PT1276431E

PT1276431E - Método para a expansão de células estaminais epiteliais

Info

Publication number: PT1276431E
Application number: PT01927340T
Authority: PT
Inventors: Ray Jui-Fang Tsai
Original assignee: Ray Jui-Fang Tsai; Scheffer C G Tseng
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2006-11-30
Also published as: JP5612801B2; EP1276431A1; JP2003532466A; TW506827B; ES2266193T3; AU2001253802B2; EP1276431B1; AU5380201A; HK1056989A1; CN1296102C; DE60120676D1; CA2406282A1; DE60120676T2; ATE329632T1; CA2406282C; CN1426289A; EP1276431A4; WO2001080760A8; WO2001080760A1

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MÉTODO PARA A EXPANSÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS EPITELIAIS"

Campo do Invento

Este invento debruça-se sobre a deficiência de células estaminais epiteliais e de células estaminais do limbo e, mais especificamente, está relacionado com um método e enxerto para o tratamento deste problema de deficiência de células estaminais epiteliais recorrendo, por exemplo, à reconstrução da superfície da córnea.

Antecedentes Técnicos

No olho, a superfície ocular normal encontra-se coberta pelos epitélios da córnea, do limbo e da conjuntiva. Os seus diferentes fenotipos celulares, juntamente com uma película pré-ocular estável de fluido lacrimal, mantêm a integridade da superfície ocular. As lesões graves do epitélio do limbo causadas por queimaduras químicas ou térmicas, síndroma de Stevens-Johnson, penfigóide cicatricial ocular, múltiplas cirurgias e crioterapias na região do limbo, uso de lentes de contacto ou infecção microbiana grave poderão conduzir à deficiência das células estaminais epiteliais do limbo. A deficiência das células estaminais epiteliais do limbo manifesta-se geralmente através de conjuntivalização, vascularização, inflamação crónica e crescimento de tecido fibroso sobre a superfície da córnea com opacificação da córnea. 1

Quando a deficiência a nível do limbo é unilateral ou bilateral com envolvimento assimétrico, é sugerida a execução de um transplante autólogo de tecido do limbo. Um dos principais inconvenientes do transplante autólogo de tecido do limbo é o de ser necessário remover do olho dador saudável um ou dois enxertos de tecido correspondendo a uma área de entre duas a três horas retirada do limbo. Existe uma referência na literatura a potenciais complicações em que incorrem os olhos dadores em resultado deste procedimento. As experiências com coelhos demonstraram igualmente que poderá ocorrer deficiência do limbo se o epitélio central da córnea for subsequentemente removido dos olhos dadores já submetidos a remoção de tecido límbico. Pellegrini et al., Lancet 1997; 349:990-993, descreve o transplante de películas de células epiteliais da córnea expandidas sobre uma camada alimentadora de fibroblastos 3T3, tendo por objectivo a reconstrução da superfície da córnea em dois pacientes sofrendo de deficiência total das células do limbo.

Recentemente, Kim e Tseng, Córnea 1995; 15:473-84, demonstraram que o transplante de membrana amniótica, funcionando como substituição de substrato, exibia eficácia na reconstrução da superfície da córnea em coelhos com deficiência total das células estaminais epiteliais do limbo.

Schwab et al. (Annual Meeting of the Association for Research in Vision and Ophthalmology, vol. 40(4), 9-14 Maio 1999, pág. 5578) descreve um enxerto composto de epitélio da córnea consistindo em membrana amniótica e células estaminais de epitélio da córnea. As células estaminais são expandidas in vitro e plaqueadas sobre uma membrana amniótica isenta de células epiteliais.

Schwab I.R. (Transactions of the American Ophthalmological Society, vol. 97, 1999, p891-986) descreve igualmente a expansão in vitro de células estaminais do epitélio da córnea 2 e a sua aplicação a uma membrana amniótica desnudada (i.e., em que o epitélio amniótico foi removido) para formar um enxerto composto.

Resumo do Invento

Em um dos exemplos deste invento, células estaminais do limbo e células epiteliais provenientes de uma pequena biópsia de limbo, retiradas de um olho saudável, são colocadas em cultura e expandidas numa membrana amniótica especialmente tratada. O uso desta membrana amniótica como substrato ajuda a restaurar um estroma límbico não inflamado e a expandir as populações de células estaminais límbicas e epiteliais. O "produto" resultante pode ser transplantado, sob a forma de enxerto, para uma superfície desnudada de córnea, no seguimento de uma heretectomia superficial para remoção de um crescimento fibrovascular. Para outras áreas corporais afectadas que não o olho, é efectuada uma biópsia de células epiteliais saudáveis de uma área de tecido adjacente possuindo características biológicas/histológicas idênticas ou similares, i.e., histocompatíveis com a área afectada.

Descrição de uma Forma de Realização Preferida É efectuada uma biópsia de limbo de um olho saudável, o qual poderá corresponder ao outro olho do paciente ou ao olho de um outro indivíduo vivo. A pálpebra é esterilizada com Betadine® (iodopovidona). Sob condições de esterilidade, 1 a 2 mm2 do tecido de limbo, contendo células epiteliais e parte do tecido do estroma da córnea, é separado da margem do limbo e removido do estroma superficial da córnea através de uma queratectomia lamelar, usando uma lâmina Beaver® N° 66 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). O tecido é colocado numa placa de 35 mm contendo 1,5 ml de meio de cultura, com a seguinte composição por ml: DMEM (meio de Eagle modificado da Dulbecco) 3 e F12 de Ham (na razão de 1:1), suplementado com DMSO (dimetilsulfóxido) a 0,5%, 2 ug de EGF (factor de crescimento da epiderme) de ratinho, 1 ug de insulina bovina, 0,1 ug de toxina da cólera e 5% de soro fetal de bovino; a placa é então imediatamente enviada ao laboratório para cultura numa câmara de fluxo laminar estéril. É utilizada uma membrana amniótica (obtida a partir da empresa Bio Tissue, Miami, FI) como sistema de cultura, sendo a sua obtenção, processamento e preservação efectuados tal como descrito em Tseng SCG em Am. J. Ophthalmol 1997; 124:765-774, e na patente dos EUA 6.452.142, de Tseng. A membrana amniótica, com a face da membrana basal virada para cima, é colocada e alisada sobre uma placa de cultura, a qual é colocada durante 12 h a 37°C sob uma atmosfera de 5% de C02 e 95% de ar, num incubador humidificado. A cultura do explante de limbo é efectuada tal como anteriormente descrito (Tsai e Tseng, Invest Ophthalmol Vis Sei 1988; 29:97-108; e Tsai et al., Invest Ophthalmol Vis Sei 1994; 35:3865-2875), com algumas modificações. Em lugar de ser transferido para um substrato de plástico, tal como explicitam estas referências, o explante de limbo com as células estaminais epiteliais é colocado/transferido para a face de membrana basal da membrana amniótica numa placa de 35 mm contendo 1 ml do meio de cultura acima descrito. O meio é substituído de 2 em 2 dias e a cultura é mantida durante 2 a 3 semanas, tempo após o qual as células estaminais epiteliais se terão desenvolvido e espalhado para formar uma camada celular que cobre uma área de cerca de 2 a 3 cm de diâmetro, destinada à de reconstrução da superfície da córnea. Para a reparação de outros tecidos poderá utilizar-se uma área maior ou menor da camada de células estaminais epiteliais, consoante a necessidade.

Prosseguindo com o exemplo da reparação de córnea, após uma periotomia do limbo, a cicatriz subconjuntival perilímbica 4 e os tecidos inflamados são removidos até à camada de esclerótica. O tecido fibrovascular da córnea é removido por queratectomia lamelar, usando lâminas Beaver Nos. 57 e 66, de uma forma semelhante â descrita para o transplante de um aloenxerto de limbo (Tsai e Tseng, Cornea 1994; 13:389-400).

Nos pacientes com lesão parcial a total do limbo da córnea, mas com uma córnea central normal, o conjunto das células estaminais do epitélio do limbo cultivadas com a membrana amniótica é usado como enxerto sectorial de limbo e córnea, ou como um equivalente de limbo, dimensionado de acordo com o tamanho do olho receptor, e transplantado para a área límbica correspondente no receptor (de entre 90° a 360°). Nos pacientes com lesão total da superfície do limbo e da córnea, o novo enxerto é usado como uma lamela completa de tecido da córnea, ou como um equivalente de limbo e córnea, e é transplantado através de uma queratoplastia lamelar de modo a cobrir toda a área lesada.

Uma película de tamanho adequado das células estaminais epiteliais cultivadas sobre o substrato de membrana amniótica tratada é aplicada de modo a cobrir a totalidade do defeito, ficando a face epitelial virada para cima, o que pode ser facilmente identificado por uma coloração fluorescente ou pela presença do explante original frouxamente ligado. O enxerto é então preso ao local lesado. Numa córnea danificada, tal pode ser efectuado usando suturas interrompidas de nylon 10-0 do lado da córnea, e suturas interrompidas de Vicryl® 8-0 no bordo conjuntival circundante com ancoramento epiesclerótico. Durante todo o procedimento, a camada cultivada de células estaminais epiteliais é protegida da exposição, desidratação e abrasão usando um revestimento de sal de sódio do ácido hialurónico (hialuronato) Healon® (Pharmacia & Upjohn AB, Uppsala, Suécia). 0 tecido original de explante poderá ser removido da membrana amniótica no final da cirurgia. Se este 5 enxerto for realizado sobre a córnea, o olho é protegido por um penso de pressão durante uma noite, é colocada uma lente de contacto terapêutica no dia seguinte, durante uma semana, e é administrada uma solução tópica de acetato de prednisolona a 1% quatro vezes por dia durante a primeira semana e duas vezes por dia durante as duas semanas seguintes, seguindo-se uma solução de fluorometolona a 0,1% duas vezes por dia durante 2 a 3 meses, dependendo da gravidade da inflamação da conjuntiva à volta da área intervencionada.

Tal como acima se referiu, o explante é cultivado sobre a face demembrana basal da membrana amniótica especialmente tratada. Após 2 a 3 semanas, as células estaminais epiteliais crescem formando uma película de aproximadamente 2 a 3 cm2 de dimensão sobre a membrana amniótica. Uma preparação em lâmina mostra que a camada de células estaminais epiteliais é negativa para as colorações de PAS e de azul Alcian, e que a membrana amniótica desnudada cora de púrpura. Os exames histológicos mostram que a película epitelial é composta por 4 a 5 camadas de células estaminais na margem da película e por 1 a 4 camadas de células na área localizada entre a margem e o tecido do explante original. Os exames ultraestruturais revelam a presença de grandes e laxos espaços intercelulares e de uma estrutura laxa da membrana basal, verificando-se uma condensação focal de substância de base densa aos electrões a nível da junção entre as células basais e a membrana amniótica.

Relativamente a uma forma de realização do invento que é específica para o tratamento de olhos, um período médio (+SD) de seguimento de 14,8 ± 1,9 meses permite verificar diversos graus de melhoria visual com base na escala de acuidade visual de Snellen. Todos os olhos apresentaram uma re-epitelização completa em 2 a 4 dias, num período médio (±SD) de 2,7 + 0,8 dias. As superfícies da córnea reconstruídas exibem uma 6 redução da inflamação e a regressão da vascularização no espaço de 1 a 2 semanas. Um mês após a operação, a claridade da córnea é melhorada e a superfície encontra-se lisa e molhável.

Dependendo da área de limbo e córnea que se encontra danificada, as células estaminais epiteliais cultivadas, expandidas sobre um substrato de membrana amniótica especialmente preparado, poderão ser usadas como um equivalente de limbo ou como um equivalente de limbo-córnea.

Foi observada em coelhos a ocorrência de deficiência de células do limbo no olho dador, devida à remoção de uma porção relativamente grande de limbo para transplante. Assim, o novo método e enxerto resultantes deste invento reduzem substancialmente as potenciais complicações a nível do olho dador, uma vez que é removida apenas uma pequena porção do limbo. Adicionalmente, este método poderá ser aplicado igualmente a olhos com deficiência bilateral do limbo com envolvimento assimétrico. A expansão ex vivo das células estaminais epiteliais autólogas sobre uma membrana amniótica especialmente tratada fornece células estaminais epiteliais suficientes para transplante em 2 a 3 semanas. Em pacientes com deficiência bilateral total do limbo, deverá considerar-se a possibilidade de usar células de limbo de fontes compatíveis: um outro indivíduo vivo ligado por laços de parentesco ao paciente. O uso, para fins de transplante, de células estaminais epiteliais autólogas baseadas em membrana amniótica especialmente tratada proporciona igualmente todos os efeitos benéficos inerentes ao transplante de membranas amnióticas, incluindo a facilitação da epitelização, a redução da inflamação e da formação de tecido cicatricial, e a substituição do substrato quando o estroma subjacente se encontra destruído. Fundamentalmente, a membrana amniótica 7 pré-tratada de acordo com Tseng fornece um substrato natural para a preservação e expansão de células estaminais epiteliais, formando-se a massa celular autóloga necessária para a reconstrução da córnea. Adicionalmente, uma vez que apenas as células autólogas são transplantadas, não é necessário recorrer à imunosupressão após o transplante. Para as células estaminais alogeneicas transplantadas desta forma, a taxa de rejeição poderá ser reduzida, uma vez que apenas são transplantadas células estaminais epiteliais e não outros tipos celulares.

Tal como acima se referiu, este enxerto único e o método da sua formação, que recorre ao uso de uma membrana amniótica especialmente tratada sobre a qual são expandidas células estaminais epiteliais de um explante, permitem outras utilizações para além da cirurgia oftálmica, por exemplo, a reparação de áreas de pele queimada; especialmente quando o local dador do explante é necessariamente pequeno. Do mesmo modo, a biópsia a partir da qual é obtido o pequeno explante não precisará de corresponder a tecido do limbo. 0 explante terá de ser formado por tecido saudável, conter células estaminais epiteliais e ser histocompatível com o local receptor do enxerto. Se a biópsia não puder pertencer à mesma parte do organismo a que pertence o local receptor, poderá escolher-se uma parte do organismo semelhante para fornecer o explante; tal como no exemplo preferido em que um olho lesado corresponde ao local receptor e o outro olho - o olho saudável - fornece o explante dador.

Acredita-se que o enxerto cirúrgico, e o método para a sua criação, característicos deste invento foram apresentados de modo suficiente para que os peritos na técnica possam colocar o invento em prática sem necessidade de recorrer a um volume significativo de experimentação. 8

Lisboa, 13 de Setembro de 2006 9

Claims

REIVINDICAÇÕES 1- Um enxerto cirúrgico a ser aplicado a um local receptor, caracterizado pelo dito enxerto compreender: - uma membrana amniótica compreendendo células amnióticas e uma matriz extracelular possuindo integridade; e células estaminais epiteliais expandidas sobre a dita membrana amniótica.
2- Um enxerto cirúrgico, de acordo com a Reivindicação N°.l, em que a dita membrana amniótica possui uma face de membrana basal; caracterizado por as ditas células estaminais epiteliais serem expandidas sobre a dita face de membrana basal.
3- Um enxerto cirúrgico, de acordo com as Reivindicações N°.1 ou N°.2, caracterizado por, um tecido de limbo, proveniente de uma biópsia de limbo realizada num olho saudável, constituir a fonte das ditas células estaminais epiteliais.
4- Um enxerto cirúrgico, de acordo com a Reivindicação N °.1, em que, a dita membrana amniótica possuir uma face de membrana basal; caracterizado por: as ditas células estaminais epiteliais provirem de num tecido tratado num meio de cultura e serem então transferidas para a dita membrana amniótica; e as ditas células estaminais epiteliais serem cultivadas ex vivo sobre a dita face de membrana basal da dita membrana amniótica.
5- Um enxerto cirúrgico, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por, 1 a fonte das ditas células estaminais epiteliais ser o tecido de uma biópsia retirada de um local saudável correspondendo biologicamente ao local receptor e sendo histocompatível com este.
6- Um método para a criação de um enxerto cirúrgico destinado a um local receptor lesado, sendo o dito método caracterizado por compreender os passos de: a) colocar, sob a forma de explante, uma biópsia sobre uma membrana amniótica; compreendendo a dita membrana amniótica células amnióticas e uma matriz extracelular possuindo integridade e contendo a dita biópsia células estaminais epiteliais; e b) permitir que as ditas células estaminais epiteliais se expandam sobre a dita membrana amniótica.
7- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.6, possuindo a dita membrana amniótica uma face de membrana basal; caracterizado por o dito passo de colocação incluir a montagem do dito explante sobre a dita face de membrana basal.
8- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.7, caracterizado por a dita montagem resultar em que as ditas células estaminais epiteliais expandidas se posicionem de face para cima relativamente ao local receptor danificado.
9- Um método, de acordo com as Reivindicações N°.6 a N° .8, caracterizado por o dito passo de permitir a expansão incluir: a cultura do dito explante num meio de cultura, antes do dito passo de colocação.
10- Um método, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.6 a N°.9, caracterizado por o dito passo de permitir a expansão se caracterizar por: 2 cultura da dita membrana amniótica, com o seu explante, por uma duração suficiente para que as ditas células estaminais epiteliais se expandam até abranger uma área de cerca de 2 a 3 cm de diâmetro.
11- Um método, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.6 a N°.10, caracterizado por: remover o dito explante da dita membrana amniótica após fixar cirurgicamente o dito enxerto ao local receptor. Lisboa, 13 de Setembro de 2006 3