JP2013064026A - ウリジンを含んだ組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】認知及び神経機能を改善し、神経細胞及び脳細胞による神経伝達物質の合成及び放出、膜合成を向上させる方法を提案する。
【解決手段】ウリジン又はそのソース、あるいは、ウリジン又はそのソースとコリンとを含んだ組成物を投与することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、ウリジン又はウリジンソースをもった組成物の投与によって、認知及び神経機能を改善し、神経伝達物質の合成及び放出と神経細胞及び脳細胞の膜合成を向上させる方法に関する。

ウリジンは、ピリミジンヌクレオシドであり、リボ核酸及びＵＤＰグルコースやＵＴＰグルコースのような組織グリコーゲンの合成における要素である。従来におけるウリジン単独の医療用途には、オロト酸尿症のようなピリミジン合成の欠損症に関連する遺伝疾患の治療が含まれている。コリンは、多くの食品の食物成分であるが、正常な膜構造及び機能にとって重要ないくつかのリン脂質の一部である。コリンは、非経口栄養を受けている患者に追加カロリー及び必須脂肪酸を届ける脂肪乳剤に含まれる。

本発明は、ウリジン又はウリジンソースをもった組成物の投与によって、認知及び神経機能を改善し、神経伝達物質の合成及び放出と神経細胞及び脳細胞の膜合成を向上させる方法を提案する。

一つの態様において、本発明は、ウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含んだ組成物を対象者に投与して、該対象者における認知機能を改善する方法を提供する。

他の態様において、本発明は、ウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含んだ組成物を対象者に投与して、該対象者における神経機能を改善する方法を提供する。

他の態様において、本発明は、ウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含んだ組成物を対象者に投与して、該対象者における認知機能の低下を治療又は改善する方法を提供する。

他の態様において、本発明は、ウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含む組成物を対象者あるいは対象者の脳細胞又は神経細胞に投与して、該対象者の脳細胞又は神経細胞の神経伝達物質合成能力を増進又は強化する方法を提供する。

他の態様において、本発明は、シナプスに隣接した神経細胞にウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成が強化され、これによってシナプスにおける神経伝達物質のレベルが向上する、シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる方法を提供する。

他の態様において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースを対象者に投与して、該対象者の組織、プラスマ（血漿）、又は細胞におけるシチジンのレベルを向上させる方法を提供する。

他の態様において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与して、該対象者の組織、プラスマ、又は細胞におけるシチジンのレベルを向上させる方法を提供する。

他の態様において、本発明は、対象者にウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成が強化され、これによって該対象者の脳細胞又は神経細胞の膜生成が刺激又は強化される、対象者の脳神経又は神経細胞の膜生成を刺激又は強化する方法を提供する。

他の態様において、本発明は、神経細胞にウリジン、ウリジンソース、又はウリジン及びコリンを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成が強化され、これによって神経細胞の神経突起伸長が刺激又は強化される、神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化する方法を提供する。

本発明は、ウリジン又はウリジンソースをもった組成物の投与によって、認知及び神経機能を改善し、神経伝達物質の合成及び放出と神経細胞及び脳細胞の膜合成を向上させる方法を提案する。

一つの例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースを対象者に投与して、該対象者における認知機能を改善する、対象者の認知機能改善方法を提供する。

また、一つの例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与して、該対象者の認知機能を向上させる、対象者の認知機能改善方法を提供する。

“ウリジン又はウリジンソースとコリンと”なる語句は、本発明に係る二つの実施形態、ａ）ウリジン及びコリンの組み合わせ、ｂ）ウリジンソース及びコリンの組み合わせ、の意味をもつものである。“ウリジン”、“コリン”、“ウリジンソース”は、ここに記載されているそれら各自の意味のいずれかを示している。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、認知機能は記憶である。記憶は、他の例においては、空間記憶、作業記憶、参照記憶、短期記憶、長期記憶、又は中期記憶である。さらに他の例においては、記憶は、当分野で知られている他のタイプの記憶である。各記憶形態が本発明の個々の実施形態に相当する。

図２１〜図２３に示すデータから見て取れるように、ウリジンがいくつかのタイプの記憶を改善する。異なるタイプの記憶の評価における種の違いを超えた効果の一貫性が、本発明の研究結果を裏付けている。実験例１５におけるデータは、さらに、ウリジンの効果がコリンの含有によって強化されることを示している。しったがって、ウリジン及びコリンを含む組成物の投与が記憶の改善に効果的で、さらに、一例においては、ウリジン又はコリン単独での投与よりも効果が高い。

他の例において、認知機能は学習である。学習は、その他の例においては、認識学習、感情学習、又は精神運動学習である。さらに他の例においては、学習は、当分野で知られている他のタイプの学習である。各学習形態が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能は知能である。その他の例においては、知能は言語知能、音楽知能、空間知能、身体知能、対人知能、個人内知能、又は論理数学的知能である。さらに他の例においては、知能は、当分野で知られている他のタイプの知能である。各知能タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能は精神的適合である。その他の例においては、認知機能は、当分野で知られている他のタイプの認知機能である。各認知機能タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、認知機能を“改善する”又は認知機能の“改善”とは、認知機能を実行する対象者の能力を向上させるということで用いられる。他の例においては、対象者における認知機能の向上又は改善されたベースラインレベルということで用いられる。その他の例においては、試験又は実験に応じた認知機能の向上又は改善レベルということで用いられる。

他の例において、認知機能を改善するとは、認知機能の１０％改善効果を意味する。他の例では、２０％改善が達成される。その他の例では、３０％改善、４０％改善、５０％改善、６０％改善、７０％改善、８０％改善、９０％改善が達成される。さらにその他の例では、認知機能を改善するとは、認知機能の１００％改善効果を意味する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能の改善は、治療開始前の認知機能に関連して評価される。他の例では、認知機能の改善は、治療しない対象者に関連して評価される。その他の例では、認知機能の改善は、たとえば実験等のように画一化された基準に関連して評価される。各認知活動の改善のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能の改善は、対象者の脳における神経細胞間のつながりの数によって評価される。他の例では、改善は、対象者の脳内又は脳内の特定領域における毛細管数によって評価される。その他の例では、改善は、神経活動によって評価される。さらに他の例では、改善は、神経機能、言語機能、又はコミュニケーション能力によって評価される。また他の例では、改善は、アセチルコリンやその他の神経伝達物質のレベル、又は認知機能に関係した脳内化学物質の測定によって評価される。また他の例では、改善は、対象者の脳を走査するポジトロン断層法（ＰＥＴ）や核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価される。また他の例では、改善は、認知機能評価法（ＣＡＳＩ）（Peila R et al, Stroke. 32: 2882-9, 2001）によって評価される。また他の例では、改善は、たとえばここに開示した実験（実験例１３）のような実験により評価される。認知機能の改善を評価するためのさらなる手法が当分野で良く知られ、たとえば、Antonova E et al (Schizophr Res. 2004 Oct 1; 70(2-3):117-45) 及びCognitive Function Analysis (Greenwood Pub Group, 1998) に開示されている。各手法が本発明の個々の実施形態に相当する。

本発明の方法の一つの例において、本発明の組成物は、対象者においてシチジンのレベルを向上させ、それによって、ここに記載した効果の一つを仲介する（たとえば、認知又は神経機能の改善、神経機能の刺激、膜合成、神経伝達物質放出等）。他の例においては、対象者におけるシチジン三リン酸（ＣＴＰ）のレベルを向上させることによって効果が仲介される。さらに他の例においては、対象者におけるＣＤＰコリンのレベルを向上させることによって効果が仲介される。また他の例においては、対象者におけるシチジン、ＣＴＰ、ＣＤＰコリンの誘導体のレベルを向上させることによって効果が仲介される。また他の例においては、対象者におけるシチジン、ＣＴＰ、ＣＤＰコリンの代謝産物のレベルを向上させることによって効果が仲介される。また他の例においては、シチジン、ＣＴＰ、ＣＤＰコリン、又はそれらの誘導体又は代謝産物のレベルを向上させることによって効果が仲介される。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

図９〜図１１に見て取れるように、経口投与したウリジンは、迅速にそして効果的に脳内シチジンレベルを上昇させるように働く。ウリジンが血流中に効果的にそして迅速に吸収されることを示す図３〜８と結びつけた場合、人を含むいくつかの種において、これらの知見は、ウリジンの投与がシチジン、ＣＴＰ、及びＣＤＰコリンのレベルを上昇させることを裏付ける。実験例１５のデータはさらに、コリンの含有によってウリジンの効果が強化されることを示している。

一つの例において、シチジンレベルは組織的レベルである。他の例においては、シチジンレベルは脳レベルである。その他の例においては、シチジンレベルは、神経組織レベルである。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、ウリジン投与のもたらし得る利益は、シチジン投与の利益よりも大きい。これは、ウリジンに比べてシチジンが、血液脳関門の通過に関し、通過できないあるいはウリジンよりも通過の効率が格段に悪いという事実に基づく（Cornford et al., Independent blood-brain barrier transport system for nucleic acid precursors. Biochim. Biophys. Acta 349:211-219, 1975）。

他の例において、シチジン、ＣＴＰ、又はＣＤＰコリン、あるいはそれらの誘導体又は代謝産物の増加は、細胞を活性化させてリン脂質のレベルを向上させ、それによってここに記載する効果の一つが仲介される。一つの例においては、リン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）である。他の例においては、リン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。また他の例においては、リン脂質はホスファチジルセリン（ＰＳ）である。さらに他の例においては、リン脂質は、ＰＣ、ＰＥ、又はＰＳの誘導体又は代謝産物である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、対象者にウリジン又はウリジンソースを投与することによって、該対象者における神経機能を改善する、対象者の神経機能改善方法を提供する。

他の例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者における神経機能を改善する、対象者の神経機能改善方法を提供する。

他の例において、本発明の方法により改善される神経機能は、シナプス伝達である。一つの例では、シナプス伝達は、運動ニューロンに隣接する。他の例では、シナプス伝達は、介在ニューロンに隣接する。また他の例では、シナプス伝達は、感覚ニューロンに隣接する。各シナプス伝達のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、シナプス伝達は、神経細胞の神経突起伸長の刺激又は強化の手法によって改善又は強化される。また他の例では、神経細胞の神経突起伸長の刺激又は強化が、シナプス伝達の改善又は強化に部分的に関与する。また他の例では、本発明の組成物は、神経突起伸長の刺激なしでもシナプス伝達を改善又は強化する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

“神経突起”は、一つの例において、神経細胞から伸びた突起を示す。一つの例では、その突起は樹状突起である。また他の例では、その突起は軸索である。各神経突起のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、シナプス伝達は、神経細胞の神経突起数を増加させるとにより改善又は強化される。その他の例では、シナプス伝達の改善又は強化は、神経細胞の神経突起数増加なしでも得られる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、シナプス伝達は、神経細胞の神経突起の枝分かれを刺激又は強化することによって改善又は強化される。その他の例では、シナプス伝達の改善又は強化は、神経細胞の神経突起の枝分かれ刺激又は強化なしでも得られる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

実験例９のデータは、膜前駆体のレベルが向上したときに、神経細胞が、より多くの枝（側枝）を伴ってより多くの神経突起を提供することを、示している。細胞の表面積及びサイズを増加させると、細胞は、一つの例では、近隣の細胞とより多くのつながりを形成し得る。さらに、細胞膜の量又は組織の向上は、一つの例では、神経伝達物質の合成及び放出を変え、これはまた、一つの例では、記憶形成に作用する。したがって、神経突起伸長を促進するウリジンのような化合物は、ニューロ結合の損失及び記憶障害を伴うアルツハイマー病のような神経退化疾患の治療に有用である。

他の例において、対象者におけるシナプス伝達の改善は、ウリジン及びコリン、又はウリジンの投与の結果として神経細胞の膜の量が向上することによって達成される。その他の例では、神経細胞の膜の合成を刺激することによって改善が達成される。さらに他の例では、神経細胞の膜の合成を強化することによって改善が達成される。また他の例では、神経細胞の膜の量又は合成の刺激又は強化が、対象者におけるシナプス伝達を向上させる仲介に部分的に関与する。また他の例では、ウリジン及びコリン、又はウリジンは、神経細胞の膜の量又は合成の刺激又は強化なしでもシナプス伝達を改善する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、改善又は強化される神経機能は、神経伝達物質の機能である。一つの例では、改善は、シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる手法によって得られる。その他の例では、改善は、シナプスにおける神経伝達物質の放出を向上させる手法によって得られる。さらに他の例では、改善は、シナプスにおける神経伝達物質のレベル又は放出を変えることなく得られる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

図１２〜図１３のデータに見て取れるように、神経機能を向上させるウリジンの能力を際立たせているのが、神経伝達物質機能の著しい改善である。図１４〜図１７のデータからは、神経機能を向上させるウリジンの能力をさらに実証する、神経突起の形態に対するウリジンの有益な効果を読み取ることができる。実験例１５のデータはさらに、ウリジンの効果がコリンの含有によって強化されることを示している。したがって、ウリジン及びコリンを含む組成物の投与が、神経機能の向上に効果があり、一つの例では、ウリジンやコリンの単独投与に比べてより効果的である。

他の例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースを対象者に投与して、該対象者における認知機能の低下を治療又は改善する、対象者の認知機能低下治療又は改善方法を提供する。

他の例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与して、該対象者における認知機能の低下を抑制し又は防ぐ、対象者の認知機能低下治療又は改善方法を提供する。

“認知機能の低下を治療又は改善する”とは、一つの例において、低下を和らげるということである。また他の例では、低下を防ぐということである。さらに他の例では、低下を反転させるということである。また他の例では、低下を緩やかにするということである。また他の例では、低下に歯止めをかけるということである。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能の低下は、神経障害に起因する。一つの例では、神経障害は記憶障害である。記憶障害は、一つの例では、記憶力低下を含む。その他の例では、記憶障害は、脳老化に関連する。一つの例において、記憶障害は、ピック病、レビー小体病、又は認知症のいずれかである。他の例では、認知症は、ハンチントン病又はエイズ認知症に関連する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能の低下は、神経変性疾患に起因する。一つの例では、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。その他の例では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、パーキンソン病、進行性核上麻痺、前頭側頭認知症、ハンチントン病、又はプリオン病である。また他の例では、神経変性疾患は、当分野で知られているその他の神経変性疾患である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、認知機能の低下は、循環器疾患に起因する。一つの例では、循環器疾患は、脳梗塞である。他の例では、循環器疾患は、多発梗塞性認知症である。その他の例では、循環器疾患は、当分野で知られている他の循環器疾患である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、神経障害は、ドーパミン作動性経路に関連する。他の例では、神経障害は、ドーパミン作動性経路に関連しない。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、神経障害は、認知機能障害である。一つの例では、認知機能障害は、失読症である。他の例では、認知機能障害は、注意力の欠如、意識の欠如、集中力の欠如、又は関心の欠如を含む。その他の例では、認知機能障害は、軽度の認知障害又は加齢による記憶障害を含む。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、神経障害は、情緒障害である。一つの例では、情緒障害は、躁、鬱、緊張、パニック、不安、又は気分変調を含む。他の例では、情緒障害は、季節性気分障害を含む。その他の例では、情緒障害は、双極性障害を含む。

他の例において、神経障害は、精神病である。その他の例において、神経障害は、鬱病である。一つの例では、鬱病は、内因性鬱病である。その他の例では、鬱病は、大鬱病性障害である。また他の例では、鬱病は、不安鬱病である。また他の例では、鬱病は、双極性鬱病である。各鬱病のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、神経障害は、運動失調及びフリードライヒ失調を含んだ群から選ばれるものである。

他の例において、神経障害は、運動障害である。運動障害は、その他の例では、遅発性ジスキネジー、ジストニア、又はトゥレットシンドロームを含んでいる。また他の例では、運動障害は、当分野において知られているその他の運動障害である。

他の例において、神経障害は、脳血管障害である。脳血管障害は、一つの例では、低酸素症に起因する。他の例では、脳血管障害を引き起こし得るその他の原因が引き金となる。また他の例では、脳血栓症である。さらに他の例では、脳血管障害は、虚血である。

他の例において、神経障害は、行動症状である。その他の例において、神経障害は、神経症候群である。また他の例では、行動症状又は神経症候群は、脳損傷、脊髄損傷、又は酸素欠乏症の後に続く。

他の例において、神経障害は、末梢神経系障害である。その他の例では、末梢神経系障害は、神経筋障害、重症筋無力症、又はポリオ後症候群である。また他の例では、末梢神経系障害は、当分野で知られているその他の末梢神経系障害である。さらに他の例では、神経筋障害は、筋ジストロフィーである。

ここに記載した神経障害の各タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースを投与することによって、対象者の脳細胞の神経伝達物質合成能力を向上又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞の神経伝達物質合成能力向上又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を投与することによって、対象者の脳細胞の神経伝達物質合成能力を向上又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞の神経伝達物質合成能力向上又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースを投与することによって、対象者の脳細胞又は神経細胞のシナプス内で効果的な量の神経伝達物質を反復放出させる能力を向上又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞シナプス内神経伝達物質効果的量反復放出能力向上又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を投与することによって、対象者の脳細胞又は神経細胞のシナプス内で効果的な量の神経伝達物質を反復放出させる能力を向上又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞シナプス内神経伝達物質効果的量反復放出能力向上又は強化方法を提供する。ここに記載するように、本発明の知見は、ウリジンが、神経伝達物質を合成し反復放出する神経能力を強化することを示している（実験例７）。実験例１５のデータは、さらに、当該ウリジンの効果が、コリンの含有により強化されることを示している。

一つの例において、本発明の方法により強化された放出は、神経細胞の刺激に続いて起こる。一つの例では、強化された放出は、神経細胞の脱分極に続いて起こる。一つの例では、強化された放出は、基底神経伝達物質放出である。一つの例では、神経細胞の刺激は、神経細胞のカリウムイオンへの暴露を含む。他の例では、神経細胞の刺激は、当分野で知られているその他の神経刺激手法を含む。神経刺激と神経伝達物質放出を評価する手法は、当分野で良く知られており、たとえば、Bewick GS, J Neurocytol. 32: 473-87,2003に記載されている。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、シナプスに隣接した神経細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる、シナプス内神経伝達物質レベル向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、シナプスに隣接した神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる、シナプス内神経伝達物質レベル向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、刺激に対する神経の感度を向上させる、神経刺激感度向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、刺激に対する神経の感度を向上させる、神経刺激感度向上方法を提供する。

一つの例において、レベル又は活性度あるいは放出が本発明の方法によって影響を受ける神経伝達物質は、アセチルコリンである。他の例では、神経伝達物質はドーパミンである。その他の例では、神経伝達物質はセロトニンである。また他の例では、神経伝達物質は５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）である。また他の例では、神経伝達物質はＧＡＢＡ（アミノ酪酸）である。また他の例では、神経伝達物質は当分野で知られているその他の神経伝達物質である。各神経伝達物質のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースを投与することにより、脳細胞又は神経細胞によるホスファチジルコリン（ＰＣ）の生成を刺激する、対象者脳細胞又は神経細胞ＰＣ生成刺激方法を提供する。

他の例において、本発明は、対象者あるいは脳細胞又は神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を投与することにより、脳細胞又は神経細胞によるホスファチジルコリン（ＰＣ）の生成を刺激する、対象者脳細胞又は神経細胞ＰＣ生成刺激方法を提供する。ここに記載するように、本発明の研究結果は、ウリジンがＰＣ前駆体のＣＤＰ−コリンの合成を強化する（実験例６）ことを示している。また実験例１５のデータはさらに、当該ウリジンの効果がコリンの含有により強化されることを示している。

他の例において、本発明は、細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、細胞膜の成分の量又は合成を刺激又は強化する、細胞膜成分量又は合成刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、細胞膜の成分の量又は合成を刺激又は強化する、細胞膜成分量又は合成刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明の方法により合成が強化される成分はＰＣである。他の例では、当該成分はグリセロリン脂質である。その他の例では、当該成分はホスファチジン酸である。また他の例では、当該成分はＰＥである。また他の例では、当該成分はレシチンである。また他の例では、当該成分はＰＩである。また他の例では、当該成分はＰＳである。また他の例では、当該成分は、２−リソレシチン、プラスマロゲン、コリンプラスマロゲン、ホスファチジルグリセロール、コリンジホスファチジルグリセロール、コリンスフィンゴリピド、又はコリンスフィンゴミエリンである。また他の例では、当分野で知られているその他のリン脂質である。各リン脂質のタイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、リン脂質前駆体の量又は合成を刺激又は強化する、リン脂質前駆体量又は合成刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、リン脂質前駆体の量又は合成を刺激又は強化する、リン脂質前駆体量又は合成刺激又は強化方法を提供する。他の例では、リン脂質前駆体はＣＤＰコリンである（実験例６）。その他の例では、リン脂質前駆体はＣＴＰである。また他の例では、リン脂質前駆体はイノシトールである。また他の例では、リン脂質前駆体はコリンである。また他の例では、リン脂質前駆体はグリセロールである。また他の例では、リン脂質前駆体はアセテートである。また他の例では、リン脂質前駆体は、当分野で知られているその他のリン脂質前駆体である。各リン脂質が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、対象者にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の生成を刺激又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞膜生成刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、対象者にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の生成を刺激又は強化する、対象者脳細胞又は神経細胞膜生成刺激又は強化方法を提供する。

一つの例において、膜は神経突起膜である。他の例では、膜は樹状突起膜である。その他の例では、膜は軸索膜である。また他の例では、膜は当分野で知られているその他の膜である。各膜タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、細胞膜の量又は合成の刺激は、リン脂質の合成を刺激すること又は強化することにより達成される（実験例６）。他の例では、神経細胞膜の量又は合成の刺激又は強化は、リン脂質前駆体の合成を刺激又は強化することにより達成される（実験例６）。その他の例では、リン脂質又はその前駆体の合成の刺激又は強化は、神経細胞膜の量又は合成を刺激することに部分的に起因する。また他の例では、本発明の組成物は、リン脂質又はその前駆体の合成を刺激又は強化することなく膜の量又は合成を刺激する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

脳細胞膜又は神経細胞膜の生成を評価する手法は、当分野で良く知られている。他の例では、膜生成は、神経突起伸長又は分岐のレベルを測定することで評価される（実験例９）。その他の例では、膜生成は、膜マーカープロテインのレベルを測定することで評価される（実験例８）。また他の例では、膜生成は、膜前駆体の合成を測定することで評価される。また他の例では、膜生成は、ウリジン治療の前と後で膜の量を測定することにより評価される。また他の例では、膜生成は、膜の代謝回転の生物学的指標を測定することで評価される。指標や細胞膜の代謝回転は当分野で良く知られており、たとえば、Das KP et al, Neurotoxicol Teratol 26(3): 397-406, 2004 に記載されている。膜生成を評価する各方法が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させ、リン脂質又はその前駆体の合成を強化することによって、神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化する、神経細胞神経突起伸長刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させ、リン脂質又はその前駆体の合成を強化することによって、神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化する、神経細胞神経突起伸長刺激又は強化方法を提供する。ここに記載するように、本発明の研究結果は、ウリジンが神経突起の伸長及び分岐を強化することを示す（実験例９）。実験例１５のデータはさらに、当該ウリジンの効果がコリンの含有により強化されることを示している。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、神経細胞の神経突起数を向上させる、神経細胞神経突起数向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を接触させることにより、リン脂質又はその前駆体の合成を強化して、神経細胞の神経突起数を向上させる、神経細胞神経突起数向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースを接触させることにより、神経細胞の神経突起分岐を刺激又は強化する、神経細胞神経突起分岐刺激又は強化方法を提供する。

他の例において、本発明は、神経細胞にウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物あるいはコリンを含む組成物を接触させることにより、神経細胞の神経突起分岐を刺激又は強化する、神経細胞神経突起分岐刺激又は強化方法を提供する。

一つの例において、本発明の方法のターゲットである細胞あるいは該方法で接触させる細胞は神経細胞である。他の例では、当該細胞は脳細胞である。その他の例では、当該細胞は、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方を含む組成物との接触で膜又はその成分の合成が強化されるその他の細胞である。また他の例では、当該細胞は、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方を含む組成物との接触で神経機能が強化されるその他の細胞である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明の方法の神経細胞、神経突起、又は脳細胞は、新たに分化したものである。他の例では、当該細胞は、新たに分化したものではない。一つの例では、“新たな分化”とは、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方の投与を開始する前の２４時間内に分化した神経を示す。他の例では、神経は投与前４８時間前に分化したものである。また他の例では、神経は投与前７２時間内に分化したものである。さらに他の例では、神経は投与前１週間内に分化したものである。その他の例では、“新たな分化”とは、本発明の組成物の投与を開始した後に分化を終えた神経を示す。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

神経分化を評価する手法は、当分野で良く知られており、たとえば、Contestabile A et al (Neurochem Int. 45: 903-14, 2004) に記載されている。そのような各手法が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースを対象者に投与することにより、組織、プラスマ、又は細胞におけるシチジンのレベルを向上させる、対象者の組織、プラスマ、又は細胞のシチジンレベル向上方法を提供する。

他の例において、本発明は、ウリジン又はウリジンソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することにより、組織、プラスマ、又は細胞におけるシチジンのレベルを向上させる、対象者の組織、プラスマ、又は細胞のシチジンレベル向上方法を提供する。他の例では、本発明は、対象者に本発明の組成物を投与して、対象者の組織、プラスマ、又は細胞におけるＣＴＰのレベルを向上させる方法を提供する。その他の例では、本発明は、本発明の組成物を投与して、対象者の組織、プラスマ、又は細胞におけるＣＤＰコリンのレベルを向上させる方法を提供する。また他の例では、本発明は、本発明の組成物を投与して、対象者の組織、プラスマ、又は細胞におけるシチジン、ＣＴＰ、又はＣＤＰコリンの誘導体のレベルを向上させる方法を提供する。また他の例では、本発明は、本発明の組成物を投与して、対象者の組織、プラスマ、又は細胞におけるシチジン、ＣＴＰ、又はＣＤＰコリンの代謝産物のレベルを向上させる方法を提供する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、組織は脳組織である。一つの例では、組織は神経組織である。他の例では、組織は脊髄組織である。また他の例では、組織は当分野で知られているその他の組織である。

一つの例において、細胞は脳細胞である。一つの例では、細胞は神経細胞である。他の例では、細胞は脊髄細胞である。また他の例では、細胞は当分野で知られているその他の細胞である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、本発明で投与されるウリジンは、ウリジン−５’−モノホスフェイト（ＵＭＰ）である。他の例では、ウリジンは、ウリジン−５’−ジホスフェイト（ＵＤＰ）である。その他の例では、ウリジンは、ウリジン−５’−トリホスフェイト（ＵＴＰ）である。また他の例では、ウリジンはＵＤＰグルコースである。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、ウリジン前駆体が本発明の方法で投与される。一つの例では、投与されるウリジン前駆体は、シチジン−５’−モノホスフェイトである。他の例では、投与されるウリジン前駆体は、シチジン−５’−ジホスフェイト（ＣＤＰ）である。その他の例では、投与されるウリジン前駆体は、ＣＤＰグルコースである。また他の例では、投与されるウリジン前駆体は、当分野で知られている薬理学的に許容されたウリジン前駆体、誘導体、又は代謝産物である。

他の例において、ウリジン誘導体が本発明の方法で投与される。“誘導体”とは、一つの例としては、ウリジンが対象者の体内で誘導体へ変換されるといったようにウリジンに化学的に関連する化合物を示す。他の例では、“誘導体”は、誘導体が対象者の体内でウリジンへ変換されるといったようにウリジンに化学的に関連する化合物を示す。一つの例では、変換は、一つ以上の安定した中間体を介して起こる。他の例では、変換は直接的に起こる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、ウリジン代謝産物が本発明の方法で投与される。

他の例において、ウリジン自身以外のウリジンベース化合物がウリジンソース又はウリジン前駆体として働く。これらは、いくつかの例において、藻類や、ウリジンホスフェイト又はアシル化ウリジンなどのウリジン塩のような、ウリジンリッチ（豊富な）食物又は食料品である。他の例では、たとえば米国特許５４７０８３８に記載されているような、ウリジンのアシル誘導体又はそれらの混合物の治療上又は薬学上有効な投与量が投与される。

他の例において、ウリジンソースは、シチジン−ジホスホコリン（ＣＤＰコリン；シチコリン）である。シチコリンは、１：１モル比でウリジンと同量のコリンを含んでいるが、一つの例では、対象者に必要な全コリンを供給するには十分でない。したがって、この例において、シチコリンは、対象者に必要な全ウリジンのソース及びコリンの一部として働く。

他の例において、ウリジン前駆体、誘導体、又はソースの塩が本発明の方法で使用される。一つの例では、塩は、ＵＭＰ二ナトリウム（実験例２，３）である。他の例では、塩は、その他の薬理学上許容されるウリジン前駆体又は誘導体の塩である。また他の例では、投与される組成物は、単独有効成分としてウリジンあるいはその前駆体又は誘導体の塩を含む。各ウリジン塩が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、上記のようなウリジン関連化合物の２以上の混合物が投与される。ウリジン前駆体、誘導体、代謝産物、又はソースの各タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

ここで使用する“ウリジン”は、一例として上記のような、ウリジンホスフェイト、ウリジン前駆体、ウリジン代謝産物、ウリジンベース化合物、又はそれらの塩を示す。他の例では、“ウリジン”は、当分野で知られているウリジン又は関連化合物を示す。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、ウリジン、その誘導体、ソース、又は前駆体は、一日におおよそ２０ｍｇから５０ｇまでの間の投薬量で本発明の方法において投与される。他の例では、ウリジン又は関連化合物は、一日におおよそ５０ｍｇ〜３０ｇの投薬量で投与される。また他の例では、投薬量は、一日あたりおおよそ、７５ｍｇ〜２０ｇ、１００ｍｇ〜２０ｇ、１００ｍｇ〜１０ｇ、２００ｍｇ〜８ｇ、４００ｍｇ〜６ｇ、６００ｍｇ〜４ｇ、８００ｍｇ〜３ｇ、１〜２．５ｇ、１．５〜２ｇ、５ｍｇ〜５ｇ、５ｍｇ〜５０ｇである。各投薬量又は投薬量範囲が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、本発明の方法で投与されるコリンは、コリン塩である。一つの例では、塩はコリンクロライド（塩化コリン）である。他の例では、塩は酒石酸水素コリンである。さらに他の例では、塩はステアリン酸コリンである。また他の例では、塩は、コリンアルホスセラート、デヒドロコール酸コリン、コリンシドロゲンシトラート、又はサリチル酸コリンである。また他の例では、塩は、当分野で知られているその他のコリン塩である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、コリンは、コリンエステルなどのコリンベース化合物である。

他の例において、コリンは、コリンに解離する化合物である。一つの例では、該化合物はスフィンゴミエリンである。他の例では、該化合物はアシルグリセロホスホコリンである。また他の例では、該化合物はレシチンである。さらに他の例では、該化合物はリゾレシチンである。また他の例では、該化合物はグリセロホスファチジルコリンである。その他の例において、これらコリン関連化合物の２以上の混合物が投与される。

ここに使用する“コリン”とは、一つの例において、コリンリン酸塩、コリン前駆体、コリン代謝産物、コリンベース化合物、又は上記物質の塩を示す。他の例では、“コリン”は、当分野で知られているコリン又は関連化合物を示す。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、コリン又はコリン関連化合物は、対象者の血液又は脳内で少なくとも２０〜３０ナノモルのコリンレベルが達成されるような手法及び投薬量で投与される。別の例では、１０〜５０ナノモルのコリンレベルが達成される。その他の例では、５〜７５ナノモルのコリンレベルが達成される。さらに他の例では、２５〜４０ナノモルのコリンレベルが達成される。また他の例では、３０〜３５ナノモルのコリンレベルが達成される。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、コリン、その誘導体、ソース、又は前駆体は、一日に２０ｍｇ〜５０ｇの投薬量で本発明の方法において投与される。他の例では、コリン又は関連化合物は、一日に、おおよそ５０ｍｇ〜３０ｇ、７５ｍｇ〜２０ｇ、１００ｍｇ〜２０ｇ、１００ｍｇ〜１０ｇ、２００ｍｇ〜８ｇ、４００ｍｇ〜６ｇ、６００ｍｇ〜４ｇ、８００ｍｇ〜３ｇ、１〜２．５ｇ、１．５〜２ｇ、５ｍｇ〜５ｇ、５ｍｇ〜５０ｇの投薬量で投与される。各投薬量範囲が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、本発明の組成物は、治療患者の母集団の少なくとも１０％で期待の効果が得られるような用量で投与される。別の例では、治療患者の少なくとも２０％に効果が現れる用量である。さらに他の例では、治療患者の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％に効果が現れる。また他の例では、患者の９０％以上に効果が現れる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、本発明の方法の対象者は哺乳類である。他の例では、対象者は人間である。別の例では、対象者は齧歯類又は事件動物である。その他の例では、対象者は男性である。また他の例では、対象者は女性である。さらに他の例では、対象者は当分野で知られているその他の種類の対象である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、“投与する”あるいは“投与”とは、対象者を本発明の化合物に接触させる状態に置くことを言う。他の例では、投与は、本発明の組成物を飲み込む又は吸収することを含む。その他の例では、投与のステップとして、調合剤や栄養剤などを利用する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、投与は対象者により実施される。他の例では、投与は介護者により実施される。その他の例では、投与は第三者により実施される。各投与タイプが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、追加の治療用化合物が本発明の方法の一部として対象者に投与される。別の例では、ウリジン、その前駆体、誘導体、又はソースが組成物における単独の有効成分である。また他の例では、ウリジン、その前駆体、誘導体、又はソースと、コリン、その前駆体、誘導体、又はソースと、が組成物における単独の有効成分である。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、追加の治療用化合物は、ベンジルバルビツレートやその誘導体などのウリジンホスホリラーゼ阻害因子として働く薬である。他の例では、該化合物は、ウリジンの効能を向上させる薬である。別の例では、該化合物は、ジラゼプやヘキソベンジンなどのウリジン分泌阻害化合物である。さらに他の例では、該化合物は、Ｌ−ウリジン、Ｌ−２’，３’−ジデオキシウリジン、及びＤ−２’，３’−ジデオキシウリジンなどのウリジン腎輸送競合物である。また他の例では、該化合物は、リン脂質の生成においてウリジンと共用作用するように働く薬である。また他の例では、該化合物は、米国特許５７２３４４９及び５５６７６８９に記載されているようなＬ−ウリジン、Ｌ−２’，３’−ジデオキシウリジン、及びＤ−２’，３’−ジデオキシウリジン、又はそれらの混合物などの腎クリアランスにおいてウリジンと競合する化合物である。また他の例では、該化合物は、対象者に有益なその他の化合物である。

他の例において、本発明の方法は、神経細胞、ニューロン、又は脳細胞のＰ２Ｙレセプタを刺激する手法により上記効果の一つを生じる。別の例では、その上記効果の一つは、神経細胞又はニューロンのＰ２Ｙレセプタ刺激の結果として部分的に生じる。さらに他の例では、上記効果の一つは、他のタイプの細胞のＰ２Ｙレセプタを刺激する手法により部分的に又は全体的に生じる。また他の例では、上記効果の一つは、Ｐ２Ｙレセプタの刺激なしで生じる。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、Ｐ２Ｙレセプタの刺激は、本発明の組成物におけるウリジン又は関連化合物により仲介される。他の例では、ウリジンは、細胞でＰ２Ｙレセプタを刺激する第２の化合物に変換される。一つの例では、その第２の化合物は、ウリジン−５’−トリホスフェイトである。別の例では、第２の化合物は、ウリジン、その誘導体、又はソースの分野で知られている代謝産物である。各化合物の例が本発明の個々の実施形態に相当する。他の例において、ウリジン、その誘導体、又はソースは、細胞内外で第２の化合物に変換される。別の例では、ウリジン、その誘導体、又はソースは、第２の化合物に変換された後に細胞から分泌される。その他の例では、ウリジン、その誘導体、又はソースは、第２の化合物に変換された細胞から分泌された後に他の細胞と接触し、該他の細胞においてＰ２Ｙレセプタを刺激する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

Ｐ２Ｙレセプタは、血小板活性化及びその他の生物学的機能に関与するとして知られたレセプタのファミリーである。それらは、Mahaut-Smith MP et al, Platelets. 2004 15:131-44, 2004 に概説されている。

一つの例において、本発明のＰ２ＹレセプタはＰ２Ｙ２レセプタである。他の例では、Ｐ２ＹレセプタはＰ２Ｙ４レセプタである。別の例では、Ｐ２ＹレセプタはＰ２Ｙ６レセプタである。また他の例では、Ｐ２Ｙレセプタは、当分野で知られているその他のＰ２Ｙレセプタである。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、Ｐ２Ｙレセプタはセカンドメッセンジャーを刺激する。一つの例では、セカンドメッセンジャーはＧアルファプロテインである。他の例では、セカンドメッセンジャーはＧアルファ（ｑ）プロテインである。別の例では、セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。その他の例では、セカンドメッセンジャーは当分野で知られているその他のセカンドメッセンジャーである。セカンドメッセンジャー及びこれらに結びついたシグナル伝達経路は、当分野で良く知られており、たとえば、Ferguson S. Pharm Rev 53: 1-24, 2001; Huang E et al, Ann Rev Biochem 72: 609-642, 2003; Blitterswijk W el al, Biochem. J. 369: 199-211, 2003 にも記載されている。各セカンドメッセンジャーが本発明の個々の実施形態に相当する。

他の例において、セカンドメッセンジャーは、ホスホリパーゼＣ酵素を刺激し、細胞内カルシウムレベルを調節し、また、プロテインキナーゼＣ活性を向上させる。一つの例では、上記伝達経路の一つ以上が膜産生を刺激する。他の例では、セカンドメッセンジャーが、膜産生を刺激する他の細胞経路を調節し又は刺激する。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、本発明の組成物におけるウリジン又は関連化合物は、Ｐ２Ｙレセプタ以外のレセプタを刺激する。

本発明の方法の他の例において、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方は、対象者の血流で脳細胞又は神経細胞へ運ばれる。他の例では、当該物質は、拡散によって対象者の脳細胞又は神経細胞に運ばれる。別の例では、当該物質は、能動輸送によって対象者の脳細胞又は神経細胞へ運ばれる。その他の例では、当該物質は、対象者の脳細胞又は神経細胞に直接接触させるなどの手法により対象者に投与される。各具体例が本発明の個々の実施形態に相当する。

一つの例において、“調合剤”は、治療効果のある量の有効成分、すなわちウリジン及びコリンのいずれか又は両方を、薬剤的に許容されるキャリア又は希釈薬と一緒にすることを示す。“治療効果のある量”とは、一つの例では、所定の条件及び投薬計画に対して治療効果をもたらす量のことを示す。

他の例において、調合剤は、非経口投与、腫瘍近傍投与、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、膣内投与、又は腫瘍内投与のような、当業者が知っている各種手法で対象者に投与される。

他の例において、調合剤は経口投与されるので、固体や液体製剤などの経口投与に適した形態とすることが想定される。適した固体経口製剤は、たとえば、タブレット、カプセル、丸剤、顆粒、小丸剤その他を含む。適した液体経口製剤は、液剤、懸濁剤、溶液剤、乳濁剤、油剤その他を含む。本発明の一つの例では、ウリジン及びコリンを含む組成物は、カプセル製剤の形態をとる。この例に従うと、本発明の組成物は、活性化合物及び不活性キャリア又は希釈剤に加えてハードゼラチンカプセルを含む。

他の例において、調合剤は、液体製剤の静脈注射、動脈注射、又は筋肉注射により投与される。適した液体製剤は、液剤、懸濁剤、溶液剤、乳濁剤、油剤その他を含む。一つの例では、調合剤は、静脈投与するために適した形態の製剤とされる。他の例では、調合剤は、動脈投与するために適した形態の製剤とされる。その他の例では、調合剤は、筋肉内投与するために適した形態の製剤とされる。

さらに、他の例において、調合剤は、たとえば肛門坐剤や尿道坐剤のような坐剤として投与される。他の例では、調合剤は、小丸剤の皮下移植によって投与される。その他の例では、小丸剤は、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方の一定期間放出コントロールを可能とする。

薬剤的に許容されるキャリア又は希釈剤は、当業者には良く知られている。一つの例では、キャリア又は希釈剤は、固体製剤用の固体キャリア又は希釈剤、液体製剤用の液体キャリア又は希釈剤、あるいはこれらの混合である。

固体キャリアや希釈剤は、他の例において、ガム、澱粉（たとえばコーンスターチ、プレゼラチン化スターチ）、糖（たとえば乳糖、マンニトール、スクロース、右旋性グルコース）、セルロース系物質（たとえば微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（たとえばポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、又はこれらの混合物を含む。

液体製剤に対して薬剤的に許容されるキャリアは、他の例において、水性の又は非水性の液剤、懸濁剤、乳濁剤、又は油剤である。非水性溶剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。水性キャリアは、食塩水及び緩衝媒体を含んだ水、アルコール溶液や水溶液、乳剤、又は懸濁液を含む。油剤の例としては、石油、動物油、植物油、又は合成油、たとえば落花生油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ひまわり油、魚肝油である。

他の例において、組成物はさらに、結合剤（たとえばアカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（たとえばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、ナトリウムスターチグリコレート）、各種ｐＨ及びイオン強度の緩衝剤（たとえばTris-HCL、アセテート、リン酸塩）、表面吸収防止用のアルブミンやゼラチンなどの添加剤、洗剤（たとえばTween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（たとえばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定剤（たとえばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（たとえばカルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（たとえばアスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑剤（たとえばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動補助剤（たとえばコロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（たとえばフタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（たとえばカルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、高分子塗膜（たとえばポロクサマー又はポロクサミン）、被覆及び皮膜形成剤（たとえばエチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリル酸）、補助薬を含む。

他の例において、ここに提供された調合剤は、放出コントロール組成物、すなわち、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方が投与後一定期間放出される組成物である。放出コントロール又は持続組成物は、脂溶性持続製剤（たとえば脂肪酸、ろう、油）の処方を含む。その他の例では、組成物は、即時放出組成物、すなわち、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方のすべてが投与後直ぐに放出される組成物である。

他の例において、調合剤は、放出コントロールシステムで誘導される。たとえば、組成物は、静脈内注射、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮貼付、リポソーム、又はその他の投与方式を使用して投与される。一つの例では、ポンプが使用される（Langer, supra; Sefton, CRC Crit, Ref. Biomed Eng. 14:201 (1987)、Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)、Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989) 参照）。他の例では、ポリマー材料が使用される。別の例では、放出コントロールシステムは、治療標的、すなわち脳の直ぐ近くに置かれ、この場合、全身投薬の分画だけが必要とされる（たとえばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 参照）。その他の放出コントロールシステムは、Langer (Science 249:1527-1533 (1990) による概説で話題にされている。

有効成分を含む調合剤の調合は、当分野で良く知られており、たとえば、混合、顆粒化、又はタブレット化プロセスである。有効治療成分は、薬剤的に許容され且つ有効成分に適合する賦形剤と混合されることが多い。経口投与については、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方、又は塩、エステル、Ｎ−酸化物その他の生理学的に容認される誘導体が、当該目的で慣用されている賦形剤、安定剤、又は不活性希釈剤のような添加剤と混合され、そして、慣用手法により、タブレット、コートタブレット、ハード又はソフトゼラチンカプセル、液剤、アルコール又は油性溶液のような経口投与に適した形態とされる。非経口投与については、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方、又は塩、エステル、Ｎ−酸化物その他の生理学的に容認される誘導体が、必要ならたとえば可溶化剤などの慣用され且つ当該目的に適した薬剤と共に、液剤、懸濁剤、又は乳濁剤とされる。

有効成分は、不活性の薬剤的に許容される塩の形態として組成物に処方することができる。薬剤的に許容される塩は、たとえば塩酸やリン酸のような無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸その他の有機酸で形成される酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基で形成）を含む。遊離カルボキシル基から形成される塩は、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄のような無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインその他のような有機塩基を利用して抽出可能である。

医薬として使用するために、ウリジン及びコリンのいずれか又は両方の塩は、薬剤的に許容される塩である。その他の塩は、一つの例において、本発明に係る組成物又はその薬剤的に許容される塩の調合に有用である。本発明の組成物の薬剤的に許容される適した塩は、たとえば、本発明に係る組成物の液剤と、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、又はリン酸のような薬剤的に許容される塩の液剤と、を混合することにより形成され得る酸付加塩を含んでいる。

実験例

実験例１
チロシン干渉のないＨＰＬＣによるシチジンの測定

材料及び方法

試料調製
ヘパリン化プラスマの１ミリリットル（ｍＬ）サンプルに内部標準として使用する１μｇフルオロウリジンを入れ、そしてメタノール（５ｍＬ）を加えてタンパク質を除いた。サンプルは、遠心分離し、凍結乾燥し、０．２５Ｎ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．８）の５ｍＬ中で再生した後、直ちにホウ素アフィニティカラムで精製した。

ホウ素アフィニティカラム
全ステップは４℃で実施した。二つの５ｍＬ酢酸アンモニウム洗剤と共にホウ素アフィニティカラム（Affigel-601, Bio-Rad）を準備し、サンプルを適用し、そしてカラムを酢酸アンモニウムで重ねて洗浄した後に、０．１Ｎギ酸（７ｍＬ）でヌクレオシドを溶出した。溶出液は凍結乾燥してから、ＨＰＬＣ分析用に１００μＬ水で再生した。ホウ素アフィニティカラムは、ヌクレオチド塩基アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、及びウリジンを含む多数の生体分子を拘束する。

ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ分析は、Rainin Dynamax Microsorb C18 カラム（３μｍパッキング、４．６×１００ｍｍ）を装備したBeckman System Gold 装置（Beckman Instruments）を使用して室温で実施した。標準ＨＰＬＣ法は、Lopez-Coviella et al, (J. Neurochem 65: 889-894, 1995) に記載されている。修正ＨＰＬＣ用に、０．００４Ｎリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ５．８）及びギ酸に代わる０．１％メタノールを含み、１ｍＬ／分の流量で３５°に加熱したアイソクラチック溶離バッファを使用した。

実験結果

ヌクレオシドを測定するための標準ＨＰＬＣ法では、ウリジンとシチジンの分かれたピークが得られたが、人のプラスマサンプルで示したように（図１）、シチジンとチロシンのピークの一致がシチジンレベルの正確な測定を邪魔する。チロシンは、プラスマや脳脊髄液（ＣＳＦ）などのほとんどの生体液中に存在する。本実験例では、シチジンとチロシンのピークを区別する修正ＨＰＬＣ法を使用し、シチジンレベルの正確な測定を可能にした（図２）。

実験例２
ＵＭＰの経口投与による人のプラスマウリジンレベル向上

材料及び実験方法

研究計画
８人の健康な対象者（男性５人、女性３人、２７〜６７歳）に対し、少なくとも三日間の休薬期間をあけて三日、投薬量を徐々に上げながら（初日５００ｍｇ、中日１０００ｍｇ、最終日２０００ｍｇ）、各日とも一晩中飲食を控えた後の朝７時〜８時に二ナトリウムＵＭＰ（Numico, Wageningen, NL）を飲むように指示した。全対象者に昼食は摂らせた。血液サンプルは、８時間の間でヘパリン化チューブに採血した。プラスマは、メタノールで処理してプロテインを沈殿させ、クロロホルムで抽出し、そして、水層のアリコートを凍結乾燥して水で溶解し、紫外検出を伴うＨＰＬＣにより測定した。

統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳ１２．０で実行した。データは、mean±SEM （平均値の標準誤差）として表した。文中に詳細を示したように、統計効果を評価するために、対応のないスチューデントｔ検定、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、繰り返しＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。適切な場合にTukey's HSD事後解析を実施した。有意水準はｐ＜０．０５に設定した。

実験結果

５００，１０００，２０００ｍｇのＵＭＰを経口投与した対象者の血中ウリジンレベルを、ベースラインと、投薬後１時間、２時間、４時間、８時間で測定した。プラスマウリジンレベルは、実験例１同様に分析した。プラスマウリジンレベルは、用量依存的に経口ＵＭＰに応じて上昇し、８時間でベースラインレベルに戻った（図３）。

実験例３
ウリジン又はＵＭＰの経口投与によるジャービルのプラスマウリジンレベル向上

材料及び実験方法

実験計画
８〜９匹のオスのジャービル（６０〜８０ｇ）の各グループに一晩中餌を与えず、ウリジン（Sigma, St. Louis, MO; ２５０ｍｇ／ｋｇ体重）（図４）又は二ナトリウムＵＭＰ（１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重、強制飼養による２５０ｍｇ／ｋｇウリジンと同等の投薬）（図５）を投与し、１時間後にTelazol麻酔下で断頭犠牲にした。図６では、体重の０、０．１、０．５、２．５％のいずれかの量を含んだ食物（Harlan Teklad, Madison, WI）を４週間ジャービルに食べさせ、一晩絶食してから、同成分の最後の食事を摂らせた１時間後に犠牲にした。首から収集した血を、ＥＤＴＡを含んだチューブに採取し、実験例２と同様に処理した。

実験結果

ウリジンの経口投与がプラスマウリジンレベルを上昇させ得るかどうか解明するために、２５０ｍｇ／ｋｇシチジン又はウリジンを強制飼養でジャービルに摂取させた６０分後、実験例１同様の手法にてプラスマウリジンレベルを評価した。シチジン及びウリジン食の両方において、シチジンやウリジンを含まない食物を摂取したコントロールグループに対し統計的に有意なマージンをもって、プラスマウリジンレベルが向上した。ウリジン食が、シチジン食以上に、おおよそ３目盛高いプラスマウリジンレベルの結果を示している。

プラスマウリジンレベル向上の起こる時間を評価するため、別の実験において、ジャービルに、水か、又は１ミリモル（ｍｍｏｌ）ＵＭＰ／ｋｇ体重を投与し、６０分内の各時間で犠牲にしてプラスマウリジンレベルを評価した。プラスマウリジンレベルは投与後１０分内で向上し、３０分までの間にピークレベルに達した（図５）。

別の実験いおいて、ジャービルには、コントロール食か、又は０．１％、０．５％、２．５％ＵＭＰ含有食のいずれかを与えた。１時間後、プラスマウリジンレベルを評価した。図６に示すように、プラスマウリジンレベルは、ＵＭＰ食に応じて用量依存的に向上した。これらの結果は、ウリジンの経口投与で血流中に取り入れられることを示す。

実験例４
ウリジン又はＵＭＰの経口投与によるジャービルの脳ウリジン向上

材料及び方法

ジャービル脳組織処理
断頭後の頭蓋から脳を即座に取り出し、ドライアイスで凍結、８０％メタノールで均質化、遠心分離、凍結乾燥、そして実験例３同様に分析した。

実験結果

ウリジンの経口投与で脳ウリジンレベルが上昇し得るかどうか解明するため、実験例３の第１実験からジャービルの脳を均質化し、ウリジンレベルを分析した。コントロール動物に比較し、シチジンの経口投与は脳ウリジンレベルを２倍向上させる結果をもたらすが、ウリジンの経口投与はそれ以上に脳ウリジンレベルを３倍向上させる結果を示した（図７）。各グループ間の違いは統計的に有意であった。

脳ウリジンレベル向上の起こる時間を評価するため、実験例３の第２実験のジャービルで脳ウリジンレベルを評価した。脳ウリジンレベルはウリジン投与後１０分内で向上し、３０分内でピークレベルに達した。プラスマウリジンレベルで観察された結果に類似している（図８）。これらの結果は、ウリジンの経口投与が脳まで効率的に運ばれることを示している。

実験例５
脳におけるウリジンの容易なシチジン変換

別の実験において、２５０ｍｇ／ｋｇ体重のウリジンを経口投与したジャービルにつき、６０分後にシチジン及びウリジンのプラスマ及び脳レベルを評価した。コントロール動物に対する倍増が計測され、図９Ａ（プラスマ）及び図９Ｂ（脳）に示している。各ケースにおいて、シチジンの増分が、ウリジンの増分を１００％として示されている。これらの結果は、（ａ）血流中のウリジンが脳に運ばれ、（ｂ）ウリジンの代謝処理が脳内とプラスマ内とで異なる、特に、プラスマ内よりも効率的にシチジンへ変換されることを表している。

実験例６
脳及び神経細胞株内におけるリン脂質前駆体ＣＤＰコリンのウリジンによるレベル向上

方法

実験計画
データは、グループサイズが５〜１６匹の範囲の動物による３実験からプールされた。オスのジャービル（６０〜８０ｇ）に強制飼養でＵＭＰ（１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重）を与え、指示時間で犠牲にした。実験例４同様に、脳均質化後、プロテイン沈殿、凍結乾燥し、サンプルをＨＰＬＣ−ＵＶで分析した。

ＣＤＰコリンレベルの評価
脳組織又は細胞はメタノール／クロロフォルム（１：２ｖｏｌ／ｖｏｌ）で溶解し、遠心分離後、水相を真空乾燥してから１００〜２００μＬ水で再懸濁し、イオン交換カラム（Alltech Hypersil Aps-2,5 μM, 250 x 4.6 mm）でＨＰＬＣにより分離した。ＣＤＰコリンは、４０分でＵＭＰのように近接して共に溶出する物質に対するＣＤＰコリンの分解能を向上させるNaH_２PO_４バッファＡ（１．７５ｍＭ NaH_２PO_４, ｐＨ２．９）及びＢ（５００ｍＭ, ｐＨ４．５）の直線傾斜で溶出した。ＣＤＰコリンに対する滞留時間は９．５分だった。個々のヌクレオチドピークは３８０ｎｍのＵＶ吸収により検出され、選択サンプルにヌクレオチド標本を追加した真正標本の位置との比較で識別された。

ＰＣ１２細胞
ＰＣ１２細胞は、３７℃で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補った最小必須培地（ＭＥＭ；Invitrogen, Carlsbad, CA）で保持される。実験培養は、テスト化合物有り又は無しで、５０ｎｇ／ｍｌ mouse ２．５Ｓ（２．５ subunit）ＮＧＦ及び１％ＦＢＳを含む培地で２又は４日間であった。ＮＧＦ及びＦＢＳはInvitrogenより得られた。

実験結果
脳内リン脂質前駆体レベルに対する経口投与ウリジンの効果を評価するために、実験例３の第２実験によるジャービットの脳を、ケネディー経路を介したリン脂質生合成の重要中間体、ＣＤＰコリンのレベルについて分析した。ＣＤＰコリンのレベルは、ＵＭＰ投与後３０分間で直線的に（回帰分析、ｒ＝０．９８、ｐ＜０．０２）顕著に上昇下(図１０）。

神経細胞におけるウリジンのＣＤＰコリン変換を直接的に示すため、神経細胞分化能をもつ細胞株のＰＣ１２細胞を、ウリジンで処理し、ＣＤＰコリンの細胞内レベルを測定した。ウリジン処理により、５０分後のＣＤＰレベルに統計的に有意な向上が結果として得られた（図１１）。これらの結果は、脳へ運ばれた後、ウリジンがおそらく中間体ＣＴＰを経てＣＤＰコリンのようなリン脂質前駆体へ変換され、その結果、脳細胞内リン脂質前駆体合成の向上により認知機能が増補されることを示している。

実験例７
ＵＭＰの経口投与による加齢ラット脳内の神経伝達物質放出向上

方法

動物及びＵＭＰ補助食
マイクロダイアリシスの時点で２２〜２４ヶ月のオスの中年Fisher 344ラットを、National Institute on Aging (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolice, IN) から入手した。ラットは、標準の飼育コンディションで個々に飼育し、１２時間の昼夜サイクルに晒しつつ自由摂食で給餌した。各ラットは、おおよそ５００ｍｇ／ｋｇ／日のＵＭＰ・２Ｎａ（ウリジンのＬＤ５０（腹腔）は約４．３ｇ／ｋｇ）を摂取した。

ラットは、コントロール実験食（Teklad Global 16% protein rodent diet, TD.00217, Harlan Teklad, Madison）、又はＵＭＰ・２Ｎａ^＋（2.5%, TD.03398, UMP・2Na^＋; Numico Research, the Netherlands）を補強した該実験食を６週間摂食する前に、７日以上施設に順応させた。

ラットには、到着から少なくとも７日後まで実験食を与えなかった。そして彼らの体重を、摂食開始時（ｔ＝０）、１、２、４、６周後の時点で測った。ｔ＝０の時点で、ラットをランダムに二つのグループに分けた。当該グループ間に有意な体重差はなく（Ｆ_１，１１＝３．０３，ｐ＞０．０５）、平均体重は４５５±５（Ｎ＝１３ラット）であった。数週間の繰り返し測定で、対象内因子として摂食期間（０、１、２、４、６周）による有意な体重変化（Ｆ_４，４４＝２．６５，ｐ＜０．０５）が見られたが、ＵＭＰ食（対コントロール）及びＵＭＰ×時間の相互関係のいずれも体重に影響しなかった（それぞれＦ_１，１１＝０．０１，Ｆ_４，４４＝１．２５、両者ｐ＞０．０５）。

本実験例に記載した実験は二回行われ、そのそれぞれで、７匹のコントロールラットと９匹のＵＭＰ食投与ラットを使った。

薬品及び液剤
ドーパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニール酢酸（ＤＯＰＡＣ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、及び３，４−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ、internal standard）をSigma（St. Louis, MO）から購入し、ＨＣｌＯ_４（０．１Ｍ）に溶かして１ｍＭ原液を作成して、アリコートを−８０℃にキープした。塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）をFort Dodge Animal Health（Fort Dorge, LA）から購入した。キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）はPhenix Scientiffic, Inc.（St. Joseph, MO）から得た。

リンゲル液はＮａＣｌ１４７、ＫＣｌ２．７、ＣａＣｌ_２１．２、ＭｇＣｌ_２０．８５ｍＭを含んだものとした。高カリウム溶液用には、ＫＣｌを８０ｍＭに増加すると共にＮａＣｌを６９．７ｍＭに減少させ、オスモル濃度を維持した。全液剤は、二重蒸留脱イオン水から生成し、Steriflip（登録商標、Millipore, Bedford, MA）で濾過した。

生体内マイクロダイアリシス
ラットは、ケタミン及びキシラジン（それぞれ腹腔内８０及び１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、Kopf定位フレームに置いた。全外科手術用器具は熱泡乾燥滅菌剤又は７０％エタノールで殺菌した。２ｍｍトレフィン骨ドリルで頭蓋骨に小孔を穿孔した。ＣＭＡ／１１ １４／０４ Cupr probe（O.D. 0.24 mm, 4mm membrane, 6,000 Da, CMA microdialysis, Sweden）を、切歯棒を−５．０ｍｍにセットして右線条体（Paxinos G et al, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 2^ｎｄ ed., Academic Press, San Diegoに記載されているように、ブレグマからＡＰ＝＋０．５，ＭＬ＝−３．０、硬膜からＤＶ＝−７．３ｍｍ）内に移植した。プローブは、歯科用セメント及び三本のアンカースクリューを使用して頭蓋骨に永久的に固定した。手術後のラットは、腹腔内に生理食塩水（５ｍｌ／ｋｇ）を注入し、目を覚ますまでヒーティングパッド上で３７℃の体温をキープした。

自由行動ラットは、液体スイベルを不要とする回転台上円形ボウルでかん流し（Wang L et al, Neurochem Int 42: 465-70, 2003参照）、手術後初日に環境に慣らさせた。実験は手術後おおよそ４８時間で実施し、午前１０：００から午後４：００までの間に遂行した。リンゲル液は、微量注入ポンプ（ＣＭＡ／１００）による１．５μｌ／分の定速で、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）樹脂管及び気密シリンジ（Exmire type 1, CMA）を使用して継続的にかん流させた。透析物は１５分間隔で収集した。０．２Ｍ ＨＣｌＯ_４及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む抗酸化剤混合物５μｌを、収集前にサンプリングバイアルに追加し、ドーパミン及びその代謝産物を保護した。最初の６０分内のサンプルは分析から外した。続いて、連続３セッションのサンプルを収集した。最後のセッション（１．５時間、６サンプル）以外は、１時間（４サンプル）で収集した。順番は次の通り：セッション１（ａＣＳＦ）、２（High Ｋ^＋）、３（ａＣＳＦ）。全サンプルは、クラッシュアイス上で収集して直ぐに凍結させ、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃を維持した。

プロテイン及びモノアミンのための脳解剖
マイクロダイアリシス実験の後、ラットを、ケタミン及びキシラジン（８０及び１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。黒インクをプローブに通し、プローブ周囲の組織を染めた。ラットは、ギロチン断頭した。脳は、冷却した解剖台で即座に解剖した。左線条体は、液体窒素中に置いたエッペンドルフチューブ内で今後のプロテイン分析のために簡易凍結した。右線条体はさらに解剖し、目視観測でプローブの位置を測定した。線条体内にプローブが見つからなかった場合のデータは含めなかった。

ラットの追加グループ（２０ヶ月、コントロールとＵＭＰの両方ともｎ＝６）を６週間飼育した。これらのラットにはマイクロダイアリシスを実行しなかった。線条体（左及び右とも）を上記同様に収集し、ドーパミン及びその代謝産物の組織レベルを測定した。

組織ドーパミンサンプルの抽出
線条体は、重さを量り、０．１Ｍ ＨＣｌＯ_４及び１μＭ ＥＤＴＡを含むＨ_２Ｏ１ｍｌを用いて１分間アイス上のエッペンドルフチューブで均質化した。１０秒のボルテックス後、アリコートを、ビシンコニン酸（Sigma, St. Louis, MO）プロテイン分析のために使用した。ホモジネートは、その後にUltrafree-MC centrifugal filter units（Millipore, 14,000rpm/15min/4℃）で濾過した。水相をＨＰＬＣにかける前に１：１０希釈を行った。内部標準均質化前に、サンプルにＤＨＢＡを添加した。ドーパミン及びその代謝産物の濃度はＨＰＬＣで測定し、三回の繰り返し測定の値を平均してサンプルあたりプロテインの量に標準化した。

ドーパミン及び代謝産物の分析
透析物及び組織のＤＡ及び代謝産物は、ESA Microdialysis Cell (model 5014B, ESA, North Chelmsford, MA) を用いたESA Coulochem II 5100A detector （Ｅ_１＝−１７５ｍＶ；Ｅ_２＝＋３２５ｍＶ；Ｅ_{ｇｕａｒｄ}＝３５０ｍＶ）を使用して測定した。移動相（ＭＤ−ＴＭ，ＥＳＡ）は７５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．７ｍＭオクタンスルホン酸、１００μｌ／Ｌトリエチルアミン、２５μＭ ＥＤＴＡ、１００％アセトニトリル、ｐＨ３．０を含む。流速は０．４ｍＬ／分。カラム（ＥＳＡ ＭＤ １５０，３×１５０ｍｍ、３μｍ、１２０Å）はカラムオーブンで４０℃に維持した。サンプルは、Alltech 580 autosampler（Alltech, Deerfield, IL）にてＨＰＬＣに注入し、分析の間、冷却トレイにて４℃に維持した。データは、Alltech AllChrom (TM) data systemにより計算され、AllChrom plus (TM) softwareで分析された。タイムラインプログラムは、サンプルの分離及び検出の間に検出ゲインを変更することができ、１回の注入で、透析物における低ＤＡ及び高代謝産物濃度データを得ることができるようになっている。

データ分析
データは、各ポイントで６〜９測定のサンプリング時間に従い表した（平均値±標準誤差（S.E.M.））。ＤＡ及び手代謝産物の基礎値は、Ｋ^＋刺激前の最初の４連続サンプルの平均を基に決定し（透析物における平均値は１０．２±０．４ｎＭ、ｎ＝２２）、これを１００％の値にあてた。統計は、Turkey's HSD事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ（処理×時間）を使用して実行した。一元配置ＡＮＯＶＡは、各時点における３グループのなかの差異を比較するために使用した。ｐ値＞０．０５は統計的有意を評価するために使用した。ドーパミンの基礎レベルは、２回の反復実験の間で均質で、したがって対応するグループ内でプールした（Ｆ_１，２０＝３．９９，ｐ＞０．０５）。透析物の基礎ＤＡレベルは、Ｋ^＋刺激前の４連続サンプルにおいて１時間平衡後も安定していた（Ｆ_３，５７＝０．１５、ｐ＞０．０５、対象内因子としてサンプリング時間（０、１５、３０、４５分）を使用した繰り返し測定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ）。

基礎ＤＡレベル同様、透析物のＤＯＰＡＣ及びＨＶＡ基礎レベルは、６１２±１４及び３６９±７ｎＭ（ｎ＝２２ラット）であり、安定していた（それぞれＦ_３，５７＝１．０６、Ｆ_３，５７＝０．８４、両者ｐ＞０．０５）。基礎ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡレベルに対するＵＭＰ処理の効果はなかった（コントロール対ＵＭＰ−１週対ＵＭＰ−６週、それぞれＦ_２，１９＝０．２７、Ｆ_２，１９＝０．０３、両者ｐ＞０．０５）。

実験結果

脳内神経伝達物質放出に対する経口投与ウリジン代謝産物の効果を評価するために、加齢ラットを制限環境において、コントロール食か２．５％ＵＭＰ補助食のどちらかを１又は６週間与えた。ＵＭＰ補給は、処理グループ中の透析物における基礎ＤＡレベルに影響しなかった（コントロール対ＵＭＰ−１週対ＵＭＰ−６週、Ｆ_２，１９＝０．９８）。透析物中のＤＡ濃度は１０．２±０．４ｎＭ（ｎ＝２２ラット）。

Ｋ^＋誘発線条体ＤＡ放出（高Ｋ^＋溶液かん流に続く）に対するＵＭＰ補助食の効果は、図１２Ａに示している。統計的に有意な差（Ｆ_{２，２６６}＝３．３６）が、コントロール、ＵＭＰ−１週、及びＵＭＰ−６週処理グループの透析物中ＤＡレベルに見られた。事後多重比較により、コントロールとＵＭＰ−６週のグループ間に有意な差が現れた。データをさらに３セクションに分けると（前、Ｋ^＋誘発、後）、コントロールとＵＭＰ−６週のグループ間に、２８３±９％から３４１±２１％という、Ｋ^＋誘発ＤＡ放出の有意な増強が見られた（図１２Ｂ）。ＵＭＰ−１週グループは、コントロールグループに対するＤＡ放出の向上を示しているが（３１６±１５％）、この向上が顕著であるとは言えない。

次に、線条体透析物におけるＤＡ代謝産物３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）に対するＵＭＰ補助食の効果を評価した。Ｋ^＋脱分極は、全グループにおいてベースラインレベルに比べ、ＤＯＰＡＣ（図１３Ａ）及びＨＶＡ（図１３Ｂ）を６５±４％及び５１±４％へ顕著に減少させた（それぞれＦ_２，９５＝５１．９０、Ｆ_２，９５＝９２．７４、全ｐ＜０．０１）。処理グループのＫ^＋減少ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡ間に差はなかった（それぞれＦ_{２，２６６}＝１．０１、Ｆ_{２，２６６}＝１．２０）。液剤を、１０５分で高Ｋ^＋支援から通常リンゲル液へ変えると、透析物におけるＤＯＰＡＣ及びＨＶＡレベルの両方が向上し、変更後３０分で最大レベルに達した（ＤＯＰＡＣ１６９±９％、ＨＶＡ１４９±５％）。しかし、３グループ間で有意な差は見られなかった。

さらに、ＵＭＰ食は、線条体のニューロンからの神経伝達物質アセチルコリンの基礎放出向上を示す（図１４）。

これらの結果は、（ａ）経口投与ウリジンが脳内の神経伝達物質放出を改善し、（ｂ）ウリジンの媒介による脳機能の増強が、ジャービルに限らない多種の現象であり、（ｃ）ウリジンによる脳機能の増強が、加齢認知機能障害に対する生物学的に関連した動物モデルを現す。

実験例８
ＵＴＰの経口投与による加齢ラット脳内ＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍレベルの向上

方法

データ分析
データは、各グループ６〜１６測定のＵＭＰ処理に従って表された（neans±S.E.M.）。Turkey's HSD事後検証を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを処理間の差を比較するために使用し、Newman-Keuls multiple range testを図１６のデータのために使用した。

ウエスタンブロッティング
線条体組織を、２００μｌ溶解バッファ（60mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 1mM dethiothreitol, 1mM AEBSF, 8μM aprotinin, 500μM bestatin, 15μM E64, 200μM leupeptin, 10 μM pepstatin A）を含んだエッペンドルフチューブに置いた。サンプルは、超音波分解、煮沸（１０分）、遠心分離にかけた（室温１分間１４，０００ｇ）。上澄みをクリーンチューブに移し、Bicinchoninic Acid assay (Sigma, St. Louis, MO) を使用して総プロテイン量を測定した。

プロテインの等量（４０μｇプロテイン／レーン）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（4-15% SDS PAGE; Bio-Rad, Hercules, CA）にロードした。ゲル電気泳動の前に、ブロモフェノールブルー溶液（０．０７％）を各サンプルに追加した。プロテインが分離され、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（immobilon-P, Millipore）上に移し、１時間、５％ウシ血清アルブミン（Tris-buffered saline/0.15% Tween 20）で封鎖した。Tris-buffered saline (TBST) で３１０分洗浄後、ブロットを、ＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍ（それぞれ１：２０００、１：５０００、Calbiochem, La Jolla, CA）を含む関心のあるプロテインに対する各種抗体をもつＴＢＳＴで、オービタルシェーカー上４℃の一晩、培養した。それぞれ製造元から提示されているようにECL system（Amersham, Piscataway, NJ）及びKodak X-AR filmを使用して、プロテイン−抗体錯体を検出し可視化した。フィルムは透明アダプタをもつSupervista S-12 scanner（UMAX Technologies, Freemont, CA）を用いてデジタル化した。分析は、パブリックドメインNIH Image program (NIH V.1.61) を使用して実施した。

実験結果

脳内新膜の生成を増補し得るウリジンレベルが向上しているかどうかを評価するために、ニューロフィラメントのＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍのレベル、神経突起伸長のバイオマーカー、について、実験例７の実験によるラットの脳において評価した。図１５に示すように、６週間のＵＭＰ補助食が、ＮＦ−７０（図１５Ａ）及びＮＦ−Ｍ（図１５Ｂ）のレベルを、それぞれコントロールレベルに対し１８２±２５％（Ｆ2,31＝６．０１、ｐ＜０．０５）及び２２１±３４％（Ｆ2,21＝８．８６、ｐ＜０．０１）へ、顕著に向上させた。ＵＭＰ食１週間摂取では、これら二つのプロテインについて、コントロールグループと比較して統計的に有意なレベル向上は見られなかった。線条体におけるＮＦ−７０とＮＦ−Ｍのレベルは、それぞれコントロールレベルに対し、２０４±３６％及び２２１±３４％に向上した。

実験例９
ウリジン又はＵＴＰの経口投与による神経突起伸長及び分岐とＰＣ１２細胞内ＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍレベルの向上

方法

データ分析
データは、mean±SEMとして表した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、グループ間の差を決定するために使用した（有意レベル、ｐ＜０．０５）。差が検出されたときは、平均値をNewman-Keuls multiple range test を使用して分離した。

神経突起伸長実験
ＰＣ１２細胞は、コラーゲンコートの６０ｍｍ培養皿で１％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ内でまばらに皮膜した。実験グループは、次の通り。ウリジン、ウリジン三リン酸塩、シチジン、reactive blue 2、スラミン、及びＰＰＡＤ（Sigma, St. Louis, MO）。全処理は、皮膜後２４時間実施した。処理期間終了時、OpenLab ソフトウエアを使用し、Zeiss Axioplan 2 位相差顕微鏡で画像を取得した。６デジタル画像が各皿からキャプチャされ、トータルで処理グループあたり１８〜２４画像となった。各実験の各グループでおおよそ３００細胞が計測された。実験は３部構成で実施した。神経突起分岐及び神経突起長を含む神経突起の数量化は、実験グループに左右されない１以上のリサーチャーにより実施した。神経突起長は、パブリックドメインNIHソフトウエア“Image J”を使用して測定した。細胞体の直径より長い経路を神経突起としてカウントした。経路生産細胞だけを分析した。

細胞内ＵＴＰ及びＣＴＰの検出
細胞内ＵＴＰ及びＣＴＰのレベルは、５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ２．６５をバッファＡとして使用する他は、実験例６同様のＨＰＬＣにより分析した。

実験結果
ＮＧＦ誘発神経突起伸長におけるウリジン処理（１０〜２００μＭ）の効果を次に実験した。ＮＧＦの欠乏で、ＰＣ１２細胞は神経突起を成長させなかった（１％以下）。ＮＧＦ欠乏下のウリジン処理（５０μＭ、２又は４日）は、神経突起の生成を起こさなかった。ＮＧＦ存在下におけるウリジン（５０〜２００μＭ）は、４日処理後に細胞あたり神経突起数を強化した（図１６Ａ〜Ｃ）が、２日処理又は低ウリジン濃度（１０，２５μＭ）では効果が見られなかった。ＮＧＦに晒した細胞のシチジン処理もまた、神経突起伸長における効果を示さなかった。

ウリジンが細胞あたり神経突起数を向上させるので、ＮＧＦ存在における神経突起分岐及び長さに対するウリジン効果も評価した。ウリジン（５０μＭ）及びＮＧＦによる４日処理後、細胞あたり神経突起分岐ポイント数は、ＮＧＦのみによる処理細胞に比べ、有意に（ｐ＜０．０１）向上した（図１６Ｄ）。ウリジンは、ＮＧＦ分化細胞における平均神経突起長に有意な影響を与えなかった。

ニューロフィラメントプロテインは神経突起中に豊富で、したがって、神経突起数向上は、ニューロフィラメントプロテインの発現向上に関連付けられると思われる。そこで、ＮＧＦ単独又はＮＧＦ＋ウリジン（５０μＭ）によるＰＣ１２細胞の４日処理後のＮＦ−７０（７０ｋＤ）及びＮＦ−Ｍレベルを測定した（図１６Ｅ）。ＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍの発現は、ＮＧＦ単独処理の細胞に比べ、ウリジン処理後に有意に（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）向上した。ＮＧＦの欠乏下でのウリジン処理は、ニューロフィラメントプロテインのレベルにも影響を示さなかった。したがって、ウリジンは、ＰＣ１２細胞における神経突起伸長を増補する。

ＮＧＦ欠乏下の外因性ウリジン追加は、ＰＣ１２細胞における細胞内ＵＴＰ及びＣＤＰコリンレベルを向上させる（実験例６）。ウリジンが、ＮＧＦ存在下でＵＴＰとＣＴＰレベルのどちらに影響するか決定するために、ＵＴＰ及びＣＴＰのレベルを、ＮＧＦ、ＮＧＦ存在下でヌクレオチドなし（コントロール）、ウリジン、シチジン、又はＣＴＰで２日間処理したＰＣ１２細胞で測定した。ウリジン（５０μＭ）は、ＮＧＦ単独処理を受けた細胞に比べ、ＵＴＰ及びＣＴＰの両レベルを有意に（ｐ＜０．０５）向上させた（それぞれ図１７Ａ−Ｂ）。ＵＴＰ（１００μＭ）又はシチジン（５０μＭ）は、いずれのヌクレオチドの細胞内レベルにも有意な影響は見られなかった。

ＵＴＰが神経突起伸長に対するウリジンの効果を仲介するかどうかを確認するために、ＰＣ１２細胞を、ＮＧＦ及び各種用量のＵＴＰで処理した。処理４日後、ＵＴＰ（１０及び５０μＭ）は、ＮＧＦ単独処理細胞に比べ、神経突起伸長を有意に（ｐ＜０．０１）強化した。したがって、ウリジン又はＵＴＰが神経突起伸長を増補する。

要するに、ウリジン又はＵＴＰ補助食は、ラットの脳において二つの主なニューロフィラメントプロテインのレベルを向上させ、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長を誘発すると言える。

実験例１０
ＮＧＦ分化ＰＣ１２細胞のピリミジン反応Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６レセプタ発現

方法

Ｐ２Ｙレセプタの検出
rabbit anti-P2Y2、anti-P2Y4（両者Calbiochem）、又はrabbit anti-P2Y6（Novus Biologicals, Litteleton, CO）を使用して、実験例８同様にウエスタンブロットを実施した。

免疫細胞化学
ＰＣ１２細胞は、コラーゲンを塗布した１２ｍｍガラスカバースリップ（A. Daigger & Co., Vernon Hills, IL）で成長させたことを除いて、上記同様に処理した。プロテインは、免疫蛍光を使用して可視化した。簡単に言うと、細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２５％Triton X-100で透過し、１０％ノーマルヤギ血清にてブロックし、適切な抗体（mouse anti-NF-70及びrabbit anti-P2Y2、rabbit anti-P2Y4、又はrabbit anti-P2Y6のいずれか）にて一晩培養した。Ｐ２Ｙ２及びＰ２Ｙ４の可視化に対して、コントロール培養物を、免疫染色が固有のものであることを裏付けるために、一次抗体プラスコントロール抗原で培養した。コントロール抗原は、Ｐ２Ｙ６レセプタに対し有効ではなかった。次に細胞は、蛍光色素結合二次抗体で１時間培養し（goat anti-rabbit ALEXA 488及びgoat anti-mouse ALEXA 568, Molecular Probes, Eugene, OR）、ＤＡＰＩ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）をもつか又はもたないマウンティングメディアでガラススライドにマウントした。一次抗体に提供したコントロール抗原は、免疫染色が固有であることを裏付けるために使用した。デジタル画像は、OpenLabソフトウエアを用いたZeiss（Oberkochen, Germany） Axioplanマイクロスコープで、Zeiss Plan-Neofluor 40x oil-immersion objectiveを使用して得た。

実験結果

ＵＴＰは、ピリミジン活性化したＰ２Ｙレセプタのクラス、すなわちＰ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４，及びＰ２Ｙ６の作用薬である。これらレセプタが細胞外ＵＴＰの神経突起伸長に作用するメカニズムに参加しているのかどうか、レセプタがＰＣ１２細胞に発現するかどうか、そして、ＮＧＦへの暴露でその発現が変わるのかどうかを見るために、ＰＣ１２細胞を０〜７日間ＮＧＦで処理し、レセプタのレベルを測定した。ＮＧＦ処理３日後、Ｐ２Ｙ２レセプタの発現が最大レベルに達し、これは、ＮＧＦ処理３日より前の場合よりも有意に（ｐ＜０．００１）高かった（図１９Ａ）。Ｐ２Ｙ２の可視化及び局在化のために、Ｐ２Ｙ４及びＰ２Ｙ６レセプタも同様に、細胞を、ＮＧＦの存在下又は欠如下で４日間成長させ、そして、神経マーカーＮＦ−７０及びＰ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６のための免疫染色を施した（それぞれ図１９Ｂの左から右）。これら三つのレセプタはすべて、ＮＧＦ分化ＰＣ１２細胞で多く発現した。さらに、Ｐ２Ｙ２は、ニューロンマーカーＭＡＰ−２で共に局在化した（図２０）。ＮＧＦの欠如において、レセプタプロテインの発現は、免疫染色では検出されなかった。加えて、ウリジンの存在は、ＮＧＦ単独に晒した細胞での発現量に比べても、レセプタの発現に作用しなかった。したがって、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６レセプタは、神経細胞には存在するが、その前駆体には存在しない。

実験例１１
ＮＧＦ誘発神経突起伸長のウリジン効果に対するＰ２Ｙレセプタの拮抗作用による阻害

Ｐ２Ｙレセプタによる信号伝達がウリジンによる神経突起伸長の誘発を仲介するかどうか確かめるために、ＰＣ１２細胞を、ＮＧＦ、ウリジン（１００μＭ）、及びＰ２Ｙレセプタ拮抗薬のスラミン（３０μＭ）、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ、３０μＭ）、及びreactive blue（ＲＢ−２、１０μＭ）で４日間培養した。各拮抗薬は、ＮＧＦ刺激神経突起伸長のウリジン強化を有意に（ｐ＜０．０５又は０．００１）ブロックした（図２１）。ＰＣ１２細胞のウリジン摂取を阻害するＰ２Ｙレセプタ拮抗薬はなかった。これらの結果は、Ｐ２Ｙレセプタを介した信号伝達が神経突起伸長のウリジン誘発を仲介することを示している。

実験例１２
ホスファチジルイノシトール（ＩＰ）信号伝達のＵＴＰ及びウリジンによる刺激

方法

代謝標識及びＰＩ代謝回転分析
ＰＩ代謝回転の分析を、（Nitsch RM et al, J Neurochem 69: 704-12, 1997）の記載に基づき実施した。簡単に言うと、細胞は、無血清ＭＥＭにおけるmyo-[2-^３H]inositol（17.0 Curie/mmol; Amersham Biosciences）の１．２５マイクロキュリー（μＣｉ／dish）で３６時間代謝標識し、Hank's balanced salt solution（ＨＢＳＳ）で二回洗浄し、ＨＢＳＳ内１０ｍＭ塩化リチウムで１５分処理した。６０分３７℃の１０ｍＭリチウムの存在下で薬剤を添加した。細胞は氷冷メタノールで溶解させ、脂質は、クロロホルム／メタノール／水（体積で２：２：１）を用いた抽出で除いた。標識した水溶性イノシトールリン酸は、ＡＧ１−Ｘ８カラム（Bio-Rad）、溶離液としての１Ｍギ酸アンモニウム及び０．１Ｍギ酸を使用したイオン交換クロマトグラフィーにより、free[^３H]inositolから分離した。放射能は、液体シンチレーションスペクトロメトリにより数量化した。

実験結果

Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６レセプタは、ホスホリパーゼＣ／ジアシルグリセロール／イノシトール 三リン酸（ＰＬＣ／ＤＡＧ／ＩＰ３）信号伝達経路を活性化する。神経突起伸長を促進するウリジン又はＵＴＰの濃度がこれらレセプタを活性化させるかどうか見るために、ＮＧＦ分化ＰＣ１２細胞を[3H]-inositol（５０μＭ）又はＵＴＰ（１０，１００μＭ）で１時間標識し、放射性標識したＩＰの代謝回転測定によりＩＰ信号伝達を評価した（図２２）。ＩＰの形成は、１００μＭ ＵＴＰ（ｐ＜０．０５）の追加及び５０μＭウリジン（ｐ＜０．０１）により、有意に向上した。Ｐ２Ｙレセプタ拮抗薬ＰＰＡＤＳ（１００μＭ）は、ＵＴＰによるＩＰ信号伝達の刺激を有意に（ｐ＜０．０５）ブロックした。これらは、ＵＴＰが、Ｐ２Ｙレセプタ仲介によるＩＰ信号伝達経路の刺激を通した神経突起伸長を促進することを示している。

実験例１０〜１２の結果は、ウリジンとその代謝産物による神経突起伸長刺激、すなわちＰ２Ｙレセプタの活性化による、メカニズムを提示している。少なくともＰ２Ｙレセプタの作用の一部がＩＰ信号伝達により仲介される。総合すれば、実験例７〜１２により得られた結果は、ウリジン治療が、各種メカニズム：（１）神経伝達物質放出の強化、（２）ＣＴＰを通した膜リン脂質の前駆体としての作用、（３）ＵＴＰを通したＰ２Ｙレセプタ結合細胞内信号伝達経路の活性化、による神経伝達物質の強化で認知機能を改善し得るさらなる裏付けを提供している。メカニズム（２）及び（３）は、神経突起形成を向上させるようにも働く。

実験例１３
各種におけるＵＭＰ補助食の学習及び記憶強化

材料及び実験方法

モリスの水迷路
加齢ラット（１８ヶ月、５００ｇ）に、コントロール食又は２．５％ＵＭＰ食含有食を６週間摂食させた。これらラットを、プラットホームを隠した直径６フィートの水プールの４等分個所の各個所に順に入れて、各トライアル９０秒の間にプラットフォームに泳ぎ着くかどうか試し、泳いだ時間「平均脱出時間」を記録した。４トライアルのセットを４日連続で繰り返した。プラットホームは各日とも同じ位置とした。このモリスの水迷路として知られたテストは、空間記憶の指標となる。

食事パレット学習分析
コントロール又は任意のＵＭＰ含有食（０、０．１、０．５又は２．５％）を３週間与えたオスの若年成人ジャービットについて、各出口に小さな食事パレットを用意した４本の枝通路をもつ中央室を備えた放射状迷路でテストした。テスト前は動物に一晩絶食させ、そして、中央室においた動物が１８０秒で全パレットを見つけられるか試した。パレット発見に要した時間が短いほど、学習及び空間記憶が改善されているこを示す。

作業記憶及び参照記憶分析
コントロール又は０．１％ＵＭＰ食を４週間与え、上記の食事パレットをすべて発見できるように訓練した１０匹のジャービルグループに対し、上記迷路の枝通路２本だけに（常に同じ２本）食事パレット報酬を用意した修正テストを実施した。このテストにおいて、ジャービルが１日の内に一度訪れた枝通路を再訪すると作業エラーを１とする。参照記憶は、ジャービルが（修正テストで）食事パレットの無い枝通路を訪れると１とする。

実験結果

前の実験例で、経口投与ウリジンがいくつかの方法で働いて神経細胞の能力を改善し増補することを示した。本実験例では、ウリジンが認知機能を増補することを直接示す。加齢ラット（１８ヶ月、５００ｇ）に、コントロール食又は２．５％ＵＭＰ・２Ｎａ^＋食を６週間与え、空間記憶の指標となるモリス水迷路を使用して記憶をテストした。ＵＭＰ・２Ｎａ^＋強化食を投与したラットは、プラットホームのある位置に到達するのに要した時間について、統計的に有意な減少を見せ（図２３）、これは、ＵＭＰが空間記憶を強化することを示す。

経口投与ウリジンの学習及び空間記憶に対する効果についてもジャービルで実験した。コントロール又は任意のＵＭＰ含有食（０、０．１、０．５又は２．５％）を３週間与えたオスの若年成人ジャービットについて、各出口に小さな食事パレットを用意した４本の枝通路をもつ中央室を備えた放射状迷路でテストした。テスト前は動物に一晩絶食させ、そして、中央室においた動物が１８０秒で全パレットを見つけられるか試した。パレットの発見に要する時間を減少させるには、空間学習を必要とする。ＵＭＰ補助食の用量に依存して、ジャービルがパレットを発見するために要した時間が減少した（図２４）。

さらに、経口投与ウリジンの作業記憶及び参照記憶に対する効果を実験した。コントロール又は０．１％ＵＭＰ食を４週間与え、上述の食事パレットをすべて発見できるように訓練したジャービルに対し、作業記憶及び参照記憶を測定する修正テストを実施した。ＵＭＰ補助食を与えたジャービルは、作業記憶エラー（図２５Ａ）及び参照記憶エラー（図２５Ｂ）の両方で回数を減少させていることが裏付けられている。

これらの結果は、（ａ）ウリジン補助食が学習及び各種の記憶（空間、作業、参照）を改善すること、（ｂ）効果は特定の種に限られないこと、（ｃ）効果は加齢による認知機能障害の生物学的に関連したモデルに現れること、を示している。

要するに、本結果は、経口投与ウリジンが、神経学的信号伝達、神経細胞構造、及び認知機能に積極的に関与していることを示している。これらの結果はまた、ウリジンがその効果を発揮するいくつかのメカニズムにも関わっている。

実験例１４
ウリジン及びコリンによる神経伝達物質放出の向上

材料及び実験方法

脳切片の用意
オスのSprangue-Dawleyラット、９〜１１ヶ月を、ケタミン（８５ｍｇ／ｋｇ体重、筋肉注射）で麻酔し、４℃に冷却した部屋で断頭した。脳は迅速に取り出し、１ｍＭケタミン及び１５μ／ｍｌエゼリンを含む冷却した（４℃）酸化Krebsバッファ（119.5 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.3 mM CaCl_２, 1.2 mM MgSO_４, 25 mM NaHCO_３, 1.2 mM KH_２PO_４, 11 mM glucose, 0.03 mM EDTA, pH 7.4）内に置いた。残った髄膜及び脈絡叢を除いた後、線条体、海馬、及び皮質の３０μｍ切片をMcIllwain tissue chopperで即座に用意し、３回洗浄して、カスタムメイドの表面かん流チャンバ（Warner Instrument, Hamden, CT）内に置いた。

表面かん流及び電気刺激
切片は、上記の酸化Krebs／ケタミン／エゼリンバッファ、流速０．８ｍｌ／分の表面かん流チャンバにより３７℃で６０分平衡に保った。表面かん流チャンバは、電気刺激装置（model S88; Grass Instruments）に接続した二つの相対した銀マッシュ電極を含んでいる。カスタムメイドの極性反転デバイスを、チャンバの分極防止と、各パルス開始後５０マイクロ秒の電流及び電圧を監視して一定のチャンバ抵抗を確保するために、使用した。平衡期間後、切片は、２０μＭコリン、２５μＭシチジン、及び２５μＭウリジンのいずれか又は全部が存在又は欠如したKrebs／ケタミン／エゼリンバッファの高Ｋ^＋バージョンでかん流することで消極した。かん流液は、２時間の期間中収集し、アセチルコリン分析した。値は、切片のプロテイン含有で標準化した。

実験結果

アセチルコリン放出に関するウリジン及びコリンの効果を見るために、線条体、海馬、及び皮質（ｎ＝８）の切片を、コリンの存在又は欠如下で培養して消極し、アセチルコリン放出を測定した。いくつかのグループにおいて、シチジン又はウリジンがその上に追加された。コリンはウリジンの有無に関係なくアセチルコリン放出を向上させた（図２６）。

この結果は、ニューロンが繰り返し刺激されてアセチルコリンを放出するとき、膜リン脂質（つまりＰＣ）のコリン在庫補充により、放出される神経伝達物質の量をコリンが向上させることを示している。上記実験例は、シチジン新ＰＣに使用されるＣＤＰコリンの合成をウリジンが増補することを示している。実験例の結果をあわせると、新しいリン脂質を合成する神経の能力及びそれによる神経伝達物質の繰り返し放出が、コリンと一緒のウリジンの追加によって、添加又は相乗作用の手法で向上すると考えられる。

実験例１５
消極を繰り返した後の神経伝達物質追加放出のウリジン及びコリンによる向上

脳切片を、この場合、８サイクル又は刺激と休みを２０分期間交互にして、上記実験例に記載のように繰り返し刺激する。全グループにおいて、神経伝達物質の放出量が各連続した刺激期間で減少したが、この減少は、ウリジン又はコリンいずれかの存在下で有意に低下する。この効果は、ウリジン及びコリン両方の存在で強化される。したがって、繰り返し刺激後の神経伝達物質放出量はウリジン又はコリンの存在で向上し、ウリジン及びコリンの存在でさらに向上する。

標準ＨＰＬＣ法で試験したシチジンとチロシンのピーク（６．５９）の一致を示す図。 溶離液（バッファ）をメタノールと共に使った修正ＨＰＬＣ法で試験したシチジン（３．２５）とチロシン（２．９２）の異なったピークを示す図。 経口ＵＭＰ投与で人の血中ウリジンレベルが上昇することを示しており、ウリジンの２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）経口投与後におけるプラスマのウリジン（１００％値に設定）対シチジンの比率を表す図。 経口ウリジン投与でジャービル（アレチネズミ）の血中ウリジンレベルが上昇することを示しており、シチジン又はウリジンの疑似投与又は投与後６０分のプラスマウリジンレベルを表す図。＊＊はｐ＜０．０１対疑似投与コントロール、＃＃はｐ＜０．０１対シチジン。 経口ＵＭＰ投与でジャービルの血中ウリジンレベルが上昇することを示しており、水又はＵＭＰを投与したときからの各時点においてプラスマウリジンレベルを表す図。 ＵＭＰ補足食でジャービルの血中ウリジンレベルが上昇することを示しており、表示した割合のＵＭＰを含んだ食物を与えたジャービルにおけるプラスマウリジンレベルを表す図。 経口ウリジン投与で脳ウリジンレベルが上昇することを示しており、シチジン又はウリジンの疑似投与又は投与後６０分の脳ウリジンレベルを表す図。＊＊はｐ＜０．０１対疑似投与コントロール、＃＃はｐ＜０．０１対シチジン。 経口ＵＭＰ投与で脳ウリジンレベルが上昇することを示しており、水又はＵＭＰを投与したときからの各時点において脳ウリジンレベルを表す図。 ウリジンが脳内で容易にシチジンへ変わることを示しており、２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のウリジンを経口投与した後のプラスマ（Ａ）及び脳（Ｂ）におけるウリジン（１００％）に対するシチジンの比率を表す図。 経口ＵＭＰ投与で脳ＣＤＰ−コリンレベルが上昇することを示しており、水又はＵＭＰを投与したときからの各時点において脳ＣＤＰ−コリンレベルを表す図。 神経細胞株におけるＣＤＰ−コリンの細胞内レベルがウリジンにより向上することを示しており、表示した濃度のウリジンと共に６時間培養した細胞で、ピコモル（ｐｍｏｌ）ＣＤＰ−コリン／ｍｇプロテインとして表示した６皿（dish）の平均値の標準誤差（means ± SEM）を表す図。実験は３回繰り返した。＊はｐ＜０．０５。 線条体透析物中のカリウム誘発ドーパミン（ＤＡ）放出がＵＭＰ食事補給により著しく向上することを示す図。（Ａ）Ｋ^＋誘発線条体ＤＡ放出に対する食事ＵＭＰ補給の効果で、データは、各ポイントで６から９測定を計算したもの（means ± SEM）。カリウム刺激前の４測定の平均による値が１００％に設定されている。（Ｂ）ＵＭＰ治療グループごとに得られたデータ。＊はｐ＜０．０５対相応コントロール。 ＵＭＰ食事補給を伴った線条体透析物におけるＤＯＰＡＣ及びＨＶＡレベルに対するカリウムの効果を示す図。（Ａ）がＤＯＰＡＣ、（Ｂ）がＨＶＡ。＊はｐ＜０．０５対相応コントロール。 ＵＭＰ治療に伴うアセチルコリン基底（basal）濃度の向上を示しており、平均値の標準誤差（means ± SEM）で表す図。＊はｐ＞０．０５。 対側性線条体における神経フィラメントプロテインレベルに対するＵＭＰ食事補給の効果を示す図。（Ａ）がＮＦ−７０、（Ｂ）がＮＦ−Ｍ。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１対相応コントロール。 ウリジン治療でＰＣ１２細胞の神経突起伸長が強化されることを示しており、ウリジン（５０μＭ）存在下のＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と非存在下のＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）とで４日間治療したＰＣ１２細胞の図。 ウリジン治療でＰＣ１２細胞の神経突起伸長が強化されることを示しており、２日及び４日治療後の細胞あたり神経突起数の図。値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊はｐ＜０．０１対ＮＧＦ治療。 ウリジン治療でＰＣ１２細胞の神経突起伸長が強化されることを示しており、異なる濃度のウリジン（５０，１００，２００μＭ）を加えたＮＧＦによる２日又は４日後の細胞あたり神経突起数の図。Ｎ＝ＮＧＦ、Ｕ＝ウリジン、値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）。 ウリジン治療でＰＣ１２細胞の神経突起伸長が強化されることを示しており、各細胞に対する分岐点数の図。Ｎ＝ＮＧＦ、Ｕ＝ウリジン、値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊はｐ＜０．０１対ＮＧＦ治療。 ウリジン治療でＰＣ１２細胞の神経突起伸長が強化されることを示しており、ウエスタンブロッティングを用いて決定した構造タンパク質（プロテイン）ＮＦ−７０及びＮＦ−Ｍのレベルの図。Ｎ＝ＮＧＦ、Ｕ＝ウリジン、値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊＊はｐ＜０．００１対ＮＧＦ治療。 ２日間ＮＧＦに晒したＰＣ１２細胞におけるＵＴＰ及びＣＴＰの細胞内レベルがウリジン治療により向上することを示す図。ウリジン治療（５０μＭ）によって（Ａ）細胞内ＵＴＰレベル及び（Ｂ）細胞内ＣＴＰレベルが格段に向上する。Ｎ＝ＮＧＦ、Ｕ＝ウリジン、Ｃ＝シチジン、値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊はｐ＜０．０５対ＮＧＦ治療。 ＵＴＰ治療で神経突起伸長が向上することを示す図。ＮＧＦ及びＵＴＰによる４日間のＰＣ１２細胞の治療で、ＮＧＦ単独治療に比べ、細胞あたり生成される神経突起数が格段に向上する。値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊はｐ＜０．０１。 ＮＧＦ分化ＰＣ１２細胞がピリミジン感受性Ｐ２Ｙレセプタを発現することを示す図。（Ａ）各種期間ＮＧＦで細胞を培養した後のＰ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６レセプタ発現のレベル、（Ｂ）ＮＧＦ治療の４日後、細胞を固定し、ＮＦ−７０（赤）及びＰ２Ｙレセプタ（緑）を免疫蛍光を使用して可視化したもの。左側がＰ２Ｙ２、中央がＰ２Ｙ４、右側がＰ２Ｙ６。値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊＊はｐ＜０．００１。 Ｐ２Ｙ２レセプタをニューロンマーカＭＡＰ−２で再特定した図。左側がＰ２Ｙ２、中央がＭＡＰ−２、右側が合成。 Ｐ２Ｙレセプタ拮抗薬が神経突起伸長に対するウリジンの効果を抑制することを示す図。細胞は、ＮＧＦと、ウリジン（１００μＭ）、Ｐ２Ｙレセプタ拮抗薬ＰＰＡＤＳ、スラミン、ＲＢ−２との各種組み合わせで４日間治療した。値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊＊＊はｐ＜０．００１対ＮＧＦ治療、＃はｐ＜０．０５、＃＃＃はｐ＜０．００１対ＮＧＦ＋ウリジン治療。 ＵＴＰ及びウリジンによってホスファチジルイノシトール（ＰＩ）代謝回転が刺激されることを示す図。細胞は、一晩で［^３Ｈ］イノシトールで代謝標識され、表示した濃度のＵＴＰ、ウリジン又はＵＴＰ＋ＰＰＡＤＳで刺激され、そして、ＰＩ分解から抽出された放射性同位元素標識化イノシトールリン酸がシンチレーション計測により測定された。値は平均値の標準偏差（means ＋ SEM）、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１対コントロール、＃はｐ＜０．０５対１００μＭのＵＴＰ治療。 経口ＵＭＰでラットの学習及び空間記憶が改善されることを示す図。制限環境においた１８ヶ月のラットにコントロール（対照）食又はＵＭＰ食を６週間摂取させた後、１日４回ずつ４日間、モリス水迷路を使用した実験を行った。プラットフォーム到達平均時間は秒表示。 経口ＵＭＰでジャービルの学習及び空間記憶が改善されることを示す図。コントロール（対照）食又は表示量のＵＭＰ含有食を与えたジャービルの学習及び空間記憶は、放射状迷路で実験した。結果は、３分をデッドラインとした残り時間で示している。 経口ＵＭＰで作業記憶及び参照記憶が改善されることを示す図。コントロール（対照）又は０．１％ＵＭＰ食を４週間与えたジャービルの記憶について、作業記憶失敗（Ａ）及び参照記憶失敗（Ｂ）の両方を測定できるように、図２４に示した実験を改変して実験した。ダイヤ印がコントロールジャービスから得られたデータ、三角印が０．１％ＵＭＰ食を与えたジャービルから得られたデータを示す。 線条体切片における神経伝達物質放出がウリジン及びコリンで向上することを示す図。データは、２時間あたりのナノモル（ｎｍｏｌ）／ｍｇプロテインで表してあり、平均値の標準偏差（means ± SEM）、＊＝ｐ＜０．００１対コリン非存在値。図中の最初のシリーズがコリン非存在での実施、次のシリーズがコリン存在での実施。その各シリーズにおける棒グラフは、左から右へ、付加化合物なし、シチジン付加、ウリジン付加（それぞれ適量をコリンに付加）。 海馬切片における神経伝達物質放出がウリジン及びコリンで向上することを示す図。データは、２時間あたりのナノモル（ｎｍｏｌ）／ｍｇプロテインで表してあり、平均値の標準偏差（means ± SEM）、＊＝ｐ＜０．００１対コリン非存在値。図中の最初のシリーズがコリン非存在での実施、次のシリーズがコリン存在での実施。その各シリーズにおける棒グラフは、左から右へ、付加化合物なし、シチジン付加、ウリジン付加（それぞれ適量をコリンに付加）。 皮質切片における神経伝達物質放出がウリジン及びコリンで向上することを示す図。データは、２時間あたりのナノモル（ｎｍｏｌ）／ｍｇプロテインで表してあり、平均値の標準偏差（means ± SEM）、＊＝ｐ＜０．００１対コリン非存在値。図中の最初のシリーズがコリン非存在での実施、次のシリーズがコリン存在での実施。その各シリーズにおける棒グラフは、左から右へ、付加化合物なし、シチジン付加、ウリジン付加（それぞれ適量をコリンに付加）。

Claims (27)

1. 対象者における認知機能を改善する方法であって、
   対象者にウリジン又はそのソースを投与することによって、該対象者の認知機能を改善することを特徴とする方法。
2. 対象者における認知機能を改善する方法であって、
   ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者の認知機能を改善することを特徴とする方法。
3. 対象者における認知機能の低下を治療又は改善する方法であって、
   対象者にウリジン又はそのソースを投与することによって、該対象者における認知機能の低下を阻害又は防止することを特徴とする方法。
4. 対象者における認知機能の低下を治療又は改善する方法であって、
   ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者における認知機能の低下を阻害又は防止することを特徴とする方法。
5. 前記低下は、循環器疾患、神経変性病、又は精神病に起因するものであることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の方法。
6. 前記認知機能が、記憶、学習、知能、又は精神的適合であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 対象者における神経機能を改善する方法であって、
   ウリジン又はそのソースを対象者に投与することによって、該対象者における神経機能を改善することを特徴とする方法。
8. 対象者における神経機能を改善する方法であって、
   ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者における神経機能を改善することを特徴とする方法。
9. 前記神経機能が、シナプス伝達又は神経伝達物質の機能であることを特徴とする請求項７又は請求項８記載の方法。
10. 対象者の脳におけるシチジン、シチジン三リン酸、又はＣＤＰコリンのレベルを向上させる方法であって、
    ウリジン又はそのソースを対象者に投与することによって、該対象者の脳におけるシチジン、シチジン三リン酸、又はＣＤＰコリンのレベルを向上させることを特徴とする方法。
11. 対象者の脳におけるシチジン、シチジン三リン酸、又はＣＤＰコリンのレベルを向上させる方法であって、
    ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者の脳におけるシチジン、シチジン三リン酸、又はＣＤＰコリンのレベルを向上させることを特徴とする方法。
12. 神経伝達物質を合成する対象者の脳細胞又は神経細胞の能力を向上又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースを対象者に投与することによって、神経伝達物質を合成する該対象者の脳細胞又は神経細胞の能力を向上又は強化することを特徴とする方法。
13. 神経伝達物質を合成する対象者の脳細胞又は神経細胞の能力を向上又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、神経伝達物質を合成する該対象者の脳細胞又は神経細胞の能力を向上又は強化することを特徴とする方法。
14. シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる方法であって、
    シナプスに隣接した神経細胞にウリジン又はそのソースを接触させることによってリン脂質又はその前駆体の合成を強化し、該シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させることを特徴とする方法。
15. シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させる方法であって、
    シナプスに隣接した神経細胞にウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を接触させることによってリン脂質又はその前駆体の合成を強化し、該シナプスにおける神経伝達物質のレベルを向上させることを特徴とする方法。
16. 前記神経伝達物質がアセチルコリンであることを特徴とする請求項９、請求項１２、請求項１３、請求項１４、又は請求項１５に記載の方法。
17. 対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の合成を刺激又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースを対象者に投与することによって、該対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の合成を刺激又は強化することを特徴とする方法。
18. 対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の合成を刺激又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者の脳細胞又は神経細胞の膜の合成を刺激又は強化することを特徴とする方法。
19. 対象者の神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースを対象者に投与することによって、該対象者の神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化することを特徴とする方法。
20. 対象者の神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化する方法であって、
    ウリジン又はそのソースとコリンとを含む組成物を対象者に投与することによって、該対象者の神経細胞の神経突起伸長を刺激又は強化することを特徴とする方法。
21. 前記投与によってリン脂質の生成が強化されることにより、前記膜の合成又は前記神経突起伸長を刺激又は強化することを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ウリジンは、ウリジン−５’−モノホスフェイト、ウリジン−５’−ジホスフェイト、又はウリジン−５’−トリホスフェイトであることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記ソースは、シチコリン（ＣＤＰコリン）であることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記コリンは、コリン塩であることを特徴とする請求項２、請求項４、請求項５、請求項６、請求項８、請求項９、請求項１１、請求項１３、請求項１５、請求項１６、請求項１８、請求項２０、請求項２１、請求項２２、又は請求項２３に記載の方法。
25. 前記ウリジン又はその代謝産物が、前記対象者の神経細胞又は脳細胞におけるＰ２Ｙレセプタの刺激によって効果を仲介することを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項２２、又は請求項２３に記載の方法。
26. 前記ウリジン又はその代謝産物が、神経細胞又は脳細胞におけるＰ２Ｙレセプタの刺激によって効果を仲介することを特徴とする請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記代謝産物は、ウリジン−５’−トリホスフェイトであることを特徴とする請求項２５又は請求項２６に記載の方法。

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