CN109258624A - 一种离体断肢保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种离体断肢保存液及其制备方法,属于器官移植领域。本发明的离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:低分子羟乙基淀粉10 30‑70份,腺苷1.5‑3份,乳糖醛酸30‑40份,七水硫酸镁1‑1.5份,还原型谷胱甘肽2‑3份,氢氧化钾4‑8份,枸橼酸钠16‑20份,磷酸氢二钠4‑6份,甘露醇8‑10份,L‑精氨酸2‑3份,昆布多糖1.7‑2.3份,别嘌呤醇0.08‑0.15份,硫化氢3‑5份,枸橼酸适量,双蒸水余量。本发明的断肢保存液与UW液和HC‑A液相比。当保存时间大于60小时后,本保存液对于小鼠离体断肢的保存效果优于UW液,并显著优于HC‑A液。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术器官移植领域,具体涉及一种离体断肢保存液及其制备方法。
背景技术
器官移植是20世纪人类医学科学发展所取得的重大技术革新,被誉为二十世纪改变人类生活的重大生命科学进展,是世界公认的治疗多种终末期疾病的有效方法。自20世纪60年代开始在临床上应用,至今已取得了突出猛进的进展。通过器官移植,全世界每年数以万计的患者得以延续生命。器官移植中一个非常关键的步骤是离体器官的储存保护,为临床器官移植提供高质量的供体,这是移植手术成功的先决条件和根本保障。而离体器官保存根本要解决的问题是如何最大限度减少缺血对离体器官造成的各种损伤,使离体器官保持有效的活力,以便完成运送、配型和手术,并在手术后能够更加迅速地恢复功能。
断肢的患者在临床工作中是比较常见的,肢体离断后因缺血缺氧,正常的代谢过程受到干扰而产生一系列的病理生理变化,如代谢和毒性物质堆积、细胞胞浆空泡形成、线粒体水肿、功能下降、溶酶体稳定性下降,导致细胞变性和组织坏死。恢复供血后又会引起一系列病理生理学方面的改变,可笼统称之为缺血再灌注损伤。
断肢离体后需要及时进行再植手术,相关实验及临床数据表明,超过4~6h的缺血时间会影响再植成功率和术后肢体功能康复。大部分患者具有急症再植手术的适应征,而有一些患者却不具备断肢再植的条件,不得不承受由于失去某一部分肢体所带来的生理及心理上的痛苦,致使生活质量下降。这些没有手术指征的患者多是由于多发伤导致生命体征不稳定、路途遥远无法及时到达医院、多肢离断导致手术时间较长等原因所致的肢体坏死。在这些情况下,如果能够妥善保存离断的肢体,延迟其坏死时间,可等到情况允许时再进行断肢的再植。因此,离体断肢体外保存的研究具有非常重要的意义。
近几年来,中国器官的移植数量已经跃居亚洲首位,但临床上除了肾脏保存外,肝、心和胰腺等器官的保存仍比较依赖于进口保存液。人体不同器官对缺血的耐受力差别很大,因而采用保存液进行保存的时限也有不同,如美国研制的UW液对胰或肾脏的储存时间可达72小时,对肝脏储存时间达24小时,但心脏保存一般不超过4~6小时。断肢再植的时限与肢体离断平面和环境因素等有关,一般而言常温下完全缺血6h不会出现不可逆变化,因此常温再植时限一般不超过6小时。
一种成功的保存液的组成应该满足5个要求:(1)减少由于低温保存导致的细胞水肿;(2)防止细胞的酸化作用;(3)防止灌洗液保存过程中细胞间隙的膨胀;(4)防止再灌注过程中氧自由基的损伤;(5)提供再生高能磷酸化合物的底物。
然而,由于断肢的固有特点,如:1、大部分由皮肤包裹,不能如肝、肾等器官一样进行灌注,导致渗透不佳;2、断肢中不同组织对缺血的耐受力差别很大,常温下,肌肉组织的临界缺血时间是4h,神经8h,脂肪13h,皮肤24h,骨组织高达4d。因此,如何研制适用于离体断肢特点的保存液有着十分重要的研究和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题,而提供一种离体断肢保存液及其制备方法,以期提供临床上经常需要的离体断肢保存问题。
本发明的目的之一是提供一种适应于断肢器官的离体断肢保存液,所述离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
作为优选的方案,本发明提供的离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
作为更进一步优选的方案,所述离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
作为优选的,本发明中所述低分子羟乙基淀粉10的分子量为10000~100000。
由于断肢的保存与其它器官表现出生理性质上的不同差异,且离体断肢的生理性质与实体器官大相径庭,而肢体对人的日常行动有着不可替代的作用,对于离体断肢的保存更加需要注重器官缺血时所造成的损伤和生理活性的丢失,因此现有的保存液如肾脏保存液、胰腺保存液等对断肢保存的效果有待进一步验证,本发明的发明人从断肢的特殊性质出发,在保存液配方上多选用分子量较小,渗透能力较强的化合物,显著提高了断肢保存液的保存效果。
本发明采用了低分子羟乙基淀粉10作为胶体渗透压的主要维持物质。羟乙基淀粉由淀粉水解并经羟乙基化制得。其结构和糖原相似,无毒且具有良好的生物相容性。本发明选用低分子羟乙基淀粉10,其分子量由10000至100000,具有非常好的稳定性。低分子羟乙基淀粉10能增加细胞膜负电荷,使已聚集的细胞解聚,降低保存液及断肢血管内粘度,改善微循环,利于保存液有效组分渗透。
昆布多糖是提炼于海带的一种多糖物质,Fehling试剂反应水解前呈阴性,加酸水解后呈阳性,说明其中存在还原糖。昆布多糖中的褐藻多糖硫酸酯一方面能抑制血小板聚集,防止血栓形成,提升微血管的通畅性,另一方面,褐藻多糖硫酸酯能明显抑制细胞过氧化,对双磷脂膜的稳定性具有非常好的维持作用。
还原型谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸组成的一种三肽,在细胞的正常运作和维持中具有非常重要的作用。还原型谷胱甘肽能和过氧化物及自由基相结合,对抗氧化剂对巯基的破坏,保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基的酶不被破坏。同时,还原型谷胱甘肽还参与了I-Kb/NF-KB信号通路的调节,抑制细胞的凋亡。
硫化氢是一种无色,易燃的酸性气体,能溶于水、醇类和油。近年来有研究发现,硫化氢在体内是一种气体介质,微量的硫化氢能作用于几乎所有器官系统,具有抗炎和抗凋亡的作用。本发明的保存液配方中加入少量硫化氢,其在缺血再灌注损伤中能够发挥很好的保护作用,能够显著延长器官生存期,减少组织细胞的凋亡。
本发明采用腺苷及L-精氨酸作为能量底物,一方面保证了细胞在冷缺血过程中糖酵解所需的能量,另一方面提供了NO合成的前体,起到抑制血小板聚集、防止中性粒细胞黏附、降低血管内皮细胞通透性和抑制炎性渗出的作用。
本断肢保存液应用乳糖醛酸作为主要非渗透性阴离子,其分子量较大,不能透过细胞膜,能减轻冷藏过程中细胞水肿。本断肢保存液应用甘露醇为渗透压调节剂,使断肢保存液的渗透压略高于细胞渗透压,抑制细胞和细胞外基质水肿。
本发明所用原料全部为国产的符合国家药典规范的药用成分,无配伍禁忌,所形成的断肢保存液为无色透明的液体,性质稳定,可高温高压消毒,可在常温或低温下贮存。
本发明经过保存液的五项要求进行配制,并以目前在医学界被广泛应用和认可的HC-A以及UW型保存液为参照,对比三者对离体断肢的保存效果,发现本发明的保存液相比HC-A液和UW液具有更优良的离体断肢保存效果。
本发明的目的之二是提供上述离体断肢保存液的制备方法,其包括以下步骤:
(1)按配方用量,向容器中预先加入双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉10、乳糖醛酸、七水硫酸镁、氢氧化钾、枸橼酸钠、磷酸氢二钠、甘露醇、别嘌呤醇、硫化氢,在室温下充分搅拌10min后逐滴加入枸橼酸,使溶液pH值达到预期的7.5-8.0,充分搅拌20-30min后加入医用活性炭,继续搅拌10min后进行滤膜脱碳;
(2)将配方用量的腺苷、L-精氨酸、还原型谷胱甘肽加入滤过液中,充分搅拌20min后,进行两次滤膜过滤,所得滤液即为离体断肢保存液。
进一步的,所述活性炭的加入量为4-6份。
进一步的,所述活性炭的加入量为5份。
进一步的,所述活性炭的直径为3μm。
进一步的,步骤(1)所述滤膜的目数为0.45μm。
进一步的,步骤(2)中所述两次过滤是先用0.45μm滤膜过滤,搅拌10min后再用0.22μm滤膜过滤。
本发明的有益效果如下:
(1)提供了一种适合离体断肢保存的器官保存液,能够用于临床上断肢再植手术对离断肢体器官保存的需求;
(2)本发明提供的离体断肢保存液相比HC-A液和UW液在保存离体断肢上具有更优良的保存效果。
附图说明
图1为离体断肢在三种保存液中保存48、60、72小时后的超微结构图;
图2为离体人骨骼肌在三种保存液中保存72小时后的超微结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行具体描述,有必要指出的是,以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明,并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
原料说明:
下述所有实施例中,氢氧化钾、枸橼酸钠、枸橼酸和磷酸氢二钠均购自上海百舜生物科技有限公司;七水硫酸镁购自上海宝达化工有限公司;腺苷、别嘌呤醇购自南京优纯生物科技有限公司;甘露醇购自上海博景化工有限公司;低分子羟乙基淀粉10购自上海翼菁实业有限公司;乳糖醛酸购自SIGMA-ALDRICH;还原型谷胱甘肽购自皓元医药集团;L-精氨酸购自上海凛恩科技发展有限公司;昆布多糖购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。
实施例1
一种离体断肢保存液,每1000ml保存液中含有组分如表1:
表1
其制备方法如下:
向1000ml容器中加入900ml双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉1050g、乳糖醛酸35g、七水硫酸镁1.25g、氢氧化钾6g、枸橼酸钠18g、磷酸氢二钠5g、甘露醇9g、别嘌呤醇0.115g、硫化氢4mg。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸,使溶液PH值达到7.5-7.6。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭,继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷2.25g、L-精氨酸2.5g、还原型谷胱甘肽2.5g加入滤过液中,在室温下充分搅拌20分钟,使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟,使用0.22微米滤膜过滤,滤液即为断肢保存液。
实施例2
一种离体断肢保存液配方,每1000ml含有组分如表2:
表2
其制备方法如下:
向1000ml容器中加入900ml双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉1049g、乳糖醛酸33g、七水硫酸镁1.2g、氢氧化钾6.5g、枸橼酸钠17g、磷酸氢二钠6g、甘露醇9g、别嘌呤醇0.12g、硫化氢4mg。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸,使溶液PH值达到7.6-7.7。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭,继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷2.5g、L-精氨酸3g、还原型谷胱甘肽3g加入滤过液中,在室温下充分搅拌20分钟,使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟,使用0.22微米滤膜过滤,滤液即为断肢保存液。
实施例3
一种离体断肢保存液配方,每1000ml含有组分如表3:
表3
成分 | 重量 |
低分子羟乙基淀粉10 | 47g |
腺苷 | 3g |
乳糖醛酸 | 32g |
七水硫酸镁 | 1.2g |
还原型谷胱甘肽 | 4g |
氢氧化钾 | 7g |
枸橼酸钠 | 17g |
磷酸氢二钠 | 6.5g |
甘露醇 | 9g |
L-精氨酸 | 3.5g |
昆布多糖 | 2.2g |
别嘌呤醇 | 0.13g |
硫化氢 | 4mg |
枸橼酸 | 适量 |
双蒸水 | 余量 |
其制备方法为:向1000ml容器中加入900ml双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉1047g、乳糖醛酸32g、七水硫酸镁1.2g、氢氧化钾7g、枸橼酸钠17g、磷酸氢二钠6.5g、甘露醇9g、别嘌呤醇0.13g、硫化氢4mg。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸,使溶液PH值达到7.7-7.8。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭,继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷3g、L-精氨酸3.5g、还原型谷胱甘肽4g加入滤过液中,在室温下充分搅拌20分钟,使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟,使用0.22微米滤膜过滤,滤液即为断肢保存液。
实施例4
一种离体断肢保存液配方,每1000ml含有组分如表4:
表4
成分 | 重量 |
低分子羟乙基淀粉10 | 46g |
腺苷 | 4g |
乳糖醛酸 | 30g |
七水硫酸镁 | 1g |
还原型谷胱甘肽 | 5g |
氢氧化钾 | 7.5g |
枸橼酸钠 | 17g |
磷酸氢二钠 | 7g |
甘露醇 | 8.5g |
L-精氨酸 | 4g |
昆布多糖 | 2.5g |
别嘌呤醇 | 0.15g |
硫化氢 | 4mg |
枸橼酸 | 适量 |
双蒸水 | 余量 |
制备方法:向1000ml容器中加入900ml双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉1045g、乳糖醛酸30g、七水硫酸镁1g、氢氧化钾7.5g、枸橼酸钠17g、磷酸氢二钠7g、甘露醇8.5g、别嘌呤醇0.15g、硫化氢4mg。在室温下充分搅拌10分钟后逐滴加入枸橼酸,使溶液PH值达到7.8-8.0。在室温下充分搅拌20-30分钟后加入直径约3微米的医用活性炭,继续搅拌10分钟后使用0.45微米滤膜脱碳。将配方用量的腺苷4g、L-精氨酸4g、还原型谷胱甘肽5g加入滤过液中,在室温下充分搅拌20分钟,使用0.45微米滤膜进行过滤后再搅拌10分钟,使用0.22微米滤膜过滤,滤液即为断肢保存液。
离体组织在冷缺血过程中的能量来源主要为无糖酵解,此过程非常依赖于能量底物的比例和保存液的酸碱性。因此,保存液中增加能量底物的比例和碱性物质能抵抗无糖酵解产生的组织酸化,维持细胞内外环境相对稳定,减轻对线粒体的损害,消除酸中毒对糖酵解关键酶1,6-二磷酸果糖激酶的抑制,增加ATP的合成。
对比例1
一种断肢保存液配方,其与实施例2的区别为:在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质,适用于需保存时间较例1更长的环境或设施。
对比例2
一种断肢保存液配方,其与实施例3的区别为:在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质,适用于需保存时间较例2更长的环境或设施。
对比例3
一种断肢保存液配方,其与实施例4的区别为:在维持渗透压基本不变的情况下增加少量能量底物和碱性物质,适用于需保存时间较例3更长的环境或设施。
实验例1
小鼠离体断肢低温保存期间的形态学改变
实验动物:健康成年实验用C57/B6小鼠,雌性,体重26-28g。
实验步骤:术前准备及麻醉:术前禁食6h,禁水10h。采用戊巴比妥2mg/kg麻醉后,采用脊椎脱臼法处死。等待半小时后,将小鼠下肢从根部离断,置入HC-A液、UW液或本断肢保存液中,放置于4℃冰箱中密封保存,在第48、60、72小时,获取下肢标本,固定后制作石蜡切片,进行HE、Masson、EvG染色。通过透射电镜进行超微结构观察,所得结果如图1。
实验结果:保存48小时,UW液及本断肢保存液保存的断肢:肌纤维稍水肿,肌纤维排列整齐,肌横纹清晰,毛细血管少量炎性细胞浸润,肌丝结构正常,排列规整。HC-A液保存的断肢:肌纤维间隙增宽,简直水肿明显,线粒体出现少许嵴性肿胀,肌丝排列尚规整。保存60小时,本断肢保存液保存的断肢:肌纤维稍水肿,排列整齐,肌横纹稍模糊,肌丝结构正常,排列规整,但肌原纤维带模糊。UW液保存的断肢:肌纤维水肿,排列不齐,肌横纹模糊,毛细血管中等量炎性细胞浸润,肌丝排列尚规整,线粒体少许嵴性肿胀。HC-A液保存的断肢:肌纤维水肿,排列稍紊乱,肌丝灶性溶解,Z线模糊,线粒体出现空泡样变。保存72小时,本断肢保存液保存的断肢:肌纤维稍水肿,排列不齐,肌横纹模糊,肌丝结构尚正常,排列稍紊乱,肌原纤维带模糊,部分线粒体肿胀。UW液保存的断肢:肌纤维水肿,排列不齐,肌横纹模糊,部分肌丝溶解,线粒体嵴性肿胀严重,大量线粒体空泡样变。HC-A液保存的断肢:横纹肌结构模糊,横纹消失,肌纤维水肿,排列紊乱,肌丝大量溶解,大量线粒体空泡样变性。
实验结论:实验例1结果显示,短期内本断肢保存液与UW液的保存效果相似,优于HC-A液。当保存时间大于60小时后,本保存液对于小鼠离体断肢的保存效果优于UW液,并优于HC-A液。
实验例2
人体骨骼肌低温保存期间的形态学改变
实验材料:征得上海长征医院伦理委员会批准,并经捐献者家属同意,在器官捐献过程中获取脑死亡供体腹外斜肌组织。
实验步骤:用组织剪完整获取供体腹外斜肌组织整块,将其修整至2×2×2cm三块,在室温中放置1小时后置入HC-A液、UW液或本断肢保存液中,放置于4℃冰箱中密封保存,在第72小时,获取下肢标本,固定后制作石蜡切片,进行HE染色,通过透射电镜进行超微结构观察,所得结果如图2。制备组织匀浆,检测丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO),所得结果如表5。
表5
组别 | MDA(mmol/L) | MPO(活力单位/克匀浆) |
正常组 | 2.57±0.19 | 0.57±0.04 |
HC-A液72小时 | 12.57±1.10 | 2.41±0.18 |
UW液72小时 | 10.42±0.77 | 2.01±0.12 |
本断肢保存液72小时 | 8.09±0.63 | 1.79±0.09 |
实验结果:本断肢保存液保存的断肢:肌纤维稍水肿,排列不齐,肌横纹模糊。UW液保存的断肢:肌纤维水肿,排列不齐,肌横纹消失。HC-A液保存的断肢:横纹肌结构模糊,横纹消失,肌纤维水肿,排列紊乱。
实验结论:实验例2结果显示,与小鼠离体断肢的保存结论相似,本断肢保存液对于离体人骨骼肌的保存效果优于UW液,优于HC-A液。
Claims (10)
1.一种离体断肢保存液,其特征在于,所述离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
2.根据权利要求1所述的离体断肢保存液,其特征在于,所述离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
3.根据权利要求1所述的离体断肢保存液,其特征在于,所述离体断肢保存液按重量份数计,每1000份含有:
所述离体断肢保存液的pH值为7.5-8.0。
4.根据权利要求1-3任一项所述的离体断肢保存液,其特征在于,所述低分子羟乙基淀粉10的分子量为10000~100000。
5.根据权利要求1-3任一项所述的离体断肢保存液的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)按配方用量,向容器中预先加入双蒸水,然后依次加入低分子羟乙基淀粉10、乳糖醛酸、七水硫酸镁、氢氧化钾、枸橼酸钠、磷酸氢二钠、甘露醇、别嘌呤醇、硫化氢,在室温下充分搅拌10min后逐滴加入枸橼酸,使溶液pH值达到7.5-8.0,充分搅拌20-30min后加入医用活性炭,继续搅拌10min后进行滤膜脱碳;
(2)将配方用量的腺苷、L-精氨酸、还原型谷胱甘肽加入滤过液中,充分搅拌20min后,进行两次滤膜过滤,所得滤液即为离体断肢保存液。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述活性炭的加入量为4-6份。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述活性炭的加入量为5份。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述活性炭的直径为3μm。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述滤膜的目数为0.45μm。
10.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述两次过滤是先用0.45μm滤膜过滤,搅拌10min后再用0.22μm滤膜过滤。
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