CN105829537B - 用于使用痘病毒载体诱导增强的免疫应答的组合物和方法载体 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含在感染早期指定过量双链RNA(dsRNA)的异源性或天然核酸的重组痘病毒，其可进一步包含编码一种或多种共刺激分子的异源性核酸，和/或编码一种或多种感染性疾病相关抗原或肿瘤相关抗原的异源性核酸；以及包含所述重组痘病毒的药物组合物及其方法和用途。相较于缺乏指定过量早期dsRNA的异源性或天然转录单元的相同重组痘病毒，本文提供的重组痘病毒增强受试者中先天性和适应性免疫活化。

Description

用于使用痘病毒载体诱导增强的免疫应答的组合物和方法 载体
领域
本文提供的本发明涉及包含编码在感染早期形成双链RNA(dsRNA)的互补RNA的异源性核酸的重组痘病毒。早期dsRNA也可通过转录重组痘病毒的天然基因的两个链来产生。本文提供的重组痘病毒可进一步包含编码一种或多种共刺激分子的异源性核酸，和/或编码一种或多种感染性疾病相关抗原或肿瘤相关抗原的异源性核酸。相较于缺乏表达早期dsRNA的异源性核酸的相同重组痘病毒，这些重组痘病毒使受试者的先天性和适应性免疫活化增强。本文也提供包含任何本文提供的重组痘病毒的药物组合物以及所述重组痘病毒的方法和用途。
背景
免疫系统借助于检测病原体相关分子模式(PAMP)的模式识别受体(PRR)来识别多种病原体，包括病毒。PRR涵盖Toll样受体(TLR)、RIG样解旋酶(RLH)、NOD样受体(NLR)和其它迄今不太充分确定的PRR的家族(Iwasaki(2012),Annu.Rev.Microbiol.66:177-196；Desmet和Ishii(2012),Nat.Rev.Immunol.12:479-491；Melchjorsen(2013),Viruses.5:470-527)。PRR的活化会导致活化各种免疫细胞，包括树突细胞(DC)，并且最终诱导先天性和适应性免疫应答。PRR活化也导致通过诱导包括IFN-α(IFN-α)和IFN-β(IFN-β)的I型干扰素(IFN)以及所述干扰素的作用，以及诱导向迄今未感染的宿主细胞发出警报并协调免疫应答的其它细胞因子和趋化因子以及所述其它细胞因子和趋化因子的作用来诱导非免疫细胞的抗病毒状态。I型IFN例如通过上调I类和II类MHC表达，交叉递呈和活化DC来调控免疫应答的许多方面，包括先天性病原体抗性机理以及抗体产生和T细胞活化(Iwasaki和Medzhitov(2010),Science 327:291-295；Desmet和Ishii(2012),Nat.Rev.Immunol.12:479-491)。
生物体检测病毒存在的一种重要方式是通过正常细胞与免疫细胞两者来识别病毒RNA或DNA。TLR3、TLR7/8、TLR9和TLR13已分别被鉴定为双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)、DNA和核糖体RNA(rRNA)的受体。具有双链DNA(dsDNA)基因组的病毒(如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒)通过TLR9依赖性路径和TLR9非依赖性路径被识别(Hochrein等(2004),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101:11416-11421；Samuelsson等(2008),J.Clin.Invest118:1776-1784)。先前研究已显示痘病毒强力抑制TLR9依赖性dsDNA识别路径与TLR9非依赖性dsDNA识别路径两者。
免疫细胞通过TLR9检测到痘病毒DNA导致产生I型干扰素(即IFN-α/β)和III型干扰素(即IFN-λ)以及其它细胞因子和趋化因子(Lauterbach等(2010),J.Exp.Med.207:2703-2717；Samuelsson等(2008),J.Clin.Invest 118:1776-1784)。浆细胞样DC(pDC)应答于TLR7/8或TLR9依赖性刺激而选择性地有能力产生大量IFN-I和IFN-III。在pDC中，TLR9依赖性刺激导致产生IFN-I和IFN-III。DNA与其它病毒核酸两者均在受感染细胞的细胞质中被识别，由此向那些细胞发出警报以产生IFN-I和IFN-III以及其它细胞因子。TLR9非依赖性痘病毒识别路径主要由各个子组的常规树突细胞(cDC)采用(Hochrein和O'Keeffe(2008),Handbook Exp Pharmacol 183:153-179)。
病毒性感染的另一重要特征是dsRNA，其不仅由RNA病毒，而且也由具有dsDNA基因组的痘病毒在细胞感染期间产生。痘病毒感染中的dsRNA是通过从位于dsDNA基因组的上链和下链上的基因重叠转录来产生。特定来说，中期和晚期基因的转录终止不受严密调控，即导致病毒mRNA具有不同长度的长3′未翻译区域(3′UTR)的现象(Cooper,Wittek和Moss(1981),J.Virol.39:733-745；Xiang等(1998),J.Virol.72:7012-7023)。当所述转录物源于处于相反定向(即朝向彼此加以转录)的两个相邻基因时，转录产生通过彼此退火或与早期转录物退火而形成dsRNA的重叠互补mRNA链段(Boone,Parr和Moss(1979),J Virol.30:365-374)。病毒dsRNA的产生似乎主要限于痘病毒复制周期的晚期(Colby和Duesberg(1969),Nature 222:940-944；Duesberg和Colby(1969),Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 64:396-403；Moss(2007),5:2905-2945)。先前已报道由病毒转录物获得的dsRNA可见于感染早期(Boone,Parr和Moss(1979),J Virol.30:365-374；Lynch等(2009),Virology 391:177-186；Willis等(2009),Virology 394:73-81；Willis,Langland和Shisler(2011),J.Biol.Chem.286:7765-7778)。然而，似乎存在阻止产生足量早期dsRNA以触发细胞的识别系统的选择压力，例如通过保证在相反方向上转录的邻近早期基因的高效转录终止(Smith,Symons和Alcami(1998),Seminars in Virology 8:409-418)。痘病毒已进化出在编码链上的具有序列TTTTTNT的特定早期终止信号，其使早期转录在这个序列的下游20至50个核苷酸处终止(Yuen和Moss(1987),Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 84:6417-6421)。朝向彼此加以转录的早期基因通常含有多个终止信号，从而指示所述基因的即刻早期转录终止受严密控制以避免在感染早期产生互补RNA似乎对病毒适合度是重要的。
宿主细胞和生物体已产生多种dsRNA识别受体来检测病毒性感染。尽管TLR3主要在免疫细胞中表达，并且可感测细胞外dsRNA，但大多数其它dsRNA感测体(如RIG-I、MDA-5、DDX1/DDX21/DHX36、蛋白质激酶R(PKR)和2′-5′-寡腺苷酸合成酶(2′-5′-OAS))在宿主的各器官和细胞类型中遍在表达，并且定位在细胞质中。关于I型IFN诱导，RIG-I和MDA-5被视为代表用以检测病毒性感染的最重要的胞质dsRNA感测体(Melchjorsen(2013),Viruses.5:470-527)。另一重要ds RNA感测体，即dsRNA活化的蛋白质激酶R(PKR)被认为主要通过使翻译延伸因子eIF2α磷酸化来施加它的抗病毒作用，所述磷酸化导致细胞和病毒翻译停止，由此限制病毒复制。(Garcia等(2006),Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:1032-1060；Williams(1999),Oncogene 18:6112-6120)。也有证据表明PKR在诱导I型IFN方面具有作用。(Barry等(2009),J Gen.Virol.90:1382-1391；Gilfoy和Mason(2007),J Virol.81:11148-11158)。
为抑制由dsRNA触发的抗病毒作用，痘病毒已使至少两种蛋白质E3和K3致力于抑制重要dsRNA感测体PKR。两种病毒蛋白质均已被广泛研究。在它们之中，E3似乎是首要的。E3结合并螯合dsRNA，并且抑制PKR活化。缺乏E3L基因的痘苗病毒(VACV)突变株(VACV-ΔE3L)具有限定的宿主范围，并且诱导许多细胞类型的凋亡(Hornemann等(2003),J.Virol.77:8394-8407；Kibler等(1997),J Virol.71:1992-2003)，从而表明PKR介导的凋亡是受VACV感染的细胞中PKR活化的主要结果。然而，也已报道VACV-ΔE3L对IFNI治疗的敏感性较高(Beattie,Paoletti和Tartaglia(1995),Virology 210:254-263)，并且用E3缺失的VACV突变株感染的凋亡前细胞中的IFN-α/β诱导程度较高(Hornemann等(2003),J.Virol.77:8394-8407)。此处，我们描述一种用以诱导用改良型安卡拉(Ankara)痘苗病毒(MVA)和绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(CVA)感染的细胞中PKR活化，而不诱导可检测细胞死亡或凋亡，但触发高量IFN-α/β以及其它趋化因子和细胞因子的释放的方法。这通过在开始DNA复制之前在感染早期表达dsRNA来实现。通过从重组基因的两个独立插入物转录两个互补mRNA来实现dsRNA的稳定表达。在CVA的情况下，I型IFN诱导导致小鼠中几乎非病原性感染，并且那个结果取决于存在功能性I型IFN系统。
通过用鸡胚胎纤维母细胞使有完全复制能力的天花疫苗病毒株绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(CVA)(Meisinger-Henschel等(2007),J.Gen.Virol.88:3249-3259)传代>570次来产生MVA。有复制能力的CVA显示具有不良IFN-I诱导性，而复制受限定的MVA相当高效诱导IFN-I(Samuelsson等(2008),J.Clin.Invest 118:1776-1784)。CVA抑制IFN-I产生是通过由B19R基因编码的痘病毒IFN-I结合蛋白(IFN-IR)来部分地介导。B19蛋白结合IFN-α，并且因此抑制它的生物活性。此外，B19与I型干扰素结合也会阻止通过基于抗体的分析技术来检测IFN-α/β，从而指示B19蛋白也结合人IFN-β。不同于人系统，B19不结合小鼠IFN-β。由B19R ORF编码的痘病毒IFN-I结合蛋白的同源物存在于许多痘病毒种类中，从而表明用于抑制IFN-I活性的这个机理在痘病毒中是更为一般地保守的。参见例如图17。
B19的I型IFN结合活性不是由痘病毒用于遏制IFN-I效应物功能或诱导的唯一抑制性机理。痘病毒编码许多破坏它们的宿主的I型干扰素系统的因子。干扰素在抗病毒防御方面是关键的，因为它们诱导IFN受体表达性细胞的抗病毒状态，并且调控宿主的先天性和适应性免疫应答。在抵抗干扰素系统的已知痘病毒因子之中的是分泌的受体样蛋白B19和B8，其分别结合以及中和I型和II型干扰素。诸如VACV E3、K7、C6、N1、C7、K1、K3和H1的其它痘病毒蛋白质抑制对I型干扰素的诱导或阻断干扰素信号传导和效应物路径。痘病毒编码如此众多蛋白质以抵抗干扰素系统的事实强调先天性免疫防御的这个系统对于受感染的宿主生物体控制以及最终清除痘病毒的重要性。除干扰素系统之外，正痘病毒编码干扰对细胞因子(如IL-1β、IL-18)和趋化因子(包括VACV B16R、WR013、C23L/vCCI)的诱导或其功能的其它免疫调节性蛋白质。这些细胞因子在限制病原体扩散以及保护宿主免遭重度病原体诱导的损害方面也是重要的。破坏模式识别路径的痘病毒蛋白质在阻碍对IFN以及其它细胞因子和趋化因子的诱导方面是普遍高效的。
因此，本发明的主要目标在于增强由细胞dsRNA感测体对痘病毒的识别以及增加由MVA诱导的先天性免疫活化。本文公开通过在基因组中两个单独位置处插入两个部分相同的DNA而被工程改造来在感染早期产生dsRNA的重组痘病毒。使那些DNA可操作连接于强力早期启动子，所述启动子被定向以使一种DNA产生‘有义’转录物，而另一DNA产生互补‘反义’转录物。两个部分或完全互补的转录物随后退火以产生dsRNA。以历经广泛尺寸范围的早期dsRNA观察到对作为先天性免疫活化的重要标志物的IFN-β的高效诱导，其中当互补转录物缩短至50bp时，效率降低。
概述
本发明涵盖一种包含在感染早期表达过量双链RNA(dsRNA)的异源性核酸的重组痘病毒。在一个实施方案中，本发明涵盖一种增强先天性免疫活化的方法，其包括向脊椎动物受试者施用重组痘病毒，其中所述施用增强所述受试者中I型干扰素(I型IFN)、细胞因子和趋化因子的产生。
在另一实施方案中，重组痘病毒从天然痘病毒序列，优选是早期基因，更优选是即刻早期基因的两个链转录有义和反义RNA。
在另一实施方案中，重组痘病毒从异源性序列的两个链转录呈有义和反义RNA形式的异源性核酸。
在另一实施方案中，本发明涵盖一种通过表达过量早期dsRNA来使具有标准复制能力的痘苗病毒株以及源于脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)的其它种类减毒的方法。
在各种实施方案中，痘病毒进一步包含编码一种或多种共刺激分子的异源性序列。
在各种实施方案中，痘病毒进一步包含编码一种或多种细菌、病毒、真菌、寄生虫或肿瘤抗原的异源性序列。
在各种实施方案中，痘病毒是正痘病毒、副痘病毒、亚塔痘病毒、禽痘病毒、野兔痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒、鹿痘病毒或软疣痘病毒。正痘病毒可选自由痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒组成的组。痘苗病毒可为改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，例如巴伐利亚诺迪克(Bavarian Nordic)改良型安卡拉痘苗病毒(MVA-BN)。
在各种实施方案中，产生dsRNA的异源性或内源性核酸包含编码部分或完全互补RNA转录物的序列，其中RNA转录物的互补部分在转录之后退火以形成dsRNA。
在各种实施方案中，编码完全或部分互补RNA转录物的异源性核酸在互补区域内是相同的，或在互补区域内具有大于99％、大于95％、大于90％、大于80％或大于70％的相似性。
本发明的其它目标和优势将部分地阐述于随后描述中，并且部分地将根据描述而明显，或可通过实施本发明来获悉。本发明的目标和优势将借助于在随附权利要求中特定指出的要素和组合来实现和获得。
应了解先前一般性描述与以下详细描述两者均仅具有示例性和说明性，而不限制如所要求保护的本发明。
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明本发明的一个(若干)实施方案，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。
附图简述
图1描绘过度产生早期dsRNA的CVA突变株和相应对照突变株的图示。各框代表ORFB14R与B20R之间的基因组区域中的CVA ORF，并且并非按比例绘制。代表CVA形式的B15ORF的框以黑色显示，而MVA形式的B15R由菱形图案指示。阴影化框代表B19R ORF。所有其它ORF都显示为灰色框。在各种缺失突变株中替换CVA ORF的细菌选择标记(neor和zeor)显示为具有特定标记指示的较小框。
图2显示CVA-dsneo-ΔB15和相关CVA突变株在BALB/c小鼠中的毒性。各组3至5只6-8周龄雌性BALB/c小鼠用50μl含有5×107(A、B右侧图版)或107TCID50(B左侧图版、C)的指示CVA突变株纯化储备物的接种物鼻内感染。A)和B)显示采用不同组CVA突变株的独立实验的结果。每日检查动物，并且在指示日称重。体重数据表示为相应组的从在第0天初始平均重量开始的平均重量+/-SEM的百分比。剑号指示在相应日的死亡动物数。C)在感染后6天回收用107TCID50的指示病毒纯化储备物鼻内感染的6-8周龄雌性BALB/c小鼠的肺。使肺均质化，并且使用CV-1细胞，通过标准TCID50测定来测定病毒滴度。指示的是两个独立实验的来自每种病毒总计8只小鼠的肺中总病毒滴度的平均值。***＝p<0.001，根据Student t检验。
图3显示CVA-dsneo-ΔB15在IFNAR0/0小鼠中的毒性。A)指示数目的两种性别9-18周龄C57BL/6-IFNAR0/0小鼠用50μl含有2×106TCID50的CVA和CVA-dsneo-ΔB15粗病毒储备物或107TCID50的CVA和CVA-dsneo-ΔB15纯化储备物的接种物鼻内感染。每日检查动物，并且在指示日称重。体重数据表示为相应组的从在第0天初始平均重量开始的平均重量+/-SEM的百分比。B)A)中所示的小鼠的存活率。
图4显示由CVA-dsneo-ΔB15达成的DC中的IFN-α和IFN-λ诱导。用指示的病毒在指示的MOI下感染来自野生型C57BL/6小鼠的FL-DC 18小时。通过ELISA来分析DC培养上清液中的IFN-α和IFN-λ。CVA和CVA-ΔB15不诱导可检测量的IFN-α。
图5显示A31细胞中由CVA-dsneo-ΔB15达成的IFN-βmRNA诱导的动力学以及neo盒插入物的作用。A)鼠类BALB/3T3 A31细胞被模拟感染，或用源自BAC的野生型MVA或CVA以及CVA突变株CVA-dsneo-ΔB15和CVA-ΔB15的纯化储备物在MOI 10下感染指示时间。使细胞溶解，并且使用QIAGEN RNeasy试剂盒制备来自细胞溶解产物的RNA。使用来自QIAGEN的DNA移除(gDNA)柱消除污染性基因组DNA，继之以用Turbo DNA酶(Ambion)在37℃下再进行1小时DNA酶处理，并且随后在65℃下使DNA酶热失活10分钟。使用针对鼠类IFN-β的商业基因表达测定(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)来测定IFN-βmRNA水平。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平，受感染细胞中的IFN-β转录物水平，表示为IFN-βmRNA的增加倍数。B)A31细胞被模拟感染，或用CVA和指示的CVA突变株(对于概述，参见图1)的粗储备物在MOI 10下感染6小时。如A)中所述进行IFN-βmRNA的RNA定量制备。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平，受感染细胞中的IFN-β转录物水平，表示为IFN-βmRNA的增加倍数。1：CVA；2：CVA-dsneo-ΔB15/B19；3：CVA-dsneo-ΔB15；4：CVA-ΔB15；5：CVA-zeo-ΔB15；6：CVA-ΔpB15-neo-ΔB15；7：模拟。
图6显示dsRNA产生性MVA突变株的EGFP和neo插入物的图示。指示由pS、pHyb或pB15R启动子控制的neo和EGFP编码序列(黑色箭头)转录的方向。ORF和所有其它元件都未按比例绘制。A)neo ORF是BAC盒内的neo-IRES-EGFP选择盒的一部分(Meisinger 2010)。BAC盒被插入基因间区域(IGR)I3L/I4L(MVA064/065)中。neo-IRES-EGFP盒在pS启动子(由箭头指示)的控制下转录，而B15R基因座中的neo/rpsL盒在B15R启动子的控制下以相反定向转录。一个MVA构建体内的Neo ORF重叠792nt(由灰色框指示)，其中具有一个单一错配。在MVA-dsneo-ΔB15/ΔBAC中，IGR I3L/I4L中的完整BAC盒通过Cre/lox重组而被缺失。B)B)中所有MVA-dsEGFP构建体都基于BAC盒内的neo-IRES-EGFP盒已从其被缺失的MVA重组体。在MVA-EGFP中，neo-IRES-EGFP盒被neo基因替换。MVA-EGFP中以有义定向转录的EGFPORF被插入ORF A25L与A26L之间(MVA136/137)的IGR中，而以反义转录的EGFP ORF被插入IGR J2R/J3R(MVA086/087)中。由重叠互补EGFP转录物形成的潜在dsRNA链段由灰色条指示。仅指示MVA-EGFP和MVA-dsEGFP的相邻ORF。在反义EGFP转录物的3′末端的lacZα序列被单独插入MVA-dsEGFP中，并且充当非互补3′突出部分以匹配MVA-dsneo-ΔB15中互补neo转录物的格局。MVA-EGFP在EGFP ORF的下游含有受控于细菌启动子的由FRT位点侧接的另一neo插入物。这个选择标记在所有MVA-dsEGFP构建体中都通过FLP/FRT重组来移除。
图7显示由dsRNA产生性MVA突变株达成的鼠类A31细胞中的IFN-βmRNA和蛋白质表达诱导。鼠类BALB/3T3 A31细胞被模拟感染，或用表达neo(A、B)或EGFP(C、D)的单一或重叠转录物的MVA-wt或指示的MVA突变株的粗病毒制剂感染。在收集以分析IFN-β转录物之前，A)和C)中的细胞被感染5小时(黑色棒条)和7小时(灰色棒条)。通过CVA-dsneo-ΔB15感染所达成的IFN-β基因诱导作为参照显示于A)中。使用QIAGEN RNeasy试剂盒制备来自细胞溶解产物的RNA。使用来自QIAGEN的DNA移除(gDNA)柱消除污染性DNA，继之以用Turbo-DNA酶(Ambion)在37℃下再进行1小时DNA酶处理，并且随后在65℃下使DNA酶热失活10分钟。使用针对鼠类IFN-β的商业基因表达测定(Applied Biosystems)，通过RT-qPCR来测定IFN-βmRNA水平。当RT反应中省略RT酶时，通过阴性RT-qPCR结果来证明不存在污染性DNA。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平，受感染细胞中的IFN-β转录物水平。使用细胞18S rRNA的Ct值来使IFN-βCt值标准化。测定被感染18小时(B)或23小时(D)的细胞的上清液中的IFN-β蛋白水平。收集上清液，并且使用可商购获得的ELISA(PBL)测定鼠类IFN-β。A和C中所示的感染来自一个实验，而实验B)和D)是独立的。A)1：MVA wt；2：MVA-dsneo-ΔB15；3：MVA-dsneo-ΔB15/-ΔBac；4：MVA-ΔB15，5：CVA-dsneo-ΔB15；6：模拟。B)1：MVA wt；2：MVA-dsneo-ΔB15；3：MVA-ΔB15；4：模拟，5：培养基。C)1：MVA-EGFP；2：MVA-dsEGFP；3：模拟。D)1：MVA-EGFP；2：MVA-dsEGFP；3：模拟。
图8显示由MVA-dsEGFP达成的依赖于dsRNA产生时机的IFN-βmRNA表达诱导。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平，受感染细胞中的IFN-β转录物水平，表示为“IFN-βmRNA的增加倍数”。A)Wt-MEF被模拟感染，或用MVA-EGFP(参照病毒，仅含有一个产生有义转录物的EGFP插入物)、作为阳性对照的MVA-dsEGFP-2、或MVA-ΔE3L(缺乏编码病毒dsRNA结合蛋白E3的基因)的纯化储备物在MOI 10下感染5小时。细胞保持未处理(黑色棒条)，或用40μg/ml最终浓度的胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，白色棒条)处理，所述胞嘧啶阿拉伯糖苷阻断病毒DNA复制，并且遏止早期感染。制备来自细胞溶解产物的RNA，并且通过RT-qPCR来分析IFN-βmRNA水平，如图7的插图说明中所述。B)Wt-MEF被模拟感染，或用MVA-EGFP、MVA-dsEGFP或由巴伐利亚诺迪克开发的在强力和专门晚期启动子(SSL)的控制下表达反义EGFP盒的MVA-dsEGFP-晚期的粗储备物感染5小时。制备来自细胞溶解产物的RNA，并且通过RT-qPCR来分析IFN-βmRNA水平，如图7的插图说明中所述。
图9显示A31细胞中由MVA-dsneo-ΔB15和MVA-dsEGFP达成的PKR活化。在用指示的病毒的粗储备物在MOI 10下接种之后第1天，鼠类A31细胞被感染。通过在1:1000稀释度下使用针对eIF2α的磷酸表位Ser51的抗体(抗体号9721，Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA,USA)进行免疫印迹来分析在指示的感染时间之后制备的细胞溶解产物中的eIF2α磷酸化(P-eIF2α)。作为装载对照，用检测小鼠同种型Iβ-微管蛋白的抗体来使免疫印迹膜的单独部分显色。图10显示MEF中由MVA-dsEGFP达成的IFN-βmRNA诱导增加依赖于PKR。Wt-MEF和PKR缺陷(PKR0/0)MEF被模拟感染，或用MVA-EGFP或MVA-dsEGFP的纯化储备物在MOI10下感染5小时。1ml 1:100稀释度的可商购获得的仙台病毒(SeV)制剂用作PKR非依赖性但dsRNA依赖性IFN-β诱导的阳性对照。A)制备来自细胞溶解产物的RNA，并且通过RT-qPCR来分析IFN-βmRNA水平，如图7的插图说明中所述。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平的IFN-β转录物水平，表示为“IFN-βmRNA的增加倍数”。1：MVA；2：MVA-EGFP；3：MVA-dsEGFP；4：SeV；5：模拟。B)测定被感染24小时的细胞的上清液中的IFN-β蛋白水平。收集上清液，并且使用可商购获得的ELISA(PBL)测定鼠类IFN-β。1：MVA；2：MVA-EGFP；3：MVA-dsEGFP；4：SeV；5：模拟。
图11显示由dsRNA产生性MVA重组体达成PKR依赖性IFN-β诱导的长度要求。Wt-MEF和PKR0/0-MEF被模拟感染，或用MVA-EGFP或指示的具有渐进缩短的EGFP ORF重叠部分的EGFP-dsRNA突变株(参见图6B)的粗储备物在37℃下在MOI 10下感染5小时(A、C)或24小时(B)。1ml 1:100稀释度的可商购获得的仙台病毒(SeV)制剂用作dsRNA依赖性但PKR非依赖性IFN-β诱导的阳性对照。使用从细胞分离的总RNA，通过RT-qPCR来测定超过模拟的IFN-βmRNA诱导倍数，如图7的插图说明中所述。用充当内源性对照的18S rRNA的Ct值校正IFN-βmRNA的Ct值。B)测定用指示的MVA重组体感染24小时的wt MEF和PKR0/0-MEF的上清液中的IFN-β蛋白水平。收集上清液，并且使用可商购获得的ELISA(PBL)测定鼠类IFN-β。MVA-ΔB15作为另一参照被包括。A)1：MVA；2：MVA-EGFP；3：MVA-dsEGFP；4：MVA-dsEGFP-2；5：MVA-dsEGFP-3；6：MVA-dsEGFP-4；7：MVA-dsEGFP-5；8：SeV；9：模拟。B)1：MVA；2：MVA-EGFP；3：MVA-ΔB15；4：MVA-dsEGFP；5：MVA-dsEGFP-2；6：MVA-dsEGFP-3；7：MVA-dsEGFP-4；8：MVA-dsEGFP-5；9：SeV；10：模拟。C)1：MVA-EGFP；MVA-dsEGFP；3：MVA-dsEGFP-6；4：模拟。
图12显示MVA-dsEGFP的复制和表型稳定性。A)对于MVA-EGFP和MVA-dsEGFP的复制行为的分析，用这些病毒一式三份在MOI 0.025下感染106个继代CEF细胞的单层(多循环分析)。将在指示时间的病毒输出量绘图，各数据点代表由三个独立孔获得的结果。B)106个人HeLa和HaCaT细胞以及猴CV-1细胞的单层用MVA-EGFP或MVA ds-EGFP在MOI 0.025下一式三份感染。将在感染后第3天的病毒输出量相对于每孔5×104TCID50的输入量的比率绘图。各数据点代表由三个独立孔获得的单一滴定结果。C)继代CEF细胞的单层用如正文中所述于DF-1细胞中传代1次(P1)或10次(P10)的指示病毒在MOI 10下感染5小时。使用从细胞分离的总RNA，通过RT-qPCR来测定受感染细胞中超过模拟的IFN-βmRNA诱导倍数，如图7的插图说明中所述。1：MVA-EGFP-P1；2：MVA-EGFP-P10；3：MVA-dsEGFP P1；4：MVA-dsEGFP P10；5：模拟。
图13显示C57BL/6wt、IPS-10/0和PKR0/0小鼠中由突变MVA-dsEGFP达成的细胞因子表达诱导。各组5只具有指示的品系(B6＝C57BL/6wt)的8-12周龄小鼠用指示的病毒在每只小鼠108TCID50的剂量下静脉内感染。在感染之后6小时将动物放血，并且使用来自BenderMedsystems的基于珠粒的流动式细胞测量测定来分析血清中如所指示的所选细胞因子的浓度。A)IFN-α。B)IFN-γ。C)IL-6。D)IL-18。E)CXCL1。F)CCL2。G)CCL5。
图14显示小鼠中由MVA-EGFP和突变MVA-dsEGFP达成的MVA特异性CD8T细胞诱导。A)各组3-5只8周龄C57BL/6小鼠用指示的病毒在108TCID50/小鼠的剂量下静脉内感染1次(A)。感染后7天收集脾，并且单细胞脾细胞混悬液用于通过使用B820-27表位特异性dextramer进行I类MHC dextramer染色来定量MVA特异性CD8T细胞。显示的是来自两个独立实验的组合结果。星号指示双尾未配对Student t检验中的p值<0.05。
图15显示由MVA-dsEGFP突变株达成的人MRC-5细胞中的IFN-βmRNA表达诱导。6孔板中的MRC-5细胞(人二倍体肺纤维母细胞)被模拟感染，或用对应于MVA wt的MVA-EGFP以及指示的具有渐进缩短的EGFP ORF重叠部分的MVA-dsEGFP重组体的粗储备物感染。此外，使用MVA-dsneo-ΔB15和MVA-ΔB15，并且使用从感染后5小时的细胞分离的总RNA，通过RT-qPCR来测定超过模拟的IFN-βmRNA诱导倍数，如图7的插图说明中所述。使用充当内源性对照的细胞18S rRNA的Ct值使IFN-βCt值标准化。显示的是相对于模拟感染细胞中的IFN-βmRNA水平，受感染细胞中的IFN-β转录物水平，表示为“IFN-βmRNA的诱导倍数”。1：MVA；2：MVA-EGFP；3：MVA-dsneo-ΔB15；4：MVA-ΔB15；5：MVA-dsEGFP；6：MVA-dsEGFP-2；7：MVA-dsEGFP-3；8：MVA-dsEGFP-4；9：MVA-dsEGFP-5；10：模拟。
图16显示MVA-dsE3L以及由MVA-dsE3L达成的IFN-β基因诱导的图示。A)突变MVA-dsE3L的示意图。指示由天然pE3L和插入pH5m启动子达成的E3L编码序列(黑色箭头)转录的方向。早期转录终止信号(ETTS)由垂直灰色条指示。灰色箭头指示ETTS潜在地具有活性所针对的转录方向。E3L ORF中的反义ETTS通过在不改变E3氨基酸序列的情况下使密码子内的摆动位置定点诱变而失活。由两个互补E3L转录物形成的潜在dsRNA链段由灰色条指示。B)6孔板中的MEF被模拟感染，或用指示的病毒的粗储备物在MOI 10下感染。MVA-EGFP对应于MVA wt。使用从感染后5小时的细胞分离的总RNA，通过RT-qPCR来测定超过模拟的IFN-βmRNA诱导倍数。用充当内源性对照的18S rRNA的Ct值校正IFN-βmRNA的Ct值。1：MVA-EGFP；MVA-dsEGFP；3：MVA-dsEGFP-5；4：MVA-dsEGFP-晚期；5：MVA-dsE3L。
图17显示B19R基因的氨基酸序列在许多痘病毒之间是保守的。A)、B)、C)和D)通过1.2.0版ClustalO以缺省设置产生的由猴痘病毒(SEQ ID NO:1)、西储(Western Reserve)痘苗病毒(“痘苗-WR”)(SEQ ID NO:2)、哥本哈根(Copenhagen)痘苗病毒(SEQ ID NO:3)、绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(“CVA”)(SEQ ID NO:4)、小鼠脱脚病病毒(ectromelia virus)(SEQ ID NO:5)、牛痘病毒(SEQ ID NO:6)、骆驼痘病毒(SEQ ID NO:7)、猪痘病毒(SEQ IDNO:8)和特纳河痘病毒(tanapox virus)(SEQ ID NO:9)编码的B19R基因和/或其同源物的氨基酸序列比对。E)显示在A)、B)、C)和D)部分中比对的B19R序列和/或其同源物的成对氨基酸序列同一性的表。
序列简述
SEQ ID NO:1[登记号Q5IXK2：IFN-α/β受体样分泌糖蛋白；猴痘病毒]：
MMKMKMMVRIYFVSLSLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMRDTLPAKDSKWLNPVCMFGGTMNDM
AALGEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDYVVKWERLEKNRRRQVSNKRVKHGDLWIANYTSKFSNR
RYLCTVTTKNGDCVQGVVRSHVWKPSSCIPKTYELGTYDKYGIDLYCGILYAKHYNNITWYKDN
KEINIDDFKYSQAGKELIIHNPELEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHRFKLIL
DPKINVTIGEPANITCSAVSTSLFVDDVLIEWKNPSGWIIGLDFGVYSILTSRGGITEATLYFENVT
EEYIGNTYTCRGHNYYEDKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:2[登记号P25213：可溶性干扰素α/β受体B19；痘苗病毒，西储病毒株]：
MTMKMMVHIYFVSLLLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMRDTLPAKDSKWLNPACMFGGTMNDIAAL
GEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDYVVKWERLEKNRRRQVSNKRVKHGDLWIANYTSKFSNRRYL
CTVTTKNGDCVQGlVRSHIRKPPSCIPKTYELGTHDKYGIDLYCGILYAKHYNNITWYKDNKEINI
DDIKYSQTGKELIIHNPELEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHRFKLILDPKIN
VTIGEPANITCTAVSTSLLIDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYSVLTSRGGITEATLYFENVTEEYIG
NTYKCRGHNYYFEKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:3[登记号Q5CAD5：IFN-α-β受体样分泌糖蛋白；痘苗病毒，哥本哈根病毒株]：
MTMKMMVHIYFVSLLLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMRDTLPAKDSKWLNPACMFGGTMNDIAAL
GEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDYVVKWERLEKNRRRQVSNKRVKHGDLWIANYTSKFSNRRYL
CTVTTKNGDCVQGIVRSHIKKPPSCIPKTYELGTHDKYGIDLYCGILYAKHYNNITWYKDNKEINI
DDIKYSQTGKKLIIHNPELEDSGRYNCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHRFKLILDPKIN
VTIGEPANITCTAVSTSLLIDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYSVLTSRGGITEATLYFENVTEEYIG
NTYKCRGHNYYFEKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:4[登记号A9J168：可溶性和细胞表面干扰素-α/β受体；痘苗病毒，安卡拉病毒株(CVA)]：
MKMTMKMMVHIYFVSLLLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMRDTLPAKDSKWLNPACMFGGTMNDI
AALGEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDYVVKWERLEKNRRRQVSNKRVKHGDLWIANYTSKFSNR
RYLCTVTTKNGDCVQGIVRSHIKKPPSCIPKTYELGTHDKYGIDLYCGILYAKHYNNITWYKDNK
EINIDDIKYSQTGKKLIIHNPELEDSGRYNCYVHYDDVKIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHRFKLILDP
KINVTIGEPANITCTAVSTSLLIDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYSVLTSRGGITEATLYFENVTEE
YIGNTYKGRGHNYYFEKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:5[登记号Q9JFS5：IFN-α/β结合蛋白；小鼠脱脚病病毒]：
MMKMTMKMMVRIYFVSLSLSLSLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMRDTLPAKDSKWLNPSCMFGG
TMNDMAALGEPFSAKCPPIEDSLLSHRYNDKDNVVNWEKIGKTRRPLNRRVKNGDLWIANYTS
NDSHRRYLCTVTTKNGDCVQGIVRSHIRKPPSCIPETYELGTHDKYGIDLYCGILYAKHYNNITW
YKNNQELIIDGTKYSQSGQNLIIHNPELEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHR
FKLILDPKINVTIGEPANITCTAVSTSLLVDDVLIDWENPSGWIIGLDFGVYSILTSSGGITEATLYF
ENVTEEYIGNTYTCRGHNYYFDKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:6[登记号Q5CAC3：可溶性干扰素-α/β受体；牛痘病毒]：
MKMTMKMMVHIYFVSLSLSLSLLLFHSYAIDIENEITEFFNKMKDTLPAKDSKWLNPACMFGGT
MNDMAAIGEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDKDNVVNWEKIGKTRRPLNRRVKNGDLWIANYTSN
DSRRRYLCTVITKNGDCIQGIVRSHVRKPSSCIPEIYELGTHDKYGIDLYCGIIYAKHYNNITWYK
DNKEINIDDIKYSQTGKELIIHNPALEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVIPSQDHRFKLI
LDPKINVTIGEPANITCTAVSTSLLVDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYSVLTSRGGITEATLYFEN
VTEEYIGNTYKCRGHNYYFEKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:7[登记号Q5CA87：可溶性干扰素-α/β受体；骆驼痘病毒]：
MKMTMKMMVHIYFVSLSLSLLLFHSYAIDIENEITDFFNKMKDILPTKDSKWLNPACMFGGTTND
MAAIGEPFSAKCPPIEDSLLSHRYKNKDNVVNWEKIGKTKRPLNRRVKNGDLWIANYTSNDSR
RRYLCTAITKNGDCIQGIIRSHVRKPSSCIPEIYELGTHDKYGIDLYCGIIYAKHYNNITWYKDNKEI
NIDDIKYSQTGKELIIHNPALEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVVSRCKILTVTPSQDHRFKLILDPK
INVTIGEPANITCTAVSTSLLVDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYSVLTSRGGITEATLYFENVTEE
YIGNTYKCRGHNYYFEKTLTTTVVLE
SEQ ID NO:8[登记号Q8V3G4：IFN-α/β样结合蛋白；猪痘病毒，猪/Nebraska/17077-99/1999病毒株]：
MISIKKYNILLFIISFIYCSADNDIDSLYEGYKEFLDPKLKQFLNDNCTYRGYRDFFLYNEEPANIKC
PLLNDILLRQKYHNYTILWKKLGERSSRLLNTHGSIFLDFFPYKSELRGSVYECMIILNNTCDQFIL
KLNDIRSNPVCYHNDYKVHTNIEIFGNVINLQYDYITWYKNNSEIIIDGYKYSNQSRRLLVYNTTY
NDSGIYYCNAYTTHGKNTYISRRCSSVSIHSHSYYDFYIEHINNITYIDPDSENTQIYCKAISYSNS
SYILIYWEDEYGGYIYDNGIYQYDNITLIGNEKVYMSILVLEKSAYYRYVNNTFTCLATSVYVEKK
TTTTLVIKKT
SEQ ID NO:9[登记号A7XCS4：I型IFN受体；特纳河痘病毒}：
MKITYIILLICKEIICDNSGDDMYDYIANGNIDYLKTIDNDIINLVNKNCSFREIKTTLAKENEVLMLK
CPQLDNYILPWKYMNRSEYTVTWKNISNSTEYNNTRIENNMLMFFPFYNLQAGSKYLCTVSTN
KSCDQSVVIVKKSFYSNNCMLSEAKENDNFEIYCGILHAKYNTIKWFKEEKEITNNYKYYTKLGG
YVKGINNVTYSDSGKYVCEGYYIDVLKNITYTAKRCVNLTVIPNTYYDFFIVDIPNVTYAKNNKKL
EVNCTSFVDINSYDYILTSWLYNGLYLPLGVRIYQLYSTDIFFENFIYRTSTLVFENVDISDDNKTF
ECEALSVTLKKIKYTTIKVEK
某些实施方案的描述
现将详细提及其实例在附图中加以说明的示例性实施方案。
定义
除非另外指示，否则本文技术术语是由分子生物学领域普通技术人员根据常规用法所使用。对于分子生物学中的常见术语，常规用法可见于标准教科书中，例如像由Benjamin Lewin所著的Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)；The Encyclopedia of Molecular Biology,由BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及由Robert A.Meyers所编的Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个提及物。因此，举例来说，提及“一个表位”包括提及一个或多个表位，而提及“所述方法”包括提及为本领域普通技术人员所知的可被修改或替代本文提供的方法的等效步骤和方法。
除非另外指示，否则位于一系列要素之前的术语“至少”应被理解为涉及所述系列中的每个要素。本领域技术人员将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文提供的本发明的特定实施方案的许多等效物。所述等效物由本发明涵盖。
在整篇本说明书和随后权利要求中，除非上下文另外要求，否则用词“包含(comprise)”和变化形式(诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)意指“包括”，并且因此包括一个陈述的整数或步骤或一组整数或步骤，并且排除任何其它整数或步骤或任何其它组整数或步骤。当在本文中使用时，术语“包含”可被术语“含有”、“包括”或“具有”替代。任何以上提及的术语(包含、含有、包括、具有)无论何时在本文中在本发明的一方面或实施方案的情形下使用都可被术语“由…组成”替代。
当在本文中使用时，术语“由…组成”排除未在权利要求中指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”排除“将影响在权利要求的其余部分中限定的产物或方法的基本和新型特征的”任何材料或步骤。Water Techs.Corp.v.Calco Ltd.,7U.S.P.Q.2d 1097,1102(Fed.Cir.1988)。
如本文所用，在多个叙述要素之间的连接词“和/或”应被理解为涵盖个别选项与组合选项两者。举例来说，当两个要素由“和/或”联合时，第一选项涉及可在无第二要素下应用第一要素。第二选项涉及可在无第一要素下应用第二要素。第三选项涉及可同时应用第一和第二要素。这些选项中的任一个都应被理解为落在含义内，并且因此应被理解为满足如本文所用的术语“和/或”的要求。可并行应用超过一个选项也应被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以引用的方式整体并入本文。在起冲突的情况下，将以包括所有定义的本说明书为准。
佐剂。媒介物用于增强抗原性。佐剂可包括：(1)其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的混悬液；(2)油包水乳液，其中抗原溶液被乳化在矿物油中(弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant))，有时包括杀灭的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以通过抑制抗原降解和/或导致巨噬细胞流入和/或活化免疫细胞来进一步增强抗原性；(3)免疫刺激性寡核苷酸，例如像包括CpG基序的那些也可用作佐剂(例如参见美国专利号6,194,388；和美国专利号6,207,646)；和(4)纯化或重组蛋白，诸如共刺激分子。示例性佐剂包括但不限于B7-1、ICAM-1、LFA-3和GM-CSF。
抗原；抗原决定簇；表位。可在动物中刺激产生抗体或CD4+或CD8+T细胞应答的化合物、组合物或物质包括被注射或吸收至动物中的组合物。抗原与免疫系统反应以产生抗原特异性体液或细胞免疫应答。术语“抗原”包括特定化合物、组合物或物质的所有相关表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上由B细胞和/或T细胞对其起应答的单独或与另一蛋白质(例如像主要组织相容性复合物(“MHC”)蛋白质或T细胞受体)联合的位点。T细胞表位由8至约20个氨基酸的连续链段形成。B细胞表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的二级和/或三级折叠而毗连的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的B细胞表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常被丧失。B细胞表位通常包括至少5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸—但通常小于20个氨基酸—呈独特空间构象。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线结晶学和2维核磁共振。参见例如“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology,第66卷,GlennE.Morris编(1996)。
抗原可为组织特异性(或组织相关)抗原或疾病特异性(或疾病相关)抗原。那些术语并非互相排斥的，因为组织特异性抗原也可为疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数目的组织中表达。组织特异性抗原包括例如前列腺特异性抗原(“PSA”)。疾病特异性抗原伴随疾病过程同时表达，其中抗原表达与特定疾病的显现相关联或预测特定疾病的显现。疾病特异性抗原包括例如与某些类型的乳腺癌相关的HER-2或与前列腺癌相关的PSA。疾病特异性抗原可为由T细胞或B细胞识别的抗原。组织和/或疾病特异性抗原可包括但不限于细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或肿瘤相关抗原或病毒抗原。
细菌抗原。即源于一种或多种例如像以下的细菌种类或其菌株的抗原：炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucellacanis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli)、肠道病源性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichia coli)、大肠杆菌)157:H7、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内氏痢疾杆菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
真菌抗原。即源于一种或多种例如像以下的真菌种类或其菌株的抗原：棒状曲霉(Aspergillus clavatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、皱褶念珠菌(Candida rugosa)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、格特隐球酵母(Cryptococcus gattii)、罗氏隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、杰氏肺囊虫(Pneumocystisjirovecii)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、纸葡萄穗霉(Stachbotryschartarum)、须癣(Tinea barbae)、头癣(Tinea captitis)、体癣(Tinea corporis)、股癣(Tinea cruris)、面癣(Tinea faciei)、隐匿癣(Tinea incognito)、黑癣(Tinea nigra)、花斑癣(Tinea versicolor)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)。
寄生虫抗原。即源于一种或多种例如像以下的寄生虫种类或其株系的抗原：异尖线虫属种(Anisakis spp.)、巴贝虫属种(Babesia spp.)、浣熊拜林蛔线虫(Baylisascarisprocyonis)、隐孢子虫属种(Cryptosporidium spp.)、卡耶塔环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)、裂头绦虫属种(Diphyllobothrium spp.)、麦地那龙线虫(Dracunculusmedinensis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、十二指肠贾第鞭毛虫(Giardiaduodenalis)、肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinalis)、兰氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)、利什曼原虫属种(Leishmania sp.)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及裂体吸虫(Schistosoma haematobium)、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicum)、绦虫属种(Taenia spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、旋毛线虫(Trichinella spiralis)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。
肿瘤相关抗原。即过度表达或主要表达在特定肿瘤类型上的抗原，例如像5-α-还原酶、α-胎蛋白(“AFP”)、AM-1、APC、April、B黑素瘤抗原基因(“BAGE”)、β-连环蛋白(catenin)、Bcl12、bcr-abl、Brachyury、CA-125、卡斯帕酶(caspase)-8(“CASP-8”，也称为“FLICE”)、组织蛋白酶(Cathepsin)、CD19、CD20、CD21/补体受体2(“CR2”)、CD22/BL-CAM、CD23/FcεRII、CD33、CD35/补体受体1(“CR1”)、CD44/PGP-1、CD45/白血球共同抗原(“LCA”)、CD46/膜辅因子蛋白(“MCP”)、CD52/CAMPATH-1、CD55/衰减加速因子(“DAF”)、CD59/保护素(protectin)、CDC27、CDK4、癌胚抗原(“CEA”)、c-myc、环加氧酶(cyclooxygenase)-2(“cox-2”)、结肠直肠癌缺失基因(“DCC”)、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基(farnesyl)转移酶、纤维母细胞生长因子-8a(“FGF8a”)、纤维母细胞生长因子-8b(“FGF8b”)、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、G黑素瘤抗原基因家族(“GAGE家族”)、促胃液素(gastrin)17、促胃液素释放激素、神经节苷脂(ganglioside)2(“GD2”)/神经节苷脂3(“GD3”)/神经节苷脂-单唾液酸-2(“GM2”)、促性腺激素(gonadotropin)释放激素(“GnRH”)、UDP-GlcNAc:R1Man(α1-6)R2[GlcNAc向Man(α1-6)]β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(“GnT V”)、GP1、gp100/Pme117、gp-100-in4、gp15、gp75/酪氨酸相关蛋白-1(“gp75/TRP-1”)、人绒毛膜促性腺激素(“hCG”)、类肝素酶(heparanase)、Her2/neu、人乳腺肿瘤病毒(“HMTV”)、70千道尔顿热激蛋白(“HSP70”)、人端粒酶逆转录酶(“hTERT”)、胰岛素样生长因子受体-1(“IGFR-1”)、白介素-13受体(“IL-13R”)、诱导性一氧化氮合成酶(“iNOS”)、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、黑素瘤抗原编码基因1(“MAGE-1”)、黑素瘤抗原编码基因2(“MAGE-2”)、黑素瘤抗原编码基因3(“MAGE-3”)、黑素瘤抗原编码基因4(“MAGE-4”)、乳腺球蛋白(mammaglobin)、MAP17、Melan-A/由T细胞识别的黑素瘤抗原-1(“MART-1”)、间皮素(mesothelin)、MIC A/B、MT-MMP、粘蛋白(mucin)、睾丸特异性抗原NY-ESO-1、骨粘连蛋白(osteonectin)、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白(melanotransferrin)、PAI-1、血小板源性生长因子(“PDGF”)、μPA、PRAME、probasin、祖细胞生成素(progenipoietin)、前列腺特异性抗原(“PSA”)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX家族、STAT3、STn、TAG-72、转化生长因子-α(“TGF-α”)、转化生长因子-β(“TGF-β”)、胸腺素-β-15、肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、TP1、TRP-2、酪氨酸酶、血管内皮生长因子(“VEGF”)、ZAG、p16INK4和谷胱甘肽-S转移酶(“GST”)。
病毒抗原。即源于一种或多种例如像以下的病毒类型或其分离株的抗原：腺病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagicfever virus)、巨细胞病毒(“CMV”)、登革病毒(dengue virus)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，“EBV”)、瓜纳瑞托病毒(Guanaritovirus)、1型单纯疱疹病毒(“HSV-1”)、2型单纯疱疹病毒(“HSV-2”)、8型人疱疹病毒(“HHV-8”)、甲型肝炎病毒(“HAV”)、乙型肝炎病毒(“HBV”)、丙型肝炎病毒(“HCV”)、丁型肝炎病毒(“HDV”)、戊型肝炎病毒(“HEV”)、人免疫缺陷病毒(“HIV”)、流感病毒、胡宁病毒(Juninvirus)、拉沙病毒(Lassa virus)、马丘坡病毒(Machupo virus)、马伯格病毒(Marburgvirus)、麻疹病毒、人间质肺炎病毒、腮腺炎病毒、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、人乳头状瘤病毒(“HPV”)、副流感病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合性病毒(“RSV”)、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、沙比亚病毒(Sabia virus)、重度急性呼吸综合征病毒(“SARS”)、中东呼吸综合征冠状病毒(“MERS-CoV”)、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、西尼罗病毒和黄热病毒。
cDNA(互补DNA)。即缺乏内部非编码区段(内含子)和决定转录起始和终止的时机和位置的调控序列的一段DNA。cDNA可在实验室中通过逆转录从细胞提取的信使RNA(“mRNA”)来合成。
保守性变体。“保守性”变体是具有一个或多个不实质上影响或降低蛋白质或其抗原性表位的活性或抗原性的氨基酸取代的变异蛋白质或多肽。通常，保守性取代是其中特定氨基酸被具有相同或类似化学特征的另一氨基酸取代的那些。举例来说，用诸如精氨酸或谷氨酰胺的另一碱性氨基酸替换诸如赖氨酸的碱性氨基酸是保守性取代。术语保守性变体也包括使用取代的氨基酸而非未取代的亲本氨基酸，前提是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽免疫反应，和/或取代的多肽保留未取代的多肽的功能。非保守性取代是用具有不同化学特征的氨基酸替换特定氨基酸，并且通常降低蛋白质或其抗原性表位的活性或抗原性的那些。
保守性取代的特定非限制性实例包括以下实例：
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CD4。即分化簇因子4，一种介导与II类MHC分子的相互作用的T细胞表面蛋白。表达CD4的细胞，被称为“CD4+”细胞，常常是辅助T(例如“TH”、“TH1”或“TH2”)细胞。
CD8。即分化簇因子8，一种介导与I类MHC分子的相互作用的T细胞表面蛋白。表达CD8的细胞，被称为“CD8+”细胞，常常是细胞毒性T(“CTL”)细胞。
共刺激分子。T细胞活化通常要求T细胞受体(“TCR”)与肽-MHC复合物以及通过共刺激分子与它的配体的相互作用递送的第二信号结合。共刺激分子是在结合于它们的配体时递送为T细胞活化所需的第二信号的分子。T细胞上最为熟知的共刺激分子是CD28，其结合B7-1或B7-2。也可提供为T细胞活化所必需的第二信号的其它共刺激分子包括细胞内粘附分子-1(“ICAM-1”)、细胞内粘附分子-2(“ICAM-2”)、白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、白细胞功能相关抗原-2(“LFA-2”)和白细胞功能相关抗原-3(“LFA-3”)。B7-1、ICAM-1和LFA-3的组合被称为“TRICOM”，代表“共刺激分子的三联体(TRIad of COstimulatoryMolecules)”。
树突细胞(DC)。树突细胞是初级免疫应答中涉及的主要抗原递呈细胞(“APC”)。树突细胞包括浆细胞样树突细胞和骨髓性树突细胞。它们的主要功能在于获得组织中的抗原，向淋巴器官迁移，并且递呈抗原以活化T细胞。不成熟树突细胞起源于骨髓中，并且以不成熟细胞形式驻留在外周中。
双链RNA(dsRNA)。根据本发明的任何实施方案的包含表达增加数目或增加量的dsRNA(例如表达过量dsRNA)的异源性或天然核酸的重组痘病毒触发细胞因子、趋化因子、效应物分子的释放和/或共刺激分子的表达增加，或活化一种或多种模式识别受体(PRR)和/或活化细胞(例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞或其它类型的免疫细胞)，并且因此优选触发或诱导增强的先天性免疫应答。过量dsRNA可通过任何适合方法，优选通过使用用以测定增强的先天性免疫应答的方法或如实施例中所述的任何方法，优选是根据实施例16的方法来测定。优选地，过量dsRNA可被定义为当使用本发明的重组痘病毒载体时，在感染早期的产生增强的先天性免疫应答的dsRNA的量。更优选地，过量dsRNA可被定义为相较于对照，在用包含表达或产生dsRNA的异源性核酸的重组痘病毒进行病毒感染的早期期间转录的dsRNA的量。过量dsRNA可通过使用具有早期活性的痘病毒启动子(例如即刻早期、早期或早期/晚期痘病毒启动子)驱动具有长度是至少100bp的优选相同或重叠序列链段的有义和反义RNA的转录来产生。测定过量dsRNA的另一方法在于测定一种或多种PRR的活化增强，所述PRR例如是如通过PKR底物的磷酸化(例如eIF2α在位置丝氨酸-51处)增加所测定的PKR，如实施例7中所示。优选地，相较于对照，PKR底物的增加的磷酸化(例如eIF2α在位置丝氨酸-51处)增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
感染早期。痘病毒的基因表达以级联方式受调控。病毒基因的早期转录由与病毒粒子一起被携带进入新近受感染细胞中的病毒转录机构驱动，并且受控于由早期病毒转录复合物识别的早期病毒启动子。熟知的是一旦病毒粒子和宿主膜已融合，并且病毒核心已被释放至细胞质中，构成病毒基因表达的内源性RNA聚合酶和包壳化转录因子即开始早期病毒基因表达的第一级联，其在早期启动子的控制下合成病毒mRNA。通常，感染早期(例如早先时期)持续在基因组复制之前约1至2小时。优选地，感染早期是病毒粒子(例如重组痘病毒)结合宿主细胞与开始病毒基因组复制(例如重组痘病毒基因组复制)之间的时间间隔。在早期蛋白质之中的是用于病毒dsDNA基因组复制以及仅可在开始病毒基因组复制之后开始的称为中期的下一转录时期的转录因子。优选地，感染早期在感染的或在接种之后的30分钟、1小时或2小时内，优选在病毒核心已被释放至细胞的细胞质中之后。
表达控制序列。即调控它们操作性地与其连接的异源性核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控核酸序列的转录和/或翻译时，表达控制序列是操作性地连接于所述核酸序列。因此，术语“表达控制序列”涵盖启动子、增强子、转录终止子、起始密码子、内含子的剪接信号以及终止密码子。术语“控制序列”至少包括其存在可影响异源性核酸序列的转录和/或翻译的组分，并且也可包括其存在是有利的其它组分，例如像前导序列和融合配偶体序列。
术语“表达控制序列”涵盖启动子序列。启动子是足以指引同源性或异源性基因的转录的最小序列。也包括足以致使启动子依赖性基因表达具有细胞类型特异性、组织特异性或可通过外部信号或试剂来诱导的那些启动子元件；所述元件可位于基因的5'或3'区域中。术语“启动子”涵盖组成性启动子与诱导性启动子两者。参见例如Bitter等,Methods inEnzymology 153:516-544(1987)。示例性启动子序列包括但不限于逆转录病毒长末端重复序列(“LTR”)、腺病毒主要晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子(“Pr7.5”)、痘苗病毒合成早期/晚期启动子(“sE/L”)、PrSynIIm启动子、PrLE1启动子、PrH5m启动子、PrS启动子、杂交早期/晚期启动子或牛痘病毒ATI启动子。其它适合启动子包括但不限于SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、人CMV即刻早期I启动子以及各种痘病毒启动子，包括但不限于以下痘苗病毒或源自MVA的启动子：30K启动子、I3启动子、sE/L启动子、Pr7.5K启动子、40K启动子、C1启动子、PrSynIIm启动子、PrLE1启动子、PrH5m启动子、PrS启动子、杂交早期/晚期启动子PrHyb、PrS5E启动子、PrA5E启动子、Pr13.5长启动子和Pr4LS5E启动子；牛痘病毒ATI启动子或以下源自鸡痘的启动子：Pr7.5K启动子、I3启动子、30K启动子或40K启动子。
异源性。即源于单独遗传来源或物种。对于改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA”)是异源性的多肽源于不包括在MVA基因组内的核酸，所述多肽例如像细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤相关抗原或病毒抗原。所述术语被广泛解释为涵盖编码通常不由MVA基因组编码的RNA或蛋白质的任何非天然核酸或由这种非天然核酸编码的任何非天然蛋白质。
同源物；变体。术语“同源物”或“变体”在涉及基因或蛋白质序列时涵盖所论述的基因或蛋白质的天然氨基酸序列、仍然能够在宿主中引发免疫应答的蛋白质片段、以及蛋白质和蛋白质片段的同源物或变体，包括例如糖基化蛋白质或多肽。因此，蛋白质和多肽不限于特定天然氨基酸序列，而是涵盖与天然序列相同的序列以及对天然序列的修饰形式，诸如缺失、添加、插入和取代形式。优选地，所述同源物或变体与参照蛋白质或多肽具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、至少约90％、91％、92％、93％或94％、至少约95％、96％、97％、98％或99％、或约100％氨基酸序列同一性。术语同源物或变体也涵盖截短、缺失或另外修饰的核苷酸或蛋白质序列。
术语同源物或变体也涵盖天然序列的简并变体。简并变体是编码蛋白质或其片段的多核苷酸，其包括含有不同于天然或野生型基因序列，但仍然指定相同氨基酸序列的密码子的序列。遗传密码指定20种天然氨基酸，其中大多数由超过一种密码子编码。因此，遗传密码是冗余或简并密码。所有简并核苷酸序列都涵盖在本公开中，前提是由简并多核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列保持不变。
用于确定氨基酸序列之间的序列同一性的技术在本领域中是已知的。两个或更多个序列可通过确定它们的“同一性百分比”来比较。两个序列的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度，并且乘以100。
关于本文所述的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在对准序列以及必要时引入空位以获得最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参照序列(即所述参照序列所源于的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域普通技能水平的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对准所需的任何算法。
宿主细胞。即其中载体可增殖，并且它的DNA可被表达的细胞。细胞可为原核的(例如细菌)或真核的(例如哺乳动物或人)。所述术语也涵盖原始宿主细胞的子代，即使所有子代都可因为可存在发生在复制期间的突变而不与亲本细胞相同。
免疫应答。即诸如B细胞、T细胞或单核细胞的免疫系统细胞对刺激物的适应性应答。适应性应答是对特定抗原的应答，并且因此描述为“具有抗原特异性”。适应性免疫应答可包括由B细胞产生针对特定抗原的抗体、由CD4+辅助T细胞达成T细胞辅助、扩大抗原特异性CD8+T细胞(细胞毒性T淋巴细胞，“CTL”)的群体、CD8+T细胞针对表达特定抗原的细胞的细胞毒性活性、或另一类型的抗原特异性免疫应答。
免疫原性组合物。如本文所用，术语“免疫原性组合物”是指包含重组痘病毒的组合物，所述重组痘病毒包含表达早期双链RNA(dsRNA)的异源性核酸。所述术语也涵盖包含表达早期dsRNA的异源性核酸和编码异源性疾病相关抗原的核酸序列的重组痘病毒。在某些实施方案中，异源性疾病相关抗原是感染性疾病相关抗原或肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，疾病相关抗原是感染性疾病抗原。在某些实施方案中，感染性疾病抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。重组痘病毒可任选包括编码例如一种或多种如本文其它地方所述的共刺激分子的其它核酸。所述组合物可包括重组痘病毒，任选与一种或多种药学上可接受的载体一起配制。
“有需要的”。当关于增强免疫应答以及使用本文提供的重组痘病毒、免疫原性组合物和药物组合物的方法使用时，“有需要的”受试者可为已被诊断有由例如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染所致的医学病状或赘生病状(即癌症)或先前针对所述医学病状或所述赘生病状加以治疗的个体。就预防而言，有需要的受试者也可为处于显现医学病状的风险下(例如具有所述病状的家族史、指示所述病状的风险的生活方式因素等)的受试者。
淋巴细胞。即身体的免疫防御中涉及的一种类型的白血细胞。存在两种主要类型的淋巴细胞：B细胞和T细胞。
主要组织相容性复合物(“MHC”)。通用符号意图涵盖不同物种中的所述组织相容性抗原系统，包括人白细胞抗原(“HLA”)。
哺乳动物。这个术语包括人与非人哺乳动物两者。类似地，术语“受试者”包括人与兽医学受试者两者。
开放阅读框(“ORF”)。即在真核起始密码子(ATG)之后的一系列核苷酸密码子，其指定无任何内部终止密码子的能够被翻译以产生多肽的一系列氨基酸，或无任何内部终止密码子的能够被转录以产生RNA分子(例如像核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA))的一系列核苷酸。
可操作地连接。当以与第二核酸序列呈功能关系放置第一核酸序列时，所述第一核酸序列被可操作地连接于所述第二核酸序列。举例来说，如果将启动子放置在其中它可指引编码序列的转录的位置中，那么所述启动子被可操作地连接于所述编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当有必要接合两个蛋白质编码区时，处于同一阅读框中。
药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上适合的载体”等是指适于经肠或胃肠外施加的不与提取物有害反应的药物赋形剂，例如药学上、生理上可接受的有机或无机载体物质。Remington’s Pharmaceutical Sciences,由E.W.Martin所著,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述使用适于施用本文公开的载体和组合物的常规药学上可接受的载体的组合物和制剂。通常，所用载体的性质取决于所采用的特定施用模式。举例来说，胃肠外制剂通常包含可注射流体作为媒介物，所述流体包括药学上和生理上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(诸如粉末、丸剂、片剂或胶囊)，常规无毒固体载体包括例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。药物组合物也可含有少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如像乙酸钠或去水山梨醇单月桂酸酯。
“药学上有效量”、“治疗有效量”、“有效量”。如本文所用，那些术语(及其同源词)是指对指定病状(例如医学病状、疾病、感染或病症)或它的一种或多种症状产生所需药理学和/或生理作用，和/或完全或部分预防所述病状或其症状发生，和/或就部分或完全治愈所述病状和/或可归因于所述病状的不利影响而言可为治疗性的量。“药学上有效量”或“治疗有效量”将视所施用的组合物、所治疗/预防的病状、所治疗或预防的病状的严重性、个体的年龄和相对健康状况、施用途径和形式、照护医学或兽医学从业者的判断、以及由熟练技术人员鉴于本文提供的教义而了解的其它因素而变化。
多核苷酸；核酸。术语多核苷酸是指长度是至少300个碱基的核酸聚合物，由核糖核苷酸(即RNA)或脱氧核糖核苷酸(即DNA或cDNA)组成，并且能够或不能够编码多肽或蛋白质。所述术语包括单链和双链形式的DNA。
多肽或蛋白质。术语多肽或蛋白质是指长度是至少100个氨基酸，通常长度大于30个氨基酸的聚合物。
痘病毒。术语“痘病毒”是指痘病毒科的以下两个亚科中的任一个：脊椎动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)。脊椎动物痘病毒亚科的成员感染脊椎动物。昆虫痘病毒亚科的成员感染昆虫(即无脊椎动物)。无论是否具有增殖性，术语“痘病毒”也指脊椎动物痘病毒亚科的任何属(例如禽痘病毒、羊痘病毒、野兔痘病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、猪痘病毒和亚塔痘病毒)，包括可感染人的那四个(正痘病毒、副痘病毒、亚塔痘病毒和软疣痘病毒)的成员，但优选是正痘和/或禽痘病毒。术语“痘病毒”也指昆虫痘病毒亚科的任何属(例如α-昆虫痘病毒、β-昆虫痘病毒和γ-昆虫痘病毒)的成员。
禽痘病毒包括金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、燕八哥痘病毒、鸽痘病毒和鹌鹑痘病毒。羊痘病毒包括绵羊痘病毒、山羊痘病毒和结节性皮肤病病毒。野兔痘病毒包括粘液瘤病毒、休普纤维瘤(Shope fibroma)病毒(也称为兔纤维瘤病毒)、野兔纤维瘤病毒和松鼠纤维瘤病毒。软疣痘病毒包括接触传染性软疣病毒。正痘病毒包括水牛痘病毒、骆驼痘病毒、牛痘病毒、小鼠脱脚病病毒、猴痘病毒、浣熊痘病毒、天花病毒(smallpox virus)(也称为天花病毒(variola virus))和痘苗病毒。术语“痘苗病毒”是指野生型痘苗病毒与随后分离的各种减毒病毒株或分离株中的任一个，包括例如西储痘苗病毒、哥本哈根痘苗病毒、Dryvax(也称为惠氏(Wyeth)痘苗病毒)、ACAM2000、绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(CVA)、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)和巴伐利亚诺迪克改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA-BN”)。副痘病毒包括牛丘疹性口腔炎病毒、ORF病毒、新西兰红鹿副痘病毒和伪牛痘病毒。猪痘病毒(Suipox virus)包括猪痘病毒(swinepox virus)。亚塔痘病毒包括特纳河痘病毒和亚巴猴肿瘤病毒(yabamonkey tumor virus)。
术语“改良型安卡拉痘苗病毒”或“MVA”是指通过用鸡胚胎纤维母细胞使皮肤安卡拉痘苗病毒株[绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(CVA)；对于综述，参见Mayr等(1975),Infection 3:6-14]连续传代超过570次而产生的病毒。CVA持续许多年被维持在Vaccination Institute,Ankara,Turkey，并且用作人疫苗接种的基础。然而，由于常常发生与痘苗病毒相关的重度疫苗接种后并发症，所以有若干尝试来产生减毒程度更大的更安全天花疫苗。
在1960年至1974年的时期期间，Anton Mayr教授通过用CEF细胞达成超过570次连续传代来使CVA成功减毒[Mayr等(1975)]。已在多种动物模型中显示所得MVA是无毒性的[Mayr,A.和Danner,K.(1978),Dev.Biol.Stand.41:225-234]。作为早期开发呈前天花疫苗形式的MVA的一部分，有临床试验在处于由痘苗所致的不利反应的风险下的受试者中与Lister Elstree组合使用MVA-517[Stickl(1974),Prev.Med.3:97-101；Stickl和Hochstein-Mintzel(1971),Munich Med.Wochenschr.113:1149-1153]。在1976年，源于MVA-571种子储备物(对应于第571代)的MVA在德国被注册为采用两阶段胃肠外天花疫苗接种程序的初免疫苗。随后，MVA-572用于约120,000名白种人个体中，大多数儿童年龄在1岁与3岁之间，未报道有重度副作用，尽管许多受试者处于与痘苗相关的并发症的风险较高的群体之中(Mayr等(1978),Zentralbl.Bacteriol.(B)167:375-390)。MVA-572以ECACCV94012707保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures)。
由于用于使MVA减毒的传代，视用CEF细胞达成的传代数目而定，存在许多不同病毒株或分离株。举例来说，MVA-572在德国在天花根除计划期间使用，而MVA-575被广泛用作兽医学疫苗。MVA-575于2000年12月7日以保藏号V00120707保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)。通过用原代鸡胚胎纤维母细胞使CVA连续增殖(超过570代)来获得减毒的CVA-病毒MVA(改良型安卡拉痘苗病毒)。
尽管Mayr和同事在1970年代期间证明MVA在人和哺乳动物中是高度减毒和无毒性的，但某些研究者已报道MVA在哺乳动物和人细胞系中并非完全减毒的，因为残余复制可能发生在这些细胞中[Blanchard等(1998),J.Gen.Virol.79:1159-1167；Carroll和Moss(1997),Virology 238:198-211；美国专利号5,185,146；Ambrosini等(1999),J.Neurosci.Res.55:569]。据设想这些出版物中报道的结果已用MVA的各种已知病毒株获得，因为所用病毒在它们的性质方面，特别是在它们于各种细胞系中的生长行为方面基本上不同。所述残余复制出于各种原因是不合需要的，所述原因包括与在人中使用关联的安全性顾虑。
对于开发更安全产品(诸如疫苗或药物)而言具有增强的安全性概况的MVA病毒株已由巴伐利亚诺迪克开发：MVA由巴伐利亚诺迪克进一步传代并指定为MVA-BN。相较于祖先CVA病毒，MVA以及MVA-BN缺乏约13％(主要来自六个区域的26.6kb)的基因组。缺失影响许多毒性和宿主范围基因以及为形成A型包涵体所需的基因。对应于第583代的MVA-BN的样品于2000年8月30日以编号V00083008保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。
MVA-BN可附着于并进入人细胞，在所述人细胞中，病毒编码的基因被极其高效表达。然而，不发生子代病毒的组装和释放。MVA-BN强烈适应于原代鸡胚胎纤维母细胞(CEF)细胞，并且不在人细胞中复制。在人细胞中，病毒基因被表达，并且不产生感染性病毒。根据美国疾病控制和预防中心所说，MVA-BN被分类为1级生物安全性生物体。MVA-BN和衍生物的制剂已向许多类型的动物以及超过4000名人受试者(包括免疫缺陷个体)施用。所有疫苗接种都已被证明是大体上安全和良好耐受的。尽管MVA-BN具有高减毒性和降低的毒性，但在临床前研究中，已显示它会引发对痘苗和由克隆至MVA基因组中的基因编码的异源性基因产物的体液免疫应答与细胞免疫应答两者[E.Harrer等(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等(2003),Hum.Gene Ther.14(14):1347-1360；M.Di Nicola等(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390]。
术语MVA的“衍生物”或“变体”是指与如本文所述的MVA展现基本上相同复制特征，但在它们的基因组的一个或多个部分方面展现差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或变体在人和小鼠中，甚至在重度免疫遏制小鼠中未能体内繁殖性复制。更具体来说，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体优选也能够在鸡胚胎纤维母细胞(CEF)中繁殖性复制，但不能够在人角质化细胞细胞系HaCat[Boukamp等(1988),J.Cell.Biol.106:761-771]、人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC号85120602)和人子宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC号CCL-2)中繁殖性复制。另外，在HeLa细胞和HaCaT细胞系中，MVA-BN的衍生物或变体具有的病毒扩增比率比MVA-575小至少2倍、更优选3倍。关于MVA变体的这些性质的测试和测定描述于两者均以引用的方式并入本文的WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中。
病毒的扩增或复制通常表示为由受感染细胞产生的病毒(输出)与当初原先用于感染细胞的量(输入)的比率，被称为“扩增比率”。扩增比率“1”阐释其中由受感染细胞产生的病毒的量与初始用于感染细胞的量相同的扩增状态，这意味着受感染细胞容许病毒感染和繁殖。相反，扩增比率小于1(即输出相较于输入水平降低)指示缺乏繁殖性复制以及因此病毒减毒。
基于MVA的疫苗的优势包括它们的安全性概况以及可用于大规模疫苗生产。临床前测试已揭示MVA-BN相较于其它MVA病毒株显示优越减毒性和功效(WO 02/42480)。MVA-BN病毒株的另一性质是当相较于DNA初免/痘苗病毒加强免疫方案时，能够在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强免疫方案中诱导大致上相同水平的免疫性。
由于作为本文所述的最优选实施方案的重组MVA-BN病毒在哺乳动物细胞中明显缺乏复制以及它们的明确确定的无毒性，所以它们被视为是安全的。此外，除它的功效之外，工业规模制造的可行性也可为有益的。另外，基于MVA的疫苗可递送多种异源性抗原，并且允许同时诱导体液免疫性和细胞免疫性。
在另一方面，适于产生重组病毒的MVA病毒株可为病毒株MVA-572、MVA-575或任何类似减毒的MVA病毒株。也适合的可为突变MVA，诸如缺失型绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(dCVA)。dCVA包含MVA基因组的六个缺失位点，被称为缺失I(del I)、缺失II(del II)、缺失III(del III)、缺失IV(del IV)、缺失V(del V)和缺失VI(del VI)。缺失位点特别适用于插入多个异源性序列。dCVA可在人细胞系(诸如人293、143B和MRC-5细胞系)中繁殖性复制(扩增比率大于10)，此则使得能够通过适用于基于病毒的疫苗接种策略的进一步突变或减毒来达成优化(参见例如WO 2011/092029)。
初免-加强免疫疫苗接种。术语“初免-加强免疫疫苗接种”是指使用首先初免注射以特定抗原为目标的疫苗，随后在各种间隔下进行一次或多次相同疫苗抗原的加强免疫注射的疫苗接种策略。关于递送疫苗抗原的疫苗模态(RNA、DNA、蛋白质、载体、病毒样粒子)，初免-加强免疫疫苗接种可为同质或异质的。同质初免-加强免疫疫苗接种使用包含相同免疫原和载体的疫苗进行初免注射与一次或多次加强免疫注射两者。异质初免-加强免疫疫苗接种使用包含相同免疫原的疫苗进行初免注射与一次或多次加强免疫注射两者，但用于初免注射和一次或多次加强免疫注射的载体不同。举例来说，同质初免-加强免疫疫苗接种可使用包含表达免疫原和TRICOM的核酸的MVA载体进行初免注射与一次或多次加强免疫注射两者。相反，异质初免-加强免疫疫苗接种可使用包含表达免疫原和TRICOM的核酸的MVA载体进行初免注射，并且使用包含表达免疫原和TRICOM的核酸的鸡痘载体进行一次或多次加强免疫注射。异质初免-加强免疫疫苗接种也涵盖各种组合，例如像在初免注射中使用编码免疫原的质粒，而在一次或多次加强免疫注射中使用编码相同免疫原的痘病毒载体，或在初免注射中使用重组蛋白质免疫原，而在一次或多次加强免疫注射中使用编码相同蛋白质免疫原的质粒或痘病毒载体。
重组；重组核酸；重组载体；重组痘病毒。术语“重组”在应用于核酸、载体、痘病毒等时是指通过人工组合两个或更多个另外异源性核酸序列区段制备的核酸、载体或痘病毒，或指包含两个或更多个另外异源性核酸序列区段的这种人工组合的核酸、载体或痘病毒。最通常通过使用完善建立的遗传工程改造技术对分离的核酸区段进行人工操作来实现人工组合。
序列同一性。术语“序列同一性”是指核酸或氨基酸序列之间的同一性程度。序列同一性常常以同一性百分比(常描述为序列“相似性”或“同源性”)来量度。序列同一性百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，蛋白质免疫原的同源物或变体将具有相对高度序列同一性。
对准序列以达成比较的方法在本领域中是熟知的。各种程序和比对算法描述于以下中：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Higgins和Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins和Sharp,CABIOS5:151,1989；Corpet等,Nucl.Acids Res.16:10881,1988；以及Pearson和Lipman,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444,1988。此外，Altschul等,Nature Genet.6:119,1994呈现对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990)可从包括国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI，Bethesda,MD；也参见http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的若干来源获得，供与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx关联使用。
使用设置成缺省参数的blastp，历经以NCBI Blast v2.0作出的与野生型免疫原的氨基酸序列的全长比对，蛋白质免疫原的同源物和变体通常具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，在使用设置成缺省参数(空位存在代价11和每个残基空位代价1)的缺省BLOSUM62矩阵下采用Blast 2序列功能。
受试者。即活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如人、非人哺乳动物和鸟类。术语“受试者”在本文中可与术语“哺乳动物”或“动物”互换使用。
T细胞。即为适应性免疫应答所必需的淋巴细胞或白血细胞。T细胞包括但不限于CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞是在它的表面上携带称为“分化簇4”(“CD4”)的标志物的免疫细胞。这些细胞，也称为辅助T细胞，帮助协调免疫应答，包括抗体应答与CTL应答两者。CD8+T细胞携带“分化簇8”(“CD8”)标志物。CD8+T细胞包括两种CTL，即记忆CTL和抑制T细胞。
治疗活性多肽。即由氨基酸组成的试剂，诸如蛋白质，其诱导生物作用和/或适应性免疫应答，如通过临床响应(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞或B细胞增加；蛋白质表达水平增加；肿瘤尺寸的可测量降低；或转移数目降低)所量度。治疗活性分子也可由核酸制得，例如像包含可操作地连接于表达控制序列的编码蛋白质或蛋白质免疫原的核酸的痘病毒载体。
治疗有效量。“治疗有效量”是组合物或细胞足以在所治疗的受试者中实现所需治疗或临床作用的量。举例来说，包含可操作地连接于表达控制序列的编码蛋白质或蛋白质免疫原的核酸的痘病毒载体的治疗有效量将为足以引发生物应答或抗原特异性免疫应答，或减轻或消除患有疾病或病症的患者或患者群体的感染性疾病或其它疾病的临床征象或症状的量。本文提供的痘病毒载体和包含痘病毒载体的组合物的治疗有效量是足以产生对表达靶标抗原的细胞的免疫应答的量。免疫应答必须具有足够量级以减轻或消除患有所靶向的病症的患者或患者群体的临床疾病征象或症状。
转导或转化。术语“转导”或“转化”是指已通过标准分子生物学方法来向细胞中引入重组核酸。如本文所用，术语转导涵盖可能将核酸分子引入这种细胞中所依的所有技术，包括用病毒载体感染，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂质体转染或粒子枪加速来引入裸露DNA。
TRICOM。即由B7-1(也称为CD80)、细胞内粘附分子-1(ICAM-1，也称为CD54)和淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3，也称为CD58)组成的共刺激分子的三联体(Triad ofCOstimlatory Molecule)，通常包括在表达特定抗原的重组病毒载体(例如痘病毒载体)中以增加抗原特异性免疫应答。TRICOM的个别组分可受控于相同或不同启动子，并且可被提供在具有特定抗原的同一载体上或在单独载体上。示例性载体例如公开于Hodge等,“ATriad of Costimulatory Molecules Synergize to Amplify T-Cell Activation,”Cancer Res.59:5800-5807(1999)和美国专利号7,211,432B2中，所述文献和所述专利两者均以引用的方式并入本文。
载体。即将目标核酸分子引入宿主细胞中，由此产生转导或转化的宿主细胞的载体。载体通常包括使得它们能够在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点，以及一种或多种可选择标记基因、表达控制序列、限制核酸内切酶识别序列、引物序列和本领域中已知的多种其它遗传元件。通常使用的载体类型包括用于在细菌(例如大肠杆菌)或酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的质粒、用于构建重组痘病毒的穿梭载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体和病毒载体。病毒载体包括痘病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)载体和脊髓灰质炎病毒载体以及其它载体。
痘病毒载体包括但不限于正痘病毒、禽痘病毒、副痘病毒、亚塔痘病毒和软疣痘病毒，但优选是正痘和/或禽痘病毒，如以上更详细定义。正痘病毒包括天花病毒(smallpoxvirus)(也称为天花病毒(variola virus))、痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒。禽痘病毒包括金丝雀痘病毒和鸡痘病毒。术语“痘苗病毒”是指野生型痘苗病毒与随后分离的各种减毒病毒株或分离株中的任一个，包括例如西储痘苗病毒、哥本哈根痘苗病毒、Dryvax(也称为惠氏痘苗病毒)、ACAM2000、改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA”)和巴伐利亚诺迪克改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA-BN”)。
重组痘病毒
在一个方面，本文提供包含表达早期双链RNA(dsRNA)的异源性核酸的重组痘病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒包含在感染后1或2小时内表达过量dsRNA的异源性核酸。在某些实施方案中，本文提供包含异源性核酸的重组痘病毒，所述异源性核酸在所述重组痘病毒的基因组复制之前表达早期或过量dsRNA。在某些实施方案中，重组痘病毒包含在感染后1或2小时内表达早期ds RNA的异源性核酸。在某些实施方案中，重组痘病毒可包含从其转录两个链以产生早期dsRNA的单一异源性核酸。在某些实施方案中，重组痘病毒可包含指引早期转录的天然痘病毒基因的早期反义转录，由此表达早期dsRNA的另一启动子。在某些实施方案中，产生早期dsRNA的重组痘病毒进一步包含编码异源性疾病相关抗原的核酸序列。在某些实施方案中，重组痘病毒进一步包含编码一种或多种共刺激分子的核酸序列。在某些实施方案中，一种或多种共刺激分子是TRICOM(即B7-1、ICAM-1和LFA-3)。在某些实施方案中，异源性疾病相关抗原是感染性疾病相关抗原或肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，异源性疾病相关抗原是感染性疾病抗原。在某些实施方案中，感染性疾病抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
在某些实施方案中，感染性疾病抗原是病毒抗原。在某些实施方案中，病毒抗原源于选自由以下组成的组的病毒：腺病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革病毒、埃博拉病毒、艾伯斯坦-巴尔病毒(EBV)、瓜纳瑞托病毒、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、8型人疱疹病毒(HHV-8)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘坡病毒、马伯格病毒、麻疹病毒、人间质肺炎病毒、腮腺炎病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)、副流感病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合性病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、沙比亚病毒、重度急性呼吸综合征病毒(SARS)、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、西尼罗病毒和黄热病毒。
在某些实施方案中，感染性疾病抗原是细菌抗原。在某些实施方案中，细菌抗原源于选自由以下组成的组的细菌：炭疽杆菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肠毒素性大肠杆菌、肠道病源性大肠杆菌、大肠杆菌157:H7、土拉热弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、立氏立克次氏体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、梅毒密螺旋体、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
在某些实施方案中，感染性疾病抗原是真菌抗原。在某些实施方案中，真菌抗原源于选自由以下组成的组的真菌：棒状曲霉、黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉、皮炎芽生菌、白色念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、皱褶念珠菌、热带念珠菌、浅白隐球酵母、格特隐球酵母、罗氏隐球酵母、新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌、犬小孢子菌、卡氏肺囊虫、杰氏肺囊虫、申克氏孢子丝菌、纸葡萄穗霉、须癣、头癣、体癣、股癣、面癣、隐匿癣、黑癣、花斑癣、红色毛癣菌和断发毛癣菌。
在某些实施方案中，感染性疾病抗原是寄生虫抗原。在某些实施方案中，寄生虫抗原源于选自由以下组成的组的寄生虫：异尖线虫属种、巴贝虫属种、浣熊拜林蛔线虫、隐孢子虫属种、卡耶塔环孢子虫、裂头绦虫属种、麦地那龙线虫、溶组织内阿米巴、十二指肠贾第鞭毛虫、肠贾第鞭毛虫、兰氏贾第鞭毛虫、利什曼原虫属种、恶性疟原虫、曼森氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、日本裂体吸虫、绦虫属种、刚地弓形虫、旋毛线虫和克氏锥虫。
在某些实施方案中，异源性疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：5-α-还原酶、α-胎蛋白(AFP)、AM-1、APC、April、B黑素瘤抗原基因(BAGE)、β-连环蛋白、Bcl12、bcr-abl、Brachyury、CA-125、卡斯帕酶-8(CASP-8，也称为FLICE)、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21/补体受体2(CR2)、CD22/BL-CAM、CD23/FcεRII、CD33、CD35/补体受体1(CR1)、CD44/PGP-1、CD45/白血球共同抗原(LCA)、CD46/膜辅因子蛋白(MCP)、CD52/CAMPATH-1、CD55/衰减加速因子(DAF)、CD59/保护素、CDC27、CDK4、癌胚抗原(CEA)、c-myc、环加氧酶-2(cox-2)、结肠直肠癌缺失基因(DCC)、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、纤维母细胞生长因子-8a(FGF8a)、纤维母细胞生长因子-8b(FGF8b)、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、G黑素瘤抗原基因家族(GAGE家族)、促胃液素17、促胃液素释放激素、神经节苷脂2(GD2)/神经节苷脂3(GD3)/神经节苷脂-单唾液酸-2(GM2)、促性腺激素释放激素(GnRH)、UDP-GlcNAc:R1Man(α1-6)R2[GlcNAc向Man(α1-6)]；β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT V)、GP1、gp100/Pme117、gp-100-in4、gp15、gp75/酪氨酸相关蛋白-1(gp75/TRP-1)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、类肝素酶、Her2/neu、人乳腺肿瘤病毒(HMTV)、70千道尔顿热激蛋白(HSP70)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、胰岛素样生长因子受体-1(IGFR-1)、白介素-13受体(IL-13R)、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、黑素瘤抗原编码基因1(MAGE-1)、黑素瘤抗原编码基因2(MAGE-2)、黑素瘤抗原编码基因3(MAGE-3)、黑素瘤抗原编码基因4(MAGE-4)、乳腺球蛋白、MAP17、Melan-A/由T细胞识别的黑素瘤抗原-1(MART-1)、间皮素、MIC A/B、MT-MMP、粘蛋白、睾丸特异性抗原NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白、PAI-1、血小板源性生长因子(PDGF)、μPA、PRAME、probasin、祖细胞生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX家族、STAT3、STn、TAG-72、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胸腺素-β-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TP1、TRP-2、酪氨酸酶、血管内皮生长因子(VEGF)、ZAG、p16INK4和谷胱甘肽-S转移酶(GST)。
在某些实施方案中，重组痘病毒是脊椎动物痘病毒亚科或昆虫痘病毒亚科的成员。在某些实施方案中，重组痘病毒是脊椎动物痘病毒亚科的成员。在某些实施方案中，重组痘病毒是选自由以下组成的组的脊椎动物痘病毒亚科属的成员：禽痘病毒、羊痘病毒、野兔痘病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、猪痘病毒和亚塔痘病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是禽痘病毒。在某些实施方案中，禽痘病毒选自由组成的组：金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、燕八哥痘病毒、鸽痘病毒和鹌鹑痘病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是羊痘病毒。在某些实施方案中，羊痘病毒选自由以下组成的组：绵羊痘病毒、山羊痘病毒和结节性皮肤病病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是野兔痘病毒。在某些实施方案中，野兔痘病毒选自由以下组成的组：粘液瘤病毒、休普纤维瘤病毒(也称为兔纤维瘤病毒)、野兔纤维瘤病毒和松鼠纤维瘤病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是软疣痘病毒。在某些实施方案中，软疣痘病毒是接触传染性软疣病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是正痘病毒。在某些实施方案中，正痘病毒选自由以下组成的组：水牛痘病毒、骆驼痘病毒、牛痘病毒、小鼠脱脚病病毒、猴痘病毒、浣熊痘病毒、天花病毒(smallpox virus)(也称为天花病毒(variolavirus))和痘苗病毒。在某些实施方案中，正痘病毒是痘苗病毒。在某些实施方案中，痘苗病毒选自由以下组成的组：西储痘苗病毒、哥本哈根痘苗病毒、Dryvax(也称为惠氏痘苗病毒)、ACAM2000、绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(“CVA”)、改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA”)和巴伐利亚诺迪克改良型安卡拉痘苗病毒(“MVA-BN”)。在某些实施方案中，重组痘病毒是副痘病毒。在某些实施方案中，副痘病毒选自由以下组成的组：牛丘疹性口腔炎病毒、ORF病毒、新西兰红鹿副痘病毒和伪牛痘病毒。在某些实施方案中，重组痘病毒是猪痘病毒。在某些实施方案中，猪痘病毒(suipox virus)是猪痘病毒(swinepox virus)。在某些实施方案中，重组痘病毒是亚塔痘病毒。在某些实施方案中，亚塔痘病毒选自由以下组成的组：特纳河痘病毒和亚巴猴肿瘤病毒。
在某些实施方案中，表达早期dsRNA的异源性核酸包含编码互补RNA转录物的序列，其中所述互补RNA转录物在转录之后退火以产生dsRNA。在某些实施方案中，互补RNA转录物包含蛋白质编码开放阅读框(ORF)或非蛋白质编码基因。在某些实施方案中，互补RNA转录物或RNA转录物的互补部分有50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个核苷酸的重叠。在某些实施方案中，互补RNA转录物有大于50、大于100、大于150、大于200、大于250、大于300、大于350、大于400、大于450、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900、大于950或大于1000个核苷酸的重叠。在某些实施方案中，互补RNA转录物有100个与1000个之间、200个与1000个之间、300个与1000个之间、400个与1000个之间、500个与1000个之间、600个与1000个之间、700个与1000个之间、800个与1000个之间、900个与1000个之间、200个与900个之间、300个与800个之间、400个与700个之间、300个与750个之间、300个与730个之间、或500个与600个之间的核苷酸的重叠。
在某些实施方案中，异源性核酸被转录成具有互补核酸或互补序列的RNA，所述互补核酸或互补序列具有优选50、60、70、80、90、100％互补序列。在某些实施方案中，编码互补RNA转录物的异源性核酸包含两个互补序列。在某些实施方案中，互补序列被一个或多个必需病毒基因或非互补核酸分隔。在某些实施方案中，编码部分或完全互补转录物的相同或高度相似序列被一个或多个必需病毒基因分隔。在某些实施方案中，编码互补RNA转录物的异源性核酸在单独转录物或核酸上包含两个互补序列。在某些实施方案中，有义信使RNA(mRNA)从一个互补序列转录，并且反义mRNA从另一互补序列转录。在某些实施方案中，有义信使RNA(mRNA)从两个相同或高度相似序列中的一个转录，并且反义mRNA从另一相同或高度相似序列转录。在某些实施方案中，编码重叠互补RNA转录物的序列的表达由一种或多种痘病毒启动子指引。在某些实施方案中，一种或多种痘病毒启动子是早期启动子或即刻早期启动子。
在某些实施方案中，互补RNA转录物或RNA转录物的部分包含不同核酸分子上的核苷酸。在某些实施方案中，RNA转录物的互补部分包含除siRNA或链段较短(例如像21至23个碱基对)的互补RNA转录物以外的核酸。
在某些实施方案中，痘病毒启动子是早期启动子。在某些实施方案中，早期启动子选自由以下组成的组：Pr7.5启动子和PrS启动子。在某些实施方案中，痘病毒启动子是即刻早期启动子。在某些实施方案中，即刻早期启动子选自由以下组成的组：I3L启动子、30K启动子、40K启动子、PrHyb启动子、PrS5E启动子、Pr4LS5E启动子和Pr13.5长启动子。
组合物
在另一方面，本文提供包含本文提供的包含表达双链RNA(dsRNA)的异源性核酸的任何重组痘病毒，以及任选药学上可接受的载体或赋形剂的免疫原性组合物。在某些实施方案中，免疫原性组合物包含本文提供的包含表达dsRNA的异源性核酸的任何重组痘病毒，并且进一步包含编码本文提供的任何异源性疾病相关抗原的核酸序列以及任选药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本文提供药物组合物，其包含本文提供的包含表达早期双链RNA(dsRNA)的异源性核酸的任何重组痘病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物包含本文提供的包含表达dsRNA的异源性核酸的任何重组痘病毒，并且进一步包含编码本文提供的任何异源性疾病相关抗原的核酸序列以及药学上可接受的载体或赋形剂。
用于制备本文提供的免疫原性组合物和药物组合物的重组痘病毒包括重组痘病毒粒子的混悬液或溶液，其具有104至109TCID50/ml、105至5×108TCID50/ml、106至108TCID50/ml、或107至108TCID50/ml的浓度范围。在某些实施方案中，组合物被配制成包含106至109之间的TCID50，或包含106TCID50、107TCID50、108TCID50或5×108TCID50的单次剂量。本文公开的重组痘病毒是以生理上可接受的形式提供，所述形式例如基于如由H.Stickl等,Dtsch.med.Wschr.99:2386-2392(1974)所述，制备用于针对天花进行疫苗接种的痘病毒疫苗时的经验。举例来说，纯化的痘病毒可于约10mM Tris、140mM NaCl中在pH 7.7下配制，以滴度5×108TCID50/ml储存在
Figure BDA0000988950620000447
下。在某些实施方案中，痘病毒制剂(例如102-108或102-109痘病毒粒子)可在2％(w/v)蛋白胨和1％(w/v)人血清白蛋白(HSA)存在下冻干在100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并且储存在由玻璃或其它适合材料制得的安瓿中。
或者，冷冻干燥的痘病毒粒子制剂可通过逐步冷冻干燥痘病毒粒子于例如像10mMTris、140mM NaCl(在pH 7.7下)，或PBS加2％(w/v)蛋白胨和1％(w/v)HSA的溶液中配制的混悬液来制备。在某些实施方案中，溶液含有一种或多种其它添加剂，诸如甘露糖醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，溶液含有适于体内施用的其它助剂，诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白或HSA)。接着将溶液等分至适当储存容器，例如像玻璃安瓿中，并且密封储存容器。在某些实施方案中，将免疫原性组合物和/或药物组合物储存在
Figure BDA0000988950620000442
与室温之间的温度下数月。在某些实施方案中，将储存容器储存在低于
Figure BDA0000988950620000443
低于
Figure BDA0000988950620000444
低于
Figure BDA0000988950620000445
或低于
Figure BDA0000988950620000446
的温度下。
在某些实施方案中，药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。所述辅助物质可为水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，所用载体的性质取决于所采用的特定施用模式。举例来说，胃肠外制剂通常包含可注射流体作为媒介物，所述流体包括药学上和生理上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。适合载体通常是代谢缓慢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
方法和用途
在另一方面，本文提供增强先天性免疫活化的方法，其包括向有需要的受试者施用任一本文提供的药物组合物或重组痘病毒，其中所述药物组合物或重组痘病毒在向受试者施用时增强先天性免疫活化。在另一方面，本文提供任一本文提供的药物组合物或重组痘病毒制造用于治疗或预防由痘病毒介导或由异源性疾病相关抗原介导的病状的药剂的用途。在另一方面，本文提供用作药剂的痘病毒或任一本文提供的药物组合物。在另一方面，本文提供用于增强先天性免疫活化或用于治疗或预防由痘病毒介导或由异源性疾病相关抗原介导的病状的痘病毒或任一本文提供的药物组合物。在另一方面，本文提供任一本文提供的药物组合物用于治疗或预防由痘病毒介导或由异源性疾病相关抗原介导的病状的用途。在某些实施方案中，受试者是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
在某些实施方案中，当向受试者施用时，相较于包含缺乏表达过量早期dsRNA的异源性核酸的重组痘病毒的相同药物组合物(无论所述重组痘病毒是否进一步包含编码异源性疾病相关抗原的核酸序列)，本文提供的包含进一步包含编码异源性疾病相关抗原的核酸序列的重组痘病毒的任何药物组合物都增强先天性免疫活化。在某些实施方案中，受试者是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
在某些实施方案中，通过为本领域普通技术人员所知的任何适合施用途径来向受试者施用任何本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物是以冻干物形式提供。在某些实施方案中，将冻干物溶解于水溶液中。在某些实施方案中，水溶液是在生理pH下的生理盐水、磷酸盐缓冲盐水或Tris缓冲液。在某些实施方案中，药物组合物被全身性施用。在某些实施方案中，药物组合物被局部施用。在某些实施方案中，皮下、静脉内、肌肉内、皮内、鼻内、口服、经表面、胃肠外或通过为熟练从业者所知的任何其它施用途径来施用任何本文提供的药物组合物。施用途径、剂量和治疗方案可由本领域技术人员加以优化。
在某些实施方案中，以单次剂量向受试者施用任何本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，以多次剂量向受试者施用任何本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，以2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25剂或更多剂向受试者施用任何药物组合物。在某些实施方案中，以第一初免剂量施用任何本文提供的药物组合物，随后施用一次或多次额外加强免疫剂量(即通过‘初免-加强免疫’疫苗接种方案来施用)。在某些实施方案中，‘初免-加强免疫’疫苗接种方案是同质初免-加强免疫方案。在某些实施方案中，‘初免-加强免疫’方案是异质初免-加强免疫方案。在某些实施方案中，第一或初免剂量包括任何本文提供的药物组合物的包含107至108TCID50的任何本文提供的重组痘病毒的剂量。在某些实施方案中，第二和随后加强免疫剂量包括任何本文提供的药物组合物的包含107至108TCID50的任何本文提供的重组痘病毒的剂量。在某些实施方案中，第二或加强免疫剂量在第一或初免剂量之后1、2、3、4、5、6、7天或更多天施用。在某些实施方案中，第二或加强免疫剂量在第一或初免剂量之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周施用。在某些实施方案中，第二或加强免疫剂量在第一或初免剂量之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月施用。在某些实施方案中，第二或加强免疫剂量在第一或初免剂量之后1、2、3、4、5年或更多年施用。在某些实施方案中，随后加强免疫剂量在第一加强免疫剂量之后1、2、3、4、5、6、7天或更多天施用。在某些实施方案中，随后加强免疫剂量在第一加强免疫剂量之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周施用。在某些实施方案中，随后加强免疫剂量在第一加强免疫剂量之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月施用。在某些实施方案中，随后加强免疫剂量在第一加强免疫剂量之后1、2、3、4、5年或更多年施用。
在某些实施方案中，先天性免疫应答增强包括I型干扰素(I型IFN)、细胞因子和趋化因子的产生增强。
在某些实施方案中，先天性免疫应答增强包括I型IFN的产生增强。在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括干扰素-β(IFN-β)编码信使RNA(mRNA)的转录增强。在某些实施方案中，IFN-β编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括IFN-β蛋白的分泌增强。在某些实施方案中，IFN-β蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括干扰素-α(IFN-α)编码mRNA的转录增强，并且IFN-α编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括IFN-α蛋白的分泌增强，并且IFN-α蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括干扰素-γ(IFN-γ)编码mRNA的转录增强，并且IFN-γ编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，I型IFN的产生增强包括IFN-γ蛋白的分泌增强，并且IFN-γ蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，先天性免疫应答增强包括细胞因子的产生增强。在某些实施方案中，细胞因子的产生增强包括白介素-6(IL-6)编码mRNA的转录增强，并且IL-6编码mRNA的转录增加至少1.8倍、至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，细胞因子的产生增强包括IL-6蛋白的分泌增强，并且IL-6蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，细胞因子的产生增强包括白介素-18(IL-18)编码mRNA的转录增强，并且IL-18编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，细胞因子的产生增强包括IL-18蛋白的分泌增强，并且IL-18蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，先天性免疫应答增强包括趋化因子的产生增强。在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CXCL1编码mRNA的转录增强，并且CXCL1编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CXCL1蛋白的分泌增强，并且CXCL1蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CCL2编码mRNA的转录增强，并且CCL2编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CCL2蛋白的分泌增强，并且CCL2蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CCL5编码mRNA的转录增强，并且CCL5编码mRNA的转录增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，趋化因子的产生增强包括CCL5蛋白的分泌增强，并且CCL5蛋白的分泌增加至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多倍。
实施例
实施例1：缺乏B15以及含有另一neor盒的CVA突变株被高度减毒
我们使用基于以细菌人工染色体(BAC)形式克隆的CVA基因组的重组系统鉴定了高度减毒CVA突变株，其中neo/rpsL盒在CVA-BAC的诱变期间用于阳性/阴性选择目的(Meisinger-Henschel等,2010)。CVA野生型病毒在ORF I3L与I4L之间的基因间区域中含有BAC控制序列插入物和其它标记以允许呈BAC形式的环化基因组在细菌中增殖。这些序列包括借助痘病毒pS启动子表达的neo-IRES-EGFP盒。先前已证明这个源自BAC的CVA与野生型噬斑纯化的CVA具有不可区分的性质(Meisinger 2010)。因此，源自BAC的CVA被视为不可与野生型CVA区分，并且在以下实施例中被称为CVA wt。
惊人地，具有neo/rpsL选择盒而非B15R ORF的突变CVA(CVA-dsneo-ΔB15，参见图1)在鼻内感染BALB/c小鼠后被高度减毒，而无neo/rpsL选择盒的CVA-ΔB15缺失突变株仅被中度减毒(图2A)。甚至在以5×107TCID50的剂量鼻内接种小鼠之后，CVA-dsneo-ΔB15也不导致可检测重量减轻(图2A和2B)和其它疾病症状(数据未显示)，而野生型CVA在这个剂量下大多具有致死性(图2A和2B)。当CVA形式的B15R被MVA形式的B15R替换时，随之获得的突变CVA-B15MVA的减毒性也是中度的(图2B)，并且与对于CVA-ΔB15观察的减毒性类似(图2B)。在SDS-PAGE中，由CVA-B15MVA表达的B15蛋白比它的CVA同源物略微更快迁移，从而确认CVA-B15MVA表达源于MVA的缺乏6个氨基酸的适当B15形式(数据未显示)。这些结果与新近公开的以下观察结果一致：MVA形式的内部缺失6个氨基酸的链段的B15是非功能性的(McCoy等(2010),J.Gen.Virol.91:2216-2220)。因此，CVA-B15MVA最可能代表B15无效突变株。
作为痘苗病毒减毒性的参照，我们使正痘病毒的编码分泌I型IFN受体的B19R基因缺失。CVA-ΔB19比CVA-ΔB15被略微更大程度减毒，但减毒程度显著小于CVA-dsneo-ΔB15(图2B)。
在用1×107TCID50的剂量鼻内感染之后分析小鼠的肺中的感染性病毒滴度。在感染后6天，用CVA-dsneo-ΔB15感染的小鼠显示肺中小于1×104TCID50的极低病毒滴度，而CVA感染的小鼠的肺中的病毒滴度超过1×107TCID50(图2C，p<0.001，根据Student t检验)。相较于CVA的病毒滴度，用CVA-ΔB19和CVA-B15MVA感染的小鼠的肺中的病毒滴度降低约1个数量级(p<0.001)(图2C)，从而反映这些病毒的病原性降低但仍然显著(图2B)。因此，在鼻内感染之后的肺中感染性病毒滴度与对CVA突变株观察的病原性样式极其充分相关，并且确认CVA-dsneo-ΔB15的强力减毒性。
为排除CVA-dsneo-ΔB15中作为它的重度减毒性的原因的非所要突变，我们测定CVA-dsneo-ΔB15(202,615个核苷酸)和CVA-ΔB15(201,296个核苷酸)的完整编码区的核苷酸序列。两种病毒均仅含有已被故意引入它们的编码区中的预期突变。因此，CVA-dsneo-ΔB15的惊人强力减毒性似乎取决于存在neo/rpsL盒。
实施例2：CVA-dsneo-ΔB15在IFN-α/β受体缺陷(IFNAR0/0)小鼠中的毒性
为探究I型IFN系统是否促进CVA-dsneo-ΔB15在小鼠中的强力减毒性，用分级剂量的CVA和CVA-dsneo-ΔB15感染缺乏功能性IFNα/β受体的IFNAR0/0小鼠。在5×107TCID50的高剂量下，CVA-dsneo-ΔB15对于IFNAR0/0小鼠具有统一致死性(数据未显示)。在用1×107中等剂量的CVA-dsneo-ΔB15感染之后，一个子组的IFNAR0/0小鼠存活，并且在用2×106TCID50的剂量感染时，所有小鼠都存活(图3A和B)。用野生型CVA感染的IFNAR0/0小鼠统一死亡，甚至在2×106TCID50的最低剂量下也是如此(图3A和B)。值得注意的是，CVA-dsneo-ΔB15对于IFNAR0/0小鼠仍然具有高度病原性，甚至在2×106TCID50的所用最低剂量下也是如此，如通过超过20％的显著重量减轻所证明(图3A)。
因此，I型IFN系统似乎是CVA-dsneo-ΔB15的强力减毒中涉及的重要因素。用2×106和1×107TCID50剂量的CVA-dsneo-ΔB15感染的IFNAR0/0小鼠部分或完全存活，而用wtCVA感染的所有IFNAR0/0小鼠都死亡的事实表明I型IFN非依赖性因素在较小程度上促进CVA-dsneo-ΔB15的减毒性。先前已报道B15是受VACV感染的细胞中NFκB活化的抑制剂(Chen等(2008),PLoS.Pathog.4:e22-)。因此，由于缺乏B15而增强的NFκB活化的抗病毒作用可能已导致CVA-dsneo-ΔB15相较于CVA在IFNAR0/0小鼠中具有中度减毒性。沿着相同思路，低效NFκB抑制可能也提供对CVA-ΔB15在野生型小鼠中具有中度减毒性(图2)的解释，因为它缺乏B15。然而，它的减毒性远小于CVA-dsneo-ΔB15，因为它也缺乏导致CVA-dsneo-ΔB15的大部分减毒性的neo/rpsL盒。
实施例3：由CVA-dsneo-ΔB15达成的树突细胞(DC)中的IFN-α和IFN-λ诱导
因为DC是I型和III型IFN以及其它细胞因子的高效产生者，所以我们评估本文提供的各种CVA构建体诱导鼠类骨髓源性DC中的这些IFN的能力，所述DC是使用fms样酪氨酸激酶3配体(flt3-L或FL)培养系统产生。正痘病毒B19蛋白结合鼠类IFN-α而非鼠类IFN-β。这个结合部分或完全阻止在IFN-α特异性ELISA中检测IFN-α(数据未显示)。为有助于分析由CVA-dsneo-ΔB15达成的IFN-α诱导，通过用博莱霉素(zeocin)抗性基因替换B19R基因来引入另一缺失(图1)。除受感染小鼠的肺中的病毒滴度在感染之后第6天甚至更低(数据未显示)之外，在BALB/c疾病模型中，所得CVA-dsneo-ΔB15/B19双重缺失突变株的减毒性不可与CVA-dsneo-ΔB15的减毒性区分。尽管如所预期在受CVA感染的FL-DC的上清液中不可检测出IFN-α，但CVA-ΔB19诱导可检测量的IFN-α(图4)，从而证明野生型CVA能够诱导中等水平的IFN-α，其由B19掩蔽而免遭基于ELISA的检测。在FL-DC中，双重缺失突变CVA-dsneo-ΔB15/B19诱导的IFN-α水平显著高于CVA-ΔB19，所述水平与由MVA诱导的水平类似(图4)。这证明neo-ΔB15突变对CVA赋予较高干扰素诱导能力。B15不促进这个作用，因为CVA-ΔB15不诱导可检测IFN-β，因此作用就如同CVA wt一样。
因为正痘病毒不表达IFN-λ的结合蛋白，所以我们能够直接分析突变CVA-dsneo-ΔB15诱导FL-DC分泌IFN-λ的能力。CVA-dsneo-ΔB15诱导的FL-DC的上清液中的IFN-λ水平显著高于CVA或CVA-ΔB15(图4)。由CVA-dsneo-ΔB15诱导的IFN-λ水平极其类似于由MVA诱导的IFN-λ水平。总之，以上结果指示与缺乏许多免疫调节剂的MVA(Antoine等(1998),Virology 244:365-396；Meisinger-Henschel等(2007),J.Gen.Virol.88:3249-3259)类似，CVA-dsneo-ΔB15是IFN-α和IFN-λ的强力诱导剂，从而相较于它的祖先CVA(Samuelsson等(2008),J.Clin.Invest 118:1776-1784)导致DC活化增加。
实施例4：由CVA和CVA-dsneo-ΔB15达成的鼠类细胞系中的IFN-β诱导
为揭示CVA-dsneo-ΔB15诱导I型IFN的能力增强是否限于DC，用各种CVA构建体感染鼠类BALB/3T3克隆A31(A31)纤维母细胞，并且通过定量逆转录酶PCR(RT-qPCR)来测定IFN-βmRNA水平。尽管CVA和CVA-ΔB15仅诱导极低IFN-β基因表达，但CVA-dsneo-ΔB15感染刺激A31细胞中IFN-β转录物的水平增加(图5A)。在感染后4小时由CVA-dsneo-ΔB15达成的IFN-βmRNA诱导类似于用MVA在这个时间点获得的诱导(图5A)。受MVA感染的A31细胞中IFN-β转录物的水平通常在感染后4小时之后下降，而由CVA-dsneo-ΔB15诱导的IFN-βmRNA甚至进一步增加，并且从感染后6小时起明显超过由MVA诱导的IFN-βmRNA(图5A)。这些数据连同CVA-dsneo-ΔB15的减毒性在IFNAR0/0小鼠中被几乎完全逆转一起强烈表明这个病毒突变株在野生型小鼠中的无毒性可能由强烈增强的I型IFN诱导引起。
当在CVA-dsneo-ΔB15的B15R基因座处的neo ORF被缺失(CVA-ΔB15)或被博莱霉素(zeo)抗性盒替换(CVA-zeo-ΔB15)时，所得突变病毒的IFN-β刺激能力几乎完全缺失(图5B)。因为新霉素ORF已在保持强力早期B15R启动子(pB15)完整的情况下替代B15R ORF加以插入，所以我们使pB15从CVA-dsneo-ΔB15缺失。所得突变CVA-ΔpB15-neo-ΔB15仅诱导CVAwt水平的IFN-β转录物(图5B)。因此，CVA-dsneo-ΔB15突变株中的neo ORF的转录似乎为IFN-β刺激能力所必需。通过靶向neo/rpsL插入物的rpsL部分的RT-qPCR分析来确认受CVA-dsneo-ΔB15感染的A31细胞中的Neo盒转录(数据未显示)。Neo和rpsL ORF已关于B15启动子以相反互补定向加以插入，并且如果这个反义RNA即使由翻译机构加以使用，那么预测仅极短ORF将从neo盒翻译。
因为CVA-dsneo-ΔB15突变株从BAC骨架中的EGFP/neo盒以有义定向在早期/晚期启动子的控制下表达第二neo转录物，所以两个部分互补转录物内的neo序列可能形成部分双链RNA(dsRNA)。这个dsRNA最可能充当受感染细胞中的另一PAMP，从而导致对I型和III型IFN的诱导增强。
实施例5：表达各对外来插入物的互补RNA的MVA载体诱导鼠类细胞中的IFN-β
为证明dsRNA原理可应用于MVA，构建两对表达neo或EGFP基因的两个互补转录物的重组MVA载体。这通过在MVA基因组中在彼此远离的位点处插入neo或EGFP ORF的两个拷贝来实现，所述拷贝各自受控于痘病毒早期/晚期启动子。源自BAC的野生型MVA已在BAC骨架插入物内含有neo/EGFP盒的一个拷贝(图6A)。先前已证明包括neo/EGFP盒的BAC盒不改变MVA的性质，并且因此等效于野生型MVA(Meisinger-Henschel等(2010),J.Virol.84:9907-9919)。MVA-dsneo-ΔB15在B15R基因座处，相对于内源性B15R启动子以相反定向含有第二neo ORF作为neo/rpsL盒的一部分(图6A)。因此，MVA-dsneo-ΔB15精确重现上述CVA-dsneo-ΔB15突变株中neo插入物的格局。对于构建MVA-dsEGFP，首先从野生型MVA的BAC插入物缺失neo/EGFP盒。为获得重组MVA-dsEGFP，接着将EGFP ORF在远端位点处在指引有义或反义EGFP RNA的转录的早期/晚期启动子的控制下两次插入MVA基因组中，从而使得能够形成720bp的dsRNA(图6B)。仅从单一EGFP插入物表达有义EGFP转录物的MVA构建体(MVA-EGFP)始终充当MVA-dsEGFP构建体的参照(图6B)。
相较于具有单一neo盒的源自BAC的MVA wt病毒，用产生两个插入neo抗原的互补转录物的MVA(MVA-dsneo-ΔB15)感染的鼠类A31细胞显示IFN-β基因转录增强(图7A)。当使用基于FRT的重组从MVA-dsneo-ΔB15缺失含有有义neo ORF的整个BAC盒时，所得MVA-neo-ΔB15/ΔBAC仅诱导野生型水平的IFN-βmRNA(图7A)。缺失B15R基因以及仅在BAC骨架中含有有义neo盒的MVA病毒(MVA-ΔB15)也诱导野生型IFN-βmRNA水平(图7A)。这证明MVA-dsneo-ΔB15诱导IFN-β的能力增加取决于存在有义neo表达盒与反义neo表达盒两者，而非由B15R缺失本身引起。MVA-dsneo-ΔB15以及CVA-dsneo-ΔB15在感染5小时之后诱导高量IFN-βmRNA(图7A)。由MVA-dsneo-ΔB15诱导的IFN-βmRNA表达在感染后5小时与7小时之间降低，而CVA-dsneo-ΔB15诱导的IFN-βmRNA水平在感染后7小时保持较高(图7A)。因此，在所有进一步实验中都在感染后5小时测定MVA-dsneo-ΔB15诱导的IFN-β的水平。相较于MVAwt或单一neo盒MVA构建体，在感染之后18小时，受MVA-dsneo-ΔB15感染的A31细胞的培养上清液含有增加量的IFN-β(图7B)，从而确认IFN-βmRNA分析的结果。
以上结果以一组指引从两个单独EGFP插入物产生互补早期转录物的MVA重组体加以重现。一个在强力早期启动子的控制下的EGFP ORF的指引有义EGFP-mRNA的表达，并且被插入IGR136/137中。相应单一插入物MVA重组体MVA-EGFP表达EGFP，并且诱导鼠类A31细胞中野生型水平的IFN-βmRNA(图7C)。含有插入IGR86/87中的另一EGFP盒，驱动在pS启动子的控制下早期/晚期表达反义EGFP转录物的MVA(Chakrabarti 1997)诱导强烈增加量的IFN-βmRNA(图7C)。因此，源于MVA基因组中异源性DNA插入物的早期dsRNA以不依赖于插入物的序列的方式刺激IFN-β分泌。
通过在蛋白质水平上分析IFN-β诱导来确认后述观察结果。类似于MVA-dsneo-ΔB15，MVA-dsEGFP刺激IFN-β分泌至培养上清液中的量显著高于相应MVA-EGFP(图7D)。在各实验之间，用各种MVA重组体感染的A31细胞的上清液中的IFN-β的量可观地变化，推测是由于传代数、细胞密度和细胞状态的变化。
实施例6：早期病毒转录足以由MVA dsRNA突变株诱导IFN-β水平增加
假定的是dsRNA介导的IFN-β诱导将主要取决于在感染期间早期产生的dsRNA。用阻断病毒基因组的复制以及因此复制后(中期和晚期)基因表达的AraC处理受MVA-dsEGFP-2感染的小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)不减弱增强的IFN-β基因表达(图8A)，从而证明dsRNA的早期转录足以达成增强的IFN-β诱导。用AraC处理的受MVA wt感染的MEF中的IFN-β中度增加(图8A)的原因是不清楚的。缺乏编码使dsRNA掩蔽而免遭识别的dsRNA结合蛋白的E3L基因的MVA突变株在一定程度上增强MEF中的IFN-β诱导，如根据先前公开的用CEF获得的观察结果以及(Hornemann等(2003),J.Virol.77:8394-8407)所预期。用AraC处理受MVA-ΔE3L感染的细胞明显降低IFN-β诱导(图8A)。这是预期的，因为大量病毒dsRNA天然地仅在痘病毒生命周期的从感染后约2小时起的复制后阶段产生。与这个见解一致，当通过AraC处理来阻断晚期基因表达时，AraC处理的MVA-E3L不比wt MVA诱导更多IFN-βmRNA(图8A)。
在晚期启动子pSSL的控制下表达反义EGFP转录物的MVA突变株(MVA-dsEGFP-晚期)诱导的IFN-βmRNA的水平类似于MVA wt(图8B)。这提供进一步证据表明在开始DNA复制之前在感染的早先时间形成dsRNA是MVA-dsEGFP的IFN诱导剂表型的先决条件，并且高度可能也适用于MVA-dsneo-ΔB15。因此，由MVA早期表达dsRNA为诱导受感染细胞中的IFN-β所必需，并且足以诱导受感染细胞中的IFN-β。极其可能的是，相同原理构成CVA-dsneo-ΔB15的先天性刺激能力增加的基础。
实施例7：MVA-dsneo-ΔB15和MVA-dsEGFP活化蛋白质激酶R(PKR)。
PKR在中等水平下以非活性激酶形式在细胞中组成性合成，其通过结合dsRNA来活化。PKR表达由I型IFN上调。活化的PKR的一种主要底物是翻译起始因子亚单位eIF2α，其由PKR磷酸化。作为一种抗病毒对策，在感染后的eIF2α磷酸化(P-eIF2α)导致受感染细胞中的翻译中止，并且可能也涉及于PKR介导的凋亡诱导中。eIF2α磷酸化被作为鼠类A31细胞中由dsRNA达成的PKR活化的指标加以分析。缺乏也结合并螯合dsRNA的痘苗病毒PKR抑制剂E3的基因的MVA突变株(MVA-ΔE3L)充当阳性对照。MVA-dsneo-ΔB15和MVA-dsEGFP早在A31细胞感染之后1小时即活化PKR，而MVA wt在整个感染期间都不可检测地活化PKR(图9)。在用基于neo与EGFP两者的早期dsRNA产生突变株感染的细胞中，P-eIF2α的量进一步增加直至感染后4小时(图9)。在感染后6小时，受MVA-dsneo-ΔB15和MVA-dsEGFP感染的细胞中的P-eIF2α量开始下降，并且在MVA-dsneo-ΔB15感染后8小时几乎不可检测，而在受MVA-dsEGFP感染的细胞中，在这个时间点，P-eIF2α仍然可微弱检测(图9)。此外，相较于受MVA-dsneo-ΔB15感染的细胞，在受MVA-dsEGFP感染的细胞中，历经感染的前6小时，P-eIF2α信号始终更强(图9)，从而表明相较于MVA-dsneo-ΔB15，MVA-dsEGFP的PKR活化活性稍微更强。
不同于早期dsRNA产生突变株，由MVA-ΔE3L诱导的P-eIF2α信号直至感染后2小时才可检测，并且在感染后2小时与3小时之间极其急剧增加，持续余下观察时期保持较高直至感染后8小时(图9)。从感染后4小时起，在所有突变株中，MVA-ΔE3L诱导最强P-eIF2α信号(图9)。这些动力学与dsRNA在MVA感染期间在感染晚期通过来自中期和晚期病毒基因的部分互补转录物的退火而形成一致。由于缺乏E3，由这个晚期dsRNA诱导的PKR活化未被阻断。相反，由产生neo-dsRNA或EGFP-dsRNA的MVA重组体达成的PKR活化的动力学与受感染细胞中极其早期存在刺激量的dsRNA一致。因为这些重组体表达E3蛋白，所以PKR活化似乎在足够E3蛋白已积累在受感染细胞中时的感染后期被下调。
实施例8：PKR为增加的IFN-βmRNA诱导以及IFN-β在细胞上清液中积累所需。
在wt MEF中，如所预期，如同wt MVA一样，MVA-EGFP诱导极其类似量的IFN-β转录物，而MVA-dsEGFP诱导增强的IFN-βmRNA合成(图10A)。相反，在PKR缺陷MEF中，MVA-dsEGFP不诱导增强的IFN-β基因表达(图10A)。由受MVA-dsEGFP感染的MEF对IFN-β蛋白的分泌同样强烈依赖于功能性PKR(图10B)。仙台病毒(Sendai virus，SeV)，即一种已知会通过PKR非依赖性路径来诱导IFN-β的负链RNA病毒，充当PKR缺陷MEF分泌IFN-β的能力的阳性对照。引起关注的是，如果即使有的话，那么wt MEF应答于SeV感染仅分泌临界量的IFN-β，而在PKR0/ 0MEF中，SeV高效诱导IFN-βmRNA和蛋白质，从而确认PKR0/0MEF完全有能力产生并分泌IFN-β(图10A和B)。总之，PKR似乎是由MVA-dsEGFP达成的IFN-β诱导增强中涉及的重要细胞感测体。在wt MEF中，由MVA和MVA-EGFP(对应于wt MVA)对IFN-β基因的诱导也部分依赖于PKR(图10A)，从而暗示这个dsRNA感测体至少在MEF中对由MVA达成的先天性免疫活化具有一般性作用。总之，由MVA-dsEGFP达成的IFN-β诱导增加完全依赖于dsRNA感测体PKR，此提供进一步证据表明由MVA-dsEGFP产生的dsRNA导致观察到的先天性免疫活化增加。
实施例9：早期dsRNA的刺激作用的长度要求
初始MVA-dsEGFP构建体被设计以模拟MVA-dsneo-ΔB15构建体，在反义EGFP转录物的3′末端处包括源于细菌β-半乳糖苷酶(β-gal)基因的非互补突出部分。为进一步表征达成IFN-β诱导增强的dsRNA长度要求，构建EGFP ORF重叠部分在720至50bp之间渐进缩短的一组嵌套突变株(图6B)。MVA-dsEGFP-2和所有其它dsEGFP突变株在反义转录物处缺乏额外3′突出部分(图6B)。在wt-MEF中，表达EGFP重叠长度递减的互补EGFP转录物的MVA诱导递减量的IFN-βmRNA和蛋白质(图11A和B)。在wt MEF中，源自β-gal的3′突出部分不为IFN-β增强作用所必需(图11A)。具有100个碱基的EGFP转录物重叠部分(MVA-dsEGFP-5)刺激的IFN-β明显少于MVA-dsEGFP，但相较于参照MVA-EGFP仍然使IFN-β应答增强(图11A和B)。再次，在PKR0/0MEF中，各种MVA重组体几乎不诱导IFN-βmRNA和IFN-β(图11A和B)。具有50bp EGFP插入重叠部分的MVA重组体不具有可检测的过度IFN-β刺激能力。
因此，达成MEF中的IFN-β诱导增加需要两个互补重组转录物的最小重叠在50与100bp之间(图11C)。
实施例10：MVA-dsEGFP复制性质和诱导剂表型稳定性
MVA-dsEGFP在继代鸡胚胎纤维母细胞(CEF)中增殖以获得大量纯化MVA-dsEGFP制剂揭示在MVA wt的范围内的正常病毒产量(数据未显示)。多步生长分析证明MVA-dsEGFP在人和鼠类细胞中保留复制限制表型(图12B)，但如同wt MVA一样，在CEF中的复制效率略微较低(图12A)。当使从CEF细胞获得的MVA-dsEGFP的病毒储备物的平均产量与MVA-EGFP的平均产量相关联时，也观察到这个略微受损的复制性。MVA-dsEGFP/MVA-EGFP的产量比率是约0.5(表1)，并且当将MVA-EGFP产量与MVA-5和MVA-6的产量进行比较时进一步降低至约0.1(表1)。因为MVA-dsEGFP-5和MVA-dsEGFP-6仅诱导略微更多IFN-如果即使有的话，所以对病毒复制的作用可能不通过可溶性I型IFN来介导。当鸡DF-1细胞用于产生病毒储备物时，在表达较短EGFP-dsRNA时不存在产量降低倾向(表1)。因此，DF-1细胞代表甚至比CEF细胞更适于使早期dsRNA过度产生性MVA突变株增殖的细胞类型。
为评估MVA-dsEGFP的增强的IFN-β刺激能力在重复传代之后是否被保持，我们采用低感染复数(MOI)约0.01，于有干扰素能力的鸡细胞系DF-1中进行10次MVA-EGFP和MVA-dsEGFP传代。用DF-1细胞传代10次的MVA-dsEGFP诱导的增强的IFN-β应答与于DF-1细胞中仅传代一次的起始MVA-dsEGFP病毒的诱导应答类似(图12C)。在10次DF-1传代之后，MVA-EGFP的基础IFN-β诱导也未改变(图12C)。因此，在于DF-1细胞中多次传代之后，MVA-dsEGFP的增强的干扰素刺激能力得以维持。MVA以及MVA-dsEGFP或MVA-dsneo-ΔB15都不诱导DF-1细胞或CEF细胞中IFN-β基因表达(数据未显示)。这支持以下见解：在DF-1细胞中无强力反向选择性压力在MVA-dsEGFP复制期间起再限制I型IFN诱导增强的作用，从而为观察到IFN-β诱导剂表型具有稳定性提供论据。连同MVA-dsEGFP突变株的产量未受损一起，DF-1细胞代表甚至比CEF细胞更适于使早期dsRNA过度产生性MVA突变株增殖的细胞类型。
实施例11：体内细胞因子诱导增加
在感染后6小时分析应答于用MVA-dsEGFP感染C57BL/6小鼠的全身性细胞因子水平。类似于体外观察结果(图9和10)，在MVA-dsEGFP感染之后，血液中的IFN-α水平显著高于对照的水平(图13A)。在受MVA-dsEGFP感染的小鼠中，IFN-γ、炎症性细胞因子IL-18和IL-6以及趋化因子CXCL1、CCL2和CCL5的水平也显著增加。应答至少部分取决于存在信号传导衔接分子IPS-1(图13)，其为通过dsRNA识别受体RIG-I和MDA-5来达成I型IFN和细胞因子诱导所需。相反，观察到的包括IFN-α、IFN-γ、IL-6、IL-18、CXCL1、CCL2和CCL5的细胞因子和趋化因子的所有诱导增加都依赖于PKR。尽管由MVA-EGFP对IFN-α、CXCL1和CCL2的基础诱导不因PKR缺乏而受强烈影响，但在PKR缺陷小鼠中，IFN-γ、IL-6、IL-18和CCL5的基础水平似乎被降低(图13)。这些结果证明由MVA达成的早期dsRNA产生不仅在培养的细胞中，而且也基于如同在培养的细胞中的类似模式识别分子的活化在体内增强I型IFN应答以及炎症性细胞因子诱导。PKR以及通过IPS-1进行信号传导的识别受体涉及于在体内通过MVA-dsEGFP来介导增强的I型IFN表达中。
实施例13：由MVA-dsEGFP在小鼠中达成的增强的CD8T细胞应答
用MVA-dsEGFP通过不同途径来使C57BL/6小鼠免疫，并且使用dextramer染色来测定在各病毒株背景下针对免疫显性表位的CD8T细胞应答。相较于MVA-EGFP，在用MVA-dsEGFP静脉内免疫之后7天，C57BL/6小鼠的脾中针对痘苗病毒的免疫显性B8R表位的CD8T细胞的数目显著增加(图14)(p＝0.048，根据未配对双尾Student t检验)。
实施例14：由MVA-dsEGFP在人细胞中达成的增强的IFN-β基因诱导
为证明由重组MVA产生的早期dsRNA的刺激作用不限于鼠类细胞，用产生早期dsRNA的MVA重组体感染人二倍体肺纤维母细胞系MRC-5的培养物。尽管由MVA-EGFP达成的基础IFN-β基因诱导有时在人MRC-5细胞中不可检测(图15，并且数据未显示)，但MVA-dsneo-ΔB15和MVA-dsEGFP高效诱导人MRC-5细胞中的IFN-βmRNA表达(图15)。类似于用鼠类细胞获得的结果，IFN-β基因诱导效率随EGFP ORF重叠部分渐进缩短而降低(图15)。使EGFP ORF重叠部分缩短至300和100nt强烈降低相应重组体MVA-dsEGFP-4和MVA-dsEGFP-5的IFN-β刺激活性(图15)。因此，由在用MVA感染期间的早期产生的dsRNA达成的增加的IFN-β诱导不限于鼠类细胞，而是在人细胞中至少同样卓越，并且因此极其可能也发生在原代人细胞和组织中以及用表达互补RNA转录物的重组痘病毒疫苗接种的人受试者中。
实施例15：由从天然MVA基因产生早期dsRNA的MVA-dsE3L达成的增强的IFN-β诱导
我们在MVA的天然早期E3L ORF的下游插入具有强力早期组分的早期/晚期H5m启动子(Wyatt等(1996),Vaccine14:1451-1458)以指引反义E3L RNA的早期表达(图16A)。E3LORF在反义链中含有同聚T7链段，其含有正痘病毒早期转录终止信号(ETTS)的T5NT共有序列。E3L ORF中的这个反义ETTS可能使早期反义转录物的长度限于约250-300个核苷酸而非完整E3L转录物的完全约650个核苷酸。因此，我们已通过用A交换一个T残基来使这个ETTS突变(图16A)，而不改变E3的编码氨基酸序列。用于终止早期全长反义E3转录物的适合反义ETTS序列天然存在于E3L/E4L基因间区域中(图16A)。
所得突变MVA-dsE3L诱导MEF中高水平的IFN-βmRNA(图16B)，所述水平与作为阳性对照的最佳可用的基于dsRNA的诱导剂(即转染多聚(I:C))的水平类似(数据未显示)。MVA-dsE3L似乎比MVA-dsEGFP诱导明显更高的IFN-βmRNA水平(图16B)。MVA-dsEGFP-5和MVA-dsEGFP-晚期连同参照病毒MVA-EGFP一起充当IFN-βmRNA诱导的阴性对照(图16B)。因此，从MVA载体产生早期dsRNA也可通过从天然早期MVA基因产生早期表达的反义转录物而非插入两个部分或完全相同的异源性序列来实现。
实施例16：EGFP dsRNA形成
为证明在受MVA-dsEGFP 720(o)感染的细胞中从EGFP基因的有义和反义转录物形成dsRNA，我们使用
Figure BDA0000988950620000611
方法，关于AraC处理(40μg/ml)的BALB/3T3-A31细胞的每种病毒，分离并组合来自两个6孔的总RNA。DNA酶处理的总RNA样品用单链特异性RNA酶A和T1(Ambion)或用RNA酶A/T1加dsRNA特异性RNA酶V1(Ambion)以总体积20μl在37℃下消化1小时。使用RNA Clean&Concentrator试剂盒(Zymo Research,Freiburg,Germany)纯化消化的RNA样品和未处理的对照样品(未消化)，并且在95℃下变性3分钟。采用可商购获得的EGFP
Figure BDA0000988950620000612
测定(Mr04329676_mr，Life Technologies)，如上所述进行逆转录和定量PCR。计算由未消化的RNA样品的一式两份qPCR反应获得的超过模拟的EGFP RNA诱导倍数平均值，并且设为100％。采用从受MVA-EGFP和MVA-dsEGFP-720(o)感染的细胞获得的在A/T1和A/T1/V1消化之后的EGFP RNA诱导倍数值计算剩余EGFP RNA的百分比。
实施例17：细胞和病毒
通过标准程序来从15天龄C57BL/6-IFNAR0/0和14天龄C57BL/6-IPS-10/0胚胎制备IFNAR0/0和IPS-10/0小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)，并且制备PKR0/0MEF和相应PKR充足的对照MEF。所有细胞系都在补充以10％胎牛血清(FCS，Pan Biotech,Aidenbach,Germany)的杜贝卡氏改良依格培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，Gibco/Invitrogen,Darmstadt,Germany)中培养。原代鸡胚胎纤维母细胞(CEF)从11天龄含胚鸡卵制备，并且在VP-SFM(Gibco)中培养以供病毒储备物产生，或在补充以10％FCS的DMEM中培养以供复制分析。通过与重组鼠类GM-CSF(tebu-bio,Offenbach,Germany)一起培养来从新鲜制备的鼠类骨髓产生GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)依赖性树突细胞(GM-DC)。
用继代CEF或DF-1细胞使野生型MVA(MVA)和MVA突变株增殖，并且使用如(45)Meisinger-Hentschel等,2007.J Gen Virol.84:3249-3259中所述的TCID50方法，用CEF细胞加以滴定。用Vero细胞使野生型CVA(CVA)和CVA突变株增殖，并且通过TCID50方法用CV-1细胞加以滴定。从ATCC获得休普纤维瘤病毒(VR-364)，并且用兔角膜SIRC细胞使其增殖并加以滴定。从Charles River Laboratories以2000HA单位/ml获得仙台病毒株Cantell。用于动物实验中的所有病毒都通过36％蔗糖垫层来纯化两次。
实施例18：感染性病毒的BAC重组工程改造和再活化
先前已描述CVA和MVA-BAC的构建(Lee和Esteban,1994.Virology 199:491-496)。对于产生表达有义和反义EGFP mRNA的MVA重组体和所有相应对照，用细菌四环素抗性盒替换这些构建体的BAC骨架中的neo-IRES-EGFP盒。MVA-EGFP重组体在EGFP ORF的下游含有细菌卡那霉素抗性盒(NPT I)，其受控于强力早期/晚期pHyb启动子。通过在大肠杆菌中同源性重组来用NPT I卡那霉素抗性盒替换核苷酸42697-43269(ORF MVA050L)以获得MVA-ΔE3L。
对于感染性病毒的再活化，使用
Figure BDA0000988950620000621
HD(Promega,Mannheim,Germany)，用3μg BAC DNA转染106个BHK-21细胞，并且60分钟后，用休普纤维瘤病毒感染以提供所需辅助功能。分离再活化的病毒，并且移除辅助病毒，如先前所述(Meisinge(Meisinger-Henschel等(2007),J.Gen.Virol.88:3249-3259)。
实施例19：小鼠感染实验
在关于每只小鼠用于PBS中稀释至最终体积50μl的2×106、1×107和5×107TCID50的CVA和CVA突变株鼻内感染之前，通过氯胺酮/甲苯噻嗪注射来使小鼠麻醉。将动物称重，并且持续两周每日检查，并根据任意标度将疾病征象从0至4进行评分。对于全身性细胞因子水平的分析，用200μl相应病毒稀释物静脉内注射小鼠，并且6小时后通过尾部静脉来放血。
实施例20：通过细胞测量珠粒测定进行的全身性细胞因子水平分析
依据制造商说明书，通过针对指示的小鼠细胞因子的基于珠粒的FlowCytomix测定(eBioscience,Frankfurt,Germany)来测定在静脉内感染之后6小时抽取的小鼠血清中的细胞因子浓度。使用非参数性曼-惠特尼U检验(non-parametric Mann-Whitney U test)来分析各处理组之间的差异的统计显著性。通过除以组数(例如在B6129SF2/J小鼠中测试的11种细胞因子和趋化因子)来对总体显著性水平(0.05)进行邦弗伦尼(Bonferroni)校正，即对于各B6129SF/2处理组之间的比较，总体邦弗伦尼校正水平被设为0.05/11＝0.00455。
本发明的其它实施方案将由考虑本文公开的本发明的说明书和实施而为本领域技术人员显而易知。意图说明书和实施例仅被视为具有示例性，其中本发明的真正范围和精神由以下权利要求指示。
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Claims (30)

1.一种重组痘病毒，其包含在感染早期表达过量双链RNA(dsRNA)的异源性核酸，其中产生dsRNA的所述异源性核酸包含编码部分或完全互补RNA转录物的序列，其中编码互补RNA转录物的序列的表达各自由早期或即刻早期痘病毒启动子指引，其中RNA转录物的互补部分在转录之后退火以形成dsRNA，其中所述RNA转录物的互补部分重叠大于150个核苷酸，并且其中痘病毒是改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)或绒毛膜尿囊安卡拉症苗病毒(CVA)。
2.如权利要求1所述的重组痘病毒，其进一步包含编码一种或多种共刺激分子的异源性序列。
3.如权利要求2所述的重组痘病毒，其中所述一种或多种共刺激分子是TRICOM(B7-1、ICAM-1和LFA-3)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的重组痘病毒，其进一步包含编码一种或多种细菌、病毒、真菌、寄生虫或肿瘤抗原的异源性序列。
5.如权利要求1所述的重组痘病毒，其中所述互补RNA转录物包含蛋白质编码开放阅读框(ORF)或非蛋白质编码基因。
6.如权利要求1至3和5任一项所述的重组痘病毒，其中所述RNA转录物的所述互补部分重叠150个至1000个核苷酸。
7.如权利要求1至3和5任一项所述的重组痘病毒，其中所述RNA转录物的所述互补部分重叠300个至1000个核苷酸。
8.如权利要求1至3和5任一项所述的重组痘病毒，其中所述RNA转录物的所述互补部分重叠超过700个核苷酸。
9.如权利要求5所述的重组痘病毒，其中编码完全或部分互补RNA转录物的所述异源性核酸在互补区域内是相同的，或在互补区域内具有大于95％的相似性。
10.如权利要求9所述的重组痘病毒，其中编码部分或完全互补转录物的两个相同或高度相似序列被一个或多个必需病毒基因分隔。
11.如权利要求10所述的重组痘病毒，其中有义信使RNA(mRNA)从所述两个相同或高度相似序列中的一个转录，并且反义mRNA从另一相同或高度相似序列转录。
12.如权利要求11所述的重组痘病毒，其中有义和反义RNA从相同异源性序列插入物的两个链转录。
13.如权利要求11所述的重组痘病毒，其中有义和反义RNA从天然痘病毒序列的两个链转录。
14.如权利要求11所述的重组痘病毒，其中有义和反义RNA从早期基因的两个链转录。
15.如权利要求11所述的重组痘病毒，其中有义和反义RNA从即刻早期基因的两个链转录。
16.一种免疫原性组合物或药物组合物，其包含权利要求1至15任一项所述的重组痘病毒和药学上可接受的载体或赋形剂。
17.权利要求1至15任一项所述的重组痘病毒在制备用于增强脊椎动物受试者的先天性免疫活化的药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述药物组合物增强所述受试者中I型干扰素(I型IFN)、细胞因子和趋化因子的产生。
19.如权利要求18所述的用途，其中I型IFN的产生包括干扰素-β(IFN-β)编码信使RNA(mRNA)的转录，并且其中IFN-βmRNA的转录增加至少2倍。
20.如权利要求19所述的用途，其中IFN-β编码mRNA的转录增加至少10倍。
21.如权利要求20所述的用途，其中IFN-β编码mRNA的转录增加至少50倍。
22.如权利要求18所述的用途，其中I型IFN的产生包括IFN-β蛋白的分泌，并且其中IFN-β蛋白的分泌增加至少2倍。
23.如权利要求22所述的用途，其中IFN-β蛋白的分泌增加至少4倍。
24.如权利要求23所述的用途，其中IFN-β蛋白的分泌增加至少10倍。
25.如权利要求18所述的用途，其中施用增强细胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-6和IL-18的产生。
26.如权利要求18所述的用途，其中施用增强趋化因子CXCL1、CCL2和CCL5的产生。
27.如权利要求18所述的用途，其中施用所述药物组合物使载体特异性CD8 T细胞的产生增强至少10％。
28.如权利要求18所述的用途，其中施用所述药物组合物使载体特异性CD8 T细胞的产生增强25％。
29.如权利要求18所述的用途，其中施用所述药物组合物使载体特异性CD8 T细胞的产生增强超过50％。
30.如权利要求1至3和5任一项所述的重组痘病毒，其中用于产生所述重组痘病毒的重组痘病毒是MVA-BN。
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