JP2013010771A - 臓器の冷却保存および灌流のための組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】最小必須培地イーグル(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、ウィリアムスE培地等の組織培養培地から成る臓器保存溶液であって、a)pHは7.0から7.8の範囲であること、b)最小緩衝能力(ベータ)はスライク単位で測定して少なくとも20であること、c)浸透圧モル濃度は300-350 mOsmolであること、d)膠質浸透圧は20から30 mmHgであること、e)[Na+]濃度は140 mM未満であり、[K+]濃度は25 mM未満であり、[Na+]/[K+]の比は少なくとも5:1であること、f)アルギニン、アスパラギン、シスチン、ヒスチジン、グルタミン、メチオニン等の濃度はウィリアムスE培地の標準的濃度に比べて高いこと、等を改変した臓器保存溶液。
【選択図】なし
Description
本発明は、医学の分野に関し、特に固体臓器および組織の移植に関する。本発明は、ヒトおよび動物からのドナー臓器および組織、特に肝臓および腎臓を、灌流して低温で保存するための、新規の解決法および方法を提供する。
臓器移植は、現在、心臓、肺、すい臓、腸(大腸)ならびに、特に腎臓および肝臓といった臓器に広く応用されている。臓器の需要の増大、およびドナー臓器の不足が、移植の順番待ちのリストを増大させ、最適以下のドナーを由来とする臓器の使用への関心が生じてきた。
定義
正常温とは、正常な生理学的環境における、身体、臓器および/または組織の温度のことであり、ヒトではおおよそ34℃から42℃の間であり、好ましくは37℃付近である。低体温とは、生理的温度より低い温度のことであり、つまり、34℃未満の温度のことである。臓器の保存には、0 - 20℃、特に0 - 10℃が、低体温とみなされる。
H2PO4- <=> HPO4 2-、CO2 <=> H2CO3、
H2CO3 <=> HCO3 -、
多くの有機酸、有機塩基およびタンパク質。本発明による溶液のための、普遍的に適用可能なおよび生物学的に許容可能な緩衝剤は、以下の性質を持たねばならない:水への溶解性、生物学的作用または金属イオンとの既知の複合体形成の傾向と干渉しない、非毒性である、および生物学的膜(浸透、可溶化、表面での吸着といった性質)と干渉しない。緩衝能力は、温度および組成物中のその他の溶質に影響される。活性および塩の効果は、以下の式に従って、溶液のpH値に著しく影響する:
pH = pKa' + log[B]/[BH] (1)
ここにおいて、pKa' = pKa + 補正因子;
溶液のイオン強度(lonic strength)は、以下のように定義される:
I = 1 / 2 Σ (ci . z2)
ここにおいて、ciは、種iの濃度であり、zは相当する電荷である。これは、実験的パラメーターから非常に容易に算出することができる。
B = ΔB / ΔpH
=ΔpHのpH変化を生じさせるために緩衝溶液に添加される強塩基(または酸)のグラム当量/リッターの小増加分
B = (2.3 x C x Ka [H+] ) / (Ka + [H+])2
B = 2.3 C a (1 - a)
C = [酸] + [塩]
または
C = [塩基] + [塩]
一価化学種の最大緩衝能力ベータ-マックス(Beta-max)は、pH = pKa'、実用的pK値の場合にみられる。pHの範囲が3 - 11の場合のベータマックスは、以下の式に従って算出される:
ベータマックス = 0.576 c
ここにおいて、cは、緩衝物質の全濃度である。従って、有用な緩衝能力は、pKa±1単位のpHの範囲に存在する。最大緩衝能力の50%超を現実化しなければならない場合、相当する範囲は、pKa' + 0.75単位の場合のみである。
第一の実施態様において、本発明は、十分平衡のとれた方法で、臓器に十分な量のビタミンおよび栄養素を提供するために、組織培養培地に基づく臓器保存および灌流溶液を提供する。多くの組織培養培地が当該分野において知られており、十分実証され、様々な供給元から商業的に利用することができる。最小必須培地イーグル(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640培地、DMEM/F-12培地、ハムF-10、ハムF12、イスコブ(Iscove's)変法ダルベッコ培地、レイボビッツ(Leibovitz's)L-15培地およびアール(Earle)塩添加最小必須培地およびウィリアムスE培地(Current Protocols in cell biology, www.interscience.wiley.com)を、本発明による臓器保存溶液の基礎として使用してよいが、当該分野において既知のその他の細胞または組織培養培地もまた使用してよい。特にウィリアムスEが、本発明による臓器保存および灌流溶液によく適しており、および好ましい。組織培養培地は、生理的塩および緩衝化合物を含み、浸透圧モル濃度およびpHは生理的条件に保たれ、すなわち、300-350 mOsmol周辺およびpH 7.0からpH 7.8の範囲のpHに保たれる。また、栄養素(糖、ビタミン、アミノ酸)が、ほとんどの定義された組織培養培地および定義されていない組織培養培地において提供される。本願発明者らは、組織培養培地を、低温での臓器の保存および灌流の両方に適した臓器保存溶液としての使用に最適化するために、様々な調整および付加を、溶液に対して行うべきであることを発見した。これらの調整は、普通はあまり好ましくない最適以下のドナーから得られた臓器の保存および灌流に特に有用であることが証明された。
本発明による臓器保存および灌流溶液のための好ましい実施態様の典型例は、広く利用される組織培養培地と比較して、以下のように表される:
ウィリアムス培地 E ポリソル(Polysol)1 ポリソル2
液体 液体 液体
mg/L mg/L mg/L
組成
無機塩
CaCl2 (無水物) 200.00 30.00 22.5
CuSO4・5H2O 0.00 x
Fe(NO3)3・9H2O 0.00 x
KCl 400.00 x
MgSO4 (無水物) 400.00 100.00 75.00
MgSO4・7H2O 200.00 100.00 75.00
MnCl2・4H2O 0.0001 0.0001 0.000075
NaCl 6800.00 x 720.00
NaHCO3 2200.00 x
NaH2PO4・H2O 140.00 1400.00
ZnSO4・7H2O 0.0002 0.0006
NaOH 10N 2.65 ml
HCl 1N 2.55 ml
その他の化合物
グルコース 2000.00 2000.00 1500.00
グルタチオン(還元型) 0.05 900.00 1500.00
リノール(Linoeic)酸メチルエステル 0.03 0.03 0.0225
フェノールレッドNa 10.00 10.00 x
ピルビン酸ナトリウム 25.00 25.00 18.75
ツイーン80 1.84 x x
アミノ酸
L-アラニン 90.00 90.00 67.5
L-アルギニン 50.00 250.00 187.5
L-アスパラギンH2O 20.00 120.00 90
L-アスパラギン酸 30.00 30.00 22.50
L-システイン 40.00 40.00 30
L-シスチン 20.00 60.00 45
L-グルタミン酸 50.00 50.00 37.50
グリシン 50.00 50.00 37.50
ヒスチジン 15.00 980.00 735.00
L-イソロイシン 50.00 50.00 37.50
L-ロイシン 75.00 75.00 56.25
L-リジンHCl 87.50 87.50 65,625
L-メチオニン 15.00 45.00 33,75
L-フェニルアラニン 25.00 50.00 37.50
L-プロリン 30.00 90.00 67.50
L-セリン 10.00 30.00 22.50
L-スレオニン 40.00 40.00 30.00
L-トリプトファン 10.00 180.00 135.00
L-チロシン 35.00 35.00 26.25
L-バリン 50.00 50.00 37.50
ビタミン
アスコルビン酸 2.00 20.00 15.00
d-ビオチン 0.50 0.50 0.375
D-Caパントテン酸塩 1.00 1.00 0.75
塩化コリン 1.50 1.50 1.125
エルゴカルシフェロール 0.10 0.10 0.075
葉酸 1.00 1.00 0.75
i-イノシトール 2.00 12.00 9.00
メナジオン重亜硫酸ナトリウム 0.01 0.01 0.0075
ニコチンアミド 1.00 1.00 0.75
ピリドキサールHCl 1.00 1.00 0.75
DL-トコフェロールリン酸Na 0.01 0.03 0.0225
リボフラビン 0.10 1.00 0.75
チアミンHCl 1.00 10.00 7.50
ビタミンAアセテート 0.10 0.10 0.075
ビタミンB12 0.20 0.20 0.15
添加物
NaSeO3.5H2O 0.05 0.0375
MgCl2.6H2) 731.88 548.91
HEPES 4766.00 4766.00
KH2PO4.H2O 1360.90 1020.67
L-オルニチン 337.00 252.75
グルタミン 10 ml/L 7.5 ml/l
ニコチン酸 0.50 0.375
アデノシン 1340.00 1005
アデニン 680.00 510.00
アロプリノール 163.20 122.40
ラフィノース 1600.00 1200.00
トレハロース2H2O 2000.00 1500.00
D-グルコン酸ナトリウム 16358.00 12268.50
D-グルコン酸カリウム 4684.00 3513.00
マクロゴールPEG 30 25000.00 20000.00
Na+ 含量 < 120 mM
K+ 含量 < 25 mM
C- 含量 < 50 mM
浸透圧モル濃度 < 340 mosmol
膠質浸透圧 25 mmHg
pH 7.4
実施例2
この実施例の狙いは、ポリソルおよびUW-Gを用いた機械式灌流による結果と、UWを用いた最高の基準(gold standard)である冷却貯蔵(cold storage)(CS)法とを比較するため、本発明による臓器保存溶液であり実施例1に記載されるポリソル-1を用いて、ラットの肝臓の機械式灌流(machine perfusion)(MP)を評価することであった。この目的のため、保存方法およびMP溶液の両方を、心拍動のあるドナー由来とする、単離され還流されたラットの肝臓モデル(the isolated perfused rat liver model)(IPRL)にて評価した。
動物および手術:
体重350 g(+/−50 g)のオスのウィスターラット(Harlan、オランダ)を、肝臓のドナーとして使用した。動物は、実験の直前まで、標準化された条件のもと、12/12時間の暗/明周期で、水および標準的固形飼料(Hope Farms、ウールデン、オランダ)を自由に摂取できる状況で飼った。全ての動物は、アムステルダム大学の動物倫理委員会の承認の下、動物へのケアにおけるオランダの規則および原則に従って取り扱われた。ラットを、O2/空気/イソフルラン(1 L/min: 1 L/min: 3 %)で麻痺させ、0.1 ml/100 g体重のFFM(ハイプノーム(Hypnorm)/ドルミカム/アクアデスト(aquadest): 1:1:2)を腹腔内注射した。手術の間、O2/空気/イソフルランを、マスクを通して吸入させることで、麻痺状態を維持した。正中切開術続いて両側性肋骨下切開の後、肝臓を周囲から分離(mobilize)し、胆管に0.9 mmカテーテル(B-Braun、メルスンゲン、ドイツ)でカニューレ処置した。門脈のカニューレ処置の前に、動物に、大静脈血管を介して0.1 mlのヘパリン(5000 IU/ml、Leo Pharma、マルメ、デンマーク)でヘパリン処置した。肝臓を、門脈のカニューレ(0.8 fr、腸内栄養管、Vygon、ファルケンスワルト、オランダ)を介して、50 mlのリンガー乳酸(Ringer Lactate)(37℃、10 cm H2O、Baxter、ユトレヒト、オランダ)でウォッシュアウト(wash out)した。ウォッシュアウトの間、動物は、腹部の大静脈血管の切れ目から出血した。肝上の大静脈血管は、0.6 frカニューレ(Vygon)でカニューレ処置し、肝臓下の大静脈血管を連結し、周辺組織の手入れの後、肝臓を切除し重量を測定した。
二重性機械式灌流システムは、学術医療センターの医療工学開発学部(the Medical Technical Development Department of the Academic Medical Center)(AMC、アムステルダム、オランダ)により開発され、単一の装置においてMPおよび再灌流(RP)段階の両方が可能である(図1)。切除された肝臓をつなぐ前に、回路を、200 mlの無菌アクアデストで、続いて50 mlの保存溶液ですすいだ。圧力調節性灌流システムは、400 mlの無菌MP溶液を含む貯蔵器(reservoir)から成る。肝臓をシステムにつないだ後、灌流溶液の最初の100 mlを回収した。溶液の残りの250 mlを、ローラーポンプ(rollerpump) (Ismatec、グラットブルグ、スイス)によって再循環させた。灌流溶液を、ガラス酸素供給器を用いてカーボジェン(carbogen)(95%O2/5%CO2、1 L/min、Hoekloos Medical、オランダ)によって酸素化し、その結果、前肝臓(prehepatic)の酸素圧は約700 mmHgとなった。空気塞栓(air emboli)を、気泡除去器(bubble trap)によりシステムから除き、その後、溶液を熱交換器(HMT-200, Heto、ブレダ、オランダ)を用いて冷却した。灌流溶液は、直列流量計(in-line flow meter) (HT-207, Transonic Systems Inc、マーストリヒト、オランダ)を通り、門脈カニューレを通って肝臓に入り、肝上大静脈血管カニューレを経由して貯蔵器へと自由に流れた。
この研究は、3つの実験群を含む:1) CS-UW (N=5); 2) MP-UW-G (N=5)および3) MP-ポリソル (N=5)。単離した肝臓を、CSまたはMPのどちらかで24時間保存し、その後再灌流した。
冷却貯蔵のために、ウィスコンシン大学の保存溶液(Viaspan, Bristol Myers Squibb)を用いた。MPのためのUW-G溶液を、Belzerの処方 (pH 7.4, 330 mosmol/kg)に従って作製した(Pienaar BH et al., Transplantation 1990:49: 258-260)。MP保存溶液ポリソル (pH 7.4, 330 mosmol/kg)は、AMCの外科研究室(the Surgical Laboratory of the AMC)で開発された。再灌流のために、ウシ血清アルブミンの入っていないクレブス-ヘンスレイ緩衝液 (KHB) (pH 7.4, 320 mosmol/kg)を用いた。UW-G、 ポリソルおよびKHBは全て、Sigma-Aldrich (ザインドレヒト、オランダ)、Merck (ハールレム、オランダ)、Cambrex (ヴェルヴィエ、ベルギー)、Centrafarm (エテン・ルール、オランダ)およびNovo Nordisk (アルフェン・アーン・デン・レイン、オランダ)からの、分析用試薬グレード(またはそれより良い等級)の化学物質を用いて、我々の研究室で作製した。使用に先立ち、溶液は、0.45μmのアンプルフィルター(DowCorning、アレスリー、イギリス)および0.22μmのフィルター(Millipack 60、Millipore、アムステルダム、オランダ)を通してろ過することで滅菌した。
肝細胞性のダメージを評価するためのサンプルを、60分間のRPの間、10分おきに採取した。肝臓のダメージは、肝後方の灌流サンプル(Laboratory of Clinical Chemistry、AMC、オランダ)において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)および乳酸脱水素酵素(LDH)の直接の分析によって評価した。アルファ-GST(アルファ-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)レベルは、ラットアルファ-GST ELISAキット(Biotrin、ダブリン、アイルランド)を用いて決定した。肝臓の機能は、60分間のRPの間、胆汁生成をモニターすることで評価した。そのうえ、嫌気的解糖を表す乳酸生成(Laboratory of Clinical Chemistry、AMC、オランダ)および灌流液pH(ABL, Radiometer、ズーテルメール、オランダ)を、再灌流の間測定した。
RP段階の終わりに、生検材料を、尾状部(caudate)および外側右葉(right lateral lobes)から得た。生検材料は、ホルムアルデヒド(10%)中に貯蔵し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片(4μm)を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、光学顕微鏡で評価した。肝臓損傷形態学的分類のために、1(良好)から9(不良)のスケールに類別される9ポイントスケールを用いた(Martin H, et al., Cryobiology 2000:41: 135-144、およびTojimbara T et al., Liver Transpl Surg 1997:3: 39-45)。1.正常な長方形の形状、2.類洞空間(sinusoidal spaces)の増大を伴う円形の肝細胞、3.ゾーン(zone)3における空胞化(vacuolization)、4.ゾーン2における空胞化、5.ゾーン1における空胞化、6.ゾーン3における空胞化および核濃縮、7.ゾーン2における空胞化および核濃縮、8.ゾーン1における空胞化および核濃縮および9.壊死。
クラスカル-ワオリス試験(Kruskall-Wallis test)を、3つの群の全体的な比較のために使用した。有意な差があった場合、個々の群の差を、ノンパラメトリック・マン・ホイットニー試験(non-parametric Mann Whitney test)にて評価した。文章およびグラフ中の結果は、平均値±SEMで示されている。統計学的有意性は、p < 0.05として定義した。
灌流パラメーター:
肝臓重量は、実験群間で有意に異なることはなかった(16.53±0.53グラム)。低体温MPおよび正常温RPの両方の間、灌流圧力は、20 cm H2O (重力制御(gravity controlled))に一定に保った。低体温MPの間の灌流の流動は、最大で、1 ml/分/グラム肝臓に達した。生常温RPの間、最大で4 ml/分/グラムの流動が記録された。低体温MPにおける酸素化は、約700 mmHgの灌流液pO2となり、正常温RPにおける酸素化は、温度がより高いために、約500 mmHgのpO2となった。正常温RPにおいて記録された温度は、37.13±0.41℃であった。
24時間の冷却虚血時間(cold ischemic time)後のALT放出は、UWによるCS後の方が、UW-Gを使用したMPに比較して、t=0’ (4.6 ± 5.37 vs 0.4 ± 0.55)およびt=10’ (5.4± 3.85 vs 1.4 ± 0.55 U/L)において、有意に高かった(図2)。しかしながら、CS-UWとMP-ポリソルを比較すると、ALTレベルは、t=0’およびt=50’を除く全ての時点において、MP-ポリソル後の方が有意に低い。LDHレベルは、有意性に到達することはなかったが、24時間のCS-UW後のものが高い結果となっている。LDHは、UW-Gまたはポリソルのどちらかを用いたMPに比べて、CS-UW後のものが、t=10’において有意に高い(図3)。灌流液の流動、pHおよび乳酸生成は、有意に異なることはなかった(データは示していない)。2つのMPの溶液を比較すると、ASTレベルがより低いことで示されるように、24時間のMP-ポリソル後において、ダメージがより小さいことがわかった(図4)。全ての時点において、ポリソルを支持する傾向があるものの、ALT、LDH、流動、pHおよび乳酸において有意な差はなかった。t=40におけるα-GSTの放出は(図5)、MP-ポリソル後のものが、CS-UW(それぞれ125.5 ± 10.51 vs 46.35 ± 9.11、p< 0.02)およびMP-UW-G(それぞれ101.6 ± 11.99 vs 46.35 ± 9.11、p<0.02)と比較して低かった。
胆汁生成は、MP-ポリソル後のほうが、MP-UW-GまたはCS-UW後より高かった(それぞれ、355 ± 82,31 対 256 ± 26,19 対 180 ± 61,89μl)。しかしながら、これは、有意性に到達しなかった(図6)。
肝臓切片の組織病理学的スコアリングの後、より良い中央値スコア(median score)が、CS-UW肝臓(4.5 ± 0.87ポイント)に比べて、UW-Gおよびポリソル(それぞれ、2.0 ± 0.55および1.6 ± 0.40ポイント)を用いたMP群で示された。MP群間では有意な差はみられなかった(図7)。肝臓切片の乾/湿重量は、MP群において最も高く、浮腫のパーセンテージが最も低いことが示されている(図8)。パーセンテージは、それぞれ、76±1.0対72±0.5対72±0.7である。
腎臓の臨床的MPのために、改変ウィスコンシン大学溶液(UW-グルコナート)が、標準的に使用されている。この溶液は、肝臓でのMPへの適用のために、マンニトールをラフィノースで置換して、さらに改変されている。生成される溶液は、実験的な肝臓保存に大規模に使用されてきたが(Kim JS et al., Transplant Proc 1997:29: 3452-3454, Pienaar BH et al., Transplantation 1990:49: 258-260,Southard JH et al., Transplant Proc 2000:32: 27-28.)(1-3)、商業的に利用することはできない。発明者らによる、4℃における代謝の抑制を助けるために必要な、栄養素を含む本発明による肝臓および腎臓のMPのための新規な保存溶液、ポリソルが試験された。我々の究極的な目的は、実施例3で取り組まれているように、辺縁性(marginal)のおよび心拍動のないドナーの臓器の保存であるが、まず、基準値を得るために、十分確立された心拍動のないドナーモデルにおいてポリソルを試験しようとした。
この実施例の狙いは、UWを用いたCS、UW-Gを用いたMPおよびポリソル-1を用いたMPによる、心拍動のないドナー(non-heart-beating donor)(NHBD)の保存を比較することである。
動物:
体重275 g (+/- 25 g)のオスのウィスターラット(Harlan、オランダ)を、肝臓のドナーとして使用した。動物は、標準化された条件のもと、12/12時間の暗/明周期で、水および標準的固形飼料(Hope Farms、ウールデン、オランダ)を自由に摂取できる状況で飼った。全ての動物は、動物へのケアにおけるオランダの規則および原則に従って取り扱われた。アムステルダム大学の動物倫理委員会により、この動物実験は承認された。
NHBD肝臓の24時間の肝臓保存を、UWを用いたCS (n=6)、UW-Gを用いたMP (n=6)またはポリソルを用いたMP (n=6)の何れかによって行った。37℃でのリンガー乳酸によるin vivoのウォッシュアウトの後、肝臓を低体温保存溶液(4℃)で洗い流した(flushed):肝臓を、50 mlのUW、UW-Gまたはポリソルの何れかで洗い流した。CSでは、肝臓を、4℃の冷却容器中の解けた氷に置かれた、100 mlの低体温UWを含むプラスティック製の無菌カップに浮遊させて置いた。MPでは、肝臓を、250 mlの保存溶液を含む、再循環標準化灌流装置(recirculating standardized perfusion set-up)につないだ。該溶液は、ローラーポンプによって貯蔵器から循環し、カーボジェン (95% O2/ 5% CO2)で酸素化され、および熱交換器で流入温度が4℃になるよう冷却された。灌流液の流出液は、大静脈血管を経由して回収し、貯蔵器に再び入れた。MPならびに再灌流(RP)の両方の間において、肝臓のダメージおよび機能の評価のために、サンプルを採取した。
実施例2と同様。
実施例2と同様。
実施例2と同様。
肝細胞の損傷および機能の評価のための灌流液サンプルを、MPおよびRPの間に採取した。MPの間、サンプルを、t = 0、1、2、22、23、24時間の時間単位で採取した。RP段階において、サンプルを、60分の間に、15分間隔で採取した。再灌流段階の終わりに、ATP評価のための肝臓サンプルを、急速凍結のための凍結固定(freeze clamp)を用いて、副肝葉(accesory liver lobe)から採取した。肝臓サンプルを、尾状部および右肝葉(right liver lobes)からさらに採取し、ホルマリン(PBS中に10%)で処理した。透過型電子顕微鏡のための肝臓サンプルを、中葉から得て、Mac Dowall溶液に貯蔵した。最終的に、肝臓サンプルを、乾/湿重量分析のために、左葉から採取した。
実施例2と同様。
以下の点以外、実施例2と同様:
透過型電子顕微鏡(TEM)のための肝臓生検材料(1 mm)を、外側左葉(left lateral lobe)から得た。超微細構造の研究のため、生検材料を、少なくとも48時間、マクドウェル(McDowells)固定液中で固定した。その後、それらを、リン酸緩衝液(0.1 M, pH 7.4)ですすぎ、1% OsO4で後固定(postfix)し、水ですすぎ、段階的なエタノールおよびプロピレンオキシド中で脱水した。最終的に、試料は、エポン(epon)に包埋した。超薄切片(80 nm)を、Reichert Ultracut Eを用いて切り出し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛(lead citrate)でコントラストを強調した(contrasted)。切片は、100kVで作動するPhilips EM420で研究した:画像を、SIS Megaview IIカメラで取得した。
全ての群を、クラスカル-ワオリス試験を用いて比較した。有意な結果の場合は、個々の群間の差を、ノンパラメトリック・マン・ホイットニー-U試験にて評価した。アンモニアクリアランス率には、反復測定の分析を、ボンフェローニによるポストホック試験(post-hoc test)とともに使用した。文章およびグラフ中の結果は、平均±SEMにて示されている。統計的有意性は、p < 0.05として定義した。
ラットの体重および肝臓重量について、実験群の間で差はなかった。灌流温度は、群間で異なることはなかった。
MPの間、ASTの放出は、t= 0、1、2および22時間のときに、ポリソルと比較してUW-Gを用いたほうが有意に高かった。ALT放出は、全ての時点において、ポリソルと比較してUW-Gを用いたほうが有意に高かった(図1a、b)。MPの間の灌流液の流動は、MP-UW-G群で低下しており、t= 22、23および24時間のときにはMP-ポリソルよりも低い結果と成った(p= 0.01) (図2)。
AST放出(図3a)は、t= 30およびt=45において、CSよりもMP-UW-G後のほうが低かった(p< 0.05)。ポリソルを用いると、この放出は、全ての時点において低かった(p< 0.005)。ALT放出は、同じ傾向を示したが(図3b)、有意性は、t= 60のMP-ポリソルにてCSと比較した場合のみに認められた(24.67 ± 7.30 vs. 6.00 ± 1.26 IU/L、p= 0.05)。RPの間の灌流液の流動は、MP-ポリソルが、CSとの比較ではt= 45および60にて、MP-UW-Gとの比較では全ての時点にて、有意に良好であった(図4)。また、灌流液の流動は、全ての時点において、CS群のほうが、MP-UW-Gよりも良好であった。
胆汁生成は、ポリソルを用いたMP後の場合が、UWによるCSおよびUW-Gを用いたMPと比較して、最も高かった(それぞれ、390 ± 23 vs. 34 ± 19 vs. 153 ± 55 μl/時間、p<0.01) 。CS-UWとMP-UW-Gとの間では、有意な差は見られなかった(図5)。ポリソルを用いたMP後において、最もアンモニアクリアランスが起こり、UW-Gを用いた場合よりt=15、45および60において、CSの場合よりt=15において、有意に良好であった。尿素生成は、全ての時点で、ポリソル群が、UW-Gと比較して有意に高かった。ポリソルとCSとの間に差はなかったものの、t=45において、UW-Gと比較して、CSのほうがより尿素が生成された(図6a、b)。乳酸生成は、CSおよびポリソルを用いたMPの両方と比較して、t=0および15において、UW-Gを用いたMP後のほうが高かった。それ以降の時点においては、差は見られなかった(図7)。酸素消費は、再灌流の段階の間、全ての群で同等であった(データは示していない)。
再灌流段階の終了時におけるATP含量は、ポリソルを用いたMPの後における場合が、UWによるCSおよびUW-Gを用いたMPの両方の場合に比べて、有意に高かった(それぞれ、7.53 ± 0.55 対 4.05 ± 0.75 対 2.46 ± 0.57 μMol/グラム湿重量)(図8)。
図9に示されるように、H&E染色した切片の半定量的評価は、ポリソルを用いて保存された肝臓では、2.4±0.3という中央値スコアが得られた。これは、CSおよびUW-Gを用いたMPの両方と比べて(それぞれ、3.9 ± 0.24および4.3 ± 0.48)、有意に良いスコアであった。
灌流後に採取された生検材料では、ポリソルを用いたMPによる保存の後の場合において、UWでのCSおよびUW-Gを用いたMPと比較して、有意に低い乾/湿重量比を示した(73 ± 0.01 対 77 ± 0.01 対 75 ± 0.01%)(図10)。
この実施例では、NHBDラット肝臓において3つの保存方法を比較した。つまり、当該分野における最高の基準であるUWを用いたCS、UW-Gを用いたMPおよび本発明による新規に開発されたMP保存溶液;ポリソル-1を用いたMPを比較した。肝臓のダメージおよび肝臓機能の両方に関して、CSおよびUW-Gを用いたMPと比較して、ポリソル-1を用いたMPを24時間行った後のほうが有意に良好であるという結果となった。結論として、本発明による、新規に開発した保存溶液ポリソル-1を用いた、MHBD肝臓の24時間の機械式灌流保存は、UWでの冷却貯蔵およびUW-Gを用いた機械式灌流と比較して、肝臓へのダメージはより低く、肝臓機能はより良好という結果がもたらされる。この実施例において、実施例1に定義されるようなポリソル-1製剤が使用された。および、ポリソルとはポリソル-1を表す。
この研究の目的は、ブタ肝臓保存モデルにおいて、ポリソルの実現性を評価することであった。最終的に、ポリソルを用いたMPを、セルシオを用いたCSと比較した。この実施例および続く実施例5および6において、実施例1に定義したようなポリソル-2製剤を使用した。
動物および麻酔:
35-45 kgのメスのランドレースブタを、肝臓のドナーとして使用した。動物は、標準的な環境下で、標準的な研究用食および水を自由に与えて、7日間研究室の環境に順応させた。実験の前に、ブタは、水は自由に摂取させつつ、一晩絶食させた。全ての動物は、動物へのケアにおけるオランダの規則および原則に従って取り扱われた。アムステルダム大学の動物倫理委員会により、この動物実験は承認された。ケタミン(10 mg/kg)、ドルミカム(1 mg/kg)およびアトロピン(0.1 mg/kg)の前投薬の後、O2/N2Oおよびイソフルラン(1-3%)の吸入により、麻酔を誘導した。管理された機械式人工呼吸のために、気管内の挿管を行った。麻酔は、クエン酸スフェンタニル(sufentanil citrate)(20 mg/L)およびケタミン(20 g/L)の投与まで維持した。静脈へのアクセスのために、耳静脈(ear vene)にカニューレ処置した。動脈の血圧は、鎖骨下動脈を介してモニターし、液体の注入によって調節した。
正中線開腹術および総胆管カニューレ挿入の後(0.8 Fr、腸内摂食管、Vygon、ファルケンスワルト、オランダ)、肝臓の血管分離(vascular isolation)を行った。大静脈血管の肝臓下および肝上部分を3-5 cm切開し、門脈を上部のすい臓の境界まで遠位に切開し、および肝動脈を腹腔軸から脾動脈の分岐点まで下向きに切開した。250 IU/kgヘパリン(5000 IU/ml, Leo Pharma、マルメ、デンマーク)によるブタへのヘパリン処置の後、門脈に、シリコン管でカニューレ処置した。次に肝臓を、in vivoで、5Lの氷冷リンガー乳酸 (乳酸塩29 mmol/L、Na+ 131 mmol/L、K+ 5.4 mmol/L、Ca++ 1.8 mmol/L、Cl- 111 mmol/L、Baxter、ユトレヒト、オランダ)を、ローラーポンプ(roller pump) (Gambro Instruments AB、ルンド、スウェーデン)で100-200 ml/分の流速で、肝臓を通して流すことで、洗い流した(flushed)。このウォッシュアウトの間、肝臓を切除し、臓器用容器に置いた。続いて、肝臓を、1Lの氷冷した、CSのためのセルシオまたはMPのためのポリソルのどちらかで洗い流し(flushed)、それぞれの方法で24時間の低体温保存を行った。
CS保存溶液セルシオ (pH 7.3、320 mOsm/kg)を、Imtix Sangstat (リヨン、フランス)から得た。我々のMP保存溶液ポリソルを学術医療センターの外科研究室(Surgical Laboratory of the Academic Medical Center)(アムステルダム、オランダ)で開発した(pH 7.4、312 mOsmol/kg)。ポリソルは、Cambrex (ヴェルヴィエ、ベルギー)で作製された。クレブス-ヘンスレイ緩衝液 (KHB)は、Sigma-Aldrich (ザインドレヒト、オランダ)およびMerck (ハールレム、オランダ)からの、分析用試薬グレードの化学物質を用いて我々の研究室で作製した。KHBは、0.22μmフィルターを通して滅菌した(Millipack 60, Millipore、アムステルダム、オランダ)。
ウォッシュアウトの後、CS群(n=5)の肝臓を、1Lの氷冷セルシオで満たした滅菌容器に入れ、4℃で貯蔵した。ポリソルを用いたMP(n=5)では、肝臓を、門脈への灌流液につながった貯蔵器としても役立つ臓器用容器に4℃で置いた。ポリソルを、ローラーポンプ(200 ml/min、Gambro Instruments AB、ルンド、スウェーデン)で再循環させ、毛細管酸素供給器(capillary oxygenator) (1 L/min、100% 医療用酸素、Hoekloos Medical、アムステルダム、オランダ)で、800-1000 mmHgの酸素圧力まで酸素化した。ポリソルは、流動センサー(HT-207、Transonic Systems Inc、マーストリヒト、オランダ)および腔内圧力センサー(Baxter、ユトレヒト、オランダ)を通した後、肝臓に入れた。灌流液は、自由に、大静脈血管から貯蔵器に流れた。温度プローブ(Lameris、ニューウェハイン、オランダ)を、肝門(liver hilum)に設置した。
酸素化KHBを用いた正常温再灌流を、24時間の保存および30分の復温の後に行った。再灌流を、MPの場合と同じ装置で(上記参照)行ったが、この操作においては、システムを熱交換器(HMT-200、Heto、ブレダ、オランダ)で39℃まで加熱した。貯蔵器は、正常温のKHBで満たされ、灌流液は、Medos Hilite 800酸素供給器(シュトルベルク、ドイツ)を用いて、カーボジェン (1 L/min、95/5% O2/CO2、Hoekloos Medical、アムステルダム、オランダ)で酸素化した。再灌流の流速は、約500 ml/分に設定した。
肝細胞のダメージ:
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)および乳酸脱水素酵素(LDH)のレベルを、15分間隔の前肝臓(prehepatic)灌流サンプルで、分光光度的に(spectofotometrically)で決定した(7)。血管内の抵抗性(R)は、灌流液の流動(F、ml/分)および腔内圧(P、mmHg)から計算した(R=P/F)。血管内の抵抗性は、類洞内皮細胞(sinusoidal endothelial cell)のダメージおよび血管の統合性のパラメーターである。
胆汁生成を、再灌流の間15分間胆汁を回収して測定した。アンモニアクリアランスおよび尿素生成は、再灌流の始めに、5 mM塩化アンモニウム(Sigma-Aldrich、ザインドレヒト、オランダ)の単一投与に肝臓をさらした後に、測定した。サンプルを、再灌流のt= 0、15、30、45および60分に採取した。アンモニアクリアランスの分析のために、サンプルを、リン酸緩衝食塩水で希釈(10x)し、HClで酸性化(終濃度:0.45% m/v)した後、氷上で処理した。グルタミン酸デヒドロゲナーゼに触媒される、アンモニア、ケトグルタル酸塩とNADPHとの反応に基づく酵素的方法を用いた(8)。尿素生成は、ジアセチルモノキシム(Sigma-Aldrich)による反応に基づく、比色定量法で分析した(9)。乳酸塩生成を、灌流サンプルで分光光度的に(spectofotometrically)測定した。灌流液のpHを、放射計血液ガスメーター(Radiometer blood gas meter)(ズーテルメール、オランダ)を用いて測定した。
実験群を、GraphPad Prismバージョン4 for Windows(登録商標) (GraphPad Software、サンデイェゴ、カリフォルニア、USA)を用いて、ノンパラメトリック・マン・ホイットニー-U試験により比較した。アンモニアクリアランスおよび尿素生成率には、反復測定の分析を、ボンフェローニによるポストホック試験とともに使用した。文章およびグラフ中の結果は、平均値±SEMで表した。統計的な有意性は、p< 0.05として定義した。
一般:
ブタの体重は、CSおよびMP群間で異なりことはなかった(それぞれ、41±3対37±1 kg)。ウォッシュアウト後の肝臓重量は、CSおよびMP群に対して、それぞれ、1100±65および950±38 gであった。平均再灌流温度は、両群とも同様であった(それぞれ、37.3±0.2および37.8±0.1℃)。
ASTレベルは、ポリソルを用いたMPと比較して、セルシオを用いたCS後のほうが、有意に高かった(図1A)。同様の結果が、ALTで得られた(図1B)。LDHの放出は、ポリソルを支持する傾向がみられたが、これらの結果は、しかしながら、有意でなかった(図1C)。
再灌流のt=0において、血管内抵抗性は、セルシオを使用したCSと比較して、24時間のポリソルを用いたMP後の場合において、有意に低かった。再灌流の間の全体的な抵抗性をこれらの群の間で比較した場合、抵抗性はまた、CS群で有意に低かった(それぞれ、0.13 ± 0.01および0.16 ± 0.01 mmHg/ml/min)。
両実験群において、胆汁の生成はなかった。しかしながら、全てのアンモニアは、再灌流の60分間に、尿素へと変換されて排除された(図3)。実験群間で差は見られなかった。再灌流の終了時において、両群で高濃度の乳酸塩が見られたが、CSおよびMP間では差がなかった(8.6±2.3対9.5±1.1 mmol/L)。結果としてpHの低下が、どちらの群においても見られた(6.9±0.1対6.8±0.1)。
肝臓移植の指標は、過去数年間ドナー臓器の利用性の増加が伴わず、拡大しており、結果として肝臓移植の待機リストが大きくなっている。ドナーの肝臓を待つ間に、患者の14%が死亡している(10)。待機リストを小さくするために、生きているドナーからの肝臓移植、分離した肝臓の移植、臓器提供の政治的システムの変化および辺縁性のドナーの肝臓の使用(11−14)を含む、幾つかの選択肢が研究された。後者の分類は、高齢者のドナー、肝臓の線維症または脂肪変性を示すドナー、または心拍動のないドナー(NHBD)から成る(15−17)。NHBDにおいては、臓器が得られる前に循環停止が起こっている。
動物
275 g (+/- 25 g)の体重のオスのウィスターラット(Harlan、ホルスト、オランダ)を、肝臓のドナーとして使用した。動物は、12/12時間の暗/明周期の標準化された条件の下、水および標準固形飼料(Hope Farms, ウールデン)を自由に摂取させて、実験の開始まで飼育した。全ての動物は、動物へのケアにおけるオランダの規則および原則に従って取り扱われた。アムステルダム大学の動物倫理委員会により、この動物実験は承認された。
NHBD肝臓の24時間の肝臓保存を、UWを用いたCS (n=6)、UW-Gを用いたMP (n=6)またはポリソルを用いたMP (n=6)の何れかにより行った。50 mlのリンガー乳酸 (乳酸塩29 mmol/L、Na 131 mmol/L、K 5.4 mmol/L、Ca 1.8 mmol/L、Cl 111 mmol/L、Baxter、ユトレヒト、オランダ)で、37℃において、in situでウォッシュアウトを行った後、肝臓を、15 mmHgの圧力で、50 mlのUW、UW-Gまたはポリソルの何れかによる、低体温保存溶液(4℃)の1つで洗い流した(flushed)。CSでは、肝臓を、4℃の冷却容器中の解けた氷に置かれた、100 mlのUWを含むプラスティック製の無菌カップに浮遊させて置いた。MPでは、肝臓を、250 mlの保存溶液を含む、再循環標準化灌流装置につないだ。MPの間、ならびに、再灌流の間の両方において、肝臓のダメージの評価のためにサンプルを採取し、肝臓機能の評価のためのサンプルを最灌流中に採取した。
CSのためのUW溶液は、DuPont (Viaspan, pH 7.4, 320 mOsmol/kg, Bristol-Myers Squibb、ニューヨーク、USA)から得た。MPのためのUW-G溶液は、Belzerの処方に従って作製した(pH 7.4, 330 mOsmol/kg)(26)。我々のMP保存溶液ポリソルは、学術医療センターの外科研究室(アムステルダム、オランダ)にて開発した(pH 7.4, 330 mOsmol/kg)。UW-G、ポリソル-2およびクレブス-ヘンスレイ緩衝液 (KHB)は、Sigma-Aldrich (ザインドレヒト、オランダ)、Merck (ハールレム、オランダ)、Cambrex (ヴェルヴィエ、ベルギー)、Centrafarm (エテン・ルール、オランダ)およびNovo Nordisk (アルフェン・アーン・デン・レイン, オランダ)からの、分析試薬グレード(または、それより良い等級)の化学物質を用いて、我々の研究室で全て作製した。HESは、Fresenius (Taunusstein、ドイツ)から入手した。溶液を、0.45μmフィルター(Dow Corning、アレスリー、イギリス)および0.22μmフィルター(Millipack 60, Millipore、アムステルダム、オランダ)を通して滅菌した。
ラットを、O2/空気/イソフルラン(1 L/min: 1 L/min: 3 %)で麻痺させた。正中切開術に続いて両側性肋骨下切開の後、動物に、大静脈血管を介して0.1 mlのヘパリン(5000 IU/ml、Leo Pharma、マルメ、デンマーク)でヘパリン処置した。2分後、動物を屠殺するために、横隔切除(phrenotomy)を行った。肝臓への血流を停止させた後、温熱虚血時間(warm ischemic time)(WIT)を開始した。WITの間、肝臓を周囲から分離し(mobilized)、胆管に0.9 mmカテーテル(B-Braun、メルスンゲン、ドイツ)でカニューレ処置した。WITの30分後、肝臓を、門脈カニューレ(2.7 mm、腸内栄養管、Vygon、ファルケンスワルト、オランダ)を介して50 mlのリンガー乳酸 (37℃, 8 mmHG)でウォッシュアウトした。ウォッシュアウトの間、肝臓のうっ血を、肝臓下の大静脈血管を切断することで防いだ。肝上の大静脈血管を、次に、2 mmのカニューレ(Vygon)でカニューレ処置し、肝臓下の大静脈血管を連結し、周辺組織の手入れの後、肝臓を切除し重量を測定した。
我々の機械式灌流システムは、学術医療センターの医療工学学部(Medical Technology Department of the Academic Medical Center)(アムステルダム、オランダ)にて開発した。肝臓をつなぐ前に、回路を、無菌アクアデストおよび保存溶液ですすいだ。圧力駆動システム(15 mmHg)は、350 mlの無菌MP溶液(4℃)を含む貯蔵器から成る。肝臓をシステムにつないだ後、溶液の最初の100 mlを、システムに再び入らないようにして、自由に排出させた。溶液の残りの250 mlを、ローラーポンプ(Ismatec、グラットブルグ、スイス)によって再循環させた。灌流溶液を、ガラス酸素供給器を用いて酸素化し、臓器の酸素圧を700 mmHgとした。空気塞栓を、気泡除去器によりシステムから除き、その後、溶液を熱交換器(HMT-200, Heto、ブレダ、オランダ)を用いて4℃まで冷却した。溶液は、流量計 (HT-207, Transonic Systems Inc、マーストリヒト、オランダ)を通り、次に門脈カニューレを通って肝臓に入った。溶液は、肝上大静脈血管カニューレから貯蔵器へと自由に流れた。
クレブス-ヘンスレイ緩衝液 (KHB)による再灌流は、30分の復温の期間の後に行い、受取人への肝臓の移植を模倣した。再灌流の直前に、塩化アンモニウムを、機能試験のために添加した。再灌流を、貯蔵器を350 mlのKHBで満たし温度を37℃に調節するという例外を除いて、MPと同様の装置で行った。肝臓の結合の前に、システムを、無菌アクアデストおよびKHBですすいだ。肝臓の結合の後、再び、最初の100 mlを、システムに再び入らないようにして、自由に排出させた。この溶液を、熱交換器で加熱し、流量計を通過させ、次に門脈カニューレを介して肝臓に入れた。肝臓のダメージおよび肝臓機能の評価のためのサンプルを、後肝臓(posthepatically)から採取した。肝臓の温度を、肝臓の下に設置した温度プローブで測定した(Lameris, ニューウェハイン、オランダ)。システムを、アルコール(70%)および滅菌水(アクアデスト)で、それぞれの方法の前後に洗浄した。
肝細胞の損傷および肝臓機能の評価のための灌流サンプルを、MPおよび再灌流の間に採取した。MPの間、サンプルを、1時間おきに、t=0、t=1、t=2、t=22、t=23およびt=24時間に採取した。再灌流の段階において、サンプルを、60分の期間、15分間隔で採取した。再灌流の段階の終わりに、アデノシン三リン酸(ATP)の評価のための肝臓サンプルを、急速組織凍結のための凍結固定を用いて、副肝葉(accessory liver lobe)から採取した。肝臓の生検材料を、尾状部および右肝葉(right liver lobes)からさらに採取し、ホルマリン(リン酸緩衝食塩水中10%)で処理した。透過型電子顕微鏡のための肝臓サンプルを、中葉から採取し、マクドウェル溶液中に貯蔵した。最終的に、肝臓サンプルを、乾/湿重量分析のために、左葉から採取した。
ダメージパラメーター:肝臓のダメージは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の分光光度分析により評価した(27)。灌流流動は、微小血管の統合性を評価するために、MPおよび再灌流の間に測定した。
組織学のための肝臓生検材料を、ホルマリン中(リン酸緩衝食塩水中、10%)に貯蔵し、パラフィンで処理し、4μm切片に切り出した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色の後、切片を、TojimbaraおよびMartinにより改変された、9−ポイント半定量的ダメージスコアを用いて、光学顕微鏡で評価した(31、32)。外側左葉(left lateral lobe)からの生検材料を、乾/湿重量比の評価のために採取した:肝臓を、再灌流後、即座に重量を測定した。その後、これらの生検材料を、60℃で環境容器(climate chamber)にて保持した。生検材料は、重量の減少がみられなくなるまで、3−5日おきに重量を測定した。乾/湿重量比を測定するため、以下の式を使用した:100% x (1−(乾燥重量/湿潤重量))。超微細構造的研究を目的として、透過型電子顕微鏡のための肝臓生検材料(1 mm3)を、マクドウェル固定液で少なくとも48時間固定した。その後、Na-リン酸緩衝液(0.1 M, pH 7.4)ですすぎ、1% OsO4で後固定(postfix)し、水ですすぎおよび段階的なエタノール(70-80-90-96-100%)およびプロピレンオキシドで脱水した。最終的に、試料を、エポン(epon)に包埋した。超薄切片(80 nm)を、Reichert Ultracut Eで切り出し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛(lead citrate)でコントラストを強調した(contrasted)。切片は、100kVで作動するPhilips EM420で研究した:画像を、SIS Megaview IIカメラで取得した。
全ての群を、クラスカル-ワオリス試験を用いて比較した。有意な結果の場合は、個々の群間の差を、ノンパラメトリック・マン・ホイットニー-U試験にて評価した。アンモニアクリアランス率および尿素生成率には、反復測定の分析を、ボンフェローニによるポストホック試験とともに使用した。文章およびグラフ中の結果は、平均±SEMにて示されている。統計的有意性は、p < 0.05として定義した。
一般
平均ラット重量および肝臓重量は、それぞれ289 ± 7 gおよび14.8 ± 0.3 gであった(n=18)。
MPの間、ASTの放出は、t=0、t=1、t=2およびt=22時間において、ポリソルと比較して、UW-Gを用いた場合のほうが有意に高かった。ATL放出は、全ての時点でポリソルと比較してUW-Gを用いた場合のほうが有意に高かった(図1A、B)。MPの間における灌流の流動は、MP-UW-G群において低下し、t=22、t=23およびt=24時間において、MP-ポリソルと比較して、より低い流動を示す結果となった(p= 0.01)(図2A)。
AST放出(図3A)は、t=30およびt=45分において、CSと比較してMP-UW-G後のほうが低かった(p< 0.05)。ポリソルを用いた場合、この放出は、全ての時点において低かった(p< 0.005)。ALT放出は同じ傾向を示したが(図3B)、有意性は、t=60分でのMP-ポリソルとCSとの比較においてのみあった(9.7 ± 2.4 対 47.2 ± 14.2 IU/L, p< 0.05)。再灌流の間における灌流流動は、CSとの比較ではt=45およびt=60分で、MP-UW-Gとの比較では全ての時点で、MP-ポリソルの方が有意に高かった(図2B)。また、灌流流動は、全ての時点において、MP-UW-Gと比較して、CS群のほうが良好であった(p< 0.05)。
胆汁生成は、ポリソルを用いたMP後が、UWによるCSおよびUW-Gを用いたMPと比較して、最も高かった(それぞれ、390 ± 23 vs. 34 ± 19 vs. 153 ± 55 μl/時間、p<0.01)。CS-UWとMP-UW-Gとの間では、有意な差は見られなかった(表1)。酸素消費量は、UW-Gを用いたMPとの比較では全ての時点で、UWを用いたCSとの比較ではt=60で、ポリソルを用いたMPの後が最も高かった(図4)。ポリソルを用いたMP後において、最もアンモニアクリアランスが起こり、UW-Gを用いたよりt=15、45および60において、CSの場合よりt=15において、有意によかった。尿素生成は、全ての時点で、ポリソル群が、UW-Gと比較して有意に高かった。ポリソルとCSとの間に差はなかったものの、t=45において、UW-Gと比較して、CSのほうがより尿素が生成された(図5A、B)。
再灌流段階の最終時におけるATP含量は、ポリソルを用いたMPの後における場合が、UWによるCSおよびUW-Gを用いたMPの両方の場合に比べて、有意に高かった(それぞれ、7.5 ± 0.6 対 4.0 ± 0.8および2.5 ± 0.6 μMol/グラム湿重量)。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片における、ダメージの半定量的評価は、ポリソルを用いて保存された肝臓では、2.2±0.2という平均スコアが得られた。これは、CSおよびUW-Gを用いたMPの両方と比べて(それぞれ、3.7 ± 0.3および4.4 ± 0.3)、有意に良いスコアであった。
再灌流後に採取された生検材料は、ポリソルを用いたMPによる保存の後において、UWでのCSおよびUW-Gを用いたMPと比較して、有意に低い乾/湿重量比を示し(それぞれ、72.6 ±0.8 対 77.1 ± 1.1および75.2 ± 0.9%)、それゆえ、組織の浮腫はより小さいことが示された。
肝臓移植は、末期肝臓疾患の患者に選択される治療である(33、34)。肝臓移植片の質は、その他の要因のなかでも、保存方法および保存期間の長さ、すなわち、冷却虚血時間(cold ischemic time)に依存する。肝臓保存における、現在の最高の基準は(35)、適当な保存溶液を用いてウォッシュアウトし、冷却貯蔵(CS)でヒト肝臓の同種移植を16時間まで安全に保存することを可能とすることである(36)。この設定において、肝臓は、移植片の生存度に関しての何れの客観的情報を伴わず、保存段階後に、受取人に移植される。肝細胞のダメージおよび肝臓の機能の前持った評価のための信頼できる方法は、静的な冷却貯蔵臓器(statically cold stored organ)において欠けている。ドナーの病歴、巨視的な評価および肝臓の生検材料分析は、冷却保存された肝臓移植片の生存度に対して、ほとんど指標となることがない(37)。ほとんどの腹腔の臓器の保存において、CSの限界に達してきた。代わりとして、肝臓の機械式灌流保存(MP)は、実験的研究が再び注目されるようになった。MPは、60年代初頭には既に適用されていた(38−40)。ウォッシュアウトにより血液の残留物を排除した後、肝臓は、再循環機械式灌流システムにつなげられ、そこで、輸送の期間、低体温保存溶液で灌流される。CSを超えるMPの幾つかの利点が推論された:1)酸素および栄養素の持続的供給、2)代謝の最終生成物の除去、3)保存中の肝臓生存度の評価(41)および4)心拍動のないドナー(NHBD)の肝臓といった、虚血性のダメージを受けた臓器の蘇生の可能性(42)。実験的研究により、CSと比較してMP後における、肝臓移植片の移植後の機能にて優れた結果が示された(43−45)。これらの結果は、臓器は4℃まで冷却されても、7−35%の本来の代謝は維持されているという事実で説明することができる(46)。低下したとしても、この代謝は、持続性酸素化MPによってのみ供給される、エネルギー基質および酸素から利益を得ることができる。実験的MPで頻繁に使用される、改変ウィスコンシン大学溶液(UW-グルコナート: UW-G)は、肝臓のエネルギー、炭水化物および脂肪代謝のための基質を欠いている(47−51)。低体温臓器保存のための溶液中の栄養素の役割に関する文献は少ないものの(52−54)、我々は、栄養素が強化された灌流溶液により、より良質な肝臓保存がもたらされると仮定した。このことは、新規の保存溶液、ポリソルの開発につながった。この溶液は、強力な緩衝剤および遊離基の補足剤とともに、肝臓代謝に必要な栄養素を含む。中でも、ポリソルとその他のMP保存溶液との間の違いを作る構成成分は、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファンおよびアルギニンといったアミノ酸、ならびに、アスコルビン酸およびアルファ-トコフェロールといったビタミンである。この研究の目的は、ポリソルを用いたラット肝臓のMPを評価することと、結果を、UW-Gを用いたMP、最高の基準であるUWを用いたCS法の両方と比較することである。この目的のため、保存方法およびMP溶液の両方を、単離され灌流されたラットの肝臓モデル(isolated perfused rat liver model)(IPRL)で評価した。
動物および手術
体重350 g(+/−50 g)のオスのウィスターラット(Harlan、ホルスト、オランダ)を、肝臓のドナーとして使用した。動物は、実験の直前まで、標準化された条件のもと、12/12時間の暗/明周期で、水および標準的固形飼料(Hope Farms、ウールデン、オランダ)を自由に摂取できる状況で飼った。全ての動物は、アムステルダム大学の動物倫理委員会の承認の下、動物へのケアにおけるオランダの規則および原則に従って取り扱われた。ラットを、O2/空気/イソフルラン(1 L/min: 1 L/min: 3 %)で麻痺させ、0.1 ml/100 g体重のFFM(ハイプノーム/ドルミカム/アクアデスト: 1:1:2)を腹腔内注射した。手術の間、O2/空気/イソフルランを、マスクを通して吸入させることで、麻痺状態を維持した。正中切開術に続く両側性肋骨下切開の後、肝臓を周囲から分離(mobilize)し、胆管に0.9 mmカテーテル(B-Braun、メルスンゲン、ドイツ)でカニューレ処置した。門脈のカニューレ処置の前に、動物に、大静脈血管を介して0.1 mlのヘパリン(5000 IU/ml、Leo Pharma、マルメ、デンマーク)でヘパリン処置した。肝臓を、門脈のカニューレ(0.8 fr、腸内栄養管、Vygon、ファルケンスワルト、オランダ)を介して、50 mlのリンガー乳酸 (37℃、10 cm H2O、Baxter、ユトレヒト、オランダ)でウォッシュアウトした。ウォッシュアウトの間、動物は、腹部の大静脈血管の切れ目から出血した。肝上の大静脈血管は、0.6 frカニューレ(Vygon)でカニューレ処置し、肝臓下の大静脈血管を連結し、周辺組織の手入れの後、肝臓を切除し重量を測定した。
二重性機械式灌流システムは、学術医療センターの医療工学開発学部(AMC、アムステルダム、オランダ)により開発され、単一の装置においてMPおよび再灌流(RP)相の両方が可能である(付録2)。切除された肝臓の結合の前に、回路を、200 mlの無菌アクアデストで、続いて50 mlの保存溶液ですすいだ。圧力調節性灌流システムは、350 mlの無菌MP溶液を含む貯蔵器から成る。肝臓をシステムにつないだ後、灌流溶液の最初の100 mlを回収した。溶液の残りの250 mlを、ローラーポンプ (Ismatec、グラットブルグ、スイス)によって再循環させた。灌流溶液を、ガラス酸素供給器を用いてカーボジェン (95%O2/5%CO2、1 L/min、Hoekloos Medical、アムステルダム、オランダ)によって酸素化し、その結果、前肝臓の酸素圧は約700 mmHgとなった。空気塞栓を、気泡除去器によりシステムから除き、その後、溶液を熱交換器(HMT-200, Heto、ブレダ、オランダ)を用いて冷却した。灌流溶液は、直列流量計(in-line flow meter) (HT-207, Transonic Systems Inc、マーストリヒト、オランダ)を通り、門脈カニューレを通って肝臓に入り、肝上大静脈血管カニューレを経由して貯蔵器へと自由に流れた。
この研究は、3つの実験群を含む:1) CS-UW (N=5); 2) MP-UW-G (N=5)および3) MP-ポリソル (N=5)。単離した肝臓を、CSまたはMPのどちらかで24時間保存し、その後再灌流した。RL(4℃)でウォッシュアウトした後、肝臓を、保存溶液でin situで洗い流した(flushed)。CS肝臓を、50 mlのUW (4℃)で洗い流し、100 mlのUWを含む無菌のカップに置き、冷却した容器(4℃)中の溶けている氷の上で24時間、貯蔵した。MP肝臓を、ウォッシュアウトおよび収集の後、門脈を経由して直接灌流システムにつなぎ、100 mlのUW-Gまたはポリソルどちらかで洗い流し、連続してこの溶液で4℃にて24時間灌流した。保存の期間の後、全ての肝臓を、酸素化したKHBで、37℃で60分間再灌流した。
冷却貯蔵のために、ウィスコンシン大学の保存溶液(Viaspan, Bristol Myers Squibb、ニューヨーク、USA)を用いた。MPのためのUW-G溶液を、Belzerの処方(pH 7.4、4℃、330 mosmol/kg)に従って作製した(55)。MP保存溶液ポリソル (pH 7.4、4℃、330 mosmol/kg)は、AMCの外科研究室で開発された。再灌流のために、ウシ血清アルブミンの入っていないクレブス-ヘンスレイ緩衝液 (KHB) (pH 7.4、37℃、320 mosmol/kg)を用いた。UW-G、 ポリソルおよびKHBは全て、Sigma-Aldrich (ザインドレヒト、オランダ)、Merck (ハールレム、オランダ)、Cambrex (ヴェルヴィエ、ベルギー)、Centrafarm (エテン・ルール、オランダ)およびNovo Nordisk (アルフェン・アーン・デン・レイン、オランダ)からの、分析用試薬グレード(またはそれより良い等級)の化学物質を用いて、我々の研究室で作製した。使用に先立ち、溶液は、0.45μmのアンプルフィルター(DowCorning、アレスリー、イギリス)および0.22μmのフィルター(Millipack 60、Millipore、アムステルダム、オランダ)を通してろ過することで滅菌した。
肝細胞性のダメージを評価するためのサンプルを、60分間のRPの間、10分おきに採取した。肝臓のダメージは、肝後方の灌流サンプル(Laboratory of Clinical Chemistry、AMC、オランダ)において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)および乳酸脱水素酵素(LDH)の直接の分析によって評価した。アルファ-GST(アルファ-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)レベルは、ラットアルファ-GST ELISAキット(Biotrin、ダブリン、アイルランド)を用いて決定した。肝臓の機能は、60分間のRPの間、胆汁生成をモニターすることで評価した。そのうえ、乳酸生成(Laboratory of Clinical Chemistry、AMC、オランダ)および灌流液pH(ABL, Radiometer、ズーテルメール、オランダ)を、再灌流の間測定した。
RP段階の終わりに、生検材料を、尾状部および外側右葉(right lateral lobes)から得た。生検材料は、ホルムアルデヒド(10%)中に貯蔵し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片(4μm)を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、光学顕微鏡で評価した。肝臓損傷形態学的分類のために、1(良好)から9(不良)のスケールに類別される9ポイントスケールを用いた(56)。1.正常な長方形の形状、2.類洞空間(sinusoidal spaces)の増大を伴う円形の肝細胞、3.ゾーン3における空胞化(vacuolization)、4.ゾーン2における空胞化、5.ゾーン1における空胞化、6.ゾーン3における空胞化および核濃縮、7.ゾーン2における空胞化および核濃縮、8.ゾーン1における空胞化および核濃縮および9.壊死。乾/湿重量比の肝臓のために、生検材料を、灌流後即座に重量を測定し、その後60℃の温室(stove)に貯蔵した。肝臓の重量の減少が止まるまで、7日ごとに再び生検材料の重量を測定した。肝臓の浮腫の量を実証するため、以下の計算を使用した:1-(乾重量/湿重量) x 100%。
クラスカル-ワオリス試験を、3つの群の全体的な比較のために使用した。有意な差があった場合、個々の群の差を、ノンパラメトリック・マン・ホイットニー試験にて評価した。文章およびグラフ中の結果は、平均値±SEMで示されている。統計学的有意性は、p < 0.05として定義した。
灌流パラメーター:
肝臓重要は、実験群間で有意に異なることはなかった(16.5±0.5グラム)。低体温MPおよび正常温RPの両方の間、灌流圧力は、20 cm H2O (重力制御(gravity controlled))に一定に保った。低体温MPの間の灌流の流動は、最大で、1 ml/分/グラム肝臓に達した。生常温RPの間、最大で3 ml/分/グラムの流動が記録された。低体温MPにおける酸素化は、約700 mmHgの灌流液pO2となり、正常温RPにおける酸素化は、より高い温度のために、約500 mmHgのpO2となった。正常温RPにおいて記録された温度は、37.1±0.4℃であった。
24時間の冷却虚血時間(cold ischemic time)後のALT放出は、UWによるCS後の方が、UW-Gを使用したMPに比較して、t=0分(4.6 ± 2.4 対 0.4 ± 0.2 IU/L)およびt=10分(5.4± 1.7 対 1.4 ± 0.2 IU/L)において、有意に高かった(図2)。しかしながら、CS-UWとMP-ポリソルを比較すると、ALTレベルは、t=0分およびt=50分を除く全ての時点において、MP-ポリソル後の方が有意に低い。LDHレベルは、有意性に到達することはなかったが、24時間のCS-UW後のものが高い結果となっている。LDHは、UW-Gまたはポリソルのどちらかを用いたMPに比べて、CS-UW後のものが、t=10分において有意に高い(図1B)。灌流液の流動、pHおよび乳酸生成は、有意に異なることはなかった(データは示していない)。2つのMPの溶液を比較すると、ASTレベルがより低いことで示されるように、24時間のMP-ポリソル後において、ダメージがより小さいことがわかった(図1C)。全ての時点において、ポリソルを支持する傾向があるものの、ALT(図1A)、LDH(図1B)、流動、pHおよび乳酸生成(データは示していない)において有意な差はなかった。t=40におけるα-GSTの放出は(図2)、MP-ポリソル後のものが、CS-UW(それぞれ125.5 ± 10.5対 46.4 ± 9.1、p< 0.02)およびMP-UW-G(それぞれ101.6 ± 12.0対46.4 ± 9.1、p<0.02)と比較して低かった。
胆汁生成は、MP-ポリソル後のほうが、MP-UW-GまたはCS-UW後より高いようであった(それぞれ、355 ± 82.3 対 256 ± 26.2 および 180 ± 61,89μl/h)。しかしながら、これは、有意性に到達しなかった(図3)。
肝臓切片の組織病理学的スコアリングの後、より良い中央値スコアが、CS-UW肝臓(4.5 ± 0.9ポイント)に比べて、UW-Gおよびポリソル(それぞれ、2.0 ± 0.6および1.6 ± 0.4ポイント)を用いたMP群でしめされた。MP群間では有意な差はみられなかった(図4)。肝臓切片の乾/湿重量は、MP群において最も高く、浮腫のパーセンテージが最も低いことが示されている(図5)。パーセンテージは、それぞれ、76±1.0対72±0.5対72±0.7である。
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Claims (18)
- ドナーの臓器の生存度を維持するための、臓器保存および灌流溶液であって、組織培養培地を含み、以下の点を特徴とする溶液:
a) 組織培養培地を含む溶液の緩衝能力が、少なくとも20のベータまで増加しており、および、
b) デキストラン、PEG、ヒドロキシエチルデンプン(HES)およびアルブミンから成る化合物の群から選択される、少なくとも1つの高分子量化合物が、膠質浸透圧を増大させるために添加され、
c) 溶液が、140 mM未満の[Na+]濃度、25 mM未満の[K+]濃度を有し、[Na+]と[K+]との比が、少なくとも2:1、好ましくは5:1である。 - 請求項1に記載の溶液であって、生理的膠質浸透圧が、20から35 mmHg、好ましくは25 mmHg周辺に維持される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、生理的浸透圧モル濃度が、300から400 mOsmの間、好ましくは300から350 mOsmの間、および最も好ましくは330 mOsm周辺に維持される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、前記組織培養培地が、最小必須培地イーグル(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640培地、DMEM/F-12培地、ハムF-10、ハムF12、イスコブ(Iscove's)変法ダルベッコ培地、レイボビッツ(Leibovitz's)L-15培地およびアール(Earle)塩添加最小必須培地およびウィリアムスE培地から成る群から選択される溶液。
- 請求項4に記載の溶液であって、前記組織培養培地が、ウィリアムスE培地である溶液。
- 請求項5に記載の溶液であって、各アミノ酸、アルギニン、アスパラギン、シスチン、ヒスチジン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリンおよびトリプトファンの少なくとも1つの濃度が、標準的なウィリアムスE培地に比べて2から10倍に増加した溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、セレンの供給源が、好ましくはNaSeO3・5H2Oとして、提供される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、付加的な緩衝能力が、HEPES、PIPES、MOPS、TES、BES、ビシン(Bicine)、トリシン、トリス、クエン酸塩、ヒスチジン、KH2PO4、K2HPO4、NaHCO3から成る群から選択される緩衝剤の付加により提供される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、高分子量化合物である、25.000から45,000ダルトン、好ましくは30,000ダルトン周辺のポリエチレングリコール(PEG)が、コロイド性添加物として使用される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、オファロプリノール(ofallopurinol)、トロロクス、グルタチオン、ビタミンE、メチレンブルーおよびアスコルビン酸から成る群から選択される、付加的な抗酸化剤が提供される溶液。
- 請求項1に記載の溶液であって、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、スクロース、グルコース、キシリトールおよびラクトビオン酸塩(lactobionate)からなる群から選択される付加的な不透過剤が添加される溶液。
- 請求項1から請求項11の何れか1項に記載の溶液に臓器を置くことを含む、臓器の保存のための方法。
- 請求項1から請求項11の何れか1項に記載の溶液にて、臓器をすすぎ(rinsing)または洗い流す(flushing)ことを含む、臓器の保存のための方法。
- 請求項1から請求項11の何れか1項に記載の溶液による連続的なまたは拍動性の灌流の条件に臓器を置くことを含む、臓器の保存のための方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記臓器が、心臓、肺、すい臓、腎臓または肝臓から成る臓器の群から選択される方法。
- 請求項12から請求項14の何れか1項に記載の方法であって、前記溶液の温度が、0℃から20℃、好ましくは0℃から10℃であり、および該溶液が酸素化されている方法。
- 請求項11から請求項16の何れか1項に記載の方法であって、移植しようとする前記臓器が、心拍動のないドナーから得られる方法。
- 請求項11から請求項17の何れか1項に記載の方法であって、前記増加がヒトの臓器である方法。
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