UA127337C2 - Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування - Google Patents

Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA127337C2
UA127337C2 UAA201606912A UAA201606912A UA127337C2 UA 127337 C2 UA127337 C2 UA 127337C2 UA A201606912 A UAA201606912 A UA A201606912A UA A201606912 A UAA201606912 A UA A201606912A UA 127337 C2 UA127337 C2 UA 127337C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
virus
mma
ifn
tug
guz
Prior art date
Application number
UAA201606912A
Other languages
English (en)
Inventor
Юрген Хаусманн
Міхаель Вольферштеттер
Михаэль Вольферштеттер
Original Assignee
Баваріан Нордік А/С
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Баваріан Нордік А/С, Бавариан Нордик А/С filed Critical Баваріан Нордік А/С
Publication of UA127337C2 publication Critical patent/UA127337C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Винахід стосується рекомбінантного поксвірусу, який містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що визначають надлишок дволанцюгової РНК (длРНК) на ранній стадії інфекції, які можуть додатково містити гетерологічні нуклеїнові кислоти, що кодують одну або більше костимулюючих молекули, і/або гетерологічні нуклеїнові кислоти, що кодують один або більше інфекційних асоційованих із захворюванням антигенів або пухлино-асоційованих антигенів, а також фармацевтичні композиції, що містять такий рекомбінантний поксвірус і спосіб і їх застосування. Рекомбінантний поксвірус посилює природжену і адаптивну імунну активацію у суб'єктів у порівнянні з ідентичними рекомбінантними поксвірусами з відсутніми гетерологічними або природними транскрипційними одиницями, які визначають надлишок ранньої длРНК.

Description

(54) РЕКОМБІНАНТНИЙ ПОКСВІРУС ДЛЯ ІНДУКЦІЇ ПОСИЛЕНОЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ ТА ЙОГО
ЗАСТОСУВАННЯ
(57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантного поксвірусу, який містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що визначають надлишок дволанцюгової РНК (длРНК) на ранній стадії інфекції, які можуть додатково містити гетерологічні нуклеїнові кислоти, що кодують одну або більше костимулюючих молекули, і/або гетерологічні нуклеїнові кислоти, що кодують один або більше інфекційних асоційованих із захворюванням антигенів або пухлино-асоційованих антигенів, а також фармацевтичні композиції, що містять такий рекомбінантний поксвірус і спосіб і їх застосування. Рекомбінантний поксвірус посилює природжену і адаптивну імунну активацію у суб'єктів у порівнянні 3 ідентичними рекомбінантними поксвірусами з відсутніми гетерологічними або природними транскрипційними одиницями, які визначають надлишок ранньої длРНК.
ВІН ВК
Не нт щи с Пе: ї у 3 і ЕН ння онов КБ 7 У ее нти и у
СУКАВІ; Ї ВИК ВЕ 1 7 ї
ЕЕ, Гл Ї
МАВ Кк 1 Й Ї ; р мс, же Ку і яви ОО Чет З, Її
СУкотнодвіяво Б РО У фе
ВЕКТОРНІ КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ ІНДУКЦІЇ ПОСИЛЕНОЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ ІЗ
ЗАСТОСУВАННЯМ ВЕКТОРІВ ПОКСВІРУСУ
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
ЇОО1| Винахід, запропонований у цьому документі, відноситься до рекомбінантних поксвірусів, які містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що кодують комплементарну РНК, яка утворює дволанцюгову РНК (длРНК) на ранньому етапі інфекції. Рання длРНК також може бути згенерована шляхом транскрибування обох ниток нативних генів рекомбінантних поксвірусів.
Рекомбінантні поксвіруси, запропоновані у цьому документі, можуть додатково містити гетерологічні нуклеїнові кислоти, які кодують одну або більше костимулюючих молекул, і/або гетерологічні нуклеїнові кислоти, які кодують один або більше асоційованих із захворюванням антигенів або пухлино-асоційованих антигенів. Ці рекомбінантні поксвіруси посилюють природжену й адаптивну імунну активацію у суб'єкта у порівнянні з ідентичними рекомбінантними поксвірусами з відсутніми гетерологічними нуклегїновими кислотами, що експресують ранню длРНК. Також у цьому документі запропоновано фармацевтичні композиції, які містять будь-який із рекомбінантних поксвірусів, запропонованих у цьому документі, а також способи і застосування таких рекомбінантних поксвірусів.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
І002| Імунна система розпізнає різні патогени, включаючи віруси, за допомогою рецепторів розпізнавання патернів (РЕК), які виявляють патоген-асоційовані молекулярні патерни (РАМР).
РЕК включають сімейство Толл-подібних рецепторів (ТІК), КІС-подібних хеліказ (КІН), МОЮ- подібних рецепторів (МІК) і інших поки що не настільки добре визначених РЕК (Імазакі (2012),
Аппи. Вем. МістобіоІї. 66:177-196; Оебтеї й Івпії (2012), Маї. Нем. Іттипої. 12:479-491;
Меї!спіогзеп (2013), Мігиве5. 5:470-527). Активація РКК призводить до активації різних імунних клітин, включаючи дендритні клітини (ОС), і можливої індукції природжених й адаптивних імунних відповідей. Активація РКК також призводить до індукції противірусного стану в неімунних клітинах внаслідок індукції та дії інтерферонів типу І (ІФН), які включають ІФН-альфа (ІФН-О) ії ІФН-бета (ІФН-РД), а також індукції та дії інших цитокінів і хемокінів, які попереджають про небезпеку ще неінфіковані клітини-хазяїв і координують імунну відповідь. ІФН типу І регулює багато аспектів імунної відповіді, у тому числі природжені механізми стійкості до патогенів, а
Зо також вироблення антитіл й активацію Т-клітин, наприклад, викликаючи підвищення експресії
ГКГС класу І і ІЇ, крос-презентацію й активацію ОС (Імазакі 5 Меалпийом (2010), Зсіепсе 327:291- 295; Оезтеї 5 Івпії (2012), Маї. Неу. Іттипої. 12:479-491). 003) Важливий для організму спосіб виявлення присутності вірусів полягає у розпізнаванні вірусної РНК або ДНК як нормальними, так і імунними клітинами. ТІ КЗ, ТІ 7/8, ТІ 9 і ТІ К13 були ідентифіковані як рецептори для дволанцюгової РНК (длРНК), одноланцюгової РНК (оЛРНК), ДНК їі рибосомальної РНК (рРНК), відповідно. Віруси з дволанцюговою ДНК (длдДнНК), подібною до генома герпесвірусів, аденовіруси та поксвіруси розпізнавалися за допомогою
ТІ В89-залежного та ТІ Ко-незалежного шляху (Носпгеїп еї а!. (2004), Ргос. Маї!. Асад. бсі. 0. 5. А 101:11416-11421; бЗативє!б55оп еї аї. (2008), 9У. Сіїп. Іпмеві 118:1776-1784). Попередня робота показала, що поксвіруси ефективно інгібують як ТІ ВО-залежний, так і ТІ В9-незалежний шляхи розпізнавання длДНнК. 004 Виявлення ДНК поксвірусу імунними клітинами через ТІ ВЗ призводить до вироблення інтерферонів типу І (наприклад, ІФН-а/р) й інтерферонів типу І! (наприклад, ІФН-Х), а також інших цитокінів і хемокінів (І ашегбасн еї а!. (2010), 9. Ехр. Мед. 207:2703-2717; Зативе!550п евї аї. (2008), У. Сііп. Іпмеві 118:1776-1784). Плазмоцитоїдні ОС (рос) вибірково здатні продукувати великі кількості ІФН-Ї та ІФН-І у відповідь на ТІ Н7/8- або ТІ КЗО-залежну стимуляцію. У разі РОС
ТТГ НЗ-залежна стимуляція призводить до продукування ІФН-ЇІ та ІФН-П. Як ДНК, так і інші вірусні нуклеїнові кислоти розпізнаються у цитоплазмі інфікованих клітин, тим самим подаючи цим клітинам сигнал до продукування ІФнН-Ї та ІФН- серед інших цитокінів. ТІ КУ9-незалежні шляхи розпізнавання поксвірусу в основному використовуються різними підгрупами звичайних дендритних клітин (СОС) (Носпгеїп 4. О'Кееїйе (2008), Напароок Ехр Рпапгтасої 183:153-179).
І005) Іншою важливою характерною рисою вірусного інфікування є длРНК, яка генерується у разі інфікування клітин не лише РНК-вірусами, але також і поксвірусами, які мають геном
ДЛДНК. У разі поксвірусної інфекції длРНК генерується шляхом перекриттям транскрипції генів, розташованих як на верхній, так і на нижній нитці генома длДНК. Зокрема, термінація транскрипції проміжних і пізніх генів не є жорстко регульованою, що призводить до утворення вірусної МРНК з довгими З нетрансльованими областями (3 НТО) гетерогенної довжини (Соорег, Му/їшек, апа Мов5 (1981), 9. Мігої. 39:733-745; Хіапоу еї а!. (1998), 9. Мігої. 72:7012-7023).
Коли такі транскрипти походять від двох сусідніх генів, що знаходяться у протилежній орієнтації бо (наприклад, які транскрибуються у напрямі один до одного), транскрипція призводить до утворення комплементарних ділянок мРНК, що перекриваються і формують длРНК шляхом гібридизації одна з одною або з ранніми транскриптами (Воопе, Раїт, апа Мо55 (1979), У Мігої. 30:365-374). Генерація вірусної длРНК значною мірою обмежена пізньою фазою циклу реплікації поксвірусу (Соїбу 5 Юиезбегуд (1969), Маїшге 222:940-944; Юцезрегу 4 СоіІру (1969),
Ргос. Майї). Асай. сі 0. 5. А 64:396-403; Мов (2007),5:2905-2945). Раніше повідомлялося, що
ДЛРНК вірусних транскриптів виявляються на ранній стадії інфекції (Воопе, Раїт, апа Мо55 (1979), У Міюї. 30:365-374; І упсп еї аї. (2009), Мігоїоду 391:177-186; МЛїїїв еї аї. (2009), Мігоїоду 394:73-81; ММШів, І апдіапа, апа Зпівієг (2011), 9. Віої. Спет. 286:7765-7778). Проте, схоже, що існує селективний тиск, який запобігає генерації достатньої кількості ранньої длРНК для запуску клітинної системи розпізнавання, наприклад, шляхом забезпечення ефективної термінації транскрипції суміжних ранніх генів, які транскрибуються у протилежних напрямах (Зтій,
Зутопе, апа АїЇсаті (1998), бетіпагз іп Мігоїоду 8:409-418). У поксвірусах розвинувся специфічний сигнал ранньої термінації з послідовністю ТТТТТМТ на кодуючому ланцюзі, який припиняє ранню транскрипцію на 20-50 нуклеотидів нижче цієї послідовності (Меп б Мо55 (1987), Ргос. Маї!. Асад. 5сі 0. 5. А 84:6417-6421). Ранні гени, транскрибовані у напрямі один до одного, зазвичай містять множинні сигнали термінації що вказує на те, що жорстке регулювання ранньої термінації транскрипції поблизу таких генів дозволяє уникнути вироблення комплементарної РНК на ранній стадії інфекції, що вочевидь є важливим для пристосованості вірусу.
ІООб) У клітинах й організмах-хазяях існує велика кількість рецепторів розпізнавання длРНК для виявлення вірусної інфекції. Тоді як ТІ АЗ в основному експресується в імунних клітинах і може сприймати позаклітинну длРНК, більшість інших рецепторів длРНК, таких як ВІС-І, МОА-5, рох1/00Х21/0НХ36, опротеїнкіназа ВА (РКЕА), і 2'-5'-олігоаденілатсинтетаза (2-5-ОАБ5), експресуються в усіх органах і типах клітин-хазяїв і локалізовані в цитоплазмі клітини. Щодо індукції ІФН типу І, вважається, що НВІС-І і МОА-5 представляють найбільш важливі цитозольні рецептори длРНК для виявлення вірусної інфекції (Меїспіогзеп (2013), Мігибе5. 5:470-527).
Вважається, що інший важливий рецептор длРНК - активована длРНК протеїнкіназа В (РКЕ) - здійснює свою противірусну роль, головним чином, шляхом фосфорилювання фактора елонгації трансляції еІг2а, що призводить до припинення клітинної та вірусної трансляції, таким
Зо чином обмежуючи реплікацію вірусу. (Сагсіа еї а!. (2006), Містгобіо!. Мої. Віо!І. Нем. 70:1032-1060;
УМ Шіатв (1999), Опсодепе 18:6112-6120). Також існують свідоцтва того, що РКЕ відіграє роль в індукції ІФН типу І. (Ватту еї аї!. (2009), ) Сіеп. Мігої. 90:1382-1391; сінмоу є Мазоп (2007), у Мігої. 81:11148-11158).
ЇОО7| Для інгібування противірусної дії, викликаної длРНК, у поксвірусах призначено щонайменше два білки, ЕЗ і КЗ, для інгібування важливого рецептора длРНК - РКА. Обидва вірусні білки детально вивчалися. Серед них основним є ЕЗ. ЕЗ зв'язує і ізолює длРНК й інгібує активацію РКК. Мутанти вірусу вісповакцини (МАСУ), позбавлені гена ЕЗІ (МАСМУ-ДЕЗІ), мають обмежений круг хазяїв й індукують апоптоз у багатьох типах клітин (Ногпетапп еї аї. (2003), 4.
Мігої. 77:8394-8407; Кіріег єї а!. (1997), У Мігої. 71:1992-2003), що дозволяє припустити, що РКЕ- опосередкований апоптоз є основним результатом активації РКК у МАСУ-інфікованих клітинах.
Проте, також повідомлялося про вищу чутливість МАСМУ-ДЕЗІ. до обробки ІФНІ (Веаціє, Раоіеці, апа Тападіа (1995), Мігоюду 210:254-263) і підвищену індукцію ІФН-а/В у пре-апоптичних клітинах, інфікованих МАСМ-мутантами з видаленим ЕЗ (Ногпетапп еї аї. (2003), 9. Мігої. 77:8394-8407). У цьому документі описано спосіб індукції активації РКК у клітинах, інфікованих модифікованим вірусом вісповакцини Анкара (ММА) і хоріоалантоїсним вірусом вісповакцини
Анкара (СМА), який не призводить до виявлюваних загибелі клітин або апоптозу, але який запускає вивільнення великої кількості ІФН-а/В й інших хемокінів і цитокінів. Це було досягнуто шляхом експресії длРНК на ранній стадії інфекції до початку реплікації ДНК. Стабільна експресія длРНК була досягнута шляхом транскрипції двох комплементарних мРНК із двох незалежних вставок рекомбінантного гена. У випадку з СМА, індукція ІФН типу І призводила до майже непатогенної інфекції у мишей, і цей результат залежав від наявності функціональної системи ІФН типу І.
І008| ММА було розроблено за допомогою 2570 пасажів повністю реплікаційно- компетентного штаму вакцини віспи хоріоалантоїсного вірусу вісповакцини Анкара (СМА) (Меїізіпде!-Непзсенеїі еї аї. (2007), У. Сеп. Міко!. 88:3249-3259) на фібробластах курячого ембріона.
Було показано, що реплікаційно-компетентний СХУА слабко індукував ІФН-Ї, тоді як реплікаційно- рестриктований ММА досить ефективно індукував ІФН-Ї (Зативє!550п еї аї. (2008), у. Сііп. Іпмеві 118:1776-1784). Інгібування СМА вироблення ІФН-І| частково було опосередкованим ІФн-І- зв'язуючим білком поксвірусу (ІФН-ІР), що кодується геном В19В. Білок В19 зв'язується з ІФН-а і бо таким чином інгібує його біологічну активність. Крім того, зв'язування В19 з інтерферонами типу
Ї також запобігає виявленню ІФН-а/р за допомогою методів аналізу на основі антитіл, вказуючи на те, що білок В19 також зв'язує людський ІФН-ВД. На відміну від людської системи, В19 не зв'язує мишачий ІФН-ВД. Гомологи ІФН-І-зв'язуючого білка поксвірусу, що кодуються ВРЗ В19Н, присутні у ряді видів поксвірусу, що дозволяє припустити, що цей механізм для інгібування активності ІФН-Ї в більш загальному випадку є консервативним для поксвірусів. Дивіться, наприклад, Фігуру 17.
ЇО09| Зв'язуюча В19 активність ІФН типу І є не єдиним механізмом інгібування, використовуваним поксвірусами для пригнічення ефекторних функцій або індукції ІФн-Ї.
Поксвіруси кодують ряд факторів, що руйнують систему інтерферонів типу І їх хазяїв.
Інтерферони мають найважливіше значення в противірусному захисті, так як вони індукують противірусний стан клітинах, які експресують рецептори ІФН, і регулюють природжену й адаптивну імунну відповідь хазяїна. Серед відомих поксвірусних факторів, протидіючих системі інтерферонів, є секретовані рецептор-подібні білки В19 і В8, які зв'язують і нейтралізують інтерферони типу І і типу ІїЇ, відповідно. Інші поксвірусні білки, такі як МАСМ ЕЗ, К7, Сб, М1, С7,
КІ, КЗ ї НІ, інгібують індукцію інтерферону типу І або блокують сигнальні й ефекторні шляхи інтерферону. Той факт, що поксвіруси кодують таку велику кількість білків, щоб протидіяти системі інтерферонів, підкреслює важливість цієї системи природженого імунного захисту для регулювання і остаточного кліренсу поксвірусів інфікованим організмом-хазяїном. Окрім системи інтерферонів, ортопоксвіруси кодують інші імуномодулюючі білки, які перешкоджають індукції або функціонуванню цитокінів, таких як ІІ -1рД, І -18, і хемокінів, включаючи МАСМ В16бК,
УУКО13, С23І /уС СІ. Ці цитокіни також відіграють важливу роль в обмеженні поширення патогена та захисті хазяїна від важкого ураження, індукованого патогеном. Поксвірусні білки, що руйнують шляхи розпізнавання патерну, є універсально ефективними для попередження індукції ІФН, а також інших цитокінів і хемокінів.
ІО10| Відповідно, основною метою цього винаходу є підвищення розпізнавання поксвірусів клітинними рецепторами длРНК, а також підвищення природженої імунної активації, індукованої
ММА. У цьому документі описано рекомбінантні поксвіруси, сконструйовані для вироблення
ДЛРНК на ранній стадії інфекції шляхом вставки двох частково ідентичних ДНК у двох окремих ділянках у геномі. Ця ДНК функціонально зв'язана із активними ранніми промоторами,
Зо орієнтованими таким чином, що одна ДНК утворює "смисловий" транскрипт, а інша утворює комплементарний "антисмисловий" транскрипт. Два частково або повністю комплементарних транскрипта потім гібридизують для отримання длРНК. Ефективну індукцію ІФН-Д, важливий маркер природженої імунної активації, спостерігали з ранніми длРНК в широкому діапазоні розмірів, при цьому ефективність зменшувалася у разі вкорочення комплементарних транскриптів до 50 п.о.
СУТЬ ВИНАХОДУ
011) Цей винахід включає рекомбінантний поксвірус, який містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що у надлишку експресують дволанцюгову РНК (длРНК) на ранній стадії інфекції. В одному варіанті реалізації винахід включає спосіб посилення природженої імунної активації, який включає введення рекомбінантного поксвірусу хребетному суб'єкту, при цьому зазначене введення підвищує вироблення інтерферонів типу І (ІФН типу І), цитокінів і хемокінів у суб'єкта.
ІО12)| У додатковому варіанті реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус транскрибує смислову й антисмислову РНК з обох ниток нативної послідовності поксвірусу переважно раннього гена, переважніше негайно-раннього гена.
ІО13| У додатковому варіанті реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус транскрибує гетерологічну нуклеїнову кислоту у вигляді смислової й антисмислової РНК з обох ниток гетерологічної послідовності. 014) У додатковому варіанті реалізації винахід включає спосіб послаблення стандартних реплікаційно-компетентних штамів вірусу вісповакцини та інших видів, отриманих від поксвірусів хребетних спогдорохмігіпае шляхом експресії надлишку ранньої длРНК.
ІО15| У різних варіантах реалізації винаходу поксвірус додатково містить гетерологічні послідовності, які кодують одну або більше костимулюючих молекул.
ІО16)| У різних варіантах реалізації винаходу поксвірус додатково містить гетерологічні послідовності, які кодують один або більше бактеріальних, вірусних, грибкових, паразитарних або пухлинних антигенів.
ІЇО17| У різних варіантах реалізації винаходу поксвірус являє собою ортопоксвірус, парапоксвірус, вірус віспи Тана і Яба (віспи мавп), вірус віспи птахів, вірус міксоми кроликів, вірус віспи свиней, вірус віспи овець, вірус віспи оленів або вірус контагіозного молюска.
Ортопоксвірус може бути вибраним із групи, що включає вірус вісповакцини, вірус коров'ячої бо віспи та вірус віспи мавп. Вірус вісповакцини може бути модифікованим вірусом вісповакцини
Анкара (ММА), наприклад, модифікований вірусом вісповакцини АпКага Вамагіап Могаїс (ММА-
ВМ).
ІО18) У різних варіантах реалізації винаходу гетерологічні або ендогенні нуклеїнові кислоти, що генерують длРНК, містять послідовності, які кодують частково або повністю комплементарні транскрипти РНК, при цьому комплементарні частини транскриптів РНК гібридизують після транскрипції для утворення длРНК. 019) У різних варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеїнові кислоти, які кодують повністю або частково комплементарні транскрипти РНК, є ідентичними в межах комплементарної області або мають ступінь схожості, що складає більш ніж 99 95, більш ніж 95 95, більш ніж 90 95, більш ніж 80 95 або більш ніж 70 95 в межах комплементарної області. 020) Додаткові цілі та переваги цього винаходу будуть частково викладені в описі, який наведено нижче, а частково стануть очевидними із опису, або можуть бути виявлені у разі практичної реалізації цього винаходу. Цілі та переваги цього винаходу будуть реалізовані та досягнуті за допомогою елементів і комбінацій, конкретно зазначених у формулі винаходу, що додається.
І021| Варто розуміти, що як наведений вище загальний опис, так і подальший детальний опис є виключно ілюстративними й пояснювальними і не обмежують заявленого винаходу.
І022| Додані графічні матеріали, які включені в опис і складають частину цього опису, ілюструють один(декілька) варіант(ів) реалізації винаходу і разом з описом слугують для пояснення принципів винаходу.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
І023| Фігура 1 демонструє схематичне зображення мутантів СМА, які характеризуються підвищеним виробленням ранньої длРНК, і відповідних контрольних мутантів. Прямокутники представляють ВРЗ (відкриті рамки зчитування) СМА у геномній області між ВРЗ В14К і В2ОК і не є зображеними у масштабі. Прямокутник, що представляє СМА-версію ВРЗ В15, наведено у чорному кольорі, тоді як ММА-версію В15К позначено ромбовидною текстурою. Заштрихований прямокутник представляє ВРЗ В19К. Всі інші ВРЗ наведено у вигляді сірих прямокутників.
Бактеріальні селектовані маркери (неог і зеог), які замінюють ВРЗ СМА у різних делеційних мутантах, наведено у вигляді малих прямокутників з вказівкою конкретного маркера.
Зо І024| Фігура 2 демонструє вірулентність СМА-длнео-АВ15 і споріднених мутантів СМА у випадку мишей ВАГВ/с. Групи з трьох-п'яти самиць мишей ВАЇВ/с у віці 6-8 тижнів інтраназально інфікували 50 мл інокулянта, який містив 5 х 107 (А, В права панель) або 107
ТСІО5О0 (В ліва панель, С) очищеного вихідного розчину зазначених мутантів СМА. А) і В) демонструють результати незалежних експериментів, в яких використовували різні групи мутантів СМА. Тварин щоденно перевіряли і зважували у зазначені дні. Дані маси тіла виражені у вигляді відсоткової долі середньої маси -/-СПС відповідної групи, починаючи з вихідної середньої маси у 0 день. Хрестики вказують число загиблих тварин у відповідні дні. С) Легені 6- 8-тижневих самиць мишей ВАГ! В/з, інтраназально інфікованих 107 ТСІО50 очищеного вихідного розчину зазначених вірусів, було відновлено за шість днів після інфікування. Легені гомогенізували і визначали вірусні титри за допомогою стандартного аналізу ТСІО5Б0О, використовуючи клітин СУ-1. Зазначено середні значення загальних вірусних титрів у легенях для двох незалежних експериментів всього для 8 мишей на вірус. 7 - р '« 0,001 згідно з 1- критерієм Стьюдента. 0251 Фігура З демонструє вірулентність СМА-длнео-АВ15 у мишей ІМЕАКО/О. А) Зазначені кількості мишей С57ВІ /6-ІМЕАКО/Ю обох статей віком 9-18 тижнів інфікували інтраназально 50 мл інокулянта, що містив 2 х 106 ТСІ0О5О неочищеного вірусного вихідного розчину або 107
ТСІ0О50 очищеного вихідного розчину СМА і СМА-длнео-ДАВ15. Тварин щоденно перевіряли і зважували у зазначені дні. Дані маси тіла виражені у вигляді відсоткової долі середньої маси тж/-
СПе відповідної групи, починаючи з вихідної середньої маси у 0 день. В) Виживання мишей показано на А). 026) Фігура 4 демонструє індукцію ІФН-а і ІФН-Х у ОС за допомогою СМА-длнео-АВ15. РІ -ОС від мишей С57ВІ/6 дикого типу інфікували зазначеними вірусами за зазначеної МОЇ упродовж 18 ч. Супернатанти культур ОС аналізували щодо ІФН-а і ІФН-А методом ІФА. СМА і СМА-АВ15 не індукують утворення виявлюваної кількості ІФН-а.
І027| Фігура 5 демонструє кінетику індукції МРНК ІФН-В за допомогою СМА-длнео-АВ15 в клітинах АЗІ і роль вставки касети нео. А) Мишачі клітини ВАГ В/3ТЗ3 АЗІ удавано інфікували або інфікували очищеним вихідним розчином ВАС-похідного ММА або СМА дикого типу і мутантів СМА СМА-длнео-АВІ15 і СМА-АВ15 за МОЇ 10 для зазначених часів. Проводили лізис клітин, а РНК із клітинних лізатів отримували, використовуючи набір СОІАСЕМ ЕМеабзу. бо Контамінуючу геномну ДНК видаляли, використовуючи колонки для видалення ДНК (ГДНК) від
ОІАСЕМ з подальшою додатковою ДНКазною обробкою Тигбо-ДНКазою (АтБбіоп) упродовж 1 години за 37 "С і подальшою термічною інактивацією ДНКази за 65 "С упродовж 10 хвилин.
Рівні мРНК ІФН-В визначали за допомогою комерційного аналізу генної експресії для мишачого
ІФН-В (Арріїей Віозузіет5, Дармштадт, Німеччина). Показано рівні транскриптів ІФН-В в інфікованих клітинах відносно рівня мРНК ІФН-Д в удавано-інфікованих клітинах, виражені як кратність збільшення кількості мРНК ІФН-ВД. В) Клітини АЗІ1 удавано інфікували або інфікували неочищеним вихідним розчином СМА і зазначеними мутантами СМА (дивіться Фігуру 1 для загальної уяви) за МОЇ 10 упродовж 6 годин. Отримання РНК для кількісного визначення мРНК
ІФН-В проводили як описано в А). Показано рівні транскриптів ІФН-В в інфікованих клітинах відносно рівня мРНК ІФН-Д у удавано-інфікованих клітинах, виражені як кратність збільшення кількості МРНК ІФН-ВД. 1: СМА; 2: СМА-длнео-АВ15/819; 3: СМА-длнео-АВ15; 4: СМА-АВ15; 5:
СМА-зео-АВ15; 6: СМА-ДрВ15-нео-АВ15; 7: контроль. 028) Фігура 6 демонструє схематичне представлення ЕСЕР- і нео-вставок мутантів ММА, які виробляють длРНК. Зазначено напрям транскрипції кодуючих послідовностей для нео і ЕСЕР (чорні стрілки), контрольованих промоторами р5, рНуб або рВ15К. ВРЗ і усі інші елементи зображено не в масштабі. А) ВРЗ нео є частиною селекційної касети нео-ІВЕ5-ЕСЕР у межах касети ВАС (Меїізіпдег 2010). Останню вставляють в міжгенну область (ІК) ІЗІЛАЇ. (МУАОб4/065). Касети нео-ІВЕ5-ЕСЕР транскрибується під управлінням промотора ро (позначено стрілкою), тоді як касета нео/гроЇ у локусі ВІТ5К транскрибується у зворотній орієнтації під управлінням промотора ВІ15К. ВРЗ нео у межах однієї конструкції ММА перекриваються упродовж 792 нуклеотидів (позначено сірим прямокутником) з однією розбіжністю. У ММА-длнео-ДВ15/АВАС було видалено повну касету ВАС у ІК ІЗІЛ/4| за допомогою рекомбінації СтеЛох. В) Усі конструкції ММА-длЕСЕР у В) грунтовані на рекомбінанті
ММА, із якого було видалено касету нео-ІВЕ5-ЕСЕР у межах касети ВАС. У ММА-ЕСЕР касету нео-ІВЕ5-ЕСЕР було замінено геном нео. ВРЗ ЕСЕР, транскрибовану у смисловій орієнтації у
ММУА-ЕСЕР, було вставлено в ІК між ВРЗ А25І і А26Ї (ММА136/137), тоді як ВРЗ ЕСЕР, транскрибовану у антисмисловій орієнтації, було вставлено в ІБК 9О2БК/ІЗК (ММУАО86/087).
Потенційні ділянки длРНК, утворені перекриттям комплементарних транскриптів ЕСЕР, позначено сірими смугами. Сусідні ВРЗ зазначено тільки для ММА-ЕСЕР і ММА-длЕСЕР.
Зо Послідовність Іасга у З'кінці антисмислового транскрипту ЕСЕР вставляється виключно у ММА- длЛЕОСЕР і слугує в якості некомплементарного З'-перекриття, щоб відповідати констеляції комплементарних транскриптів нео у ММА-длнео-ДВ15. ММА-ЕСЕР містить додаткову вставку нео, фланковану ділянками ЕКТ під управлінням бактеріального промотора нижче від ВРЗ
ЕСЕР. Цей селектований маркер видаляли в усіх конструкціях ММА-длЕСЕР за допомогою рекомбінації РІГ Р/ЕКТ.
І0291| Фігура 7 демонструє індукцію мРНК ІФН-Д і експресію білку в мишачих клітинах АЗІ1 мутантів ММА, які виробляють длРНК. Клітини АЗІ мишей ВАГ В/3ІЗ удавано інфікували або інфікували препаратами ММА дикого типу або зазначених мутантів ММА, які експресують одиничні транскрипти або транскрипти, що перекриваються, нео (А, В) або ЕСЕР (С, 0). Клітини в А) ії С) інфікували упродовж 5 годин (чорні стовпчики) і 7 годин (сірі стовпчики) перед збиранням транскриптів ІФН-ВД для аналізу. Індукцію гена ІФН-ВД з боку СМА-длнео-ЛАВ15 інфекції показано на А). РНК із клітинних лізатів отримували, використовуючи набір ОІАСЕМ КМеаву.
Контамінуючу ДНК видаляли, використовуючи колонки для видалення ДНК (ГДНК) колонок від
ОІАСЕМ з подальшою додатковою обробкою Тигро-ДНКазою (Атбріоп) упродовж 1 години за 37 "С ії подальшою термічною інактивацією ДНКази за 65 "С упродовж 10 хвилин. Рівні мРНК
ІФН-ВД визначали за допомогою ОТ-КПЛР, використовуючи комерційний аналіз генної експресії для мишачого ІФН-В (Аррієй /Віозузіет5). Відсутність контамінуючої ДНК було продемонстровано за допомогою негативних результатів ОТ-КОЛР, коли ОТ-фермент було вилучено із ОТ-реакції. Показано рівні транскриптів ІФН-В в інфікованих клітинах відносно рівня
МРНК ІФН-ВД у удавано-інфікованих клітинах. Значення Сі для ІФН-ВД нормували, використовуючи значення Сі для клітинної 185 рРНК. Білкові рівні ІФН-ВД визначали в супернатантах клітин, інфікованих упродовж 18 годин (В) або 23 годин (0). Супернатанти збирали і аналізували для мишачого ІФН-В, використовуючи комерційно доступний ЕГІЗА (РВІ). Інфікування, наведені на
А і С, належали до одного експерименту, тоді як експерименти В) і Ю) були незалежними. А) 1:
ММА мас; 2: ММА-длнео-АВ15; 3: ММА-длнео-АВ15/-АВас; 4: ММА-АВ15, 5: СМА-длнео-АВ15; 6: контроль. В) 1: ММА дт; 2: ММА-длнео-АВ15; 3: ММА- АВ15; 4: контроль, 5: середнє. С) 1: ММА-
ЕСЕР; 2: ММА-длЕСЕР; 3: контроль. ОЮ) 1: ММА-ЕСЕР; 2: ММА-длЕеЕСЕР; 3: контроль.
ІОЗОЇ Фігура 8 демонструє індукцію експресії мРНК ІФН-Д з боку ММА-длЕСЕР у залежності від часу генерації длРНК. Показано рівні транскриптів ІФН-В в інфікованих клітинах відносно бо рівня мРНК ІФН-ВД у удавано-інфікованих клітинах, виражені як "Кратність збільшення кількості
МРНК ІФН-Д». А) Дт-МЕЕ удавано інфікували або інфікували очищеними вихідними розчинами
МУА-ЕСЕР (контрольний вірус, що містить тільки одну вставку ЕСЕР, що генерує смисловий транскрипт), ММА-длЕСЕР-2 в якості позитивного контролю або ММА-ДЕЗІ (з відсутнім геном, який кодує вірусну длРНК, що зв'язує білок ЕЗ) зо МОЇ 10 упродовж 5 годин. Клітини або залишали необробленими (чорні стовпчики) або оброблювали цитозинарабінозидом у кінцевій концентрації 40 мкг/мл (АгасС, білі стовпчики), який блокує реплікацію вірусної ДНК і блокує інфекцію на ранніх стадіях. Отримували РНК із клітинних лізатів і аналізували за допомогою ОТ-
КПЛР щодо рівнів мРНК ІФН-ВД, як зазначено в описі до Фігури 7. В) Дт-МЕЕ упродовж 5 годин удавано інфікували або інфікували неочищеними вихідними розчинами ММА-ЕСЕР, ММА-
ДлЛЕСЕР або ММА-длЕСЕР-пізнім, який експресує антисмислову касету ЕСЕР під управлінням активного і виключно пізнього промотора (551), розробленого Вамагіап Могаїс. Отримували РНК із клітинних лізатів і аналізували за допомогою ОТ-КПЛР щодо рівнів мРНК ІФН-рД, як зазначено в описі до Фігури 7.
ІО31| Фігура 9 демонструє активацію РКК з боку ММА-длнео-АВ15 і ММА-длЕеЕСЕР у клітинах
АЗ1. Мишачі клітини АЗІ інфікували у 1-й день після висівання з неочищеними розчинами зазначених вірусів за МОЇ 10. Фосфорилювання еїЕ2а (Р-еІг2а) в клітинних лізатах, отриманих у зазначений час інфікування, аналізували за допомогою імуноблотінгу, використовуючи антитіла проти фосфо-епітопа Зего1 еІЕ2а (антитіло Мо 9721, СеїІ Бідпаїїпуд Тесппоїоду Іпс.,
Данверс, Масачусетс, США) при розведенні 1:1000. В якості навантажувального контролю, було розроблено окрему частину мембрани для імуноблотінгу з антитілом, що виявляє мишачий р- тубулін ізотипу І. Фігура 10 демонструє, що збільшення індукції мРНК ІФН-Д з боку ММА-длЕСЕР у МЕР залежить від РКК. Дт-МЕЕ і РКК-дефіцитні (РККО/) МЕР удавано інфікували або інфікували очищеними вихідними розчинами ММА-ЕСЕР або ММА-длЕеЕСЕР за МОЇ 10 упродовж 5 годин. Один мл препарату розведеного 1:100 комерційно доступного вірусу Зепааї (зем) використовували в якості позитивного контролю у разі РКК-незалежної, але длРНК-залежної індукції І?Н-Д. А) Отримували РНК із клітинних лізатів і аналізували за допомогою ОТ-кПЛР щодо рівнів МРНК ІФН-Д, як зазначено в описі до Фігури 7. Показано рівні транскрипту ІФН-В відносно рівня мРНК ІФН-РД у удавано-інфікованих клітинах, виражені як "Кратність збільшення кількості МРНК ІФН-Д». 1: ММА; 2: ММА-ЕСЕР; 3: ММА-длЕСЕР; 4: бем; 5: контроль. В) Рівні
Зо білка ІФН-Д визначали у супернатантах клітин, інфікованих упродовж 24 годин. Супернатанти збирали і аналізували для мишачого ІФН-ВДВ, використовуючи комерційно доступний ЕГІ5А (РВІ). 1: ММА; 2: ММА-ЕСЕР; 3: ММА-длЕеЕСОЕР; 4: Зеум; 5: контроль.
ІО321| Фігура 11 демонструє вимоги до довжини у разі РКК-залежної індукції ІФН-В з боку рекомбінантів ММА, які виробляють длРНК. Дт-МЕР і РККО/-МЕР удавано інфікували або інфікували неочищеними вихідними розчинами ММА-ЕСЕР або зазначеними мутантами ЕСЕР-
ДЛРНК, які містять сильно вкорочені ділянки перекриття ВРЗ ЕСЕР (дивіться Фігуру 6В) за МОЇ 10 упродовж 5 годин (А, С) або 24 годин (В) за 37 "С. Один мл препарату розведеного 1:100 комерційно доступного вірусу Зепааї (зем) використовували в якості позитивного контролю у разі длРНК-залежної, але РКК-незалежної індукції ІФН-Д. Кратність збільшення індукції мРНК
ІФН-В у порівнянні контролем визначали за допомогою ОТ-КПЛР, використовуючи загальну кількість РНК, ізольовану з клітин, як наведено в описі до Фігури 7. Значення Сї для мРНК ІФН-В коригували за допомогою значень Сі для 185 рРНК, яка слугувала в якості ендогенного контролю. В) Білкові рівні ІФН-Д визначали для супернатантів МЕЕ ії РККО/О-МЕБ, інфікованих упродовж 24 годин зазначеними рекомбінантами ММА. Супернатанти збирали і аналізували для мишачого ІФН-Д, використовуючи комерційно доступний ЕГІЗА (РВІ). ММА-АВ15 було включено в якості додаткового контролю. А) 1: ММА; 2: ММА-ЕСЕР; 3: ММА-длЕСЕР; 4: ММА-длЕСЕР-2; 5:
ММУА-длЕСЕР-3; 6: ММА-длЕСЕР-4; 7: ММА-длЕСЕР-5; 8: Бе; 9: контроль. В) 1: ММА; 2: ММА-
ЕСЕР; 3: ММА-АВ15; 4: ММА-длЕСЕР; 5: ММА-длЕСЕР-2; 6: ММА-ДдлЕСЕР-3; 7: ММА-длЕСЕР-4; 8: ММА-длЕСЕР-5; 9: бБем; 10: контроль. С) 1: ММА-ЕСЕР; ММА-длЕСЕР; 3: ММА-длЕСЕР-6; 4: контроль.
ІО33| Фігура 12 демонструє реплікацію та фенотипічну стабільність ММА-длЕСЕР. А) Для аналізу реплікаційної поведінки ММА-ЕСЕР і ММА-длЕСЕР, моношар із 106 вторинних клітин
СЕРЕ інфікували цими вірусами у трьох повторностях за МОЇ 0,025 (мультициклічний аналіз).
Будували криву вірусного виходу у зазначений час, де кожна точка представляє результати для трьох незалежних лунок. В) моношари із 106 людських клітин Нега і Насат і клітини мавпячих
СУ-1 мавпи інфікували у трьох повторностях за МОЇ! 0,025 з ММА-ЕСЕР або ММАдл-ЕСЕР.
Будували залежність вірусного виходу на третій день після інфікування від введення 5 х 104
ТСІО5О на лунку. Кожна точка представляє результати одного титрування для трьох незалежних лунок. С) Моношари вторинних клітин СЕРЕ інфікували за МОЇ 10 упродовж 5 годин бо зазначеними вірусами, пересіяними один (Р11) або 10 разів (Р10) у клітинах ОЕ-1 як описано в тексті. Кратність збільшення індукції мРНК ІФН-В в інфікованих клітинах у порівнянні з контролем визначали за допомогою ОТ-кПЛР, використовуючи загальну кількість РНК, ізольовану з клітин, як наведено в описі до Фігури 7. 1: ММА-ЕСЕР-РІ1І; 2: ММА-ЕСЕР-Р10; 3:
ММУА-длЕеЕСЕР РІ; 4: ММА-длЕСЕР РІ10; 5: контроль.
ІО34| Фігура 13 демонструє індукцію експресії цитокіну мутантом ММА-длЕСЕР у мишей
С57ВИ/6 дт, ІР5Б-10/0 і РККО/О. Групи із 5 мишей зазначених штамів (86-С57ВІ /6 дт) віком 8-12 тижнів внутрішньовенно інфікували зазначеними вірусами у дозуванні 108 ТСІО5О на мишу.
Кров тварин збирали через б годин після інфікування й аналізували сироватку щодо концентрації зазначених вибраних цитокінів, використовуючи метод проточної цитометрії з гранулами від Вепдег Меазузіетв. А) ІФН-а. В) ІФН-У. С) 11 -6. 0) 1-18. Е) СХСІ 1. Р) СС12. С)
ССІ5.
ЇОЗ5| Фігура 14 демонструє індукцію ММА-специфічних Т-клітин СО8 з боку ММА-ЕСБЕР і мутанта ММА-длЕСЕР у мишей. А) Групи із 3-5 мишей С57ВІ/6 віком 8 тижнів одноразово внутрішньовенно інфікували (А) зазначеними вірусами у дозуванні 108 ТСІО5О/мишу. Селезінки збирали через 7 днів після інфікування і використовували суспензії окремих клітин спленоцитів для кількісної оцінки ММА-специфічних Т-клітин СО8 шляхом забарвлення декстрамерів ГКГС класу | з використанням В820-27 епітоп-специфічних декстрамерів. Показано об'єднані результати для двох незалежних експериментів. Зірочкою вказано р-значення « 0,05 для двостороннього непарного І-критерія Стьюдента.
ІОЗ36| Фігура 15 демонструє індукцію експресії МРНК ІФН-ВД у людських клітинах МКС-5 з боку мутантів ММА-длЕСЕР. Клітини МАС-5 (диплоїдні фібробласти легенів людини) у б-лункових планшетах удавано інфікували або інфікували неочищеними вихідними розчинами ММА-ЕСЕР, що відповідають ММА дт і зазначеним рекомбінантам ММА-длЕСЕР з сильно вкороченими ділянками перекриття ВРЗ ЕСЕР. Додатково використовували ММА-длнео-АВІ15 і ММА-АВ15, а кратність збільшення індукції мРНК ІФН-ВД у порівнянні з контролем визначали за допомогою ОТ-
КПЛР, використовуючи загальну кількість РНК, ізольовану з клітин через 5 годин після інфікування, як наведено в описі до Фігури 7. Значення Сі для ІФН-В нормували, використовуючи значення Сі для клітинної 185 рРНК, яка слугувала в якості ендогенного контролю. Показано рівні транскриптів ІФН-В в інфікованих клітинах відносно рівня мРНК ІФН-В
Зо у удавано-інфікованих клітинах, виражені як "Кратність збільшення кількості МРНК ІФН-ВД». 1:
ММА; 2: ММА-ЕСЕР; 3: ММА-длнео-АВ15; 4: ММА-АВ15; 5: ММА-длЕСЕР; 6: ММА-длЕСЕР-2; 7:
ММУА-длЕСЕР-3; 8: ММА-длЕСЕР-4; 9: ММА-длЕСЕР-5; 10: контроль.
ІО37| Фігура 16 демонструє схематичне зображення індукції гена ММА-длЕЗІ і ІФН-ВД з боку
ММА-длЕЗІ. А) Схематичне зображення мутантного ММА-длЕЗІ.. Зазначено напрям транскрипції кодуючої ЕЗІ. послідовності (чорні стрілки) нативним рЕЗІ і вставленим промотором рН5т.
Сигнали ранньої термінації транскрипції (ЕТТ5) позначено за допомогою перпендикулярних сірих смуг. Сірі стрілки вказують напрям транскрипції, для якого ЕТТ5 є потенційно активним.
Антисмисловий ЕТТ5 у ВРЗ ЕЗІ інактивували шляхом сайт-спрямованого мутагенезу неоднозначної позиції в кодоні без зміни амінокислотної послідовності ЕЗ. Потенціальну ділянку
ДлЛРНК, утворену за допомогою двох комплементарних транскриптів ЕЗІ, позначено сірою смугою. В) МЕРЕ у б-лункових планшетах удавано інфікували або інфікували неочищеними вихідними розчинами зазначених вірусів за МОЇ 10. ММА-ЕСЕР відповідає ММА дт. Кратність збільшення індукції мРНК ІФН-ВД у порівнянні з контролем визначали за допомогою ОТ-кПЛР, використовуючи загальну кількість РНК, ізольовану з клітин через 5 г після інфікування.
Значення СІ для МРНК ІФН-РД коригували за допомогою значень Сі для 185 рРНК, яка слугувала в якості ендогенного контролю. 1: ММА-ЕСЕР; ММА-длЕСЕР; 3: ММА-длЕСЕР-5; 4: ММА- длЛЕСЕР-пізній; 5: ММА-длЕЗІ..
ІОЗ38) Фігура 17 демонструє, що амінокислотна послідовність гена В19К зберігається у ряді поксвірусів. А), В), С) ї Б) представляють вирівнювання амінокислотних послідовностей генів
В19К і/або їх гомологів, що кодуються вірусом віспи мавп (ЗЕО ІЮ МО:1), вірусом вісповакцини
Мезієт ВНезегме ("Массіпіа-УУК") (ЗЕБЕО І МО:2), вірусом вісповакцини Копенгаген (ЗЕО ІО
МО:3), хоріоалантоїсним вірусом вісповакцини Анкара (СМА" (5ЕБЕО ІЮ МО:4), вірусом ектромелії (ЗЕО ІЮ МО:5), вірусом коров'ячої віспи (5ЕО ІЮО МО:6), вірусом віспи верблюдів (ЗЕО
ІО МО:7), вірусом віспи свиней (ЗЕО ІЮО МО:8) і танапоксвірусом (ЗЕО ІО МО:9), отримані за допомогою СіивіаЮ, м. 1.2.0 з налаштуваннями за умовчанням. Е) представляє таблицю, що демонструє попарні ідентичні ділянки в амінокислотних послідовностях для послідовностей
ВІ19К і/або його гомологів, вирівняні з частинами А), В), С) і 0).
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЇО39| 5ЕО І МО:1 |Ме доступу ОБІХК2: ІФН-альфа/бета-рецептор-подібний секретований бо глікопротеїн; вірус віспи мавп):
ММКМКММУВІМЕМБІ БІЛ ЛЕНЗМУАІОТЕМЕ!ТЕРЕМКМАОТІ РАКОБКУМІ МРИСМЕСИТММОМАА
ІГаЕРЕБАКСРРІБОБІ ЇЇ ЗНАУКОМУУКМ ЕВ ЕКМААВОМ5МКАУКНаИпі УМАМУТ5КЕЗМАВМІ СТУ
ТК ОСМОСМУУВЗНУМУКРУОБСІРКТУЄГ СТ УОКМСІРІ МСС МАКНУММІ ТУУУКОМКЕІМОСЕКМ5
ОАДСКЕПІНМРЕ! ЕОМ ОСМУНМООМВІКМОЇМУЗАСКІСТМІРБООНАЕКИ ОРКІММТІБЕРАМІТС 5АМ5ТЗ ЕМООМ ТЕМ КМРЗОУУПОЇІ СОРОМУ Т5ВОаСІТЕАТІ УГЄЕММУТЕЕМІЕМТУИТСНЯаНМУМЕОК
ТІТТТУМІ Е
Ї040Ї 5ЕО ІЮ МО:2 |Ме доступу Р25213: Розчинний рецептор В19 інтерферона альфа/бета; вірус вісповакцини, штам Мевівт Везегув|:
МТМКММУНІМЕМІС С ЕНЗУАІВТЕМЕ! ТЕРЕМКМАОТІ РАКОБЗКУУМІ МРАСМЕеССИТММОІААЇ СЕРЕ 5АКСРРІБОБІЇ БНАУКОУУУКУМЕВЕКМААКОМ5МКАУКНаИТпві ММАМУТ5КЕЗМААМІ СТУТТКМО рСМОСІМАЗНІВКРРОСІРКТУЕ аТНОКМИтоІ МСС МАКНУММІ ТУУУКОМКЕІМОПІКУВОТаТкеЕНІ
НМРЕГЕОЗаАУОСУУНМООМВІКМОЇ ММЗ АСКІТМІРЗООНА ЕКО ОРКІММТІСЕРАМІТСТАМ5Т5І.
ПООМЛТЕМЕМРЗСУМ ТЯ БОГОМУ МІ Т5ВОСІТЕАТІ МЕЕМУТЕЕМІЕМТУКСВанМУМЕЕКТІТТТМ
М'Єє
Ї041| 5ЕО І МО:З |Ме доступу ОБСАБ5: ІФН-альфа/бета-рецептор-подібний секретований глікопротеїн; вірус вісповакцини, штам Копенгагені:
МТМКММУНІМЕМІС С ЕНЗУАІВТЕМЕ! ТЕРЕМКМАОТІ РАКОБЗКУУМІ МРАСМЕеССИТММОІААЇ СЕРЕ
ЗАКСРРІБОБІ І ЗНАУКОУУУКУМЕВІ ЕКМАВВОМЗМКАУКНОИ ОТГ УМЛАМУТЗКЕ5МАВМІ СТУИТТКМОа рСМОСІМАЗНІККРРУОСІРКТУЕ! ат НОКМСИті Меса МАКНУММІТУМУУКОМКЕІМОПІКУВОТакки
НУІРЕГЕО5БОаВУМСУУНМООМВІКМОЇМУМЗАСКІСТМІРБООНАЕКИ ОРКІММТІСЕРАМІТСТАМ5Т5І.
ПООМЛТЕМЕМРЗСУМ ТЯ БОГОМУ МІ Т5ВОСІТЕАТІ МЕЕМУТЕЕМІЕМТУКСВанМУМЕЕКТІТТТМ
М'Єє 042 5ЕО 10 МО4 |Ме доступу АЗ9)168: Розчинний інтерферон-альфа/бета-рецептор клітинної поверхні; вірус вісповакцини, штам Анкара (СУА):
МКМ ТМКкМММНІМЕМБИ С ЕНЗМАОТЕМЕІТЕРЕМКМАОТ РАКОЗКУУЛ МРАСМЕеСОИТтММОІААІ а
ЕРЕБАКСРРІБОБІ ЗНАУКОУУУКУМЕВГЕКМА ВВОУМЗМКАУКНОИТрі МАМУ Т5КЕЗМАВМІ СТУТТ
КМарсмМосіуАЗНІККРРУОСІРКТУЕГ ат нНОКМаИтрі мса МАКНУММІ ГТМ УКОМКЕІМОПІКУВОТОа
ККИЛІНМРЕГЕОБИ ВУМСУУНУООМУКІКМОЇММЗАСКІСТМІРЗОЮСНАЕКОИОРКІММТІСЕРАМІТСТАМ
ЗТЗП ІЮОМ ТЕМ ЕМРБСУМ ІЗ ГОБГОММ МІ ТЕВОСІТЕАТІ МЕЕМУТЕЕМІЕМТУКСВОНМУМЕЕКТІ Т
ТУМЕ
Ї043| ЗЕО ІЮ МО:5 (Мо доступу О9ОЕ55: ІФН-альфа/бета-зв'язуючий білок; вірус ектромелії):
ММКМТМКМММВІМЕМБІ 5І БІ З ЛЕНЗМАІОТЕМЕ! ТЕРЕМКМАОТІ РАКОБЗКУУМ МРОСМЕСОЯТММО
МААЇ СЕРЕБАКСРРІЕОБІ І БНАУМОКОМУУМУЕКІСКТААРІ МААУКМООЇГ УЛАМУ ТЗМО5НАВХІ.
СТУТТКМОарСМОСІМАЗНІВКРРУОСІРЕТМЕ СТНОКМСИтІ МСС МАКНУММІ ПУУКММОЕСПпОСТК / УБОБООМІНМРЕГ ЕОБИВУОСУУНУООМВІКМОЇМУЗАСКІСТМІРЗОЮСНАЕКИ ОРКІММТІСЕРАМ
ІТСТАМ5ТОІ І МОМ ГОМ ЕМРБЗСОУПИІ ОРСМУБІ 550 СІТЕАТІ МЕЕММТЕЕММТУТСНОаНнММУ У
ЕОКТІ ТТТУМГ Е
Ї044| 5ЕО ІС МО:6 (Ме доступу ОБСАСЗ: Розчинний інтерферон-альфа/бета рецептор; вірус коров'ячої віспи):
МКкКМТМКкМММНІМЕМ5І 51 5І 5 ЕНЗУАІОТЕМЕІ! ТЕРЕЕМКМКОТІ РАКОЗКУМІ МРАСМЕССТММОМ
АДІСЕРЕБАКСРРІЕОБІ І ЗНАУКОКОМУУМУЕКІСКТА АРІ МААУКМООЇ УЛАМУ ТЗМОАААМІ СТ
МІТКМЕОСІОСІМАЗНУВКРУБСІРЕЇМЕ СТНОКМСІОІ МСС ПМАКНУММІ ТУУМКОМКЕІМОПІКУБОТ
СКЕПІНМРАГЕОЗавАУОСУУНУООМВІКМОЇММЗАСКІСТМІРЗООСНАЕКИОРКІММТІВЕРАМІТСТА
М5ТЗИ МОМ ТЕМ ЕМРЗСУМ ТЯ ГОБГОМУ5МІ ТЕВОСІТЕАТІ МЕЕММТЕЕМІСМТУКСВаТНМУМРЕКТ
ІТТТУМЕ
Ї045| 5ЕО ІО МО:7 |Ме доступу ОБСАВ87: Розчинний інтерферон-альфа/бета рецептор; вірус віспи верблюдіві:
МКМТМКММУНІМЕМ5І 5І БІ ЕНЗМАІОТЕМЕ! ТОРЕМКМКО РТКОБКУУІ МРАСМЕСИТТМОМААЇ
СЕРЕБАКСРРІБОБІ ЇЇ ЗНАУКМКОМУУМУУЕКІСКТКАРІ МА ВУКМО ОЇ УМЛАМУТЗМО5ААВМІ СТАТ
КМарсСІОСІІАЗНУВКРУБСІРЕІМЕ СТНОКМСИті моапмАКНУММТУ/УКОМКЕІМОПІКУВОТаКкЕ
ПНМРАГЕОЗавурсУУнМрОУвВІКМОЇМУЗАСКІСТМТРОООЮНАРКИООРКІММТІСЕРАМІТСТАМ5Т
ЗИ МОМ ТЕМ ЕМРІСУМ ПО БОГОМУБМІ ТЕВОСІТЕАТІ МЕЕМУТЕЕМІСМТУКС НАНМУМЕЕКТІ ТТ
ТУМІЕ
І046Ї 5ЕО ІЮ МО:8 |Мо доступу О8УЗСа4: ІФН-альфа/бета-подібний зв'язуючий білок; вірус віспи свиней, штам Зміпе/МергазКа/17077-99/19991|:
МІБІККУМІ С РПЗЕІМСБЗАОМОО5І МЕСУКЕРГОРКІ КОРІ МОМСТУВОаМВОГРІ УМЕЕРАМІКСРІ І М
РІСВОКУНММТІІ МУККІ СЕВЗЗВГ І МТ НОБІР ОБЕРУКЗЕЇ ВОБУМЕСМПИ ММ СОБОРІ КІ МОТА!АМ
РУСУНМОМКУНТМЕТЕСММІМ ОМОМТУУУКММЗЕНОСУКУЗМОАВИ МУМТТИМОБаМУСМАМТ
ТНакмтМ5ААС5ЗБМ5ІНБНОЗУМУОБМІЕНІММІ ТИ РОБЕМТОІ УСКАІБУЗМЗМИ МУМЕВЕУСИМІ МО 60 0 МОІМОМОМІТЛаТИмМмеЕКМУМ5ІІ М ЕКБАУУВУМММТЕТСІ АТЗМУМЕККТТТТІ МІККТ
047! 5ЕО 10 МО:9 Мо доступу А7ХО54: Рецептор ІФН типу !/ танапоксвірус):
МКІТМП ІСКЕПСОМЗИВОММОМІАМаМІОЮМІ КТІОМОПМІ УМКМОЗЕВЕЇІКТТІ АКЕМЕМІ МІ КСРОЇГ.
ОММІ РУКУММАЗЕМТМ ГПМУКМІЗМОТЕМММТВІЄМММІ МЕЕРЕММІ ОДИаЗКМІ СТУИЗТМКЗОСВОБУМІ
МККЗЕМЗММОСМІ ЗЕАКЕМОМЕЕІ МСС НАКУМТІКУ ЕКЕЕКЕІТЯММУКУУТКІ СДСЯЯУУКСОСІММУТУЗОБ
СКУМСЕ,ММІОМІ КМІТМТАКАСУМСТМІРМТУМОБРІМОТРМУТМАКММККГЕУМСТЗЕМОІМЗМ ОМ Т
ЗУМІ УМИІ МІ Р аМВІМОЇ МЗТО1ЕРЕМЕІМАТОЗТІ МЕЕММОРІЗООМКТЕЕСЕАЇ ЗМТІ ККІКУТТІКМЕК
ОПИС ДЕЯКИХ ВАРІАНТІВ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ
(048) Далі наведено детальний опис типових варіантів реалізації винаходу, приклади яких проілюстровано у доданих графічних матеріалах.
Визначення
І049| Якщо не вказано інше, технічні терміни використовуються у цьому документі згідно із традиційним використанням спеціалістами в області техніки молекулярної біології. Щодо загальних термінів молекулярної біології, їх традиційне використання можна знайти у стандартних посібниках, таких як, наприклад, Сепе5 М авторства Вепіатіп І ем/п, опублікованому Охіога Опімегейу Ргев55, 1994 (ІЗВМ 0-19-854287-9); Кепагем/ єї аї. (єдв.); Те
Епсусіоредіа ої МоїІесціаг Віоіоду, рибіїзнейд бу ВіасКмеї! Зсіепсе Ц., 1994 (ІЗВМ 0-632-02182-9); і МоіІеєсшаг Віоіоду апа Віоїесппоіоду: а Сотргепепзіме ОезК Веїегепсе під редакцією Нобеті А.
Меуеєгз, опублікованому МСН РибіївНетгв, Іпс., 1995 (ІЗ5ВМ 1-56081-569-8).
ОБОЇ У контексті цього документа форма однини включає віднесення до множини, якщо не вказано інше. Таким чином, наприклад, посилання на "епітоп" включає посилання на один або більше епітопів, а посилання на "спосіб" включає посилання на еквівалентні кроки та способи, відомі фахівцям у цій області техніки, які можуть бути модифіковані або замінені способами, запропонованими у цьому документі.
ІО51| Якщо не вказано інше, термін "щонайменше", який передує серії елементів, варто розуміти як такий, що відноситься до кожного елементу в серії. Фахівці у цій області техніки знають або здатні встановити, використовуючи лише рутинні експерименти, велику кількість еквівалентів конкретних варіантів реалізації винаходу, запропонованих у цьому документі. Такі еквіваленти входять у цей винахід. 052) В описі та формулі винаходу, які наведено нижче, якщо контекст не вимагає іншого, слово "містити" та його варіації, такі як "містить" і "що містить", означають "включає" і, отже, включають встановлені ціле число або етап або групу цілих чисел або етапів і виключають будь-яке інше ціле число або етап або групу цілих чисел або етапів. У разі використання у цьому документі термін "що включає" може бути замінено терміном "що містить", "що включає" або "що має". Будь-який із зазначених вище термінів (що включає, що містить, що має) в усіх випадках використання у цьому документі в контексті аспекту або варіанту реалізації цього винаходу може бути замінено терміном "що складається із". 053) Використовуваний у цьому документі термін "що складається із" виключає будь-який елемент, етап або інгредієнт, не зазначений у формулі винаходу. Використовуваний у цьому документі, термін "що складається переважно із" виключає будь-які матеріали або етапи, "які впливатимуть на основні та нові характеристики" продукту або способу, визначені в іншій частині формули винаходу. УУаїег Тесив5. Согр. м. Саісо (а., 7 0.5.Р.О.2а 1097, 1102 (Еєд. сії. 1988). 054) Використовуваний у цьому документі сполучник "і/або" між декількома перерахованими елементами варто розуміти як такий, що включає як окремі, так і комбіновані варіанти.
Наприклад, коли два елементи з'єднані за допомогою "і/або", перший варіант відноситься до застосовності першого елементу без другого. Другий варіант відноситься до застосовності другого елементу без першого. Третій варіант відноситься до застосовності першого та другого елементів разом. У контексті цього документу будь-який із цих варіантів варто розуміти як такий, що потрапляє в межі значення, і тому задовольняє вимогу терміну "і/або". Одночасна застосовність більш ніж одного із варіантів також варто розуміти як таку, що потрапляє у межі значення, і тому задовольняє вимогу терміну "і/або".
ІО55)| Усі публікації, заявки на патенти, патенти та інші посилання, наведені у цьому документі, у повному об'ємі включено за допомогою посилання. У разі протиріччя цей опис, включаючи усі визначення, має перевагу.
ІО56) Ад'ювант. Засіб, який застосовують для підвищення антигенності. Ад'юванти можуть включати: (1) суспензії мінералів (галун, гідроксид алюмінію або фосфат), на яких адсорбується антиген; (2) емульсії типу вода-в-олії, в яких розчин антигена емульсифіковано у мінеральній олії (неповний ад'ювант Фрейнда), іноді з включенням убитих мікобактерій (повний ад'ювант
Фрейнда) для подальшого підвищення антигенності шляхом інгібування деградації антигена бо або спричинення потоку макрофагів, і/або активації імунних клітин; (3) імуностимулюючі олігонуклеотиди, такі як, наприклад, ті, які містять мотив Сро також можуть бути використані в якості ад'ювантів (наприклад, дивіться Патент США Мо 6194388; і Патент США Мо 6207646); і (4) очищені або рекомбінантні білки, такі як костимулюючі молекули. Приклади ад'ювантів включають, але не обмежуються цим, В7-1, ІСАМ-1, І ЄА-3 і 5М-С5Е.
ІО57| Антиген; антигенна детермінанта; епітоп. Сполука, композиція або речовина, яка може стимулювати вироблення антитіл або відповідь Т-клітин СО4ж або СО8-- у тварин, включаючи композиції, які ін'єктгують тваринам або які всмоктуються тваринами. Антиген взаємодіє з імунною системою для отримання антиген-специфічної гуморальної або клітинної імунної відповіді. Термін "антиген" включає усі споріднені епітопи конкретної сполуки, композиції або речовини. Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" відноситься до ділянки на антигені, на яку реагують В- і/або Т-клітини, як на саму по собі, так і у поєднанні з іншим білком, таким як, наприклад, білок головного комплексу гістосумісності ("ГКГС") або Т-клітинним рецептор. Т- клітинні епітопи утворюються із суміжних ділянок із від 8 до «20 амінокислот. В-клітинні епітопи можуть утворюватися як із суміжних амінокислот або несуміжних амінокислот, які знаходяться поруч внаслідок згортання білка у вторинну і/або третинну структуру. В-клітинні епітопи, утворені із суміжних амінокислот, як правило, зберігаються у разі дії денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені третинною структурою, як правило, руйнуються у разі обробки денатуруючими розчинниками. В-клітинний епітоп зазвичай включає щонайменше 5, 6, 7, 8,9, 10 або більше амінокислот, але, як правило, менше, ніж 20 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Способи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографію і 2-вимірний ядерний магнітний резонанс. Дивіться, наприклад, "Еріюоре Марріпу Ргоїосоїв" у Меїнодвз іп Моіесціаг Віоіоду, Мої. 66, Сіепп Е. Могтті5, Ед (1996). 058) Антиген може бути тканинно-специфічним (або тканинно-асоційованим) антигеном або специфічним до захворювання (або асоційованим із захворюванням) антигеном. Ці терміни не є взаємовиключними, тому що тканинно-специфічний антиген також може бути специфічним до захворювання антигеном. Тканинно-специфічний антиген експресується в обмеженій кількості тканин. Тканинно-специфічні антигени включають, наприклад, простато-специфічний антиген ("ПСА"). Експресія специфічного до захворювання антигена співпадає з процесом хвороби, при цьому експресія антигена корелює з або прогнозує розвиток конкретного захворювання.
Специфічні до захворювання антигени включають, наприклад, НЕК-2, який пов'язаний з деякими типами раку молочної залози, або ПСА, який пов'язаний з раком простати.
Специфічний до захворювання антиген може бути антигеном, що розпізнається Т-клітинами або
В-клітинами. Специфічні до тканини і/або хвороби антигени можуть включати, але не обмежуватися цим, бактеріальні антигени, грибкові антигени, паразитарні антигени або пухлино-асоційовані антигени, або вірусні антигени.
ІО59| Бактеріальні антигени. Антигени, отримані з одного виду бактерій або їх штамів, таких як, наприклад, Васіїйи5 апійгасіз, ВогаєїеїЇІа репив5і5, Воїтеїйа ригадопетгі, ВгисеПа аропив, ВгисеїПа сапіб5, Вгисе|а теїйепвів, ВгисеїЇПа в5ці5, Сатруіобасієг |єЇипі, Спіатуайа рпештопіає, Спіатуаіа
Маспотаїйх, СПНіатудорніїа рзіНасі, Сіовійдіит Боїшііпит, Сіовігідішт айісЦе, Сіовігаійит рептгіпдепв, Сіовігідішт іеїапі, Согупебрасієгйт аїріпегіає, Епіегососсив5 Гаєсаїї5, Епівгососсив5
Таесішт, Е5сПегіспіа соїї, ентеротоксигенна Е5спегіспіа соїї, ентеропатогенна Езспегіспіа соїїЇ,
Еб5сПепіспіа соїї) 157:Н7, ЕгапсізеМйа ішагепвзі5, Наеторнійй5 іпПшепга, Неїїсобасієї руїйогі,
І едіопейа рпешторпіїа, І еріозріга іпівтодап5, ІГібїейа топосуюдепе5, Мусобвасіелпит Іергавє,
Мусобрасієгішт Шбегсціовзії, Мусоріаєта рпеитопіає, Меїібб5епйа допогпоєає, Меїі55егіа тепіпоуйідез5, Рвевейдотопаз аегидіпоза, ВісКейвіа сісКейвіа, Заїтопеїйа урні, ЗаІтопеїЇа турпітитгит, ЗпідеПа в5оппеї, Єтарпуіососсив ашгеив, біарпуіососсив ерідептіаів, єтарпуіососсив заргорпуїісив, Зперіососсив адаїасіає, Зперіососсиз рпейтопіає, Зперіососсивз руодепев,
Тгеропета раїїїдит, Міргіо споїегає, і ХУегзіпіа ревіі5.
ІО60О| Грибкові антигени. Антигени, отримані з одного виду грибів або їх штамів, таких як, наприклад, Азрегодійи5 сіамат5, Азрегойи5 Пами5, АзрегойШив5 Титідасв5, Аврегоїййи5 піашапв,
Азрегадйив5 підег, Аврегуйив5 Чепеийив, Віазіотусев5 дептаїййіаів, Сапаїда аїрісап5, Сапаїда дибіїпіепвії, Сапаїда діабгаїа, Сапаїда рагарзізіз, Сапайа гидоза, Сапаїда (горісаїїв5,
Стуріососсив аїіріди5, Стуріососсив дайії, Стуріососсив |Іацгепії, Стуріососсив пеоїоптапв,
Нівіоріазєта сарзшайцшт, Містозрогит сапів, Рпештосузвіїв сагіпії, Рпештосузвіїв |гомесії, 5рогоїнтгіх зеПепескії, таспроїгуз спапагит, Тіпєа Брагтбає, Тіпєа сарійів, Тіпеа согрогів, Тіпєа спигів, Тіпеа
Тасівї, Тіпеа іпсодпіт, ТГіпеа підга, Тіпеа мегзісоЇог, Піспорпуїоп гиргит і Тгіспорпуюп (опзигапв.
ІО61| Паразитарні антигени. Антигени, отримані з одного або більше відів паразитів або їх штамів, таких як, наприклад, Апізакіх 5рр. Вабезіа 5рр., Вауїїзазсагів ргосуопів, Стуріозрогіадійт 60 5рр., Сусіозрога сауєеїапепвіз5, ОірнуПобоїйпцт зрр., Огасипсціи5 теаіпеп5і5, Епіатоебра півіюїуїіса, Спіагдіа диодепаїїв, Сіагаіа іпіевіїпаїйй5, Сіагайа Іатбіїа, І еїівптапіа 5р., Ріазтодійит
ТаІсірагит, Зспівіовота тапвзопі, 5співіовота паета!йюбіит, Зспівіозота |аропісит, Таєпіа 5рр.,
Тохоріазта допаїї, Гиіспіпеїва 5рікаїїв5, і Ггурапозота сги?і. (062| Пухлино-асоційовані антигени. Антигени, які в надлишку експресуються або переважно експресуються у конкретних видах пухлин, такі як, наприклад, 5-с-редуктаза, а-фетопротеїн ("АФП"), АМ-1, АПК, Аргії, ген антигена меланоми В ("ВАСЕ"), рД-катенін, Всі12, рег-абі, Вгаспуцгу,
СА-125, каспаза-8 ("САБР-8", також відома як "РІІСЕ") катепсини, СО19, СО20,
СО21/комплементарний рецептор 2 ("СН2") СбОр22/ВІ-САМ, СОр23/РсєВІЇ, СО33,
СОоЗБ/комплементарний рецептор 1 ("СА81"), СО44/РаР-1, СО45/спільний антиген лейкоцитів (І СА" СО46б/мембранний кофактор білка ("МСР") СО52/САМРАТН-Ї, СО55/фактор прискорення розпаду ("САЕ"), СОБ59/протектин, СОС27, СОК4, карциноембріональний антиген ("СЕА"), с-тус, циклооксигеназа-2 ("сох-22"), видалений у разі колоректального раку ген ("000"), ОсАЗ, Еб/Е7, СОЕВ, ЕМВР, Юпа78, фарнезилтрансфераза, фактор росту фібробластів- ва РагВа"), фактор росту фібробластів-8Б6 ("БСЕ8Б"), Р К-1/КОВ, рецептор фоліевої кислоти,
Се250, антиген сімейства генів меланоми с ("З4АСіЕ-сімейство"), гастрин 17, гастрин- вивільняючий гормон, гангліозид 2 ("Я4О2'"Уганглімозид З ("9О3"Угангліозид-моносіалова кислота-2 ("аМг"), гонадотропін-вивільняючий гормон ("сапАН"), ООР-СІСМАс:В1 Мап(а1-6)82 від СісСМАс до Мап(а1!-6)| В1,6-М-ацетилглюкозамінтрансфераза М (пт М"), ар, др100/Рте117, ар-100-іп4, др15, др7Б/тирозин-споріднений білок-1ї ("др75/ТАР-1"), людський хоріонічний гонадотропін ("ХГ"), гепаринази, Негг/пеи, вірус пухлини молочної залози людини ("НМУ"), білок теплового шоку у 70 кілодальтонів ("НОР70") обернена транскриптаза теломерази людини ("ПТЕРВТ"), рецептор-1 інсулін-подібного фактору росту (СЯЕВ-1"), рецптор інтерлейкіну-13 ("І -138"), індуцибельна синтаза окису азоту ("іМО5"), Кіб7, КІААО2О5, К-гав, Н- газ, М-газ, КБА, І КІ В-РОТ, антиген-кодуючий ген меланоми 1 ("МАСЕ-1"), антиген-кодуючий ген меланоми 2 ("МАСЕ-2"), антиген-кюодуючий ген меланоми З ("МАСІЕ-3"), антиген-кодуючий ген меланоми 4 ("МАСЕ-4"), маммаглобін, МАР17, Мелан-А/антиген меланоми, що розпізнається Т- клітинами-1 ("МАВТ-1"), мезотелін, МІС А/В, МТ-ММР», муцин, сім'яник-специфічний антиген
МУ-Е5ЗО-1, остеонектин, рі5, Р1І70/МОНТ, ро53, р9о7/меланотрансферин, РА!-1, тромбоцитарний фактор росту ("ТРФ"), НнРА, РКАМЕ, пробасин, прогенопоетин, простато-специфічний антиген
Зо ("РЗА"), простато-специфічний антиген мембрани ("РОМА"), ВАСЕ-1, В, ВАСАБІ, ЗАВТ-1, 55Х- сімейство, ЗТАТЗ, 5Тп, ТАС-72, трансформуючий фактор ростул-альфа ("ТОарг-а»), трансформуючий фактор росту-бета ("ТОавЕ-рВ»), Тимозин-бета-15, фактор некрозу пухлин-альфа ("ФНО-а»), ТРІ, ТЕР-2, тирозиназа, фактор росту ендотелію судин ("УЕСЕ"), 2АС, рі1бімкаА і глутатіон-з-трансфераза ("4517").
ІО6ЄЗІ Вірусні антигени. Антигени, отримані з одного або більше типів вірусу або їх ізолятів, таких як, наприклад, аденовірус, вірус Коксакі, вірус Конго-Кримскої геморагічної лихоманки, цитомегаловірус ("ЦМВ"), вірус денге, вірус Ебола, вірус Епштейна-Барр, (ЕВУ"), вірус
Гуанаріто, вірус простого герпесу типу 1 ("НеМ-1"), вірус простого герпесу типу 2 ("НБУ-2"), герпесвірус людини типу 8 ("ННУ-8"), вірус гепатиту А ("НАМ"), вірус гепатиту В ("НВУ"), вірус гепатиту С ("НСУ"), вірус гепатиту Ю ("НОМ"), вірус гепатиту Е ("НЕУ"), вірус імунодефіциту людини ("ВІЛ"), вірус грипу, вірус Хунін, вірус Ласса, вірус Мачупо, вірус Марбург, вірус корі, людський метапневмовірус, вірус паротиту, вірус Норуолк, вірус папіломи людини ("ВПУ"), вірус парагрипу, парвовірус, вірус поліомієліту, вірус сказу, респіраторно-синцитіальний вірус ("АБУ"), риновірус, ротавірус, вірус краснухи, вірус Сабіа, вірус важкого гострого респіраторного синдрому ("атипової пневмонії"), коронавірус близькосхідного респіраторного синдрому ("МЕН5Б- бом"), вірус вітряної віспи, вірус натуральної віспи, вірус західного Нілу та вірус жовтої лихоманки.
І064| КДНК (комплементарна ДНК). Частина ДНК, у якій відсутні внутрішні некодуючі сегменти (інтрони) та регуляторні послідовності, які визначають час і місце ініціації транскрипції і термінації. КДНК може бути синтезована в лабораторії за допомогою оберненої транскрипції матричної РНК ("мРНК"), виділеної з клітин.
І065| Консервативний варіант. "Консервативний" варіант являє собою варіант білка або поліпептиду, який містить одну або більше амінокислотних замін, які суттєво не впливають на або не зменшують активність або антигенність білка або його антигенного епітопа. Як правило, консервативними замінами є ті, у яких конкретна амінокислота замінена іншою амінокислотою, що має однакові або схожі хімічні характеристики. Наприклад, заміна основної амінокислоти, такої як лізин, іншою основною амінокислотою, такою як аргінін або глутамін, є консервативною заміною. Термін "консервативний варіант" також включає використання заміщеної амінокислоти замість незаміщеної батьківської амінокислоти, за умови, що антитіла, що виробляються проти бо заміщеного поліпептиду, також імунореагують із незаміщеним поліпептидом і/або що заміщений поліпептид зберігає функцію незаміщеного поліпептиду. Неконсервативні заміни є такими, за яких конкретну амінокислоту замінено іншою, що має відмінні хімічні характеристики, ії, як правило, знижують активність або антигенність білка або його антигенного епітопа. 066) Конкретні, необмежуючі приклади консервативних замін включають наступні приклади:
Оригінальні залишки Консервативні заміни
Ага Г ув
Авп ап, Нів
Азр Спи
Сув 5ег
Сіп А5п
Сім А5р
Нів Авп; Сп
Пе Гей, Маї
Ї еи Пе; Маї
Гуз Аг9; Сп; Спи
Мен еи; Пе
Рпе Мей; І еи; Тут зег ТИг
ТАг Зег
Тер Тут
Тут Тр; Рпе
УапПе; І ей
І067| СОВА. Кластер фактора диференціювання 4, білок поверхні Т-клітин, який опосередкує взаємодію з молекулою ГКГС класу ІІ. Клітини, які експресують СО4, що називаються клітинами "Ср 4», часто є хелперними Т-клітинами (наприклад, "ТН", "ТНІ" або "ТН2"). (068) СО8. Кластер фактора диференціювання 8, білок поверхні Т-клітин, який опосередкує взаємодію з молекулою ГКГС класу І. Клітини, які експресують СО8, що називаються клітинами "СО в», часто є цитотоксичними Т-клітинами ("СТІ").
І069| Костимулююча молекула. Активація Т-клітин, як правило, вимагає зв'язування Т-
Зо клітинного рецептора ("ТОК") з комплексом пептид-ГКГС, а також іншого сигналу, що подається через взаємодію костимулюючої молекули з її лігандом. Костимулюючі молекули є молекулами, які у разі зв'язування зі своїм лігандом, подають другий сигнал, необхідний для активації Т- клітин. Найбільш відомою костимулюючою молекулою Т-клітини є СО28, яка зв'язується з В7-1 або з В7-2. Інші костимулюючі молекули, які також можуть забезпечувати другий сигнал, необхідний для активації Т-клітин, містять молекулу міжклітинної адгезії-1 ("(САМ-1"), молекулу міжклітинної адгезії-2 ("(САМ-2"), асоційований з лейкоцитарною функцією антиген-1 ("ГЕА-17),, асоційований з лейкоцитарною функцією антиген-2 ("ГЕА-2") і асоційований з лейкоцитарною функцією антиген-3 ("І ЕА-3"). Комбінація В7-1, ІСАМ-1 і ГЕА-3 називається "ТКІСОМ" від "ТКІай ої СОвіїтиіатюгу Моїесшев" ("Тріади костимулюючих молекул").
ІО7О| Дендритні клітини (0С). Дендритні клітини є головними антигенпрезентуючими клітинами (АПК"), що беруть участь у первинних імунних відповідях. Дендритні клітини містять плазмоцитоїдні дендритні клітини та мієлоїдні дендритні клітини. Їх основною функцією є отримання антигена в тканинах, міграція в лімфоїдні органи і представлення антигена для активації Т-клітин. Незрілі дендритні клітини зароджуються у кістковому мозку і знаходяться на периферії у вигляді незрілих клітин.
ІО71| Дволанцюгові РНК (длРНК). Рекомбінантний поксвірус, який містить гетерологічні або нативні нуклеїнові кислоти, що експресують підвищене число або кількість длРНК (наприклад, що експресують надлишок длРНК) згідно з будь-яким варіантом реалізації цього винаходу, запускає вивільнення цитокінів, хемокінів, ефекторних молекул і/або збільшує експресію костимулюючих молекул, або активує один або більше рецепторів розпізнавання патерну (РЕК), і/або активує клітини (наприклад, дендритні клітини, макрофаги, В- клітини або інші типи імунних клітин), і таким чином переважно запускає або індукує посилену природжену імунну відповідь. Надлишкову ДдлЛРНК можна визначити будь-яким відповідним способом, переважно, використовуючи спосіб визначення підвищеної природженої імунної відповіді або будь-який спосіб, як описано у прикладах, переважно спосіб згідно з Прикладом 16. Бажано, щоб надлишкову длРНК можна було визначати, як таку кількість длРНК на ранній стадії інфекції, що генерує посилену природжену імунну відповідь у разі використання рекомбінантного поксвірусного вектору згідно з цим винаходом. Прийнятніше, щоб надлишкову длРНК можна було визначити як кількість длРНК, що транскрибується упродовж ранньої фази вірусного бо інфікування рекомбінантним поксвірусом, що містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, які експресують або генерують длРНК, у порівнянні з контролем. Налишкова длРНК може бути згенерована шляхом ініціації транскрипції смислової або антисмислової РНК з ідентичними ділянками послідовностей або ділянками послідовностяей, що перекриваються, переважно довжиною щонайменше у 100 п.о., використовуючи поксвірусні промотори з ранньою активністю (наприклад, негайно ранні, ранні, або ранні/пізні поксвірусні промотори). Іншим способом визначення надлишкової длРНК є визначення підвищеної активації одного або більше РЕК, наприклад, РКЕ за визначенням за посиленням фосфорилювання субстрату РКЕ (наприклад, еіг2а у позиції серин-51) як показано у Прикладі 7. Переважно посилене фосфорилювання субстрату РКК (наприклад, еІБ2а у позиції серин-51) підвищується щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 15 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше у порівнянні з контролем.
І072| Рання стадія інфекції. Генна експресія поксвірусів регулюється у каскадний спосіб.
Рання транскрипція вірусних генів здійснюється вірусним транскрипційним апаратом, який потрапляє із вірусною частинкою в інфіковану клітину і знаходиться під управлінням ранніх вірусних промоторів, розпізнаваних комплексом ранньої вірусної транскрипції. Добре відомо, що після злиття віріону та мембрани хазяїна й вивільнення вірусного ядра в цитоплазму, ендогенна
РНК-полімераза і фактории транскрипції, що знаходяться у білковій оболонці, які складають вірусну генну експресію, розпочинають перший каскад ранньої вірусної генної експресії, протягом кого синтезується вірусна мРНК під контролем раннього промотора. Зазвичай рання стадія інфекції, наприклад, рання фаза триває близько 1-2 годин перед реплікацією генома.
Переважно, рання стадія інфекції триває проміжок часу між зв'язуванням вірусної частинки (наприклад, рекомбінантного поксвірусу) із клітиною-хазяїном і початком реплікації вірусного генома (наприклад, реплікації рекомбінантного поксвірусного генома). Серед ранніх білків є фактори транскрипції для реплікації вірусного генома длДНК, а наступна фаза транскрипції, яку називають проміжною, може починатися тільки після початку реплікації вірусного генома.
Переважно, рання стадія інфекції триває в межах 30 хвилин, однієї години або двох годин після інфікування або після інокуляції, бажано після того, як ядро вірусу було вивільнено у цитоплазму клітини.
Зо ІЇО73| Послідовності, які регулюють експресію. Послідовності нуклеїнових кислот, які регулюють експресію гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти, 3 якою вони функціонально зв'язані. Послідовності, які регулюють експресію, функціонально зв'язані з послідовністю нуклеїнової кислоти, коли послідовності, які регулюють експресію, контролюють і регулюють транскрипцію і/або трансляцію послідовності нуклеїнової кислоти. Таким чином, термін "послідовності, які регулюють експресію" включає промотори, енхансери, термінатори транскрипції, стартові кодони, сигнали сплайсингу для інтронів і стоп-кодони. Термін "регуляторні послідовності" включає, як мінімум, компоненти, присутність яких може впливати на транскрипцію і/або трансляцію послідовності гетерологічної нуклеїнової кислоти, і може також включати додаткові компоненти, присутність яких є корисною, таких як, наприклад, лідерні послідовності та послідовності партнерів злиття.
І074| Термін "послідовності, які регулюють експресію" включає промоторні послідовності.
Промотор - це мінімальна послідовність, достатня для управління транскрипцією гомологічних або гетерологічних генів. Також включено ті промоторні елементи, яких достатні, щоб зробити промотор-залежну генну експресію клітинно-специфічною, тканинно-специфічною або індуцибельною зовнішніми сигналами або агентами; такі елементи можуть розташовуватися у 5 або 3 областях гена. Термін "промотор" включає як конститутивні, так й індуцибельні промотори. Дивіться, наприклад, ВЩШег еї аї., Меїйоа5з іп Еплутоїоду 153:516-544 (1987).
Приклади промоторних послідовностей, включають, але не обмежуються цим, довгий кінцевий повтор ретровірусу (ТК"), основний пізній промотор аденовірусу, промотор вірусу вісповакцини 7,5К ("Рг7.5"), синтетичний ранній/пізній промотор вірусу вісповакцини ("5ЕЛ", промотор РізЗупі!т, промотор РІЇЕ1, промотор РіНот, промотор Рг5, гібридний ранній/пізній промотор або промотор вірусу АТІ коров'ячий віспи. Інші відповідні промотори включають, але не обмежуються цим, ранній промотор 5М40, основний пізній промотор аденовірусу, негайно- ранній промотор | людського ЦМВ, а також різні поксвірусні промотори, включаючи, але не обмежуючись цим, наступні промотори вірусу вісповакцини або отримані із ММА промотори: промотор ЗОК, промотор ІЗ, промотор 5Е/Л, промотор Ріг7.5К, промотор 40К, промотор С1, промотор РізЗупі!т, промотор РІЇЕ1, промотор РіНот, промотор Рг5, гібридний ранній/пізній промотор РігНуб, промотор Рг55Е, промотор РгАБбБЕ, промотор Рг13.5 і промотор Рг4І!55Е; промотор АТІ вірусу коров'ячої віспи або наступні промотори, отримані з вірусу віспи курей: бо промотор Рг7.5К, промотор ІЗ, промотор ЗОК або промотор 40К.
ІО75| Гетерологічний. Той, що походить від окремих генетичних джерел або видів.
Поліпептид, який є гетерологічним до модифікованого вірусу вісповакцини Анкара ("ММА"), що походить із нуклеїнової кислоти, не включеної в геном ММА, такий як, наприклад, бактеріальний антиген, грибковий антигена, паразитарний антиген, пухлино-асоційований антиген або вірусний антиген. Термін трактується у широкому сенсі, включаючи будь-яку ненативну нуклеїнову кислоту, що кодує РНК або білок, який зазвичай не кодується геномом ММА, або будь-який ненативний білок, що кодується такою ненативною нуклеїновою кислотою. 076) Гомолог; варіант. Термін "гомолог" або "варіант", вживаний у відношенні послідовності гена або білка, включає нативну амінокислотну послідовність гена або білка, про яку йде мова, фрагменти білка як зберегли здатність викликати імунну відповідь у хазяїна, а також гомологи або варіанти білків і фрагментів білків, включаючи, наприклад, глікозильовані білки або поліпептиди. Таким чином, білки та поліпептиди не обмежені конкретними послідовностями нативних амінокислот, але включають послідовності, ідентичні нативній послідовності, а також модифікації нативної послідовності, такі як делеції, добавки, вставки та заміщення. Переважно, такі гомологи або варіанти характеризуються щонайменше близько 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 9», 86 90, 87 У», 88 95 або 89 965, щонайменше близько 90 95, 91 Фо, 92 9о, 93 95 або 94 95, щонайменше близько 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 або близько 100 95 ідентичності амінокислотної послідовності з контрольним білком або поліпептидом. Термін "гомолог" або "варіант" також включає вкорочені, маючі видалення або іншим чином модифіковані нуклеотидні або білкові послідовності.
ІО77| Термін "гомолог" або "варіант" також включає вироджені варіанти нативних послідовностей. Вироджений варіант є полінуклеотидом, що кодує білок або його фрагмент, який включає послідовність, що містить кодони, відмінні від послідовності нативного гена або гена дикого типу, але визначає таку саму амінокислотну послідовність. Генетичний код визначає 20 природних амінокислот, більшість з яких кодується більш ніж одним кодоном. Таким чином, він є надлишковим або виродженим кодом. Усі вироджені нуклеотидні послідовності включено у цей опис за умови, що амінокислотна послідовність білка, кодованого виродженого полінуклеотидом, залишається незмінною.
ЇО78| Способи визначення ідентичності послідовностей між амінокислотними послідовностями відомі у цій області техніки. Дві або декілька послідовностей можна порівнювати шляхом визначення їх "відсотка ідентичності" Відсоток ідентичності двох послідовностей являє собою кількість точних збігів між двома вирівняними послідовностями, поділену на довжину коротшої послідовності та помножену на 100.
ІО79| "Відсоток (90) ідентичності амінокислотних послідовностей" у контексті білків, поліпептидів, антигенних білкових фрагментів, антигенів і епітопів, описаних у цьому документі, визначається як відсоток амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, які ідентичні до амінокислотних залишків у контрольній послідовності (тобто білка, поліпептиду, антигенного білкового фрагменту, антигена або епітопа, з якого він отриманий), після вирівнювання послідовностей і введення гепів, якщо це необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, і без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснювати різними способами, які відомі фахівцеві у цій області техніки, наприклад, використовуючи загальнодоступне комп'ютерне програмне забезпечення, таке як програмне забезпечення ВІ А5ЗТ, АГІСМ або Медаїїдп (ОМАЗТАК). Фахівці у цій області можуть визначити відповідні параметри для визначення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по усій довжині порівнюваних послідовностей.
ІО80Ї Клітини-хазяї. Клітини, в яких можливі розмноження вектору та експресія його ДНК.
Клітини можуть бути прокаріотичними (наприклад, бактеріальними) або еукаріотичними (наприклад, клітинами ссавців або людини). Термін також включає потомство вихідної клітини- хазяїна, хоча усе потомство може не бути ідентичним батьківській клітині, оскільки під час реплікації можуть виникати мутації.
І081)| Імунна відповідь. Адаптивна відповідь імунної системи клітини, такої як В-клітина, Т- клітина або моноцит, на стимул. Адаптивна відповідь є відповіддю на конкретний антиген і, таким чином, описується як "антиген-специфічна". Адаптивна імунна відповідь може включати вироблення антитіл до конкретного антигена В-клітиною, Т-клітинна допомогу з боку хелперної
Т-клітини СО4-, розширення популяції антиген-специфічних Т-клітин СОв-- (цитотоксичних Т- лімфоцитів, "СТІ"), цитотоксичну активність Т-клітин СО8ж, спрямовану проти клітин, що експресують конкретний антиген, або інший тип антиген-специфічної імунної відповіді. бо (082) Імуногенна композиція. Вживаний у цьому документі, термін "їмуногенна композиція"
відноситься до композиції, що містить рекомбінантний поксвірус, який містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню дволанцюгову РНК (длРНК). Термін також включає рекомбінантні поксвіруси, які містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню
ДЛРНК, і нуклеотидні послідовності, що кодують гетерологічний асоційований із захворюванням антиген. У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічний асоційований із захворюванням антиген є антигеном, який асоціюється з інфекційним захворюванням, або пухлино- асоційованим антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу асоційований із захворюванням антиген є антигеном інфекційного захворювання. У деяких варіантах реалізації винаходу, антиген інфекційного захворювання є вірусним антигеном, бактеріальним антигеном, грибковим антигеном або паразитарним антигеном. Рекомбінантний поксвірус може додатково включати додаткові нуклеїнові кислоти, що кодують, наприклад, одну або більше костимулюючих молекули, як описано у іншому місці цього документу. Такі композиції можуть включати рекомбінантний поксвірус, необов'язково змішаний з одним або більше фармацевтично прийнятних носіїв. (083) "Що потребують цього". У разі застосування щодо способів посилення імунної відповіді та використання рекомбінантних поксвірусів, імуногенних композицій і фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, суб'єктом, "що потребує цього", може бути людина, якій було поставлено діагноз або у якої раніше лікували патологічний стан внаслідок, наприклад, вірусної, бактеріальної, грибкової або паразитарної інфекції, або неопластичний стан (тобто рак). Щодо профілактики, суб'єкт, що потребує цього, також може бути суб'єктом схильним до ризику розвитку патологічного стану (наприклад, таким, що має сімейний анамнез патологічного стану, фактори способу життя, які свідчать про ризик виникнення патологісного стану тощо). (084) Лімфоцити. Тип білих кров'яних тілець, які беруть участь в імунному захисті організму.
Існує два основні види лімфоцитів: В-клітини і Т-клітини.
І085| Головний комплекс гістосумісності ("ГКГС"). Загальне визначення включає антигенні системи гістосумісності, описані для різних видів, включаючи людські лейкоцитарні антигени ("НГ А").
І086| Ссавець. Цей термін включає як людину, так і відмінних від людини ссавців.
Зо Аналогічно, термін "суб'єкт" включає як людей, так і суб'єктів ветеринарії.
І087| Відкрита рамка зчитування ("ВРЗ3"). Группа нуклеотидних кодонів, що розташована після еукаріотичного стартового кодона (АТО), яка визначає ряд амінокислот без будь-яких внутрішніх термінаційних кодонів, яка може транслюватися для отримання поліпептиду, або група нуклеотидів без будь-яких внутрішніх термінаційних кодонів, яка може транскрибуватися для отримання молекули РНК, такої як, наприклад, рибосомальна РНК (рРНК) або транспортна
РНК (тРНК).
І088)| Функціонально зв'язані. Перша нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з другою нуклеотидною послідовністю, якщо перша нуклеотидна послідовність знаходиться у функціональному взаємозв'язку з другою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, промотор є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо промотор знаходиться у позиції, у якій він може управляти транскрипцією кодуючої послідовності. У загальному випадку, функціонально зв'язані послідовності ДНК є суміжними і, у разі необхідності сполучення двох кодуючих білок областей, знаходяться в одній рамці зчитування.
ІО89| Фармацевтично прийнятні носії. Терміни "фармацевтично прийнятний носій" або "фармацевтично відповідний носій" і тому подібне, що використовуються у цьому документі, відносяться до фармацевтичних допоміжних речовин, наприклад, фармацевтичних, фізіологічних, прийнятних органічних або неорганічних речовин-носіїв, придатних для ентерального або парентерального застосування, які не вступають у шкідливі реакції з екстрактом. У Кетіпдіоп'є Рпагтасешіса! 5сіепсе5, Е. МУ. Мапіп, Маск Рибіїзпіпд Со., Еавіюоп,
РА, 15Іп Едййоп (1975), описано композиції та препарати, в яких використовують традиційні фармацевтично прийнятні носії, придатні для введення векторів і композицій, розкритих у цьому документі. В загальному випадку природа використовуваного носія залежить від конкретного застосовного способу введення. Наприклад, парентеральні препарати зазвичай містять ін'єкційні рідини, які включають фармацевтично та фізіологічно прийнятні рідини, такі як вода, фізіологічний розчин, збалансовані сольові розчини, водний розчин декстрози, гліцерин або таке інше, в якості носія. У разі твердих композицій (наприклад, порошків, пігулок, таблеток або капсул) традиційні нетоксичні тверді носії містять, наприклад, фармацевтичного ступеня чистоти маніт, лактозу, крохмаль або стеарат магнію. Фармацевтичні композиції можуть також містити незначні кількості нетоксичних допоміжних речовин, таких як змочуючі або бо емульсифікуючі агенти, консерванти, рН-буферні речовини тощо, такі як, наприклад, ацетат натрію або сорбітанмонолаурат. 090) "Фармацевтично ефективна кількість", ""ерапевтично ефективна кількість", "ефективна кількість". У контексті цього документа ці терміни (і споріднені їм терміни) відносяться до кількості, яка призводить до бажаного фармакологічного і/або фізіологічного ефекту у разі певного патологічного стану (наприклад, медичного патологічного стану, хвороби, інфекції або розладу) або одного або більше його симптомів і/або повністю або частково запобігає виникненню патологічного стану або його симптому, і/або може бути терапевтичною у сенсі часткового або повного лікування патологічного стану і/або шкідливого наслідку, обумовленого патологічним станом. "Фармацевтично ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" варіюватиметься залежно від композиції, що вводиться, патологічного стану, лікування/попередження якого проводиться, тяжкості патологічного стану, лікування або попередження якого проводиться, віку та відносного стану здоров'я особи, шляху та форми введення, оцінки лікаря або ветеринара, а також інших факторів, відомих фахівцеві у цій області з урахуванням принципів, запропонованих у цьому документі.
ЇО91| Полінуклеотид; нуклеїнова кислота. Термін "полінуклеотид" відноситься до нуклеотидного полімеру довжиною щонайменше у 300 основ, який складається з рибонуклеотидів (тобто РНК) або дезоксирибонуклеотидів (тобто ДНК або кДНК) і здатен або не здатен кодувати поліпептид або білок. Термін включає одно- і дволанцюгові форми ДНК.
І092| Поліпептид або білок. Термін "поліпептид" або "білок" відноситься до полімеру довжиною щонайменше у 100 амінокислот, у загальному випадку довжиною більше ніж 30 амінокислот.
І093| Поксвірусє. Термін "поксвірус" відноситься до будь-якої з двох підродин сімейства
Рохмігідае: СПпогаорохмігіпае і Епіоторохмігіпає. Представники підродини СВПогаорохмігіпає інфікують хребетних. Представники підродини Епіоторохмігіпає інфікують комах (тобто безхребетних). Термін "поксвірус" також відноситься до представників будь-якого роду
Спогаорохмігіпає (наприклад, вірусів віспи птахів, вірусів віспи овець, вірусів міксоми кроликів, вірусів контагіозного молюска, ортопоксвірусів, парапоксвірусів, вірусів віспи свиней та вірусів віспи Тана і Яба), включаючи ті чотири, які можуть інфікувати людину (ортопоксвіруси, парапоксвіруси, віруси віспи Тана і Яба та віруси контагіозного молюска), продуктивно або ні,
Зо але переважно ортопоксвіруси і/або віруси віспи птахів. Термін "поксвірус" також відноситься до представників будь-якого з роду Епіоторохмігіпає (наприклад, альфа-ентомопоксвіруси, бета- ентомопоксвіруси та гамма-ентомопоксвіруси).
І094| Віруси віспи птахів включають вірус віспи канарок, вірус віспи курей, вірус віспи майни, вірус віспи голубів і вірус віспи перепелиць. Віруси віспи овець включають віруси віспи овець, віруси віспи кіз і вірус нодулярного дерматозу. Віруси міксоми кроликів включають вірус міксоми, вірус фіброми Шопе (також відомий як вірус фіброми кроликів), вірус фіброми зайців і вірус фіброми білок. Віруси контагіозного молюска включають вірус МоПи5сит сопіадіозит.
Ортопоксвіруси включають вірус віспи буйволів, вірус віспи верблюдів, вірус коров'ячої віспи, вірус ектромелії, вірус віспи мавп, вірус віспи єнотів, вірус віспи людей (також відомий, як вірус натуральної віспи) і вірус вісповакцини. Термін "вісповакцина" відноситься як до вірусу вісповакцини дикого типу, так і до будь-яких чисельних атенуйованих штамів або ізолятів, виділених згодом, включаючи, наприклад, вірус вісповакцини МуУезіегп Кезегме, вірус вісповакцини Копенгаген, ЮОгумах (також відомий як вірус вісповакцини Умуе(й), АСАМ2000, хоріоалантоїсний вірус вісповакцини Анкара (СМА), модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА) і модифікований вірус вісповакцини АпКага-Вамагіап Могаїс ("ММА-ВМ"). Парапоксвіруси включають вірус папульозного стоматиту великої рогатої худоби, ОРФ-вірус, парапоксвірус новозеландського червоного оленя та вірус паравакцини. Віруси віспи свиней включають вірус віспи свиней. Віруси віспи Тана і Яба включають танапокс-вірус і вірус пухлини мавп яба. 095) Термін "модифікований вірус вісповакцини Анкара" або "ММА" відноситься до вірусу, згенерованого внаслідок більше 570 серійних пасажів дермальної вісповакцини штаму Анкара
Іхоріоалантоїсного вірусу вісповакцини Анкара (СМА); щодо загальної інформації, дивіться Мауг еї аї., (1975), Іптесіоп 3:6-14| на фібробластах курячого ембріона. СМА зберігали в Інституті вакцинації, Анкара, Туреччина, упродовж багатьох років і використовували як основу для вакцинації людей. Проте, із-за частих важких ускладнень після вакцинації, пов'язаних із вірусами вісповакцини, було зроблено декілька спроб створення більш послаблених, безпечніших вакцин проти віспи.
ІЇ096| У період з 1960 по 1974, проф. Антон Майр досяг успіху в послабленні СМА за допомогою більш ніж 570 безперервних пасажів у клітинах СЕРЕ |Мауг еї аї. (1975)). На різних моделях тварин було показано, що отриманий в результаті ММА був авірулентним (|Мауг, А. 8 60 Баппег, К. (1978), Оєм. ВіоІї. єгапа. 41:225-234|. У рамках ранньої розробки ММА в якості попередньої вакцини проти віспи, були проведені клінічні випробування, в яких використовували
МУА-517 у поєднанні з І істег ЕїІбігеє |БІСКІ (1974), Ргем. Меа. 3:97-101; ЄсКІ апа Носнвівїп-
Міпіге! (1971), Мипісп Мей. М/оспеп5сНг. 113:1149-1153), на пацієнтах з високим ризиком розвитку побічних реакцій після вакцинації. У 1976 ММА, отриманий від висіяного матеріалу
ММУА-571 (що відповідає 571му пасажу), було зареєстровано в Німеччині в якості основної вакцини для двохетапної програми парентеральної вакцинації проти віспи. Після цього ММА-572 було застосовано приблизно до 120000 представників європеоїдної раси, в більшості дітей від 1 до З років, без будь-яких зареєстрованих серйозних побічних ефектів, хоча багато суб'єктів належали до популяції з високим ризиком розвитку ускладнень, зв'язаних з вірусом вісповакцини (Мауг еї аї. (1978), 7епігаІйіІ. Васіегіо!. (В) 167:375-390). ММА-572 було здано на зберігання в Європейську колекцію тваринних клітинних культур під номером ЕСАСС
У94012707.
І097| В результаті пасивування, використовуваного для послаблення ММА, існує цілий ряд різних штамів або ізолятів, залежно від кількості пасажів у клітинах СЕР. Наприклад, ММА-572 використовували у Німеччині під час програми ліквідації віспи, а ММмА-575 широко використовували в якості ветеринарної вакцини. ММА-575 було здано на зберігання 7 грудня 2000 року в Європейську колекцію тваринних клітинних культур (ЕСАСС) під депозитарним номером У00120707. Послаблений СМА-вірус ММА (модифікований вірус вісповакцини Анкара) було отримано шляхом послідовного розмноження (більше ніж 570 пасажів) СМА на первинних фібробластах курячих ембріонів.
І098| Хоча Майєр та його колеги продемонстрували упродовж 1970-х, що ММА є сильно атенуйованим й авірулентним в організмі людини і ссавців, деякі дослідники повідомляли, що
ММА не є повністю атенуйованим у клітинних лініях ссавців і людини, оскільки у цих клітинах може відбуватися залишкова реплікація (ВіІапспага еї аІ. (1998), У. Сбеп. Мікої. 79:1159-1167;
СатоїЇ в Мов (1997), Мігоїсау 238:198-211; Патент США Мо 5185146; Атргобвіпі еї аї. (1999), 9.
Мешцгозсі. Вев. 55: 569|. Вважається що результати, представлені у цих публікаціях, були отримані з використанням різних відомих штамів ММА, оскільки застосовні віруси суттєво відрізняються за своїми властивостями, в особливості у своїй поведінці під час росту в різних клітинних лініях. Така залишкова реплікація є небажаною з різних причин, включаючи проблеми
Зо безпеки у зв'язку із застосуванням на людях.
І099| Штами ММА, які мають поліпшені профілі безпеки для розробки безпечніших продуктів, таких як вакцини або фармацевтичні препарати, було розроблено Вамагпап Могаїс: ММА додатково пасивували у Вамапап Могаїс і позначили ММА-ВМ. У ММА, а також у ММА-ВМ не вистачає приблизно 13 95 (26,6 т.п.о. в основному із шести областей) генома у порівнянні із спорідненим вірусом СМА. Делеції впливають на ряд вірулентних генів і генів кола хазяїв, а також на гени, необхідні для утворення тілець включення типу А. Зразок ММА-ВМ, що відповідає пасажу 583, було здано на зберігання 30 серпня, 2000 року в Європейську колекцію клітинних культур (ЕСАСС) під номером УО00083008.
ІО100| ММА-ВМ може приєдневатися до та проникати у людські клітини, де кодовані вірусом гени експресуються дуже ефективно. Проте, зборки та вивільнення потомства вірусу не відбувається. ММА-ВМ дуже адаптований до клітин первинних фібробластів курячих ембріонів (СЕРЕ) і не розмножується в клітинах людини. У клітинах людини експресуються вірусні гении, а інфекційний вірус не утворюється. ММА-ВМ класифікується як організм 1 рівня біологічної безпеки за цими Центрів контролю і профілактики захворювань у Сполучених Штатах.
Препарати ММА-ВМ і похідні вводили багатьом типам тварин, а також більше ніж 4000 суб'єктів- людей, у тому числі імунодефіцитним особам. Усі щеплення в цілому виявилися безпечними та добре переносилися. Незважаючи на високе атенуювання та зниження вірулентності, в доклінічних дослідженнях було показано, що ММА-ВМ викликає як гуморальну, так і клітинну імунні відповіді на вірус вісповакцини та гетерологічні генні продукти, що кодуються генами, які клонуються у геномі ММА ЦЕ. Нагтег еї аї. (2005), Апіїміг. ТНег. 10(2):285-300; А. Созта еї аї. (2003), Массіпе 22(1):21-9; М. бі Місоїа єї а. (2003), Нит. Сепе ТНег. 14(14):1347-1360; М. Оі
Місоїа еї а!. (2004), Сііп. Сапсег Вевз., 10(16):5381-53901.
ЇО10О1| Терміни "похідні" або "варіанти" ММА відносяться до вірусів, що здебільшо демонструють такі самі реплікаційні характеристики як і ММА, описаний у цьому документі, але мають відмінності в одній або декількох частинах їх геномів. ММА-ВМ, а також похідне або варіант ММА-ВМ не може репродуктивно реплікуватися в природних умовах в організмі людини та мишей. Конкретніше, ММА-ВМ або похідне або варіант ММА-ВМ переважно характеризуються також здатністю до репродуктивної реплікації у фібробластах курячих ембріонів (СЕРЕ), але не здатні до репродуктивної реплікації в клітинній лінії НаСаї кератиноцитів людини |ІВочКатр еї аї 60 (1988), 9. СеїІ. ВіоїІ. 106: 761-771), клітинній лінії остеосаркоми кісток людини 1438 (ЕСАСС Мо
91112502), клітинній лінії нирок ембріона людини 293 (ЕСАСС Мо 85120602) і клітинній лінії аденокарциноми шийки матки людини Не а (АТСС Мо ССІ-2). Крім того, похідне або варіант
ММУА-ВМ характеризується ступенем ампліфікації вірусу щонайменше, в два рази меншим, переважніше в три рази меншим, ніж ММА-575 у лініях клітин Неїа і клітин НаСат. Дослідження та аналіз цих властивостей варіантів ММА описано в УМО 02/42480 (США 2003/0206926) і УМО 03/048184 (США 2006/0159699), які обидві включено у цей документ за допомогою посилання. 0102) Ампліфікацію або реплікацію вірусу, як правило, виражають як співвідношення вірусу, отриманого з інфікованої клітини (вихід), і кількості, використовуваної для інфікування клітини в першу чергу (вхід), і називають "ступенем ампліфікації". Ступінь ампліфікації "1" визначає статус ампліфікації, за якого кількість вірусу, отриманого з інфікованих клітин, є такою смою, як і кількість, використана для інфікування клітин, що означає, що інфіковані клітини допускають інфікування вірусом і його розмноження. На відміну від цього, ступінь ампліфікації, менший за 1, тобто зниження виходу у порівнянні з рівнем входу, вказує на відсутність репродуктивної реплікації і, отже, на послаблення вірусу.
І0103| Переваги вакцини на основі ММА включають їх профіль безпеки, а також придатність для великомасштабного виробництва вакцини. Доклінічні випробування показали, що ММА-ВМ демонструє чудове атенуювання та ефективність у порівнянні з іншими штамами ММА (МО 02/42480). Додатковою властивістю штамів ММА-ВМ є здатність індукувати майже однаковий рівень імунітету в режимаї прайм-ін'єкція вірусу вісповакцини/буст-ін'єкція вірусу вісповакцини у порівнянні з режимом прайм-ін'єкція ДНК/буст-ін'єкція вірусу вісповакцини.
І0О104| Рекомбінантні віруси ММА-ВМ - найпереважніший варіант реалізації винаходу, описаний у цьому документі, - вважаються безпечними внаслідок притаманного їм реплакаційного дефекту в клітинах ссавців й їх стійкої авірулентності. Крім того, на доданок до своєї ефективності, вигідною може бути можливість виробництва в промисловому масштабі.
Крім того, вакцини на основі ММА можуть доставити декілька гетерологічних антигенів і забезпечувати одночасну індукцію гуморального та клітинного імунітету.
ІО105) В іншому аспекті вірусним штамом ММА, придатним для генерації рекомбінантного вірусу, може бути штам ММА-572, ММА-575 або будь-який подібний послаблений штам ММА.
Також придатним може бути мутант ММА, такий як хоріоалантоїсний вірус вісповакцини Анкара з видаленням (аСМА). асСМА містить шість делеційних ділянок генома ММА, які називаються делецією І (аеї! І), делецією ІІ (аеї ІІ), делецією ПІ (аеї ІП), делецією М (аеї! ІМ), делецією М (аеї М) і делецією МІ (аеєї МІ). Делеційні ділянки особливо корисні для вставки декількох гетерологічних послідовностей. аОСМА може репродуктивно реплікуватися (із ступенем ампліфікації більше 10) у клітинній лінії людини (такій як клітинні лінії людини 293, 1438 і МКС-5), яка потім уможливлює оптимізацію внаслідок додаткової мутації або послаблення, що корисно для стратегії вакцинації на вірусній основі (дивіться, наприклад, УМО 2011/092029).
ІО106| "Прайм-буст вакцинація". Термін "прайм-буст вакцинація" відноситься до стратегії вакцинації, в якій використовують першу прайм-ін'єкцію вакцини, націлену на специфічний антиген, за якою з інтервалами слідує одна або більше бустерних ін'єкцій того самого вакцинного антигена. Прайм-буст вакцинація може бути гомологічною або гетерологічною у відношенні до модальності вакцини (РНК, ДНК, білок, вектор, вірусоподібні частинки), за допомогою якої доставляють вакцинний антиген. У гомологічній прайм-буст вакцинації використовується вакцина, що містить однакові імуноген і вектор як для прайм-ін'єкції, так і для однієї або більше бустерних ін'єкцій. У гетерологічної прайм-буст вакцинації використовується вакцина, що містить однаковий імуноген як для прайм-ін'єкції, так і для однієї або більше бустерних ін'єкцій, але різні вектори для прайм-ін'єкції і для однієї або більше бустерних ін'єкцій.
Наприклад, у разі гомологічної прайм-буст вакцинації можна використовувати вектор ММА, що містить нуклеїнові кислоти, що експресують імуноген і ТКІСОМ як для праймч-ін'єкції, так і для однієї або більше бустерних ін'єкцій. Навпаки, у разі гетерологічної прайм-буст вакцинації можна використовувати вектор ММА, який містить нуклеїнові кислоти, що експресують імуноген і
ТКІСОМ для праймч-ін'єкції, і вектор вірусу віспи курей, який містить нуклеїнові кислоти, що експресують імуноген і ТЕІСОМ для однієї або більше бустерних ін'єкцій. Гетерологічна прайм- буст вакцинація також включає різні комбінації, такі як, наприклад, використання плазміди, що кодує імуноген у разі праймч-ін'єкції, і використання вектору поксвірусу, що кодує той самий імуноген у разі однієї або більше бустерних ін'єкцій, або використання рекомбінантного білка імуногена у разі прайм-ін'єкції і використання плазміди або вектору поксвірусу, що кодують той самий білок імуногена у разі однієї або більше бустерних ін'єкцій.
ЇО107| Рекомбінанти; рекомбінантна нуклеїнова кислота; рекомбінантний вектор; рекомбінантний поксвірусє. Термін "рекомбінантний", застосовуваний до нуклеїнової кислоти, 60 вектору, поксвірусу тощо, відноситься до нуклеїнової кислоти, вектору або поксвірусу,
отриманих за допомогою штучного комбінування двох або більше в інших випадках гетерологічних сегментів нуклеотидної послідовності, або нуклеїнової кислоти, вектору або поксвірусу, що містять таку штучну комбінацію двох або більше в інших випадках гетерологічних сегментів нуклеотидної послідовності. Штучне комбінування найчастіше виконують за допомогою штучної маніпуляції з виділеними сегментами нуклеїнових кислот, використовуючи добре відомі методи генної інженерії.
ІО108)| Ідентичність послідовностей. Термін "іодентичність послідовностей" відноситься до міри ідентичності між нуклеотидними або амінокислотними послідовностями. Ідентичність послідовностей часто визначають у термінах відсотка ідентичності (який часто описують як "схожість" або "гомологію" послідовностей). Чим вище відсоток ідентичності послідовностей, тим більш схожі дві послідовності. Гомологи або варіанти білка імуногена матимуть відносно високий ступінь ідентичності послідовностей у разі вирівнювання за допомогою стандартних способів.
І0109| Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі у цій області техніки. Різні програми й алгоритми вирівнювання описані в: 5тійй апа УМаїегтап, Аду. Аррі.
Майн. 2:482, 1981; Меєдієтап апа УУипзсн, у). Мої. Віої. 48:443, 1970; Ніддіп5 апа ЗНнагр, Сепе 73237, 1988; Ніддіп5 апа Зпагр, САВІОБ5 5:151, 1989; Согреї еї аї., Мисі. Асіає Ве5. 16:10881, 1988; і Реагзоп апа Гіртап, Ргос. Маг! Асад. сі. ОБА 85:2444, 1988. Крім того, в АїївспиЇ еї аї.,
Майте Сепеї 6:119, 1994, представлено детальний розгляд способів вирівнювання послідовностей та обрахування степеню гомології. Основний інструмент пошуку локального вирівнювання МОВІ (ВІ А5Т) (Айвепиї еї аї!., У. Мої. ВіоіІ. 215:403, 1990) є доступним із декількох джерел, у тому числі від Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ, Бетесда,
Меріленд; дивіться також ПпЕр://ріаві.побрі.піт.пій.дом/Віавзі.саді), для використання з програмами для аналізу послідовностей бБіавзір, Бріавіп, Біавзіх, Юіавіп і Юіавіх.
ІЇО110| Гомологи та варіанти білка імуногена, як правило, характеризуються щонайменше 90 оо, 91 965, 92 95, 93 95, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Уо, 98 9 або 99 95 ідентичності амінокислотних послідовностей у разі повнорозмірного вирівнювання з амінокислотною послідовністю імуногена дикого типу, отриманого за допомогою МСВІ Віаві м2.0, використовуючи Біавзір зі встановленими за умовчанням значеннями параметрів. Для порівняння амінокислотних послідовностей із
Зо більше ніж близько 30 амінокислот, використовують функцію послідовностей Віабії 2 із застосуванням матриці ВГОБИОМб2 зі встановленими за умовчанням значеннями параметрів (зі штрафом за геп 11, і штрафом за геп на залишок 1).
ІО111| Суб'єкт. Живі багатоклітинні хребетні організми включаючи, наприклад, людей, ссавців, що не відносяться до людей, і птахів. У цьому документі термін "суб'єкт" можна взаємозамінно використовувати з термінами "ссавець" або "тварина".
ІЇО112| Т-клітина. Лімфоцит або біле кров'яне тільце, необхідне для адаптивної імунної відповіді. Т-клітини включають, але не обмежуються цим, Т-клітини СО4-- і Т-клітини СОв-.. Т- клітина СО4ж- є імунною клітиною, яка на своїй поверхні несе маркер, відомий як "кластер диференціювання 4" ("СО4"). Ці клітини, відомі як хелперні Т-клітини, допомагають управляти імунною відповіддю, включаючи відповіді як антитіл, так і СТІ. Т-клітини СОвя- несуть маркер "кластера диференціювання 8" ("СО8"). Т-клітини СО8- включають СТІ, СТІ пам'яті та супресорні Т-клітини. (0113) Терапевтично активний поліпептид. Агент, що складається з амінокислот, такий як білок, який індукує біологічний ефект і/або адаптивну імунну відповідь, визначувану за клінічною відповіддю (наприклад, збільшенням кількості Т-клітин СО4ж, Т-клітин СОвя- або В-клітин, збільшенням рівня експресії білка, виивлюваним скороченням розміру пухлини або зменшенням кількості метастазів). Терапевтично активні також молекули можуть бути отримані з нуклеїнових кислот, таких як, наприклад, вектор поксвірусу, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує білок або білковий імуноген, функціонально зв'язану з послідовністю, яка регулює експресію.
Ї0114| Терапевтично ефективна кількість. "герапевтично ефективна кількість" являє собою кількість композиції або клітин, достатню для досягнення бажаного терапевтичного або клінічного ефекту у суб'єкта, лікування якого проводять. Наприклад, терапевтично ефективна кількість вектору поксвірусу, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує білок або білковий імуноген, функціонально зв'язану з послідовністю, яка регулює експресію, являє собою кількість, достатню, щоб викликати біологічну відповідь або антиген-специфічну імунну відповідь, або щоб зменшити або усуненути клінічні ознаки або симптоми інфекції або іншого захворювання у пацієнта або популяції пацієнтів, які мають захворювання або розлад. Терапевтично ефективна кількість векторів поксвірусів та композицій, що містять вектори поксвірусів, запропонованих у цьому документі, являє собою кількість, достатню, щоб підвищити імунну відповідь на клітини, бо що експресують антиген-мішень. Імунна відповідь має бути достатньої величини, щоб зменшити або усунути клінічні ознаки або симптоми захворювання у пацієнта або популяції пацієнтів, що мають цільовий розлад.
ІЇО115| Трансдукований або трансформований. Термін "трансдукований" або "грансформований" відноситься до клітини, в яку за допомогою стандартних способів молекулярної біології було внесено рекомбінантну нуклеїнову кислоту. Вживаний у цьому документі термін "трансдукція" включає всі методи, за допомогою яких молекулу нуклеїнової кислоти може бути внесено у такі клітини, включаючи інфеїкування вірусними векторами, трансформацію плазмідними векторами і внесення "оголеної" ДНК шляхом електропорації, ліпофекції або за допомогою генної гармати.
ІО116| ТКІСОМ. Тріада костимулюючих молекул (Тгіадй ої СОб5ійтіагту МоїІесшев), що складається із В7-1 (також відомої як СО80), молекули внутрішньоклітинної адгезії-1 (ІСАМ-1, також відомої як СО54) і функціонально-зв'язаного антигена лімфоцитів-З3 (І ЕА-3, також відомого як СО58), які зазвичай включають у рекомбінантні вірусні вектори (наприклад, поксвірусні вектори), що експресують специфічний антиген, з метою підвищення антиген- специфічної імунної відповіді. Окремі компоненти ТКІСОМ можуть знаходитися під управлінням одного й того самого або різних промоторів і можуть знаходитися у одному векторі із специфічним антигеном або в окремому векторі. Типові вектори розкриті, наприклад, у Нодде еї а!., "А Ттїай ої Совіїтціаюгу Моїесшев Зупегадіге ю Атріїу Т-Сеї| Асіїмайоп", Сапсег Нев. 59:5800- 5807 (1999) і Патенті США Мо 7211432 В2, які включено у цей документ за допомогою посилання.
ІО117| Вектор. Носій, за допомогою якого молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, вносять у клітину-хазяїна, внаслідок чого отримують трансдуковану або трансформовану клітину-хазяїна. Вектори, як правило, містять послідовності нуклеїнових кислот, що дозволяють їм реплікуватися у клітині-хазяїні, такі як сайт ініціації реплікації, а також один або декілька генів селектованих маркерів, послідовності, які регулюють експресію, послідовність розпізнавання рестрикційної ендонуклеази, послідовності праймерів і різних інших генетичних елементів, відомих у цій області техніки. Зазвичай використовувані типи векторів включають плазміди для експресії у бактеріях (наприклад, Е. соїї) або дріжджах (наприклад, 5. сегемізіае), човникові вектори для конструювання рекомбінантних поксвірусів, косміди,
Зо бактеріальні штучні хромосоми, дріжджові штучні хромосоми та вірусні вектори. Вірусні вектори включають серед інших вектори поксвірусу, вектори ретровірусу, вектори аденовірусу, вектори вірусу герпесу, вектори бакуловірусу, вектори вірусу Сіндбіс і вектори поліовірусу. 0118) Вектори поксвірусу включають, але не обмежуються цим, ортопоксвіруси, віруси віспи птахів, парапоксвіруси, віруси віспи Тана і Яба і віруси контагіозного молюска, але переважно ортопоксвіруси і/або віруси віспи птахів, як детальніше визначено вище. Ортопоксвіруси включають вірус віспи людей (також відомий як вірус натуральної віспи), вірус вісповакцини, вірус коров'ячої віспи та вірус віспи мавп. Віруси віспи птахів включають вірус канарок і вірус віспи курей. Термін "вірус вісповакцини" відноситься як до вірусу вісповакцини дикого типу, так і до будь-якого із різних атенуйованих штамів або ізолятів, виділених пізніше, включаючи, наприклад, вірус вісповакцини Умезівегтп Кезегме, вірус вісповакцини Копенгаген, Огумах (також відомий як вірус вісповакцини Уууе(й), АСАМ2000, модифікований вірус вісповакцини Анкара ("ММА") і модифікований вірус вісповакцини АпКага-Вамагіап Могаїс ("ММА-ВМ").
Рекомбінантні поксвіруси
ІО119| В одному аспекті у цьому документі запропоновано рекомбінантні поксвіруси, які містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранні дволанцюгові РНК (длРНК). У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні поксвіруси містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують надлишкову длРНК упродовж 1 або 2 годин після інфікування. У деяких варіантах реалізації винаходу у цьому документі запропоновано рекомбінантні поксвіруси, які містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню або надлишкову
ДлЛРНК перед початком реплікації генома зазначеного рекомбінантного поксвірусу. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні поксвіруси, які містять гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню длРНК упродовж 1 або 2 годин після інфікування. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні поксвіруси можуть містити одну гетерологічну нуклеїнову кислоту, обидві нитки якої транскрибуються для генерації ранньої длРНК. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні поксвіруси можуть містити додатковий промотор, що управляє ранньою антисмисловою транскрипцією ранньо транскрибованого нативного гена поксвірусу, тим самим експресуючи ранню длРНК. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні поксвіруси, що генерують ранню длРНК, додатково містять нуклеотидну послідовність, яка кодує гетерологічний асоційований із хворобою антиген. У деяких варіантах бо реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус додатково містить нуклеотидну послідовність, яка кодує одну або більше костимулюючих молекули. У деяких варіантах реалізації винаходу одна або більше костимулюючих молекули являє собою ТКІСОМ (тобто В7-1, ІСАМ-1 і І ЕА-3). У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічний асоційований із захворюванням антиген є антигеном, асоційованим із інфекційним захворюванням, або пухлино-асоційованим антигеном.
У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічний асоційований із захворюванням антиген є антигеном інфекційного захворювання. У деяких варіантах реалізації винаходу антиген інфекційного захворювання є вірусним антигеном, бактеріальним антигеном, грибковим антигеном або паразитарним антигеном.
І0120| У деяких варіантах реалізації винаходу антиген інфекційного захворювання є вірусним антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу вірусний антиген отримано від вірусів, вибраних із групи, що складається із аденовірусу, вірусу Коксакі, Конго-Кримського вірусу геморагічної лихоманки, цитомегаловірусу (ЦМВ), вірусу денге, вірусу Еболи, вірусу
Зпштейна-Барр (ЕВМ), вірусу Гуанаріто, вірусу простого герпесу-типу 1 (НБМ-1), вірусу простого герпесу-типу 2 (НБЗУ-2), герпесвірусу людини типу 8 (ННУ-8), вірусу гепатиту А (НАМ), вірусу гепатиту В (НВУ), вірусу гепатиту С (НС), вірусу гепатиту О (НОМ), вірусу гепатиту Е (НЕМ), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу грипу, вірусу Хунін, вірусу Ласса, вірусу Мачупо, вірусу Марбург, вірусу кору, людського метапневмовірусу, вірусу паротиту, вірусу Норуолк, вірусу папіломи людини (ВПЛ), вірусу парагрипу, парвовірусу, вірусу поліомієліту, вірусу сказу, респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ), риновірусу, ротавірусу, вірусу краснухи, вірусу Сабіа, вірусу важкого гострого респіраторного синдрому (атипової пневмонії), вірусу вітряної віспи, вірусу натуральної віспи, вірусу західного Нілу та вірусу жовтої лихоманки.
ІО121| У деяких варіантах реалізації винаходу антиген інфекційного захворювання є бактеріальним антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу бактеріальний антиген отримоно із бактерій, вибраних із групи, що складається із Васійн5 апійнгасіх5, Вогаєїейа репизв5і5,
Воїтейа Бигдаопегі, Вгисейа аропйих, Вгисейа сапі5, ВгисеМПа теїйепві5, Вгисейа в5иїв5,
Сатруобасієг |є|пі, СНіатудіа рпештопіає, Спіатуадіа і аспотаїйй5, СНіатуадорніа рзінасі,
Сіозійдіит Боїшііпит, Сіовійдішт айбісіє, Сіовійдішт репіпдеп5, Сіовіпдіт (іеїапі,
Согупебасієгішт аірійегіає, Епіегососсив Таесаїів, Епіегососсив Таєсішт, ЕзсПепгісніа «соїї, ентеротоксигенної Ев5спПегіспіа соїї, ентеропатогенної Е5сПегіспіа соїї, Евспегіспіа соїї 157:Н7,
ЕгапсізеїІа Іміагепві5, Наеторнійсиз іпПшеплга, Неїїсобасіег руйогі, І едіопейа рпешторнпіїйа, І еріозріга іпієттодапе, І ібієйа топосуїодепе5, Мусобрасієгйт Іергає, Мусобасієгішт Шрегсицовів,
Мусоріазта рпеитопіає, Меї55етіа допопповеає, Меїі5зегіа тепіпдійдев5, Рзендотопах аегидіповза,
ВісКенНвіа гпісКейнвіа, ЗаітопеїІа їурні, ЗаІтопейПа їурпітигішт, Зпідейа 5оппеї, еїарпуіососсив ацгеивх, еїарпуіососсив ерідептідіє, єЄФарнуососсив заргорнуїісивє, ЗйМеріососсив адаїасііає, зігеріососси5 рпештопіає, Зігеріососсиз5 руодепез, Тгеропета раїїйаит, Мібгіо споїегає і Уегвіпіа резвіїв.
І0122| У деяких варіантах реалізації винаходу антиген інфекційного захворювання є грибковим антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу грибковий антиген отримано із грибів, вибраних із групи, що складається із АзрегойШ5 сіамайи5, Азрегуйи5 ПЯами5, Азрегдйив5
ТШтідай5, Азрегайш5 піашапе, Азрегай5 підег, Азрегуйи5 їетеийв5, Віазіотусе5 аептаййіаів,
Сапаїда аїІрісапо, Сапаїда аибііпіепзі5, Сапаїда діарбгаіа, Сапаїда рагарзіювзів, Сапаїда гидоза,
Сапаїда ігорісаїїз, Стуріососсив аїбідив, Стуріюсоссив дації, Стуріососсив Іацйгепії, Стуріососсив пеоїоптапв5, Нівіоріаєта сарвзшацт, Містозрогит сапі5, Рпешйтосубвіїв5 саїгіпії, Рпеитосувіїв фгомесії, Зрогоїнгіх зсПепскії, єїаспроїгувє спапагит, Тіпеа Батбає, Тіпеа сарійіфв, Тіпеа согрогів,
Тіпеа сгпигі5, Тіпеа Тасієї, Тіпеа іпсодпію, Тіпеа підга, Тіпеа мегзісоїог, Тгіспорпуюп гибгит і
Тиспорнпуюп Ююпзигапв.
І0123| У деяких варіантах реалізації винаходу антиген інфекційного захворювання є паразитарним антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу паразитарний антиген отримано із паразита, вибраного із групи, що складається із Апізакіє 5рр., Вабевіа 5рр.,
Вауїїзазсагіз ргосуопіз, Стуріозрогідішт 5рр., Сусіозрога сауєїапепвів, ОірпуПобоїйгіШт зрр.,
Огасипсши5 теєаіпепві5, Епіатоера Півіоїуїїса, Сіагаіа диодепаїїйв, Сіагаіа іпіезііпаїйї5, Сіагаіа
Іатьійа, І еїзптапіа 5р., Ріазтодіит Заісірагит, ЗспівТо5зота тапвзопі, Зспівіїозота паетаїйобіит, зспізіозота |аропісит, Таеєпіа 5рр., Тохоріазта допаїйї, ТгіспіпейПа 5рігаїї5 і Ттурапозхота сги?і.
І0124| У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічний асоційований із захворюванням антиген є пухлино-асоційованим антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу пухлино-асоційований антиген вибрано із групи, що складається із 5-с-редуктази, а- фетопротеїну (АФП), АМ-1, АПК, Аргії, гена антигена меланоми В (ВАСЕ), р-катеніна, Всі12, Беог- ані, Вгаспушйгу, СА-125, каспази-8 (САБР-8, також відомої як ЕГІСЕ), катепсинів, СО19, СО20,
СОр21/комплементарного рецептора 2 (СК2), СО22/ВІ-САМ, СО23/ЕсеєКІІ, сСО33, бо СОоЗ5/комплементарного рецептора 1 (СК1), СО44/РОР-1, СО45/спільного антигена лейкоцитів
(СА), СО46/мембранного кофактора білка (МСР) СО52/САМРАТН-1, СО55/фактора прискорення розпаду (БАР), СО59/протектину, СОС27, СОК4, карциноембріонального антигена (СЕА), с-ппус, циклооксигенази-2 (сох-2), видаленого у разі колоректального раку гена (ОСС),
ОсКкЗ, Еб/Е7, СОЕК, ЕМВР, Опа78, фарнезилтрансферази, фактора росту фібробластів-ва (ЕОЕ8а), фактора росту фібробластів-ВБ (БСЕ8Б), РІ К-1/КОК, рецептора фолієвої кислоти, 05250, антигена сімейства генів меланоми (С (сімейства САСЕ), гастрину 17, гастрин- вивільняючого гормону, гангліозиду 2 (502) /гангліозиду З (503) /гангліозид-моносіалової кислоти-2 (8М2), гонадотропін-вивільняючого гормону (ЗпПКН), ООР-СІСМАс:К1Мап(са1-6К2 |від
СІСМАс до Мап(а1-6)); В1,6-М-ацетилглюкозамінтрансферази М (Сп М), аРІ, др100/Рте117, др- 100-іп4, одр15, др7бБ/тирозин-зв'язаного білка-ї (др7/75/ТАР-1), людського хоріонічного гонадотропіну (ХГ), гепаринази, Нег2г/пеи, вірусу пухлини молочної залози людини (НМТ), білка теплового шоку у 70 кілодальтонів (НЗР70), оберненої транскриптази теломерази людини (нТЕКТ), рецептора-1 інсулін-подібного фактора росту (ІСЕК-1), рецептора інтерлейкіну-13 (ІІ - 13г), індуцибельної синтази окису азоту (МОБ), Кіб7, КІААО205, К-гав, Н-га5, М-гав, КА, І КІ В-
РТ, антиген-кодуючого гена меланоми 1 (МАСБЕ-1), антиген-кодуючого гена меланоми 2 (МАСЕ-2), антиген-кодуючого гена меланоми З (МАСЕ-3), антиген-кодуючого гена меланоми 4 (МАСЕ-4), маммаглобіну, МАР17, Мелан-А/антигена меланоми, що розпізнається Т-клітинами-1 (МАВТ-1), мезотеліну, МІС А/В, МТ-ММР», муцину, сім'яник-специфічного антигена ММ-ЕБО-1, остеонектину, р15, Р1І70О/МОКТ, р53, ро7/меланотрансферину, РА!І-1, тромбоцитарного фактора росту (ТРФ), НРА, РЕАМЕ, пробасину, прогенопоетину, простато-специфічного антигена (РЗА), простато-специфічного антигена мембрани (РОМА), КАСЕ-1, Вр, ВАСАБІ, 5АВТ-1І, 55Х- сімейства, ЗТАТЗ3, З5Тп, ТАС-72, трансформуючого фактора росту-альфа (ТОБ-о), трансформуючого фактора росту-бета (ТОБ-В), Тимозин-бета-15, фактора некроза пухлин- альфа (ФНоО-а), ТР1, ТКР-2, тирозинази, фактора росту ендотелію судин (МЕСЕ), 2АС, р1бІМКА і глутатіон-5-трансферази (051). 0125) У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є представником підродини СПпогдорохміїіпає або підродини Епіоторохмігіпае. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є представником підродини СПпогдорохмігіпае. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є представником роду
Зо СПпогдорохмігіпає, вибраним із групи, що складається із вірусів віспи птахів, вірусів віспи овець, вірусів міксоми кроликів, вірусів контагіозного молюска, ортопоксвірусів, парапоксвірусів, вірусів віспи свиней та вірусів віспи Тана і Яба. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом віспи птахів. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус віспи птахів вибрано із групи, що складається із вірусу віспи канарок, вірусу віспи курей, вірусу віспи майн, вірусу віспи голубів і вірусу віспи перепелиць. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом віспи овець. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус віспи овець вибрано із групи, що складається із вірусу віспи овець, вірусу віспи кіз і вірусу нодулярного дерматозу. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом міксоми кроликів. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус міксоми кроликів вибрано із групи, що складається із вірусу міксоми, вірусу фіброми Шопе (також відомого як вірус фіброми кроликів), вірусу фіброми зайців і вірусу фіброми білок. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом контагіозного молюска. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус контагіозного молюска є вірусом МоПизсит сопіадіозит. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є ортопоксвірусом. У деяких варіантах реалізації винаходу ортопоксвірус вибрано із групи, що складається із вірусу віспи буйволів, вірусу віспи верблюдів, вірусу віспи корів, вірусу ектромелії, вірусу віспи мавп, вірусу віспи єнотів, вірусу віспи людини (також відомого як вірус натуральної віспи) і вірусу вісповакцини. У деяких варіантах реалізації винаходу ортопоксвірус є вірусом вісповакцини. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус вісповакцини вибрано із групи, що складається із вірусу вісповакцини Умезіегп Кезегме, вірусу вісповакцини Копенгаген, Огумах (також відомого як вірус вісповакцини Умуеїй), АСАМ2000, хоріоалантоїсного вірусу вісповакцини Анкара ("СМА", модифікованого вірусу вісповакцини Анкара ("ММА") і модифікованого вірусу вісповакцини
АпКага-Вамагіап Могаіїс ("ММА-ВМ") У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є парапоксвірусом. У деяких варіантах реалізації винаходу парапоксвірус вибрано із групи, що складається із вірусу папульозного стоматиту великої рогатої худоби, ОРФ-вірусу, парапоксвірусу новозеландського червоного оленя і вірусу паравакцини. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом віспи свиней. У деяких варіантах реалізації винаходу вірус віспи свиней є вірусом віспи свиней. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний поксвірус є вірусом віспи Тана і Яба. У деяких варіантах реалізації бо винаходу вірус віспи Тана і Яба є вибрано із групи, що складається із танапоксвірусу та вірусу пухлини мавп яба.
І0126| У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню длРНК, містять послідовності, кодуючі комплементарні транскрипти РНК, причому комплементарні транскрипти РНК гібридизують після транскрипції для отримання
ДлЛРНК. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні транскрипти РНК містять відкриті рамки зчитування (ВРЗ), що кодують білок, або гении, що не кодують білок. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні транскрипти РНК або комплементарні частини транскриптів РНК перекриваються упродовж 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 або 1000 нуклеотидів. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні транскрипти РНК перекриваються упродовж більш ніж 50, більш ніж 100, більш ніж 150, більш ніж 200, більш ніж 250, більш ніж 300, більш ніж 350, більш ніж 400, більш ніж 450, більш ніж 500, більш ніж 550, більш ніж 600, більш ніж 650, більш ніж 700, більш ніж 750, більш ніж 800, більш ніж 850, більш ніж 900, більш ніж 950 або більш ніж 1000 нуклеотидів. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні транскрипти РНК перекриваються упродовж ділянки між 100 ї 1000, між 200 ї 1000, між 300 їі 1000, між 400 ї 1000, між 500 ї 1000, між 600 і 1000, між 700 ї 1000, між 800 ї 1000, між 900 ії 1000, між 200 і 900, між
ЗО00 і 800, між 400 і 700, між 300 і 750, між 300 ї 730 або між 500 і 600 нуклеотидами.
І0127| У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеїнові кислоти транскрибовані в РНК з комплементарною нуклеїновою кислотою або комплементарною послідовністю, довжина якої переважно складає 50, 60, 70, 80, 90, 100 95 комплементарної послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеїнові кислоти, які кодують комплементарні транскрипти РНК, містять дві комплементарні послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні послідовності розділені за допомогою одного або більше важливих вірусних генів або некомплементарної нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу ідентичні або дуже схожі послідовності, які кодують частково або повністю комплементарні транскрипти, відокремлені за допомогою одного або більше важливих вірусних генів. У деяких варіантах реалізації винаходу, гетерологічні нуклеїнові кислоти, які кодують комплементарні транскрипти РНК, містять дві комплементарні послідовності в окремих транскриптах або нуклеїнових кислотах. У деяких варіантах реалізації винаходу смислова
Зо матрична РНК (мРНК) транскрибується з однієї комплементарної послідовності, а антисмислова
МРНК транскрибується з іншої комплементарної послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу смислова матрична РНК (мРНК) транскрибується з однієї із двох ідентичних або дуже схожих послідовностей, а антисмислова мРНК транскрибується з іншої ідентичної або дуже схожої послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу експресія послідовностей, які кодують комплементарні транскрипти РНК, що перекриваються, управляється одним або більше поксвірусними промоторами. У деяких варіантах реалізації винаходу один або більше поксвірусних промоторів є ранніми промоторами або негайно-ранніми промоторами.
ІО128| У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарний транскрипт РНК або частина транскрипту РНК містить нуклеотиди на різних молекулах нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні частини транскриптів РНК складаються із нуклеїнових кислот, відмінних від міРНК або комплементарних транскриптів РНК коротких ділянок, довжина яких складає, наприклад, від 21 до 23 пар основ. 0129) У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусний промотор є раннім промотором.
У деяких варіантах реалізації винаходу ранній промотор вибрано із групи, що складається із промотора Рг/7.5 і промотора Рг5. У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусний промотор є негайно-раннім промотором. У деяких варіантах реалізації винаходу негайно-ранній промотор вибрано із групи, що складається із промотора ІЗ, промотора ЗОК, промотора 40ОК, промотора РгНуб, Рг55Е промотора, промотора Рг4! 55Е і промотора РІ13.5.
Композиції
ІО130)| У іншому аспекті у цьому документі запропоновано імуногенні композиції, які містять будь-який із рекомбінантних поксвірусів, що містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують дволанцюгову РНК (длРНК), запропоновану у цьому документі, і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій або допоміжну речовину. У деяких варіантах реалізації винаходу імуногенні композиції містять будь-який із рекомбінантних поксвірусів, що містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують длРНК, запропоновану у цьому документі, і додатково містять нуклеотидні послідовності, які кодують будь-який із гетерологічних асоційованих із захворюванням антигенів, запропонованих у цьому документі, і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій або допоміжну речовину.
ІО131) В іншому аспекті у цьому документі запропоновано фармацевтичні композиції, які бо містять будь-який із рекомбінантних поксвірусів, що містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують ранню дволанцюгову РНК (длРНК), запропоновану у цьому документі, і фармацевтично прийнятний носій або наповнювач. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції, які містять будь-який із рекомбінантних поксвірусів, що містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують длРНК, запропоновану у цьому документі, і додатково містять нуклеотидні послідовності, які кодують будь-який із гетерологічних асоційованих із захворюванням антигенів, запропонованих у цьому документі, і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій або допоміжну речовину. 0132) Рекомбінантні поксвіруси, використовувані для приготування імуногенних композицій та фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, містять суспензію або розчин рекомбінантних поксвірусних частинок з концентрацією в діапазоні від 104 до 109
ТСІО5О/мл, від 105 до 5х108 ТСІЮО5О/мл, від 106 до 108 ТСІО5О/мл або від 107 до 108
ТСІО5О/мл. У деяких варіантах реалізації винаходу композиції отримані у вигляді одиничних доз, що містять від 106 до 109 ТСІЮ50 або що містять 106 ТСІО50, 107 ТСІО50, 108 ТСІО5О або 5х108 ТСІО50. Рекомбінантні поксвіруси, розкриті у цьому документі, представлені у фізіологічно прийнятній формі, що грунтується, наприклад, на досвіді приготування поксвірусних вакцин, використовуваних для вакцинації проти віспи людини, як описано в Н.
ЗІСКІ еї аЇ., Бібсп. тей. МУзспг. 99:2386-2392 (1974). Наприклад, очищені поксвіруси можна зберігати за -80 "С у титрі 5х108 ТСІО5БО/мл, приготованому у близько 10 мМ Тріс, 140 мм Масі, за рН 7,7. У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусні препарати, наприклад, 102-108 або 102-109 поксвірусних частинок можна ліофілізувати у 100 мл розчину фосфатно-сольового буфера (РВ5) у присутності 2 95 (м/об) пептону і 1 95 (м/0об) людського сироваткового альбуміну (ЛСА) і зберігати в ампулі, зробленій із скла або іншого відповідного матеріалу. 0133) Крім того, ліофілізовані препарати поксвірусних частинок можна отримати шляхом ступінчастої ліофілізації суспензії поксвірусних частинок, приготованих у розчині такому як, наприклад, 10 мМ Тріс, 140 мМ Масі, за рН 7,7, або РВ5 плюс 2 95 (м/об) пептону і 1 95 (м/об)
ЛСА. У деяких варіантах реалізації винаходу розчин містить одну або більше додаткових добавок, таких як маніт, декстран, цукор, гліцин, лактоза або полівінілпіролідон. У деяких варіантах реалізації винаходу розчин містить інші добавки, такі як антиоксиданти або інертний газ, стабілізатори або рекомбінантні білки (наприклад, людський сироватковий альбумін або
ЛСА), придатні для введення іп мімо. Розчини потім аліквотують у відповідних сосудах для зберігання, таких як, наприклад, скляні ампули, а сосуди для зберігання герметизують. У деяких варіантах реалізації винаходу імуногенні і/або фармацевтичні композиції зберігають за температури від 42С до кімнатної температури декілька місяців. У деяких варіантах реалізації винаходу сосуди для зберігання зберігають за температури нижче-209С, нижче-409С, нижче- 609С або нижче-809С.
ІО134| У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтично прийнятний носій або допоміжна речовина містить одну або більше добавок, антибіотиків, консервантів, ад'ювантів, розчинників і/або стабілізаторів. Такими допоміжними речовинами можуть бути вода, фізіологічний розчин, гліцерин, етиловий спирт, змочуючі або емульсифікуючі агенти, рн- буферні речовини тощо. У загальному випадку природа використовуваного носія залежить від конкретного вживаного способу введення. Наприклад, парентеральні препарати зазвичай містять ін'єкційні рідини, які включають фармацевтично та фізіологічно прийнятні рідини, такі як вода, фізіологічний розчин, збалансовані сольові розчини, водний розчин декстрози, гліцерин або таке інше, в якості носія. Відповідні носії зазвичай є великими, повільно метаболізовані молекулами, такими як білки, полісахариди, полимолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, сополімерні амінокислоти, ліпідні агрегати тощо.
Способи та застосування 0135) У іншому аспекті у цьому документі запропоновано способи підвищення активації природженого імунітету, які включають введення будь-якої із фармацевтичних композицій або будь-якого із рекомбінантних поксвірусів, запропонованих у цьому документі, суб'єкту, що потребує цього, при цьому фармацевтична композиція або рекомбінантний поксвірус підвищують активацію природженого імунітету у разі введення суб'єкту. У іншому аспекті у цьому документі запропоновано застосування будь-якої із фармацевтичних композицій або будь-якого із рекомбінантних поксвірусів, запропонованих у цьому документі, у приготуванні лікарського засобу для лікування або профілактики патологічного стану, опосередкованого поксвірусом або опосередкованого гетерологічним асоційованим із захворюванням антигеном.
У іншому аспекті у цьому документі запропоновано поксвірус або будь-яку із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, для застосування в якості лікарського засобу. У іншому аспекті у цьому документі запропоновано поксвірус або будь-яку із фармацевтичних бо композицій, запропонованих у цьому документі, для застосування для підвищення природженої імунної активації або для лікування або попередження патологічного стану, опосередкованого поксвірусом або опосередкованого гетерологічним асоційованим із захворюванням антигеном.
У іншому аспекті у цьому документі запропоновано застосування будь-якої із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, для лікування або попередження патологічного стану, опосередкованого поксвірусом або опосередкованого гетерологічним асоційованим із захворюванням антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єкт є хребетним. У деяких варіантах реалізації винаходу хребетне є ссавцем. У деяких варіантах реалізації винаходу ссавець є людиною.
ІО136| У деяких варіантах реалізації винаходу, будь-які фармацевтичні композиції, що містять рекомбінантний поксвірус, додатково містять нуклеотидну послідовність, яка кодуює гетерологічний асоційований із захворюванням антиген, запропонований у цьому документі, підвищують природжену імунну активацію у порівнянні з ідентичною фармацевтичною композицією, що містить рекомбінантний поксвірус з відсутньою гетерологічною нуклеїновою кислотою, що експресує надлишкову ранню длРНК у разі введення суб'єкту (незалежно від того, містить рекомбінантний поксвірус додатково нуклеотидні послідовністі, які кодують гетерологічний асоційований із захворюванням антиген, чи ні). У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єкт є хребетним. У деяких варіантах реалізації винаходу хребетне є ссавцем. У деяких варіантах реалізації винаходу ссавець є людиною.
ІО137| У деяких варіантах реалізації винаходу, будь-які із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, вводять суб'єкту будь-яким відповідним шляхом введення, відомим фахівцеві у цій області техніки. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції представлені у вигляді ліофілізату. У деяких варіантах реалізації винаходу ліофілізат розчиняють у водному розчині. У деяких варіантах реалізації винаходу водний розчин є фізіологічним розчином, розчином фосфатного буфера, або Тріс-буфером за фізіологічного рн.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції вводять системно. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції вводять локально. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції, запропоновані у цьому документі, вводять підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інтрадермально, інтраназально, перорально, місцево, парентерально або будь-яким іншим шляхом введення, відомим фахівцеві. Спосіб
Зо введення, дозу та протокол лікування можуть бути оптимізовані фахівцями у цій області техніки.
ІЇО138| У деяких варіантах реалізації винаходу будь-які із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, вводять суб'єкту як одну дозу. У деяких варіантах реалізації винаходу будь-які із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, вводять суб'єкту у декількох дозах. У деяких варіантах реалізації винаходу будь-які із фармацевтичних композицій вводять суб'єкту у2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше дозах. У деяких варіантах реалізації винаходу будь-які із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, вводять як першу прайм-дозу з подальшим введенням однієї або більше додаткових бустерних доз (тобто вводять згідно з протоколом "прайм-буст" вакцинації). У деяких варіантах реалізації винаходу протокол "прайм-буст" вакцинації є гомологічним прайм-буст протоколом. У деяких варіантах реалізації винаходу протокол "прайм-буст" вакцинації є гетерологічним прайм-буст протоколом. У деяких варіантах реалізації винаходу перша або прайм-доза містить дозу будь-якої із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, що містить від 107 до 108 ТСІЮО5О будь-яких рекомбінантних поксвірусів, запропонованих у цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу друга і подальші бустерні дози, включають дози будь-яких із фармацевтичних композицій, запропонованих у цьому документі, що містять від 107 до 108 ТСІЮО5О будь-яких рекомбінантних поксвірусів, запропонованих у цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу другу або бустерну дозу вводять через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або більше днів після першої або прайм-дози. У деяких варіантах реалізації винаходу другу або бустерну дозу вводять через
БО 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше тижнів після першої або прайм-дози. У деяких варіантах реалізації винаходу другу або бустерну дозу вводять через 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше місяців після першої або прайм-дози. У деяких варіантах реалізації винаходу другу або бустерну дозу вводять через 1, 2, 3, 4, 5 або більше років після першої або прайм- дози. У деяких варіантах реалізації винаходу, подальші бустерні дози вводять через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або більше днів після першої бустерної дози. У деяких варіантах реалізації винаходу, подальші бустерні дози вводять через 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше тижнів після першої бустерної дози. У деяких варіантах реалізації винаходу, подальші бустерні дози вводять через 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше місяців після першої бустерної дози. У деяких варіантах реалізації винаходу, подальші бустерні дози вводять через 1, 2, 3, 4, 5 або більше бо років після першої бустерної дози.
ІО139| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищена природжена імунна відповідь включає підвищене вироблення інтерферонів типу І (ІФН типу І), цитокінів і хемокінів.
І0140| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищена природжена імунна відповідь включає підвищене вироблення ІФН типу І. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену транскрипцію кодуючої інтерферон-бета (ІФН-Д) матричної РНК (мРНК). У деяких варіантах реалізації винаходу транскрипція кодуючої ІФН-В
МРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену секрецію білка ІФН-Д. У деяких варіантах реалізації винаходу секреція білка ІФН-В зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. 0141) У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену транскрипцію кодуючої інтерферон-альфа (ІФН-с) мРНК, а транскрипція кодуючої
ІФН-Я4 мРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20раз, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену секрецію білка ІФН-а, а секреція білка ІФН-я зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. 0142) У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену транскрипцію кодуючої интерферон-гамма (ІФН-у) мРНК, а транскрипція кодуючої
ІФН-уУ мРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20раз, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких
Зо варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення ІФН типу | включає підвищену секрецію білка ІФН-у, а секреція білка ІФН-у зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
ІЇО143| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищена природжена імунна відповідь включає підвищене вироблення цитокінів. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення цитокінів включає підвищену транскрипцію кодуючої інтерлейкін-б (І1/-6) мРНК, а транскрипція кодуючої І/-6 мРНК зростає щонайменше в 1,8 разів, щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 раз або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення цитокінів включає підвищену секрецію білка ІЇ/-б, а секреція білка І/-6 зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. (0144) У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення цитокінів включає підвищену транскрипцію кодуючої інтерлейкін-18 (1-18) мРНК, а транскрипція кодуючої 1-18
МРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу, підвищене вироблення цитокінів включає підвищену секрецію білка 1-18, а секреція білка І/-18 зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
І0145)| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищена природжена імунна відповідь включає підвищене вироблення хемокінів. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену транскрипцію кодуючої СХСІ 1 мРНК, а транскрипція кодуючої СХСІ 1 мРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 бо разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в
30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену секрецію білка СХСІ1, а секреція білка СХСІ 1 зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
ІО146)| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену транскрипцію кодуючої ССІ2 мРНК, а транскрипція кодуючої ССІ2 мРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену секрецію білка ССІ2, а секреція білка ССІ 2 зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
ІО147| У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену транскрипцію кодуючої ССІ 5 мРНК, а транскрипція кодуючої ССІ 5 мРНК зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу підвищене вироблення хемокінів включає підвищену секрецію білка ССІ 5, а секреція білка ССІ 5 зростає щонайменше в 2 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 6 разів, щонайменше в 8 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів, щонайменше в 30 разів, щонайменше в 40 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів або більше.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: СМА-мутант з відсутнім В15, який містить додаткову касету нео, є сильно атенуйованим
ЇО148| Ми визначили сильно атенуйований мутант СМА, використовуючи систему рекомбінації на основі генома СМА, клонованого в якості бактеріальної штучної хромосоми
Зо (ВАС), причому касета нео/грз!І. слугувала для позитивної/негативної селекції під час мутагенезу
СУА-ВАС (Меїівзіпдег!-Непзсенпеї еї аї., 2010). Вірус дикого типу СМА містить вставку контрольних послідовностей ВАС і додаткові маркери в міжгенній області між ВРЗ ІЗІ. і І4Ї для забезпечення розмноження циркулярного генома у вигляді ВАС у бактеріях. Ці послідовності включають касети нео-ІВЕ5-ЕСЕР, які експресуються під управлінням поксвірусного промотора ро. Раніше було продемонстровано, що цей отриманий із ВАС СМА має властивості, які не відрізняються від віділеного із бляшок СМА дикого типу (Меїізіпдег, 2010). Тому вважається, що отриманий із
ВАС СУМА не відрізняється від СМА дикого типу і у наведених нижче прикладах називається СМА дт.
І0149| Як не дивно, мутант СМА, що несе селекційну касету нео/гр5Ї замість ВРЗ3 ВІК (СМА-длнео-ДАВІ15, дивіться Фігуру 1), був сильно атенуйованим після інтраназального інфікування мишей ВАЇ В/с, тоді як делеційний мутант СМА-АВІ15 без селекційної касети нео/гроЇ був лише помірно атенуйованим (Фігура 2А). Навіть після інтраназальної інокуляції мишей дозою 5х107 ТСІ0О50, СМА-длнео-АВІ15 не викликав помітної втрати маси (Фігура 2А і 28) і будь-яких інших симптомів хвороби (дані не представлені), тоді як СМА дикого типу переважно є летальним у цій дозі (Фігура 2А і 28). Коли СМА-версію ВІ5К було замінено ММА-версією
ВІ5К, послаблення наступного мутанта СМА-В15ММА було також помірним (Фігура 2В) і порівнянним із послабленням, яке спостерігали для СМА-АВ15 (Фігура 28). Білок В15, який експресується СМА-В15ММА, мігрував трохи швидше у ДСН-ПААГ, ніж його СМА-гомолог, підтверджуючи, що СМА-В15ММА експресував правильну версію В15, отриману від ММА, у якому відсутні б амінокислот (дані не представлені). Ці результати узгоджуються з нещодавно опублікованим спостереженням, що ММА-версія В15, яка містить внутрішню делецію ділянки із шести амінокислот, є нефункціональною (МесСоу еї аї. (2010), 9. сзеп. Мігої. 91:2216-2220). Таким чином, СМА-В15ММА найймовірніше представляє нуль-мутанта В15.
ІО150) В якості контролю для послаблення вірусу вісповакцини, ми видалили ген В19Е, який кодує секретований рецептор ІФН типу | ортопоксвірусів. СМА-АВ19 був трохи більш атенуйованим, ніж СМА-АВ15, але значно менш атенуйованим, ніж СМА-длнео-АВ15 (Фігура 28).
І0151| Інфекційні вірусні титри у легенях мишей аналізували після інтраназального інфікування дозою 1х107 ТСІО50. Миші, інфіковані СМА-длнео-АВ15, демонстрували дуже низькі вірусні титри, що складали менш ніж 1х104 ТСІ0О5О у легенях на шостий день після бо інфікування, тоді як вірусні титри в легенях СМА-інфікованих мишей перевищували 1х107
ТСІО5БО (Фігура 2С, р«0,001 згідно з критерієм Стьюдента). Вірусні титри у легенях мишей, інфікованих СМА-АВ19 ї СМА-В15ММА, були зниженими приблизно на порядок (р«0,001) у порівнянні з титрами СМА (Фігура 2С), що відображає знижену, але все ще суттєву патогенність цих вірусів (Фігура 2В). Таким чином, інфекційні титри вірусу в легенях після інтраназального інфікування дуже добре корелювали із спостережуваною картиною патогенності СМА-мутантів і підтверджували сильне атенуювання СМА-длнео-АВ15.
ІО152| Щоб виключити небажані мутації в СМА-длнео-ДВІ5 як причину його сильного атенуювання, ми визначили нуклеотидні послідовності повних кодуючих ділянок СМА-длнео-
АВІ15 (202615 нуклеотидів) і СМА-АВ15 (201296 нуклеотидів). Обидва віруси містили тільки очікувані мутації, які були навмисно введені в їх кодуючі області. Таким чином, виявилося, що дуже сильне атенуювання СМА-длнео-АВ15 залежить від присутності касети нео/грзї.
Приклад 2: Вірулентність СМА-длнео-ДВ15 у мишей з нестачою рецепторів ІФН-а/р (ІМЕАНОО) 0153) Щоб визначити, чи сприяла система ІФН типу І сильному атенуюванню СМА-длнео-
АВІ15 у мишей, мишей ІМЕАКО/0О з відсутнім функціональним рецептором ІФН а/Вр інфікували зростаючими дозами СМА і СМА-длнео-АВІ15. За високої дози 5х107 ТСІ0О50, СМА-длнео-АВ15 був однаково смертельним мишей для ІМЕАКО/0 (дані не представлені). Підгрупа мишей
ІМЕАКО/О вижила після інфікування проміжною дозою 1х107 СМА-длнео-АВІ15 і усі миші вижили після інфікування дозою 2х106 ТСІО5БО (Фігура ЗА їі В). Миші ІМЕАКО/, інфіковані СМА дикого типу, однаково гинули навіть за найнижчої дозі 2 х 106 ТСІО50О (Фігура ЗА і В). Варто відмітити, що СМА-длнео-ДАВ15 залишався сильно патогенним для мишей ІМЕАКО/О навіть за найнижчої викоистовуваної дозі 2 х 106 ТСІО50О, про що свідчить значна втрата ваги більш ніж на 20 95 (Фігура ЗА). 0154) Таким чином, виявилося, що система ІФН типу І є важливим фактором, залученим до сильного атенуювання СМА-длнео-АВ15. Той факт, що миші ІМЕАКОО, інфіковані дозами 2х106 і 1х107 ТСІ050О СМА-длнео-АВІ15, частково або повністю вижили, тоді як усі миші ІМЕАКОЛ, інфіковані СМА дт, загинули, дозволяє припустити, що незалежні від ІФН типу І фактори сприяли атенуюванню СМА-длнео-АВ15 у меншому степені. Раніше повідомлялося, що В15 є інгібітором активації МЕКВ у МАСУ-інфікованих клітинах (Спеп еї аї. (2008), Рі о5. Раїйпод. 4:е22-). Тому, противірусний ефект посиленої активації МЕКВ внаслідок відсутності В15, можливо, відповідає за помірне атенуювання СМА-длнео-АВІ15 у порівнянні з СМА у мишей ІМЕАКО/. Аналогічно, менш ефективне інгібування МЕКкВ також може пояснити помірноме атенуювання СМА-АВІ15 у мишей дикого типу (Фігура 2), оскільки у ньому відсутній В15. Проте він є значно менш атенуйованим, ніж СМА-длнео-ДВ15, тому що у ньому відсутня таож касета нео/гтрзї, яка відповідає за велику частину атенуювання СМА-длнео-АВ15.
Приклад 3: Індукція ІФН-а і ІФН-ХА в дендритних клітинах (ОС) з боку СМА-длнео-АВ15
ІО155) Оскільки, ОС є ефективними виробниками ІФН типу І і типу ПІІ, а також інших цитокінів, ми оцінили здатність різних конструкцій СМА, запропонованих у цьому документі, індукувати ці
ІФН у ОС, отриманих із кісткового мозку мишей, які було згенеровано з використанням культуральної системи Пт5-подібного ліганда тирозинкінази З (ЯЇ3-Ї або РІ). Мишачий ІФН-а, але не мишачий ІФН-рД, зв'язаний із ортопоксвірусним білком В19. Це зв'язування частково або повністю запобігає виявленню ІФН-а за допомогою ІФН-а-специфічного методу ЕГІ5А (дані не представлені). Для полегшення аналізу індукції ІФН-я з боку СМА-длнео-ДВІ15, було введено додаткову делецію шляхом заміщення гена ВІЗОК геном стійкості до зеоцину (Фігура 1).
Атенуювання результуючого мутанта СМА-длнео-ДВ15/819 з подвійною делецією не відрізнялося від такого для СМА-длнео-ДВ15 у моделі хвороби ВАЇ В/с за винятком того, що вірусні титри в легенях інфікованих мишей були навіть нижчими, ніж на шостий день після інфікування (дані не представлені). Тоді як ІФН-а, як і очікувалося, не виявлявся в супернатантах СМА-інфікованих РІ -ОС, СУА-АВ19 індукував виявлювані кількості ІФН-са (Фігура 4), демонструючи, що СМА дикого типу здатен індукувати помірні рівні ІФН-са, які приховані від виявлення методом ЕГІЗБА В19. Мутант СМА-длнео-АВ15/819 з подвійною делецією індукує значно вищі рівні ІФН-а, ніж СМА-АВІ19 у РІ-ОС, які були порівняними з індукованими ММА (Фігура 4). Це свідчить про те, що мутація нео-АВ15 надає СМА здатність індукувати віщі рівні інтерферону. В15 не сприяє цьому ефекту, оскільки СМА-АВ15 не індукував виявлюваного ІФН-
В, і, таким чином, поводився як СМА дт.
ІО156| Оскільки ортопоксвіруси не експресують зв'язуючий білок для ІФН-Х, ми змогли безпосередньо проаналізувати мутант СМА-длнео-ДВІ5 щодо його здатності індукувати секрецію ІФН-Х ЕГ-ОС. СМА-длнео-АВІ15 індукує значно вищі рівні ІФН-Х в супернатантах РІ -ОС, ніж СМА або СМА-АВІ15 (Фігура 4). Рівні ІФН-Х, індуковані СМА-длнео-ДАВ15 були дуже схожими бо на індуковані ММА. У сукупності, представлені вище результати, вказують на те, що СМА-длнео-
АВ15 є потужним індуктором ІФН-а і ІФН-А порівняним з ММА, у якого відсутній ряд імуномодуляторів (Апіоіпе еї аї. (1998), Мігоїоду 244:365-396; Меїізіпде!-Непзсенеї еї аї. (2007), 9.
Сеп. Мігої. 88:3249-3259), що призводить до посилення активації ОС, у порівнянні з їх СМА- попередниками (Затие!550п еї аї. (2008), 9. Сііп. Іпмеві 118:1776-1784).
Приклад 4: Індукція ІФН-Д у мишачій клітинній лінії з боку СМА і СМА-длнео-АВ15
ІЇО157| Для того, щоб визначити, чи обмежена підвищена здатність СМА-длнео-ДАВ15 індукувати ІФН типу І ОС, клітини фібробластів клону мишей ВАГ В/ЗІЗ АЗІ (АЗ1) інфікували різними конструкціями СМА і визначали рівні мРНК ІФН-В за допомогою кількісної ПЛР. із оберненою транскриптазою (ОТ-КПЛР). Тоді як СМА ії СМА-АВ15 індукували лише дуже низьку експресію гена ІФН-ВД, інфікування СМА-длнео-АВ15 стимулювало підвищені рівні транскриптів
ІФН-ВуУ клітинах АЗІ1 (Фігура 5А). Індукція МРНК ІФН-ВД з боку СМА-длнео-АВ15 через 4 години після інфікування була аналогічна отриманій для ММА для цього моменту часу (Фігура 5А). Рівні транскриптів ІФН-Д у ММА-інфікованих клітинах АЗ1 зазвичай знижувалися через 4 години після інфікування, тоді як кількість МРНК ІФН-ВД, індукованої СМА-длнео-ДАВ15 зростала ще більше і явно перевищувала індуковану ММА через 6 годин після інфікування й далі (Фігура 5А). Ці дані у поєднанні з майже повною зміною атенуювання СМА-длнео-ДВ15 у мишей ІМЕАКО/0 переконливо свідчать, що вірулентність цього вірусного мутанта у мишей дикого типу, ймовірно, викликана сильно підвищеною індукцією ІФН типу Ї. 0158) Коли ВРЗ нео у локусі ВІЗ СМА-длнео-АВ15 було або видалено (СМА-ДАВ15) або заміненио касетою (зео) стійкості до зеоцину (СМА-зео-АВІ15), здатність отриманих мутантних вірусів стимулювати ІФН-В булла рактично повністю відсутньою (Фігура 58). Оскільки ВРЗ неоміцину було вставлено замість ВРЗ3 В15К, залишивши активний ранній промотор ВІ5К (рВ15) інтактним, ми видалили рВ15 із СМА-длнео-АВІ15. Отриманий в результаті мутант СМА-
АрВв15-нео -АВ15 індукував лише рівні транскриптів ІФН-В СМА дт (Фігура 58). Таким чином, транскрипція ВРЗ нео у мутанті СМА-длнео-ДВІ5 виявилася важливою для здатності стимулювати ІФН-ВД. Транскрипцію касети нео у СМА-длнео-АВ15-інфікованих клітинах АЗ1 було підтверджено за допомогою аналізу ОТ-КПЛР, націленого на гр5і -частину вставки нео/грз!. (дані не представлені). ВРЗ нео і гр5! було вставлено в орієнтації оберненою комплементарністю у відношенні до промотора В15 і прогнозується, що лише дуже коротка ВРЗ буде транслюватися
Зо з касети нео, якщо ця антисмислова РНК взагалі буде використовуватись трансляційним апаратом.
І0159| Так як мутант СМА-длнео-ДВ15 експресував другий нео-транскрипт у смисловій орієнтації під управлінням раннього/пізнього промотора з касети ЕСЕР/нео в остові ВАС, послідовності нео в двох частково комплементарних транскриптах можуть утворювати частково дволанцюгову РНК (длРНК). Ця длРНК найбільш ймовірно слугувала в якості додаткового
РАМР в інфікованих клітинах, що призводить до підвищення індукції ІФН типу | ї типу ПІ.
Приклад 5: ММА вектори, що експресують комплементарні РНК пар сторонніх вставок, індукують ІФН-Д у мишачих клітинах
І0160)| Щоб продемонструвати застосовність принципу длРНК до ММА, було сконструйовано дві пари рекомбінантних векторів ММА, які експресували два комплементарні транскрипти гена нео або ЕСЕР. Цього досягли шляхом вставки двох копій ВРЗ нео або ЕСЕР в ділянках, віддалених одна від одної в геномі ММА, кожна з яких знаходилася під управлінням поксвірусного раннього/пізнього промотора. Отримані із ВАС ММА дикого типу вже містили одну копію касети нео/ЕСЕР у вставці в остові ВАС (Фігура 6А). Раніше було продемонстровано, що касета ВАС, включаючи касету нео/ЕСЕР, не змінює властивості ММА і тому є еквівалентною до
ММА дикого типу (Меїізіпдег-Неп5сНеї! еї аї. (2010), 9. Мігої. 84:9907-9919). ММА-длнео-АВ15 містить другу ВРЗ нео у локусі В15К в оберненій орієнтації відносно ендогенного промотора
ВІТ5К як частину касети нео/грз!. (Фігура б6А). ММА-длнео-АВ15, таким чином, точно відтворює констеляцію вставок нео у мутанті СМА-длнео-АВ15, описаному вище. Для конструювання ММА-
ДлЛЕСЕР, спочатку видаляли касетуа нео/ЕСЕР із ВАС-вставки ММА дикого типу. Для отримання рекомбінантного ММА-длЕСЕР, ВРЗ ЕСЕР потім двічі вставляли в геном ММА у віддалені ділянки, що знаходяться під управляннім ранніх/пізніх промоторів, які управляють транскрипцією смислової або антисмислової РНК ЕСЕР, забезпечуючи утворення длРНК із 720 п.о. (Фігура 6В). Конструкція ММА, яка експресує лише смисловий ЕСЕР-транскрипт з однієї
ЕСЕР-вставки (ММА-ЕСЕР) слугувала в якості контролю для усіх конструкцій ММА-длЕСЕР (Фігура 68). 0161) Мишачі клітини АЗ1, інфіковані ММА, що генерують комплементарні транскрипти двох вставлених антигенів нео (ММА-длнео-АВ15), демонстрували підвищену транскрипцію гена ІФН-
В (Фігура 7А) у порівнянні з отриманим із ВАС ММА дт з однією касетою нео. Коли усю касету бо ВАС, що містить смислову ВРЗ нео, було видалено із ММА-длнео-АВ15 шляхом рекомбінації на основі ЕКТ, отриманий в результаті ММА-нео-ДВ15/АВАС індукував лише рівні дикого типу
МРНК ІФН-В (Фігура 7А). Вірус ММА з делецією гена В15К (ММА -АВ15), який містить тільки смислову касету нео в остові ВАС, також індукував рівні дикого типу мРНК ІФН-ВД (Фігура 7А). Це свідчить про те, що підвищення здатності ММА-длнео-АВІ15 індукувати ІФН-ВД залежало від наявності як смислових, так і антисмислових касет експресії нео і не було викликаним виключно делецією В15К. ММА-длнео-АВ15, а також СМА-длнео-АВ15 індукували високу кількість ІФН-В
МРНК через 5 годин після інфікування (Фігура 7А). Експресія МРНК ІФН-ВД, індукована ММА- длнео-АВ15, зменшилася між 5 і 7 годинами після інфікування, тоді як індуковані СМА-длнео-
АВІ1І5 рівні мРНК ІФН-Д залишалися високими через 7 годин після після інфікування (Фігура 7А).
Отже, рівень ММА-длнео-АВ15-індукованого ІФН-ВД визначали через 5 годин після інфікування в усіх подальших експериментах. Культури супернатантів інфікованих ММА-длнео-АВІ15 клітин
АЗ1 містятили підвищену кількість ІФН-Д через 18 годин після інфікування у порівнянні з ММА дт або конструкцій ММА з одинарною нео касетою (Фігура 7В), підтверджуючи результати аналізу
МРНК ІФН-В.
І0162| Наиведені вище результати були відтворені з набором рекомбінантів ММА, які управляють генерацією комплементарних ранніх транскриптів з двох окремих вставок ЕСЕР.
Одна ВРЗ ЕСЕР під управлінням активного раннього промотора управляла експресією смислової ЕСЕР-МРНК і була вставлена у ІСК136/137. Відповідна одинарна вставка ММА- рекомбінанту ММА-ЕСЕР експресувала ЕСЕР й індукувала рівні мРНК ІФН-ВД у мишачих клітинах
АЗ1 (Фігура 7С). ММА, що містить додаткову касету ЕСЕР, вставлену у ІСК86/87, яка управляє ранньою/пізньою експресією антисмислового транскрипту ЕСЕР під управлінням промотора ро (Спакгавагії 1997), індукував сильне підвищення кількості МРНК ІФН-РД (Фігура 7С). Таким чином, рання длРНК, отримана із гетерологічних ДНК-вставок в геном ММА, стимулювала секрецію
ІФН-ВД незалезно від послідовності вставки.
І0163| Останнє спостереження було підтверджене аналізом індукції ІФН-В на білковому рівені. Аналогічно до ММА-длнео-ДВ15, ММА-длЕСЕР стимулював секрецію значно вищих кількостей ІФН-ВД у культурі супернатантів, ніж відповідний ММА-ЕСЕР (Фігура 70). Кількість ІФН-
В у супернатантах клітин АЗІ, інфікованих різними ММА-рекомбінантами, сильно змінюється від експерименту до експерименту, ймовірно через зміну кількості пасажів, щільність клітин і стану
Зо клітин.
Приклад 6: Рання вірусна транскрипція є достатньою для індукції підвищених рівнів ІФН-ВД з боку мутантів ММА длРНК
І0164| Було припущено, що длРНК-опосередкована індукція ІФН-ВД в основному залежатиме від длРНК, яка генерується на ранній стадії інфекції. Обробка інфікованих ММА-длЕСЕР-2 клітин фібробластів ембріонів мишей (МЕР) із АгасС, який блокує реплікацію вірусного генома і, отже, пост-реплікативну (середню і пізню) експресію генів, не зменшило підвищену генну експресію ІФН-ВД (Фігура 8А), демонструючи, що рання транскрипція длРНК є достатньою для посилення індукції ІФН-В. Причина помірного збільшення ІФН-В у інфікованих ММА дт МЕР, оброблених Агас (Фігура 8А), залишається нез'ясованою. ММА-мутант з відсутнім геном ЕЗІ, який кодує білок зв'язування длРНК, маскуючий длРНК від розпізнавання, підвищує індукцію
ІФН-В у МЕРЕ до деякого ступеня, як і очікувалося посля раніше опублікованих спостережень у
СЕРЕ (Ногттетапп еї аї. (2003), 9У. Мігої. 77:8394-8407). Обробка ММА-ДЕЗІГ-інфікованих клітин
АгасС явно знизила індукцію ІФН-В (Фігура 8А). Це було очікувано, оскільки значні кількості вірусних ДдлРНК, природно, генерується тільки на пост-реплікативній стадії життєвого циклу поксвірусу від «2 годин після інфікування і пізніше. Згідно з цим фактом, оброблені Агас ММА-
ЕЗІ не індукували більшої кількості МРНК ІФН-ВД, ніж ММА дт, коли пізня експресія гена була блокована обробкою Агас (Фігура 8А).
І0165| Мутант ММА, що експресував антисмисловий транскрипт ЕСЕР під управлінням пізнього промотора разі. (ММА-длЕСЕР-пізній) індукував рівні мРНК ІФН-ВД, аналогічні до ММА дт (Фігура 88). Це забезпечило ще один доказ, що утворення длРНК на ранній стадії інфекції до початку реплікації ДНК є необхідною умовою для фенотипа ММА-длЕеЕСЕР з індукцією ІФН і, дуже ймовірно, також для ММА-длнео-ДВ15. Таким чином, рання експресія длРНК ММА є необхідною і достатньою, щоб індукувати ІФН-В у інфікованих клітинах. Дуже ймовірно, що такий самий принцип лежить в основі підвищеної природженої стимулюючої здатності СМА- длнео-АВ15.
Приклад 7: ММА-длнео-АВ15 і ММА-длЕСЕР активує протеїн-кіназу К (РКК). (0166) РКК конститутивно синтезується у клітинах на помірних рівнях як неактивна кіназа, яка активується шляхом зв'язування з длРНК. Експресія РКК підвищується ІФН типу І. Одним із основних субстратів активованої РКК є субодиниця еїІЕ2а фактора ініціації трансляції, яка бо фосфорилюється РКК. Фосфорилювання еїЇБ2а (Р-еІг2а) після інфікування призводить до
Зо припинення трансляції в інфікованих клітинах в якості противірусного контрзаходу і може також бути зв'язаним з РКЕ-опосередкованою індукцією апоптозу. Проводили аналіз фосфорилювання еїЕ2а як індикатора активації РКК з боку длРНК у мишачих клітинах АЗ1.
Мутант ММА (ММА-ЛЕЗІ) з відсутнім геном інгібітора ЕЗ РКЕ вірусу вісповакцини, який також зв'язує і секвеструє ДЛРНК, слугував позитивним контролем. ММА-длнео-АВ15 і ММА-длЕСЕР активували РКК вже через 1 годину після інфікування клітин АЗІ1, тоді як ММА дт помітно не активував РКК упродовж інфікування (Фігура 9). Кількість Р-еІг2а додатково збільшувалася до 4 годин після інфікування у клітинах, інфікованих обома мутантами на основі нео і ЕСЕР, які виробляють ранню длРНК (Фігура 9). Через 6 годин після інфікування кількість Р-еіг2а у у інфікованих ММА-длнео-ДВ15 і ММА-длЕСЕР клітинах почала знижуватися і майже не виявлялася через 8 годин після інфікування у випадку ММА-длнео-ДВІ15, в той час як у інфікованих ММА-длЕСЕР клітинах Р-еІЕ2а все ще слабо виявлявля на цей момент часу (Фігура 9). Крім того, сигнал Р-еіБб24 був стабільно сильнішим протягом перших б годин після інфікування у інфікованих ММА-длЕеЕСЕР клітинах у порівнянні з інфікованими ММА-длнео-АВ15 клітинами (Фігура 9), що дозволяє припустити наявність дещо сильнішої РКК-активуючої активності ММА-ДдлЕСЕР у порівнянні з ММА-длнео-АВ15.
І0167| На відміну від мутантів, що виробляють ранню длРНК, сигнал Р-еІЕ2а, індукований
МУА-ДЕЗІ, не виявлявся до 2 г після інфікування й дуже різко посилювався між 2 г і З г після інфікування, залишаючись високим упродовж подальшого періоду спостереження до 8 г після інфікування (Фігура 9). ММА-ДЕЗІ. індукував найсильніший сигнал Р-еІЕ2а серед усіх мутантів вчерез 4 г після інфікування і пізніше (Фігура 9). Ця кінетика узгоджується з ДЛРНК, сформованій на пізній стадії інфекції під час інфікування ММА шляхом гібридизації частково комплементарних транскриптів з проміжних і пізніх вірусних генів. Через нестачу ЕЗ активація РКК, яка індукується цією пізньою длРНК, не була заблокована. Навпаки, кінетика активації РКК ММА- рекомбінантами, генеруючими нео- або ЕСЕР-длРНК, узгоджується з дуже ранньою присутністю стимулюючої кількості ДЛРНК в інфікованих клітинах. Оскільки ці рекомбінанти експресують білок ЕЗ, активація РКК виявляється пригнічуваною на пізнішій стадії інфекції, коли в інфікованих клітинах накопичується достатня кількість білка ЕЗ.
Приклад 8: РКК є необхідною для підвищеної індукції мРНК ІФН-ВД і накопичення ІФН-Б у
Зо клітинних супернатантах.
І0168| У випадку МЕРЕ дт ММА-ЕСЕР, як і очікувалося, індуковав дуже схожі кількості транскрипту ІФН-В з ММА дт, тоді як ММА-длЕСЕР індукував посилений синтез мРНК ІФН-В (Фігура 10А). Навпаки, ММА-длЕСЕР не індукував посилену генну експресію ІФН-В ву РКЕ- дефіцитних МЕРЕ (Фігура 10А). Секреція білка ІФН-В інфікованими ММА-длЕСЕР МЕР також сильно залежить від функціональної РКК (Фігура 108). Вірус Зепадаї (Зем), РНК-вірус з негативним ланцюгом, який, як відомо, індукує ІФН-В через РКК-незалежний шлях, слугував в якості позитивного контролю для перевірки здатності РКК-дефіцитних МЕРЕ секретувати ІФН-ВД.
Цікаво, що МЕРЕ дт секретував тільки мінімальну кількість ІФН-РД у відповідь на інфікування зем, якщо секретував взагалі, при цьому зем ефективно індукував мРНК ІФН-В і білок у РККО/Ю МЕРЕ, підтверджуючи, що РККО/О МЕРЕ були повністю здатні генерувати та секретувати ІФН-РД (Фігура 10А ї В). В цілому РКК виявилася важливими клітинними сенсором, що відіграє роль у підвищеній індукції ІФН-В з боку ММА-длЕСЕР. Індукція гена ІФН-В з боку ММА і ММА-ЕСЕР (відповідає ММА дт) у МЕБЕ дт також частково залежала від РКК (Фігура 10А), щи свідчить про загальну роль цього сенсора длРНК для природженої імунної активації з боку ММА, принаймні у
МЕР. Разом підвищена індукція ІФН-В з боку ММА-длЕСЕР повністю залежала від сенсора
ДлЛРНК РКК, що забезпечує додаткові свідчення, що длРНК, утворювана ММА-длЕСЕР, відповідає за спостережуване посилення природженої імунної активації.
Приклад 9: Вимоги до довжини для стимуляції ранньої длРНК
І0О169| Було розроблено вихідну конструкцію ММА-длЕСЕР для імітації конструкції ММА- длнео-АВ15, включаючи некомплементарний "липкий" кінець ДНК, отриманий із бактеріального гена В-галактозидази (В-гал), у 3' кінці антисмислового транскрипту ЕСЕР. Щоб визначити додаткові вимоги до довжини длРНК для підвищення індукції ІФН-В, конструювали групу споріднених мутантів з сильно вкороченими ділянками перекриття ВРЗ ЕСЕР від 720 до 50 п.о. (Фігура 68). У мутантів ММА-длЕСЕР-2 й усіх інших длЕСЕР-мутантів були відсутні додаткові З "липкі" кінці в антисмисловому транскрипті (Фігура 68). У випадку МЕЕ дт ММА, що експресує комплементарні транскрипти ЕСЕР зі зменшеною довжиною ділянок перекриття ЕСБЕР, індукував зменшену кількість мРНК і білка ІФН-ВД (Фігура 114А і В). У випадку МЕРЕ дт отриманий їх
В-гал З "липкий" кінець не був необхідним для підвищення ІФН-В (Фігура 11А). Перекриття транскрипту ЕСЕР у 100 основ (ММА-длЕСЕР-5) стимулювало явно меншу кількість ІФН-В, ніж 60 ММА-длЕСЕР, але посилювавало ІФН-В-відповідь у порівнянні з контрольним ММА-ЕСЕР
(Фігура 114А і В). Знову таки, у випадку РККО/О МЕБК різні рекомбінанти ММА майже не індукували
МРНК ІФН-В і ІФН-Д (Фігура 11А і В). Рекомбінант ММА зі вставленою ділянкою перекриття у 50 п.о. ЕСЕР не проявляв надлишкової здатності стимулювати ІФН-ВД.
ІО170| Таким чином, для підвищеної індукції ІФН-В в МЕР було необхідним мінімальне перекриття двох комплементарних рекомбінантних транскриптів від 50 до 100 п.о. (Фігура 11С).
Приклад 10: Реплікаційні властивості ММА-длЕеЕСЕР і стабільність індукуючого фенотипа 0171) Розмноження ММА-длЕСЕР у вторинних фібробластах курячих ембріонів (СЕР) для отримання великого об'єму очищених препаратів ММА-длЕСЕР демонструвало нормальний вірусний вихід у межах ММА дт (дані не представлені). Багатоступінчастий аналіз росту показав, що ММА-длЕСЕР зберігав реплікаційно-обмежений фенотип у людських і мишачих клітинах (Фігура 128), але реплікувався дещо менш ефективно у СЕБЕ, ніж ММА дт (Фігура 12А). Цю трохи послаблену реплікацію також спостерігали, коли середній вихід вихідного вірусного розчину
ММУА-длЕСЕР, отриманого з клітин СЕР, порівнювали з ММА-ЕСЕР. Співвідношення виходу
ММА-длЕСЕР/ММА-ЕСЕР складало близько 0,5 (Таблиця 1) і додатково знижувалося, коли вихід
ММА-ЕСЕР порівнювали з ММА-5 і ММА-6, до близько 0,1 (Таблиця 1). Оскільки ММА-длЕСЕР-5 і -6 індукує тільки трохи більшу кількість ІФН, якщо індукує взагалі, дія на реплікацію вірусу, ймовірно, не була опосередкованою розчинним ІФН типу Ї. Коли курячі клітини ОБ-1 використовували для отримання вірусних розчинів, тенденції до зниження вірусного виходу у разі експресії коюоротших ЕСЕР-длРНК не спостерігали (Таблиця 1). Таким чином, клітини ОБ-1 є ще більше придатним типом клітин для розмноження ММА-мутантів, які у надлишку виробляють ранню длРНК, ніж клітини СЕР.
ІО172| Для того, щоб оцінити, чи зберігається підвищена здатність ММА-длЕСЕР стимулювати ІФН-В після багатократного пасивування, ми провели 10 пасажів ММА-ЕСЕР і
МУА-длЕеЕСЕР в інтерферон-компетентній курячій клітинній лінії ОБ-1, використовуючи низьку множинність інфікування (МОЇ), яка складала приблизно 0,01. ММА-длЕСЕР, який пасивували 10 разів на клітинах ОЕ-1, індукував посилену ІФН-ВДВ-відповідь, порівняну з вихідним вірусом
ММА, -длЕСЕР, який пасивували лише один раз у клітинах ОЕ-1 (Фігура 12С). Основна індукція
ІФН-В ММА-ЕСЕР також залишалася без змін після 10 пасажів ОЕ-1 (Фігура 12С). Таким чином, підвищена інтерферон-стимулююча здатність ММА-длЕеЕСЕР зберігалася після декількох пасажів
Зо у клітинах ОБ-1. Ані ММА, ані ММА-длЕСЕР або ММА-длнео-АВІ15 не індукували генну експресію
ІФН-В у клітинах ОЕ-1 або клітинах СЕБЕ (дані не представлені). Це підтверджує припущення, що ніякий сильний протиселективний тиск не діяв у клітинах ЮОЕ-1 для обмеження підвищеної індукції ІФН типу І упродовж реплікації ММА-длЕСЕР, появнюючи спостережувану стабільність
ІФН-В-індукуючого фенотипа. У сукупності з непослабленим виходом мутантів ММА-длЕСЕР, клітини ЮЕ-1 є ще більше придатним типом клітин для розмноження ММА-мутантів, які у надлишку виробляють ранню длРНК, ніж клітини СЕР.
Приклад 11: Підвищена індукція цитокінів іп мімо (0173) Аналізували рівні системних цитокінів у відповідь на інфікування мишей С57ВІ/6
ММУА-длЕСЕР через 6 годин після інфікування. Рівні ІФН-а у крові після інфікування. ММА-
ДлЛЕСЕР були значно вищими, ніж у контрольних тварин (Фігура 13А), аналогічно до іп міго спостережень (Фігура 9 і 10). Рівні ІФН-у, запальних цитокінів ІЇ-18 і І/-6б, а також хемокінів
СХСІ1, ССІ2 ії ССІ5 були також значно підвищеними у ММА-длЕСЕР-інфікованих мишей.
Відповідь щонайменше частково залежала від наявності сигнальної адаптерної молекули ІРБЗ-1 (Фігура 13), яка потрібна для ІФН типу І ї індукції цитокінів через рецептори розпізнавання
ДЛРНК КІС-Ї ії МОА-5. Навпаки, усе спостережуване підвищення індукції цитокінів і хемокінів, включаючи ІФН-а, ІФН-у, ІІ -6, І -18, СХСІ1, ССІ12 і ССІ 5, залежало від РКК. Тоді як на основну індукцію ІФН-а, СХСІ 1 ї ССІ2 з боку ММА-ЕСЕР не сильно вплинув дефіцит РКК, основні рівні
ІФН-Уу, 1С-6, 11-18 ії ССІ 5 виявилися зменшеними у РКК-дефіцитних мишей (Фігура 13). Ці результати показують, що вироблення ранньої длРНК ММА, підсилює відповідь ІФН типу Її, а також індукцію запальних цитокінів не лише в культивованих клітинах, але також іп мімо, як видно по активації аналогічних молекул розпізнавання патернів, схожій з культивованими клітинами. Синалізація РКК, а також рецепторів розпізнавання, через ІР5-1, була залучена в опосередкування підвищеної експресії ІФН типу І з боку ММА-длЕеСЕР іп мімо.
Приклад 13: Посилення відповідей Т-клітин СО8 з боку ММА-длЕСЕР у мишей (0174| Мишей С57ВІ/6 імунізували різними шляхами ММА-длЕеЕСЕР і визначали відповіді Т- клітин СО8 проти имунодомінантних епітопів у фоні кожного штаму, використовуючи забарвлення декстрамером. Кількість Т-клітин СО8 у селезінці мишей С57ВІ/6, спрямованих проти имунодомінантного епітопа В8К вірусу вісповакцини, була значно підвищеною через сім днів після внутрішньовенної імунізації ММА-длЕСЕР у порівнянні з ММА-ЕСЕР (Фігура 14) бо (р-0,048 згідно з непарним двостороннім І-критерієм Стьюдента).
Приклад 14: Підвищення індукції гена ІФН-ВД з боку ММА-длЕеЕСЕР в клітинах людини
ІО175| Щоб продемонструвати, що стимулюючий ефект ранньої длРНК, генерованої рекомбінантним ММА, не обмежується мишачими клітинами, культури лінії диплоїдних клітин фібробластів легенів людини МКСО-5 інфікували рекомбінантними ММА, що генерують ранню
ДлЛРНК. Тоді як основна індукція гена ІФН-В з боку ММА-ЕСЕР іноді не виявлялася у людських клітинах МКС-5 (Фігура 15 і дані не представлені), ММА-длнео-АВІ15 і ММА-длЕСЕР ефективно індукували експресію мРНК ІФН-ВД у людських клітинах МКС-5 (Фігура 15). Ефективність індукції гена ІФН-В зменшується із укороченням ділянок перекриття ВРЗ ЕСЕР (Фігура 15), що аналогічно результатам, отриманим для мишачих клітин. Укорочення ділянок перекриття ВРЗ
ЕСЕР до 300 і 100 нуклеотидів сильно знижує ІФН-В-стимулюючу активність відповідних рекомбінантів ММА-длЕСЕР-4 і ММА-длЕСЕР-5 (Фігура 15). Таким чином, підвищення індукції
ІФН-В з боку длРНК, генерованої на ранній стадії інфікування ММА, не обмежується мишачими клітинами, але й чітко проявлялося у людських клітинах і, отже, дуже ймовірно, може виникати також у первинних людських клітинах і тканинах, а також у суб'єкті-людині, вакцинованому рекомбінантними поксвірусами, що експресують комплементарні транскрипти РНК.
Приклад 15: Підвищення індукції ІФН-В з боку ММА-й5ЕЗІ, що генерує ранню длРНК із природного гена ММА 0176) Ми вставили ранній/пізній промотор Нот (Уууаїй еї а. (1996), Массіпе 14:1451-1458), що має активний ранній компонент, розташований нижче нативної ВРЗ раннього ЕЗІ ММА для управління ранньою експресією антисмислової ЕЗІ РНК (Фігура 16А). ВРЗ ЕЗІ містить гомополімерну ділянку Т7 на антисмисловому ланцюзі, що містить консенсусну послідовність
Т5МТ ортопоксвірусного раннього сигналу термінації транскрипції (ЕТТ5). Цей антисмисловий
ЕТТ5 у ВРЗ ЕЗІ ймовірно може обмежувати довжину ранніх антисмислових транскриптів до приблизно 250-300 нуклеотидів замість повних «650 нуклеотидів повного транскрипту ЕЗГ.. Тому ми мутували цей ЕТТЗ (Фігура 16А) за допомогою заміни одного залишку Т на А, не змінюючи кодовану амінокислотну послідовність ЕЗ. Відповідна антисмислова послідовність ЕТТ5 для термінації повнорозмірного раннього атисмислового транскрипту ЕЗ природно є присутньою у міжгенній області ЕЗІ /Е4Ї. (Фігура 16А).
І0177| Отриманий мутант ММА-длЕЗІ. індукував високі рівні мРНК ІФН-ВД у МЕРЕ (Фігура 168),
Зо які були порівнянні з кращим доступним індуктором на основі длРНК, трансфікованим полі(І:С), в якості позитивного контролю (дані не представлені). Виявилось, що ММА-длЕЗІГ індукував значно вищі рівні мРНК ІФН-ВДВ, ніж ММА-длЕСЕР (Фігура 168). ММА-длЕСЕР-5 і ММА-длЕСЕР- пізній слугували в якості негативного контролю для індукції мРНК ІФН-Д разом з контрольним вірусом ММА-ЕСЕР (Фігура 168). Таким чином, генерацію ранніх длРНК із векторів ММА можна отримати шляхом генерації ранніх експресованих антисмислових транскриптів із нативних ранніх генів ММА замість вставки двох частково або повністю ідентичних гетерологічних послідовностей.
Приклад 16: Утворення ЕСЕР длРНК (01781 Щоб продемонструвати утворення длРНК із смислових й антисмислових транскриптів гена ЕСЕР у інфікованих ММА-длЕСЕР-720(0) клітинах, ми виділили і об'єднали всю РНК із двох б-лункових планшетів із обробленими вірусом АгасС (40 мкг/мл) клітинами
ВАЇ В/313-АЗ1, використовуючи метод ТтгігофФ. Оброблені ДНКазою зразки спільної РНК розщеплювали специфічною до одноланцюгових конструкцій РНКазою А і Т1 (АтрБбіоп) або
РНКазою А/Т1 плюс длРНК-специфічною РНКазою М1 (Атбріоп) у загальному об'ємі 20 мл упродовж 1 г за 37 "С. Розщеплені зразки ДНК і необробленого контрольного зразка (нерозщеплені) очищували, використовуючи набір ЕМА Сіеап 5 Сопсепігайг (2уто Кезеагсй,
Фрайбург, Німеччина), і денатурували за 95 "С упродовж З хвилин. Обернену транскрипцію та кількісну ПЛР проводили, як описано вище, використовуючи комерційно доступний аналіз ЕСЕР
Тадмапе (Мг04329676 тг, Ме Тесппоіодіе5). Розраховували середню кратність підвищення індукції РНК ЕСЕР у порівнянні з контролем з двох паралельних реакцій ПЛР для нерозщеплених зразків РНК, і приводили до 10095. Відсоток залишкової РНК ЕСЕР розраховували, використовуючи значення кратності підвищення індукції РНК ЕСЕР після розщеплювання А/11 і А/Т1Л/1, отримані для інфікованих ММА-ЕСЕР ії ММА-длЕСЕР-720(0) клітин.
Приклад 17: Клітини та віруси
І0179| Фібробласти ембріонів мишей (МЕР) ІМЕАКО/ЮО і ІР5-10/0, а також РККО/ МЕБЕ і відповідні РКК-достатні контрольні МЕРЕ отримували від 15-денних С57ВІ /6-ІМЕАКО/О ії 14- денних С57ВІ /6-ІР5-10/0 ембріонів за допомогою стандартних процедур. Усі клітинні лінії культивували у середовищі гла, модифікованого за способом Дульбекко (ОМЕМ, 60 сірсо/пмігодеп, Дармштадт, Німеччина) з додаванням 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕС5,
Рап Віоїесі, Айденбах, Німеччина). Первинні клітини фібробластів курячих ембріонів (СЕР) отримували із 11-денних курячих ембріонів і культивували у МР-5БЕМ (сірсо) для отримання вихідного розчину вірусів або ОМЕМ з додаванням 10 95 ЕС5 для аналізу реплікації. ЗМ-С5Е (гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор макрофагів)-залежні дендритні клітини (зМ-ОС) отримували із свіжоприготованого мишачого кісткового мозку шляхом культивування з рекомбінантним мишачим ЗМ-С5Е (Тери-біо, Оффенбах, Німеччина).
ІО180)| ММА дикого типу (ММА) і мутанти ММА розмножували на вторинних клітинах СЕРЕ або
ОЕ-1 ї титрували на клітинах СЕЕ, використовуючи метод ТСІЮО5БО, як описано (45) Меїі5зіпдег-
Непівспеєї єї аЇ., 2007. ) Сеп МігоІ.84:3249-3259. СМА дикого типу (СМА) і мутанти СМА розмножували на клітинах Мего і титрували, використовуючи метод ТСІЮО5О, на клітинах СМ-1.
Вірус фіброми Шопе отримували від АТСС (МА-364) і розмножували і титрували на клітинах
ЗІКС рогівки кролика. Штам Кантелл вірусу зепдаї отримували від Спагіє5 Кімег І арогайгіез за 2000 НА одиниць/мл. Усі віруси, використовувані в експериментах на тваринах, були очищені двічі через 36 95 сахарозну подушку.
Приклад 18: Рекомбінантна інженерія ВАС і реактивація інфекційного вірусу (0181) Конструювання СМА і ММА-ВАС було описано раніше (І єе апа Евіврап, 1994. Мігоїоду 199:491-496). Для генерування рекомбінантів ММА, що експресують смислову і антисмислову
МРНК ЕСРЕР, і усіх відповідних контролів, касету нео-ІВЕ5-ЕСЕР в остові ВАС цих конструкцій замінювали бактеріальною касетою стійкості до тетрацикліну. Рекомбінант ММА-ЕСЕР містив бактеріальну касету стійкості до канаміцину (МРТ І) нижче ВРЗ ЕСЕР, яка знаходиться під контролем активного раннього/пізнього промотора рНуб. ММА-ДЕЗІ. отримували шляхом заміни нуклеотидів 42697-43269 (ВРЗ ММУАО5БОЇ) касетою МРТ І стійкості до канаміцину за допомогою гомологічної рекомбінації в Е. соїї.
І0182)| Для реактивации інфекційного вірусу клітини 106 ВНК-21 трансфікували З мкг ДНК
ВАС, використовуючи ЕРидепе? НО (Рготеда, Маннхей, Німеччина), а через 60 хвилин інфікували вірусом фіброми Шопе, щоб забезпечити необхідні допоміжні Функції.
Реактивований вірус виділяли, а допоміжний вірус видаляли, як описано вище (Меїівіпде(Меїівзіпде!/-Непзсенеї! єї аї. (2007), У. Сеп. Мігої. 88:3249-3259).
Приклад 19: Експерименти з інфікування мишей
Зо ЇО183| Мишей анестезували ін'єкцією кетаміну/ксилазину перед проведенням інтраназального інфікуванняз 2 х 106,1 х 107 ї 5 х 107 ТСІО5О СМА їі мутантами СМА, розлученими в РВ5З до кінцевого об'єму 50 мкл на мишу. Тварин щоденно зважували та оглядали упродовж двох тижнів, а ознаки захворювання оцінювали за умовною шкалою від 0-4.
Для аналізу системних рівнів цитокінів, мишам вводили в.в. (внутрішньовенно) 200 мл відповідних вірусних розчинів і через 6 г брали кров із хвостової вени.
Приклад 20: Системний аналіз рівня цитокінів методом аналізу цитометрії з гранулами
І184) Концентрації цитокінів у сироватці мишей, отриманої через 6 г після в.в. інфікування, визначали за допомогою аналізу цитометрії з гранулами для зазначених мишачих цитокінів (еВіозсіепсе, Франкфурт, Німеччина) згідно з інструкцією виробника. Статистичну значущість відмінностей між групами лікування аналізували за допомогою непараметричного ИО-тесту
Манна-Уіїтні. Загальний рівень значущості (0,05) коригували за допомогою поправки поправкою
Бонфоні шляхом розділення на кількість груп (наприклад, 11 цитокінів і хемокінів, досліджуваних у мишей В61295Е2/)), тобто загальний рівень з урахуванням поправки Бонфоні склав 0,05/11-0,00455 для порівняння між оброблюваними групами Вб1295БГ/2.
І185| Інші варіанти реалізації винаходу стануть очевидними для фахівців у цій області після вивчення опису і практичної реалізації винаходу, описаного у цьому документі. Мається на увазі, що опис та приклади варто розглядати лише як типові, а справжній об'єм і суть винаходу зазначені у наведеній нижче формулі винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
-110» Вамагіап Могаїс А5, ВМ «120» ВЕКТОРНІ КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ ІНДУКЦІЇ ПОСИЛЕНОЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ ІЗ
ЗАСТОСУВАННЯМ ВЕКТОРІВ ПОКСВІРУСУ
-1305 ВМОО86РСТ
«1505 ЕР13005541.1 -151» 2013-11-28 -160» 9 «170» РаїепіНп версія 3.5 «-2105 1 «2115 352 «212» Білок -213» Вірус віспи мавп «220» «221» Ме доступу ОБІХК2; ІФН-альфа/бета-рецептор-подібний секретований глікопротеїн «222» (1)..(352) «4005 1
Меї Меї Гуз Меї Гуз Меї Меї Маї Ага Іе Туг Ре Маї 5ег І еи Зег 201 5 10 15
Ї ей Г еи Г еи РНе Ні 5ег Туг Аа Пе Авр Пе Спи Авп Сім Пе ТНг
Зо 25 Сім Ре РНе Авп Гуз Меї Аго Агр ТНг Геи Рго Айа Гуз Авр Зег Гуз
Тр еи Азп Рго Маї Суз Меї Рне Сіу Спу ТНиг Меї Азп Авр Меї Аїа бо
Зо
Аа І ви Спу Сім Рго РНе 5ег Аа Гуз Сув Рго Рго Пе Сім Авр 5ег 65 70 75 80
Ї ей І єи Бег Ніз Агу Туг Гуз Азр Туг Маї Маї Гуз Тгр Сім Аго І єи 35 85 90 95 сій Гуз Авп Агу Аг Ага ап Маї Зег Авп І уз Агу Маї Гуз Нів Спу 100 105 110 40 Азр Геи Ттр ЇІе Аа Авп Туг Тниг 5ег Гу РНе Зег Авп Аг Ага Туг 115 120 125
Ї еи Сувз Тниг Маї Тиг Тниг Гуз Азп Стпу Ар Суз Маї Сіп Спу Ма! Ма! 130 135 140 45
Аг Зег Нів Ма! Ттр Гуз Рго Зег Зег Сув Пе Рго Гуз Тиг Туг Си 145 150 155 160
Їеи Спу Тнг Туг Авр Гуз Туг Спу Пе Ар Геи Туг Суз Су Пе І еи 50 165 170 175
Туг Айва Гуз Ні Туг Авп Авп ЇІе Тиг Ттр Туг Гуз Авр Авп Гуз СПИ 180 185 190 55 Пе Авп Пе Ар Авр РНе Гуз Туг Зег Сп Аа Спу Гуз Сім Гей Пе 195 200 205
Пе Ні Авп Рго Си Геи Сім Авр Бег Сіу Агоу Туг Авр Суз Туг Маї 210 215 220 60
Ні Туг Азр Авр Маї Ага Іе Гуз Азп Ар Іе Маї Маї 5ег Ага Сув 225 230 235 240
Гуз Пе Геи Тнг Маї Пе Рго 5ег Сп Авр Ні Аг Ре Гуз І єи Пе 245 250 255
Ї еи Авр Рго Гуз Пе Авп Маї Тиг Пе Спіу Сі Рго Аа Азп Пе ТНг 260 265 270
Сувз 5ег Аа Маї Зег ТНиг 5ег І еи РНе Маї Азр Азр Маї І єи Пе Спи 275 280 285
Тр Гуз Авп Рго 5ег Спу Тр Іе Пе Сіу Геи Ар РНеє Сіу Маї Туг 290 295 З00 зег Пе Геи ТНг Зег Агу Спу Спу Пе ТАг Си Аїа Тнг Геи Туг Ре 305 з10 315 з20 сій Авп Маї Тиг Сім Спи Туг Пе Спіу Авп ТНиг Туг Тиг Суз Ага Спу 325 330 335
Ні5 Авзп Туг Туг Ре Азвр Гуз ТНг І еи ТАг ТАг Тнг Маї Ма! Геи Спи 340 345 350 -2105 2 «2115 351 «212» БІЛОК -213» Вірус вісповакцини, штам У/евієт Незегуе
Зо «220» «221» Мо доступу Р25213, Розчинний рецептор В19 інтерферону альфа/бета «реа» (1)..(351) «-4005 2
З5
Меї Тиг Меї Гуз Меї Ме! Маї Ніз Пе Туг Рне Маї 5ег І єи Геи І ви 1 5 10 15
Ї ей І єи Ре Ні 5ег Туг Аа Пе Авр Пе Сіи Авп Спи Пе Тиг Спи 40 20 25 Зо
Рпе Ріє Авп Гуз Меї Ага Авр ТНг І єи Рго Аїа Гуз Авр 5ег Гуз Тр 45 Ї еи Авп Рго Аа Суз Меї Рпе Спу Спу Тнг Меї Азп Авр Іе Аа Аіа бо
Ї еи Сіу Сім Рго РНе 5ег Аа І уз Суз Рго Рго Пе Спи Авр 5егІ еи 65 70 75 80 50
Ї еи Зег Ніз Агу Туг Гуз Ар Туг Маї Ма! Гуз Ттр Си Аго І еи Спи 85 90 95
Гуз Авп Аго Ага Аго ап Маї 5ег Авп І уз Агу Маї Гуз Нів СПу Авр 55 100 105 110
Ї еи Ттр Іе Аїа Авп Туг ТНг Зег Гуз Ріє 5ег Азп Агу Аг Туг Гей 115 120 125 60 Сув Тиг Ма! ТАг Тпг Гуз Авп сапу Ар Суз Маї Сіп Спу Пе Ма! Аг9
Зб
130 135 140 зег Ні Пе Аго Гуз Рго Рго бег Суз Пе Рго Гуз Тиг Туг Сім Гей 145 150 155 160
Сіу Тег Ніз Ар Гуз Туг Спу Пе Авр Геи Туг Сувз СПУ Пе Гей Туг 165 170 175
Аа Гуз Ні Туг Азп Авп Іе ТНг Тгр Туг Гуз Ар Авп Гуз Спи Пе 180 185 190
Азп Пе Азвр Авр Іе Гуз Туг 5ег Сип ТНг Спу Гуз Сім ГГ еи Пе Пе 195 200 205
Нів Авп Рго Си І єи СПш Авр бег Спу Агу Туг Азр Суз Туг Маї Ні 210 215 220
Туг Авр Азр Маї Ага Іе Гуз Авп Ар Іе Маї Ма! Зег Агу Суз ГІ ув 225 230 235 240
Пе Ї єи ТАиг Ма! Пе Рго 5ег Сіп Авр Ніз Агу РНе Гуз І еи Пе І еи 245 250 255
Азр Рго Гуз Пе Азп Маї Ти Пе Спу Спи Рго Аа Авп Пе Тиг Суб 260 265 270
ТАг Аа Маї бег Тнг Зег І ей І еи Пе Азр Авр Ма! І еи Пе Сім Тр 275 280 285
См Авп Рго 5ег Сіпу Тр І еи Пе Спу Рпе Ар РНе Ар Маї Туг 5ег 290 295 З00 маї Геи Тнг Зег Агу Спу Спу Пе Тиг Сім Аа Тнг Геи Туг Рпе Си 305 з10 315 з20
З5
Азп Ма! Тиг Спи Спи Туг Пе Спіу Авп ТНг Туг Гуз Суз Ага Су Нів 325 330 335
Азп Туг Туг Рпе Спи Гуз ТНг Геи Тиг Тнг Тнг Маї Маї І еи Стій 340 345 350 «2105» З «2115 351 «212» БІЛОК -213» Вірус вісповакцини, штам Копенгаген «220» «221» Ме доступу ОБСАЮ5: ІФН-альфа/бета-рецептор-подібний секретований глікопротеїн «222» (1)..(351) «4005 З
Меї Тиг Меї Гуз Меї Ме! Маї Ніз Пе Туг Рне Маї 5ег І єи Геи І ви 1 5 10 15
Ї ей І єи Ре Ні 5ег Туг Аа Пе Авр Пе Сіи Авп Спи Пе Тиг Спи 20 25 Зо бо Рпе Ріє Авп Гуз Меї Ага Авр ТНг І єи Рго Аїа Гуз Авр 5ег Гуз Тр
35 40 45
Ї еи Авп Рго Аа Суз Меї Рпе Спу Спу Тнг Меї Азп Авр Іе Аа Аіа 50 55 бо
Ї еи Сіу Сім Рго РНе 5ег Аа І уз Суз Рго Рго Пе Спи Авр 5егІ еи 65 70 75 80
Ї еи Зег Ніз Агу Туг Гуз Ар Туг Маї Ма! Гуз Ттр Си Аго І еи Спи 85 90 95
Гуз Авп Аго Ага Аго ап Маї 5ег Авп І уз Агу Маї Гуз Нів СПу Авр 100 105 110
Ї еи Ттр Іе Аїа Авп Туг ТНг Зег Гуз Ріє 5ег Азп Агу Аг Туг Гей 115 120 125
Сув Тиг Маї Тиг ТАг Гуз Авп Стпу Ар Суз Маї Сіп Спу Пе Ма! Агу 130 135 140 зЗег Ні Іе Гуз І ув Рго Рго 5ег Суз Іе Рго Гуз ТНг Туг Си І еи 145 150 155 160
Сіу Тег Ніз Ар Гуз Туг Спу Пе Авр Геи Туг Сувз СПУ Пе Гей Туг 165 170 175
Аа Гуз Ні Туг Азп Авп Іе ТНг Тгр Туг Гуз Ар Авп Гуз Спи Пе 180 185 190
Авбп Пе Авр Азр Іе Гуз Туг Зег Сп Тиг Спу Гуз Гуз І еи Пе Пе 195 200 205
Нів Авп Рго Си І єи СПш Авр бег Спу Агу Туг Азп Суз Туг Маї Ні 210 215 220
З5
Туг Авр Азр Маї Ага Іе Гуз Авп Ар Іе Маї Ма! Зег Агу Суз ГІ ув 225 230 235 240
Пе Ї єи ТАиг Ма! Пе Рго 5ег Сіп Авр Ніз Агу РНе Гуз І еи Пе І еи 245 250 255
Азр Рго Гуз Пе Азп Маї Ти Пе Спу Спи Рго Аа Авп Пе Тиг Суб 260 265 270
ТАг Аа Маї бег Тнг Зег І ей І еи Пе Азр Авр Ма! І еи Пе Сім Тр 275 280 285
Сі Авп Рго Зег Сіу Тгр І єи Пе Спіу Рне Авр РНе Азр Маї Туг Зег 290 295 З00 маї Геи Тнг Зег Агу Спу Спу Пе Тиг Сім Аа Тнг Геи Туг Рпе Си 305 з10 315 з20
Азп Ма! Тиг Спи Спи Туг Пе Спіу Авп ТНг Туг Гуз Суз Ага Су Нів 325 330 335
Азп Туг Туг Рпе Спи Гуз ТНг Геи Тиг Тнг Тнг Маї Маї І еи Стій 340 345 350 бо «210» 4
Зв
«2115 353 «212» БІЛОК «213» Вірус вісповакцини, штам Анкара (СУМА) «220» «221» Ме доступу АЗУ)168 Розчинний інтерферон-альфа/бета-рецептор клітинної поверхні «реа» (1)..(353) «400» 4
Меї Гуз Меї Тниг Меї Гуз Меї Меї Маї Ніз Пе Туг Рне Маї Зег Гей 1 5 10 15
Гей Г еи Геи Геи Ре Ні 5ег Туг Аа Пе Авр Іе Спи Авп Си Пе
Зо
ТАиг См Рне РнНе Азп І уз Меї Агу Авр ТНг Гей Рго Аа Гуз Авр 5ег 35 40 45 20 Гуз Тр Гей Авп Рго Аа Суз Меї Рпе Спу СПу Тиг Меї Авп Авр ЇІе 50 55 бо
Аа Аїа І єи Стпу См Рго РНе 5ег Аа Гуз Суз Рго Рго Пе Сіи Авр 65 70 75 80 25 зегі еи Г еи 5ег Ні Агу Туг Гуз Авр Туг Маї Ма! Гуз Ттр Сім Ага 85 90 95
Їеи Спи Гуз Авп Аг Аг Аг Сп Маї бег Авп Гуз Аго Маї Гуз Ніб 100 105 110
Сіу Авр ГІ єм Тр Іе Аїа Авп Туг ТАг Зег Гуз Рпе Зег Авп Агу Ага 115 120 125
Тугі еи Су5 ТНг Ма! ТНк Тит Гуз Авп сту Азр Суз Маї Сп Спу Пе 130 135 140
Маї Ага 5ег Ніз Пе Гуз Гуз Рго Рго Зег Суз Пе Рго Гуз ТАг Туг 145 150 155 160 сій Геи Спу Тнг Ні Авр Гуз Туг Спу Пе Азвр І єи Туг Су Спу Пе 165 170 175
Ї єи Туг Аа Гуз Ні Туг Азп Авп Пе ТНАг Тр Туг Гуз А5р Авп Гуз 180 185 190
Си Пе Авп Пе Ар Ар Іе Гуз Туг Зег Сп Ти Спу Гуз Гуз І еи 195 200 205
Пе Пе Нів Авп Рго Си І ви См Авр 5ег Спу Аг Туг Азп Суз Туг 210 215 220
Ммаї Ні Туг Авр Авр Маї Гуз Іе Гуз Азп Ар Іе Маї Ма! 5ег Аг 225 230 235 240
Сув Гуз Іе І еи Тниг Ма! Пе Рго Зег Сп Авр Ні Агу РНе Гуз Гей 245 250 255
Пе Г еи Авр Рго Гуз Пе Азп Маї Ти Пе Спіу Спи Рго Аа Азп Пе бо 260 265 270
ТАг Сувз ТНиг Аа Маї Зег ТНг 5ег І єи І єи Пе Авр Азр Маї І єи Пе 275 280 285 ам Тер ам Авп Рго 5ег Сіу Тр І єеи Пе Сіу Рпе Авр РНе Азр Маї 290 295 00
Туг Зег Ма! І єи Тиг Зег Агу Спу СпПу Пе ТАг Спи Аа Тнг Гей Туг 305 з10 315 з20
Рпе Спи Авзп Маї Тиг Спи Сім Тут Пе Спу Авп ТНг Туг Гуз Сувз Агд 325 330 335
Сіу Ніз Азп Туг Туг Рпе Спи Гу Тпг ГГ еи ТАг Тнг Тнг Маї Ма! Гей 340 345 350
Сім -2105 5 «2115 358 «212» БІЛОК -213» Вірус ектромелії «220» «221» Ме доступу ОЗ9УЕ55: ІФН-альфа/бета-зв'язуючий білок «реа» (1)..(358) «4005» 5
Зо
Меї Меї Гуз Меї Тниг Меї Гуз Меї Меї Маї Аг Пе Туг Рне Ма! Зег 1 5 10 15
Ї еи Зег І єи Зег І єи 5ег еи І еи Геи РНе Нів Зег Туг Аа Пе А5р 20 25 Зо
Пе Спи Авп Спи Пе ТНг Си Рне Рне Азвп І уз Меї Ага Авр ТНг І еи 35 40 45
Рго Ага Гуз Авр 5ег І уз Тр Гей Азп Рго 5ег Суз Меї Рне Сіу СПу 50 55 60
ТАг Меї Азп Азр Меї Аїа Аа І еи Спу Спи Рго РНе 5ег Аа Гуз Суз 65 70 75 80
Рго Рго Ме Сіи Авр 5ег І ей Ї еи 5ег Ні Агу Туг Азп Авр І уз Азр 85 90 95
Азп Маї Ма! Авп Ттр Сім Гуз Пе Спіу Гуз ТНг Агу Ага Рго Гей Авп 100 105 110
Аго Аг Маї Гуз Авп ау Авр І єи Тгр Іе Аа Авп Туг Тиг Зег Авп 115 120 125
Авр 5ег Ні Аг Ага Туг І єи Суз ТАг Маї Тиг ТАг Гуз Авп Сіу Азр 130 135 140
Суз Маї Сп Спу Пе Маї Агу 5ег Нів Іе Аго Гуз Рго Рго Зег Сув 145 150 155 160 60
Пе Ро Сім ТАг Туг Спи Ї ви С1у ТНг Ніз Авр Гуз Туг Спу Пе Азр 165 170 175
Ї еи Туг Суз Су Пе ГІ єи Туг Ага Гуз Ні Туг Авп Авзп Їе ТНг Ттр 180 185 190
Туг Гуз Авп Авп Сп Си І єеи Пе Пе Авр Спу ТНг Гуз Туг Зег Сп 195 200 205
Зег Спу Суп Авп Геи Пе Пе Ні Авп Рго Си Геи Спи Ар Бег Спу 210 215 220
Аго Туг А5р Суз Туг Маї Ніз Туг Авр Азвр Маї Ага Іе Гу Авп Ар 225 230 235 240
Пе Маї Маї Зег Агу Суз Гуз Пе І єи Тиг Ма! Пе Рго бег Сіп Азр 245 250 255
Ні Аг Рне Гуз І еи Іе І еи Авр Рго Гуз Пе Авп Маї Тпиг Пе Спу 260 265 270
Сім Рго Аїа Авп Іе Тниг Суз ТНг Аа Маї Зег ТНиг Зег І еи І еи Маї 275 280 285
Авр А5р Маї І єи Пе Азвр Тгр Спи Авп Рго Зег Спу Тр Пе Пе Спу 290 295 З00
Ї еи Авр Ріє Су Маї Туг Зег Пе Гей Тнг Зег Зег Спу Спу Пе ТНг 305 з10 315 320
Зо
Сім Аа Тниг І єи Туг Рпе Сім Авп Маї ТАг Спи Спи Туг Пе СПу Авп 325 330 335
Тиг Туг Тиг Суз Аго Су Ні Авп Туг Туг Рпе Авр Гуз ТНг І єи ТНг 340 345 350
Тиг Тниг Маї Ма! Геи Сіи 355 -2105» 6 «2115 357 «212» БІЛОК -213» Вірус коров'ячої віспи «220» «221» Ме доступу ОБСАСЗ: Розчинний інтерферон-альфа/бета рецептор «реа» (1)..(357) «-4005» 6
Меї Гуз Меї Тниг Меї Гуз Меї Меї Маї Ніз Пе Туг Рне Маї Зег Гей 1 5 10 15 зегі єи 5егіІ єи 5егІ еи І єи Геи Рне Нів Зег Туг Аа Пе Ар Пе 20 25 Зо
Сім Азп Спи Пе ТНиг Спи Рне РнНе Азп І уз Меї І уз Авр ТНг І єи Рго 35 40 45 60 Аа І уз Авр 5ег Гуз Тр І єи Азп Рго Аа Суз Меї Рне Сіу СПу ТАг ді
50 55 бо
Меї Азп Азр Меї Аїа Аа Пе Спу Спи Рго Рне 5ег Ага Гуз Сув Рго 65 70 75 80
Рго Пе Сім Авр Зег І еи І еи Зег Нів Ага Туг Гуз Авр Гуз Авр Авп 85 90 95
Ммаї Маї Авп Ттр Сім Гуз Пе Спу Гуз ТНг Ага Агу Рго Геи Авп Агу 100 105 110
Аг Маї Гуз Авп Сту Азр І єи Тр Іе Аа Азп Туг Тиг Зег Авп Авр 115 120 125
Зег Ага Аг Аго Туг Гей Суз ТНиг Маї Пе Ти Гуз Авзп Спу Ар Суз 130 135 140
Пе Сп Спу Пе Маї Ага 5ег Ні Маї Аг І уз Рго 5ег бег Суз Пе 145 150 155 160
Рго Сі Пе Туг Спи Її и пу Тнк Ніз Авр Гуз Туг СпуУ Пе Авр І еи 165 170 175
Туг Суз Су Пе Пе Туг Аа Гуз Нів Туг Авп Авп Іе Тнг Тр Туг 180 185 190
Гуз Ар Авп Гуз Сім Пе Авп Пе Авр Авр Іе Гуз Туг Зег Сп ТНг 195 200 205 спіу Гуз Спи Ге Пе Пе Нів Авп Рго Аїа І єи Спи Ар Зег Спіу Аг9 210 215 220
Туг Авр Суз Туг Маї Ніз Туг Авр Азвр Маї Ага Іе Гуз Авп Авр Пе 225 230 235 240
З5 маї Маї Зег Аг Суз Гуз Пе І еи ТНиг Ма! Пе Рго Зег Сп Авр Нів 245 250 255
Агу Ре Гуз І єи Пе Гей Авр Рго Гуз Пе Азп Маї ТНг Пе СпПу Спи 260 265 270
Рго Аа Авп Іе Тиг Суз Тиг Аа Маї 5ег Тнг 5ег Геи І ви Ма! Авр 275 280 285
Авр Маї І єи Пе Спи Тр Си Авп Рго 5ег СПУ Тр І єи Пе Спу Рпе 290 295 З00
Азр Рпе Ар Маї Туг Зег Ма! І еи Тнг Зег Агу Сіу Спу Пе ТАг Спи 305 з10 315 320
Аа ТНиг І еи Туг Ріє Сім Авп Маї Тнг Сім Спи Тук Пе Спіу Авп ТНг 325 330 335
Туг Гуз Суз Ага ау Ні Азп Туг Туг Рпе Сім Гу Тиг ГГ еи ТАг ТНг 340 345 350
Ти Маї Ма! Геи Спи 355 бо -2105 7
«2115 355 «212» БІЛОК «213» Вірус віспи верблюдів «220» «221» Ме доступу ОБСАВ87: Розчинний інтерферон-альфа/бета рецептор «реа» (1)..(355) «4005 7
Меї І уз Меї Тнг Меї Гуз Меї Меї Маї Ніз Пе Туг Рне Маї 5ег І еи 1 5 10 15 зЗегі єи Зегі еи Геи І єи РНе Ні 5ег Туг Аа Пе Авр Пе Спи Авп
Зо
Сі Пе ТАг Азр Ріє Ріє Авп Гуз Меї Гуз Авр Пе І єи Рго Тнг Гув 35 40 45 20 Авр б5ег Гуз Тр Гей Авп Рго Аа Суз Меї Рпе Спу Спу Тиг ТАг Авп 50 55 бо
Азр Меї Аїа Аїа Пе Спіу Спи Рго Ре 5ег Аа Гуз Сув Рго Рго Іе 65 70 75 80 25 сій Авр 5ег І еи ГГ еи 5ег Ні Аго Туг Гуз Авп Гуз Авр Авзп Маї Маї 85 90 95
Азп Тр Спи Гуз Пе Сіу Гуз Ти Гуз Агу Рго ГГ єи Азп Ага Ага Маї 100 105 110
Гуз Авп Сіу Авр І єи Тр Іе Аїа Азп Туг Тиг Зег Азп Авр 5ег Ага 115 120 125
З5 Аго Аго Туг ГГ еи Сув ТНг Аа Пе Тпг Гуз Авзп Спу Авр Суз Пе Сп 130 135 140
Ссіу Пе Пе Аг 5ег Ні Маї Агу Гуз Рго 5ег Зег Суз Пе Рго Си 145 150 155 160
Пе Туг Сім Гей Стпу ТНг Ніз Авр Гуз Туг Спу Пе Авр ГІ еи Туг Суз 165 170 175
Ссіу Пе Пе Туг Аа Гуз Нів Туг Авзп Авзп Іе Тнг Ттр Туг Гуз Азр 180 185 190
Авп Гуз Сім Пе Авп Пе Авр Азр Пе Гуз Туг Зег Сп ТНг Спу Гув 195 200 205 сім еи Пе Пе Нів Авп Рго Аїа І єи Сім Авр 5ег Сіу Агу Туг Азр 210 215 220
Суз Туг Маї Ніз Туг Азр Азр Маї Ага Іе Гуз Авп Азр Іе Маї Маї 225 230 235 240 зЗег Агу Суз І уз Пе Гей ТНг Маї Тнг Рго 5ег СіІп Авр Ніз Агу Рпеє 245 250 255
Гуз Геи Пе І єи Авр Рго Гуз Іе Авп Маї Тнг Пе Спу Спи Рго Аа бо 260 265 270
Азп Пе ТНиг Суз ТНг Аа Маї 5ег Тнг 5ег І єи І єи Ма! Авр Ар Маї 275 280 285
Гей Пе Си Тгтр Сім Авп Рго Зег Спу Тгр Геи Пе Сіу Рпе Авр Ріе 290 295 00
Азр Маї Туг Зег Ма! Геи Тнг Зег Агу Сіу Спу Пе ТАг Сім Аїа Тниг 305 з10 315 з20
Ї еи Ту Рпєе Си Авп Маї Тиг Спи Спи Туг Пе Спіу Авп ТНг Туг Гуз 325 330 335
Суз Агу ау Нів Авп Туг Туг Рпе Стпи Гуз ТНг І еи Тег Тиг ТАг Маї 340 345 350 маї Геи Си 355 -2105» 8 «2115» 344 «212» БІЛОК «213» Вірус віспи свиней, штам Зм/іпе/МебгазКа/17077-99/1999 «220» «221» Ме доступу О8УЗС4: ІФН-альфа/бета-подібний зв'язуючий білок «реа» (1)..(344) «-4005» 8
Зо
Ме! Пе Зег Пе Гуз Гуз Туг Авп Іе І еи І єи Ре Пе Пе Зег Рпе 1 5 10 15
Пе Туг Суз Зег Аіа Азр Авп Авр Іе Авр 5ег І єи Туг Спи Спіу Туг 20 25 Зо
Гуз Спи РНе Геи Авр Рго Гуз І еи Гуз Сп Ре І єи Авп Авр Авзп Сув 35 40 45
ТАг Туг Агу Су Туг Ага Ар Ріє Ре Геи Туг Авп Спи Сім Рго Аїа 50 55 60
Азп Іе Гуз Суз Рго Геиц І ви Авп Авр ІІє ГІ єи І еи Агу Сіп Гуз Туг 65 70 75 80
Ні5 Авп Туг ТАг Пе ГІ єи Тгр Гуз Гуз Геи Спіу Сім Агу Зег Зег Аг9 85 90 95
Ї еи І єи Авп ТНг Ніз Спу 5ег Пе Рнеє І еи Азр РНе Рне Рго Туг ГГ ув 100 105 110 зЗег Си І єи Агу Сіу бег Ма! Туг Сім Суз Меї Пе Пе І єи Авп Авп 115 120 125
ТНг Суз Авр Сп РНе Пе І єи Гуз Гей Авп Азр Іе Ага з5ег Авп Рго 130 135 140 маї Суз Туг Ні Авп Азр Туг Гуз Маї Ні5 ТНг Авп Іе Спи Пе Рпе 145 150 155 160 60
Сув Авзп Ма! Іе Авп ГІ єи Сп Туг Авр Тут Пе ТНг Ттр Туг Гу Авп 165 170 175
Азп Зег Сім Пе Пе Пе Авр Су Туг Гуз Туг Зег Авп Сп бег Аг9 180 185 190
Аго І еєи Г еи Маї Туг Азп ТНг Тнг Туг Авп Авр 5ег Спу Пе Туг Туг 195 200 205
Сув Авп Аа Тут Тиг ТНг Нів СПу Гуз Авп ТАг Туг Пе 5ег Ага Ага 210 215 220
Сув бег Зег Ма! Бе! Пе Нів 5ег Нів 5ег Туг Туг Азр РНе Туг Пе 225 230 235 240
Сім Нів Пе Авп Авп Пе Тпг Туг Пе Авр Рго Авр 5ег Сім Авп ТНг 245 250 255
Сіп Пе Туг Суз Гуз Аа Пе бег Туг Зег Авп 5ег Зег Тут Пе І еи 260 265 270
Пе Туг Ттр Сім Авр Спи Туг СЧу Спу Туг Пе Туг Авр Авп Сту Пе 275 280 285
Тугаїп Туг Азр Авп ЇІе ТНг І єи Пе Спіу Авп Спи Гуз Ма! Туг Меї 290 295 З00 зег Пе І єи Ма! Геи Сім Гуз Зег Аа Туг Туг Агу Туг Ма! Авп Авп 305 з10 315 320
Зо
Тиг Рне Тнг Суз Геи Аа Тнг 5ег Маї Туг Маї Спи Гув Гув ТНг ТНг 325 330 335
ТА" ТНг Г еи Ма! Пе Гуз Гуз ТНг 340 «210» 9 «2115 351 «212» БІЛОК «213» Танапоксвірус «220» «221» Ме доступу А7ХО54: Рецептор ІФН типу «реа» (1)..(351) «4005» 9
Меї І уз Пе ТНг Туг Пе Іе І єи І єи Пе Суз І ув Спи Пе Пе Су 1 5 10 15
Азр Авп 5ег СПу Азр Авр Меї Туг Авр Тут Пе Аа Авп Стпу Авп Пе 20 25 Зо
Ар ТугІ єи Гуз ТНг Пе Азр Авп Ар Пе Пе Азп І єи Маї Авп ГГ ув 35 40 45
Азп Сувз 5ег Рпе Аго Сім Пе Гуз Тнг ТНг І еи Аа Гуз СП Авп Спи 50 55 бо 60 Маї Геи Меї Геи Гуз Су Рго Сп І еи Авр Авп Тут Пе Геи Рго Ттр
65 70 75 80
Гуз Туг Меї Авп Аг 5ег Сім Туг ТАг Ма! Тнг Тер Гуз Авп Пе Зег 85 90 95
Авп Зег Тиг Сім Туг Азп Азп ТНг Ага Іе Сім Авп Азп Меї І еи Меї 100 105 110
Рпе Ре Рго Ре Туг Авп ГГ еи Сп Аа Спу Зег Гуз Туг І ви Суз ТНг 115 120 125 маї Зег Тиг Авп Гуз Зег Сувз Авр Сп 5Бег Маї Ма! Пе Маї Гуз Гув 130 135 140
Зег Рпе Туг 5ег Авп Авп Су Меї І еи Зег Спи Аа Гуз СПм Авп Ар 145 150 155 160
Азп Ре Си Пе Туг Суз Спу Пе Гей Нів Аа Гуз Туг Авзп ТНг Пе 165 170 175
Гуз Ттр Рпе Гуз СП Спи Гуз Спи Пе ТНг Авп Авп Туг Гуз Туг Туг 180 185 190
Тиг Гуз Геи Спіу Спу Туг Ма! Гуз Спу Пе Авп Авп Маї Тиг Тут Зег 195 200 205
Азр Зег СаПу Гуз Туг Ма! Суз Сім СТу Туг Туг Пе Авр Ма! І еи Гув 210 215 220
Зо Азп Ге Тнг Туг Тниг Аа Гуз Агу Суз Маї Авп Геи ТНг Ма! Пе Рго 225 230 235 240
Авп ТНг Тут Туг А5р Ре РнНе Пе Маї Азр Іе Рго Азп Маї Тнг Тут 245 250 255
З5
Аа Гуз Авп Авп І уз І уз І ви Спи Ма! Азп Суз ТНг Зег Ре Маї Авр 260 265 270
Пе Авп Зег Туг Азр Тут Пе Гей Тиг 5ег Тгр Геи Туг Авп СПУ Гей 275 280 285
ТугГеи Рго І єи Стпу Маї Аго Пе Туг Сіп Гей Туг Зег Тиг А5р ІПе 290 295 З00
Рпе Ріє Сі Авп Ре Пе Туг Агу ТНиг 5ег ТНг І єи Ма! Рне Си Авп 305 з10 315 з20
Ммаї Авр Іе 5ег Азр Авр Авп Гуз ТНиг Рпе Спи Суз Сім Айа І єи 5ег 325 330 335 маї Тиг ГГ еи Гуз Гуз Пе Гуз Туг ТАг Ти Пе Гуз Маї Спи Гув

Claims (13)

340 345 350 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рекомбінантний поксвірус, який містить гетерологічні нуклеїнові кислоти, що експресують збільшену кількість дволанцюгової РНК (длРНК) на ранній стадії інфекції, де гетерологічні нуклеїнові кислоти, які генерують длРНК, містять послідовності, що кодують комплементарні транскрипти РНК, де експресія послідовностей, які кодують комплементарні транскрипти, бо спрямовується для кожного раннім або негайно-раннім поксвірусним промотором, де комплементарні частини транскриптів РНК випалюються після транскрипції з формуванням ДлЛРНК, де комплементарні частини транскриптів РНК перекриваються на більше ніж 100 нуклеотидів, і де поксвірус являє собою ортопоксвірус.
2. Рекомбінантний поксвірус за п. 1, який додатково містить гетерологічні послідовності, що кодують одну або більше костимулюючих молекул.
3. Рекомбінантний поксвірус за п. 2, де одна або більше костимулюючих молекул являють собою ТКІСОМ (В87-1, ІСАМ-1 і І ЕА-3).
4. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-3, який додатково містить гетерологічні послідовності, що кодують один або більше бактеріальних, вірусних, грибкових, паразитарних або пухлинних антигенів.
5. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-4, де ортопоксвірус вибраний із групи, що складається із вірусу вісповакцини, вірусу коров'ячої віспи та вірусу віспи мавп.
6. Рекомбінантний поксвірус за п. 5, де вірус вісповакцини вибраний із групи, що складається із вірусу вісповакцини Ууезіет Кезегме, вірусу вісповакцини "Копенгаген", Огумах (також відомого як вірус вісповакцини Умуеїй), вірусу вісповакцини ГГ із(ег, вірусу вісповакцини АсатрБбів 2000 і 3000, вірусу віспи кролів, вірусу віспи буйволів, модифікованого вірусу вісповакцини Анкара (ММА) і модифікованого вірусу вісповакцини АпКага-Вамагіап Могаїс (ММА-ВМ).
7. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-6, де комплементарні транскрипти РНК містять кодуючі білок відкриті рамки зчитування (ВРЗ) або не кодуючі білок гени.
8. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-7, де комплементарні частини транскриптів РНК перекриваються на 100-1000 нуклеотидів.
9. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-7, де комплементарні частини транскриптів РНК перекриваються на більше ніж 700 нуклеотидів.
10. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-9, де дві послідовності, що кодують комплементарні транскрипти, розділені одним або більше важливими вірусними генами.
11. Рекомбінантний поксвірус за п. 10, де смислова матрична РНК (мРНК) транскрибується з однієї з двох послідовностей, а антисмислова мРНК транскрибується з іншої послідовності.
12. Рекомбінантний поксвірус за п. 11, де смислові або антисмислові РНК транскрибуються з обох ниток однієї вставки гетерологічної послідовності. Зо
13. Рекомбінантний поксвірус за п. 11, де смислові або антисмислові РНК транскрибуються з обох ниток послідовності нативного поксвірусу.
14. Спосіб послаблення стандартних реплікаційно-компетентних штамів вірусу вісповакцини та інших видів, що походять від ортопоксвірусу, шляхом експресії ранньої длРНК, як описано у будь-якому з пп. 1-13.
15. Спосіб підвищення природженої імунної активації, який включає введення рекомбінантного поксвірусу за будь-яким із пп. 1-13 хребетному суб'єкту, де зазначене введення підвищує вироблення інтерферонів типу І (ІФН типу І), цитокінів і хемокінів у суб'єкта.
16. Спосіб за п. 15, де вироблення ІФН типу І включає транскрипцію інтерферон-бета (ІФН-В)- кодуючої матричної РНК (мРНК), і де транскрипція І?ФН-ВД мРНК підвищується щонайменше в два рази.
17. Спосіб за п. 15, де вироблення ІФН типу І включає секрецію білка ІФН-РД, і де секреція білка ІФН-ВД підвищується щонайменше в два рази.
18. Фармацевтична композиція, яка містить рекомбінантний поксвірус за будь-яким із пп. 1-13 і фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.
19. Застосування рекомбінантного поксвірусу за будь-яким із пп. 1-13 або фармацевтичної композиції за п. 18 як лікарського засобу.
20. Застосування за п. 19 для посилення природженої імунної активації.
21. Застосування за п. 20, що включає введення рекомбінантного поксвірусу хребетному суб'єкту, де зазначене введення посилює вироблення інтерферонів типу І (ІФН типу І), цитокінів і хемокінів у суб'єкта.
22. Застосування за п. 21, де вироблення ІФН типу І включає а) транскрипцію інтерферон-бета (ІФН-В)-кодуючої матричної РНК (мРНК), і де транскрипція ІФН-В мРНК підвищується щонайменше в два рази, або Б) де вироблення ІФН типу І включає секрецію білка ІФН-Р, ї де секреція білка ІФН-ДР підвищується щонайменше в два рази.
ве вів о - б ; СУА На щей М шН СМА длнео-ДНІВ Ге КУ щу р У Я у Е СУА-ДНІ5 ЖКвенев | М Ні я в з їй у СМА-ВІ5 КН шен ПОЇ ОН СМА-АВІВ НО НО се І СМАдянеоВВІВВІВ ОО КЕН ЦО Я І
Фіг. ' А вити в зо тс БО! ТОЮ: Фа яв я я - й - ден Й і фра я рак ок я я - КОЖ оо . ш зв дн яні І З вх док й ех Й шк те за во ча й тв и, з х ІВ я а З МЕ І | і х ЮК Я вк т чі щі х Бі З Ж ві Я М З. у и ії дві | / жи ши ше шк. й чи ЩО З нт от уттрентунннретнн Й, З ечоодечуєі стече ЖЖ лю линуучтує учня тенет п х а Б 8 31333532 в о а я воза у за й З Ж й в їх ІЖЕЖв жсмАдянко я Ва хисувх ВІ іже УА МА: Вів зерно З ВІВ чектя Вів С зх ТО жде в М ово : хох ТЕ: зв3 : тона КУА тріг.а фігура З В з -8 Я я А я р: «еннЕ ув данео-авіВ м Те ї 8 Щ в о кв м ля й . М вен Шо ! в де Кей та В 8 а в з че 8 їх 8 5 8 зве День п. День пі. з з зовававажоо Во й СУА ЗКОЙ во - . «МА дтню вия хй6 З І ва ее НІ є шо цї Вед динею ори В 10 ХЕ а і і Ява, В ії 5 о Е ГУАІ й 5 ВІ хх. мдкноух фокоючух аа ях ня 8 3 я в а ява ва День п. 0 | дл хи 2 воо в 4 | о Є, Її й т оса І, З дові 1 і Ж ше ї ! і Е І 3 ве ОБРІЗ 51 8 052 5-й Ж М 04 п НН 13 05 03 13 08 оз МОЇ МО СУА ВСУА вОУААЗВІа ВСМАдлнвю ЗВ ОСУД» диноо Вів воуд-еВіВ внуд ВМчА ПОеУАСВіЄ фі
А в В ВО -к им їх зсув ддієа Я ВИВ ш ЗСЧАЄ Вів за а змив ; «00 5 1200 5 8 но 200 5 «00 в ЖОВ а Ж Ж й . ; її 2 4 8 я яв ії 235557 гадння хі.
«Мг.Я Чисура бА фев дини онни нт умежах касети ВАЄ . фрізах ФЕНИ я. сови ЩЕ др р пеоітовної 0 праці ЕП ЕШКЯ "ЩІ ММА-АВІБ фс дин овти--я- с-в ве я ра я я ва . м ВІК сет 4 ВВ де -- ТВ бух Ко те МУД- дпнез -АВІБШАНАС "ВИК да чом и кети ММА ВОК МУАЕОКК оіммА своя дес нав фарнввис сс а ДНК АЕК ІВО фони ем НИМИ правих ссннк МО ВН ур " а С зн нні М ШЕ 00 Б ву МУКА ЕШКК перс ДМ вок» одаво «оС )--фенннтоєттвни---«оЯЖЕ Гама векР-я -ш-- щк сн НН ЕМО КОН о ПЕ р н- - фі ВЕК МНИН Кос» 5 ВЖ сдянкаляннкінютох о ММАССЕФЕВЯ пф юн -" НН ИН ММА. ЕФЕР-В, вх НО ср НКИ «00 Вб ділюваденковаю 0 ке БО гнид ГлеА» зи всввз | деаю-ф ОО і ВУД - ях БОЕВ-візнів ! и 0 шк фіг; В Б ши ; -о ! жит ТВ - ці і вісхь ЩЕ я гуоткн вав що шва хв : Ева. зо с Її 5 І І КН їх : Б або си ді В
5 т. , | ке 5 т. ща в. | і зво С ! й ї зн 3 с , й се сраваскекткюрнжн, З 5 у З ту і 234565 12345 1 2 з 123
«Фк. БІ
-- со я 7 Ж 1650 3 оМмЕЕ необроблений 00 Б Ж МЕ зАга-с оо я МЕК-дІ ж що 120 І. 500 ж Ж і: Ж | 500 Во З зоб - ЕЕ я є | 200 до КУ | . ! 190 Ж Но в Мк. ЯКОС М. рон о шт - г М а Я Ко Ф Ка З ко ою 2 « ху 4 І ки Ж о «5 КОМ фіг. 8 з м що ж за я ща я. Я 5. 8,8, Я в о. в В А В 5 а її в й - 5 - Б - 5 - В - - 5 - ЕВ
Бо. Що. ЩО. Во. Шов. ов. Щай. «ВЕ 55 у «20, «5-8 «чечач« часи: ша«ччс: чада ча ке ж "вих: х»»»: " з» зІ»»»І п» ві их ххх Ех КЕ яв ВЕЕх Ех ЗВБЕЖ Як її и | Я ак ве г НК звгура 10 ; їн А я я ШМЕРдт 00 з амЕвдх о вв. Ме вКе ОщЕвеке й п 1509 5 В 705 . - Ж ш - 00 в 850. . З ; В ще свя ще тех ; З їх ї 5 501 . о ; і Фо
40. жов. І 8 | ші
Е.В 1 й в вв а М Кн ек 0 Й. ен у ення 1 234 5 1 2345 Фігура 11 А В С - В Ж У 4 х щ. що ЯВЕКАЮ Шо | ЗИКЕ де де ренні шо Я осивикую іще. з реак ЗЕ ши г се г х ! і; я 0 в 1, м шН в ш б. ЕЕ в. : Я 85» ме і 85, їв 8 110 баці 01011 ен
Е.В 3 п НІ 33 шо шо В: Я КЕ те Ж Ж В й зом акне ДОВ 1 53:34578 59 ти 39585789 1234 чнгура ІЗ
Ж я. ш ЗО 5 ОХ щі - 010 вмудовво вт и шини «| БО оле3/ 0 ЗМУдялвОве ЗВ о кВ, т | Її їє1Е Її
УМ. ий еММАЕОвР пом її Ж : но й , я я фронтон ва : є С с щ а 677 жо оо тодини пі. о ком ше у ще о вов Ж З За | гг В во - шо Я щі. 5 зво 4 о У | ш. Еш і щі же ан м дах ПИ 5 я де Я тю 1 2345
Фигура ЗА 3000 | чу г
КЕ. ї- ЗПО0 - , Гу | їі т 4 Що шк ще 51 Щи АЙ б «- « З ю « Ю «- « - ..- Ки а о « г «г Ку чк ее Чнетра СН 12000 4 С ; че зе - 8000 - - Зеавиє 4 і. ее ее ай кеш Є Ка КЗ ме ї К шк ж я
«Вігурв ІС 14000 І 12000 - : -к ВО00 4 . ун шк й Ай ВЛ Лі - "Є Ба Ко ще У й ек Ку Км ве ІРБ-15о рКНОЄ Фігура ТО яО000Оо - а я К; Я и
Фігури ЗЕ 120000 4 є 100000 Я воооо - о т адово - о | в. ОО. з 20000 - Щщ ж ШИ" о щш в и б жа и У є Б є Фе КО Кк КУ й Я Я ов є є ви ува ЗК 500000 4 ш 400000 як - 2 100000 - ЩЕ Щщ ака : ж ; Є ак ще
Є . я Я ей я «є фігура 116 6000 - т. - ! о шо. З що Ш О 2000 4 щЩ ще шк га А о А и и до У є Мей й ак о ж жк у Фігура 14 ши ОБОВ я т. : ща ; о - Що лбБн5. х я | Я п щ | 2 ММА дпЕбЕР Енн ши 5 ж | І Ще 1 шу ОСОБОЮ. ден ну о
Ж. и
(Вігура 15 80 4 Ж зе ши 2 501 З жо 20 1 11 ге | щи.
З. 104 | 1 щ 0 А А Я НЯМ сл 1234567 8 910
«Фігура 16 А МуданЕЗ, «ЧК з в ооо в Єс-я В СП М а че в Няни В Чен зв и ОККО о С НеКе Я емисповаВК Я. ! . ТТ нейзктивняй зитисмисвовии СТЕ З В де Й я ще 00 3 її ЯЗ я з Щ ш 200 - «г | 5
45. с Ж 2 100. | с є - г - в Ж й а З кре Я ЩЕ. но В їі 5 45 а 5 бо
Вірує пісня маво кеВ МУВЕ УВІ ВВБІЖНВЖА- - ОЕВМКІТЕЕВМ- - КМАОТІ ВАВ Вірус віспа вакцин ЖК я УМ МУНІ ЖЕ УМО ЕЕ АД БО ЕМЕТХЕКЕН- МВТ ВАК ОВХ Мірус віха вакцини Сорока се МЕМЕММУНХУВУЮЬ сн ПІКИ ВУАї ее ОЕВМВІВЕКЕМ А ЕМВ КОВХ СУА -МЕКЕМКММУНІ ХУ ВЕОЕНІЖАД ІЕЕ КТЕКЕМ ее кМиБеОаиВКОВх рус октраменн МИХКІМЕМиУЕІУЮСВииаЬивІ ЕН АХ- - ПІЕНЕІТЕЕЕМ- МЕ БТеЕАКОВК Віреє вісн; зони. -ЮюЕМІМЕМИУВІ УК ВВЕ ЕНВУАІ- І ЕМНІЗЕКЕМ-- КМ рТІі АКОВХ Вірек вісн верблюдів «МЕМЕМЕМИУНІУК ав вЕБІТЕНВУАІ- ПІКЕТ ЕМ-- КМЕВІВЕТКОВЕ Вірує віспи свиний --МЕВЕЖ- КМ ДПІ ЕХІВЕХТОВАЮНЮ ТрЯрУВ СИ КЕЕКОРКОКО І нати нення ВК нед ж ЦІ КІ ТОК ТО ОМА СОМ ХТАМОМІПУБКЖЕОМОХІ В -Ж «жи « ок я 2 Віру вів мак МОНУ СМи СОТ АСІсВРуЕДЕС р ВОВЬООВВХЕ З рЕУКшВКЕЕКМЕВНОМ У Візує вісво ввхлнивЗ ЖЕ ВІМРАСМУОТМНОХАЛІСКІКВАКІВрЕДОВЦЮІНЕХ и ЖУК МЕВВОМ В Вірує вістю пакт соренвавсв ВУД РАСМУ У МНОХААСОКРЕМАКТВРІВОВИМОНЕХК А ПУ ЧКМЕНКЕКМЕВЕОМЯ СУА БІМБАСМУОЦУКММОІВАНОЕрЕЕВоАКОСРБІВОСБИМИЖЕ ПУ УЧЕНІ ВКМЕВВОМИ Нірує скпроМменії БІМоВСВЕссТММОМААІСВВЕВАКСВрІЕВЕБІКНКУНОК МУ МШЕКІСВУВВ ЕК Вную зон жерне БІМБАСМЕССТММОМААТСЕВКВАКСВРІВОЕБЬЕНК КОКСУ Ю ЕК ШИЯ их Вих вісн веролкеців шШІМІАСМЕПОТУМОМЛА ОВ ВЕВАКСВБІВОЕБОАНЕКМА ЦИ ЧУММЕК ХИТ КИ В Вірус віспи свмней БІМОМСТТВОККОРЕОМЕЕВАНТКСВІ МІ БОВОКУН- Мет ЕК ТОВКИ ТБананоке ПМЕМСсКРЕВІКуУ т АКЕМВУЇЧБКОВОСОМУТЬОШКУММиЗЕУТуУТВ КИМ ж оож і : х ЖЖ тр: І їх 161 Хіт 4 «Фі ТА Вірус віспи мови МЕБУКВІООМІАМУТЗЕиВМВЕЖСТУТТЕМрОоОоУУК НУ РОСТ РЕТУЕІТХ Вірус кісле вакцкни УК, МКБУКНОЛІВІАМНУТаКЕВМВАХБСТУТТКМОрОСЧУОСІВ НІК НоВСІ Кто Вірус вл вакцива Сорезйзеев МКВУКНОПІМІАМИТИКЕВОМНВУБСТУТТКЕМО ТУТ ВНІККЕВЕЕСІНИТХЕООТИ СУА МмЕЕУКНООМІМУРЛКИНМВЕ СТУ ВККСУ ЗНІККРРСТРЕТУКТИ Вівує вхзромедії чЕвУКМОрІШІКНУТВВИВНиКУСТУтТКМОоросчОосІУв ЕНІВКреЗсІВЕТЕКОСТВ Вірус віспи копів МавУКУСІІВМІАМУТЕВеВВАВУ СТУ КТКМОТ ІОшІЕ внук ВаВсІ ВЕУ ВІНКИ Вівує відп верблюдів МЕКУВНОПВОВІАМУ РЕМОНТ АТВЕМОрОСІ СВІ ЗНУ ВВЕСІРЕКЖВЬОТИ Вірус віспи свиней ІЖТНОНІвРОКЕеУКвЬКИІВУУОС МТМ ТОСПОКІВКІЛОТВ МЕС У НУ Кн Тачатщке МТВІВММИМЕК ДЕК ІАСВЕХУВСТУВТМК ВОСТОБУУТУККВЕУ ВОМУ т, жож то Ж її у. ки Вірус вісн маму ВКкУпІВЬЕСвІвУАВНІММІТВУКОМЕБІМІОВЕКЕВОДЦЕ ВрІХНЮЕрЕВЕВЕОВУ ДО Внрує вікна ванн ЖК ПЕУОтоЬІ і еАЕНУММІТНУКИМЕКІМІПЮТКУ ВТО еБЕІІНМКРрЕВЕНВЕСВУ Віртс вили вакнвни Сороввнеев ЗЕжЗКОУСсІБУАКНУМИХКУКОМиКІМІрОТЕХВОВОаКк оКЬЕІНМмиКоКЗасиХМОо СУА ПижЛІПИУСОТІХАКНУКНІТШУКОМКЕІМІВОХЕЕВОТлК о КІТ НМЕврЕВВОоКиМО Рируюткуровеяй вЕхОТООУССІБУДИНІММІТИХУЕНМОВІТІрОТКУ НОВОЮ МеЕХНМОЕУ ВІВ Вірус вцн копів ПЕжСІДИХССХІХАКНУМНІВНУКОМЕКІМІВСККЕВоТОК ВІК ВИРАБЕОІСВХ ТИ Візує ствах зержуводів ПЕжІПІУСОТІХАКНХУКМІКНУКОМКЕІМІррІнУ Вот ИК- МІХ НМЕВЬьЕвасоКЖо Вірус вклни свннея УНЖКІВТЕОСВОХВІ: ОТОЖ ТТВУКиМа ВІТ КЕН КЬЕЧУМІ ТВО Танапке ЕМОМЕБІУСІЬКА КУМТІКМКККЕКЕІТМ МВТ ОТМЕОТИМУ ТВО ВИК ; ЕІ Ж Її іт Ж,хІкі КІ ЖЖ їх «ЖЖ ж ох
Фі. 17В
Нрус вісвм мани ЕжУНХЮКУВА НИК БУМ ВЕЛИКЕ ЕК У І ОВ АМЕ ВАХ Крує вісво яакиман У яУНУрОУВІКШОІУНИСКІвТТВНКорННеКОІСирКІвУТЕ- КЕ ВАВІСТАУВ ВЕ Мкрує віспо вакцини Сбропіаеєв УНП КІКІ УВС КІХ ТУ РНОПИКЕКИХВО БК ОКОМ КОСТА, А пами их ее мвиг м ит чу у тя т - м о ЗеЩМ СТА жУНХБОУКІКНЮХУУ ВВЕ ТЕМНІ ЕКИНУ І ОБАМИ ІКАО ЕХ Вік екцуомені ЕУНУМВОУВІКНІ УНН ИККМИМ ОПИСИ БИРКІУтТ І СОКРАТ ТАЧВ КВ, Типує вісн ковів тунік УЧЕВОСККиІУТЕНОПИКиКІ ХИБНЕ ВАС АВК, Вірує спи вербннав ХеНУПИчКІКМОТУЕ ВСТУПНІ ВО БИТВИ АКТОМ: Вірус вісни свиней. МАХТІН- -спПЕМТУХвиЕВсиВМАгвНиуХпЕХІВнНІММІТУХЛеОвЕМІОКУСКА ХНИ Баманоке БІХТІДУВАМНІТХТАКВТУМОЕХ ЧТ ВКЕ ЕОМ УАНМ ОЕ УМСТВЕМІК ох : жо у їі її. ї ме Вірує відпн мові ЕшчУчумрУгІЕВиМиа ОБЛІКОМ Ки КБ ЗЕТЕАТСЕВЕМУТЕВУ ТОМ ЕТ Вер внлн накцинв ЯК ТИКОУБІВНЕМЕК СН ОК ПОЕТ УВУ ян ПЕН ТКАТОЕ МУКИ ТЕКО Вфрусіво вокинкиа Сорокацния ПЕДІТМОТКМЕМеа ОСІ ОК ЕП У БТІ ВАТЬУУВНТВ ВЕ ВІКО СУА БІТИ ЮЖКЕШЕНКа СВІ СЕ МЕТИ Юм ТОК ОІТВАТЕХКЕМУХВЕХ ХХІ НІрже ектремеям ІМПЕУБТПЖЕМЕН КМТ УМХВХ нн МНН УХІ ВАТИ КВЕХ КК Вірує вісвм кора МІУ ТЕВЕНЕН ОК ОК ПЕКИ нн ТАКО ТАТИ ТЕКУХ ОН ЕКе Брус вісви верблюдів БУООУТЕШЕНЕЕ ГОЛКА УВК ОСІ ВАТИХЕМУЖКЕУ ХК ВІрує віспи сввниУй чар укЕлЕсиЕ І ОХ Е тим ЕКУХВХУ СЕК АУХВУ НЕТУ Тенацоке ЗКПЖХНТНЮНЕ вхо х увів ЕвКЧЕУВиВ УК МУурІ ОККО ор ож Ж 00 їх їй. 1хї ж чне ГАС ті» - пеки зд тир ИН НТ ЕЕ Ту Ві мук вісн ма ВОМУ КОКО АЛ В ня зи доку х доня ше ду жк с т ту жах учет, стае те тож вірус вісповакцини МЕ ВОМУ КБАТОТЕ ТУ М ЦВ - Яся ки і умжчи ту арт ї Хе м же . ЗатІдвтІ ця ит слуху хто вірус вісповакцини Сорапласер ВОМУ ЕЕКТОТЕТУУ ТЕ ня ке ЕТ ри то тт яхт от СУА ВОоНМ УТЕКАТО ТРУ ТЗ Я жук длелтУуух тод тики ур т пит КТ ую вірує ектромелії ВОНМУТЕОКТЕГТЕУУ СЕ жу ким пакт - пошту пайку БИ ЧК АТ о дл вірус вас ков КОНМУУКВКТОТТМУЄ ТЗ куулих 3 - втру ПІВ ТТН ТТ ТИ дня Вірус віспи верблюдів ВОНМУТЕБКТИТТ ТЛА т А . 2 т сзтуктутих тот тити, тт спи Вірус вісти свиней ГАТВУХУБККТТТТУТЕКТ ТО ер руки їх роби у ОК и, їанапокс КАБВУТСКАКІКУТТІКУКЕ З Ж» хо к ж ж я ж а
Фіг. 17
UAA201606912A 2013-11-28 2014-11-25 Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування UA127337C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13005541 2013-11-28
PCT/EP2014/075522 WO2015078856A1 (en) 2013-11-28 2014-11-25 Compositions and methods vectors for inducing an enhanced immune response using poxvirus vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127337C2 true UA127337C2 (uk) 2023-07-26

Family

ID=49680779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201606912A UA127337C2 (uk) 2013-11-28 2014-11-25 Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20160376596A1 (uk)
EP (2) EP3074517B1 (uk)
JP (2) JP6641276B2 (uk)
KR (1) KR102504316B1 (uk)
CN (1) CN105829537B (uk)
AU (3) AU2014356546A1 (uk)
BR (1) BR112016011866A2 (uk)
CA (1) CA2929600A1 (uk)
CY (1) CY1124707T1 (uk)
DK (1) DK3074517T3 (uk)
EA (1) EA039037B1 (uk)
ES (1) ES2895977T3 (uk)
HU (1) HUE056105T2 (uk)
IL (1) IL245509B (uk)
LT (1) LT3074517T (uk)
MX (1) MX2016006758A (uk)
MY (1) MY188100A (uk)
NZ (2) NZ719934A (uk)
PT (1) PT3074517T (uk)
SI (1) SI3074517T1 (uk)
UA (1) UA127337C2 (uk)
WO (1) WO2015078856A1 (uk)
ZA (1) ZA201603187B (uk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3691675A1 (en) * 2017-08-24 2020-08-12 Bavarian Nordic A/S Combination therapy for treating cancer with an intravenous administration of a recombinant mva and an antibody
CN112996908A (zh) * 2018-07-13 2021-06-18 亚利桑那州立大学董事会 用表达tnf的粘液瘤病毒治疗癌症的方法
CN113573729A (zh) 2019-01-10 2021-10-29 詹森生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
KR20220112241A (ko) 2019-09-02 2022-08-10 아리조나 보드 오브 리젠츠 온 비하프 오브 아리조나 스테이트 유니버시티 점액종 바이러스를 이용하여 암을 치료하기 위한 새로운 종양용해성 바이러스 플랫폼
IL293051A (en) 2019-11-18 2022-07-01 Janssen Biotech Inc calr and jak2 mutant-based vaccines and their uses
US20240245765A1 (en) * 2021-05-13 2024-07-25 Thomas Jefferson University Use of Ectromelia Virus for Cancer Immunotherapy and Vaccines
CN115043948B (zh) * 2022-06-24 2024-05-28 青岛硕景生物科技有限公司 一种猴痘病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5519239A (en) * 1978-07-28 1980-02-09 Green Cross Corp:The Interferon-producing attractant
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DK0772619T4 (da) 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
CA2678259C (en) * 1998-12-09 2016-10-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services A recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
AU4077100A (en) * 1999-04-08 2000-11-14 Chiron Corporation Enhancement of the immune response for vaccine and gene therapy applications
CN1375004A (zh) * 1999-04-21 2002-10-16 惠氏公司 抑制多核苷酸序列的功能的方法和组合物
WO2002042480A2 (en) 2000-11-23 2002-05-30 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia ankara virus variant
WO2003048184A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
EP1523333A4 (en) * 2002-07-24 2007-01-24 Univ Arizona USE OF VACCINIA VIRUS WITH DELETION OF E3L GENE AS VACCINE VECTOR
US20050281782A1 (en) * 2004-06-21 2005-12-22 Howard Kaufman Novel recombinant poxvirus composition and uses thereof
US7998733B2 (en) * 2004-10-05 2011-08-16 Merial Limited Chimeric vectors
AU2005319306B9 (en) * 2004-12-22 2012-04-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
EP2042604A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-01 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) VV promoter driven overexpression of recombinant antigens
AU2011209175B2 (en) 2010-01-28 2016-02-04 Bavarian Nordic A/S Vaccinia virus mutants containing the major genomic deletions of MVA

Also Published As

Publication number Publication date
EP3971298A2 (en) 2022-03-23
LT3074517T (lt) 2021-11-25
JP2020072693A (ja) 2020-05-14
NZ759538A (en) 2022-10-28
AU2024202790A1 (en) 2024-07-04
KR20160087814A (ko) 2016-07-22
EA039037B1 (ru) 2021-11-24
EP3074517B1 (en) 2021-08-11
MY188100A (en) 2021-11-18
AU2014356546A1 (en) 2016-06-02
EP3971298A3 (en) 2022-04-27
KR102504316B1 (ko) 2023-02-24
CA2929600A1 (en) 2015-06-04
EA201691120A1 (ru) 2016-09-30
EP3074517A1 (en) 2016-10-05
AU2021200985A1 (en) 2021-03-11
SI3074517T1 (sl) 2021-12-31
NZ719934A (en) 2022-10-28
US20200325477A1 (en) 2020-10-15
JP2017503479A (ja) 2017-02-02
IL245509B (en) 2020-09-30
AU2021200985B2 (en) 2024-02-01
ES2895977T3 (es) 2022-02-23
DK3074517T3 (da) 2021-11-08
HUE056105T2 (hu) 2022-01-28
BR112016011866A2 (pt) 2017-09-26
CN105829537B (zh) 2020-09-22
JP6641276B2 (ja) 2020-02-05
PT3074517T (pt) 2021-11-03
CY1124707T1 (el) 2022-07-22
IL245509A0 (en) 2016-06-30
ZA201603187B (en) 2023-12-20
US20160376596A1 (en) 2016-12-29
WO2015078856A1 (en) 2015-06-04
CN105829537A (zh) 2016-08-03
JP7050044B2 (ja) 2022-04-07
MX2016006758A (es) 2016-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127337C2 (uk) Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування
JP6818797B2 (ja) 強靭なｔ細胞用のｐｒ１３．５プロモータ及び抗体応答
KR101028937B1 (ko) 신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라
US9265823B2 (en) Use of a modified poxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents
EA045254B1 (ru) Промотор pr13.5 для устойчивых т-клеточных и гуморальных иммунных реакций