CN109221084A - 一种胰腺专用保存液及其制备方法 - Google Patents

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丁国善
韩澍
郭猛
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赵渊宇
陈子奇
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    • A01N1/0205—Chemical aspects
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Abstract

本发明提供了一种胰腺专用保存液及其制备方法，属于器官移植领域。本发明的胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：低分子羟乙基淀粉10 30‑60份，腺苷1‑2份，乳糖醛酸35‑45份，七水硫酸镁1‑2份，还原型谷胱甘肽1‑2份，氢氧化钾4‑8份，枸橼酸钠18‑26份，磷酸氢二钠6‑9份，甘露醇11‑15份，L‑精氨酸1‑2份，昆布多糖1‑2份，奥利司他0.3‑0.8份，抑肽酶0.1‑0.2份，枸橼酸适量，双蒸水余量。本发明的胰腺保存液与UW液和HC‑A液相比，在保存胰腺上具有更优良的保存效果，在保存10h后胰腺中的细胞凋亡数仅为14％。

Description

一种胰腺专用保存液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术器官移植领域，具体涉及一种胰腺专用保存液及其制备方法。
背景技术
器官移植是20世纪人类医学科学发展所取得的重大技术革新，被誉为二十世纪改变人类生活的重大生命科学进展，是世界公认的治疗多种终末期疾病的有效方法。自20世纪60年代开始在临床上应用，至今已取得了突出猛进的进展。通过器官移植，全世界每年数以万计的患者得以延续生命。器官移植中一个非常关键的步骤是离体器官的储存保护，为临床器官移植提供高质量的供体，这是移植手术成功的先决条件和根本保障。而离体器官保存根本要解决的问题是如何最大限度减少缺血对离体器官造成的各种损伤，使离体器官保持有效的活力，以便完成运送、配型和手术，并在手术后能够更加迅速地恢复功能。
离体器官移植在临床工作中是比较常见的，器官离体后因缺血缺氧，正常的代谢过程受到干扰而产生一系列的病理生理变化，如代谢和毒性物质堆积、细胞胞浆空泡形成、线粒体水肿、功能下降、溶酶体稳定性下降，导致细胞变性和组织坏死。恢复供血后又会引起一系列病理生理学方面的改变，可笼统称之为缺血再灌注损伤。器官离体后需要及时进行移植手术，近几年来，中国器官的移植数量已经跃居亚洲首位，但临床上除了肾脏保存外，肝、心和胰腺等器官的保存仍比较依赖于进口保存液。人体不同器官对缺血的耐受力差别很大，因而采用保存液进行保存的时限也有不同，如美国研制的UW液对胰或肾脏的储存时间可达72小时，对肝脏储存时间达24小时，但心脏保存一般不超过4～6小时。
糖尿病是一种由多基因遗传和环境因素共同作用造成的胰岛素分泌相对或绝对不足导致的以慢性高血糖为主要表现的代谢疾病，目前中国的糖尿病患病率超过10％。其中有一部分属于高危糖尿病患者，易于发生严重的低血糖或高血糖事件，随时有导致生命危险的可能。胰岛细胞移植能增加糖尿病患者体内胰岛素分泌细胞数量，有效控制血糖，减少和改善糖尿病的并发症，避免由外源性胰岛素导致的低血糖和胰岛素抵抗。近年来，越来越多的研究者及病患关注胰岛细胞移植治疗高危糖尿病的可能，但由于胰腺保存时间较短，胰岛细胞在保存过程中损伤较多等原因，导致胰腺供体弃用较多，使大量的病患在疾病的痛苦中煎熬地等待。
目前世界上最常用的UW多器官保存液对于不同脏器的保存时限是不同的。研究显示，UW液最多能保存肝脏48小时，肾脏72小时，肺18小时左右，但对于胰腺仅能保存6-8小时。我们在前期研究中发现，胰腺作为消化道的外分泌器官，其分泌的胰蛋白酶和胰脂肪酶在低温保存过程中仍具有一定的活性，可能是导致胰腺保存时限较短的主要原因。
在胰腺获取的过程中，其正常的生理结构被破坏，大量胰液外漏至保存液中。胰液中的胰蛋白酶及胰脂肪酶在此状态下仍具有约20％的活性，可能会消化自身胰腺组织，损伤胰岛细胞。因此，根据胰腺组织的特点，研制适用于胰腺的保存液有着十分重要的研究和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种胰腺专用保存液及其制备方法，以期提供临床上经常需要的离体胰腺器官的保存问题。
本发明的目的之一是提供一种胰腺专用保存液，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。。
作为优选的方案，本发明提供的胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。。
作为进一步优选的方案，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。。
5、作为最优选的技术方案，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。。
作为优选的，本发明中所述低分子羟乙基淀粉10的分子量为10000～100000。
由于胰腺特殊的生理性质，本发明在保存液配方上多选用分子量较小，渗透能力较强的化合物，显著提高了胰腺的保存效果。并结合器官保存液组成的五项要求，即：(1)减轻由于低温保存导致的细胞水肿；(2)减少保存过程中细胞的酸化作用；(3)减少保存过程中细胞间隙的膨胀；(4)减轻离体保存及再灌注过程中氧自由基的损伤；(5)提供再生高能磷酸化合物的底物，维持细胞能量。以我研究所自主开发的HC-A以及HC-AII型保存液为参照，结合发明人在器官移植保存液三十余年的研究经验，提供了一种新型的离体胰腺保存液。
本发明采用了低分子羟乙基淀粉10作为胶体渗透压的主要维持物质。羟乙基淀粉由淀粉水解并经羟乙基化制得。其结构和糖原相似，无毒且具有良好的生物相容性。本发明选用低分子羟乙基淀粉10，其分子量由10000至100000，具有非常好的稳定性。低分子羟乙基淀粉10能增加细胞膜负电荷，使已聚集的细胞解聚，降低保存液及胰腺血管内粘度，改善微循环，利于保存液有效组分渗透。
昆布多糖是提炼于海带的一种多糖物质，Fehling试剂反应水解前呈阴性，加酸水解后呈阳性，说明其中存在还原糖。昆布多糖中的褐藻多糖硫酸酯一方面能抑制血小板聚集，防止血栓形成，提升微血管的通畅性，另一方面，褐藻多糖硫酸酯能明显抑制细胞过氧化，对双磷脂膜的稳定性具有非常好的维持作用。
还原型谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸组成的一种三肽，在细胞的正常运作和维持中具有非常重要的作用。还原型谷胱甘肽能和过氧化物及自由基相结合，对抗氧化剂对巯基的破坏，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基的酶不被破坏。同时，还原型谷胱甘肽还参与了I-Kb/NF-KB信号通路的调节，抑制细胞的凋亡。
奥利司他是一种长效的脂肪酶抑制剂，作为一种戊酮酸酶，奥利司他能紧密地和胰腺中脂肪酶活性位点的丝氨酸残基共价键结合，使脂肪酶失活。有研究显示，活化的胰脂肪酶能破坏磷脂双层膜原有的有序结构，并使磷脂分子的有序性降低，从而使磷脂双层膜形成空洞或缺陷，并随时间的增加而增大，进而导致细胞磷脂双层膜的稳定性下降。应用奥利司他能抑制外漏胰液中的胰脂肪酶，减轻细胞损伤。
抑肽酶是一种低分子广谱蛋白酶抑制剂，能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。抑肽酶在临床上主要用于预防和治疗急性胰腺炎，通过酶上的丝氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶复合物而达到抑制作用。应用抑肽酶能防止活化的胰蛋白酶对自身组织的消化。
本发明采用腺苷及L-精氨酸作为能量底物，一方面保证了细胞在冷缺血过程中糖酵解所需的能量，另一方面提供了NO合成的前体，起到抑制血小板聚集、防止中性粒细胞黏附、降低血管内皮细胞通透性和抑制炎性渗出的作用。
本胰腺保存液应用乳糖醛酸作为主要非渗透性阴离子，其分子量较大，不能透过细胞膜，能减轻冷藏过程中细胞水肿。本胰腺保存液应用甘露醇为渗透压调节剂，使胰腺保存液的渗透压略高于细胞渗透压，抑制细胞和细胞外基质水肿。
本发明所用原料全部为国产的符合国家药典规范的药用成分，无配伍禁忌，所形成的胰腺保存液为无色透明的液体，性质稳定，可高温高压消毒，可在常温或低温下贮存。
本发明按照保存液的五项要求进行配制，并以目前在医学界被广泛应用和认可的HC-A以及UW型保存液为参照，对比三者对离体胰腺的保存效果，发现本发明的保存液相比HC-A液和UW液具有更优良的胰腺保存效果。
本发明的目的之二是提供上述胰腺专用保存液的制备方法，其包括以下步骤：
(1)按配方用量，向容器中预先加入双蒸水，然后依次加入低分子羟乙基淀粉10、乳糖醛酸、七水硫酸镁、氢氧化钾、枸橼酸钠、磷酸氢二钠、甘露醇，在室温下充分搅拌10min后逐滴加入枸橼酸，使溶液pH值达到预期的7.5-8.0，充分搅拌20-30min后加入医用活性炭，继续搅拌10min后进行滤膜脱碳；
(2)将配方用量的腺苷、L-精氨酸、还原型谷胱甘肽加入滤过液中，充分搅拌20min后，进行两次滤膜过滤；
(3)将配方用量的奥利司他和抑肽酶加入滤过液中，在室温下充分搅拌10min，使用滤膜过滤，所得滤液即为胰腺保存液。
进一步的，所述活性炭的加入量为4-6份，优选为5份，活性炭的直径为3μm。
进一步的，步骤(1)所述滤膜的目数为0.45μm。
进一步的，步骤(2)中所述两次过滤是先用0.45μm滤膜过滤，搅拌10min后再用0.22μm滤膜过滤。
进一步的，步骤(3)中采用0.45μm滤膜过滤，然后搅拌10min，即得胰腺保存液。
本发明的有益效果如下：
(1)提供了一种适合离体胰腺保存的专用保存液，能够很好用于临床上胰腺再植手术对离断器官保存的需求；
(2)本发明提供的胰腺专用保存液相比HC-A液和UW液在保存胰腺上具有更优良的保存效果。
附图说明
图1为胰腺石蜡切片经荧光染色后在不同保存液的超微结构图；
图2为制作的胰腺标本在不同保存液中的细胞凋亡结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
原料说明：
下述所有实施例中，氢氧化钾、枸橼酸钠、枸橼酸和磷酸氢二钠均购自上海百舜生物科技有限公司；七水硫酸镁购自上海宝达化工有限公司；腺苷购自南京优纯生物科技有限公司；甘露醇购自上海博景化工有限公司；低分子羟乙基淀粉10购自上海翼菁实业有限公司；乳糖醛酸购自SIGMA-ALDRICH；还原型谷胱甘肽购自皓元医药集团；L-精氨酸购自上海凛恩科技发展有限公司；昆布多糖购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，奥利司他购自泰州东邦精细化工有限责任公司；抑肽酶购自南京优纯生物科技有限公司。
实施例1
一种胰腺专用保存液，每1000ml保存液中含有组分如表1：
表1
成分 重量
低分子羟乙基淀粉10 45g
腺苷 1.5g
乳糖醛酸 40g
七水硫酸镁 1.5g
还原型谷胱甘肽 1.5g
氢氧化钾 6g
枸橼酸钠 22g
磷酸氢二钠 7.5g
甘露醇 13g
L-精氨酸 1.5g
昆布多糖 1.5g
奥利司他 550mg
抑肽酶 150mg
枸橼酸 适量
双蒸水 余量
其制备方法如下：
向1000ml容器中加入900ml双蒸水，然后依次加入低分子羟乙基淀粉1045g、乳糖醛酸40g、七水硫酸镁1.5g、氢氧化钾6g、枸橼酸钠22g、磷酸氢二钠7.5g、甘露醇13g。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸，使溶液pH值达到7.5-7.6。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭，继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷1.5g、L-精氨酸1.5g、还原型谷胱甘肽1.5g加入滤过液中，在室温下充分搅拌20分钟，使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟，使用0.22微米滤膜过滤。将配方用量的奥利司他550mg和抑肽酶150mg加入滤过液中，在室温下充分搅拌10分钟，使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟，滤液即为胰腺保存液。
实施例2
一种胰腺专用保存液配方，每1000ml含有组分如表2：
表2
成分 重量
低分子羟乙基淀粉10 43g
腺苷 3g
乳糖醛酸 38g
七水硫酸镁 1.5g
还原型谷胱甘肽 2g
氢氧化钾 6g
枸橼酸钠 22g
磷酸氢二钠 7.5g
甘露醇 13g
L-精氨酸 3g
昆布多糖 2g
奥利司他 700mg
抑肽酶 200mg
枸橼酸 适量
双蒸水 余量
其制备方法如下：
向1000ml容器中加入900ml双蒸水，然后依次加入低分子羟乙基淀粉1043g、乳糖醛酸38g、七水硫酸镁1.5g、氢氧化钾6g、枸橼酸钠22g、磷酸氢二钠7.5g、甘露醇13g。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸，使溶液PH值达到7.9-8.0。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭，继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷3g、L-精氨酸3g、还原型谷胱甘肽2g加入滤过液中，在室温下充分搅拌20分钟，使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟，使用0.22微米滤膜过滤。将配方用量的奥利司他700mg和抑肽酶200mg加入滤过液中，在室温下充分搅拌10分钟，使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟，滤液即为胰腺保存液。
离体胰腺组织在冷缺血过程中的能量来源主要为无糖酵解，此过程非常依赖于能量底物的比例和保存液的酸碱性。因此，保存液中增加能量底物的比例和碱性物质能抵抗无糖酵解产生的组织酸化，维持细胞内外环境相对稳定，减轻对线粒体的损害，消除酸中毒对糖酵解关键酶1,6-二磷酸果糖激酶的抑制，增加ATP的合成。
对比例1
一种胰腺保存液配方，其与实施例2的区别为：在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质，适用于需保存时间较例1更长的环境或设施。
对比例2
一种胰腺肢保存液配方，其与实施例3的区别为：在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质，适用于需保存时间较例2更长的环境或设施。
对比例3
一种胰腺保存液配方，其与实施例4的区别为：在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质，适用于需保存时间较例3更长的环境或设施。
实验例1
小鼠离体胰腺低温保存期间的细胞凋亡情况
实验动物：健康成年实验用C57/B6小鼠，雌性，体重26-28g。
实验步骤：术前准备及麻醉：术前禁食6h，禁水10h。采用戊巴比妥2mg/kg麻醉后，采用脊椎脱臼法处死。等待10分钟后，将胰腺从十二指肠根部离断，置入本胰腺保存液或UW保存液中，放置于4℃冰箱中密封保存，在第10小时，获取胰腺标本，固定后制作石蜡切片，进行TUNEL荧光染色。通过透射电镜进行超微结构观察，所得结果如图1，细胞凋亡结果如图2。
实验结果：在第10小时，应用UW保存液保存的胰腺中出现大量凋亡细胞，约占总数的32％。相比之下，应用本胰腺保存液保存的胰腺中仅约14％的细胞出现凋亡。证实本保存液在保存胰腺方面优于目前广泛应用于多器官保存的UW保存液。

Claims (10)

1.一种胰腺专用保存液，其特征在于，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
2.根据权利要求1所述的胰腺专用保存液，其特征在于，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
3.根据权利要求1所述的胰腺专用保存液，其特征在于，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
4.根据权利要求1所述的胰腺专用保存液，其特征在于，所述胰腺专用保存液按重量份数计，每1000份含有：
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胰腺专用保存液，其特征在于，所述低分子羟乙基淀粉10的分子量为10000～100000。
6.根据权利要求1-4任一项所述的胰腺专用保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按配方用量，向容器中预先加入双蒸水，然后依次加入低分子羟乙基淀粉10、乳糖醛酸、七水硫酸镁、氢氧化钾、枸橼酸钠、磷酸氢二钠、甘露醇，在室温下充分搅拌10min后逐滴加入枸橼酸，使溶液pH值达到7.5-8.0，充分搅拌20-30min后加入医用活性炭，继续搅拌10min后进行滤膜脱碳；
(2)将配方用量的腺苷、L-精氨酸、还原型谷胱甘肽加入滤过液中，充分搅拌20min后，进行两次滤膜过滤；
(3)将配方用量的奥利司他和抑肽酶加入滤过液中，在室温下充分搅拌10min，使用滤膜过滤，所得滤液即为胰腺保存液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述活性炭的加入量为4-6份，活性炭的直径为3μm。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述滤膜的目数为0.45μm。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述两次过滤是先用0.45μm滤膜过滤，搅拌10min后再用0.22μm滤膜过滤。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中采用0.45μm滤膜过滤，然后搅拌10min，即得胰腺保存液。
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