチン療法への使用に非常に適している。驚くべきことに、ＣＶＡとＭＶＡの間の遺伝的関連性の研究において、本願発明者は、ＣＶＡそれ自体のｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する配列の欠失が、ウイルスベースのワクチン療法におけるベクターとしてのＭＶＡの使用によって有利な特性を与えるために十分ではないことを見出した。ＭＶＡの有利な減毒化は、（ａ）ｄｅｌ Ｉ〜ＶＩの配列の欠失、および（ｂ）これらの配列の欠失を超えたその他の変異の発生の組み合わせによるものと考えられる。ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列が欠失したワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ）の提供において、本発明は、上述の欠失を超えたさらなる変異に効果を及ぼす出発点として使用できる重要な手段を有利に提供する。それ故ｄＶＡＣＶゲノムおよびベクター、特にウイルス、本発明のコンストラクトは、ウイルスベースのワクチンの成功に重要なウイルス複製の減毒化の基礎を決定し、最終的にはウイルスベースのワクチン療法において有用である代替のウイルスベクターの開発を助けるための重要な手段を提供する。

本発明の様々な態様の特に好ましい実施形態によれば、ｄＶＡＣＶはｄＣＶＡである。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２の下に提示されるゲノム配列を有するＣＶＡ由来のｄＣＶＡが特に好ましい。対応する物的なウイルスは、株「ＣＶＡ−ＰＰ」として、受託番号１００６２９０１によりＥＣＡＣＣに寄託されている。

好ましいｄＣＶＡゲノムの一例は、ｄｅｌ Ｖに対応する配列を欠除した、さらに好ましくはｄｅｌ ＩおよびＩＶに対応する配列を欠除した、さらに好ましくはｄｅｌ Ｉ、ＩＩ、およびＩＶに対応する配列を欠除した、さらになお好ましくはｄｅｌ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに対応する配列を欠除した、さらになお好ましくはｄｅｌ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶに対応する配列を欠除した、ならびに最も好ましくはｄｅｌ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩに対応する配列を欠除したゲノムを含む。

従って好ましい実施形態によれば、ワクシニアウイルス変異体を得ることのできる方法は、少なくとも１の変異をｄＶＡＣＶゲノムに導入して変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を産生することをさらに含み、ここでｍｄＶＡＣＶは少なくとも１のヒト細胞株内で複製能力があり、かつヒト細胞株内でのｍｄＶＡＣＶの複製能力はヒト細胞株内でのｄＶＡＣＶの複製能力に比較して制限される。ヒト細胞株は例えばＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）であってよい。

関連する好ましい実施形態は、少なくとも１の変異をさらに含むｄＶＡＣＶ（ｍｄＶＡＣＶ）を提供し、ここでｍｄＶＡＣＶは少なくとも１のヒト細胞株内で複製能力があり、かつヒト細胞株内でのｍｄＶＡＣＶの複製能力はヒト細胞株内でのｄＶＡＣＶの複製能力に比較して制限される。ヒト細胞株は例えばＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）であってよい。

上に説明したように、その複製能力において、その祖先ｄＶＡＣＶに比較して制限または減毒化された変異欠失変異体のゲノムは、特定の条件下での複製能力の望ましい制限に関与するゲノム変異の型に対する有用な情報を提供できる。野生型ワクシニアウイルスのような既知のウイルスはウイルスベースのワクチンとしての使用には困難を呈するが；これらは関心のある抗原に応答して望ましい免疫原性を誘発し、また投与の際にしばしば有意な病原性および病的状態をもたらすために十分な病原性を有し、かつそのために患者への投与は安全でない可能性がある。対照的に、本実施形態の変異ワクシニアウイルス欠失変異形（ｍｄＶＡＣＶ）は、それらの親ｄＶＡＣＶに比較して複製が制限されていることから病原性が減少しているが、ワクチン療法において関心のある抗原の配列をコードする送達薬剤として作用する能力は保持している。

本発明のこの実施形態によれば、ｍｄＶＡＣＶゲノムは複製能力を保持しているが、対応する親ｄＶＡＣＶに比較したこの複製能力の制限は、複製能力の減少および最終的な喪失に関与する変異の型ならびに位置についての貴重な情報を提供できる。この情報は、ウイルスベースのワクチン療法における使用のための複製減毒化ウイルスのさらなる設計に重要である。

本明細書で用いられる「変異」は、配列の持続領域における少なくとも１のヌクレオチドの挿入、欠失、置換（転移および転換を含む）として理解されなければならない。ｍｄＶＡＣＶを導く変異が欠失であるかまたは欠失を含む場合、「欠失」は、上に定義したｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する領域以外の領域に由来する少なくとも１のヌクレオチドを除去することが好ましい。このように、ｄＶＡＣＶからｍｄＶＡＣＶ を導く変異が欠失である場合、この欠失は、ＶＡＣＶのｄＶＡＣＶへの変換後に残るｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩのいずれかに対応する配列以外の配列（少なくとも１のヌクレオチド）の欠失であることが好ましい。「持続領域」は、ＶＡＣＶでは最終コンストラクトで欠失し得ない領域を指し、ｄＶＡＣＶではｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩの１以上の欠失後に残るゲノム領域を指す。従って持続領域は、ＶＡＣＶゲノム内で影響を及ぼす全ての欠失が影響した後にｍｄＶＡＣＶに残り得る領域であり、このような欠失がｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩの１以上であるか、またはｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応しない別の領域であるかに関わらない。少なくとも１の変異が、公知の方法、例えば標的変異誘発、エラープローンＰＣＲなどによってこの領域に導入されてよい。

本発明のこの実施形態によれば、上に提示したｍｄＶＡＣＶゲノムは、ｍｄＶＡＣＶにおける場合、ヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５内でのその複製が対応する親ｄＶＡＣＶに比較して制限されている、および／または動物におけるその病原性が対応する親ｄＶＡＣＶに比較して減毒化している。ウイルスの複製能力の制限を判定するために適した方法は、上に提示した。動物におけるウイルスの複製能力の減毒化、ならびに動物における病原性および／または免疫原性を判定するために適した方法は、以下に提示する。

少なくとも１の欠失および少なくとも１の変異が導入される順序は決定的なものではない。すなわち、ｄＶＡＣＶを産生するために、最初にＶＡＣＶゲノムからｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩ（上に定義した）に対応する少なくとも１の配列を欠失させ、次に最終的なｍｄＶＡＣＶを産生するために、持続領域に少なくとも１の変異を導入してｍｄＶＡＣＶを産生することが可能である。あるいは、持続領域であることが意図される領域内に少なくとも１の変異を最初に導入し、次にｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列を欠失させて、もう一度最終的なｍｄＶＡＣＶを産生することが可能である。しかしながら以下で明らかになり得るように、最初に配列を欠失させてｄＶＡＣＶを産生し、次に１以上のさらなる変異を導入して最終的なｍｄＶＡＣＶを産生することが有利であり得るが、これはｍｄＶＡＣＶ産物（ゲノムまたはウイルス）の最終的に望まれる減毒化のため、制御された段階的な方法でｄＶＡＣＶにおけるさらなる突然変異の関連性を確立することが可能なためである。上で説明したように、これはｉｎ ｖｉｔｒｏでの有利な制限、およびよりよく理解され、確立され、次にウイルスベースのワクチン療法における使用に適した新規なウイルスコンストラクト産生において最終的に活用されるべきウイルス複製能力の、ｉｎ ｖｉｖｏでの最終的な減毒化の遺伝的な基礎を可能にすることから、本発明の利点の一部である。

ｄＶＡＣＶ、好ましくは、ｄＣＶＡは、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩの少なくとも１の欠失を超えてさらなる突然変異を含むことができ、持続領域内のこのような単数または複数のさらなる突然変異によってｍｄＶＡＣＶと名付けられる。好ましい事例ではｄＶＡＣＶはｄＣＶＡであり、対応するｍｄＶＡＣＶはｍｄＣＶＡである。当業者は、ｄＶＡＣＶ、好ましくはｄＣＶＡのヌクレオチド配列を変化させるための分子生物学的または遺伝的技術を用いて作製できる、多数の変異が存在することを理解する。当業者はさらに、ヒト細胞株におけるｄＶＡＣＶの複製能を阻害することなく、多数の変異、例えば保存されたサイレント変異、および非コード領域内の変異を作製できることを認識する。しかしながら、少なくとも１の変異はコード領域内に導入されることが望ましい。

本発明の一実施形態では、さらなる突然変異を含むｍｄＶＡＣＶの、ｄＶＡＣＶに比較した複製能力をヒト細胞株内でアッセイし、ｄＶＡＣＶの欠失を超えるさらなる突然変異が、アッセイに使用したヒト細胞株内でｍｄＶＡＣＶゲノムの複製能力を制限するか否かを調べた。これは上述のように行うことができ、ｍｄＶＡＣＶの、上に定義した増幅率が同じヒト細胞株においてｄＶＡＣＶよりも低い事例において、ｍｄＶＡＣＶの複製能力は親ｄＶＡＣＶに比較して制限されていると結論できるであろう。この複製制限ｍｄＶＡＣＶは次に、さらなる変異を導入し、ｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶのいずれかに関して複製能力を再評価することによる最適化のさらなるラウンドのための手段として用いることができる。従ってウイルスベースのワクチン療法における使用により適した複製制限ウイルスの産生は、さらに取り込まれた変異が所定のヒト細胞株内で複製能力のさらなる制限をもたらす、反復的な効果を表すことができる。すなわち、最適化の第１ラウンドの最後にあるｍｄＶＡＣＶは、さらなる最適化のラウンドの開始においてｄＶＡＣＶとなり、第１のものよりもさらに制限されたｍｄＶＡＣＶをなお産生する。適した細胞株には、１４３Ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０３、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ＨａＣａＴ（６）、Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）、ＢＡＬＢ／３Ｔ１２−３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１６４）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）、ＲＫ−１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７、ＳＩＲＣ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６０）、およびＩＥＣ−６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９２）が含まれる。ヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）が特に好ましい。好ましい実施形態によれば、ｄＶＡＣＶ、好ましくはｄＣＶＡの変異が、ヒト細胞株、好ましくはＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）内で、得られたｍｄＶＡＣＶ、好ましくはｍｄＣＶＡの複製に影響を及ぼすか否かについて決定される。

１以上の型のｍｄＶＡＣＶを作製するため、任意に反復的な方法でｄＶＡＣＶに変異を取り込ませることにより、ヒト細胞株内でのｍｄＶＡＣＶの複製能力を、このヒト細胞株内での複製能力が完全に失われるまで制限することが可能である。このことは選択したヒト細胞株へのｍｄＶＡＣＶの感染後に測定した増幅率が、感染後に細胞を感染させるために最初に用いたよりも少ないウイルスを意味する１．０未満、好ましくは十分に１未満である事例に相当する。この場合、複製能力のないｍｄＶＡＣＶによるウイルス感染は、ｍｄＶＡＣＶの全体的な喪失と共に進行する。このようなｍｄＶＡＣＶゲノムおよびベクター、特にウイルスベクターは、いずれの複製または病原性もなく望ましい免疫原性応答を誘発する可能性があることから、ウイルスベースのワクチン療法に特に有利である。

従って本発明のさらなる態様は、
ａ）ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）のゲノムを提供すること；
ｂ）上に提示するｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖおよび／またはｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列を欠失させること；および
ｃ）ＶＡＣＶゲノムに少なくとも１の変異を導入することを含む方法によって得られる変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）のゲノムを提供し、
ここでｍｄＶＡＣＶは少なくとも１のヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）において複製能力がなく、かつ以下のウイルスのゲノムは否定される：ＭＶＡ−５７２（ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７）、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）、ＭＶＡ ＩＩ／８５（５）、ＭＶＡ（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８）、およびＮＹＶＡＣ（３４）。その配列がＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＹ６０３３５５により寄託されるＡｃａｍｂｉｓ３０００改変ウイルスアンカラ、およびＭＶＡ−Ｉ７２１（１）もまた除外される。

本発明の関連態様は変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を提供し、ここで前記ｍｄＶＡＣＶは、上に提示するｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖおよび／またはｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列を欠如しており、ここで前記ｍｄＶＡＣＶは少なくとも１の変異を含み、ここでｍｄＶＡＣＶは、少なくとも１のヒト細胞株、例えばヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）において複製能力がなく、かつ以下のウイルスは否定される：ＭＶＡ−５７２（ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７）、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）、ＭＶＡ ＩＩ／８５（５）、ＭＶＡ（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８）、およびＮＹＶＡＣ（３４）。その配列がＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＹ６０３３５５により寄託されるＡｃａｍｂｉｓ３０００改変ウイルスアンカラ、およびＭＶＡ−Ｉ７２１（１）もまた除外される。

好ましくは、本明細書に記載される方法によって得られるｍｄＶＡＣＶまたはｍｄＣＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｖ０００８３００８としてＥＣＡＣＣに寄託されている）と同じ性質／特色を有する。これらの性質は：ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内で再生複製できること、ヒトケラチノサイト株ＨａＣａｔ、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａ内では再生複製できないことである。

ＭＶＡ−ＢＮのこれらの特色、ＭＶＡ株がＭＶＡ−ＢＮであるか否かを評価可能な生物学的アッセイ、およびＭＶＡ−ＢＮ（またはその誘導体）を得ることができる方法についての記載は、国際公開第０２／４２４８０号および国際公開第０３０４８１８４号に詳細に開示されている。この出願の内容は、参照により本出願に含まれる。前記参考文献は、ＭＶＡおよびその他のワクシニアウイルスがどのように繁殖するかについても開示している。

上に述べたように、本発明はｍｄＶＡＣＶ、好ましくはＭＶＡ−ＢＮと同じ性質を有するｍｄＣＶＡを企図することから、以下のウイルス／ゲノムは包含されない：ＭＶＡ−５７２（ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７）、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ ＩＩ／８５、ＭＶＡ ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８、およびＮＹＶＡＣ。その配列が受託番号ＡＹ６０３３５５によりＧｅｎＢａｎｋに寄託されるＡｃａｍｂｉｓ ３０００改変ウイルスアンカラ、およびＭＶＡ−Ｉ７２１もまた包含されない。

本発明のｄＶＡＣＶ、好ましくはｄＣＶＡ、またはｍｄＶＡＣＶ、好ましくはｍｄＣＶＡは、医薬品または診断用組成物に含まれることが予想される。これはまたワクチン組成物にも含まれてよい。

ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列を欠損し、残りの持続領域に少なくとも１の変異を含むｍｄＶＡＣＶの供給において、本発明者らはウイルスベクターおよびウイルスワクチン療法としての使用に潜在的に高く適したワクシニアウイルス変異体を改変するための方針を有利に提供した。

上で述べたように、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する配列の全てがｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶコンストラクトに不在でなくてもよい。しかしながら、ｄＶＡＣＶおよび／またはｍｄＶＡＣＶがこれらに対応する配列を含まないように、ｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩの全てを除去することが好ましいであろう。

ｍｄＶＡＣＶにおける少なくとも１の変異に関して、変異はＶＡＣＶゲノムの少なくとも１のコード領域内へ導入されることが好ましい。例えば設定されるコード領域は、Ｆ５Ｌ、Ｂ８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ａ３１Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ３７Ｒ、およびＡ４Ｌから選択されてよい。１以上のこれらのコード領域における変異が好ましい。これらのコード領域は、ＶＡＣＶコペンハーゲン株の公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）に対して定義される。

好ましくはＶＡＣＶゲノムは、そのゲノム配列がＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２により示される漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２に示される配列を含むＣＶＡは、「ＣＶＡ−ＰＰ」として受託番号１００６２９０１によりＥＣＡＣＣに寄託されている。

本発明によるｍｄＶＡＣＶ変異形は、その他のＶＡＣＶを超えた決定的な利点をもつ。野生型ワクシニアウイルス、例えばＣＶＡのような既知のウイルスは、ウイルスベースのワクチンとしての使用に困難を呈し得るが；これらは関心のある抗原に応答して望ましい免疫原性を誘発し、投与の際に有意な病原性および病的状態をもたらすために十分な病原性を有する可能性があり、かつそのために患者への投与は安全でない可能性がある。対照的に本発明のｍｄＶＡＣＶ変異形は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの複製能力および／またはそれらの生体内での病原性および／またはそれらのｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性において減毒化されているが、ワクチン療法の一部として関心のある抗原の配列をコードする送達薬剤として作用する能力は保持している。そのため、これらは存在する多くのウイルスよりもかなり安全である。従って本発明は、新規ウイルスゲノム、および、哺乳類、例えばヒト被験体における高い免疫原性および良好な安全特性の利点を組み合わせたＭＶＡのような新規ウイルスへのアクセスを有利に拡大する。

本発明のさらなる態様は、ベクター、好ましくは上に提示したｄＶＡＣＶ（特にｄＶＡＣＶのゲノム）またはｍｄＶＡＣＶゲノムを含むＤＮＡベクターに関する。本発明の別の態様は、以下に詳述するｄＶＡＣＶの調製法によって得られるｄＣＶＡのゲノムを含むＤＮＡベクターである。好ましくは、前記ｄＣＶＡまたは前記ｄＣＶＡのゲノムを含む前記ＤＮＡベクターは、ヒト２９３細胞株、ヒト１４３Ｂ細胞株、またはヒトＭＲＣ−５細胞株において５よりも大きな増幅率により再生的に複製する。ベクターは、例えば有利に細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、またはウイルスであってよい。ベクターがウイルスである場合、ウイルスはワクシニアウイルスであることが特に好ましい。このように本発明は、上に提示するゲノムを含むワクシニアウイルスもまた提供する。

ベクター、好ましくはＶＡＣＶゲノム（ｄＶＡＣＶゲノム）の欠失変異体、好ましくはＣＶＡゲノムの欠失変異体（ｄＣＶＡゲノム）を含むＤＮＡベクターは、ｄＶＡＣＶゲノム、好ましくはｄＣＶＡゲノムの大きさのＤＮＡ分子に対する用量を有するいずれのベクターであってもよい。好ましい実施形態によれば、ＤＮＡベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ−１由来人工染色体（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、またはヒト人工染色体 （ＨＡＣ）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：３４５；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９７：９３；Ｇｉｒａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓ．１０：８３；Ａｍｅｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６０：２３５；Ｂｕｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：１９５）である。最も好ましくは、ＤＮＡベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。ＤＮＡベクターを用いる場合、伝染性ウイルスは、当該技術分野における日常的技術、例えば以下の実施例に記載する技術を用いてＤＮＡベクターから産生できる。一実施形態によれば、ｄＣＶＡウイルス（ｄＶＡＣＶの実例として）は、ヘルパーウイルスとしてショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）を用いてｄＣＶＡのゲノムを含むベクターから産生できる（４７）。別の実施形態によれば、ヘルパー細胞株は、伝染性娘ウイルス内にパッケージされているトランスフェクトされたベクターから真正ウイルスゲノムを産生するための、ポックスウイルスによりコードされる転写系を供給するために用いることができる。

ＢＨＫ−２１細胞へのベクタートランスフェクションおよびＳＦＶ感染後、伝染性ｄＶＡＣＶ、好ましくは伝染性ｄＣＶＡを救出できる。ヘルパーウイルスを除去するため、ＣＥＦ細胞、またはＳＦＶに許容的でないその他の細胞型について３回継代を行うことができる。ＣＥＦ細胞の３回継代後、救出したウイルスのストック内にＳＦＶ ＤＮＡが存在せず、従って伝染性ＳＦＶは存在しないことを確認するためにＰＣＲを用いることができる。

本発明のさらなる態様は、上もしくは下に述べるｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶいずれかのゲノム、上に提示するいずれかのベクター、または上に提示するｄＶＡＣＶもしくはｍｄＶＡＣＶを含む単離細胞を提供する。単離細胞は好ましくは酵母細胞、細菌細胞、または哺乳類細胞である。細胞が哺乳類細胞である場合、哺乳類細胞はマウス細胞、サル細胞、またはウサギ細胞であることが好ましい。特に好ましい実施形態では、細胞はＣＥＦ、ＢＨＫ−２１、１４３Ｂ、２９３、ＨａＣａｔ、Ｈｅｌａ、ＭＲＣ−５、ＢＳ−Ｃ−１、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ ＢＡＬＢ／３Ｔ１２−３、ＭＤＣＫ、ＲＫ−１３、ＳＩＲＣ、またはＩＥＣ−６細胞から選択される。ＭＲＣ−５細胞が最も好ましい。

前述のことから明らかであるように、ｍｄＶＡＣＶ変異形の産生は、ホストまたはホスト細胞に細胞壊死性の影響を引き起こすことなく、ホストまたはホスト細胞に所望の抗原を送達するために使用され得る代替のウイルスベクターを得るための有利な方法を表すものであり、これによって代替のウイルスベースのワクチン投与戦略への道を開く。従って本発明のさらなる態様は：
（ａ）・ｄｅｌ Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置４０５２〜７４６５）；
・ｄｅｌ ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置２３１３９〜２５８８４）；
・ｄｅｌ ＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１５８８６７〜１６２４１３）；
・ｄｅｌ ＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１８０６３９〜１８７０９２）；
・ｄｅｌ Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１７４３８〜２２１５９）；および／または
・ｄｅｌ ＶＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１３５４８１〜１３９２６４）から選択される配列に対応する少なくとも１の配列を欠失するＶＡＣＶのゲノムであって、該ＶＡＣＶゲノムがヒト細胞株内で複製する、欠失したＶＡＣＶゲノムを含むベクターを提供すること；
（ｂ）該ｄＶＡＣＶゲノムに少なくとも１の変異を導入すること；および
（ｃ）該変異が、変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）の複製に影響を及ぼすか否かを決定することを含む、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）における変異の効果を決定するための方法を提供する。

好ましい態様によれば、ＶＡＣＶにおける変異の効果を決定するための方法は、
ヒト細胞株における前記ｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程；および／または
ヒト細胞株における前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程をさらに含む。

別の好ましい態様によれば、前記方法は、少なくとも１の変異が前記ヒト細胞株内での前記ｍｄＶＡＣＶの複製に影響するか否かを決定するため、前記ｄＶＡＣＶの増幅率を前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率と比較することをさらに含む。

上記方法において、同じヒト細胞株におけるｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶの増幅率（それぞれ第１および第２の複製と名付ける）は、上に提示する方法により測定できる。本明細書で用いられる「増幅率」は、増幅率を決定することもまた含む。ｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶそれぞれに対する第１および第２の複製の単純な数値的比較は次に、ｄＶＡＣＶに加えた所定の変異が、ｄＶＡＣＶに比較してｍｄＶＡＣＶの複製に影響するか否かについての望ましい指標として役立つ。特に、ｄＶＡＣＶに対して測定された「第１の複製」がｍｄＶＡＣＶに対して測定された「第２の複製」よりも大きな場合、このことはｍｄＶＡＣＶを得るためにｄＶＡＣＶに導入された変異が、測定に用いた細胞内でのｍｄＶＡＣＶのｄＶＡＣＶに比較した複製能力を制限したことを示す。

本発明のこの態様による方法は、上記のｄｅｌ Ｉ〜ｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列における特定の欠失に加えて作られたどのような種類の変異が、改良されたかまたは許容される安全特性を有し、ウイルスベースのワクチン療法に用いることが可能なウイルスベクターをもたらし得るかについての決定を有利に可能にする。制御された段階的な方法でｄＶＡＣＶのゲノム内に変異を誘導するこのアプローチにより、その複製および／またはその病原性の減毒化が十分に制限され、患者への投与が安全なウイルスをもたらす変異の型の系統的な決定が可能となる。例えば第１の複製の規模が第２の複製の規模よりも大きな場合、この比較により、複製せず、それ故にその親ウイルスであるｄＶＡＣＶよりも安全であるｍｄＶＡＣＶが変異によって産生されたと結論し得る。第１の複製の規模が第２の複製の規模と同等であるかまたは小さな場合、ｍｄＶＡＣＶにおけるさらなる突然変異は安全性に対して効果を持たないか、またはこれによりｍｄＶＡＣＶはウイルスワクチンとしての使用にその親ウイルスよりもさらに不適切であると結論し得る。本発明のこの態様による方法を反復的に行うことにより、ウイルスベースのワクチン療法における使用に適したウイルスの表現型に近付くか、またはそれをもたらすｄＶＡＣＶ変異形における遺伝的変異の同定および最適化が可能になる。

上述のように、本発明のこの態様による方法は、反復的方法において有利に用いられ得る。すなわち、特定の変異または変異の集合の確立により、ｍｄＶＡＣＶは、複製が少なく、それ故にその祖先であるｄＶＡＣＶよりも安全となり、得られたｍｄＶＡＣＶは、その持続配列内にさらなる変異を導入することによってさらに改良できる。従って、変異による改変の第１ラウンドのｍｄＶＡＣＶは、それに続くラウンドそれぞれのｄＶＡＣＶとなり得る。ウイルスベースのワクチン計画における潜在的な使用のためのワクシニアウイルス変異体の望ましい安全特性における継続的な改良の利点に加え、本発明のこの態様による方法のこのような系統的応用により、望ましい減毒化をもたらすことによるウイルスベースのワクチン療法における安全な有用性のために、ＶＡＣＶゲノムのどの領域が変異に最適であるかについて、およびどのような単数または複数の変異であるべきかについての有用な系統的規則の有利な開発が可能となる。

好ましくは、本発明のこの態様による方法で用いられるヒト細胞株は、ヒト細胞株２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ヒト細胞株１４３Ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０３）、およびヒト細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）から選択される。

好ましくは、ｄＶＡＣＶはヒト細胞株内で１０以上の増幅率によって再生的に複製する。このことは十分に高い開始値を提供し、続いて導入される変異による複製能力の制限は明確に観察され得、かつこのような変異に起因し得る。

さらなる実施形態によれば、上に提示した方法は、変異が動物におけるｄＶＡＣＶの複製、病原性、および／または免疫原性に影響するか否かについて決定することをさらに含み得る。

これらのパラメータを決定するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスは適切な動物モデルとして役立ち得る。これらのマウスは、例えば鼻腔内に被検ウイルスを感染させることができる。

ｉｎ ｖｉｖｏでの複製に関して、鼻腔内に感染させたマウスの肺およびその他の臓器は、例えばＴＣＩＤ_５０法を用いて前述のように臓器ホモジネート内のウイルス力価を測定することにより、ウイルス量を分析できる（１４、２７）。

病原性に関しては、感染後の生存を決定するため、十分に高い接種を用いることによって測定できる。さらに、低および高用量の感染後の病原性は、規定されたスコアリングシステムに従った体重減少および疾病の徴候の計量によって決定できる。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶの病原性決定のための実験の詳細は、以下の実施例に示す。

動物におけるｍｄＶＡＣＶの複製に関しては、適切なマウスモデルにおいて決定できる。例えばそれぞれのマウスは成熟ＢおよびＴ細胞を産生できない。このようなマウスの一例は、トランスジェニックマウスモデルＲＡＧ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）であり、または成熟ＢおよびＴ細胞を産生できず、重篤な免疫不全で、複製ウイルスに対して高度に感受性であるという要件を満たすその他のいずれかのマウス系統が使用できる。

特に本発明のウイルスは、腹腔内注射によって投与した１０^７ＴＣＩＤ_５０、さらに好ましくは１０^８ＴＣＩＤ_５０のウイルスによるマウスの感染後、少なくとも４５日以内、さらに好ましくは少なくとも６０日以内、および最も好ましくは９０日以内の期間に、ＲＡＧマウスを死滅させ得ない。「ｉｎ ｖｉｖｏでの複製の失敗」を示すウイルスは、腹腔内注射を通して投与した１０^７または１０^８ＴＣＩＤ_５０のウイルスによるマウスの感染後、最も早い４５日目のＲＡＧマウスの臓器または組織から回収できるウイルスが存在しないことによってさらに特徴付けられる。測定は、典型的には感染後６０または９０日目に行われる。免疫抑制性マウスを用いた感染アッセイ、およびウイルスが感染マウスの臓器および組織から回収できるか否かを決定するために用いるアッセイについての詳細な情報は、米国特許第７，３８４，６４４号に提示される。特に、ｍｄＶＡＣＶの伝染性用量である１０^７ＴＣＩＤ_５０、さらに好ましくは１０^８ＴＣＩＤ_５０の伝染性用量により、腹腔内経路を通してマウスを感染させる。接種材料はＰＢＳによって希釈し、マウスあたり最大量５００μｌ、好ましくはマウスあたり２００μｌの量が適用される。マウスは、毛の逆立ち、丸まった姿勢、行動および移動性の減少、歩行異常、呼吸促迫症、および皮膚病変部のような疾病の徴候について視覚的に検査ならびに点検される。

マウスの屠殺後、肺、脾臓、肝臓、卵巣または精巣、腎臓、脳、および腸を含む臓器を無菌的な技術を用いて除去し、臓器除去手順の間に氷上に保管する。次に臓器をさらなる使用までに−２０℃にて凍結する。回収した臓器におけるウイルス力価の用量設定のため、臓器をペトリ皿内の５ｍｌ ＤＭＥＭ中で金網上に押し付けて融解し、組織が均一化するまでシリンジプランジャーを用いて金網から押し出す。組織サンプルを均一化するために許容されるその他のいずれの方法も代替的に用いられてよい。５ｍｌの組織ホモジネートを回収し、凍結融解するか、またはＢｒａｎｓｏｎ Ｃｕｐｈｏｒｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ内で４℃にて少なくとも２分間、最大出力の５０％で超音波処理して細胞を溶解し、ウイルス粒子を放出させる。超音波処理後、組織ホモジネートは−２０℃もしくは−８０℃にて再び凍結させてよいか、または上記（「複製分析からのウイルス試料の用量設定分析」の表題下）および以下の実施例（「ウイルス複製分析」の項）のＴＣＩＤ_５０法によってウイルス力価を決定するために直ちに用いてもよく、結果は先行技術の方法に従って算出される（１４、２７）。ホモジネートを再凍結するか、または凍結融解の反復によって調製する場合、サンプルは、用量設定または複製アッセイに使用する前に、４℃にて少なくとも１分間、最大出力の５０％で超音波処理されなければならない。

ＴＣＩＤ_５０法（１４、２７）による用量設定は、上述のようにサンプルあたり８の複製を用いて行う。力価は、それぞれの組織ホモジネートの量を考慮して、臓器あたりの総ウイルス力価として算出する。

別々の動物を既知量のｄＶＡＣＶおよび所定量のｍｄＶＡＣＶによって感染させた後、所定の時間後に、ｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶの相対的な量を比較できる。ｄＶＡＣＶがｍｄＶＡＣＶよりも多く観察された場合、ｄＶＡＣＶの変異がｄＶＡＣＶの増幅能力を有利に減少させたと結論できる。このようなｍｄＶＡＣＶは、おそらくウイルスベースのワクチン投与戦略のさらなる変異によるさらなる最適化の後に基礎を形成し得る。一方で、所定の時間後、動物においてｍｄＶＡＣＶがｄＶＡＣＶよりも多く見出された場合、ｄＶＡＣＶの変異はｄＶＡＣＶの増幅能力を減少させなかったと結論でき、取り込まれた変異は、ウイルスベースのワクチン投与戦略における使用に適したｍｄＶＡＣＶへのさらなる最適化へと進めるべきではないことが示される。

問題となるｍｄＶＡＣＶの生体内での病原性の評価に関しては、感染前および感染後連続的に、疾病の尺度として体重ならびに体温および疾病症状を適宜定義されたスコアに従って測定することにより評価できる。これについては、以下の実施例でさらに詳述する。

問題となるｍｄＶＡＣＶの免疫原性の評価に関しては、以下の実施例に提示する技術を用い、免疫応答を誘導するウイルス株の能力について試験できる。しかしながら一般に、ｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶの免疫原性は、それぞれのｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶに対する液性および細胞性免疫応答の分析によって評価できる。

液性免疫応答の分析のため、マウスを、選択した経路（筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内）で、所望により１、２、または３回、１０^７ＴＣＩＤ_５０のｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶによって免疫し、各免疫後２週間目に血液を採取する。感染したマウスのｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶに特異的な抗体の血清中の濃度は、ＥＬＩＳＡにより以下のように判定できる：９６ウェルＴＲＡＮＳＰ ＭＡＸＩＳプレート（Ｎｕｎｃ、ウィースバーデン、独国）を、コーティング緩衝液（２００ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の、１００μｌ（７．５μｇ／ｍｌ）の対応するウイルス抗原（すなわちｄＶＡＣＶもしくはｍｄＶＡＣＶ、または場合によってはそれらに感染した細胞の未精製抽出物）によって一晩４℃にてコーティングする。あるいは、ＭＶＡは通常その他のワクシニア株に高度に等しい抗原性を有し得るため、ウイルス抗原はＭＶＡ抗原、例えばＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞の未精製抽出物であってもよい。プレートを２００μｌのＰＢＳ−ＦＣＳ ５％（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リンツ、オーストリア）により、３０分室温にてブロックする。プレートを洗浄し、マウス試験血清の２倍連続希釈によって室温（ＲＴ）で１時間インキュベートする。必要に応じ（すなわち力価が１：２０００を超える場合）、マウス血清のプレ希釈物を調製する。検出のため、プレートをヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ検出抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）によって１時間ＲＴにてインキュベートした。３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用し、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４（Ｍｅｒｃｋ）の添加によって反応を停止した。Ｔｅｃａｎ Ｆ０３９３００ Ｓｕｎｒｉｓｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を用い、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。

ＣＤ８Ｔ細胞の応答は、ｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ８Ｔ細胞により、ＣＤ８Ｔ細胞抗原性エピトープを提示するそれぞれのｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶを感染させた細胞との接触に応答して産生されるインターフェロンγに対する、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）によって測定する。動物を、選択した経路（筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内）で、４週間の間隔で１回、２回、３回、または４回、１０^７ＴＣＩＤ_５０または１０^８ＴＣＩＤ_５０のｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶにより免疫する。加えて、ＣＤ８Ｔ細胞のメモリー応答を判定するため、マウスは最終免疫後少なくとも１２週間再び免疫できる。動物は、各免疫後６日目に尾静脈から採血し、マウスあたり１００〜１２０μｌの血液を、４％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および２．５Ｕ／ｍｌヘパリンを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に再懸濁させる。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、独国）を製造者の指示に従って用いて赤血球を溶解することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。ＰＢＭＣを１：２の比で２つの一定分量に分割し、ＰＢＭＣのより小さな一定分量を、０．０５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で、感染効率１０にて、それぞれのｄＶＡＣＶまたはｍｄＶＡＣＶにより感染させて刺激細胞を得る。細胞を３７℃にてウイルスと共に１時間インキュベートした後、０．０５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で洗浄し、最終的に０．０５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中に再懸濁する。残りの３分の２のＰＢＭＣを、０．０５ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび１μｌ／ｍｌ（最終濃度）のＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、開口分泌経路を通してサイトカイン分泌を遮断するため）を含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中の洗浄した刺激細胞に加え、さらに５時間３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートする。刺激したＰＢＭＣを遠心分離によって回収し、氷冷したＰＢＳ／１０％ＦＣＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４に再懸濁して、４℃にて一晩保管する。翌日、ＰＢＭＣを抗−ＣＤ８α−Ｐａｃ−Ｂｌｕｅおよび抗−ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体によって染色する（全ての抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、独国より市販されている）。ＰＢＭＣを適切に希釈した指示される抗体と共に３０分間４℃、暗所にてインキュベートする。洗浄後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の指示に従って用いることにより、細胞を固定および透過処理した。洗浄後、ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ結合抗ＩＦＮγ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞内インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）に対して染色した。ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって抗体を希釈し、ＰＢＭＣを２０分間、４℃、暗所にて染色した。洗浄後、染色した細胞を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲ ＩＩシステム上でフローサイトメトリーにより分析する。前方および側方散乱の特性によって生存ＰＢＭＣを同定する。サンプルあたりおおよそ２０，０００のＰＢＭＣが取得される。

本実験における本発明のウイルスは、ＰＢＭＣ中の全てのＣＤ８Ｔ細胞のうちのＩＦＮγ産生ＣＤ８Ｔ細胞の割合による評価として、ｍｄＶＡＣＶプライム／ｍｄＶＡＣＶブースト投与によって誘導される上述のエピトープに対するＣＴＬ免疫応答が、ｄＶＡＣＶ／ｄＶＡＣＶブースト投与によって誘導されるものに実質的に等しい、好ましくは少なくとも等しいことにより特徴付けられる。免疫原性の尺度として、ｄＶＡＣＶおよびｍｄＶＡＣＶに特異的なＩｇＧ抗体ならびに細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＴＬ）の量が決定できる。ｄＶＡＣＶ／ｍｄＶＡＣＶに特異的な抗体は、感染ＣＥＦ細胞ライセートまたは精製ｄＶＡＣＶ／ｍｄＶＡＣＶを抗原として、および抗ＩｇＧ特異的酵素結合抗体を二次試薬として用いる標準的なＥＬＩＳＡ技術によって決定できる。ｍＶＡＣＶ／ｍｄＶＡＣＶに特異的なＣＴＬは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または脾細胞を、全ウイルスとしてのｄＶＡＣＶ／ｍｄＶＡＣＶ、またはＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫した際にはタンパク質Ｂ８、Ａ３、Ｋ３、Ａ８、Ｂ２、およびＡ２３由来の、もしくはＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した際にはタンパク質Ａ５２、Ｆ２、Ｃ６、およびＥ３由来の免疫優性エピトープに対応する特異的なペプチドのいずれかによって再刺激することにより決定できる。

好ましい実施形態によれば、上記のアッセイにおいて投与される１０^７ＴＣＩＤ_５０ｍｄＶＡＣＶを用いる代わりに、本発明の１×１０^８ＴＣＩＤ_５０ワクシニアウイルスが、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によって、プライムおよびブースト免疫の両方のために投与される。本実験における本発明のウイルスは、ＰＢＭＣ中の全てのＣＤ８Ｔ細胞のうちのＩＦＮγ産生ＣＤ８Ｔ細胞の割合による評価として、ｍｄＶＡＣＶプライム／ｍｄＶＡＣＶブースト投与によって誘導される上述のエピトープに対するＣＴＬ免疫応答が、ｄＶＡＣＶプライム／ｄＶＡＣＶブースト投与によって誘導されるものに実質的に等しい、好ましくは少なくとも等しいことにより特徴付けられる。あるいは、ＩＦＮγ産生細胞の割合は、ＩＦＮγに対する細胞内サイトカイン染色によって、または受容体特異的なＭＨＣクラスＩテトラマー／ペンタマー／デキストラマー試薬による染色によって評価できる。

本発明のさらなる態様は、ワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ）の調製法を提供し、前記方法は：
ａ）ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）のゲノムを含むベクターを提供すること、またはワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）のゲノムを提供すること；
ｂ）上に提示するｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、および／またはｄｅｌ ＶＩに対応する少なくとも１の配列を欠失させること；
ｃ）ｄＶＡＣＶを分離することを含む。

好ましくは、ＶＡＣＶゲノムはヒト細胞株内で複製する。

好ましい実施形態によれば、ｄＶＡＣＶを調製するための前記方法は、ヒト細胞株内での前記ｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程を含む（いわゆる第１の複製）。好ましくは、上記方法によって調製されるｄＶＡＣＶゲノムは、ヒト細胞株内で複製する。前記ヒト細胞株は、ＭＲＣ−５、２９３、および１４３Ｂからなる群より好ましく選択される。

ｄＶＡＣＶを調製する前記方法の好ましい幾つかの実施形態によれば、ＶＡＣＶは漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）、好ましくは受託番号ＡＭ５０１４８２によりＧｅｎＢａｎｋに寄託されており、かつ受託番号１００６２９０１によりＥＣＡＣＣに寄託されているＣＶＡ−ＰＰである。

上記方法の産物は、上に提示するｄＶＡＣＶである。好ましくは、該産物は上記方法によって得られる欠失ＣＶＡ（ｄＣＶＡ）であり、前記ｄＣＶＡは、２９３、１４３Ｂ、およびＭＲＣ−５細胞株から選択されるヒト細胞株内で好ましく複製する。

上記方法によって得られるｄＣＶＡの好ましい幾つかの実施形態によれば、以下のウイルスのゲノムが除外される：ｖＰ６６８、ｖＰ６８１、ｖＰ７４９、ｖＰ７７４、ｖＰ７９６、ｖＰ８１１、ＭＶＡ−Ｉ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３６）（１）、およびＶＡＣＶ株Ｔｉａｎ Ｔａｎ変異体ＭＶＴＴ_{２−ＧＦＰ}（３９、４０）。ｖＰ７５９（２５）もまた除外される。ｖＰ６６８、ｖＰ６８１、ｖＰ７４９、ｖＰ７５９、ｖＰ７７４、ｖＰ７９６、およびｖＰ８１１は、Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（２５）に開示される。ＭＶＡ−Ｉ７２１は、米国特許第５，１８５，１４６号（１）に開示される。

上に提示するｍｄＶＡＣＶを調製するため、本発明のこの態様のさらなる実施形態は、上に提示するように、少なくとも１の変異をｄＶＡＣＶゲノム内に導入するさらなる工程、および得られたｍｄＶＡＣＶを分離する工程を含む方法を提供する。

特に、本発明は：
（ａ）ｄＶＡＣＶ、好ましくは本明細書に記載されるｄＣＶＡを提供すること；
（ｂ）前記ｄＶＡＣＶ、好ましくはｄＣＶＡのゲノム内に少なくとも１の変異を導入すること；および
（ｃ）ｍｄＶＡＣＶ、好ましくはｍｄＣＶＡを分離することを含む、複製制限変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を調製するための方法を提供する。

好ましい実施形態によれば、複製制限変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を調製するための前記方法は、
前記ｄＶＡＣＶ、好ましくは前記ｄＣＶＡのヒト細胞株内での増幅率を測定する工程；および／または
前記ｍｄＶＡＣＶ、好ましくは前記ｍｄＣＶＡの前記ヒト細胞株内での増幅率を測定する工程をさらに含む。

別の好ましい実施形態によれば、複製制限変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を調製するための前記方法は、
少なくとも１の変異が前記ヒト細胞株内での前記ｍｄＶＡＣＶの複製に影響するか否かを決定するため、前記ｄＣＶＡの増幅率を前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率と比較する工程をさらに含む。

好ましい実施形態によれば、前記ｍｄＶＡＣＶ、好ましくは前記ｍｄＣＶＡは複製制限されており、好ましくはヒト細胞株内で、前記ヒト細胞株内でのｄＶＡＣＶの複製に比較して複製能力がない。

好ましくは、前記ヒト細胞株は、ＭＲＣ−５、２９３、および１４３Ｂからなる群より選択される。

ｍｄＶＡＣＶを調製するための方法の産物は、好ましくは前記方法によって得られる漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ欠失変異体（ｍｄＣＶＡ）である。好ましくは、前記ｍｄＣＶＡは、２９３、１４３Ｂ、およびＭＲＣ−５から選択されるヒト細胞株内での複製が制限される。

ｍｄＣＶＡの好ましい実施形態によれば、以下のウイルスは否定される：ＭＶＡ−５７２（ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７）、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）、ＭＶＡ ＩＩ／８５、ＭＶＡ（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８）、およびＮＹＶＡＣ。その配列が受託番号ＡＹ６０３３５５によりＧｅｎＢａｎｋに寄託されているＡｃａｍｂｉｓ３０００改変ウイルスアンカラ、およびＭＶＡ−Ｉ７２１もまた除外される（１）。

ＢＡＣコンストラクトならびにＢＡＣ由来のＭＶＡおよびＣＶＡウイルスを示した図である。Ａ）ＣＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）のＩＧＲ Ｉ３Ｌ−Ｉ４Ｌへの相同組み換えに用いるコンストラクトは、プラスミドｐＢＮ１９４からＳａｃＩ消化により切り出した。コンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢＡＣの複製に必要とされる遺伝子および選択マーカーを含み、相同組み換えによってＣＶＡ−ＢＡＣ１およびＭＶＡ−ＢＮ−ＢＡＣ４を産生するために用いた。ＭＶＡ−ＢＮ−ＢＡＣ２４は、ＢＡＣの骨格に隣接する２つのｌｏｘＰ部位を含むＭＶＡ−ＢＮ−ＢＡＣ４の部位特異的変異誘発によって作製した。ＢＡＣの再構成により、ＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂそれぞれを得た。Ｆ１ ＩＧＲ Ｉ３Ｌ−Ｉ４ＬおよびＦ２ ＩＧＲ Ｉ３Ｌ−Ｉ４Ｌ＝左および右は、ＣＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ゲノムへの相同組み換えに対して隣接する。ＮＰＴ ＩＩ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰは、ｐＳプロモーターにより駆動されるマーカーカセットに結合する。ｐＳプロモーターにより駆動され、２つのＦＲＴ部位に隣接するＲＦＰは、Ｆｌｐリコンビナーゼ活性をモニターするための一過性のマーカーとして用いた。ＣｍＲ＝Ｅ．ｃｏｌｉ．を選択するためのクロラムフェニコールアセチル基転移酵素耐性マーカー。Ｂ）全ての主なＭＶＡ様欠失を含む突然変異体ＣＶＡを産生するために用いる、変異誘発過程の模式図。６個の主なＭＶＡ欠失に対応する遺伝的セグメントの相対的位置を、ｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩなどと名付けられたボックスによって示す。これらの配列をＣＶＡから欠失させるためのこれらの領域の連続的除去、および変異体の命名を上または下に表示する。これらの部位においてＭＶＡ配列を正確に模倣するために導入されたＯＲＦを、それぞれの欠失部位に示す。欠失Ｉを導入するために用いた選択カセットは、単一のｌｏｘＰ部位（「ｌｏｘＰ」）を残し、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えによって除かれた。ＶＡＲＶ＝痘瘡ウイルス、ＣＰＸＶ＝牛痘ウイルス、（ｆ）＝断片化ＯＲＦ。 同上。 ＢＡＣ由来のウイルスＭＶＡ_ＢおよびＣＶＡ_Ｂの複製性質および病原性は、対応する親野生型ウイルスのものと区別できないことを示した図である。ＭＶＡ_Ｂ（Ａ）およびＣＶＡ_Ｂ（Ｂ）の複製行動を様々な細胞株および原発性ＣＥＦ細胞において分析し、対応する野生型ウイルスＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）およびＣＶＡ−ＰＰのものと比較した。細胞を、表示するウイルスの０．０５ＴＣＩＤ_５０／細胞によって３通りに感染させた。表示する時間の総ウイルス出力をプロットし、各データ点は３つの独立ウェルからの結果を表す。０日目の５×１０^４ＴＣＩＤ_５０の値は接種物力価を表す。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの、感染後の生存（Ｃ、Ｄ）、体重減少（Ｅ）、および疾病の症状（Ｆ）を決定した。動物は、親ウイルスＣＶＡ−ＰＰ（四角）およびＣＶＡＢ（三角）の１０（Ｃ、Ｄ、Ｆ；白符号）および５〜７×１０^７ＴＣＩＤ_５０（Ｄ、Ｅ、Ｆ；黒記号）によって鼻腔内感染させた。実験には表示する数（ｎ）のマウスを用い、２〜３回の独立した実験を行った。１つの代表的な実験からの動物を表示する日に個別に秤量し、検査した（Ｅ、Ｆ）。この特定の実験において、１０^７ＴＣＩＤ_５０のＣＶＡ−ＰＰによって感染させた動物は全て死亡したが、ＣＶＡＢを感染させた５動物のうちの２は生存した。体重データは、各群の体重を、０日目における開始時の平均群体重に比較したパーセンテージとして表す。疾病スコアは、０〜４の範囲である上記のスコアリングシステムに従い、表示する日に個別に決定した。疾病スコアは、代表的な実験の５マウスの群の平均＋ＳＥＭとして表す。^＊接種後１１日目に１０^７ＴＣＩＤ_５０のＣＶＡＢを投与された群の体重および疾病スコアは、生存した２動物の値に基づく。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ｄｅｌ ＩＩを含む変異体のＭＶＡ様細胞壊死性効果、ならびに変異ｍＣＶＡｂｃ４５およびｍＣＶＡｂｃ５０のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製の分析を示した図である。Ａ）初代ＣＥＦ細胞を、０．０５ＴＣＩＤ_５０／細胞の表示するウイルスによって感染させた。ＣＰＥの視覚的特徴付けのため、蛍光顕微鏡によって感染細胞の単層を毎日検査した：感染細胞は組み換えウイルスによるｅＧＦＰ発現のために緑色蛍光を呈し、接種後３日目に１００×倍率にて撮影した。ｍＣＶＡｂｃ４８およびｍＣＶＡｂｃ５０の細胞壊死性効果は、変異体ｍＣＶＡｂｃ３９およびｍＣＶＡｂｃ４５のものと区別できないため、ここには提示しない。Ｂ）ＣＥＦ細胞および哺乳動物細胞株内での野生型ＣＶＡ、ｍＣＶＡｂｃ４５、およびｍＣＶＡｂｃ５０の多段階複製を分析するため、おおよそ１０^６の原発性ＣＥＦ細胞または表示する細胞株の単層を、０．０５ＴＣＩＤ_５０／細胞の表示するウイルスによって３通りに感染させた。表示する時間の総ウイルス出力をプロットし、各データ点は３つの独立ウェルからの結果を表す。０日目の値は接種物力価を表す（５×１０^４ＴＣＩＤ_５０）。 同上。 ６個までのＭＶＡ様欠失を含むＣＶＡ変異体の、マウスにおける病原性を示した図である。６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの５群を、５０μｌ ＰＢＳ中の３×１０^５ＴＣＩＤ_５０（Ａ〜Ｄ）または５×１０^７ＴＣＩＤ_５０（Ｅ〜Ｈ）の表示するウイルスによって鼻腔内感染させ、動物を毎日個別に秤量および検査した。体重データは、０日目の初期平均重量から、各群の平均体重のパーセンテージとして表す。平均疾病スコア＋／−ＳＥＭは、０〜４のスコアの範囲である上記のスコアリングシステムに従い、表示する日に決定した。同じＭＶＡ感染コントロール群を、それぞれＡおよびＢ、ならびにＥおよびＦに示す。 突然変異体ｍＣＶＡｂｃ３９（Ｅ）またはｍＣＶＡｂｃ５０（Ｆ）を投与された各群からの１動物は、それぞれ７および１０日目に疾病によって死亡した。Ａ〜Ｄは、３つの独立した実験から組み合わせたデータを示す。Ｅ〜Ｈは、少なくとも２の独立した実験の１つを示す。Ｉ）感染マウスの肺のウイルス力価を分析するため、６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、５０μｌ ＰＢＳ中の、３ｘ１０^５ＴＣＩＤ_５０の表示するウイルスによって鼻腔内感染させた。接種後６日目に動物を屠殺し、肺を回収して２ｍｌの細胞用培地中で均一化した。ＣＶ−１細胞（ＣＶＡウイルス）またはＣＥＦ細胞（ＭＶＡ_Ｂ）において、ＴＣＩＤ_５０法によってウイルス力価を決定し、２つの独立した実験からの全８マウスの臓器あたりの平均ウイルス力価を示す。^＊＊＊＝ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定により決定。ｎ．ｓ．、統計学的に有意ではない。ｎ．ｄ．、検出せず。アッセイの検出限界は３．１６×１０^１ＴＣＩＤ_５０／ｍｌである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 欠失Ｖのみを含む変異体は中程度に減毒化されることを示した図である。６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの５群を、５０μｌ ＰＢＳ中の３×１０^５ＴＣＩＤ_５０（Ａ〜Ｃ）または１×１０^７ＴＣＩＤ_５０（Ｄ）の表示するウイルスによって鼻腔内感染させ、動物を毎日個別に秤量（Ａ）および検査（Ｂ）した。ＣＶＡ_ＢおよびｍＣＶＡｂｃ６１を感染させた別々の群の５マウスそれぞれを接種後６日目に屠殺し、肺を回収して２ｍｌの細胞用培地中で均一化して、伝染性ウイルス力価（Ｃ、Ｄ）を決定した。体重データは、０日目の初期平均重量から、各群の平均体重のパーセンテージとして表す。平均疾病スコア＋／−ＳＥＭは、０〜４のスコアの範囲である上記のスコアリングシステムに従い、表示する日に決定した。２つの独立した実験のうちの１実験からのデータを示す。ＭＶＡ感染コントロール群は、図４Ａ〜Ｄに示すものと同じである。^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定により決定。 同上。 同上。 ＭＶＡ様欠失を含むＣＶＡ変異体の病原性を示した図である。病原性スコアは、最大体重減少；最大疾病スコア；回復動態のパラメータと任意に組み合わせた。パラメータは上記の順序に従って加重した。

表１：６個の主なＭＶＡ様欠失に含まれる完全長遺伝子。
^＊完全長遺伝子は、牛痘ウイルスの相同分子種のような、同様のアミノ酸数を有するタンパク質をコードする遺伝子として定義される。６個の主な欠失内の３１ＯＲＦのうち、１９ＯＲＦは完全長牛痘遺伝子の断片または切断型を表すことから、表には示さない。

表２：様々な細胞株における様々なＣＶＡ突然変異体ウイルスのウイルス伝播。^ａ：０．０５ＴＣＩＤ_５０／細胞による感染後４８時間目に、蛍光により可視化したウイルス伝播。ウイルス伝播は以下の任意のスケールに従ってスコア化した：それぞれ、−、蛍光細胞なし；＋、１〜４の蛍光細胞の増殖巣；＋＋、５〜２５の蛍光細胞の増殖巣；＋＋＋、＞２５の蛍光細胞の増殖巣またはコンフルエント感染。

改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の６個の主なゲノム欠失の、親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）への導入は、細胞培養およびマウスにおけるＭＶＡ様表現型の再生に十分ではない。

概要
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、細胞培養において高度に制限された宿主域を有し、ｉｎ ｖｉｖｏでは非病原性である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における５７０回を超える継代によって、親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）から派生した。ＣＥＦ細胞の継代の間、２４６６８ヌクレオチドを含む６個の主な欠失がＣＶＡゲノムに発生した。本願発明者は、ＭＶＡおよび親ＣＶＡゲノムの両方を細菌人工染色体（ＢＡＣ）内にクローン化し、次にクローン化したＣＶＡゲノム内に６個の主なＭＶＡ欠失を連続的に導入した。２〜６個の主なＭＶＡ欠失を含む、再構成した突然変異体ＣＶウイルスは、ウサギ細胞株のＲＫ１３およびＳＩＲＣを除き、試験した１２の哺乳動物細胞株において複製制限を検出しなかった。マウスにおいて、３個までの欠失を有するＣＶＡ変異体はわずかに増大した病原性を示したことから、ＶＡＣＶにおける遺伝子欠失はｉｎ ｖｉｖｏでの適応の取得をもたらし得ることが示唆される。５個または６個全ての欠失を含むＣＶＡ変異体の減毒化は中程度で、なお病原性を有する。欠失Ｖは、主にこれらの変異体の減毒化表現型に関与する。結論として、６個の主な欠失における３１の翻訳領域全ての喪失または切断の組み合わせは、強い減毒および高度に制限された宿主域を有する特定のＭＶＡ表現型の再生には十分でない。

材料および方法
細胞株およびウイルス
細胞株は全てＡＴＣＣまたはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから得たが、ＨａＣａＴ細胞（６）のみＧｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＤＫＦＺ）、ハイデルベルクから得た。細胞株は全て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。１１日齢の発育鶏卵から初代ＣＥＦ細胞を調製し、ＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）または１０％ＦＣＳを加えたダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。ＣＶＡはＡｎｔｏｎ Ｍａｙｒ（獣医学部、ルートヴイヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン、ミュンヘン、独国）から得て、ＢＨＫ−２１細胞内でプラーク精製を３回行った後に、ＣＥＦ細胞内で２ラウンド増幅してＣＶＡ−ＰＰを得た（１９）。ウイルス株ＣＶＡ−ＰＰはＥＣＡＣＣに寄託されており、受託番号は１００６２９０１である。ＣＶＡ−ＰＰのコード領域のヌクレオチド配列は決定されてＧｅｎＢａｎｋに寄託されており、受託番号はＡＭ５０１４８２である。ＣＶＡ−ＰＰ由来の変異体は全てＣＶ−１細胞内で繁殖させ、力価を決定した。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）はＢａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発され、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている（ＥＣＡＣＣ；Ｖ０００８３００８）。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）はＣＥＦ細胞内で繁殖させ、力価を決定した。ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）はＡＴＣＣ（ＶＲ−３６４）から得て、ＳＩＲＣ細胞内で繁殖させ、力価を決定した。配列決定および動物実験に用いたウイルスは全て、スクロースクッションにより２回精製した。

プラスミド
ｍｉｎｉＦ ＢＡＣプラスミドｐＭＢＯ１３１（２２）は、Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒから供与された。組み換えプラスミドｐＢＮ１９４（図１Ａ）は標準法によってクローン化し、これはｐＭＢＯ１３１の全配列、および強力な合成初期／後期ｐＳプロモーターによって駆動されるＮＰＴＩＩ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰレポーター／選択カセットを含んだ（８）。これはさらに、ｐＳプロモーターにより駆動され、ＦＲＴ部位に隣接するＲＦＰレポーター遺伝子も含んだ。これらの配列は、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）およびＣＶＡのＩ３Ｌ（ＯＲＦ ＭＶＡ ０６４Ｌ、ｓｓＤＮＡ結合リン酸化タンパク質）とＩ４Ｌ（ＯＲＦ ＭＶＡ ０６５Ｌ、リボヌクレオチド還元酵素大サブユニット）の間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）内挿入部位の、左側および右側に由来する相同組み換え配列の２つの伸展に隣接する。Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドｐＯＧ４４はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。組み換え機能であるｒｅｄα（ｅｘｏ）、ｒｅｄβ（ｂｅｔ）、およびエキソヌクレアーゼ阻害物質であるｒｅｄγ（ｇａｍ）をコードするプラスミドｐＫＤ４６（１０）は、ルートヴイヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン、ミュンヘン、独国のＵ．Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉから供与された。Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ。

ｐｒｅＣＶＡ−ＢＡＣおよびｐｒｅＭＶＡ−ＢＡＣの構築
ＢＡＣベクターｐＭＢＯ１３１の全配列に加え、ＣＶＡおよびＭＶＡのＩＧＲ ３Ｌ−Ｉ４Ｌに選択マーカーを含む組み換えＣＶＡ−ＰＰおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を表すウイルスであるｐｒｅＣＶＡ−ＢＡＣおよびｐｒｅＭＶＡ−ＢＡＣを産生するために、プラスミドｐＢＮ１９４を用いた。ここでの実験は以下に述べるようにＢＡＣベクターを用いて行ったが、その他の組み換えベクターも適していることに留意されたい。当業者は、ＢＡＣベクターに関する本明細書の教示が、本明細書で構築され用いられる特定のＢＡＣベクターに加えて、その他の組み換えベクターにも日常的に応用され得ることを知る。あるいは一過性のドミナント選択を用いることにより、ＢＡＣ内のクローン化されたＶＡＣＶゲノムを用いることなくＶＡＣＶ内に変異を導入できる（１３）。

ＣＶＡおよびＭＶＡのゲノムそれぞれを含むＢＡＣを構築するため、ＢＮ１９４プラスミドをＳａｃ Ｉにより直線化して、ほとんどコンフルエントであるＣＶＡを感染させたＣＥＦ細胞の単層およびＭＶＡを感染させたＣＥＦ細胞の単層に、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、独国）を用いてトランスフェクトした。感染後４８時間目に細胞および培地を回収し、凍結−融解後にカップ超音波処理装置内で均一化した。Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国）を３００μｇ／ｍｌの濃度で用い、６ウェルプレート内のＣＥＦ細胞に対して組み換えウイルスの選択を行った。１０倍連続希釈を用いて９６ウェルプレート内のＣＥＦ細胞に対して単一ウイルスクローンのプラーク精製を行い、ｅＧＦＰ発現によって可視化された単一のウイルスプラークを含むウェルをスクリーニングした。正確な変異誘発を確認するため、幾つかのクローンに由来するウイルスＤＮＡをＰＣＲおよび配列決定によって分析した。

ＣＶＡ−ＢＡＣおよびＭＶＡ−ＢＡＣの産生
ＢＡＣとしてのＭＶＡおよびＣＶＡゲノムのクローニングは、基本的にはこれまでの記載をわずかに改変して行った（１１）。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、６ウェルプレート内のＣＥＦ細胞に２μｇのＦｌｐ発現プラスミドｐＯＧ４４をトランスフェクトした。３７℃で６０分経過後、細胞にｐｒｅＣＶＡ−ＢＡＣまたはｐｒｅＭＶＡ−ＢＡＣを感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）５によって感染させ、イサチン−β−チオセミカルバゾン（ＩβＴ）を最終濃度４５μＭで添加した。感染後２４時間目に細胞を回収し、記載されるようにＤＮＡをフェノール抽出して沈殿させ（１１）、２０μｌのｄｄＨ_２Ｏに溶解した。８μｌのウイルスＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのエレクトロポレーションに用いた。ＢＡＣプラスミドとしてのウイルスＤＮＡを含むＥ． ｃｏｌｉの選択は、２５μｇ／ｍｌ濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で行った。ＬＢ培養液から、複数のクローンに由来するＤＮＡをアルカリ溶解によって分離し、適切な制限酵素（ＮＥＢ、フランクフルト、独国、およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いた消化によってスクリーニングした。Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＢＡＣ １００キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌデューレン、独国）を用いて、完全なウイルスＤＮＡを含む候補クローンのＢＡＣ−ＤＮＡを調製し、幾つかの制限酵素による消化と一晩の電気泳動によって大規模にスクリーニングした。ＣＶＡ−ＢＡＣおよびＭＶＡ−ＢＡＣそれぞれにつき１クローンのＢＡＣ−ＤＮＡを配列決定して、配列の完全性を確認した。

伝染性ウイルスの再活性化
Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを用いて６ウェルプレート内のＢＨＫ−２１細胞に３μｇのＢＡＣ ＤＮＡをトランスフェクトし、ヘルパー機能を提供するため、６０分後にＳＦＶを感染させた。ｅＧＦＰの発現および細胞壊死効果（ＣＰＥ）の発生について細胞をモニターし、３日後に回収した。凍結融解およびカップ超音波処理装置内での均一化後、段階的な量のライセートを用いてＣＥＦ細胞の単層を感染させたウイルス増殖の出現について細胞をモニターした。ヘルパーＳＦＶを除去するためにＣＥＦ細胞を３回継代した後、最後に継代した感染細胞から全ＤＮＡを抽出し、ＳＦＶの不在についてＰＣＲによりスクリーニングした。救出したＢＡＣ由来のウイルスをそれぞれＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂと命名し、ＣＶ−１（ＣＶＡ_Ｂ）およびＣＥＦ細胞（ＭＶＡ_Ｂ）内で繁殖させた。

ＢＡＣの組み換え
相同組み換えのためのλ Ｒｅｄシステムを用いたＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ内での対立遺伝子交換により、ＣＶＡ−ＢＡＣを改変した。（ａ）ｐＫＤ４６のＥ．ｃｏｌｉ．への導入。ＣＶＡ−ＢＡＣを含むエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞にｐＫＤ４６プラスミドをエレクトロポレーションして、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートにまき、３０℃にて一晩インキュベートした。（ｂ）λ Ｒｅｄシステムの誘導。関心のあるＢＡＣならびにＲｅｄリコンビナーゼを構成する３つのタンパク質γ、β、およびｅｘｏをコードするｐＫＤ４６を含むＤＨ１０Ｂ細胞（１０）を、３０℃にて０．３のＯＤ_６００まで繁殖させた。エレクトロポレーションに先立ち、Ｌ−アラビノース（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、独国）を最終濃度０．４％で添加後、３７℃６０分間インキュベートすることによってλ Ｒｅｄ遺伝子を誘導した。（ｃ）選択／対抗選択カセットの導入。正の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子および対抗選択のためのｒｐｓＬ遺伝子（２６、３５、３８）を含むカセットの導入によって欠失を得た。簡単に述べると、ＰＣＲによって選択−対抗選択カセットの５’および３’末端にホモロジーアームを付加するため、ＣＶＡに相同な領域（５０ｂｐ）およびｒｐｓＬ−ｎｅｏカセットの末端に相補的な配列（２４ｂｐ）を含む７４ｂｐ長のオリゴヌクレオチド（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、マーティンスリート、独国）を用いた。次にＰＣＲ産物を、ＣＶＡ−ＢＡＣおよびｐＫＤ４６を有する、Ｌ−アラビノースにより誘導されたＥ．ｃｏｌｉへエレクトロポレーションした。２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートにおいて、３０℃にて一晩選択を行った。（ｄ）選択不可能なＤＮＡによるｒｐｓＬ−ｎｅｏの置換。上記のように、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ−ＢＡＣおよびｐＫＤ４６を含むＤＨ１０Ｂへの選択不可能なＤＮＡのエレクトロポレーションによってカセットを置換し、相同組み換えを誘導した。選択不可能なＤＮＡは、選択不可能なＤＮＡの両端に５０ｂｐのホモロジーアームを付加する、長いオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって産生した。ＤＮＡのいずれのさらなる挿入もなしにｒｐｓＬ−ｎｅｏカセットを跡形なく除去するため、ｒｐｓＬ−ｎｅｏカセット両端の挿入部位にある３０ｂｐのホモロジーアームからなる単鎖オリゴヌクレオチドを用いた。対抗選択にストレプトマイシン（７５μｇ／ｍｌ）を用いて、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ−陰性のＢＡＣクローンを得た。導入した改変を含む領域の、幾つかの制限酵素による消化および配列決定によって改変ＢＡＣを分析した。選択カセットの除去を、ネステッドＰＣＲによってさらに確認した。挿入配列（ＩＳ）エレメントの不在を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＩＳエレメント１、２、３、４、５、１０、３０、１５０、および１８６に対するＰＣＲによって確認した。

配列決定
ＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ内でＢＡＣ ＤＮＡを増幅させ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＢＡＣ １００キットを用いて分離した。ｍＣＶＡｂｃ３９およびｍＣＶＡｂｃ５０の配列決定のため、市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｂｌｏｏｄ Ｑｕｉｃｋ Ｐｕｒｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌデューレン、独国）を用いて２×１０^７〜１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０の精製ウイルスストック懸濁液からＭＶＡおよびＣＶＡのゲノムＤＮＡを分離した。精製ウイルスゲノムＤＮＡまたはＢＡＣ ＤＮＡを鋳型として用い、左の末端逆位配列（ＩＴＲ）の反復配列と翻訳領域（ＯＲＦ）ＭＶＡ００１ＬおよびＣＶＡ００１それぞれとの間に始まる完全なコード配列を網羅し、それぞれが〜５００ｂｐ重複しながらＯＲＦ ＭＶＡ１９３ＲおよびＣＶＡ２２９それぞれを通して伸長する〜５ｋＢのＤＮＡ断片を増幅した。簡単に述べると、ＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒ（商標）ＰＣＲシステム（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、独国）を用いてＰＣＲ断片を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、独国）を用いて精製した。ＰＣＲ断片および精製ＢＡＣ−ＤＮＡは、ＰＣＲ断片あたり１０〜１４のカスタム設計プライマーを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ５．０を使用して、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ （ファターシュテッテン、独国）によって配列決定された。コンティグを集め、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）９．１を用いて分析した。

ウイルス複製分析
ウイルス複製および拡散の分析のため、６ウェル培養プレート内のコンフルエントな単層を、ＦＣＳを含まない５００μｌのＤＭＥＭ中で、５×１０^４のＴＣＩＤ_５０を用いて細胞あたり０．０５のＴＣＩＤ_５０により感染させた。３７℃で６０分経過後、細胞をＤＭＥＭで１回洗浄し、２％ＦＣＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭによりさらにインキュベートした。表示する時点で細胞および上清を回収し、凍結溶解、超音波処理を行い、記載されるＴＣＩＤ５０法に従ってＣＥＦ細胞において用量設定した（２８）。簡単に述べると、ウイルス懸濁液の連続希釈を９６ウェルプレートで増殖したＣＥＦ細胞の単層上に８通りにまいた。接種後５日目に細胞をメタノール：アセトン５０／５０（ｖ／ｖ）によって固定し、感染細胞の増殖巣を免疫染色によって可視化した。固定および透過処理した単層を、ＰＢＳ／３％ＦＣＳで１：１０００に希釈したウサギポリクローナルワクシニアウイルス抗体（Ｑｕａｒｔｅｔｔ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ、ベルリン、独国）と共に３０分間インキュベートし、次にＰＢＳ／３％ＦＣＳで１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、独国）と共に３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＴＭＢ：ＰＢＳ基質溶液（Ｓｅｒａｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｈｅｉｄｅｓｅｅ、独国）と共に１５分間インキュベートした。感染ウェルを細胞の紫色の染色によって同定し、ＳｐｅａｒｍａｎとＫａｒｂｅｒによるＴＣＩＤ_５０法（１４、２７）を用いて感染力価を算出した。

マウス感染実験
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをハーラン・ヴィンケルマン社（Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ）（ドイツ）から購入した。マウスをケタミン／キシラジン注射により麻酔した後、１匹当たり５０μｌの最終体積にＰＢＳで希釈した３×１０^５または５×１０^７ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ、ＣＶＡおよびＣＶＡ変異体で鼻腔内感染させた。動物を毎日体重測定および視診し、疾病の兆候を０〜４の任意スケールでスコア化した。スコア０＝健康；スコア１＝若干病気、中程度の背中の歪曲および被毛の乱れ、通常の移動および活動レベル；スコア２＝病気、明白な背中の歪曲および被毛の乱れ、移動および活動レベルの減少、中等度の呼吸窮迫；スコア３＝重病、強い姿勢の歪曲および被毛の乱れ、移動および活動の強い減少、協調問題を伴うハリネズミのような歩調、深刻な呼吸窮迫；スコア４＝瀕死。全ての動物実験はオーバーバイエルン行政府（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ）により承認され、バイエルン・ノルディック社（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ ＧｍｂＨ）の動物実験のための指針に従って行った。

結果
ＢＡＣとしてのＣＶＡおよびＭＶＡのクローニング並びに伝染性ウイルスの再活性化。
ＶＡＣ−ＢＡＣ（１１）のためにＤｏｍｉおよびＭｏｓｓにより開発された手順と同様に、ＣＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）のゲノムを含むＢＡＣを作成した。大腸菌内での維持のためのｍｉｎｉＦプラスミド配列、ポックスウイルスの合成プロモーター（ｐＳ）により駆動されるＮＰＴ ＩＩ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰマーカーカセット、およびｐＳにより駆動され、ＦＲＴ組換え部位に隣接する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むＢＡＣカセットを設計した（図１Ａ）。このＢＡＣカセットを、相同組換えによりＣＶＡおよびＭＶＡのＯＲＦ Ｉ３ＬおよびＩ４Ｌ間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入し、ウイルスｐｒｅＣＶＡ−ＢＡＣおよびｐｒｅＭＶＡ−ＢＡＣを作成した（図１Ａ）。ＮＰＴ ＩＩ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセットにより、ＢＡＣカセットを含む組換えＣＶＡおよびＭＶＡウイルスのセレクションが可能となる。ＣＥＦ細胞にＦｌｐ発現プラスミドを形質移入し、組換えウイルスに感染させ、同時にイサチン−β−チオセミカルバゾン（ＩβＴ）で処理することにより、前述（１１）のように、ウイルスヘアピン分解を阻害し、且つゲノムの鎖状体化を促進させた。Ｆｌｐリコンビナーゼが感染細胞で発現し、単位長さのゲノムの環状化が増強された（１１）。ＦＲＴ部位に隣接するＲＦＰ遺伝子は、Ｆｌｐリコンビナーゼ活性をモニタリングするためのマーカーとして働く。形質移入および感染細胞からＤＮＡを抽出し、大腸菌の形質転換に使用した。正しい制限酵素パターンが得られたいくつかのクローンを増幅し、種々の制限酵素でＤＮＡマッピングすることによりさらに特徴付けした。興味深いことに、ｐｒｅＣＶＡ−ＢＡＣウイルスにおいて、1個のＦＲＴ部位が残存しているにもかかわらず、Ｆｌｐのいかなる発現誘導よりも前に、ＲＦＰ遺伝子が欠失していることが分かった。恐らく、ワクシニアウイルスの組換え潜在能が、ＦＲＴ部位を介した相同組換えによるＲＦＰ遺伝子の欠失を可能としたのだろう。一方で、いくつかのＢＡＣクローンはなおＦＲＴ部位に隣接したＲＦＰ遺伝子を含んでおり、このことは、Ｆｌｐリコンビナーゼ活性とは無関係に単位長のゲノムの環状化が発生することを示しており、以前の観察（１１）を確証させる。初期ＭＶＡ−ＢＮ−ＢＡＣ４のＢＡＣバックボーンを、ｌｏｘＰ部位に隣接させることによりさらに改変し（図１Ａ）、Ｃｒｅリコンビナーゼの過剰発現によるＢＡＣ配列の切除を可能とした。ＣＶＡおよびＭＶＡの両方について、正しい制限パターンを有する１つのＢＡＣクローンを選択し、コード領域の配列をＢＡＣ ＤＮＡの直接シーケンスにより決定した。ＣＶＡおよびＭＶＡ ＢＡＣクローンの両方のコード領域配列は、公開されたＣＶＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２）およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の配列に正確に一致した。

各ＢＡＣクローンから得られた伝染性ＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂの再活性化（「レスキュー」）はＳＦＶをヘルパーウイルスとして使用することにより達成され（３７）、伝染性娘ウイルスにパッケージングされた形質移入ＢＡＣから真正ウイルスゲノムを産み出すのに必要なポックスウイルスの転写系が得られた。ＢＨＫ−２１細胞のＢＡＣ形質移入およびＳＦＶ感染後、伝染性ＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂがレスキューできた。ヘルパーウイルスを除去するため、ＳＦＶに非許容的なＣＥＦ細胞で3回継代した。高感度ＰＣＲアッセイにより、３回のＣＥＦ細胞継代後、レスキューされたウイルスのストックにはＳＦＶ ＤＮＡが存在せず、従って伝染性ＳＦＶも存在しないことが確認された（データ未記載）。

ＢＡＣ由来ＭＶＡ_ＢおよびＣＶＡ_Ｂの解析
許容および非許容細胞系の両方で、ＢＡＣ由来ＭＶＡ_Ｂの複製特性を、親ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の複製特性と比較した。許容原発性ＣＥＦおよび許容ハムスター細胞株ＢＨＫ−２１におけるＭＶＡ_Ｂの複製能はＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の複製能と同等であった（図２Ａ）。同様に、ＭＶＡ_ＢはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）のように、非許容的なヒト細胞株２９３、ＭＲＣ−５およびＨｅＬａにおいて複製できなかった。

ＢＡＣ由来ＣＶＡ_Ｂの複製特性もまた、様々な細胞株においてその親ウイルスＣＶＡ−ＰＰと比較された。原発性ＣＥＦ細胞から、並びにヒトの細胞株（２９３、ＨｅＬａ、ＭＲＣ−５）およびハムスター由来（ＢＨＫ−２１）の細胞株からのＣＶＡ_Ｂのウイルス収量は、親ＣＶＡ−ＰＰで得られたウイルス収量と同等であった（図２Ｂ）。まとめると、許容および非許容細胞培養におけるＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂの複製特性は、それぞれの親ウイルスＣＶＡ−ＰＰおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の複製特性と区別不能であった。

ＢＡＣ由来ＣＶＡ_Ｂの病原性が、親ＣＶＡ−ＰＰの病原性と比較して、６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、鼻腔内感染後の体重減少および生存の評価により、さらに特徴付けされた。ＣＶＡは、鼻腔内感染時に、マウス適合型ＶＡＣＶ−ＷＲよりもマウスに対して病原性が弱いため、マウス当たり１０^７および５〜７×１０^７ＴＣＩＤ_５０の接種量が使用された。死亡率は、両方のウイルスについて、１０^７の投与量で８０〜９０％であり、５〜７×１０^７の投与量で１００％まで増加した（図２Ｃ、Ｄ）。両方の投与量で、体重減少および病徴はＣＶＡ−ＰＰおよびＣＶＡ_Ｂの両方で非常に類似していた（図２Ｅ，Ｆ）。重度の体重減少および疾患が、両方の野生型ウイルスで、感染３日後に始まり（図２Ｅ、Ｆ）、最後の動物が死亡したのは感染９日後であり、ＣＶＡ_ＢおよびＣＶＡ−ＰＰについて、死亡までの平均時間はそれぞれ８．４日および８．６日であった。結論として、ＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂは、親プラーク精製ＣＶＡ−ＰＰおよびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスと比較して、複製および病原性において検出可能な違いが見られなかった

ＢＡＣ組換え操作によるＣＶＡ遺伝子の欠失およびゲノム安定性
特異的ＭＶＡ表現型の遺伝学的基礎を明らかにするために、６個全ての主なＭＶＡ欠失（上記で定義されたｄｅｌ Ｉ〜ＶＩ）に対応する配列を、ＢＡＣ変異誘発によりＣＶＡ_Ｂから順次除去した。欠失部位でのＭＶＡ配列を正確に模倣するために、対応する切断または融合されたＭＶＡ ＯＲＦを、ＣＶＡに新しくつくられた欠失部位に導入した。ＣＶＡの末端領域では、ＯＲＦの大部分は断片化および切断され、恐らくは非機能的なＯＲＦであるため、ｄｅｌ Ｉ〜ＶＩ導入により最終的に得られた結果は、１２個の完全長遺伝子（表１）のみを欠如している変異体ＣＶＡ_Ｂである。正しい制限パターンを有するＢＡＣクローンを、伝染性ウイルスの再活性化のために選択した。さらに注目すべきことは、変異誘発後に異常な制限パターンを有するいくつかのＢＡＣクローンが、大腸菌ＤＨ１０Ｂ宿主由来の組み込まれた細菌挿入配列を有していたことである（４，１５）。そのような大腸菌の可動遺伝因子により改変されたＢＡＣを除外するために、レスキュー前のＰＣＲにより、細菌挿入配列をなくすために全てのＢＡＣを常にスクリーニングした。５つ全ての変異型ＣＶＡ−ＢＡＣはＢＡＣ−ＤＮＡのＳＦＶ感染ＢＨＫ細胞への形質移入によりレスキューされ、得られた変異体ＣＶＡはＣＥＦ細胞で継代され、ヘルパーウイルスを除去された。レスキューされたＣＶＡ欠失変異体は、ｍＣＶＡｂｃ３６、ｍＣＶＡｂｃ３９、ｍＣＶＡｂｃ４５、ｍＣＶＡｂｃ４８およびｍＣＶＡｂｃ５０と命名された（図１Ｂ）。再活性化された変異体ｍＣＶＡｂｃ３９およびｍＣＶＡｂｃ５０のゲノムのＯＲＦ ＣＶＡ００１からＯＲＦ ＣＶＡ２２９までの完全なコード配列が決定された。故意に導入された変異以外では、それぞれおよそ１７９，７５０および１６７，７００のヌクレオチドから成る２つのゲノム配列中に、余分な変化は観察されなかった。この結果により、ＶＡＣＶゲノムに多重突然変異を導入するためのＢＡＣ系の適合性が確認された。

ＣＶＡ欠失変異体の複製様式および細胞変性効果
細胞培養における種々のＣＶＡ変異体の宿主域は、細胞単層中の変異体の拡散を目視検査することによりまず特徴づけられた。このために、原発性ＣＥＦ細胞および異なる７種から得られた１４の永久細胞株のパネルが使用された。結果は、変異体ウイルスによるｅＧＦＰ発現により緑色蛍光を発する細胞の数を表わす任意スケールでのスコアとして示される。ウイルス拡散における肉眼的変化は、原発性ＣＥＦ細胞においても、またいずれの変異体に関する１４中１２の細胞株においても、観察されなかった（表２）。唯一の例外として記されるのは、ウサギ由来の２つの細胞株、ＲＫ１３およびＳＩＲＣであった。欠失ＩＩ（変異体ｍＣＶＡｂｃ３９〜５０）を含む変異体は全て、これらの細胞に拡散できなかった。欠失ＩＩの導入はＫ１Ｌ遺伝子の機能的不活化につながる（表１）。ＲＫ１３細胞において、それぞれのワクシニアウイルスの複製効率が強力に損なわれることは、以前から示されている（２４，３３）。２つの主な欠失ＩおよびＩＶより多くを含む全ての変異体のＣＥＦにおける細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ＣＶＡ_Ｂとは異なり、これらの原発性細胞においてＭＶＡ_Ｂにより引き起こされるＣＰＥにより類似していた（図３Ａ）。変異体ｍＣＶＡｂｃ３９〜５０に感染したＣＥＦ単層はより低い程度の細胞円形化を示した。ｍＣＶＡｂｃ３６のみがなお、野生型ＣＶＡ_Ｂと同様のＣＰＥを示した（図３Ａ）。ＭＶＡに許容的でもあるＢＨＫ−２１細胞において、すべてのＣＶＡ欠失変異体が野生型様ＣＰＥを示した（データ未記載）。

ＭＶＡ様欠失を含むＣＶＡ変異体の複製特性を、多段階複製分析により選択された細胞株で、さらに詳細に調べた。原発性ＣＥＦ細胞、加えて、ヒト細胞株のＨｅＬａおよびＭＲＣ−５並びにマウス細胞株のＢＡＬＢ／３Ｔ１２−３における全ての変異体ウイルスの複製動態は、ＣＶＡ_Ｂと比較して基本的に不変であったが（図３Ｂ）、これによりウイルス拡散の目視検査（表２参照）に基づく上記の結論が確認された。明瞭化のために、変異体ｍＣＶＡｂｃ４５およびｍＣＶＡｂｃ５０のデータのみを図３Ｂに示す。ＣＥＦ細胞における変異体ｍＣＶＡｂｃ３９〜５０のＣＰＥはＭＶＡ様であるにもかかわらず、これらの変異体はＭＶＡの複製効率に届かなかった（図３Ｂ）。対照的に、ＭＶＡ_Ｂは以前の分析（３１）から予測されるように、ヒト細胞株における複製を示さなかった（図３Ｂ）。ＭＶＡに対し半許容であるＶｅｒｏ細胞において（２０）、すべてのＣＶＡ変異体はＣＶＡ_Ｂと比較して、複製能力における明白な変化無しに、非常に類似した複製様式を示した（図３Ｂ）。

ラットＩＥＣ−６細胞において、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）並びにＭＶＡ_Ｂは、感染細胞の小増殖巣を形成し、これにより、Ｖｅｒｏ細胞と同様にこの細胞株において限定的に複製および拡散が可能であるように思われた（データ未記載および図３Ｂ）。従って、ＩＥＣ−６細胞は、以前の報告（７）で決定された分類により、ＭＶＡに対し半許容である。しかしながら、以前の観察（２３）とは対照的に、ＩＥＣ−６細胞はＭＶＡ_Ｂに対し、明らかに、完全には許容的ではなかった。全てのＣＶＡ変異体は、このラット細胞株において、ＣＶＡ_Ｂと同様の効率で複製した（図３Ｂ）。

まとめると、ＣＶＡへの６個全ての主なＭＶＡ欠失の組み合わされた導入および３１個のＯＲＦの欠失は、Ｋ１Ｌ遺伝子が不活性であるためウサギ細胞は唯一例外であるが、ヒト、マウス、サル、ハムスター、イヌおよびラットを含む様々な種の哺乳動物細胞株における得られた変異体ウイルスの複製能力を、肉眼的には改変させなかった。

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＶＡ様欠失を含むＣＶＡ変異体の病原性
６個までのＭＶＡ様の大きな欠失を含むＣＶＡ変異体の病原性を判定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１匹当たり致死量未満量の３×１０^５ＴＣＩＤ_５０で、異なる変異体並びにＣＶＡ_ＢおよびＭＶＡ_Ｂを鼻腔内感染させた。この接種量では、ＣＶＡ_Ｂに感染したマウスは、感染６日後にピークとなる、およそ１５〜２０％の最大体重減少および臨床疾病を示した（図４Ａ、Ｃ）。変異体ＣＶＡｂｃ３６〜４５により誘発された体重減少および臨床疾病は、ＣＶＡ_Ｂ感染後よりもさらにより顕著であり、このことはこれらの変異体の病原性が、親ＣＶＡ_Ｂと比較してわずかに増強されていることを示している（図４Ａ，Ｃ）。注目すべきは、これらのＣＶＡ変異体が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて３ｘ１０^５ＴＣＩＤ_５０の投与量で一律に致死性であるマウス適合性ＶＡＣＶ株Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅよりも、なお病原性が低いことである（データ未記載）。対照的に、変異体ｍＣＶＡｂｃ４８およびｍＣＶＡｂｃ５０に感染したマウスは、ＣＶＡ_Ｂと比較して、体重減少の低減（図４Ｂ）および病徴の緩和（図４Ｄ）を示した。

致死量のウイルスに感染させた後のＣＶＡ変異体の病原性を比較するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、一匹当たり５ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０の各ウイルス変異体を鼻腔内感染させた。ＣＶＡ_ＢまたはいずれのＣＶＡ変異体の感染によっても、全てのマウスで体重の激減が起こったのに対し、ＭＶＡ_Ｂは完全に非病原性であった（図４Ｅ、Ｆ）。ＣＶＡ_Ｂおよび変異体ｍＣＶＡｂｃ３６に感染したマウスは全て死亡した（図４Ｇ）。対照的に、ｍＣＶＡｂｃ４８に感染した全てのマウスおよびｍＣＶＡｂｃ５０に感染したマウスの８０％超が生存した（図４Ｈおよびデータ未記載）。ｍＣＶＡｂｃ５０に感染した動物の１匹のみが、２つの独立した実験のうちの１つで、感染のために死亡した。ｍＣＶＡｂｃ４８およびｂｃ５０に感染したマウスのほとんどは生存したが、それらマウスは、ＣＶＡ_Ｂに感染した動物と比較してわずかに低減しただけの、著しい体重減少を示した（図４Ｆ）。意外なことに、高投与量の変異体ｍＣＶＡｂｃ３９に感染したほとんどのマウスもまた感染から生存した（図４Ｅ，Ｇ）。低接種量と高接種量でｍＣＶＡｂｃ３９の病原性の表現型が異なる理由は、現在のところ不明である。１ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０の接種量は５ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０の接種量と比較して類似した効果をもたらした（データ未記載）。従って、欠失Ｉ〜ＶおよびＩ〜ＶＩを含むＣＶＡ変異体は中程度に弱毒化され、その効果は使用された接種量に非依存的であった。対照的に、４つまでの欠失を含む変異体は、弱毒化もせず、さらに、低い接種量で野生型ＣＶＡよりも若干より病原性でさえあった。変異体ｍＣＶＡｂｃ３９は、高接種量でわずかに弱毒化するが、低接種量では病原性の増強を示すという、予期しない表現型を示した（図４）。ＭＶＡ_Ｂとは明らかに異なり、ｍＣＶＡｂｃ５０でさえなお、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてかなりの病原性を示した（図４）。従って、１２個の完全長遺伝子および６個の主なＭＶＡ欠失に含まれる３１個のＯＲＦ全ての欠失または切断（表１）は、ＢＡＬＢ／ｃマウス鼻腔内攻撃モデルにおけるＣＶＡの病原性を中程度に減少させるのみである。

弱毒化の非連続的パターンの発見は、疾患の重症度が通常ピークに達した時の、３ｘ１０^５ＴＣＩＤ_５０の投与量の接種から６日後のマウスの肺におけるウイルス力価の分析により裏付けられた。力価は、ＣＶＡ_Ｂと比較して、変異体ＣＶＡｂｃ３６およびｍＣＶＡｂｃ３９感染後にわずかに、だが有意ではない程度に高く（スチューデントのｔ検定により、ｐ＝０．０６）（図４Ｉ）、それらの増強された病原性を反映している。対照的に、ＣＶＡ_Ｂと比較して、ｍＣＶＡｂｃ４８およびｍＣＶＡｂｃ５０の感染から６日後に、力価は９０％超減少し（図４Ｉ、ｐ＜０．００１）、このことはこれら変異体の病原性が減少した表現型の発見を支持している。

ｍＣＶＡｂｃ４８弱毒化の決定因子
高接種量でだけでなく低接種量でのｍＣＶＡｂｃ４８およびｍＣＶＡｂｃ５０の弱毒化は、欠失Ｖの導入が観察されたこれら変異体（表１参照）の弱毒化全体の主な要因になっていることを示唆した。欠失ＶはＯＲＦのＣ５Ｌ〜Ｃ１Ｌを包含し、Ｎ１Ｌ ＯＲＦにおいてフレームシフトをもたらし、Ｎ１のＣ末端の２３残基のアミノ酸配列改変およびＮ１ ＯＲＦの４アミノ酸短縮を引き起こす。ｄｅｌ ＶがｍＣＶＡｂｃ４８の弱毒化された表現型を産むのに十分であるかどうかを決定するために、欠失Ｖに相当する配列を野生型ＣＶＡ_Ｂから別々に欠失させた。得られた変異体ｍＣＶＡｂｃ６１は、ＨｅＬａ、ＣＥＦおよびＢＡＬＢ／３Ｔ１２−３細胞においてＣＶＡ様複製特性を有し、変異体ｍＣＶＡｂｃ３９〜ｍＣＶＡｂｃ５０で観察された改変されたＣＰＥ表現型を示さなかった（データ未記載）。後者の結果は、主に欠失ＩＩの存在によりＣＰＥの改変が引き起こされるという結論を裏付けた。３ｘ１０^５ＴＣＩＤ_５０のウイルスでの鼻腔内感染時に、ｍＣＶＡｂｃ６１は、変異体ｍＣＶＡｂｃ４８で観察された弱毒化とやや異なる、弱毒化された表現型を示した（図５Ａ、Ｂ）。ｍＣＶＡｂｃ６１感染マウスの肺におけるウイルス価は、野生型ＣＶＡ_Ｂと比較して有意に減少した（図５Ｃ）。従って、欠失ＶはｍＣＶＡｂｃ４８の弱毒化された表現型に最も寄与していた。

３１個までのＯＲＦの欠失によるＣＶＡ変異体の弱毒化は高々中程度であるが、変異体の病原性の分析により、ポックスウイルス病原性の遺伝的基礎を解明するいくつかの興味深い側面が明らかにされた。２つの弱毒化パターンは接種量に応じて現れた。低い接種量では、病原性はｄｅｌ ＩおよびＩＶに対応する配列の欠失により増加し（ｍＣＶＡｂｃ３６）、その後徐々に減少した（図６）。ｄｅｌ Ｉ〜ＶおよびＩ〜ＶＩに対応する配列が欠失している変異体のみ、野生型ＣＶＡよりも病原性が低かった。５個または６個全ての欠失に対応する配列が除去されている場合、高接種量で病原性は最も明白に減少した。例外は変異体ｍＣＶＡｂｃ３９であり、ｍＣＶＡｂｃ４８と同様に弱毒化した（図６）。従って、累積的な欠失の正味の効果は、単純に６個の欠失の逐次誘導により発生した小さな適合性欠損効果の合計ではない。むしろ、ｄｅｌ ＩおよびＩＶに対応する配列の欠失は、少なくとも低接種量では疾患を増強させるものであった。隣接する配列の欠失は欠失ＩおよびＩＶの疾患増強効果を補償したが、元のＣＶＡ_Ｂと比較して検出可能な弱毒化を達成したのは、ｄｅｌ Ｖに対応する配列後のみである（図６）。疾患増強効果は免疫反応を弱らせる、免疫調節物質の損失により引き起こされたかもしれず、従ってより強力な局所または全身性免疫反応による免疫病理を表わし得る。さらに、病原性パターンは投与量依存的であった。変異体ｍＣＶＡｂｃ３９は高接種量でわずかな弱毒化を示し、これは低接種量では検出されなかった（図６）。従って、高接種量を用いた場合、弱毒化の非線形パターンが、遺伝子欠失の蓄積により現れた。

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Claims (19)

1. ワクシニアウイルス欠失変異体（ｄＶＡＣＶ）を調製する方法であって、前記方法が、
   （ａ）ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）ゲノムがヒト細胞株内で複製する、ＶＡＣＶのゲノムを含むベクターを提供すること；
   （ｂ）・ｄｅｌ Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置４０５２〜７４６５）；
   ・ｄｅｌ ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置２３１３９〜２５８８４）；
   ・ｄｅｌ ＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１５８８６７〜１６２４１３）；
   ・ｄｅｌ ＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１８０６３９〜１８７０９２）；
   ・ｄｅｌ Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１７４３８〜２２１５９）；および／または
   ・ｄｅｌ ＶＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１３５４８１〜１３９２６４）に対応する少なくとも１つの配列を欠失させること；
   （ｃ）前記ｄＶＡＣＶを分離することを含む、方法。
2. ヒト細胞株内での前記ｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒト細胞株が、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、２９３、および１４３Ｂからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＶＡＣＶが、漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）、好ましくは受託番号ＡＭ５０１４８２によりＧｅｎＢａｎｋに寄託されており、かつ受託番号１００６２９０１によりＥＣＡＣＣに寄託されているＣＶＡ−ＰＰである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって得られる欠失漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ｄＣＶＡ）であって、前記ｄＣＶＡが、２９３、１４３Ｂ、およびＭＲＣ−５細胞株から選択されるヒト細胞株内で複製する、欠失漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ｄＣＶＡ）。
6. 請求項５に記載のｄＣＶＡのゲノムを含むベクター。
7. 前記ｄＣＶＡが、前記ヒト２９３細胞株、ヒト１４３Ｂ細胞株、またはヒトＭＲＣ−５細胞株において、５よりも大きな増幅率により複製する、請求項５に記載のｄＣＶＡまたは請求項６に記載のベクター。
8. 前記ベクターが細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項６または７に記載のベクター。
9. 請求項５に記載のｄＣＶＡのゲノムを含む細胞。
10. ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）における変異の効果を決定するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）・ｄｅｌ Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置４０５２〜７４６５）；
    ・ｄｅｌ ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置２３１３９〜２５８８４）；
    ・ｄｅｌ ＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１５８８６７〜１６２４１３）；
    ・ｄｅｌ ＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１８０６３９〜１８７０９２）；
    ・ｄｅｌ Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１７４３８〜２２１５９）；および／または
    ・ｄｅｌ ＶＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＭ５０１４８２；ＥＣＡＣＣ １００６２９０１の位置１３５４８１〜１３９２６４）から選択される配列に対応する少なくとも１つの配列を欠失するＶＡＣＶのゲノムであって、該欠失ＶＡＣＶ（ｄＶＡＣＶ）ゲノムがヒト細胞株内で複製する、欠失したＶＡＣＶゲノムを含むベクターを提供すること；
    （b）変異ＶＡＣＶ欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を得るために、該ｄＶＡＣＶゲノムに少なくとも１つの変異を導入すること；
    （ｃ）該変異が、前記ｍｄＶＡＣＶの複製に影響を及ぼすか否かを決定することを含む、方法。
11. ヒト細胞株における前記ｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程；および／または
    前記ヒト細胞株における前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率を測定する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つの変異が、前記ヒト細胞株内での前記ｍｄＶＡＣＶの複製に影響するか否かを決定するため、前記ｄＶＡＣＶの増幅率を前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率と比較することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの変異が、動物における前記ｄＶＡＣＶの複製、前記ｄＶＡＣＶの病原性、および／または前記ｄＶＡＣＶの免疫原性に影響するか否かについて決定することをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ヒト細胞株がＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、２９３、および１４３Ｂからなる群より選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 複製制限変異ワクシニアウイルス欠失変異体（ｍｄＶＡＣＶ）を調製するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）請求項５に記載のｄＣＶＡを提供すること；
    （ｂ）前記ｄＣＶＡのゲノム内に少なくとも１つの変異を導入すること；および
    （ｃ）前記ｍｄＶＡＣＶを分離すること；
    を含む、方法。
16. 前記ｄＣＶＡのヒト細胞株内での増幅率を測定する工程；および／または
    ｍｄＶＣＶＡの前記ヒト細胞株内での増幅率を測定する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つの変異が、前記ヒト細胞株内での前記ｍｄＶＡＣＶの複製に影響するか否かを決定するため、前記ｄＣＶＡの増幅率を前記ｍｄＶＡＣＶの増幅率と比較することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ｍｄＶＡＣＶが複製制限されており、好ましくはヒト細胞株内で、前記ヒト細胞株内での前記ｄＣＶＡの複製に比較して複製能力がない、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ヒト細胞株が、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、２９３、および１４３Ｂからなる群より選択される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。

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