ES2431297T3

ES2431297T3 - Composición de células hepáticas encapsuladas

Info

Publication number: ES2431297T3
Application number: ES10721304T
Authority: ES
Inventors: Krasimira Aleksandrova; Peter Pediaditakis; Jo Salisbury; Wolfgang RÜDINGER
Original assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Current assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2013-11-25
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: US9517247B2; SI2424510T1; CN103638002A; KR101372384B1; WO2010124837A2; CN103638002B; RS52989B; AU2010243888C1; KR20120014171A; IL215887A0; JP2012524739A; SG175792A1; RU2500390C2; PL2424510T3; US20120093937A1; NZ595511A; BRPI1014835A8; CN102413820B; CY1114464T1; US8535923B2

Abstract

Microcápsulas que comprenden una envoltura de la cápsula que encapsula una suspensión de unacantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capazde estimular las células hepáticas.

Description

Composición de células hepáticas encapsuladas

5 La presente invención se refiere a microcápsulas que comprenden células hepáticas y eritropoyetina, a procedimientos para la preparación de dichas microcápsulas y a procedimientos para tratar a pacientes que comprenden la aplicación de dichas microcápsulas a los pacientes.

Aunque el hígado de los individuos sanos es capaz de regenerarse por sí mismo reparando o substituyendo el tejido dañado o enfermo, desafortunadamente una vez un número determinado de células han muerto o han sido gravemente dañadas debido a enfermedades o lesiones, puede producirse el fallo de todo el órgano. Dicho fallo, sea agudo o crónico, puede provocar un estado patológico y la muerte. El tratamiento de las enfermedades hepáticas incluye medios convencionales tales como la administración de fármacos. Sin embargo, también se incluye en el estado de la técnica el trasplante de hígado o de parte del mismo. Además, es ampliamente conocido el trasplante

15 de poblaciones de células hepáticas a pacientes, tal como se describe, por ejemplo, en WO 2004/009766 A2. Sin embargo, dentro del diseño de tratamientos para la curación de enfermedades hepáticas agudas o crónicas, todavía es un reto el suministro de células hepáticas a pacientes que las necesiten con procedimientos optimizados en términos de viabilidad, capacidad de implantación, proliferación y diferenciación de las células trasplantadas en el tejido diana.

Haque y otros (Biotechnology Letters 27 (5) (2005), 317 – 322)) describen estudios in vitro de microcápsulas de alginato-quitosano como una alternativa a los trasplantes de células hepáticas para el tratamiento del fallo hepático. Chandrasekaran y otros (Tissue Engineering 12 (7), (2006)) dan a conocer células progenitoras hepáticas incrustadas en perlas producidas mediante técnicas electrostáticas.

25 A pesar de los esfuerzos realizados para desarrollar sistemas terapéuticos para suministrar de forma eficiente células hepáticas en el tejido diana del paciente, persiste la necesidad de dar a conocer medios terapéuticos más fiables para curar las enfermedades hepáticas, en concreto, medios que proporcionen una viabilidad y actividad fisiológica elevadas de las células hepáticas en el organismo diana.

La presente invención solventa dicho problema dando a conocer microcápsulas que comprenden una envoltura de la cápsula, preferentemente una envoltura de la cápsula biocompatible, que encapsula una suspensión de una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas. En una realización preferente, la presente invención da a conocer microcápsulas

35 que comprenden una envoltura de la cápsula y un núcleo, en las que la envoltura de la cápsula encapsula en el núcleo una suspensión de una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas y una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas, en particular estando la eritropoyetina (en adelante denominada EPO) y las células hepáticas en contacto físico entre sí, de manera que se produce un efecto estimulante de la EPO sobre las células hepáticas.

Así pues, una realización preferente de la presente invención prevé dar a conocer microcápsulas que comprenden una envoltura de la cápsula, fabricada preferentemente de un material de envoltura de la cápsula biocompatible y un núcleo que está encapsulado por dicha envoltura de la cápsula. En una realización preferente de la presente invención el núcleo contiene una suspensión de una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas en

45 contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas.

En otra realización preferente, el núcleo contiene una matriz, preferentemente fabricada de un material de la matriz biocompatible, estando la suspensión de la cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas incrustada en dicha matriz en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas. Preferentemente, el material de la matriz es el mismo que el material de la envoltura de la cápsula. En otra realización, el material de la matriz biocompatible puede ser un material diferente al material de la envoltura de la cápsula.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la enseñanza de encapsular la eritropoyetina y las células hepáticas

55 conjuntamente en una envoltura de la cápsula de manera que la eritropoyetina se halla en contacto físico con las células hepáticas de forma que ejerce al menos una de sus funciones biológicas sobre las mismas, en concreto la estimulación de las mismas.

Una ventaja de la presente invención es que las células hepáticas están encapsuladas en la envoltura de la cápsula y, por lo tanto, no provocan ninguna reacción adversa, en concreto reacciones alérgicas o inmunológicas, en el paciente, en el cual se trasplanta preferentemente la microcápsula. Además, el contacto íntimo entre la eritropoyetina y las células hepáticas estimula dichas células hepáticas para que ejerzan su función biológica, proporcionando al paciente la función biológica de un hígado.

65 En una realización particularmente preferente, las células hepáticas están contenidas en la microcápsula en una concentración tal que se hallan en contacto físico entre sí generando un efecto aún más pronunciado cuando son estimuladas por la eritropoyetina. Así, la presente invención prevé en una realización particularmente preferente que las células hepáticas contenidas en las microcápsulas se hallen en contacto físico entre sí y se hallen en contacto físico con la eritropoyetina.

5 En el contexto de la presente invención, la expresión “las células hepáticas se hallan en contacto físico con la eritropoyetina” significa que la eritropoyetina es capaz de ejercer al menos una de sus funciones biológicas sobre la célula hepática, en concreto es capaz de alcanzar y unirse de forma reversible o irreversible a los receptores de eritropoyetina presentes en la célula hepática.

En el contexto de la presente invención, la expresión “las células hepáticas se hallan en contacto físico entre sí” significa que las células hepáticas se encuentran en la microcápsula de la presente invención en una relación íntima tal que las células se tocan entre sí y proporcionan un ambiente estable de gran semejanza a la situación fisiológica natural del hígado.

15 En el contexto de la presente invención, el término “estimular las células hepáticas” significa que la eritropoyetina aumenta la funcionalidad biológica de las células hepáticas, preferentemente en un paciente en el que se trasplanta la microcápsula, incrementa la viabilidad de las células hepáticas, incrementa su estabilidad de almacenamiento y/o incrementa su potencial para ejercer con éxito su función biológica una vez trasplantadas en el individuo.

En el contexto de la presente invención, “biocompatibilidad” significa que el material, en concreto el material de la envoltura de la cápsula y/o el material de la matriz, es capaz de mantener viables las células hepáticas integradas y de permitir la interacción entre la eritropoyetina y las células hepáticas. En una realización particularmente preferente, el término “biocompatible” significa que el material permite, preferentemente a largo plazo, la implantación en un paciente manteniendo la función de las células hepáticas incrustadas sin provocar efectos

25 indeseables locales o sistémicos en el individuo, en concreto, reacciones alérgicas o inmunológicas. En una realización particularmente preferente, el término “biocompatible” significa que el material es capaz de actuar como substrato de soporte de la actividad de las células hepáticas incluyendo la necesidad de un sistema molecular y mecánico similar entre las células hepáticas y la EPO, preferentemente para optimizar la regeneración hepática sin generar efecto indeseable alguno en las células y el individuo.

En el contexto de la presente invención el término “eritropoyetina” designa una hormona glicoproteica que controla la eritropoyesis o producción de células sanguíneas, preferentemente una substancia que, en la dosis adecuada, controla el crecimiento, diferenciación y maduración de las células madre de eritroblastos a eritrocitos.

35 La eritropoyetina es una glicoproteína que posee 166 aminoácidos, tres sitios de glicosilación y un peso molecular de aproximadamente 34.000 Da. Durante la diferenciación inducida por EPO de las células progenitoras de eritrocitos, se induce la síntesis de globina, se aumenta la síntesis del complejo hemo y se incrementa el número de receptores de ferritina. De este modo la célula puede captar más hierro y sintetizar hemoglobina funcional. En los eritrocitos maduros, la hemoglobina se une al oxígeno. Por ello, los eritrocitos y la hemoglobina contenida en los mismos juegan un papel clave en el suministro de oxígeno al organismo. Estos procesos se inician mediante la interacción de la EPO con un receptor adecuado en la superficie celular de las células progenitoras de eritrocitos (Graber y Krantz, Ann. Rev. Med. 29 (1978), 51-56).

En el contexto de la presente invención, el término “eritropoyetina” engloba la eritropoyetina salvaje, en concreto la

45 eritropoyetina humana, y derivados de la misma. En el contexto de la presente invención, los derivados de la eritropoyetina son proteínas tipo eritropoyetina recombinantes caracterizadas por al menos una modificación de un aminoácido, en concreto la deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la EPO salvaje, y/o proteínas tipo eritropoyetina con una patrón de glicosilación diferente en comparación con el de la eritropoyetina salvaje. En una realización particularmente preferente, un derivado de la eritropoyetina es también una eritropoyetina salvaje. En una realización especialmente preferente, los derivados de eritropoyetina son también proteínas de fusión o proteínas truncadas de tipo de eritropoyetina salvaje o derivados de la misma que posee un patrón de glicosilación diferente en comparación con el patrón de glicosilación de la eritropoyetina salvaje.

El término “eritropoyetina” utilizado en la presente invención incluye EPO de todos los orígenes, especialmente la

55 EPO humana o animal. Por lo tanto, el término utilizado en la presente invención engloba no sólo la EPO natural, o en otras palabras las formas salvajes de EPO, sino también sus derivados, también denominados modificaciones, muteínas o mutantes, siempre y cuando muestren los efectos biológicos de la eritropoyetina salvaje.

En relación con la presente invención, también se entenderá por “derivados” aquellos derivados de la eritropoyetina que, reteniendo la estructura básica de la eritropoyetina, se obtienen mediante la sustitución de uno o más átomos o grupos moleculares o residuos, especialmente mediante la sustitución de las cadenas hidrocarbonadas tales como el etilenglicol, y/o aquellos cuyas secuencias de aminoácidos difieren de la eritropoyetina natural humana o animal en, al menos una posición, pero que esencialmente poseen un elevado grado de homología a nivel de aminoácidos y una actividad biológica comparable. Los derivados de eritropoyetina que pueden ser utilizados en la presente

65 invención son conocidos a partir de, por ejemplo, WO 94/25055, EP 0148605 B1 o WO 95/05465.

“Homología” significa especialmente una identidad entre secuencias de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85% y particularmente preferente al menos más del 90%, 95%, 97% y 99%. El término “homología” conocido por los expertos en la técnica, se refiere así al grado de relación entre dos o más moléculas de polipéptido. Ello se determina mediante la concordancia entre secuencias. Dicha concordancia significa o bien una concordancia

5 idéntica o bien un intercambio conservador de aminoácidos.

De acuerdo con la presente invención, el término “derivado” también incluye proteínas de fusión, en las que se hallan dominios funcionales de otra proteína en la parte N-terminal o C-terminal. En una realización de la presente invención, esta otra proteína puede ser, por ejemplo, GM-CSF, VEGF, PIGF, una estatina u otro factor que posea un efecto estimulador sobre las células progenitoras endoteliales. En otra realización de la presente invención, la otra proteína puede ser también un factor que posea un efecto estimulante sobre las células hepáticas.

Las diferencias entre un derivado de eritropoyetina y la eritropoyetina nativa o salvaje pueden producirse, por ejemplo, mediante mutaciones tales como deleciones, sustituciones, inserciones, adiciones, intercambios de bases

15 y/o recombinaciones de secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de la eritropoyetina. Obviamente, dichas diferencias también pueden deberse a variaciones de secuencias naturales, tales como las secuencias de otro organismo o a secuencias que han mutado de forma natural, o a mutaciones introducidas de forma selectiva dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la eritropoyetina, utilizando medios habituales conocidos en la técnica, tales como agentes químicos y/o agentes físicos. Por lo tanto, en relación con la presente invención, el término “derivado” incluye también moléculas de eritropoyetina mutada, o en otras palabras muteínas de eritropoyetina.

De acuerdo con la presente invención, también pueden utilizarse péptidos o proteínas análogas de la eritropoyetina. En relación con la presente invención, el término “análogos” incluye compuestos que no poseen una secuencia de

25 aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina pero que poseen una estructura tridimensional muy similar a la de la eritropoyetina, de manera que poseen una actividad biológica comparable. Los análogos de eritropoyetina pueden ser, por ejemplo, compuestos que contienen, en una conformación adecuada, los residuos de aminoácido responsables de la unión de la eritropoyetina a sus receptores, y que son por lo tanto capaces de estimular las propiedades superficiales esenciales de la región de unión de la eritropoyetina. Se describen compuestos de este tipo en, por ejemplo, Wrighton y otros, Science, 273 (1996), 458.

La EPO utilizada según la presente invención puede producirse de modos diversos, por ejemplo mediante el aislamiento a partir de orina humana o de orina o plasma (incluyendo suero) (Miyake y otros, J.B.C. 252 (1977), 5558). A modo de ejemplo, también puede obtenerse EPO a partir de cultivos tisulares de células de cáncer renal

35 humano (Solicitud de Patente no Examinada JA 55790/1979), a partir de células linfoblásticas humanas, que poseen la capacidad de sintetizar EPO (Solicitud de patente no examinada JA 40411/1982) y a partir de un cultivo de hibridoma obtenido de la fusión de una línea celular humana. La EPO también puede producirse mediante procedimientos de tecnología genética, utilizando moléculas de ADN o ARN adecuadas que codifiquen las secuencias de aminoácidos de EPO adecuadas para producir la proteína deseada mediante ingeniería genética, por ejemplo, en una bacteria, una levadura, una planta o una línea celular humana o animal. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en EP 0148605 B2 o EP 0205564 B2 y EP 0411678 B1.

En el contexto de la presente invención, los derivados de eritropoyetina son, en una realización preferente, derivados de EPO funcional y clínicamente probados, preferentemente seleccionados del grupo formado por Epoetina, también

45 denominada Procrit, Epogen, Eprex o NeoRecormon, Epoetina delta, también denominada Dynepo, Darbepoetina, también denominada Aranesp, PDpoetina, CERA (antagonista continuo del receptor de la eritropoyetina) y metoxi polietilénglicol-epoetina beta, también denominado Mircera.

En una realización preferente de la presente invención, una microcápsula es una perla, preferentemente esférica, fabricada de un material de envoltura de la cápsula biocompatible que contiene incrustada en ella una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas. En el contexto de la presente invención, una microcápsula es preferentemente una esfera, preferentemente de un diámetro entre 10 µm a 10 mm, preferentemente entre 140 µm y 10 mm, preferentemente entre 50 µm y 1 mm, preferentemente entre 60 µm y 800 µm, preferentemente entre 100 µm y 700

55 µm. En una realización preferente de la presente invención, las microcápsulas de la presente invención están formadas por células hepáticas, eritropoyetina y el material de envoltura de la cápsula. Preferentemente además de los tres elementos anteriores, se prevén un recubrimiento de la microcápsula y/o una matriz biocompatible en el núcleo de la misma.

Así, en una realización particularmente preferente la presente invención hace referencia a microcápsulas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas encapsuladas en un material de la matriz biocompatible en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas.

En una realización particularmente preferente, las células hepáticas están incrustadas en la envoltura de la cápsula

65 en forma de suspensión, preferentemente en forma de suspensión en cultivo celular. La suspensión de células hepáticas es preferentemente en forma de células hepáticas contenidas en un medio de cultivo celular o en una solución acuosa fisiológicamente aceptable. La suspensión de células hepáticas es preferentemente una suspensión de células hepáticas en un medio de cultivo celular.

En una realización particularmente preferente, las células hepáticas están incrustadas en la matriz contenida en la

5 envoltura en forma de suspensión, preferentemente en forma de suspensión en cultivo celular, preferentemente en forma de células hepáticas contenidas en un medio de cultivo celular o en una solución acuosa fisiológicamente aceptable.

En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que las células hepáticas se seleccionan del grupo formado por células precursoras hepáticas, células madre hepáticas, hepatoblastos y hepatocitos.

En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que las células hepáticas se seleccionan del grupo formado por células precursoras hepáticas, células madre hepáticas,

15 hepatoblastos, hepatocitos y células endoteliales.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que las células hepáticas se obtienen de hígado adulto, hígado fetal, hígado neonatal o cultivos de células hepáticas. Preferentemente, las células hepáticas son células vivas. En una realización preferente, las células hepáticas pueden obtenerse a partir de un donante vivo o muerto, en concreto, recientemente fallecido.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que las células hepáticas son células hepáticas humanas, células hepáticas de primates no humanos, células hepáticas de cerdo, células hepáticas de perro, células hepáticas de gato, células hepáticas de conejo, células hepáticas de ratón o células

25 hepáticas de rata.

En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, poseyendo dichas microcápsulas un diámetro promedio entre 100 y 700 µm, preferentemente entre 200, 300, 400, 500, 600 o 650 y 700 µm.

En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que la cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas está entre 104 y 108, preferentemente entre 105 y 107 células hepáticas por ml de suspensión.

35 En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que las células hepáticas poseen un diámetro promedio entre 8 y 14 µm, preferentemente entre 9 y 12 µm.

En una realización más preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, de manera que la cantidad de eritropoyetina que estimula las células hepáticas es de 10-7 a 10-2, preferentemente 10-7 a 10-3, preferentemente 10-7 a 10-5 y preferentemente 10-6 a 10-5 U/ml de suspensión.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que la EPO es eritropoyetina salvaje o eritropoyetina recombinante.

45 En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que el material de la envoltura de la cápsula se selecciona del grupo formado por alginato, alginato-quitosano (AC), alginato-poli-L-lisina (APA), polímeros por termogelación e hidrogel de PEG.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que el material de la matriz se selecciona del grupo formado por alginato, alginato-quitosano (AC), alginato-poli-L-lisina (APA), polímeros por termogelación e hidrogel de PEG.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, en las que además de células hepáticas se halla en la microcápsula al menos otro tipo celular adicional.

55 En una realización particularmente preferente, el al menos otro tipo celular adicional presente en la microcápsula se selecciona del grupo formado por células hepáticas estrelladas, células biliares, células hematopoyéticas, monocitos, células de la estirpe macrofágica, linfocitos y células endoteliales.

En otra realización preferente de la presente invención, se prevé que la microcápsula comprenda, además de células hepáticas y EPO al menos un factor de crecimiento adicional, preferentemente seleccionado del grupo formado por HGH (factor de crecimiento humano), VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial), CSF (factor estimulador de colonias), trombopoyetina, complejo SCF complejo (que contiene complejo de Skp-cullina-caja F), SDF (factor derivado de células del estroma factor 1), NGF (factor de crecimiento nervioso), PIGF (proteína clase F

65 de la biosíntesis del anclaje de glicofosfatidil inositol), inhibidores de la HMG coreductasa, inhibidores de la ACE (enzima convertidor de la angiotensina), inhibidor de la AT-1 y dadores de NO.

En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas, estando las microcápsulas recubiertas.

5 En una realización particularmente preferente de la presente invención, el recubrimiento es un recubrimiento de polímero, un recubrimiento hidrocarbonado, un recubrimiento de alcoholes de azúcar y/o un recubrimiento de cera o grasa.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de microcápsulas según lo anterior que comprende:

a) proporcionar una suspensión de una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas y una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular la cantidad de las células hepáticas, b) mezclar la suspensión de células hepáticas y la eritropoyetina para que queden en contacto físico entre 15 sí, y c) encapsular la suspensión de células hepáticas y eritropoyetina en un material de envoltura de la cápsula de manera que se forme una microcápsula.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento, en el que las microcápsulas obtenidas en la etapa c) se criopreservan.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad hepática en un individuo en necesidad del mismo que comprende la administración de las microcápsulas según la presente invención al individuo en necesidad de las mismas.

25 En una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para ser utilizadas en un procedimiento, en el que la enfermedad hepática es hepatitis, cirrosis, errores congénitos del metabolismo, insuficiencia hepática aguda, infecciones hepáticas agudas, toxicidad química aguda, insuficiencia hepática crónica, colangitis, cirrosis biliar, síndrome de Alagille, déficit de alfa-1-antitripsina, hepatitis autoinmune, atresia biliar, cáncer hepático, enfermedad quística hepática, hígado graso, galactosemia, litiasis biliar, cálculos biliares, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C e infecciones por otros virus de la hepatitis, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Reye, sarcoidosis, tirosinemia, glucogenosis tipo 1 o enfermedad de Wilson.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para ser utilizadas en un

35 procedimiento, en el que la administración se realiza mediante la introducción de las microcápsulas debajo de la cápsula hepática, dentro del bazo, dentro del hígado, dentro de la pulpa hepática o dentro de la arteria esplénica o la vena porta.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para ser utilizadas en un procedimiento para introducir células hepáticas en un individuo que comprende administrar las microcápsulas según la invención al individuo.

En una realización particularmente preferente según la presente invención la administración se efectúa mediante la introducción en el individuo en necesidad de ello, siendo la administración tópica, enteral o parenteral. En una

45 realización preferente, la administración tópica es una administración epicutánea, por inhalación, vaginal o intranasal. En una realización preferente la administración entérica es por vía oral, mediante sonda gástrica, o por vía rectal. En una realización preferente, la administración parenteral es mediante inyección o infusión, preferentemente mediante administración endovenosa, intrarterial, intracardíaca, subcutánea, intraósea, intradérmica, intratecal, intraperitoneal, o intravesical. En otra realización preferente, la administración parenteral es transdérmica, transmucosa o inhalada.

En una realización especialmente preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para su utilización en un procedimiento para el cultivo de células hepáticas en un medio de cultivo, preferentemente in vitro, comprendiendo el cultivo de microcápsulas de acuerdo con la presente invención en un medio de cultivo apropiado y

55 en condiciones apropiadas para mantener o incrementar la viabilidad de las células vivas.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a microcápsulas para ser utilizadas en un procedimiento para mantener o aumentar el estado energético de las células hepáticas en un medio de cultivo, preferentemente in vitro, que comprende cultivar las microcápsulas según la presente invención en un medio de cultivo adecuado y bajo condiciones adecuadas para mantener o aumentar el estado energético de las células hepáticas.

Otras realizaciones preferentes de la presente invención son asunto de sub-reivindicaciones.

65 La figura muestra el cociente ATP/ADP de las células hepáticas encapsuladas con o sin EPO tras ser cultivadas como medida del estado energético de las células.

Ejemplo 1

Las células hepáticas, en presencia de EPO (5 x 10-3 unidades/ml), encapsuladas con alginato a una concentración

5 entre 104 y 108 células/ml dentro de perlas de un diámetro promedio entre 100 y 700 µm tendrán un mejor comportamiento que las células hepáticas encapsuladas de modo idéntico pero sin EPO. Se utiliza el cociente ATP/ADP como medida del estado energético de las células. Si el cociente ATP/ADP aumenta durante el curso del experimento a una velocidad mayor o permanece más elevado que en las células no tratadas, esta evidencia apoyaría la hipótesis.

10 Encapsulación de las células hepáticas

La encapsulación de las células hepáticas a partir de un solo lote de células hepáticas humanas criopreservadas se realizó utilizando un aparato de generación de perlas electrostático. Las células hepáticas se suspendieron en un

15 medio de cultivo rutinario y se mezclaron con una solución al 2% de alginato sódico en una relación 1:1. La solución resultante de alginato al 1% con células hepáticas a una concentración de 4 millones de células por ml se introdujo en una jeringa de 1 cc. unida a un angiocatéter de calibre 24. El angiocatéter se traspasó por el centro con una aguja de calibre 23 para que sirviera de electrodo positivo en el proceso de fundición electrostática. La jeringa se cargó en una bomba de jeringa (Braintree Scientific BS-8000, Braintree, MA) y se dispuso de manera que las gotitas que

20 salían del angiocatéter caían ortogonalmente sobre la superficie de una solución de 125 mM de cloruro cálcico (CaCl2) (tampón convencional o Cytonet 4 con albúmina humana 1%, con 5x10-3 y 5x10-6 U/ml de EPO o sin EPO) en un recipiente de vidrio de 250 ml. Se fijó la distancia desde la punta del angiocatéter a la superficie de CaCl2 en aproximadamente 2,5 cm. Las velocidades de flujo de la bomba se fijaron entre 0,75 y 1,5 ml/min. Se sumergió un electrodo de tierra en el baño de CaCl2. Se generó un potencial electrostático entre la punta del angiocatéter y el

25 baño de CaCl2 utilizando una fuente de corriente continua de alto voltaje (Spellman modelo RHR30PF30, Hauppauge, NY) de entre 3,8 y 6 kV. Se controló el tamaño de las perlas (500 µm) ajustando el potencial aplicado. Cuando se accionó la bomba de jeringa en presencia de un potencial electrostático elevado, la solución de alginato sódico exprimida se separaba en pequeñas gotitas que al entrar en contacto con la solución de CaCl2 polimerizaban de forma inmediata en forma de alginato cálcico sólido.

30 Tras la encapsulación, las perlas de alginato con células hepáticas se mantuvieron en medio de Williams E suplementado con un 10% de suero, 244 unidades/ml de penicilina, 0,244 mg/ml, glutamina 5 mM, 0,195 unidades/ml de insulina, 0,017 µg/ml de glucagón, 0,73 µg/ml de prednisolona, 0,54 µg/ml de dexametasona y se cultivaron durante 2 horas.

35 La descapsulación se realizó colocando las perlas en citrato 100 mM. Una vez disuelto el alginato, las células se lavaron dos veces con PBS y se obtuvo una pastilla celular mediante centrifugación a 200 x G durante 1 minuto. Se extrajeron los metabolitos añadiendo ácido perclórico al 4% sobre las células y homogeneizando durante 20 segundos con un micro homogeneizador manual. A continuación, se centrifugó la muestra a 14.000 x G durante tres

40 minutos y se retiró el sobrenadante con los metabolitos. Se neutralizó el ácido perclórico con KOH y se eliminó el perclorato potásico mediante centrifugación. A continuación, se analizó la muestra mediante un procedimiento de HPLC para análisis de ATP, ADP descrito en “Measurements of ATP in Mammalian Cells” (“Determinación de ATP en células de mamífero”) (Manfredi y otros, Methods 2002 (4), 317-326). Para determinar los niveles de ATP/ADP se utilizaron tres placas en paralelo.

45 Resultados

El cociente ATP/ADP es una medida del estado energético de las células y representa el efecto de todas las vías metabólicas sobre el estado de las mismas. El mantenimiento del cociente ATP/ADP (ver figura), observado en las

50 células hepáticas encapsuladas con EPO, muestra claramente que las células son capaces de mantener las vías de generación de energía necesarias para todas las funciones celulares. En este experimento, se mantuvo el cociente ATP/ADP en el grupo tratado con EPO pero no en los controles no tratados. Mientras que el grupo tratado con EPO fue capaz de mantener el cociente ATP/ADP, el cociente ATP/ADP de los controles cayó por debajo de 0,5. Ello muestra que la EPO puede estar realizando la señalización a través de una vía controlada por un receptor no EPO

55 para conseguir la estimulación trófica de las células.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Microcápsulas que comprenden una envoltura de la cápsula que encapsula una suspensión de una

cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas en contacto físico con una cantidad de eritropoyetina capaz 5 de estimular las células hepáticas.
2.

Microcápsulas, según la reivindicación 1, en las que las células hepáticas se seleccionan del grupo formado por células precursoras hepáticas, células madre hepáticas, hepatoblastos, células endoteliales y hepatocitos.
3.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en las que las células hepáticas se obtienen de hígado adulto, hígado fetal, hígado neonatal o cultivos de células hepáticas.
4.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las que las células hepáticas son células

hepáticas humanas, células hepáticas de primates no humanos, células hepáticas de cerdo, células hepáticas de 15 perro, células hepáticas de gato, células hepáticas de conejo, células hepáticas de ratón o células hepáticas de rata.
5.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que las microcápsulas poseen un diámetro promedio entre 100 y 700 µm.
6.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que las células hepáticas poseen un diámetro promedio entre 8 y 14 µm.
7.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la cantidad terapéuticamente

efectiva de células hepáticas es entre 104 y 108 células hepáticas/ml de suspensión. 25
8.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas es entre 10-7 y 10-2, preferentemente entre 10-7 y 10-3 U/ml de suspensión.
9.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la eritropoyetina es eritropoyetina de tipo salvaje o eritropoyetina recombinante.
10.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la envoltura de la cápsula está hecha de un material biocompatible seleccionado del grupo formado por alginato, alginato-quitosano (AC), alginato-poli-l-lisina (APA), polímeros por termogelación e hidrogel de PEG.
11.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que además de las células hepáticas se halla en la microcápsula al menos otro tipo celular adicional.
12.

Microcápsulas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que las microcápsulas están recubiertas.
13.

Microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la microcápsula contiene una matriz biocompatible que engloba las células hepáticas y la eritropoyetina.

45 14. Procedimiento de preparación de microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende a) proporcionar una suspensión de una cantidad terapéuticamente efectiva de células hepáticas y una cantidad de eritropoyetina capaz de estimular las células hepáticas, b) mezclar la suspensión de células hepáticas y la eritropoyetina para que queden en contacto físico entre sí, y c) encapsular la suspensión de células hepáticas y eritropoyetina en un material de envoltura de la cápsula de manera que se forme una microcápsula.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las microcápsulas obtenidas en la etapa c) se

criopreservan. 55
16.

Microcápsula, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad hepática en un individuo en necesidad de ello.
17.

Microcápsula, según la reivindicación 16, en la que la enfermedad hepática es hepatitis, cirrosis, errores congénitos del metabolismo, insuficiencia hepática aguda, infecciones hepáticas agudas, toxicidad química aguda, insuficiencia hepática crónica, colangitis, cirrosis biliar, síndrome de Alagille, déficit de alfa-1-antitrpsina, hepatitis autoinmune, atresia biliar, cáncer hepático, enfermedad quística hepática, hígado graso, galactosemia, cálculos biliares, litiasis biliar, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, infecciones por otros virus de la hepatitis, porfiria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Reye, sarcoidosis, tirosinemia,

65 glucogenosis tipo 1 o enfermedad de Wilson.
18. Microcápsula, según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en la que la microcápsula es adecuada para su administración mediante la introducción de la misma debajo de la cápsula hepática, dentro del bazo, dentro del hígado, dentro de la pulpa hepática o dentro de la arteria esplénica o la vena porta.

5 19. Microcápsula, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para ser utilizada en un procedimiento de introducción de células hepáticas en un individuo.
20. Procedimiento de cultivo de células hepáticas en un medio de cultivo que comprende cultivar las

microcápsulas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en un medio de cultivo adecuado. 10