CN102600199A - 含有尿苷的组合物及使用其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有尿苷的组合物及使用其的方法。特别地，本发明涉及尿苷和胆碱在制备用于改善受试者的认知功能的药物中的用途。

Description

含有尿苷的组合物及使用其的方法

本申请是申请号为200580039021.3、申请日为2005年9月13日、发明名称为“含有尿苷的组合物及使用其的方法”的中国专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及改善认知功能和神经功能、增加神经细胞和脑细胞对神经递质的合成和释放以及膜合成的方法，其包括给药含有尿苷或其来源的组合物。

发明背景

尿苷是一种嘧啶核苷，是合成核糖核酸和组织糖原如UDP葡萄糖和UTP葡萄糖所必需的。过去尿苷单独的医学用途包括治疗与嘧啶合成不足相关的遗传病症如乳清酸尿症。胆碱是多种食物中的饮食成分，是对于正常的膜结构及功能至关重要的几种主要磷脂的一部分。胆碱被包含在向接受胃肠外营养的患者递送额外热量和必需脂肪酸的脂质乳剂中。

发明内容

本发明涉及改善认知功能和神经功能、增加神经细胞和脑细胞对神经递质的合成和释放以及膜合成的方法，其包括给药含有尿苷或其来源的组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中改善认知功能的方法，其包括向所述受试者给药尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中改善神经功能的方法，其包括向所述受试者给药尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗或缓解认知功能减退的方法，其包括向所述受试者给药尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供了提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞合成神经递质的能力的方法，其包括向所述受试者或所述脑细胞或神经细胞给药尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供了提高突触中神经递质水平的方法，其包括使与所述突触相邻的神经细胞与尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物接触，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而提高突触中神经递质的水平。

在另一实施方案中，本发明提供了提高受试者的组织、血浆或细胞中胞苷水平的方法，其包括向所述受试者给药尿苷或其来源。

在另一实施方案中，本发明提供了提高受试者的组织、血浆或细胞中胞苷水平的方法，其包括向所述受试者给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加受试者的脑细胞膜或神经细胞膜生成的方法，其包括使所述受试者与尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物接触，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增加受试者的脑细胞膜或神经细胞膜的生成。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增强神经细胞神经突向外生长(outgrowth)的方法，其包括使所述神经细胞与尿苷、其来源或含有尿苷和胆碱的组合物接触，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增强神经细胞神经突的向外生长。

附图简述

图1说明了用标准HPLC方法测试时，胞苷与酪氨酸峰的重合(6.59)。

图2说明了用使用含有低甲醇含量的洗脱缓冲液的修正后的HPLC方法测试时，不同的胞苷(3.25)和酪氨酸(2.92)峰。

图3：口服给药UMP升高人类的血中尿苷水平。描述的是每kg体重250毫克(mg/kg)尿苷的口服给药后，血浆中尿苷(设定为100％值)对胞苷的比率。

图4：口服给药尿苷升高沙鼠的血中尿苷水平。描述的是模拟给药或给药胞苷或尿苷后60分钟的血浆尿苷水平。**：与模拟喂食对照相比，p＜0.01；##：与胞苷相比，p＜0.01。

图5：口服给药UMP升高沙鼠的血中尿苷水平。描述的是给予水或给药UMP后不同时间点的血浆尿苷水平。

图6：添加UMP的饮食升高沙鼠的血中尿苷水平。描述的是用含有标示百分数的UMP的饮食饲养的沙鼠中的血浆尿苷水平。

图7：口服给药尿苷升高脑中尿苷水平。描述的是模拟给药或给药胞苷或尿苷后60分钟的脑中尿苷水平。**：与模拟喂食对照相比，p＜0.01；##：与胞苷相比，p＜0.01。

图8：口服给药UMP升高脑中尿苷水平。描述的是给予水或给药UMP后不同时间点的脑中尿苷水平。

图9：在脑中，尿苷易于转化为胞苷。描述的是每kg体重250毫克(mg/kg)尿苷的口服给药后，血浆中(A)和脑中(B)尿苷(100％)对胞苷的比率。

图10：口服给药UMP升高脑中CDP-胆碱水平。描述的是给予水或给药UMP后不同时间点的脑中CDP-胆碱水平。

图11：胞苷升高神经细胞系中的细胞内CDP-胆碱水平。将细胞与标示浓度的尿苷培养6小时。描述的是六个培养皿中的平均值+/-S.E.M，表达为皮摩尔(pmol)CDP-胆碱/mg蛋白质。实验重复三次。*：p＜0.05。

图12：添加UMP的饮食显著增加纹状体透析液中钾诱发的多巴胺(DA)释放。(A)添加UMP的饮食对K⁺诱发的纹状体DA释放的影响。从每点的6-9次测量计算数据(平均值±测量标准误[S.E.M.])。将代表在钾刺激之前的四次测量平均值的100％值设定为100％。(B)根据UMP处理组收集数据。“*”表示与相应对照相比p＜0.05。

图13：钾对含有添加UMP的饮食的纹状体透析液中DOPAC和HVA水平的影响。(A)：DOPAC(B)：HVA。*：与相应对照相比p＜0.05。

图14：用UMP处理所增加的乙酰胆碱基底浓度。描述的是平均值+/-SEM。“*”表示＞0.05的p值。

图15：添加UMP的饮食对于对侧纹状体中神经丝蛋白水平的影响。(A)：NF-70。(B)：NF-M。与相应对照相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01。

图16：尿苷处理增强PC 12细胞中神经突的向外生长。A.在存在或不存在尿苷(50μM)时用NGF(50ng/ml)处理PC 12细胞4天。B.处理2天或4天后每个细胞的神经突数目。C.用NGF加不同浓度的尿苷(50、100和200μM)处理2天或4天后每个细胞的神经突数目。D.定量各细胞的支化点的数目。E.用蛋白质印迹法测定的结构蛋白NF-70和NF-M的水平。N＝NGF，U＝尿苷。数值代表平均值+SEM。与NGF处理相比，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图17：尿苷处理增加接触NGF 2天的PC 12细胞中UTP和CTP的细胞内水平。尿苷处理(50μM)显著增加细胞内UTP水平(A)和细胞内CTP水平(B)。N＝NGF，U＝尿苷，C＝胞苷。数值代表平均值+SEM。*：与NGF处理相比p＜0.05。

图18：UTP处理增加神经突的向外生长。与单独用NGF处理相比，用NGF和UTP处理PC 12细胞4天显著增加每个细胞产生的神经突数目。数值代表平均值+SEM。^**p＜0.01。

图19：NGF分化的PC 12细胞表达嘧啶敏感性P2Y受体。A.将细胞与NGF培养不同时长后，P2Y2、P2Y4和P2Y6受体表达的水平。B.用NGF处理4天后，将细胞固定，使用免疫荧光法显影NF-70(红色)和P2Y受体(绿色)蛋白。左组：P2Y2。中间组：P2Y4。右组：P2Y6。数值代表平均值+SEM。^***p＜0.001。

图20：P2Y2受体与神经元标记物MAP-2共定位。左组：P2Y2受体。中间组：MAP-2。右组：合并。

图21：P2Y受体拮抗剂抑制尿苷对神经突向外生长的影响。用NGF且用或不用尿苷(100μM)及P2Y受体拮抗剂PPADS、苏拉明或RB-2处理细胞4天。数值代表平均值+SEM。***与NGF处理相比，p＜0.001；与NGF加尿苷处理相比，#p＜0.05，###p＜0.001。

图22：UTP和尿苷刺激磷脂酰肌醇(PI)周转。用[³H]肌醇整夜代谢地标记细胞，在锂的存在下在标示浓度下用UTP、尿苷或UTP加PPADS刺激细胞，用闪烁计数法测量从PI分解生成的放射性标记的肌醇磷酸。数值代表平均值+SEM。与对照相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与100μM UTP处理相比，#p＜0.05。

图23：口服UMP改善大鼠的学习和空间记忆。置于受限环境中的18月龄大鼠食用对照饮食或UMP饮食6周，然后使用Morris水迷宫进行测试，4次试验/天，持续4天。用于定位平台的平均时间以秒给出。

图24：口服UMP改善沙鼠的学习和空间记忆。在放射臂迷宫中对用对照饮食或含有标示量UMP的饮食饲养的沙鼠的学习和空间记忆进行测试。结果描述为在3分钟的最后期限结束之前剩余的时间量。

图25：口服UMP改善工作记忆和参考记忆。使用描述于图24中的试验的修正形式对用对照饮食或0.1％UMP饮食饲养四周的沙鼠的记忆进行测试，其测量工作记忆误差(A)和参考记忆误差(B)。菱形代表来自对照沙鼠的数据点，三角形代表来自喂食0.1％UMP饮食的沙鼠的数据点。

图26：尿苷和胆碱增加纹状体切片(上组)、海马切片(中间组)和皮层切片(上组)中神经递质的释放。数据表示为每毫克蛋白质每两小时的纳摩尔数，并描述为平均值±SEM。“*”＝相对于胆碱不存在时得到的值P＜0.001。每组中的第一系列在胆碱不存在时进行，第二系列在胆碱存在下进行。每个系列中的柱从左到右代表未加入其他化合物；加入胞苷；以及加入尿苷(当合适时，各自除加入胆碱外)。

发明详述

本发明涉及改善认知功能和神经功能、增加神经细胞和脑细胞对神经递质的合成与释放以及膜合成的方法，其包括给药含有尿苷或其来源的组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中改善认知功能的方法，其包括向所述受试者给药尿苷或其来源，从而在受试者中改善认知功能。

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中改善认知功能的方法，其包括向所述受试者给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而在受试者中改善认知功能。

短语“尿苷或其来源以及胆碱”是指本发明的两个实施方案：a)尿苷和胆碱的组合；b)尿苷来源和胆碱的组合。术语“尿苷”、“胆碱”和“尿苷来源”是指本文提及的它们各自意义中的任何意义。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，所述认知功能是记忆。在其他实施方案中，所述记忆是空间记忆、工作记忆、参考记忆、短期记忆、长期记忆或中期记忆。在另一实施方案中，所述记忆是本领域已知的任何其他类型的记忆。每种记忆类型代表本发明的单独的实施方案。

如本文提供的，图21-23的数据直接表明尿苷改善几种类型的记忆。跨越不同物种，在不同类型的记忆评价中的结果的一致性证实了本发明的发现。实施例15的数据进一步表明加入胆碱增强尿苷的作用。因此，给药含有尿苷和胆碱的组合物在改善记忆方面有效-在一个实施方案中，比单独给药尿苷或胆碱都更有效。

在另一实施方案中，所述认知功能是学习。在其他实施方案中，所述学习是认知学习、情感性学习或精神运动学习。在另一实施方案中，所述学习是本领域已知的任何其他学习类型。每种学习类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述认知功能是智力。在其他实施方案中，所述智力是语言智力、音乐智力、空间智力、身体智力、人际智力、内省智力(intrapersonalintelligence)、人际智力或逻辑数学智力。在另一实施方案中，所述智力是本领域已知的任何其他智力类型。每种智力类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述认知功能是精神健康(mental fitness)。在另一实施方案中，所述认知功能是本领域已知的任何其他认知功能类型。每种认知功能类型代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，“改善”认知功能或认知功能的“改善”是指提高受试者实现所述认知功能的能力。在另一实施方案中，此术语是指提高或改善所述受试者的认知功能的基线水平。在另一实施方案中，此术语是指提高或改善所述认知功能响应难题或测试的水平。

在另一实施方案中，改善认知功能是指达到其10％的改善。在另一实施方案中，达到20％的改善。在其他实施方案中，达到30％的改善、40％的改善、50％的改善、60％的改善、70％的改善、80％的改善或90％的改善。在另一实施方案中，改善认知功能是指达到其100％的改善。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，相对于在开始处理前的认知功能评价所述认知功能的改善。在另一实施方案中，相对于未处理的受试者评价所述认知功能的改善。在另一实施方案中，根据标准化指标例如测试等评价认知功能的改善。认知功能的每种类型的改善代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，通过受试者脑中神经元之间的连接数目评价认知功能的改善。在另一实施方案中，通过受试者脑中的或受试者脑部特定区域中的毛细管数目评价所述改善。在另一实施方案中，通过神经活性评价所述改善。在其他实施方案中，通过神经功能、语言功能或交流能力评价所述改善。在另一实施方案中，通过测量乙酰胆碱或与认知功能相关的其他神经递质或脑中化学物质的水平评价所述改善。在其他实施方案中，通过正电子发射体层摄影术(PET)扫描受试者的脑、核磁共振成像(MRI)扫描受试者的脑评价所述改善。在另一实施方案中，通过认知能力筛选工具(CASI)(Peila R等人，Stroke.32：2882-9，2001)评价所述改善。在另一实施方案中，通过试验例如本文公开的试验(实施例13)评价所述改善。评价认知功能改善的其他方法是本领域熟知的，例如描述于Antonova E等人(Schizophr Res.2004 Oct 1；70(2-3)：117-45)和Cognitive Function Analysis(Greenwood Pub Group，1998)中的。每种方法代表本发明的单独的实施方案。

在本发明方法的一个实施方案中，本发明的组合物提高了受试者中的胞苷水平，从而介导本文所述的作用之一(如改善认知或神经功能、刺激神经功能、膜合成、神经递质释放等)。在另一实施方案中，通过提高受试者中的胞苷三磷酸(CTP)水平介导所述作用。在另一实施方案中，通过增加受试者中的CDP-胆碱水平介导所述作用。在另一实施方案中，通过增加受试者中的胞苷、CTP、CDP-胆碱的衍生物水平介导所述作用。在另一实施方案中，通过增加受试者中的胞苷、CTP、CDP-胆碱的代谢物水平介导所述作用。在另一实施方案中，不增加胞苷、CTP、CDP-胆碱或其衍生物或代谢物的水平而介导所述作用。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

如本文所述，图9-11表明口服给药的尿苷迅速起效并有效地提高脑中胞苷水平。结合图3-8，其表明尿苷在包括人类的一些物种中被迅速且有效地吸收至血流中，这些发现证明给药尿苷提高了胞苷、CTP和CDP-胆碱的水平。实施例15中的数据进一步表明加入胆碱增强了尿苷的作用。

在一个实施方案中，所述胞苷水平是全身水平。在另一实施方案中，所述胞苷水平是脑中水平。在另一实施方案中，所述胞苷水平是神经系统水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，给药尿苷的潜在益处大于给药胞苷的益处。这是因为与尿苷相比，胞苷不能穿过或只能低效得多地穿过血脑屏障(Cornford等人，Independent blood-brain barrier transport systems for nucleic acid precursors.Biochim.Biophys.Acta 349：211-219，1975)。

在另一实施方案中，胞苷、CTP或CDP-胆碱或其衍生物或代谢物的增加使细胞能够提高磷脂水平，从而介导本文所述的作用之一。在一个实施方案中，所述磷脂是磷脂酰胆碱(PC)。在另一实施方案中，所述磷脂是磷脂酰乙醇胺(PE)。在另一实施方案中，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸(PS)。在另一实施方案中，所述磷脂是PC、PE或PS的衍生物或代谢物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中改善神经功能的方法，其包括向所述受试者给药尿苷或其来源，从而在受试者中改善神经功能。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中改善神经功能的方法，其包括向所述受试者给药包含尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而在受试者中改善神经功能。

在另一实施方案中，通过本发明的方法改善的神经功能是突触传递。在一个实施方案中，所述突触传递与运动神经元相邻。在另一实施方案中，所述突触传递与中间神经元相邻。在一个实施方案中，所述突触传递与感觉神经元相邻。每种突触传递类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，通过刺激或增强神经细胞神经突的向外生长来刺激或增强所述突触传递。在另一实施方案中，突触传递的改善或增强部分地由于刺激或增强神经细胞神经突的向外生长引起。在另一实施方案中，本发明的组合物改善或增强突触传递而不刺激神经突向外生长。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，“神经突”是指从神经元向外生长的突起。在一个实施方案中，所述突起是树突。在另一实施方案中，所述突起是轴突。每种类型的神经突代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，通过增加神经细胞神经突的数目来改善或增强突触传递。在另一实施方案中，发生所述突触传递的改善或增强而不增加神经细胞神经突的数目。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，通过刺激或增强神经细胞神经突的分支来改善或增强突触传递。在另一实施方案中，发生所述突触传递的改善或增强而不刺激或增加神经细胞神经突的分支。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

实施例9的数据表明当膜前体水平升高时，神经元产生带有更多分支的神经突。在一个实施方案中，通过增加其表面积和大小，细胞能与相邻细胞形成更多连接。此外，在一个实施方案中，浆膜的量或组分的增加改变神经递质的合成与释放，在一个实施方案中，也会影响记忆形成。因此，促进神经突向外生长的化合物，如尿苷，具有治疗神经变性病症例如涉及神经元连接缺失和记忆损伤的阿尔茨海默病的用途。

在另一实施方案中，通过增加神经细胞膜的量，其作为给药尿苷和/或胆碱的结果实现了在受试者中改善突触传递。在另一实施方案中，通过刺激神经细胞膜的合成实现所述改善。在另一实施方案中，通过增加神经细胞膜的合成实现所述改善。在另一实施方案中，刺激或增加神经细胞膜的量或合成是介导在受试者中改善突触传递的部分原因。在另一实施方案中，所述尿苷和/或胆碱改善突触传递而不刺激或增强神经细胞膜的量或合成。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，被改善或增强的神经功能是神经递质的功能。在一个实施方案中，通过增加突触中神经递质的水平发生所述改善。在另一实施方案中，通过增加神经递质到突触中的释放发生所述改善。在另一实施方案中，发生所述改善而不改变突触中所述神经递质的水平或释放。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

如本文所提供的，图12-13的数据表明尿苷显著地改善神经递质功能，突显尿苷改善神经功能的能力。图14-17的数据表明尿苷对神经突的形态学的有益作用，进一步证明尿苷改善神经功能的能力。实施例15的数据还表明通过加入胆碱增强了尿苷的作用。因此，给药包含尿苷和胆碱的组合物在改善神经功能方面有效-在一个实施方案中，比单独给药尿苷或胆碱更有效。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗或缓解认知功能减退的方法，其包括向所述受试者给药尿苷或其来源，从而在受试者中治疗或改善认知功能减退。

在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗或缓解认知功能减退的方法，其包括向所述受试者给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而在受试者中抑制或预防认知功能减退。

在一个实施方案中，“治疗或缓解认知功能减退”是指减轻所述减退。在另一实施方案中，该短语是指预防所述减退。在另一实施方案中，该短语是指逆转所述减退。在另一实施方案中，该短语是指减慢所述减退。在另一实施方案中，该短语是指停止所述减退。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述认知功能减退由神经病症引起。在一个实施方案中，所述神经病症是记忆病症。在一个实施方案中，所述记忆病症包括记忆减退。在另一实施方案中，所述记忆减退与脑老化有关。在其他实施方案中，所述记忆病症选自于皮克病、路易体病或痴呆。在其他实施方案中，所述痴呆与亨廷顿病或艾滋病痴呆有关。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述认知功能减退由神经变性疾病引起。在一个实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。在其他实施方案中，所述神经变性疾病是肌萎缩性侧索硬化、多系统萎缩症、帕金森病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、亨廷顿病或朊病毒病(prion disease)。在另一实施方案中，所述神经变性疾病是本领域已知的任何其他的神经变性疾病。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述认知功能减退由心血管疾病引起。在一个实施方案中，所述心血管疾病是中风。在另一实施方案中，所述心血管疾病是多发性脑梗死性痴呆。在另一实施方案中，所述心血管疾病是本领域已知的任何其他的心血管疾病。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，所述神经病症与多巴胺能途径有关。在另一实施方案中，所述神经病症与多巴胺能途径无关。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述神经病症是认知障碍。在一个实施方案中，所述认知障碍是诵读困难。在其他实施方案中，所述认知障碍包括缺乏注意力、缺乏机敏、缺乏专注(concentration)、缺乏集中(focus)。在其他实施方案中，所述认知障碍包括最低限度的认知损伤或年龄相关的记忆损伤。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述神经病症是情绪障碍。在其他实施方案中，所述情绪障碍包括躁狂症、抑郁症、紧张、惊恐、焦虑、情绪不良或精神病。在另一实施方案中，所述情绪障碍包括季节性情感障碍。在另一实施方案中，所述情绪障碍包括双相型障碍。

在另一实施方案中，所述神经病症是精神病。在另一实施方案中，所述神经病症是抑郁症。在一个实施方案中，所述抑郁症是内源性抑郁症。在另一实施方案中，所述抑郁症是重度抑郁症。在另一实施方案中，所述抑郁症是伴焦虑症状的抑郁症。在另一实施方案中，所述抑郁症是双相型抑郁症。每种抑郁症类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述神经病症选自于共济失调和弗里德赖希共济失调。

在另一实施方案中，所述神经病症是运动障碍。在其他实施方案中，所述运动障碍包括迟发性运动障碍、肌张力障碍或图雷特综合征。在另一实施方案中，所述运动障碍是本领域已知的任何其他运动障碍。

在另一实施方案中，所述神经病症是脑血管疾病。在一个实施方案中，所述脑血管疾病由缺氧引起。在另一实施方案中，所述疾病由其他能够引起脑血管疾病的原因引起。在另一实施方案中，所述疾病是脑血栓症。在另一实施方案中，所述脑血管疾病是局部缺血。

在另一实施方案中，所述神经病症是行为综合征。在另一实施方案中，所述神经病症是神经综合征。在其他实施方案中，所述行为综合征或神经综合征发生在脑创伤、脊髓损伤或缺氧之后。

在另一实施方案中，所述神经病症是外周神经系统病症。在其他实施方案中，所述外周神经系统病症是神经肌肉病症、重症肌无力或脊髓灰质炎后综合征。在另一实施方案中，所述外周神经系统病症是本领域已知的任何其他外周神经系统病症。在另一实施方案中，所述神经肌肉病症是肌营养不良。

本文提到的每种类型的神经病症代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞合成神经递质的能力的方法，其包括向所述受试者或所述脑细胞或神经细胞给药尿苷或其来源，从而提高或增强受试者的脑细胞合成神经递质的能力。

在另一实施方案中，本发明提供了提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞合成神经递质的能力的方法，其包括向所述受试者或所述脑细胞或神经细胞给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而提高或增强受试者的脑细胞合成神经递质的能力。

在另一实施方案中，本发明提供了提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞反复向突触中释放有效量的神经递质的能力的方法，其包括向所述受试者或所述脑细胞或神经细胞给药尿苷或其来源，从而提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞反复向突触中释放有效量的神经递质的能力。

在另一实施方案中，本发明提供了提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞反复向突触中释放有效量的神经递质的能力的方法，其包括向所述受试者或所述脑细胞或神经细胞给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而提高或增强受试者的脑细胞或神经细胞反复向突触中释放有效量的神经递质的能力。如本文所述，本发明的研究结果表明尿苷增强神经元合成神经递质并反复释放它们的能力(实施例7)。实施例15中的数据进一步表明通过加入胆碱进一步增强了尿苷的这种作用。

在一个实施方案中，经本发明的方法增强的释放在刺激神经元后发生。在一个实施方案中，被增强的所述释放在所述神经元去极化后发生。在一个实施方案中，被增强的所述释放是基底神经递质释放。在一个实施方案中，所述神经元的刺激包括所述神经元与钾离子接触。在另一实施方案中，所述神经元的刺激包括本领域已知的任何其他神经刺激方式。评价神经刺激和神经递质释放的方法在本领域是熟知的，例如在Bewick GS，J Neurocytol.32：473-87，2003中描述的。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了增加突触中神经递质水平的方法，其包括使与所述突触相邻的神经细胞接触尿苷或其来源，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而增加突触中神经递质的水平。

在另一实施方案中，本发明提供了增加突触中神经递质水平的方法，其包括使与所述突触相邻的神经细胞接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而增加突触中神经递质的水平。

在另一实施方案中，本发明提供了提高神经元对刺激的敏感性的方法，其包括使所述神经元接触尿苷或其来源，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而提高神经元对刺激的敏感性。

在另一实施方案中，本发明提供了提高神经元对刺激的敏感性的方法，其包括使所述神经元接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而提高神经元对刺激的敏感性。

在一个实施方案中，其水平或活性或释放受本发明的方法影响的神经递质是乙酰胆碱。在另一实施方案中，所述神经递质是多巴胺。在另一实施方案中，所述神经递质是血清素。在另一实施方案中，所述神经递质是5-羟色胺(5-HT)。在另一实施方案中，所述神经递质是GABA。在另一实施方案中，所述神经递质是本领域已知的任何其他神经递质。每种神经递质类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激受试者的脑细胞或神经细胞生成磷脂酰胆碱(PC)的方法，其包括向所述受试者或脑细胞或神经细胞给药尿苷或其来源，从而刺激脑细胞或神经细胞生成PC。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激受试者的脑细胞或神经细胞生成磷脂酰胆碱(PC)的方法，其包括向所述受试者或脑细胞或神经细胞给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而刺激脑细胞或神经细胞生成PC。如本文所述，本发明的研究结果表明尿苷增强PC前体CDP-胆碱的合成(实施例6)。实施例15中的数据进一步表明通过加入胆碱增强了尿苷的这种作用。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加细胞膜组分的量或合成的方法，其包括使所述细胞接触尿苷或其来源，从而刺激或增加细胞膜的量或合成。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加细胞膜组分的量或合成的方法，其包括使所述细胞接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而刺激或增加细胞膜的量或合成。

在另一实施方案中，通过本发明的方法增强其合成的组分是PC。在另一实施方案中，所述组分是甘油磷脂。在另一实施方案中，所述组分是磷脂酸。在另一实施方案中，所述组分是PE。在另一实施方案中，所述组分是卵磷脂。在另一实施方案中，所述组分是PI。在另一实施方案中，所述组分是PS。在其他实施方案中，所述组分是2-溶血卵磷脂、缩醛磷脂、胆碱缩醛磷脂、磷脂酰甘油、胆碱双磷脂酰甘油、胆碱鞘脂或胆碱鞘磷脂。在另一实施方案中，所述组分是本领域已知的任何其他磷脂。每种磷脂类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加磷脂前体的量或合成的方法，其包括使所述细胞接触尿苷或其来源，从而刺激或增加磷脂前体的量或合成。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加磷脂前体的量或合成的方法，其包括使所述细胞接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而刺激或增加磷脂前体的量或合成。在另一实施方案中，所述磷脂前体是CDP-胆碱(实施例6)。在另一实施方案中，所述磷脂前体是CTP。在另一实施方案中，所述磷脂前体是肌醇。在另一实施方案中，所述磷脂前体是胆碱。在另一实施方案中，所述磷脂前体是甘油。在另一实施方案中，所述磷脂前体是乙酸酯。在另一实施方案中，所述磷脂前体是本领域已知的任何其他磷脂前体。每种磷脂前体代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增强受试者的脑细胞膜或神经细胞膜生成的方法，其包括使所述受试者接触尿苷或其来源，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增强受试者的脑细胞膜或神经细胞膜的生成。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增强受试者的脑细胞膜或神经细胞膜生成的方法，其包括使所述受试者接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增强受试者的脑细胞膜或神经细胞膜的生成。

在一个实施方案中，所述膜是神经突膜。在另一实施方案中，所述膜是树突膜。在另一实施方案中，所述膜是轴突膜。在另一实施方案中，所述膜是本领域已知的任何其他类型的膜。每种膜类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，对细胞膜的量或合成的刺激通过刺激或增强磷脂的合成来实现(实施例6)。在另一实施方案中，对神经细胞膜的量或合成的刺激或增强通过刺激或增强磷脂前体的合成来实现(实施例6)。在另一实施方案中，对磷脂或其前体合成的刺激或增强是刺激神经细胞膜的量或合成的部分原因。在另一实施方案中，本发明的组合物刺激膜的量或合成而不刺激或增强磷脂或其前体的合成。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

评价脑细胞膜或神经细胞膜的生成的方法在本领域是熟知的。在另一实施方案中，膜的生成通过测量神经突的向外生长或分支进行评价(实施例9)。在另一实施方案中，膜的生成通过测量膜标记蛋白的水平进行评价(实施例8)。在另一实施方案中，膜的生成通过测量膜前体的合成进行评价。在另一实施方案中，膜的生成通过在尿苷处理之前和之后测量膜的量进行评价。在另一实施方案中，膜的生成通过测量膜周转的生物学指标进行评价。指标或细胞膜周转是本领域熟知的，例如在Das KP等人，Neurotoxicol Teratol 26(3)：397-406，2004中描述的。每种膜的生成的评价方法代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加神经细胞神经突向外生长的方法，其包括使所述神经细胞接触尿苷或其来源，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增加神经细胞神经突向外生长。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加神经细胞神经突向外生长的方法，其包括使所述神经细胞接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而刺激或增加神经细胞神经突向外生长。如本文所述，本发明的研究结果表明尿苷增强神经突的向外生长和分支(实施例9)。实施例15的数据进一步表明通过加入胆碱增强了尿苷的这种作用。

在另一实施方案中，本发明提供了增加神经细胞神经突数目的方法，其包括使所述神经细胞接触尿苷或其来源，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而增加神经细胞神经突的数目。

在另一实施方案中，本发明提供了增加神经细胞神经突数目的方法，其包括使所述神经细胞接触含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，其中所述组合物增强磷脂或其前体的合成，从而增加神经细胞神经突的数目。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加神经细胞神经突分支的方法，其包括使所述神经细胞接触尿苷或其来源，从而刺激或增加神经细胞神经突分支。

在另一实施方案中，本发明提供了刺激或增加神经细胞神经突分支的方法，其包括使所述神经细胞接触含有尿苷或其来源和/或胆碱的组合物，从而刺激或增加神经细胞神经突分支。

在一个实施方案中，作为本发明的方法的靶的细胞或在所述方法中接触的细胞是神经细胞。在另一实施方案中，所述细胞是脑细胞。在另一实施方案中，所述细胞是其中通过与含有尿苷和/或胆碱的组合物接触增强膜或组分的合成的任何细胞。在另一实施方案中，所述细胞是其中通过与含有尿苷和/或胆碱的组合物接触增强神经功能的任何细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明方法中的神经细胞、神经突或脑细胞是新分化的。在另一实施方案中，所述细胞不是新分化的。在一个实施方案中，“新分化的”是指在开始给药尿苷和/或胆碱之前24小时内分化的神经元。在另一实施方案中，所述神经元在给药前48小时内分化。在另一实施方案中，所述神经元在给药前72小时内分化。在另一实施方案中，所述神经元在给药前1周内分化。在另一实施方案中，“新分化的”是指在开始给药本发明的组合物之后完成其分化的神经元。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

评价神经元分化的方法是本领域熟知的，例如在Contestabile A等人，(Neurochem Int.45：903-14，2004)中描述的。每种方法代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的胞苷水平的方法，其包括向所述受试者给药尿苷或其来源，从而增加组织、血浆或细胞中的胞苷水平。

在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的胞苷水平的方法，其包括向所述受试者给药含有尿苷或其来源以及胆碱的组合物，从而增加组织、血浆或细胞中的胞苷水平。在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的CTP水平的方法，其包括向所述受试者给药本发明的组合物。在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的CDP-胆碱水平的方法，其包括给药本发明的组合物。在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的胞苷、CTP或CDP-胆碱的衍生物的水平的方法，其包括给药本发明的组合物。在另一实施方案中，本发明提供了增加受试者的组织、血浆或细胞中的胞苷、CTP或CDP-胆碱的代谢物的水平的方法，其包括给药本发明的组合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，所述组织是脑组织。在一个实施方案中，所述组织是神经组织。在另一实施方案中，所述组织是脊髓组织。在另一实施方案中，所述组织是本领域已知的任何其他组织。

在一个实施方案中，所述细胞是脑细胞。在一个实施方案中，所述细胞是神经细胞。在另一实施方案中，所述细胞是脊髓细胞。在另一实施方案中，所述细胞是本领域已知的任何其他细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，本发明中给药的尿苷是尿苷-5’-一磷酸(UMP)。在另一实施方案中，所述尿苷是尿苷-5’-二磷酸(UDP)。在另一实施方案中，所述尿苷是尿苷-5’-三磷酸(UTP)。在另一实施方案中，所述尿苷是UDP葡萄糖。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明的方法中给药尿苷前体。在一个实施方案中，给药的所述尿苷前体是胞苷-5’-一磷酸。在另一实施方案中，给药的所述尿苷前体是胞苷-5’-二磷酸(CDP)。在另一实施方案中，给药的所述尿苷前体是CDP-葡萄糖。在另一实施方案中，给药的所述尿苷前体是本领域已知的任何药理学可接受的尿苷前体、衍生物或代谢物。

在另一实施方案中，本发明的方法中给药尿苷衍生物。在一个实施方案中，术语“衍生物”是指与尿苷具有化学关联的化合物，其关联方式使尿苷在受试者体内转化为所述衍生物。在另一实施方案中，“衍生物”是指与尿苷具有化学关联的化合物，其关联方式使所述衍生物在受试者体内转化为尿苷。在一个实施方案中，所述转化通过一个或多个稳定中间体而发生。在另一实施方案中，直接发生所述转化。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明的方法中给药尿苷代谢物。

在其他实施方案中，除尿苷本身之外的尿苷系化合物作为尿苷来源或尿苷前体。在一些实施方案中，其为富含尿苷的食物或饮食产品如藻类、尿苷的盐类如尿苷磷酸盐、酰化尿苷等。在另一实施方案中，给药治疗有效剂量或药理学有效剂量的尿苷酰基衍生物或它们的混合物，如美国专利第5,470,838号中公开的那些。

在另一实施方案中，所述尿苷来源是胞苷二磷酸胆碱(CDP-胆碱；胞二磷胆碱)。尽管在一个实施方案中，胞二磷胆碱含有摩尔比率为1∶1的胆碱和尿苷，但其不足以提供受试者所需的全部胆碱。因此，在这一实施方案中，胞二磷胆碱作为所述受试者所需的全部尿苷和一些胆碱的来源。

在另一实施方案中，本发明的方法中使用尿苷前体、衍生物或来源的盐。在一个实施方案中，所述盐是UMP二钠(实施例2-3)。在另一实施方案中，所述盐是尿苷前体或衍生物的任何其他药理学可接受的盐。在另一实施方案中，给药的组合物含有作为单一活性成分的尿苷或其前体或衍生物的盐。每种尿苷盐代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，给药上述尿苷相关化合物中的两种或多种的混合物。每种尿苷前体、衍生物、代谢物或来源类型代表本发明的不同实施方案。

在一个实施方案中，本文使用的术语“尿苷”是指任何尿苷磷酸盐、尿苷前体、尿苷代谢物、尿苷系化合物或上述的盐。在另一实施方案中，“尿苷”是指本领域已知的任何尿苷或相关化合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，本发明的方法中给药尿苷、其衍生物、来源或前体的剂量为每日约20毫克(mg)至50克(g)之间。在另一实施方案中，所述尿苷或相关化合物的给药剂量为每日约50mg-30g。在其他实施方案中，所述剂量为每日约75mg-20g、100mg-20g、100mg-10g、200mg-8g、400mg-6g、600mg-4g、800mg-3g、1-2.5g、1.5-2g、5mg-5g或5mg-50g。每个剂量或剂量范围代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，本发明的方法中给药的胆碱是胆碱盐。在一个实施方案中，所述盐是胆碱盐酸盐。在另一实施方案中，所述盐是胆碱酒石酸氢盐。在另一实施方案中，所述盐是胆碱硬脂酸盐。在其他实施方案中，所述盐是甘磷酸胆碱、胆碱去氢胆酸盐、胆碱二氢柠檬酸盐或胆碱水杨酸盐。在另一实施方案中，所述盐是本领域已知的任何其他胆碱盐。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述胆碱是胆碱系化合物，如胆碱酯。

在另一实施方案中，所述胆碱是分解为胆碱的化合物。在一个实施方案中，所述化合物是鞘磷脂。在另一实施方案中，所述化合物是酰基甘油磷酸胆碱。在另一实施方案中，所述化合物是卵磷脂。在另一实施方案中，所述化合物是溶血卵磷脂。在另一实施方案中，所述化合物是甘油磷脂酰胆碱。在另一实施方案中，给药两种或多种上述胆碱相关化合物的混合物。

术语“胆碱”，如本文使用的，在一个实施方案中是指任何胆碱磷酸盐、胆碱前体、胆碱代谢物、胆碱系化合物或上述它们的盐。在另一实施方案中，“胆碱”是指本领域已知的任何胆碱或相关化合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述胆碱或胆碱相关化合物的给药方式和剂量使所述受试者的血液或脑中的胆碱水平达到至少20-30纳摩尔。在另一实施方案中，达到10-50纳摩尔的胆碱水平。在另一实施方案中，达到5-75纳摩尔的胆碱水平。在另一实施方案中，达到25-40纳摩尔的胆碱水平。在另一实施方案中，达到30-35纳摩尔的胆碱水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明的方法中给药胆碱、其衍生物、来源或前体的剂量为每日20mg-50g。在其他实施方案中，所述胆碱或相关化合物以每日约50mg-30g、75mg-20g、100mg-20g、100mg-10g、200mg-8g、400mg-6g、600mg-4g、800mg-3g、1-2.5g、1.5-2g、5mg-5g或5mg-50g的剂量给药。每个剂量范围代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，本发明的组合物以在至少10％的被治疗患者中产生期望作用的剂量给药。在另一实施方案中，所述剂量为在至少20％的被治疗患者中产生作用的剂量。在其他实施方案中，在至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的被治疗患者中产生作用。在另一实施方案中，在90％以上的所述患者中产生作用。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，本发明方法的所述受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，所述受试者是人类。在其他实施方案中，所述受试者是啮齿动物或试验动物。在另一实施方案中，所述受试者为雄性。在另一实施方案中，所述受试者为雌性。在另一实施方案中，所述受试者是本领域已知的任何其他类型的受试者。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，术语“给药”是指使受试者与本发明的化合物接触。在其他实施方案中，给药包括吞咽或吸取本发明的组合物。在另一实施方案中，给药步骤使用药物组合物、营养添加剂等。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，给药由所述受试者实施。在另一实施方案中，给药由护理者实施。在另一实施方案中，给药由第三方实施。每种给药类型代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，作为本发明方法的一部分，向所述受试者给药其他的治疗化合物。在另一实施方案中，所述尿苷或其前体、衍生物或来源是所述组合物中的唯一活性成分。在另一实施方案中，所述尿苷或其前体、衍生物或来源以及胆碱或其前体、衍生物或来源是所述组合物中的唯一活性成分。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，所述其他的治疗化合物是充当尿苷磷酸化酶抑制剂的药物，如苄基巴比妥盐或其衍生物。在另一实施方案中，所述化合物是增加尿苷利用度的药物。在另一实施方案中，所述化合物是尿苷分泌抑制性化合物，如地拉齐普或克冠二胺。在另一实施方案中，所述化合物是尿苷肾转运竞争剂，如L-尿苷、L-2′，3′-二脱氧尿苷和D-2′，3′-二脱氧尿苷。在另一实施方案中，所述化合物是与尿苷协同作用生成磷脂的药物。在另一实施方案中，所述化合物是与尿苷在肾清除过程中发生竞争的化合物，如L-尿苷、L-2′，3′-二脱氧尿苷和D-2′，3′-二脱氧尿苷或它们的混合物，如在美国专利第5,723,449和5,567,689号中公开的。在另一实施方案中，所述化合物是对受试者有益的任何其他化合物。

在另一实施方案中，本发明的方法通过刺激神经细胞、神经元或脑细胞的P2Y受体而引起上述作用之一。在另一实施方案中，上述作用之一部分地由刺激神经细胞或神经元的P2Y受体而引起。在另一实施方案中，上述作用之一部分或完全地由刺激另一细胞类型的P2Y受体而引起。在另一实施方案中，不刺激P2Y受体而引起上述作用之一。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，P2Y受体的刺激由本发明组合物中的尿苷或相关化合物介导。在另一实施方案中，所述尿苷被转化为刺激细胞中P2Y受体的第二化合物。在一个实施方案中，所述第二化合物是尿苷-5’-三磷酸。在另一实施方案中，所述第二化合物是尿苷或其衍生物或来源的本领域已知的任何代谢产物。每种化合物代表本发明的单独的实施方案。在其他实施方案中，所述尿苷或其衍生物或来源在细胞内或细胞外被转化为所述第二化合物。在另一实施方案中，所述尿苷或其衍生物或来源在被转化为所述第二化合物之后从细胞中分泌出来。在另一实施方案中，所述尿苷或其衍生物或来源在从将其转化为第二化合物的细胞中分泌出来后与不同细胞接触，并在所述不同细胞中刺激P2Y受体。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

P2Y受体是已知与血小板活化和其他生物学功能有关的受体家族。它们被综述在Mahaut-Smith MP等人，Platelets.200415：131-44，2004中。

在一个实施方案中，本发明的P2Y受体是P2Y2受体。在另一实施方案中，所述P2Y受体是P2Y4受体。在另一实施方案中，所述P2Y受体是P2Y6受体。在另一实施方案中，所述P2Y受体是本领域已知的任何其他P2Y受体。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在另一实施方案中，所述P2Y受体刺激第二信使。在一个实施方案中，所述第二信使是Gα蛋白。在另一实施方案中，所述第二信使是Gα(q)蛋白。在另一实施方案中，所述第二信使是cAMP。在另一实施方案中，所述第二信使是本领域已知的任何其他第二信使。第二信使及其相关的信号转导途径在本领域是熟知的，例如在Ferguson S，Pharm Rev 53：1-24，2001；Huang E等人，Ann Rev Biochem 72：609-642，2003；和Blitterswijk W等人，Biochem.J.369：199-211，2003中描述的。每种第二信使代表本发明的单独的实施方案。

在其他实施方案中，所述第二信使刺激磷脂酶C，调节细胞内钙水平或增加蛋白激酶C的活性。在一个实施方案中，上述途径中的一种或多种刺激膜的生成。在另一实施方案中，所述第二信使调节或刺激另一细胞途径，所述另一细胞途径刺激膜的生成。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，本发明的组合物中的尿苷或相关化合物刺激除P2Y受体之外的受体。

在本发明方法的另一实施方案中，所述尿苷和/或胆碱在受试者的血流中被携带至所述受试者的脑细胞或神经细胞中。在另一实施方案中，所述物质通过扩散被携带至所述受试者的脑细胞或神经细胞。在另一实施方案中，所述物质通过主动转运被携带至所述受试者的脑细胞或神经细胞。在另一实施方案中，所述物质以使其直接接触受试者的脑细胞或神经细胞的方式向所述受试者给药。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一个实施方案中，“药物组合物”是指治疗有效量的活性成分，即尿苷和/或胆碱，连同药学可接受的载体或稀释剂。在另一实施方案中，“治疗有效量”是指为给定病症和给药方案提供治疗作用的量。

在其他实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法例如胃肠外地、癌旁侧地(paracancerally)、经粘膜地、经皮地、肌内地、静脉内地、皮内地、皮下地、腹膜内地、心室内地、颅内地、阴道内地或瘤内地向受试者给药含有尿苷和/或胆碱的药物组合物。

在另一实施方案中，所述药物组合物经口服给药，且因此配制为适于口服给药的剂型，即作为固体或液体制剂。合适的口服固体制剂包括，例如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、弹丸剂等。合适的口服液体制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的一个实施方案中，含有所述尿苷和胆碱的组合物被配制在胶囊中。根据此实施方案，本发明的组合物除活性化合物和惰性载体或稀释剂外，还含有硬明胶胶囊。

在另一实施方案中，所述药物组合物经静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂给药。合适的液体制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施方案中，所述药物组合物经静脉内给药，且因此配制为适于静脉内给药的形式。在另一实施方案中，所述药物组合物经动脉内给药，且因此配制为适合于动脉内给药的形式。在另一实施方案中，所述药物组合物经肌内给药，且因此配制为适合于肌内给药的形式。

此外，在另一实施方案中，所述药物组合物作为栓剂给药，例如直肠栓剂或尿道栓剂。在另一实施方案中，所述药物组合物以皮下植入弹丸剂给药。在另一实施方案中，所述弹丸剂在一段时间内提供尿苷和/或胆碱的控制释放。

药学可接受的载体或稀释剂是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，所述载体或稀释剂是用于固体制剂的固体载体或稀释剂、用于液体制剂的液体载体或稀释剂或它们的混合物。

在其他实施方案中，固体载体/稀释剂包括树胶、淀粉(如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(如乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(如微晶纤维素)、丙烯酸酯(如聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。

对于液体制剂，在其他实施方案中，药学可接受的载体是水溶液或非水溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂包括丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水及缓冲介质。油的实例有石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、橄榄油、葵花籽油和鱼肝油。

在另一实施方案中，所述组合物还含有粘合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜耳胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜耳胶、淀粉乙醇酸钠)、不同pH和离子强度的缓冲剂(如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止表面吸附的添加剂如白蛋白或明胶、洗涤剂(如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜耳胶)、甜味剂(如阿司帕坦、柠檬酸)、防腐剂(如柳硫汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯类)、润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、助流剂(如胶体二氧化硅)、增塑剂(如酞酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物包衣剂(如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣及成膜剂(如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或辅剂。

在另一实施方案中，本文提供的所述药物组合物是控释组合物，即其中尿苷和/或胆碱在给药后一段时间内释放的组合物。控释或延时释放的组合物包括在亲脂性贮库(depot)(如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一实施方案中，所述组合物是速释组合物，即其中全部尿苷和/或胆碱在给药后立即释放的组合物。

在另一实施方案中，所述药物组合物在控释系统中递送。例如，使用静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴、脂质体或其他给药方式给药所述组合物。在一个实施方案中，使用泵(参见Langer，supra；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574(1989)。在另一实施方案中，使用聚合材料。在另一实施方案中，将控释系统置于治疗靶即脑的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984)。Langer(Science 249：1527-1533(1990)在其综述中讨论了其他控释系统。

通过例如混合、制粒或压片过程制备含有活性组分的药物组合物在本领域是熟知的。所述活性治疗成分通常与药学可接受的并与所述活性成分相容的赋形剂混合。对于口服给药，尿苷和/或胆碱或其生理学可耐受的衍生物如盐、酯、N-氧化物等与针对此目的的常规添加剂如载体、稳定剂或惰性稀释剂混合，经常规方法转化为合适的给药形式如片剂、包衣片剂、硬明胶胶囊或软明胶胶囊、水溶液、醇溶液或油溶液。对于胃肠外给药，如果需要，所述尿苷和/或胆碱或其生理学可耐受的衍生物如盐、酯、N-氧化物等，与针对此目的的常规和合适的物质如助溶剂或其他物质一起转化为溶液剂、混悬剂或乳剂。

活性组分可作为中和的药学可接受的盐形式被配制进所述组合物中。药学可接受的盐包括酸加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成)，其为与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。从游离羧基形成的盐也可从无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等衍生得到。

对于药物中使用，所述尿苷和/或胆碱的盐是药学可接受的盐。在一个实施方案中，其他盐可用于制备本发明的化合物或其药学可接受的盐。本发明化合物的合适的药学可接受的盐包括酸加成盐，其可通过例如将本发明的化合物的溶液与药学可接受的酸溶液如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸混合进行制备。

实验详述

实施例1

用HPLC测量胞苷而不受酪氨酸干扰

材料与方法

样品的准备

向1毫升(mL)肝素化血浆样品中加入1μg氟尿苷用作内标，然后加入甲醇(5mL)脱蛋白。将样品离心、冻干、重新溶解于5mL 0.25N乙酸铵(pH 8.8)中，然后立即用硼酸盐亲和柱(boronate affinity column)纯化。

硼酸盐亲和柱

所有步骤都在4℃下进行。对硼酸盐亲和柱(Affigel-601，Bio-Rad)用5mL乙酸铵洗涤两次进行预处理，加入样品，再次用乙酸铵洗涤柱，然后用0.1N甲酸(7mL)洗脱核苷。将洗脱液冻干，然后重新溶解于100μL水中进行HPLC分析。硼酸盐亲和柱与许多生物分子结合，包括核苷碱基腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷。

HPLC

在室温下，使用装配有Rainin Dynamax Microsorb C18柱(3μm填料；4.6X100mm)的Beckman System Gold仪器(Beckman Instruments)进行HPLC分析。标准HPLC方法描述于Lopez-Coviella等人，(J.Neurochem 65：889-894，1995)中。修正后的HPLC方法使用等度洗脱缓冲液，其含有0.004N磷酸钾缓冲液(pH 5.8)和0.1％甲醇，而不含甲酸，流速为1mL/min并加热至35°。

结果

测量核苷的标准HPLC方法得到单独的尿苷和胞苷峰，但是胞苷与酪氨酸的峰重合妨碍了胞苷水平的精确测量，如人血浆样品所示(图1)。酪氨酸在很多生物流体如血浆或脑脊液(CSF)中存在。在本实施例中，使用修正后的HPLC方法，其将胞苷峰与酪氨酸峰区别开，允许精确地测量胞苷水平(图2)。

实施例2

口服给药UMP增加人血浆中的尿苷水平

材料与实验方法

研究设计

指导8名健康受试者(5例男性，3例女性，27-67岁)禁食过夜，在三天内每天7-8AM顺序增加剂量(500、1000和2000mg)给予UMP二钠(Numico，Wageningen，NL)，间隔至少三天的洗脱期。所有受试者都给予午餐。在8小时期间将血样抽取至肝素化试管中。用甲醇处理血浆以沉淀蛋白，用氯仿萃取，将水层的一等份冻干，溶于水中，用配有UV检测的HPLC进行分析。

统计学分析

用SPSS 12.0进行统计学分析。数据表示为平均值±SEM。如上下文中详细描述的，用不对称t检验、单向方差分析(ANOVA)、伴随重复测量的ANOVA、双向ANOVA评价统计学效果。适时进行Tukey’s HSD事后(post hoc)分析。显著性水平设为p＜0.05。

结果

向受试者口服给药500、1000或2000mg UMP，在基线水平和给药后1、2、4和8小时测量血液尿苷水平。如实施例1所述分析血浆尿苷水平。血浆尿苷水平响应口服UMP，以剂量依赖的方式升高，接着在8小时内回复至基线水平(图3)。

实施例3

口服给药尿苷或UMP增加沙鼠血浆尿苷水平

材料与实验方法

实验设计

使每组8至9只雄性沙鼠(60-80g)的动物组禁食过夜，给药(a)尿苷(Sigma，St.Louis，MO；250mg/kg体重)(图4)或UMP二钠(1mmol/kg体重，使用管饲法，剂量相当于250mg/kg尿苷)(图5)，1小时后在Telazol麻醉下断头处死。对于图6，用含有0、0.1、0.5或2.5重量％UMP的饲料(Harlan Teklad，Madison，WI)没有限制地饲养沙鼠4周，禁食过夜，然后消耗相同组成的最后一餐后1小时被处死。从颈部取血收集至含有EDTA的试管中，如上文实施例2所述进行处理。

结果

为确定口服给药尿苷是否能够提高血浆尿苷水平，通过管饲法给予沙鼠250mg/kg胞苷或尿苷。60分钟(min)后，通过如实施例1所述的方法评价血浆尿苷水平。与用不含胞苷或尿苷的饲料饲养的对照组相比，饮食中的胞苷和尿苷都使血浆尿苷以统计学的显著水平增加，饮食中的尿苷比饮食中的胞苷导致血浆尿苷水平高约3倍(图4)。

在评价血浆尿苷水平升高的时间进程的单独的实验中，给予沙鼠水或每千克(kg)体重1毫摩尔(mmol)UMP，在之后60分钟内不同的时间点处死动物，评价血浆尿苷水平。血浆尿苷水平在给药后10分钟内升高，在30分钟后达最大值水平(图5)。

在另一实验中，用对照饮食或含有0.1％、0.5％或2.5％UMP的饮食饲养沙鼠。1小时后，评价血浆尿苷水平。如图6中描述的，血浆尿苷水平响应饮食UMP，以剂量依赖的方式升高。这些结果表明口服给药尿苷被吸收至血流中。

实施例4

口服给药尿苷或UMP升高沙鼠脑中尿苷水平

材料与方法

沙鼠脑组织制备

断头后迅速从头骨中取出脑，在干冰上冷冻，在80％甲醇中匀浆，离心、冻干，如实施例3所述进行分析。

结果

为确定口服给药尿苷是否能够升高脑中尿苷水平，将实施例3中第一项实验中的沙鼠脑匀浆并测定尿苷水平。相对于对照动物，口服给药胞苷导致脑中尿苷水平升高两倍，口服给药尿苷导致脑中尿苷水平升高三倍以上(图7)。各组间的全部差异都具有统计学显著性。

为评价血浆尿苷水平升高的时间进程，对实施例3中第二项实验中的沙鼠脑中尿苷水平进行评价。给药尿苷后10分钟内脑中尿苷水平升高，30分钟内达最大值水平，与血浆中尿苷水平结果相似(图8)。这些结果表明口服给药的尿苷有效地被转运至脑内。

实施例5

尿苷易于在脑中转化为胞苷

在一项单独的实验中，向沙鼠口服给药250mg/kg体重的尿苷，60分钟后评价血浆中和脑中胞苷和尿苷水平。计算相对于对照动物增加的倍数并描述于图9A(血浆)和图9B(脑)中。在每种情况下，用尿苷升高的倍数将胞苷升高的倍数标准化，将尿苷升高的倍数任意设为100％。这些结果表明(a)血流中尿苷被转运至脑内，(b)尿苷在血浆中代谢过程与脑中不同，特别地，在脑中尿苷比在血浆中被更有效地转化为胞苷。

实施例6

尿苷增加脑中和神经细胞系中的磷脂前体CDP-胆碱水平

方法

实验设计

由三项实验合并数据，具有从5至16只动物的组大小。经管饲法向雄性沙鼠(60-80g)给药UMP(1mmole/kg体重)，在标示时间处死动物。如实施例4所述，将脑匀浆、沉淀蛋白和冻干后，用HPLC-UV分析样品。

评价CDP-胆碱水平

将脑组织或细胞溶于甲醇/氯仿(1∶2vol/vol)中，离心，将水相真空干燥，重新悬浮于100-200μL水中，在离子交换柱(Alltech Hypersil APS-2，5μM，250x4.6mm)上进行HPLC分离。用NaH₂PO₄缓冲液A(1.75mM NaH₂PO₄，pH 2.9)和B(500mM，pH 4.5)的线性梯度洗脱CDP-胆碱，其允许在40分钟内将CDP-胆碱从非常接近的共洗脱物质如UMP中洗脱出来。CDP-胆碱的保留时间为9.5min。在380nm处通过UV吸收检测各核苷的峰，通过与可靠的标准位置进行比较以及通过向遴选样品中加入核苷标准来确认各峰。

PC12细胞

在37℃，在添加10％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(MEM；Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养PC12细胞。实验培养物在含有或不含有受试化合物、含有50ng/ml小鼠2.5S(2.5亚基)NGF和1％FBS的培养基中培养2天或4天。

NGF和FBS从Invitrogen获得。

结果

为评价口服给药的尿苷对脑中磷脂前体水平的影响，对实施例3中第二项实验中沙鼠的脑中CDP-胆碱的水平进行测定，CDP-胆碱是在通过肯尼迪途径进行磷脂生物合成中的重要中间体。给药UMP后30分钟CDP-胆碱水平以线性方式显著升高(回归分析，r＝0.98，p＜0.02)。

为直接证明尿苷在神经细胞中转化为CDP-胆碱，用尿苷处理能分化为神经细胞的细胞系PC12细胞，测量细胞内CDP-胆碱水平。尿苷处理在50分钟后使CDP-胆碱水平显著升高(图11)。这些结果表明，转运至脑中后，尿苷转化为磷脂前体如CDP-胆碱，可能是通过中间体CTP完成转化，因此通过增加磷脂前体在脑细胞中的合成来增强认知功能。

实施例7

口服给药UMP增加老年大鼠脑中神经递质的释放

方法

动物和饮食UMP添加

中年雄性Fischer 344大鼠从National Institute on Aging(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)获得，进行微透析时年龄为22-24个月。在标准饲养条件下饲养大鼠，实施12hr光照/黑暗循环，没有限制地提供食物和水。每只大鼠消耗约500mg/kg/日的UMP·2Na(通过i.p.给药尿苷的LD₅₀约为4.3g/Kg)。

在用实验室对照饮食(Teklad Global 16％啮齿动物蛋白质饮食，TD.00217，Harlan Teklad，Madison，WI)饲养大鼠之前使大鼠在动物饲养设施中适应7天以上，或者在该饮食中添加UMP·2Na⁺(2.5％，TD.03398，UMP·2Na⁺；NumicoResearch，the Netherlands)，持续6周。

大鼠在到达至少7天之后才开始用研究饮食饲养。开始饲养时对其称重(t＝0)，然后1、2、4、6周后再称重。在0时间，将大鼠随机分为两组。两组间体重没有显著差异(F_1，11＝3.03，p＞0.05)；平均体重为455±5(N＝13只大鼠)。作为受试者内因素的几周重复测量表明饲养时间(0、1、2、4、6)显著改变体重(F_4，44＝2.65，p＜0.05)，而UMP-饮食(与对照相比)和UMP×时间相互作用都不影响体重(分别为F_1，11＝0.01，F_4，44＝1.25，全部p＞0.05)。

本实施例所述实验进行两次，每次有7只对照大鼠和9只给予UMP饮食的大鼠。

化学品与溶液

多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、血清素(5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)和3，4-二羟基苯甲酸(DHBA；内标)购自Sigma(St.Louis，MO)，将其溶于HClO₄(0.1M)制备1mM储备液，将各等份在-80℃保存。盐酸氯胺酮(100mg/ml)购自Fort Dodge Animal Health(Fort Dorge，IA)。甲苯噻嗪(20mg/ml)来自Phoenix Scientific，Inc.(St.Joseph，MO)。

林格溶液由NaCl 147、KCl 2.7、CaCl₂1.2和MgCl₂0.85mM组成。对于高钾溶液，将KCl增至80mM，将NaCl降至69.7mM以维持渗透压。所有的溶液都用双蒸去离子水制备并用(Millipore，Bedford，MA)过滤。

体内微透析

用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为80和10mg/Kg体重，腹膜内)将大鼠麻醉并置于Kopf立体定位架上。所有的手术工具都通过热珠干燥灭菌器或70％乙醇灭菌。用2mm环锯骨钻在颅骨上钻一个小孔。将CMA/11 14/04Cupr探针(O.D.0.24mm，4mm膜，6,000Da，CMA微透析，瑞典)植入右侧纹状体中(AP＝+0.5，距前囟点ML＝-3.0，距硬膜DV＝-7.3mm，如Paxinos G等，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates，第二版，Academic Press，San Diego所述)，切割条(incisor bar)设为-5.0mm。用牙科粘固粉和三个固定螺丝将探针永久固定在颅骨的位置上。手术后，给大鼠腹膜内注射盐水(5ml/kg)，将大鼠置于热垫上，使体温保持在37℃直至苏醒。

将自由行动的大鼠置于旋转平台上的环状碗中，不需要使用液体转环(参见Wang L等人，Neurochem Int 42：465-70，2003)，使大鼠在手术后第一天熟悉环境。实验在手术后约48小时进行，在10:00am-4:00pm之间进行。用聚全氟乙丙烯(FEP)树脂管和防漏气注射器(Exmire I型，CMA)连续灌注林格溶液，使用微量输液泵(CMA/100)，恒定速率为1.5μl/min。每隔15分钟收集透析液，收集前向取样小瓶中加入5μl由0.2M HClO₄和0.1mM EDTA组成的抗氧化混合物以保护多巴胺及其代谢物。从分析中弃去前60分钟的样品。然后连续三个时间段收集样品。除最后时间段(1.5小时，6个样品)之外，其他样品收集时间为1小时(4个样品)。顺序如下：时间段1(aCSF)、2(高K⁺)、3(aCSF)。所有的样品都在碎冰上收集，立即冷冻并保存在-80℃直至HPLC分析。

解剖脑获得蛋白质和单胺

微透析实验后，用氯胺酮和甲苯噻嗪(80和10mg/Kg，i.p.)将大鼠麻醉。经探针推入黑色墨水将探针周围组织染色。用截断机(guillotine)将大鼠断头处死。在冷冻解剖板上迅速取出脑。将左侧纹状体在置于液氮中的Eppendorf管中迅速冷冻用于将来蛋白质分析。将右侧纹状体进一步解剖，并经目测确定探针位置。若该纹状体内未发现探针，则未包括该数据。

将另一组大鼠(20月龄；对照组和UMP组都是n＝6)饲养6周。对这些大鼠不进行微透析。如上所述收集纹状体(左右两侧)以测定多巴胺及其代谢物的组织水平。

提取组织多巴胺样品

将纹状体称重，在Eppendorf管中在冰上用含有0.1M HClO₄和1μMEDTA的1ml H₂O匀浆1分钟。涡旋混合(vortexing)10秒后，将一等份用于双金鸡宁酸(Sigma，St.Louis，MO)蛋白质测定。然后用Ultrafree-MC离心过滤单元(Millipore，14,000rpm/15min/4℃)过滤此匀浆液。在对水层进行HPLC分析前，完成1∶10的稀释。匀浆前向样品中加入DHBA作为内标。用HPLC测定多巴胺及其代谢物浓度，将三次重复测量值取平均值，并标准化至每个样品蛋白质的量。

多巴胺及代谢物的分析

使用带有ESA微透析池(5014B型，ESA，North Chelmsford，MA)的ESACoulochem ll 5100A检测器(E₁＝-175mV；E₂＝+325mV；E_guard＝350mV)测定透析液和组织样品中的DA和代谢物。流动相(MD-TM，ESA)由75mMNaH₂PO₄、1.7mM 1-辛磺酸、100μl/L三乙胺、25μM EDTA、10％乙腈组成，pH 3.0。流速为0.4mL/min。将柱(ESA MD 150，3×150mm，3μm，

)保持在40℃的柱箱中。样品经Alltech 580自动进样器(Alltech，Deerfield，IL)注射至HPLC，分析过程中用冷却盘将温度保持在4℃。数据由Alltech AllChrom^TM数据系统收集，用AllChrom plus^TM软件分析。所使用的时间线程序在样品分离和检测过程中可以改变检测增益(gain)，以使可能通过一次注射获得透析液中低DA浓度和高代谢物浓度的数据。

数据分析

根据取样时间表示数据，每个点有6-9次测量(平均值±测量的标准误差[S.E.M.])。基于K⁺刺激之前的前四个连续样品的平均值确定DA和主要代谢物的基底值(透析液中的平均值为10.2±0.4nM，n＝22)，其被指定为100％的值。使用双向ANOVA(处理×时间)和Turkey’s HSD事后检验进行统计。使用单向ANOVA比较每个时间点三组之间的差异。p＞0.05用于评价统计学显著性。多巴胺基底水平在两次重复实验中是一致的，因此将它们合并至相应的组中(F_1，20＝3.99，p＞0.05)。在K⁺刺激之前的四个连续样品中，透析液中的DA基底水平在平衡1小时后是稳定的(F_3，57＝0.15，p＞0.05；单向ANOVA，使用取样时间(0、15、30、45min)的重复测量作为受试者内因素)。

与DA基底水平相似，DOPAC和HVA在透析液中的基底水平为612±14和369±7nM(n＝22只大鼠)，且为稳定的(分别为F_3，57＝1.06，F_3，57＝0.84，在每种情况下，p＞0.05)。UMP处理对DOPAC和HVA基底水平没有影响(对照与UMP-1周相比与UMP-6周相比；分别为F_2，19＝0.27，F_2，19＝0.03，在每种情况下，p＞0.05)。

结果

为评价口服给药的尿苷代谢物对脑中神经递质释放的影响，将老年大鼠饲养于受限环境中，使其食用对照饮食或添加2.5％UMP的饮食1周或6周的时间。UMP添加没有影响治疗组透析液中的DA基底水平(对照与UMP-1周相比与UMP-6周相比；F_2，19＝0.98)。透析液中的DA浓度为10.2±0.4nM(n＝22只大鼠)。

饮食UMP添加对K⁺诱发的纹状体DA释放的影响(用高K溶液灌注后)描述于图12A中。在对照组、UMP-1周处理组和UMP-6周处理组的透析液中DA水平中发现统计学显著性差异(F_2，266＝3.36)。事后多重比较显示对照组与UMP-6周组之间有显著性差异。将数据进一步分为三个部分(之前、K⁺诱发、之后)，也显示对照组与UMP-6周组之间相比，K⁺诱发的DA释放从283±9％显著增加至341±21％(图12B)。UMP-1周组的DA释放(316±15％)与对照组相比也有所升高，但这种升高不具有显著性。

然后，对饮食UMP添加对纹状体透析液中DA代谢物3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)水平的影响进行评价。与基线水平相比，K⁺去极化在所有组中都使DOPAC(图13A)和HVA(图13B)水平显著降低至65±4％和51±4％(分别为F_2，95＝51.90，F_2，95＝92.74，所有p＜0.01)。治疗组之间K⁺降低的DOPAC和HVA水平没有差异(分别为F_2，266＝1.01，F_2，266＝1.20)。在105分钟处将溶液从高K⁺换回至正常林格溶液，使透析液中DOPAC和HVA水平均升高，换溶液后30分钟达到最大水平(DOPAC，169±9％；HVA，149±5％)。然而，三组之间没有发现显著性差异。

此外，表明饮食UMP增加纹状体中来自神经元的神经递质乙酰胆碱的基底释放(图14)。

这些结果表明(a)口服给药的尿苷增加脑中神经递质的释放；(b)尿苷介导的脑功能增强是多物种现象，不限于沙鼠；以及(c)尿苷对脑功能的增强作用发生在生物学相关的针对老年损伤性的认知功能障碍的动物模型中。

实施例8

口服给药UTP增加老年大鼠脑中NF-70和NF-M水平

方法

数据分析

根据UMP的处理表示数据，每组测量6-16次(平均值±S.E.M.)。使用单向ANOVA和Turkey’s HSD事后检验比较各治疗组间的差异，使用Newman-Keuls多范围检验分析图16的数据。

蛋白质印迹法

将纹状体组织置于含有200μl溶胞缓冲液(60mM Tris-HCl，4％SDS，20％甘油，1mM二硫苏糖醇，1mM AEBSF，8μM抑酞酶，500μM苯丁抑制素，15μM E64，200μM亮肽酶素，10μM胃酶抑素A)的Eppendorf管中。将样品超声，沸腾(10min)并离心(14,000g，室温下1分钟)。将上清液转移至洁净试管中，使用双金鸡宁酸分析(Sigma，St.Louis，MO)测定总蛋白质含量。

加样等量蛋白质(40μg蛋白质/泳道)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4-15％SDS PAGE；Bio-Rad，Hercules，CA)。进行凝胶电泳之前，向每个样品中加入溴酚蓝溶液(0.07％)。分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P，Millipore)上，用5％牛血清白蛋白封闭(Tris-缓冲盐水/0.15％吐温20)1小时。在Tris-缓冲盐水(TBST)进行3次10分钟的洗涤之后，将印迹在TBST中与针对重要蛋白质的各种抗体包括NF-70、NF-M(分别为1∶2000、1∶5000；Calbiochem，La Jolla，CA)在4℃下在轨道摇床上一起培养过夜。使用ECL系统(Amersham，Piscataway，NJ)和Kodak X-AR胶片分别检测并显影蛋白质-抗体复合物，根据制造商的说明进行操作。使用带有透明度适配器的Supervista S-12扫描仪将胶片数字化(UMAX Technologies，Freemont，CA)。使用公共域NIH Image程序(NIH V.1.61)进行分析。

结果

为评价增加尿苷水平是否能够增加脑中新膜的生成，对实施例7中所述实验中的大鼠脑中神经微丝70(NF-70)水平和神经微丝M(NF-M)的水平、神经突向外生长的生物标志进行评价。如图15所示，UMP饮食添加持续6周分别显著升高了NF-70(图15A)和NF-M(图15B)水平至对照值的182±25％(F2，31＝6.01，p＜0.05)和221±34％(F2，21＝8.86，p＜0.01)。与对照组相比，食用UMP饮食1周没有以统计学显著的方式增加这两种蛋白水平。纹状体中NF-70和NF-M水平分别增加至对照值的204±36％和221±34％。

实施例9

口服给药尿苷或UTP增加PC 12细胞中神经突向外生长和分支以及NF-70和NF-M水平

方法

数据分析

数据表示为平均值+/-S.E.M。使用方差分析(ANOVA)确定组间差异(显著性水平，p＜0.05)。当检测到差异时，使用Newman-Keuls多重范围检验区别平均值。

神经突向外生长研究

将PC12细胞稀疏地铺于涂有胶原的60mm培养皿中，培养基是MEM，含有1％胎牛血清。实验组如下：尿苷、尿苷三磷酸、胞苷、反应蓝2、苏拉明和PPADS(Sigma，St.Louis，MO)。铺板24小时后进行处理。处理期结束时，用相差Zeiss Axioplan 2显微镜和OpenLab软件获取影像。每个培养皿获取6个数码影像，每个处理组共获取18-24个影像。对每项实验中每个处理组约有300个细胞被定量。实验一式三份进行。神经突的定量，包括神经突分支和神经突长度，由对实验组不知情的其他研究者进行。使用公共域NIH软件“Image J.”测量神经突长度。长于细胞体直径的突起被计数为神经突。只对带有突起的细胞进行分析。

细胞内UTP和CTP的检测

除了用5mM NaH₂PO₄，pH 2.65作为缓冲液A之外，如实施例6所述用HPLC分析细胞内UTP和CTP水平。

结果

接着对尿苷处理(10-200μM)对NGF诱导的神经突向外生长的影响进行测试。NGF不存在时，PC12细胞不生长神经突(低于1％)。NGF不存在时，尿苷(50μM，2天或4天)处理未导致神经突的生成。在NGF的存在下，在尿苷(50-200μM)处理4天后显著(p＜0.01或0.001)增加了每个细胞的神经突数目(图16A-C)，而处理2天或较低的尿苷浓度(10，25μM)则没有作用。用胞苷处理接触NGF的细胞对神经突向外生长也没有作用。

由于尿苷增加了每个细胞的神经突数目，所以还评价了在NGF的存在下尿苷对神经突分支和长度的影响。用尿苷(50μM)和NGF处理4天后，与仅用NGF处理的细胞相比，每个细胞的神经突分支点数目显著增加(p＜0.01)(图16D)。尿苷对NGF分化细胞的平均神经突长度没有显著影响。

神经突内高度富含神经丝蛋白，因此增加神经突的数目应该与神经丝蛋白的表达增加有关。因此，对单独用NGF或用NGF加尿苷(50μM)处理4天后的PC 12细胞中的NF-70(70kD)和NF-M(145kD)水平进行测量(图16E)。与仅用NGF处理的细胞相比，尿苷处理后的NF-70和NF-M表达都显著增加(分别为p＜0.01，p＜0.001)。NGF不存在时，尿苷处理对两种神经丝蛋白的水平都没有影响。因此，尿苷在PC 12细胞中促进神经突的向外生长。

NGF不存在时，加入外源性尿苷增加PC 12细胞中的细胞内UTP和CDP-胆碱的水平(实施例6)。为确定在NGF存在下尿苷是否影响UTP或CTP水平，在NGF存在下，对不用核苷处理(对照)、用尿苷、胞苷或UTP处理的PC 12细胞中的UTP和CTP水平进行测定。与仅接受NGF处理的细胞相比，尿苷(50μM)显著(p＜0.05)增加了UTP和CTP水平(分别为图17A-B)。UTP(100μM)或胞苷(50μM)没有显著影响两种核苷的细胞内水平。

为确定UTP是否可介导尿苷对神经突向外生长的作用，用NGF和不同剂量的UTP处理PC12细胞。处理4天后，与仅用NGF处理的细胞相比，UTP(10和50μM)显著(p＜0.01)增加了神经突的向外生长。因此，尿苷或UTP促进神经突向外生长。

总之，尿苷或UTP饮食添加增加了大鼠脑中两种主要神经丝蛋白的水平，并直接表明其在PC 12细胞中诱导神经突向外生长。

实施例10

NGF分化的PC 12细胞表达嘧啶敏感性P2Y2、P2Y4和P2Y6受体

方法

P2Y受体的检测

如实施例8所述进行蛋白质印迹法，使用兔抗-P2Y2、抗-P2Y4(都来自于Calbiochem)；或兔抗-P2Y6(Novus Biologicals，Littleton，CO)。

免疫细胞化学

如上所述处理PC12细胞，只是在铺有胶原的12mm盖玻片(A.Daigger &Co.，Vernon Hills，IL)上培养细胞。经免疫荧光使蛋白质显影。简言之，用4％的低聚甲醛固定细胞，用0.25％Triton X-100进行透化处理，用10％正常山羊血清封闭，在适当的抗体(小鼠抗NF-70以及兔抗-P2Y2、兔抗-P2Y4或兔抗-P2Y6)中培养过夜。对于P2Y2和P2Y4显影，将对照培养物与一级抗体加对照抗原一起培养以确保免疫染色具有特异性。对于P2Y6受体的对照抗原是不可得的。然后在荧光染料辍合的二级抗体(山羊抗兔ALEXA 488和山羊抗小鼠ALEXA 568；Molecular Probes，Eugene，OR)中培养细胞1小时，然后用含有或不含DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的固定介质将其固定在载玻片上。使用一级抗体的对照抗原以确保免疫染色具有特异性。使用Zeiss(Oberkochen，德国)Axioplan显微镜和OpenLab软件获得数字化影像，使用Zeiss Plan-Neofluor 40x油浸目镜。

结果

UTP是P2Y受体即P2Y2、P2Y4和P2Y6受体的嘧啶激活类激动剂。为确定这些受体是否参与细胞外UTP影响神经突向外生长的作用机理，首先确定所述受体是否在PC12细胞中表达以及接触NGF是否改变它们的表达，用NGF将PC 12细胞处理0-7天并测量受体水平。用NGF处理3天后，P2Y2受体的表达达到最高水平，其显著地(p＜0.001)高于用NGF处理不到3天所看到的(图19A)。为显影P2Y2和P2Y4、P2Y6受体的表达和位置，在NGF存在或不存在时使细胞生长4天，然后将它们针对神经突标记物NF-70并针对P2Y2、P2Y4或P2Y6进行染色(图19B，分别从左至右)。在NGF分化的PC12细胞中，全部三种受体都高度表达。此外，P2Y2与神经元标记物MAP-2处于共同定位(图20)。不存在NGF时，经免疫染色检测不到受体蛋白质的表达。此外，与仅接触NGF的细胞中存在的量相比，尿苷的存在不影响受体的表达。因此，P2Y2、P2Y4和P2Y6受体存在于神经细胞中，但不存在于其前体中。

实施例11

拮抗P2Y受体抑制尿苷对NGF诱导的神经突向外生长的影响

为确定P2Y受体的信号转导是否介导尿苷对神经突向外生长的诱导，将PC 12细胞与NGF、尿苷(100μM)和P2Y受体拮抗剂苏拉明(30μM)、吡多醛-磷酸-6-偶氮苯基-2′，4′二磺酸(PPADS；30μM)和反应蓝2(RB-2；10μM)一起培养。每种拮抗剂都显著地(p＜0.05或0.001)阻断了尿苷对NGF刺激的神经突向外生长的增强作用(图21)。没有一种P2Y受体拮抗剂抑制PC12细胞对尿苷的摄取。这些结果表明通过P2Y受体的信号转导介导尿苷对神经突向外生长的诱导。

实施例12

UTP和尿苷刺激磷脂酰肌醇(IP)信号转导

方法

代谢标记和PI周转分析

PI周转的分析方法如(Nitsch RM等人，J Neurochem 69：704-12，1997)中所述。简言之，用1.25微居里(μCi)/皿的肌-[2-³H]肌醇(17.0居里/毫摩尔；Amersham Biosciences)在不含血清的MEM中将细胞代谢标记36小时，用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，用10mM氯化锂在HBSS中的溶液处理15分钟。在37℃，在10mM锂的存在下加入药物，持续60分钟。用冰冷的甲醇将细胞溶胞，用氯仿/甲醇/水(体积比2∶2∶1)萃取除去脂质。使用离子交换色谱法将标记的水溶性磷酸肌醇与游离的[³H]肌醇分离，使用AG 1-X8柱(Bio-Rad)，洗脱剂为1M甲酸铵和0.1M甲酸。用液体闪烁光谱测定法定量放射性。

结果

P2Y2、P2Y4和P2Y6受体激活磷脂酶C/二酰基甘油/肌醇三磷酸(PLC/DAG/IP3)信号转导途径。为确定促进神经突向外生长的尿苷或UTP浓度是否激活这些受体，用[³H]-肌醇(50μM)或UTP(10，100μM)将NGF分化的PC12细胞标记1小时，然后通过测量放射性标记的IP周转评价IP信号转导(图22)。通过加入100μM UTP(p＜0.05)和50μM尿苷(p＜0.01)显著地增加了IP的形成。P2Y受体拮抗剂PPADS(100μM)显著地(p＜0.05)阻断了UTP对IP信号转导的刺激。这些结果表明UTP通过P2Y受体介导的IP信号转导途径的刺激来促进神经突向外生长。

实施例10-12的结果提供了尿苷及其代谢物刺激神经突向外生长的机理，即：通过激活P2Y受体。P2Y受体的至少部分作用由IP信号转导介导。实施例7-12的结果结合在一起进一步证明尿苷处理能够通过多种机理增强神经传递从而改善认知功能：(1)增加神经递质释放；(2)通过CTP，作为膜磷脂的前体起作用；(3)通过UTP，激活P2Y受体偶联的细胞内信号转导途径。机理(2)和(3)可共同起作用增加神经突的形成。

实施例13

添加UMP的饮食在多个物种中增强学习和记忆

材料与实验方法

莫里斯水迷宫

用对照饮食或含有2.5％UMP的饮食饲养老年大鼠(18月龄，500g)6周。然后向它们指示在直径为6英尺的水池中隐藏的平台，将它们依次置于水池中四个象限中每个的某处，每次试验中给大鼠90秒的时间通过游泳重新定位平台，记录游泳时间“平均逃出时间(mean escape latency)”。连续四天，每天进行一套四项试验。每天的平台都置于同一位置。该实验已知为莫里斯水迷宫，是空间记忆的指标。

食物粒学习分析

用对照鼠粮或含有UMP(0、0.1、0.5或2.5％)的鼠粮没有限制地喂养年轻的雄性成年沙鼠3周，对其进行放射臂迷宫测试，放射臂迷宫由中央室和四个分支组成，每个分支的末端都预先放置一个小食物粒。测试前，使动物禁食过夜，然后将每只动物置于中央室内，给动物180秒的时间寻找全部小粒。找到小粒需要的时间较短表示学习和空间记忆得到改善。

工作记忆和参考记忆测定法

对用对照饮食或含有0.1％UMP的饮食饲养4周后、经过训练能够成功地如上所述找到全部食物粒的各动物组(每组10只沙鼠)进行修正的测试，其中只有迷宫的两只臂(但总是相同的两只臂)含有食物粒奖励。在这个测试中，工作记忆误差是沙鼠再次访问该日已经从中取走食物粒的臂。参考记忆误差是沙鼠进入从未有过食物粒的臂(在修正的实验期间)。

结果

前述实施例表明口服给药的尿苷以几种方式提高神经细胞起作用的能力。本实施例直接表明尿苷增强认知功能。用对照饮食或含有2.5％UMP·2Na⁺的饮食饲养老年大鼠(18月龄，500g)6周，使用空间记忆的一个指标——莫里斯水迷宫测试它们的记忆。表明给药添加UMP·2Na⁺的饮食的大鼠到达平台位置所需的时间显著缩短(图23)，指示UMP提高空间记忆。

也在沙鼠中考察口服给药的尿苷对学习和空间记忆的影响。在放射臂迷宫中测试用对照鼠粮或含有UMP的鼠粮(0、0.1、0.5或2.5％)没有限制地饲养3周的雄性年轻成年沙鼠，放射臂迷宫由中央室和四个分支组成，在每个分支的末端预先放置一个小食物粒。测试前，使动物禁食过夜，然后将每只动物置于中央室内，给动物不多于180秒的时间寻找全部小粒。找到小粒所需时间的缩短需要空间学习。添加UMP的饮食以剂量依赖的方式减少了沙鼠找到小粒所需的时间(图24)。

此外，考察了口服给药的尿苷对工作记忆和参考记忆的影响。对用对照饮食或含有0.1％UMP的饮食饲养4周、训练得能够成功地如上所述找到全部食物粒的沙鼠进行修正的测试，其测量工作记忆和参考记忆。食用添加UMP的饮食的沙鼠显示工作记忆误差(图25A)和参考记忆误差(B)的数目都减少。

这些结果直接表明(a)饮食中添加尿苷改善学习和不同类型(空间、工作和参考)的记忆；(b)该作用不限于特别的物种；和(c)该作用表现在生物学相关老年损伤性的认知功能模型中。

总之，本文提出的发现证明口服给药的尿苷对神经信号转导、神经细胞解剖学和认知功能具有积极影响。这些结果还表明了尿苷发挥其作用的几种机理。

实施例14

尿苷和胆碱增加神经递质的释放

材料与实验方法

脑切片的制备

用氯胺酮(85mg/kg体重，肌内)将9-11月龄的雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉，在冷藏室内4℃下断头处死。迅速取出脑并置于冰冷(4℃)的Krebs充氧缓冲液(119.5mM NaCl，3.3mM KCl，1.3mM CaCl₂，1.2mM MgSO₄，25mMNaHCO₃，1.2mM，KH₂PO₄，11mM葡萄糖和0.03mM EDTA，pH 7.4)中，其含有1mM氯胺酮和15μg/ml毒扁豆碱。除去残余的脑脊膜和脉络丛后，立即用McIllwain组织切片机制备30μm的纹状体切片、海马切片和皮层切片，洗涤3次，置于定制的灌流室(Warner Instrument，Hamden，CT)内。

灌流和电刺激

用上述的充氧Krebs/氯胺酮/毒扁豆碱缓冲液以0.8ml/min的流速对灌流室进行灌流(superfusing)，以期在37℃使切片平衡60分钟。灌流室含有两个相对的银网状电极，电极与电刺激器(S88型；Grass Instruments)相连。使用定制的极性逆转装置以防止灌流室极化，并监测每次脉冲开始后50毫秒的电流和电压以确保一致的室电阻。平衡期后，用高K⁺(52mM)型的Krebs/氯胺酮/毒扁豆碱缓冲液在存在或不存在20μM胆碱、25μM胞苷和/或25μM尿苷的情况下灌注使切片极化。在整个2小时期间收集灌注液，并分析乙酰胆碱。数值被标准化用于切片的蛋白质含量。

结果

为确定尿苷和胆碱对乙酰胆碱释放的影响，将纹状体切片、海马切片和皮层切片(n＝8)在胆碱存在或不存在时进行培养，然后去极化，测量乙酰胆碱释放。在一些组中还加入胞苷或尿苷。胆碱增加了乙酰胆碱的释放，无论是否也存在尿苷(图26)。

这些结果表明当反复刺激神经元以释放乙酰胆碱时，胆碱通过补充膜磷脂(如PC)中胆碱储量来增加所释放的神经递质的量。上述实施例已表明尿苷增加CDP-胆碱的合成，然后CDP-胆碱用于合成新的PC。连同本实施例的发现，这些结果表明神经元合成新磷脂的能力、并因此反复释放神经递质的能力，将通过尿苷连同胆碱的加入以加合或协同的方式被提高。

实施例15

反复去极化后尿苷和胆碱加合性地增加神经递质的释放

如前一实施例中所述，反复刺激脑切片，在此次情况中，刺激8个周期或交替20分钟的刺激和静息周期。在所有组中，神经递质的释放量伴随每个连续刺激期下降，但是这种下降幅度在尿苷或胆碱的存在下则显著较小。这一作用经同时存在尿苷和胆碱被增强。因此，在反复刺激后，神经递质释放的总量经尿苷或胆碱的存在被增加，且经尿苷和胆碱的存在被进一步增加。

Claims (20)

1.尿苷和胆碱在制备用于改善受试者的认知功能的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述胆碱是胆碱磷酸盐、胆碱前体、胆碱代谢物、胆碱系化合物或它们的盐。

3.权利要求1的用途，其中所述胆碱是胆碱盐。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述受试者的所述认知功能已经减退。

5.权利要求4的用途，其中所述减退是心血管疾病、神经变性疾病或精神病的结果。

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述认知功能是记忆、学习、智力或精神健康。

7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述认知功能是神经功能。

8.权利要求7的用途，其中所述神经功能是突触传递或神经递质的功能。

9.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述改善所述认知功能提高所述受试者脑中的胞苷、胞苷三磷酸或CDP-胆碱的水平。

10.权利要求9的用途，其中所述改善所述认知功能提高或增强所述神经递质的合成。

11.权利要求10的用途，其中通过增强磷脂或其前体的合成来提高所述神经递质的所述合成。

12.权利要求8、10和11中任一项的用途，其中所述神经递质是乙酰胆碱。

13.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述改善所述认知功能刺激或增强所述受试者的脑细胞膜或神经细胞膜的合成。

14.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述改善所述认知功能刺激或增强所述受试者的神经细胞的神经突向外生长。

15.权利要求13或14的用途，其中所述尿苷以及所述胆碱增强磷脂的生成，从而刺激或增强所述膜的合成或神经突向外生长。

16.权利要求1-15中任一项的用途，其中所述尿苷是尿苷-5’-一磷酸、尿苷-5’-二磷酸或尿苷-5’-三磷酸。

17.权利要求1-16的用途，其中所述药物还包含鞘磷脂、酰基甘油磷酸胆碱、卵磷脂、溶血卵磷脂、甘油磷脂酰胆碱或它们的组合。

18.权利要求1-17中任一项的用途，其中所述尿苷通过刺激所述受试者的神经细胞或脑细胞中的P2Y受体介导其作用。

19.权利要求18的用途，其中所述P2Y受体是P2Y2、P2Y4或P2Y6。

20.权利要求16的用途，其中所述尿苷是尿苷-5’-三磷酸。

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