JP2012524739A - カプセル化肝細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a) 治療有効量の肝細胞の懸濁液と肝細胞刺激量のエリスロポエチンを提供するステップ、
b) 肝細胞の懸濁液とエリスロポエチンを混合して互いに物理的に接触させるステップ、および
c) 肝細胞の懸濁液とエリスロポエチンをカプセルシェル材料にカプセル化してマイクロカプセルを形成するステップ
を含んでなる、上記方法に関する。
EPO(5 x 10-3単位/ml)の存在下で、平均直径100〜700μmを有するビーズに104〜108細胞/mlの濃度でアルギン酸塩と共にカプセル化された肝細胞は、EPOを含まない点を除いて同様にカプセル化された肝細胞よりも優れているであろう。ATP/ADP比は、細胞のエネルギー状態の尺度として用いられる。実験中に、ATP/ADP比が未処理の細胞よりも速い速度で増加するか、または未処理の細胞中のATP/ADP比より高いままであるならば、この証拠は仮説を裏付けるであろう。
凍結保存したヒト肝細胞の単一ストックから、静電ビーズ作成装置を用いて肝細胞の細胞カプセル化を行った。肝細胞を常用の培地に懸濁し、2%アルギン酸ナトリウム溶液と1:1の比で混合した。結果として得られた、4000,000細胞/mlの濃度で肝細胞を含む1%アルギン酸塩溶液を、24ゲージの血管カテーテルが取り付けられた1ccシリンジに吸引した。この血管カテーテルは、23ゲージの針で中心に穴が開けられ、静電キャスティング過程で陽極としての役割を果たした。このシリンジを、シリンジポンプ(Braintree Scientific BS-8000, Braintree, MA)上に搭載し、血管カテーテルから放出される液滴が、250mlガラスビーカー中の125mM塩化カルシウム(CaCl2)溶液(5 x 10-3U/mlおよび5 x 10-6U/mlのEPOを含む、またはEPOを含まない、1%ヒトアルブミンを含む従来のバッファー4またはサイトネット(Cytonet)社のバッファー4)の表面上に直角に落ちるように配置した。血管カテーテルチップからCaCl2の表面までの距離は約2.5cmで固定した。ポンプ流量は0.75〜1.5ml/分の範囲内に設定した。接地電極をCaCl2受入バスに浸した。高圧DC源(Spellmanモデル RHR30PF30, Hauppauge, NY)を3.8〜6kVの範囲で用いて、血管カテーテルチップからCaCl2バスに静電位を発生させた。ビーズサイズ(500μm)は、印加電位を調整することによって制御した。高静電位の存在下でシリンジポンプのスイッチを入れると、搾り出されたアルギン酸ナトリウム溶液が小さな液滴として引き出され、この液滴はCaCl2溶液と接触すると直ぐに固体アルギン酸カルシウムへと重合した。
ATP/ADP比は細胞のエネルギーの尺度であり、全ての生化学経路が細胞の代謝状態に及ぼす影響を示す。EPOと共にカプセル化された肝細胞中で見られるATP/ADP比の維持(図参照)は、該細胞が、この細胞の全ての機能に必要とされるエネルギー生成経路を維持し得ることを明らかに示す。この実験では、ATP/ADPの比は、EPO処理群では維持されたが、未処理の対照では維持されなかった。EPO処理群はATP/ADP比を維持することができたが、対照のATP/ADP比は0.5を下回った。このことは、EPOが、非EPO受容体駆動経路を通じてシグナル伝達して細胞栄養刺激を与える可能性を示している。
Claims (20)
- 肝細胞刺激量のエリスロポエチンと物理的に接触した治療有効量の肝細胞の懸濁液をカプセル化しているカプセルシェルを含むマイクロカプセル。
- 肝細胞が、肝前駆細胞、肝幹細胞、肝芽細胞、内皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、請求項1に記載のマイクロカプセル。
- 肝細胞が、成体の肝臓、胚形成期の肝臓、胎児の肝臓、新生児の肝臓または肝細胞培養物から得られる、請求項1または2に記載のマイクロカプセル。
- 肝細胞が、ヒト肝細胞、非ヒト霊長類肝細胞、ブタ肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウサギ肝細胞、マウス肝細胞またはラット肝細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- マイクロカプセルが100〜700μmの平均直径を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 肝細胞が8〜14μmの平均直径を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 治療有効量の肝細胞が104〜108肝細胞/ml懸濁液である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 肝細胞刺激量のエリスロポエチンが、10-7〜10-2、好ましくは10-7〜10-3U/ml懸濁液である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- エリスロポエチンが、野生型エリスロポエチンまたは組換えエリスロポエチンである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- カプセルシェルが、アルギン酸塩、アルギン酸塩-キトサン(AC)、アルギン酸塩-ポリ-L-リジン(APA)、熱ゲル化ポリマーおよびPEGヒドロゲルからなる群から選択される生体適合性材料で作製されている、請求項1〜9のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 肝細胞に加えて少なくとも1種のさらなる細胞種がマイクロカプセル中に存在する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- マイクロカプセルがコーティングされている、請求項1〜11のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- マイクロカプセルが、肝細胞とエリスロポエチンを埋め込んだ生体適合性マトリクスを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のマイクロカプセルを調製する方法であって、以下のステップ:
a) 治療有効量の肝細胞の懸濁液と肝細胞刺激量のエリスロポエチンを提供するステップ、
b) 肝細胞の懸濁液とエリスロポエチンを混合して互いに物理的に接触させるステップ、および
c) 肝細胞の懸濁液とエリスロポエチンを生体適合性カプセルシェル材料にカプセル化してマイクロカプセルを形成するステップ
を含んでなる、前記方法。 - ステップc)で得られるマイクロカプセルが凍結保存される、請求項14に記載の方法。
- それを必要とする被験体における肝臓疾患を予防または治療するための方法であって、請求項1〜13のいずれか1項に記載のマイクロカプセルをそれを必要とする被験体に投与するステップを含んでなる、前記方法。
- 肝臓疾患が、肝炎、肝硬変、先天性代謝異常、急性肝不全、急性肝臓感染、急性化学毒性、慢性肝不全、細胆管炎、胆汁性肝硬変、アラジール症候群、α-1-アンチトリプシン欠損症、自己免疫肝炎、胆道閉鎖症、肝臓癌、肝嚢胞症、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎および他の肝炎ウイルス感染、ポルフィリン症、原発性硬化性胆管炎、ライ(Reye's)症候群、サルコイドーシス、チロシン血症、1型糖原病またはウィルソン病である、請求項16に記載の方法。
- 投与が、肝臓被膜下、脾臓中、肝臓中、肝髄中または脾動脈もしくは脾門脈中へのマイクロカプセルの導入によって行われる、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のマイクロカプセルを被験体に投与することを含んでなる、肝細胞を被験体に導入する方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のマイクロカプセルを好適な培地中で培養するステップを含んでなる、培地中で肝細胞を培養する方法。
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