WO2020217575A1 - 水素含有臓器保存液の生成方法及び水素含有臓器保存液 - Google Patents

水素含有臓器保存液の生成方法及び水素含有臓器保存液 Download PDF

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organ preservation
organ
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英司 小林
元昭 佐野
総 橋本
勝春 飯沼
西　善一
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学校法人慶應義塾
株式会社ドクターズ・マン
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a hydrogen-containing organ preservation solution obtained by dissolving hydrogen gas and the hydrogen-containing organ preservation solution.
  • Non-Patent Document 1 a mechanism that is effective in preventing ischemia-reperfusion injury has been clarified (for example, Non-Patent Document 1), and the effectiveness of hydrogen gas has been reported by various organ transplantation models using small animals (for example). , Non-Patent Documents 2-4).
  • these relate to organ transplantation models of small animals such as mice, and do not use pig models.
  • there are papers that have verified the effectiveness of hydrogen gas with preclinical models such as the pig model for example, Non-Patent Documents 5 to 9), but these are few and do not suggest a certain view. Absent.
  • an object of the present invention is to generate a hydrogen-containing organ preservation solution quickly, easily, and safely at a site where an organ for transplantation is handled. It is an object of the present invention to provide a method for producing a hydrogen-containing organ preservation solution and a hydrogen-containing organ preservation solution.
  • a method for producing a hydrogen-containing organ preservation solution is to press hydrogen gas into a flexible container containing an organ preservation solution from a hydrogen storage alloy canister at a site where an organ for transplantation is handled. By vibrating the flexible container to dissolve hydrogen gas in the organ preservation solution and opening the flexible container to the outside air to reduce the internal pressure, dissolved hydrogen at a predetermined concentration or higher in the flexible container. To produce a hydrogen-containing organ preservation solution that contains and is used to flush and / or preserve the organ for transplantation.
  • hydrogen gas from a hydrogen storage alloy canister is used, the hydrogen gas is press-fitted into the flexible container, and the flexible container is vibrated to cause hydrogen.
  • the gas is dissolved in the organ preservation solution, and then the flexible container is opened to the outside air to reduce the internal pressure. Since a hydrogen storage alloy canister is used as the hydrogen gas generation source, the hydrogen gas generation source can be easily and safely brought to the medical site, and hydrogen gas is quickly press-fitted into the flexible container even in an emergency. be able to.
  • by vibrating the flexible container after the hydrogen gas is injected more hydrogen gas can be dissolved in the organ preservation solution, and the concentration of hydrogen gas nanobubbles contained in the organ preservation solution becomes higher. ..
  • the organ preservation solution in the flexible container can only be used for flushing and preserving the organ for transplantation. Instead, the concentration of hydrogen gas nanobubbles contained in the organ preservation solution can be increased. The hydrogen gas nanobubbles greatly contribute to the improvement of the flush-out effect of the organ for transplantation.
  • the predetermined pressure is in the range of 0.02 MPa to 0.07 MPa (gauge pressure).
  • the hydrogen-containing organ preservation solution is a liquid that contains dissolved hydrogen at a predetermined concentration or higher and is used for flushing and / or preserving the organ for transplantation.
  • This hydrogen-containing organ preservation solution is preferably a liquid used to wash away the excised organ for transplantation at the site of excision of the organ for transplantation.
  • this hydrogen-containing organ preservation liquid is an organ preservation liquid used for storing the excised organ for transplantation and transporting it to the transplantation site of the organ for transplantation.
  • This hydrogen-containing organ preservation solution is contained in a flexible container, and a part of the contained hydrogen-containing organ preservation solution is a liquid used to wash away the excised organ for transplantation, and is flexible. It is also preferred that the rest contained in the container is a liquid used to store the excised organ for transplantation.
  • the above-mentioned predetermined concentration is such that the dissolved hydrogen concentration after 4 hours becomes 1.0 mg / L or more.
  • the hydrogen gas generation source can be easily and safely brought into the medical field even in an emergency, and can be stored in the flexible container.
  • Hydrogen gas can be quickly press-fitted.
  • the organ preservation solution in the flexible container can only be used for flushing and preserving the organ for transplantation. Instead, the concentration of hydrogen gas nanobubbles contained in the organ preservation solution can be increased.
  • the hydrogen gas nanobubbles greatly contribute to the effect of flushing the organs for transplantation.
  • FIG. 5 is a perspective view schematically showing a configuration of a hydrogen-containing organ preservation solution generating device according to the embodiment of FIG. It is a graph which shows the initial and time transition of the dissolved hydrogen concentration of a hydrogen-containing organ preservation solution. It is a figure which shows the observation image of the Donar Cardiac Death (DCD) kidney which was washed away with the hydrogen gas-containing ETK solution and the hydrogen gas-free ETK solution. It is a figure which shows the observation image of the DCD kidney which was washed away and stored with the ETK solution containing no hydrogen gas.
  • DCD Donar Cardiac Death
  • FIG. 1 schematically shows a step of producing a hydrogen-containing organ preservation solution and a step of using the hydrogen-containing organ preservation solution as one embodiment of the present invention
  • FIG. 2 shows the production of the hydrogen-containing organ preservation solution in the present embodiment.
  • the configuration of the device is shown schematically.
  • a process of dissolving hydrogen gas in an organ preservation solution is instantaneously performed to obtain a predetermined dissolved hydrogen.
  • a hydrogen-containing organ preservation solution having a concentration is generated, and the excised organs are washed out (flashed out) and preserved using this hydrogen-containing organ preservation solution.
  • ETK ET-Kyoto
  • UW Universality of Wisconsin
  • HTK Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate
  • a plastic soft bag 10 (flexible container made of a film such as polyethylene, polypropylene, or polyvinyl chloride) containing an ETK liquid 10a is prepared, and hydrogen is added to the plastic soft bag 10.
  • the storage alloy canister 21 is connected (step S1 in FIG. 1). Specifically, as shown in FIG. 2, the tube 13, the one-touch coupler 14 (socket 14a, and the socket 14a) connected to the bottle needle 12 are formed by penetrating the bottle needle 12 through the rubber stopper 11 of the plastic soft bag 10.
  • the hydrogen storage alloy canister 21 is connected to the plastic soft bag 10 via the plug 14b), the tube 15, the joint 16, the tube 18, the one-touch coupler 19 (socket 19a and the plug 19b), and the tube 20.
  • hydrogen gas from the hydrogen storage alloy canister 21 is plastic through a supply path consisting of a tube 20, a one-touch coupler 19, a tube 18, a fitting 16, a tube 15, a one-touch coupler 14, a tube 13, and a bottle needle 12. It is press-fitted into the soft bag 10 (step S2 in FIG. 1).
  • the internal pressure in the flow path that is, the pressure in the plastic soft bag 10 is a predetermined pressure in the range of, for example, 0.02 MPa to 0.07 MPa (gauge pressure). Is maintained at.
  • the hydrogen storage alloy canister 21 is a bomb-shaped container containing a hydrogen storage alloy that can reversibly absorb and release hydrogen at room temperature and low pressure by an exothermic reaction and an endothermic reaction, and is generally commercially available. (For example, manufactured by Japan Steel Works, Ltd. (JSW)).
  • This hydrogen storage alloy canister 21 does not correspond to the high pressure gas referred to in the High Pressure Gas Safety Act because the internal pressure does not exceed 1 MPa. Therefore, it can be easily used at an organ removal site such as a hospital. Further, the size of the container can be designed as small as several cm in diameter and about 10 cm in height. Further, since the hydrogen storage alloy can be used by reabsorption even after hydrogen is consumed, there is an advantage of cost reduction due to repeated use. As described above, according to the hydrogen storage alloy canister 21, it is possible to safely supply high-purity hydrogen gas while being lightweight and compact.
  • the one-touch coupler 14 is disconnected, and the plastic soft bag 10 is separated from the hydrogen storage alloy canister 21. Even in the disconnected state, the shutoff valve (valve) provided in the plug 14b of the one-touch coupler 14 is closed, so that hydrogen gas does not leak from the plastic soft bag 10 and is similarly provided in the plug 14a. Since the shutoff valve (valve) is closed, hydrogen gas is not released to the atmosphere from the hydrogen storage alloy canister 21.
  • Step S3 in FIG. 1 The vibration time is preferably 30 seconds or more.
  • the plastic soft bag 10 is opened to the atmosphere (step S4 in FIG. 1). This opening is performed, for example, by connecting a socket (not shown) without a shutoff valve to the plug 14b.
  • a hydrogen-containing ETK solution containing hydrogen having a desired dissolved hydrogen concentration is produced in the plastic soft bag 10 in a very short time at the organ removal site.
  • a tubular expansion suppressing member may be provided on the outer circumference thereof.
  • the removed organ is washed out (flashed out) with the hydrogen-containing ETK solution thus generated (step S5 in FIG. 1). This washing is performed with a part of the hydrogen-containing ETK solution in the plastic soft bag 10.
  • the rubber stopper side of the plastic soft bag 10 containing the remaining hydrogen-containing ETK liquid facing up the upper part of the plastic soft bag is cut and opened with scissors, and the inside of the plastic soft bag containing the remaining hydrogen-containing ETK liquid is opened.
  • the washed-out excised organ is stored in the remaining hydrogen-containing ETK solution and transported to the transplant site (step S6 in FIG. 1).
  • the excised organ is taken out from the hydrogen-containing ETK solution and transplanted (step S7 in FIG. 1).
  • the hydrogen gas from the hydrogen storage alloy canister 21 in which hydrogen is stored in the storage alloy is dissolved in the ETK liquid, so that it can be safely used anywhere. Since the hydrogen gas supply source can be easily transported and the hydrogen storage alloy canister 21 can be easily connected to the plastic soft bag 10, the plastic soft bag 10 can be easily and quickly used at the site of organ removal in an emergency. Hydrogen gas can be press-fitted inside. Further, by vibrating the plastic soft bag 10 after the hydrogen gas is press-fitted, more hydrogen gas can be dissolved in the ETK liquid, and the nanobubbles of the hydrogen gas contained in the ETK liquid have a higher concentration.
  • the plastic soft bag 10 after that, by opening the plastic soft bag 10 to the outside air to reduce the internal pressure, not only the ETK solution in the plastic soft bag 10 can be used for washing and storing the organ for transplantation.
  • the nanobubbles of hydrogen gas contained in the ETK liquid can be made to have a higher concentration.
  • the hydrogen gas nanobubbles greatly contribute to the improvement of the flushing effect of the organ for transplantation.
  • the pressure (gauge pressure) of the hydrogen gas supplied to the plastic soft bag 10 is a predetermined pressure in the range of 0.02 MPa to 0.07 MPa.
  • the following test was conducted to know the relationship between the hydrogen gas pressure in the plastic soft bag, which is a flexible container that expands and contracts, and the dissolved hydrogen concentration.
  • 1. Test method Put 1 L of medical liquid (for example, ETK liquid) in a plastic soft bag (made of a multi-layer film of polyethylene film and polypropylene film) with a total capacity of 1,850 mL (space volume: 150 mL), and apply hydrogen gas to the internal pressure (gauge). The pressure) was injected until it became 0.04 MPa, 0.05 MPa, and 0.06 MPa, and the dissolved hydrogen concentration of the solution was measured with a BIH-50D measuring instrument manufactured by Bionics Instruments Co., Ltd. 2. Test Results Table 1 below shows the test results.
  • the pressure of the injected hydrogen gas is 0.02 MPa or more in order to obtain a dissolved hydrogen concentration of about 1.7 mg / L.
  • 0.07 MPa is the maximum. Therefore, it is desirable that the pressure of the hydrogen gas supplied to the plastic soft bag is a predetermined pressure in the range of 0.02 MPa to 0.07 MPa.
  • the following tests were conducted to know the desired vibration time of a plastic soft bag, which is a flexible container that can be expanded and contracted.
  • 1. Test method Put 1 L of tap water in a plastic soft bag with a total volume of 1,550 mL, crush this plastic soft bag until the volume of the remaining air reaches 50 mL, and then apply hydrogen gas to the bag with 0 internal pressure (gauge pressure). It was injected until it reached 0.05 MPa and sealed. After that, the dissolved hydrogen in the content liquid of the one that was allowed to stand without shaking for 1 hour, the one that was shaken for 10 seconds and mixed, the one that was shaken for 30 seconds and mixed, the one that was shaken for 1 minute and mixed, and the one that was shaken for 2 minutes and mixed.
  • the concentration was measured with a BIH-50D measuring instrument manufactured by Bionics Instruments Co., Ltd.
  • the water temperature was 10 ° C. 2.
  • Test results The test results are as shown in Table 3.
  • the maximum amount of dissolution in hydrogen gas in a liquid is separately determined to be 2.40 mg / L, and the difference in efficiency of shaking time is calculated from this maximum amount of dissolution in the following table. It becomes like 4. From Table 4, it can be seen that a dissolution efficiency of 69.6% or more can be obtained by shaking for more than 30 seconds. Therefore, the plastic soft bag 10 can be vibrated (shaken) for 30 seconds or more. desirable.
  • the UW solution and the HTK solution contained high-concentration hydrogen under the same pressure. Further, all of the UW solution, the HTK solution, and the ETK solution showed extremely slow decay with time when stored at 1 ° C. under normal pressure. Within the range of 4 hours, a dissolved hydrogen concentration of 1 mg / L or more could be secured.
  • the effect of using the hydrogen-containing ETK solution produced by the method of this embodiment can be seen in the kidney transplant pig from a circulatory arrest donor. Considered with a model.
  • MMP used was developed as an experimental miniature pig and did not exceed 30 kg even with age. Specifically, females, 25-40 months old, and weighing 20-26 kg were used.
  • the hydrogen-containing ETK solution was filled with hydrogen gas by the above-mentioned method immediately before perfusion after cooling the ETK to 4 ° C.
  • the preservation solution is opened to the atmosphere on ice, and the hydrogen gas concentration in the hydrogen-containing ETK solution is changed over time by gas chromatography (using Trilyzer mBA-3000 manufactured by Taiyo Co., Ltd.). Was measured.
  • the donor was laparotomized by a midline incision in the upper abdomen under general anesthesia, and the left and right kidneys were freed. The chest was then opened, the thoracic aorta was blocked, and ischemia of all abdominal organs was induced. After creating a warm ischemic state for 30 minutes, the left and right kidneys were collectively taken out and used as donor kidneys. During that time, no anticoagulant such as heparin was added to the donor.
  • the removed kidney was immediately placed on the back table and divided into left and right kidneys, one of which was produced by the method of the present embodiment (hydrogen gas pressure 0.02 to 0.07 MPa, vibration time 30 seconds or more) (at a temperature of 4 ° C.).
  • a cold ETK solution containing hydrogen and the other cold ETK solution containing no hydrogen (at a temperature of 4 ° C.) produced without adding hydrogen gas were perfused with a 1 m natural drip drop for 5 minutes.
  • the rate at which the hydrogen-containing cold ETK solution and the hydrogen-free cold ETK solution were dropped was counted.
  • Table 6 shows the perfusion rate of the hydrogen-containing cold ETK solution and the hydrogen-free cold ETK solution by the number of counts per hour (minute).
  • FIG. 4 shows A as an isolated DCD kidney perfused with a hydrogen-containing cold ETK solution, and B as an isolated DCD kidney perfused with a hydrogen-free cold ETK solution.
  • the donor kidney As the donor kidney, a 30-minute circulatory arrest kidney was used as in the above case. The left and right separated kidneys were simply immersed and stored in a hydrogen-containing cold ETK solution and a normal hydrogen-free cold ETK solution, and stored for the time until put-in to the recipient (storage for 1 to 4 hours).
  • the hydrogen-containing cold ETK solution is produced by the production method of the present embodiment and has a dissolved hydrogen concentration of 1 mg / L or more.
  • the recipient was first laparotomized with a midline abdominal incision after general anesthesia to expose the recipient's area around the left renal artery and vein. After intravenous administration of 1 cc of heparin, the abdominal aorta around the renal vein was totally clamped.
  • the recipient's renal vein was squeezed and the recipient's left kidney was resected from the base of the renal artery in the form of a Karel patch.
  • the donor kidney stored here was put in, and the kidney veins of the Karel patch were anastomosed end-to-side with a series of 5-0 nylon.
  • the peripheral renal vein was clipped again to release the total blockage of the abdominal aorta.
  • the total blockage time of the abdominal aorta was set to 30 minutes.
  • the renal veins were continuously anastomosed with 6-0 nylon, and finally the ureter was sutured 6-0.
  • the transplanted kidney was fixed in a 10% neutral buffered formaldehyde solution and cut out in the longitudinal direction so as to include the papilla centering on the cortex. Embedding was performed according to a conventional method, thin-layer sections were prepared, stained with Hematoxylin Eosin (HE) and Elastica van Gieson (EVG), and pathologically verified. Transplanted kidneys were scored with reference to the Banff classification. The results are shown in Table 7.
  • FIG. 5 is an observation image of the DCD kidney in the hydrogen-free ETK solution group.
  • FIGS. (A) and (B) are subcapsular examples, and FIGS. (C) and (D) are examples near the skin boundary. Is shown. However, FIGS. (A) and (C) are low magnification (40 times) images, and FIGS. (B) and (D) are high magnification (400 times) images.
  • FIG. 5 (A) most of the observation area was a necrotic image, and panrenal cortex necrosis was diagnosed.
  • Fig. (B) some of them retained the cell nucleus of the capsule and the renal tubule immediately below, but these cytoplasms exhibited degeneration-necrosis.
  • FIGS. (C) and (D) a large number of lymphocytes, monocytes and neutrophils as infiltrated cell residues were mixed in the interstitium.
  • FIG. 6 is an observation image of the DCD kidney of the hydrogen-containing ETK solution group
  • FIGS. (A) and (B), (C) and (D), and (E) and (F) are three examples under the film. Are shown respectively.
  • the figures (A), (C) and (E) are low magnification (40 times) images
  • the figures (B), (D) and (F) are high magnification (400 times) images. is there.
  • FIGS. 6 (A) and 6 (B) dilation of renal tubules and cell infiltration were observed at the low magnification shown in FIG. 6 (A).
  • FIG. 3B infiltration of mononucleosis and the like and blockage of the snare were observed in the glomerulus.
  • tubular inflammation due to infiltration of a large number of mononuclear cells and lymphocytes was observed in the interstitium of the renal tubules.
  • FIGS. 6 (C) and 6 (D) bleeding and dilation of renal tubules were observed at the low magnification shown in FIG. 6 (C).
  • FIG. 6 (C) bleeding and dilation of renal tubules were observed at the low magnification shown in FIG. 6 (C).
  • Kidney transplantation was performed in the same manner as the above-mentioned kidney transplantation. However, as the donor kidney, a 20-minute circulatory arrest kidney was used. The kidneys were rinsed with a hydrogen-free cold ETK solution and a hydrogen-containing cold ETK solution, respectively, and then simply immersed and stored in the hydrogen-free cold ETK solution and the hydrogen-containing cold ETK solution, respectively. Kidneys stored in cold hydrogen-free ETK solution for 1 hour (without hydrogen), kidneys stored in cold hydrogen-containing ETK solution for 1 hour (1h with hydrogen), and kidneys stored in cold hydrogen-containing ETK solution for 4 hours (with hydrogen) 4h) was put into each recipient.
  • the hydrogen-containing cold ETK solution is produced by the production method of the present invention and has a dissolved hydrogen concentration of 1 mg / L or more.
  • An immunosuppressive drug was administered postoperatively.
  • the immunosuppressive drug and its dosage and administration were as follows.
  • Tacrolimus (Prograf) 0.15 to 0.30 mg / kg, oral administration, every 12 hours, twice daily
  • mycophenolate mofetil 500 mg / head
  • prednisolone 0.5 to 2 mg / kg, intravenous or oral administration, twice daily. After that, he was free to drink and eat.
  • BUN and Cre of peripheral blood before, immediately after, and 1 to 14 days after surgery were measured by the GLDH method and the enzymatic method, respectively. The results are shown in Tables 8 and 7 and Tables 9 and 8.
  • the existing organ preservation solution was filled with hydrogen gas, and the initial dissolved hydrogen gas concentration and its change with time were measured. It was found that the organ preservation solution is extremely easy to contain hydrogen at low temperature and can maintain hydrogen gas for a long time.
  • the flush-out effect in DCD kidney was verified using ETK solution, which is an extracellular fluid type organ preservation solution. It was found that the ETK solution is less viscous than the intracellular fluid type UW solution, but is perfused at a higher flow rate from the initial perfusion than when it does not contain hydrogen gas. From the tissue analysis of the perfused region, the dilation of the capillary system such as glomeruli and the effect of flushing out microthrombus were inferred.
  • the effect of the hydrogen-containing organ preservation solution of the present invention is that by adding an intraoperative rinsing effect, intraoperative and postoperative immunosuppressive drug administration, and auxiliary cell therapy such as MSC, a kidney that has not been transplantable until now can be treated. There is an expectation that it will be portable.

Abstract

水素含有臓器保存液の生成方法は、移植用臓器を取り扱う現場において、水素吸蔵合金キャニスタから、臓器保存液を収容した可撓性容器内に水素ガスを圧入し、この可撓性容器を振動させて水素ガスを臓器保存液内に溶解させ、この可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、可撓性容器内に所定濃度以上の溶存水素を含有し、移植用臓器を洗い流し及び／又は保存するために使用する水素含有臓器保存液を生成する。

Description

水素含有臓器保存液の生成方法及び水素含有臓器保存液
　本発明は、水素ガスを溶解させてなる水素含有臓器保存液の生成方法及びこの水素含有臓器保存液に関する。
　水素ガスが種々の生体反応を引き起こすことは、近年、明らかにされてきている。特に虚血再灌流障害の防止に有効である機構が明らかにされており（例えば、非特許文献１）、小動物を用いた種々の臓器移植モデルによって水素ガスの有効性が報告されている（例えば、非特許文献２～４）。しかし、これらはネズミなどの小動物の臓器移植モデルに関するものであり、ブタモデルを用いたものではない。一方、水素ガスの有効性をブタモデル等の前臨床モデルで検証した論文は存在するが（例えば、非特許文献５～９）、これらは少数であり、しかも、一定の見解を示唆するものではない。
　また、これら非特許文献の開示内容を含む従来技術においては、水素ガスを、電気分解装置で発生させて供給するか又は水素ボンベから供給することが行われていた。
Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, Watanabe M, Nishimaki K, Yamagata K, Katsura K, Katayama Y, Asoh S, Ohta S, "Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals", Nat Med. 2007 Jun;13(6):688-94. Epub 2007 May 7 Abe T, Li XK, Yazawa K, Hatayama N, Xie L, Sato B, Kakuta Y, Tsutahara K, Okumi M, Tsuda H, Kaimori JY, Isaka Y, Natori M, Takahara S, Nonomura N, "Hydrogen-rich University of Wisconsin solution attenuates renal cold ischemia-reperfusion injury", Transplantation. 2012 Jul 15;94(1):14-21. doi: 10.1097/TP.0b013e318255f8be Lobb I, Jiang J, Lian D, Liu W, Haig A, Saha MN, Torregrossa R, Wood ME, Whiteman M, Sener A. "Hydrogen Sulfide Protects Renal Grafts Against Prolonged Cold Ischemia-Reperfusion Injury via Specific Mitochondrial Actions", Am J Transplant. 2017 Feb;17(2):341-352. doi: 10.1111/ajt.14080. Epub 2016 Nov 29. Tamaki I, Hata K, Okamura Y, Nigmet Y, Hirao H, Kubota T, Inamoto O, Kusakabe J, Goto T, Tajima T, Yoshikawa J, Tanaka H, Tsuruyama T, Tolba RH, Uemoto S, "Hydrogen Flush After Cold Storage as a New End-Ischemic Ex Vivo Treatment for Liver Grafts Against Ischemia/Reperfusion Injury", Liver Transpl. 2018 Nov;24(11):1589-1602. doi: 10.1002/lt.25326 Hosgood SA, Moore T, Qurashi M, Adams T, Nicholson ML, "Hydrogen Gas Does Not Ameliorate Renal Ischemia Reperfusion Injury in a Preclinical Model", Artif Organs. 2018 Jul;42(7):723-727. doi: 10.1111/aor.13118. Epub 2018 Apr 2. Sekijima M, Sahara H, Miki K, Villani V, Ariyoshi Y, Iwanaga T, Tomita Y, Yamada K, "Hydrogen sulfide prevents renal ischemia-reperfusion injury in CLAWN miniature swine", J Surg Res. 2017 Nov;219:165-172. doi: 10.1016/j.jss.2017.05.123. Epub 2017 Jun 28 Lee G, Hosgood SA, Patel MS, Nicholson ML, "Hydrogen sulphide as a novel therapy to ameliorate cyclosporine nephrotoxicity", J Surg Res. 2015 Aug;197(2):419-26. doi: 10.1016/j.jss.2015.02.061. Epub 2015 Mar 17. Haam S, Lee S, Paik HC, Park MS, Song JH, Lim BJ, Nakao A, "The effects of hydrogen gas inhalation during ex vivo lung perfusion on donor lungs obtained after cardiac death", Eur J Cardiothorac Surg. 2015 Oct;48(4):542-7. doi: 10.1093/ejcts/ezv057. Epub 2015 Mar 6 Matsuno N, Watanabe R, Kimura M, Iwata S, Fujiyama M, Kono S, Shigeta T, Enosawa S, "Beneficial effects of hydrogen gas on porcine liver reperfusion injury with use of total vascular exclusion and active venous bypass", Transplant Proc. 2014 May;46(4):1104-6. doi: 10.1016/j.transproceed.2013.11.134.
　臓器移植におけるドナーの医療現場において、従来技術のように、水素ガスを電気分解装置で発生させて供給すること、又は水素ボンベを現場に持ち込んでこのボンベから水素ガスを供給することは、その準備に多大の労力及び時間を要することのみならず、危険性を伴うことから、緊急性が要求される現場において、迅速に実施することは実質的に不可能であった。
　従って本発明は、従来技術のこのような問題点を解消するものであり、その目的は、移植用臓器を取り扱う現場において、素早く、簡便にかつ安全に水素含有臓器保存液を生成することができる水素含有臓器保存液の生成方法及び水素含有臓器保存液を提供することにある。
　本発明によれば、水素含有臓器保存液の生成方法は、移植用臓器を取り扱う現場において、水素吸蔵合金キャニスタから、臓器保存液を収容した可撓性容器内に水素ガスを圧入し、この可撓性容器を振動させて水素ガスを臓器保存液内に溶解させ、この可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、可撓性容器内に所定濃度以上の溶存水素を含有し、移植用臓器を洗い流し及び／又は保存するために使用する水素含有臓器保存液を生成する。
　このように、本発明によれば、医療現場において、水素吸蔵合金キャニスタからの水素ガスを使用し、この水素ガスを可撓性容器内に圧入し、この可撓性容器を振動させることによって水素ガスを臓器保存液内に溶解させ、その後、可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させている。水素ガス発生源として水素吸蔵合金キャニスタを用いているため、手軽にかつ安全に医療現場に水素ガス発生源を持ち込むことができ、緊急時においても、可撓性容器内に水素ガスを素早く圧入することができる。また、水素ガス圧入後に可撓性容器を振動させることにより、臓器保存液内により多くの水素ガスを溶解させることができると共に、臓器保存液内に含まれる水素ガスのナノバブルがより高い濃度となる。さらに、その後、可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、可撓性容器内の臓器保存液を移植用臓器の洗い流し及び保存に使用することが可能となるのみならず、臓器保存液内に含まれる水素ガスのナノバブルをより高い濃度とすることができる。この水素ガスのナノバブルは、移植用臓器の洗い流し（フラッシュアウト）効果向上に大きく寄与するものである。
　水素吸蔵合金キャニスタから可撓性容器に供給される水素ガスの圧力が所定圧力となるまで、水素ガスの供給を行うことも好ましい。
　この場合、所定圧力が、０．０２ＭＰａ～０．０７ＭＰａ（ゲージ圧）の範囲の圧力であることがより好ましい。
　可撓性容器の振動を、３０秒間以上行うことも好ましい。
　本発明によれば、さらに、水素含有臓器保存液は、所定濃度以上の溶存水素を含有し、移植用臓器を洗い流し及び／又は保存するために使用する液体である。
　この水素含有臓器保存液は、移植用臓器の摘出現場において、摘出した移植用臓器を洗い流しするために使用する液体であることが好ましい。
　この水素含有臓器保存液は、摘出した移植用臓器を保存し、移植用臓器の移植現場に搬送するために使用する臓器保存液体であることも好ましい。
　この水素含有臓器保存液は、可撓性容器内に収容されており、収容された水素含有臓器保存液の一部が摘出した移植用臓器を洗い流しするために使用する液体であり、可撓性容器内に収容された残りが摘出した移植用臓器を保存するために使用する液体であることも好ましい。
　上述の所定濃度が、４時間後の溶存水素濃度が１．０ｍｇ／Ｌ以上となる濃度であることも好ましい。
　本発明によれば、水素ガス発生源として水素吸蔵合金キャニスタを用いているため、手軽にかつ安全に医療現場に水素ガス発生源を持ち込むことができ、緊急時においても、可撓性容器内に水素ガスを素早く圧入することができる。また、水素ガス圧入後に可撓性容器を振動させることにより、臓器保存液内により多くの水素ガスを溶解させることができると共に、臓器保存液内に含まれる水素ガスのナノバブルがより高い濃度となる。さらに、その後、可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、可撓性容器内の臓器保存液を移植用臓器の洗い流し及び保存に使用することが可能となるのみならず、臓器保存液内に含まれる水素ガスのナノバブルをより高い濃度とすることができる。この水素ガスのナノバブルは、移植用臓器を洗い流し効果に大きく寄与するものである。
本発明の一実施形態として、水素含有臓器保存液の生成工程及び水素含有臓器保存液の使用工程を概略的に示すフロー図である。 図１の実施形態における水素含有臓器保存液の生成装置の構成を概略的に示す斜視図である。 水素含有臓器保存液の溶存水素濃度の初期及び時間的推移を示すグラフである。 水素ガス含有ＥＴＫ液及び水素ガス非含有ＥＴＫ液で洗い流したＤｏｎａｒ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｄｅａｔｈ　（ＤＣＤ）腎臓の観察画像を示す図である。 水素ガス非含有ＥＴＫ液で洗い流し及び保存したＤＣＤ腎臓の観察画像を示す図である。 水素ガス含有ＥＴＫ液で洗い流し及び保存したＤＣＤ腎臓の観察画像を示す図である。 術後慢性期の血中ＢＵＮの推移を示すグラフである。 術後慢性期の血中Ｃｒｅの推移を示すグラフである。
　図１は本発明の一実施形態として、水素含有臓器保存液の生成工程及び水素含有臓器保存液の使用工程を概略的に示しており、図２は本実施形態における水素含有臓器保存液の生成装置の構成を概略的に示している。
　本実施形態においては、腎臓などの移植用臓器を取り扱う現場、即ち、心停止したドナーから臓器を摘出する現場において、臓器保存液内に水素ガスを溶解させる処理を瞬時に行って、所定溶存水素濃度の水素含有臓器保存液を生成し、この水素含有臓器保存液を用いて摘出した臓器の洗い流し（フラッシュアウト）及び保存を行う。臓器保存液としては、以下の説明では、ＥＴＫ（ET-Kyoto）液を用いるが、ＵＷ（University of Wisconsin）液やＨＴＫ（Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate）液を用いても良いことはもちろんである。
　臓器摘出現場において、水素含有ＥＴＫ液を生成する工程を以下説明する。
　まず、図２に示すように、ＥＴＫ液１０ａが収容されたプラスチックソフトバッグ１０（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等フィルムで作られた可撓性容器）を用意し、このプラスチックソフトバッグ１０に水素吸蔵合金キャニスタ２１を接続する（図１のステップＳ１）。具体的には、図２に示すように、瓶針１２をこのプラスチックソフトバッグ１０のゴム栓１１に穿通させることにより、この瓶針１２に接続されているチューブ１３、ワンタッチカプラ１４（ソケット１４ａ及びプラグ１４ｂ）、チューブ１５、継手１６、チューブ１８、ワンタッチカプラ１９（ソケット１９ａ及びプラグ１９ｂ）、並びにチューブ２０を介して、水素吸蔵合金キャニスタ２１をプラスチックソフトバッグ１０に接続する。
　この接続により、水素吸蔵合金キャニスタ２１からの水素ガスが、チューブ２０、ワンタッチカプラ１９、チューブ１８、継手１６、チューブ１５、ワンタッチカプラ１４、チューブ１３、及び瓶針１２からなる供給路を介してプラスチックソフトバッグ１０内に圧入される（図１のステップＳ２）。
　継手１６の流路にリリーフ弁１７が接続されているため、流路内の内部圧力、即ちプラスチックソフトバッグ１０内の圧力は、例えば０．０２ＭＰａ～０．０７ＭＰａ（ゲージ圧）の範囲の所定圧力に維持される。
　なお、水素吸蔵合金キャニスタ２１は、発熱反応及び吸熱反応により常温、低圧下で可逆的に水素の吸放出が可能な水素吸蔵合金を内部に収容したボンベ状の容器であり、一般に市販されている（例えば株式会社日本製鋼所（ＪＳＷ）製）。この水素吸蔵合金キャニスタ２１は、内部圧力が、１ＭＰａ以上にならないため高圧ガス保安法でいう高圧ガスには該当しない。従って、病院等の臓器摘出現場で手軽に利用することができる。また、容器のサイズも直径数ｃｍ、高さ１０ｃｍ程度まで小さく設計することが可能である。さらに、水素吸蔵合金は、水素を消耗した後でも再吸収により利用可能となるため、繰返し利用によるコストダウンというメリットがある。このように、水素吸蔵合金キャニスタ２１によれば、軽量及びコンパクトでありながら安全に高純度の水素ガスを供給可能である。
　次いで、ワンタッチカプラ１４を接続解除状態とし、プラスチックソフトバッグ１０を水素吸蔵合金キャニスタ２１から切り離す。接続解除状態としても、ワンタッチカプラ１４のプラグ１４ｂ内に設けられた閉止弁（バルブ）が閉じられるため、プラスチックソフトバッグ１０から水素ガスが漏れ出すことはなく、同様にプラグ１４ａ内に設けられた閉止弁（バルブ）が閉じられるため、水素吸蔵合金キャニスタ２１から水素ガスが大気に放出されることはない。
　この状態でワンタッチカプラ１４のプラグ１４ｂ、チューブ１３、瓶針１２及びプラスチックソフトバッグ１０を、例えば手で持って、激しく振動させることによって、プラスチックソフトバッグ１０の液体１０ａ内に水素ガスをより多く溶解させる（図１のステップＳ３）。振動の時間は、３０秒以上であることが望ましい。
　次いで、プラスチックソフトバッグ１０を大気に開放する（図１のステップＳ４）。この開放は、例えばプラグ１４ｂに閉止弁を設けていないソケット（図示無し）を接続することによって行われる。
　以上の工程により、プラスチックソフトバッグ１０内には、所望の溶存水素濃度の水素が含有された水素含有ＥＴＫ液が、臓器摘出現場において、非常に短時間で生成されることとなる。プラスチックソフトバッグ１０の膨張を抑制するために、その外周に筒型の膨張抑止部材を設けても良い。
　その後、このように生成した水素含有ＥＴＫ液によって、摘出した臓器の洗い流し（フラッシュアウト）を行う（図１のステップＳ５）。この洗い流しは、プラスチックソフトバッグ１０内の水素含有ＥＴＫ液の一部で行う。
　次いで、残りの水素含有ＥＴＫ液が入ったプラスチックソフトバック１０のゴム栓側を上にして、プラスチックソフトバッグの上部をハサミで切断開封し、残りの水素含有ＥＴＫ液が入ったプラスチックソフトバッグ内の残りの水素含有ＥＴＫ液内に、洗い流しした摘出臓器を保存し、移植現場まで搬送する（図１のステップＳ６）。
　次いで、移植現場において、水素含有ＥＴＫ液から摘出臓器を取り出し、移植を行う（図１のステップＳ７）。
　以上説明したように、本実施形態によれば、吸蔵合金に水素を貯蔵した水素吸蔵合金キャニスタ２１からの水素ガスをＥＴＫ液内に溶解させるように構成しているので、どこへでも安全にかつ簡単に水素ガス供給源を搬送でき、しかも、水素吸蔵合金キャニスタ２１をプラスチックソフトバッグ１０に簡単に接続できるように構成されているので、緊急時の臓器摘出現場で簡単にかつ素早くプラスチックソフトバッグ１０内に水素ガスを圧入することができる。また、水素ガス圧入後にプラスチックソフトバッグ１０を振動させることにより、ＥＴＫ液内により多くの水素ガスを溶解させることができると共に、ＥＴＫ液内に含まれる水素ガスのナノバブルがより高い濃度となる。さらに、その後、プラスチックソフトバッグ１０を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、プラスチックソフトバッグ１０内のＥＴＫ液を移植用臓器の洗い流し及び保存に使用することが可能となるのみならず、ＥＴＫ液内に含まれる水素ガスのナノバブルをより高い濃度とすることができる。この水素ガスのナノバブルは、移植用臓器の洗い流し効果向上に大きく寄与するものである。
　次に、プラスチックソフトバッグ１０に供給される水素ガスの圧力（ゲージ圧）が、０．０２ＭＰａ～０．０７ＭＰａの範囲にある所定圧力であることが望ましい理由について説明する。
　膨張・収縮する可撓性容器であるプラスチックソフトバッグ内の水素ガス圧力と溶存水素濃度との関係を知るために下記の試験を行った。
１．試験方法
　全体容量が１，８５０ｍＬのプラスチックソフトバッグ（ポリエチレンフィルムとポリプロピレンフィルムの複層フィルム製）に１Ｌの医療用液体（例えばＥＴＫ液）を入れ（空間容積：１５０ｍＬ）、水素ガスを内圧（ゲージ圧）が０．０４ＭＰａ、０．０５ＭＰａ、０．０６ＭＰａとなるまで注入し、その溶液の溶存水素濃度をバイオニクス機器株式会社製のＢＩＨ－５０Ｄ計測器で計測した。
２．試験結果
　次の表１はこの試験結果を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　ヘンリーの法則によって計算した最大溶解量は、表２のようになる。
　　　　　　　全内容量　　　　　　　　：　　１，８５０　ｍＬ
　　　　　　　医療用液体量　　　　　　：　　１，０００　ｍＬ
　　　　　　　初期空気容量　　　　　　：　　　　１５０　ｍＬ
　　　　　　　注入ガス全体容量　　　　：　　　　８５０　ｍＬ
　　　　　　　液温　　　　　　　　　　：　　　　　１５　℃
　　　　　　　振る時間　　　　　　　　：　　　　　３０　秒間
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２に示すように、医療用液体（例えばＥＴＫ液）に水素ガスを溶解する場合、１．７ｍｇ／Ｌ程度の溶存水素濃度を得るためには、注入する水素ガスの圧力は０．０２ＭＰａ以上であることが望ましく、プラスチックソフトバッグの可撓性を低下させて耐圧性を向上させると設計した場合、例えば０．０７ＭＰａが最大である。従って、プラスチックソフトバッグに供給される水素ガスの圧力は、０．０２ＭＰａ～０．０７ＭＰａの範囲にある所定圧力であることが望ましい。
　次に、プラスチックソフトバッグの振動時間が３０秒以上であるのが望ましい理由について説明する。
　膨張・収縮が可能な可撓性容器であるプラスチックソフトバッグの望ましい振動時間を知るために下記の試験を行った。
１．試験方法
　全体容量が１，５５０ｍＬのプラスチックソフトバッグに１Ｌの水道水を入れ、残りの空気の容積が５０ｍＬとなるまでこのプラスチックソフトバッグを押しつぶした後に、水素ガスをバッグ内圧（ゲージ圧）が０．０５ＭＰａとなるまで注入し密閉した。その後、１時間振らずに静置したもの、１０秒間振って混合したもの、３０秒間振って混合したもの、１分間振って混合したもの、２分間振って混合したもの、の内容液の溶存水素濃度をバイオニクス機器株式会社製のＢＩＨ－５０Ｄ計測器で計測した。水温は１０℃であった。
２．試験結果
　試験結果は、表３のごときものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
ヘンリーの法則に従って演算すると、液体への水素ガスへの最大溶解量は２．４０ｍｇ／Ｌであることが別途求められ、この最大溶解量から、振った時間の効率差を求めると、次の表４のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
この表４より、３０秒より多くの時間振り混ぜることで６９．６％以上の溶解効率が得られることが分かり、従って、プラスチックソフトバック１０の振動（振り混ぜ）を、３０秒間以上行うことが望ましい。
　このように生成した水素含有ＥＴＫ液内の初期（バッグ解放時）の溶存水素濃度とその経時的変化について、検証した。
　まず、ＵＷ液、ＨＴＫ液、及びＥＴＫ液について、水素ガス溶解を行った。その条件は、以下の通りである。
　　　　　　　全内容量　　　　　　　　：　　１，８５０　ｍＬ
　　　　　　　内容液量　　　　　　　　：　　１，０００　ｍＬ
　　　　　　　初期空気容量　　　　　　：　　　　　５０　ｍＬ
　　　　　　　注入ガス全体容量　　　　：　　　　８５０　ｍＬ
　　　　　　　液　温　　　　　　　　　：　　　　　　１　℃
　　　　　　　充填水素ガス圧　　　　　：　　　０．０６　ＭＰａ
　　　　　　　振動時間　　　　　　　　：　　　　　　１　分間
計測は、低温であることよりガスクロマトグラフ法によって行った。ガスクロマトグラフはタイヨウ社トライライザーｍＢＡ－３０００を使用した。その後、この液のプラスチックソフトバッグを大気開放した際の溶存水素濃度と、冷却した状態での溶存水素濃度の経時変化とを測定した。その計測結果を表５及び図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
表５及び図３に示すように、同等の加圧下ではＵＷ液、ＨＴＫ液が高濃度水素を含有した。また、ＵＷ液、ＨＴＫ液、及びＥＴＫ液のいずれも常圧下、１℃保存で時間的な減衰は極めて緩徐であった。４時間の範囲であれば、１ｍｇ／Ｌ以上の溶存水素濃度は確保できた。
　臓器摘出現場において、本実施形態の方法（水素ガス圧力０．０２～０．０７ＭＰａ、振動時間３０秒以上）により生成した水素含有ＥＴＫ液を用いることによる効果を、循環停止ドナーからの腎移植ブタモデルで検討した。
　その結果、ＤＣＤ（ドナー心停止）３０分モデルにおいて、この水素含有ＥＴＫ液は、ＤＣＤ腎臓の血液の洗い流し効果が高かった。さらに、ＤＣＤ腎臓の移植後の短期間観察（術後５日まで）において、これまでの冷臓器保存液での保存では移植した臓器が機能しないＰｒｉｍａｒｙ　ｎｏｎ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＮＦ）となっていたが、この水素含有ＥＴＫ液による洗い流し及び保存により、尿排泄が観察された。従ってこの手法は、障害臓器を移植可能な臓器への蘇生させる新たな技術として、臨床現場で安全かつ簡便に使用可能であることが分かった。
　次に、本実施形態により生成した水素含有冷ＥＴＫ液をブタＤＣＤからの腎臓移植モデルにおいて、その有効性と安全性を試験した方法及びその結果を説明する。ここでは、より臨床を反映させるため、年齢がかさんでも大きくならないマイクロミニブタ（ＭＭＰ）を使用した。循環停止３０分の虚血状態の腎臓を作り、ドナー腎として摘出した後、水素含有ＥＴＫ液又は水素非含有ＥＴＫ液を使用して保存し、移植後急性期のレシピエントの腎機能を比較検討した。
（使用したマイクロミニブタ）
　使用したＭＭＰは、実験専用ミニブタとして開発され、年齢が行っても３０Ｋｇを超えないものとした。具体的には、雌、２５～４０か月齢、体重２０～２６Ｋｇのものを使用した。
（水素含有ＥＴＫ液の生成及び水素濃度の測定）
　水素含有ＥＴＫ液は、ＥＴＫを４℃に冷やした上で灌流直前に前述の手法で水素ガスの充填を行った。冷生理食塩水をコントロールとして、オンアイス上で保存液の大気開放を行い、経時的に水素含有ＥＴＫ液内の水素ガス濃度をガスクロマトグラフ法（株式会社タイヨウ製のトライライザーｍＢＡ－３０００使用）にて測定した。
（ＤＣＤ腎臓の洗い流し効果における水素含有の有効性の検証）
　ドナーについて、全身麻酔下、上腹部正中切開で開腹し、左右の腎臓のフリーイングを行った。その後、開胸し、胸部大動脈を遮断し、腹部全臓器の虚血を誘導した。３０分の温虚血状態を作った後、左右の腎臓を一括で取り出し、ドナー腎とした。その間、ドナーにはヘパリン等の抗凝固剤を加えなかった。摘出腎臓は直ちにバックテーブルに置いて、左右の腎臓に分け、一方を本実施形態の方法（水素ガス圧力０．０２～０．０７ＭＰａ、振動時間３０秒以上）により生成した（温度４℃の）水素含有冷ＥＴＫ液、他方を水素ガスを添加せずに生成した（温度４℃の）水素非含有冷ＥＴＫ液を用いて１ｍの自然点滴落下で５分間灌流した。その灌流の際に、これら水素含有冷ＥＴＫ液及び水素非含有冷ＥＴＫ液の滴下される速度をカウントした。表６は水素含有冷ＥＴＫ液及び水素非含有冷ＥＴＫ液の灌流速度を時間（分）当たりのカウント数で表している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
また、図４は、Ａは水素含有冷ＥＴＫ液を灌流した摘出ＤＣＤ腎臓、Ｂは水素非含有冷ＥＴＫ液を灌流した摘出ＤＣＤ腎臓をそれぞれ示している。
　表６から分かるように、摘出ＤＣＤ腎臓への水素含有冷ＥＴＫ液による灌流の場合は、灌流初期から水素非含有冷ＥＴＫ液の場合に比べ自然滴下による灌流速度が速かった。また、図４から分かるように、灌流終了時の灌流領域の肉眼所見では、水素含有冷ＥＴＫ液の方が水素非含有冷ＥＴＫ液に比して、より多量に灌流されていた。
（腎移植モデルにおける評価）
　ドナー腎臓としては、前述の場合と同様に、３０分の循環停止腎臓を用いた。左右に分離した腎臓を、水素含有冷ＥＴＫ液及び通常の水素非含有冷ＥＴＫ液で単純浸漬保存し、レシピエントへのプットインまでの時間、保存した（１～４時間保存）。水素含有冷ＥＴＫ液は、本実施形態の生成方法で生成したものであり、１ｍｇ／Ｌ以上の溶存水素濃度を有するものである。レシピエントは、まず、全身麻酔後腹部正中切開で開腹し、レシピエントの左腎動静脈周囲を露出した。ヘパリン１ｃｃを静脈内投与の後に、腎臓脈周囲の腹部大動脈をトータルクランプした。レシピエント腎静脈にブルドックカンシをかけ、レシピエントの左腎を腎動脈基部からカレルパッチ状に切除した。ここで保存しておいたドナー腎臓をプットインし、５－０ナイロンの連続にて、カレルパッチ部の腎臓脈を端側吻合した。動脈吻合後は、再度末梢腎臓脈にクリップをかけ直し、腹部大動脈の全遮断を解除した。腹部大動脈の全遮断時間は３０分と設定した。続いて腎静脈を、６－０ナイロンを用いて連続で端端吻合し、最後に尿管を６－０で結節縫合した。移植腎は、リフロー後に移植腎の血流を確認し、右腎臓を摘出の上、閉腹した。術後は当日の抗菌薬投与を行い、以後、飲水及び食事を自由にした。術後６日まで観察し、犠牲死の上、末梢血、膀胱内尿、さらに移植腎のサンプリングを行った。末梢血、尿中のＢＵＮ及びＣｒｅをそれぞれＧＬＤＨ法及び酵素法で測定した。また尿中のＴＰはピガロールレット法、電解質はイオン選択電極法、ＩＰは酵素法、ＧＬＵはＨＫ－Ｇ６ＰＤＨ法で測定した。移植腎は、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液に固定して、皮質を中心に乳頭部を含むように縦断方向に切り出した。常法に従って包埋し、薄層切片を作成し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ　Ｅｏｓｉｎ（Ｈ．Ｅ．）及びＥｌａｓｔｉｃａ　ｖａｎ　Ｇｉｅｓｏｎ（ＥＶＧ）染色し、病理学的に検証した。移植腎は、Ｂａｎｆｆ分類を参考にスコア化した。その結果が表７に示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　移植を受けたミニブタは全例観察期間（６病日）まで生存した。犠牲時、水素非含有ＥＴＫ液による群は、全例、膀胱内に尿が観察されず、移植腎の血流も認められなかった。これに対して、水素含有ＥＴＫ液による保存群は、保存時間４時間のものも、移植腎には血流があり、膀胱内に尿が認められた。また、表７から分かるように、回収された末梢血中のＢＵＮの平均値は、水素含有ＥＴＫ液群が１４３（ｍｇ／ｄＬ）、水素非含有ＥＴＫ液群が２７０（ｍｇ／ｄＬ）であり、Ｃｒｅの平均値は、水素含有ＥＴＫ液群が１５．５（ｍｇ／ｄＬ）、水素非含有ＥＴＫ液群が２４（ｍｇ／ｄＬ）であった。回収された水素群の尿解析では、急性糸球体障害を示していた。
　さらに病理学的解析を行うと、水素非含有ＥＴＫ液群によって保存された腎臓は、急性腎不全による腎皮質壊死が認められた。図５は水素非含有ＥＴＫ液群のＤＣＤ腎臓の観察画像であり、同図（Ａ）及び（Ｂ）は皮膜下の一例、同図（Ｃ）及び（Ｄ）は皮髄境界部付近の一例を示している。ただし、同図（Ａ）及び（Ｃ）は低倍率（４０倍）の画像であり、同図（Ｂ）及び（Ｄ）は高倍率（４００倍）の画像である。
　図５（Ａ）に示すように、観察領域のほとんどが壊死像となっており、汎腎皮質壊死と診断された。また、同図（Ｂ）に示すように、被膜と直下の尿細管の細胞核が保持されているものもあったが、これらの細胞質は変性―壊死を呈していた。さらに、同図（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、間質には浸潤した細胞残渣としてのリンパ球、単球細胞及び好中球が多数混在していた。
　これに対して、水素含有ＥＴＫ液群によって保存された腎臓は、急性組織障害があるものの血流は保たれていた。図６は水素含有ＥＴＫ液群のＤＣＤ腎臓の観察画像であり、同図（Ａ）及び（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）、並びに（Ｅ）及び（Ｆ）は皮膜下の３つの例をそれぞれ示している。ただし、同図（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は低倍率（４０倍）の画像であり、同図（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は高倍率（４００倍）の画像である。
　図６（Ａ）及び（Ｂ）の例では、同図（Ａ）に示す低倍率において、尿細管の拡張と細胞浸潤が認められた。同図（Ｂ）に示す高倍率において、糸球体に単核球等の浸潤と係蹄の閉塞がみられた。また、尿細管の間質に多数の単核細胞、リンパ球の浸潤による尿細管炎が認められた。図６（Ｃ）及び（Ｄ）の例では、同図（Ｃ）に示す低倍率において、出血、尿細管の拡張がみられた。同図（Ｄ）に示す高倍率では、同図（Ｂ）の例と比べ、尿細管間質の細胞浸潤が乏しかった。図６（Ｅ）及び（Ｆ）の例では、同図（Ｅ）に示す低倍率において、多くの尿細管は萎縮と拡張がみられ、尿細管の幾つかに硝子円柱がみられた。同図（Ｆ）に示す高倍率では、尿細管の間質に多数の単核球、リンパ球の浸潤がみられた。
（腎移植モデルの慢性期における評価）
　前述した腎移植術と同様の方法で腎移植を行った。ただし、ドナー腎臓としては、２０分の循環停止腎臓を用いた。腎臓を、水素非含有冷ＥＴＫ液及び水素含有冷ＥＴＫ液でそれぞれ洗い流しした後、水素非含有冷ＥＴＫ液及び水素含有冷ＥＴＫ液でそれぞれ単純浸漬保存した。水素非含有冷ＥＴＫ液に１時間保存した腎臓（水素なし）と、水素含有冷ＥＴＫ液に１時間保存した腎臓（水素あり１ｈ）と、水素含有冷ＥＴＫ液に４時間保存した腎臓（水素あり４ｈ）をレシピエントへそれぞれプットインした。水素含有冷ＥＴＫ液は、本発明の生成方法で生成したものであり、１ｍｇ／Ｌ以上の溶存水素濃度を有するものである。術後に免疫抑制剤を投与した。免疫抑制剤及びその用法・用量は以下の通りであった。タクロリムス（プログラフ）：０．１５～０．３０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１２時間おき、１日２回、ミコフェノール酸モフェチル：５００ｍｇ／ｈｅａｄ、経口投与、１日２回、プレドニゾロン：０．５～２ｍｇ／ｋｇ、静脈内又は経口投与、１日２回。以後、飲水及び食事を自由にした。術前、術直後、術後１～１４日の末梢血のＢＵＮ及びＣｒｅをそれぞれＧＬＤＨ法及び酵素法で測定した。その結果が表８及び図７並びに表９及び図８に示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　表８及び図７並びに表９及び図８から分かるように、水素なし（非含有）の通常のＥＴＫ液に保存した腎臓を移植したミニブタは、ＢＵＮ及びＣｒｅが、術後日数の経過に従って単純上昇しているが、本発明の生成方法によって生成可能な１ｍｇ／Ｌ以上の溶存水素濃度を有する水素含有冷ＥＴＫ液に保存した腎臓によれば、術後４日経過すると、ＢＵＮ及びＣｒｅが共に低下を開始し、腎機能が回復した。即ち、本発明の生成方法によって生成した１ｍｇ／Ｌ以上の溶存水素濃度の水素含有冷ＥＴＫ液に保存した腎臓は、免疫抑制剤を投与した移植後慢性期において、腎機能が大幅に回復することが分かった。
（まとめ）
　これまで水素ガスが虚血再灌流障害防止に効果があることは知られていたが、高濃度の水素ガスは、可燃性があり、その臨床での使用では安全面で難があった。本願発明者は、設備の整っている病院での医師主導型治験として、水素ガスの吸入が、冠動脈のインターベンション後の虚血再灌流障害に有効であることを示してきた。しかしながら、突発的に発生するドナーの臨床現場では、あらかじめ水素充填した臓器保存液を用意することも、水素ガスボンベを現場に持ち込むことも、実現が非常に難しかった。また、臓器保存液内で電気分解を行って水素ガスを発生させる手法は、臨床現場では簡便性に欠けていた。これに対して、本発明によれば、水素吸蔵合金機器に注目して、既存の臓器保存液の可撓性容器に対し０．０６ＭＰａ程度のゲージ圧にまで水素ガスを充填することが臨床現場において簡単にかつ迅速行うことができる。
　本発明の検証として、既存の臓器保存液への水素ガスの充填を行い、初期の溶存水素ガス濃度及びその経時変化を測定した。臓器保存液は、低温できわめて水素を含有しやすくしかも長時間水素ガスを維持できることが判明した。また、細胞外液型臓器保存液であるＥＴＫ液を用いてＤＣＤ腎臓におけるフラッシュアウト効果を検証した。ＥＴＫ液は細胞内液型のＵＷ液と比し、その粘張度は低くいが、水素ガスを含有していない場合と比し、初期灌流から高流量で灌流されることが判明した。灌流領域の組織解析から、糸球体等の毛細血管系の拡張と微小血栓の洗い流し効果が推測された。その機序として、ブタ腎移植を想定した虚血・再灌流障害に対する水素ガスの効果を実際の腎移植でそれを検証した。本モデルで使用した高齢ＭＭＰでのＤＣＤ３０分モデルにおいて、水素非含有ＥＴＫ液では全例がＰＮＦであったのに反して、水素含有ＥＴＫ液では血流が維持され尿の産出がなされた。また、前述したように、術後急性期のみならず、免疫抑制剤投与下における慢性期の移植腎機能も極めて良好となることが検証された。本発明の水素含有臓器保存液の効果は、術中のリンス効果や術中、術後の免疫抑制薬の投与、さらにＭＳＣなどの補助細胞療法を加えることで、これまで移植不可能であった腎臓が移植可能となる期待が持たれる。
　以上述べた実施形態及び実施例は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
　１０　プラスチックソフトバッグ
　１０ａ　ＥＴＫ液
　１１　ゴム栓
　１２　瓶針
　１３、１５、１８、２０　チューブ
　１４、１９　ワンタッチカプラ
　１４ａ、１９ａ　ソケット
　１４ｂ、１９ｂ　プラグ
　１６　継手
　１７　リリーフ弁
　２１　水素吸蔵合金キャニスタ

Claims (9)

  1. 　移植用臓器の摘出現場において、水素吸蔵合金キャニスタから、臓器保存液を収容した可撓性容器内に水素ガスを圧入し、前記可撓性容器を振動させて水素ガスを前記臓器保存液内に溶解させ、前記可撓性容器を外気に開放して内部の圧力を低減させることにより、前記可撓性容器内に所定濃度以上の溶存水素を含有し、移植用臓器を洗い流し及び／又は保存するために使用する水素含有臓器保存液を生成することを特徴とする水素含有臓器保存液の生成方法。
  2. 　前記水素吸蔵合金キャニスタから前記可撓性容器に供給される水素ガスの圧力が所定圧力となるまで、前記水素ガスの供給を行うことを特徴とする請求項１に記載の水素含有臓器保存液の生成方法。
  3. 　前記所定圧力が、０．０２ＭＰａ～０．０７ＭＰａの範囲の圧力であることを特徴とする請求項２に記載の水素含有臓器保存液の生成方法。
  4. 　前記可撓性容器の振動を、３０秒間以上行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の水素含有臓器保存液の生成方法。
  5. 　所定濃度以上の溶存水素を含有し、移植用臓器を洗い流し及び／又は保存するために使用する液体であることを特徴とする水素含有臓器保存液。
  6. 　移植用臓器の摘出現場において、摘出した移植用臓器を洗い流しするために使用する液体であることを特徴とする請求項５に記載の水素含有臓器保存液。
  7. 　摘出した移植用臓器を保存し、移植用臓器の移植現場に搬送するために使用する臓器保存液体であることを特徴とする請求項５又は６に記載の水素含有臓器保存液。
  8. 　可撓性容器内に収容されており、該収容された水素含有臓器保存液の一部が摘出した移植用臓器を洗い流しするために使用する液体であり、該可撓性容器内に収容された残りが摘出した移植用臓器を保存するために使用する液体であることを特徴とする請求項５から７のいずれか１項に記載の水素含有臓器保存液。
  9. 　前記所定濃度が、４時間後の溶存水素濃度が１．０ｍｇ／Ｌ以上となる濃度であることを特徴とする請求項５から８のいずれか１項に記載の水素含有臓器保存液。
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